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Dokumentenidentifikation DE69232687T2 21.11.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0909813
Titel Rezeptor flk-2 von pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen
Anmelder The Trustees of Princeton University, Princeton, N.J., US
Erfinder Lemischka, Ihor R., Princeton, US
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69232687
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.04.1992
EP-Aktenzeichen 981193964
EP-Offenlegungsdatum 21.04.1999
EP date of grant 17.07.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.11.2002
IPC-Hauptklasse C12N 5/00
IPC-Nebenklasse C07K 14/705   C07K 14/52   C07K 16/28   C07K 14/715   C07H 15/12   C07H 17/00   A61K 38/00   C07K 14/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Rezeptorproteintyrosinkinase, flk-2, auf ein Nukleinsäuremolekül, welches für die Rezeptorproteintyrosinkinase codiert, auf Vektoren, welche das zuvor erwähnte Nukleinsäuremolekül umfassen, auf Antikörper, die für die Rezeptorproteintyrosinkinase spezifisch sind, sowie auf Nukleinsäuren, die für diese Antikörper codieren. Ferner ist die Verwendung der Antikörper für die Herstellung eines Medikamentes sowie ein in vitro Verfahren für die Stimulierung der Proliferation und/oder Differenzierung von undifferenzierten, hämopoetischen Säugetierstammzellen offenbart.

Das hämopoetische Säugetiersystem umfasst rote und weiße Blutzellen. Diese Zellen sind reife Zellen, welche von mehr undifferenzierten, auf den Stammbaum beschränkte Zellen abstammen. Die Zellen des hämopoetischen Systems sind von Dexter and Spooncer in "Annual Review of Cell Biology" 3, 423-441 (1987) beschrieben worden.

Die roten Blutzellen oder Erythrozyten stammen von undifferenzierten Zellen ab, die von Dexter und Spooncer als Erythrozytenbündel-Bildungseinheiten (BFU-E) bezeichnet wurden. Die direkten Nachkommen der Erythrozytenbündel-Bildungseinheiten werden als Erythrozytenkolonie- Bildungseinheiten (CFU-E) bezeichnet.

Die weißen Blutzellen enthalten die reifen Zellen des lymphoiden und des myeloischen Systems. Die Lymphiodzellen beinhalten die B-Lymphozyten und die T-Lymphozyten. Die B- und T-Lymphozyten stammen von früheren Vorläuferzellen ab, die von Dexter und Spooncer als preT- und pre-B-Zellen bezeichnet wurden.

Das myeloische System umfasst eine Reihe von Zellen, die Granulozyten, Blutplättchen, Monozyten, Makrophagen und Megakaryozyten umfassen. Die Granulozyten werden weiter in Neutrophile, Eosinophile, Basophile und Mastzellen aufgeteilt.

Jede reife hämopoetische Zelle ist auf eine spezifische Funktion spezialisiert. Beispielsweise sind die Erythrozyten verantwortlich für den Sauerstoff- und Kohlendioxidtransport. Die T- und B-Lymphozyten sind verantwortlich für die zelluläre Immunreaktion bzw. für die Immunreaktion auf Antikörperbasis. Die Blutplättchen sind an der Blutgerinnung beteiligt. Die Granulozyten und die Markrophagen wirken im allgemeinen als Fänger- und Hilfszellen bei der Immunantwort gegen eindringende Organismen und ihren Nebenprodukten.

In, Zentrum des hämopoetischen Systems liegen eine oder mehrere totipotente, hämopoetische Stammzellen, die einer Reihe von Differenzierungsschritten unterliegen, die zunehmend auf die Stammbaum beschränkten Vorläuferzellen führen. Die reiferen Vorläuferzellen sind beschränkt auf die Herstellung von ein oder zwei Abstammungslinien. Einige Beispiele für auf Stammbaum beschränkte Vorläuferzellen, die von Dexter und Spooncer erwähnt werden, umfassen die Granulozyten/Makrophagenkolonie-Bildungszellen (GM-CFC), die Megakaryozytenkolonie-Bildungszellen (Meg-CFC), die Eosinophilkolonie-Bildungszellen (Eos-CFC) und die Basophilkolonie-Bildungszellen (Bas-CFC). Andere Beispiele für Vorläuferzellen werden weiter unten diskutiert werden.

Das hämopoetische System funktioniert mittels einer präzis kontrollierten Herstellung der verschiedenen reifen Abstammungslinien. Die totipotente Stammzelle besitzt die Fähigkeit zur Selbsterneuerung sowie zur Differenzierung in fixierte Vorläuferzellen für alle hämopoetischen Abstammungslinien. Diese am meisten undifferenzierten Zellen unter den hämopoetischen Zellen sind notwendig als auch ausreichend für die vollständige und permanente, hämopoetische Rekonstitution eines durch Strahlung bei Säugetieren abladierten, hämopoetischen Systems. Die Fähigkeit der Stammzellen zur Rekonstitution des gesamten hämopoetischen Systems ist die Basis für die Knochenmark-Transplantationstherapie.

Es ist bekannt, dass Wachstumsfaktoren eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und bei der Arbeitsweise des hämopoetischen Systems bei Säugetieren spielen. Die Rolle der Wachstumsfaktoren ist jedoch komplex und zur Zeit noch nicht richtig verstanden. Ein Grund für diese Unsicherheit liegt darin begründet, dass das bisherige Wissen über hämopoetische Wachstumsfaktoren von in vitro Experimenten abstammt. Solche Experimente spiegeln nicht notwendigerweise die in vivo Realitäten wieder.

Ferner kann die in vitro Hämatopeose in Abwesenheit von zugefügten Wachstumsfaktoren etabliert werden, sofern dem Medium Stromamarkzellen hinzugefügt werden. Die Beziehung zwischen den Stromazellen und den hämopoetisohen Wachstumsfaktoren ist in vivo nicht verstanden. Es wurde aber gezeigt, dass die hämopoetischen Wachstumsfaktoren in vivo hochaktiv sind.

Von dem, was zur Zeit bekannt ist, scheinen die hämopoetischen Wachstumsfaktoren ein Spektrum von Aktivitäten zu zeigen. An einem Ende des Spektrums befinden sich Wachstumsfaktoren, wie Erythropoietin, von dem angenommen wird, dass es nur die Proliferation von reifen Erythrozytenvorläuferzellen fördert. In der Mitte des Spektrums befinden sich Wachstumsfaktoren, wie IL-3, von dem angenommen wird, dass es das Wachstum und die Entwicklung von frühen Stammzellen sowie von zahlreichen Vorläuferzellen erleichtert. Einige Beispiele für die durch IL-3 induzierten Vorläuferzellen umfassen solche, die auf die Abstammungslinien für Granulozyten/Makrophagen, Eosinophile, Megakaryozyten, Erythrozyten und Mastzellen beschränkt sind.

Am anderen Ende des Spektrums befindet sich der hämopoetische Wachstumsfaktor, der zusammen mit dem entsprechenden Rezeptor in einer Reihe von Artikeln in der Ausgabe von Cell vom 5. Oktober 1990 diskutiert wurde. Der Rezeptor ist das Produkt des W-Locus, c-Kit, der ein Mitglied der Klasse der Rezeptorproteintyrosinkinasen ist. Der Ligand für c-Kit, der mit verschiedenen Namen bezeichnet wird, wie Stammzellfaktor (SCF) und Mastzellwachstumsfaktor (MGF), ist wahrscheinlich essentiell für die Entwicklung von frühen hämopoetischen Stammzellen sowie für Zellen, die in Mäusen auf die Abstammungslinien für Erythrozyten und Mastzellen beschränkt sind. Hierzu wird beispielsweise auf Copeland et al., Cell 63, 175-183 (1990) verwiesen.

Es scheint somit Wachstumsfaktoren zu geben, die exklusiv reife Zellen beeinflussen. Es scheint ferner Wachstumsfaktoren zu geben, die sowohl reife Zellen als auch Stammzellen beeinflussen. Die Wachstumsfaktoren, welche beide Typen von Zellen beeinflussen können, können eine kleine Zahl oder eine große Zahl von reifen Zellen beeinflussen.

Es scheint ferner eine umgekehrte Beziehung zwischen der Fähigkeit eines Wachstumsfaktors zur Beeinflussung einer reifen Zelle und der Fähigkeit eines Wachstumsfaktors zur Beeinflussung von Stammzellen zu geben. Es wird beispielsweise von dem c-Kit Liganden, der eine kleine Zahl an reifen Zellen stimuliert, angenommen, dass er hinsichtlich der Erneuerung und der Entwicklung von Stammzellen wichtiger ist als IL-3, der die Proliferation von vielen reifen Zellen stimuliert (siehe oben).

Vor dieser hier vorliegenden Beschreibung gab es keine Berichte über Wachstumsfaktoren, die exklusiv Stammzellen in Abwesenheit eines Effektes auf reife Zellen stimulieren. Die Entdeckung von solchen Wachstumsfaktoren ist von besonderer Bedeutung.

Wie oben erwähnt, ist c-Kit eine Proteintyrosinkinase (pTK). Es wird zunehmend deutlich, dass die Proteintyrosinkinasen eine wichtige Rolle als zelluläre Rezeptoren für hämopoetische Wachstumsfaktoren spielen. Andere Rezeptor pTKs umfassen die Rezeptoren für den Koloniestimulierenden Faktor 1 (CSF-1) und PDGF.

Rosnet et al., Genomics 9 (1991), 380-385 bezieht sich auf die Isolierung und chromosomale Lokalisierung eines FMS-ähnlichen Tyrosinkinasegens. Das als FLT3 bezeichnete Gen wurde erzielt durch das Screening einer menschlichen Testis-cDNA Bibliothek mit einem FMS-Fragment.

Nocka et al., EMBO J. 9 (1990), 3287-3294 bezieht sich auf einen Kandidaten für einen Liganden des transmembranösen c-Kit-Kinaserezeptors. Der Kandidatenligand wird als KL bezeichnet und stellt einen von Fibroplasten abstammenden Wachstumsfaktor dar, der Mastzellen und Erythrozyten-Vorläuferzellen stimuliert.

Rosnet et al., Oncogene 6 (1991), 1641-1650, was nach dem ersten Prioritätsdatum des vorliegenden Patentes veröffentlicht wurde, bezieht sich auf Maus-Flt3, was ein Gen ist, welches für einen Tyrosinkinaserezeptor der PDGFR/CSF1R Familie codiert.

Die pTK Familie kann durch die Gegenwart von verschieden konservierten Aminosäureregionen in der katalytischen Domäne erkannt werden. Diese konservierten Regionen wurden zusammengefasst von Hanks et al. in Science 241, 42-52 (1988), siehe die auf der Seite 46 beginnende Fig. 1, sowie von Wilks in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1603-1607 (1989), siehe Fig. 2 auf Seite 1605.

Zusätzliche Proteintyrosinkinasen, die Rezeptoren für hämopoetische Wachstumsfaktoren darstellen, sind notwendig, um effektiver die Selbsterneuerung der totipotenten, hämopoetischen Stammzellen zu stimulieren und um effektiver die Entwicklung von allen Zellen des hämopoetischen Systems sowohl in vitro als auch in vivo zu stimulieren. Neue Rezeptoren für hämopoetische Wachstumsfaktoren, die nur auf undifferenzierten Stammzellen, aber nicht auf reifen Vorläuferzellen vorhanden sind, werden insbesondere gewünscht. Liganden für die neuen Rezeptoren sind auch erwünscht, um als hämopoetische Wachstumsfaktoren zu wirken. Nukleinsäuresequenzen, welche für die Rezeptoren und die Liganden codieren, sind notwendig, um rekombinante Rezeptoren und Liganden herzustellen.

Diese und andere Aufgaben, die für den Fachmann erkenntlich sind, wurden gelöst durch die Bereitstellung einer Rezeptorproteintyrosinkinase mit einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus (i) der in der Fig. 1a gezeigten Sequenz, (ii) funktionellen Äquivalenten von der in der Fig. 2 gezeigten Sequenz, welche eine Substitution, Addition oder Deletion der Sequenz von Fig. 1a enthalten, und (iii) Fragmente von jeder der zuvor erhaltenen Rezeptorproteintyrosinkinase-Aktivität. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Rezeptorproteintyrosinkinase der vorliegenden Erfindung die menschliche flk-2 oder die Maus flk-2. Ferner umfasst sind Nukleinsäuremoleküle, die für die Rezeptorproteintyrosinkinase codieren, sowie Vektoren, welche das Nukleinsäuremolekül umfassen, welches für die Rezeptorproteintyrosinkinase codiert, wobei der Vektor in einem Wirt kloniert werden kann und der Wirt ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Wirt ist. Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Antikörper bereit, der für die Rezeptorproteintyrosinkinase spezifisch ist. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines Antikörpers für die Herstellung eines Medikamentes zur Stimulierung der Proliferation und/oder der Differenzierung von undifferenzierten hämopoetischen Säugetierstammzellen und stellt ferner ein in vitro Verfahren für die Stimulierung der Proliferation und/oder Differenzierung von undifferenzierten hämopoetischen Säugetierstammzellen unter Verwendung der Antikörper bereit.

Die Fig. 1a.1-1a.3 zeigt die cDNA- und die Aminosäuresequenzen von der Maus flk-2. Die entsprechenden Aminosäurereste sind direkt unter den Nukleotiden im offenen Leseraster angezeigt. Die Aminosäuren 1-27 stellen die hydrophobe Leadersequenz dar. Die Aminosäuren 28-544 stellen die extrazelluläre Rezeptordomäne dar. Die Aminosäuren 545-564 stellen die transmembranöse Region dar. Die verbleibenden Aminosäuren stellen die intrazelluläre, katalytische Domäne dar. Die folgenden Aminosäurereste in der intrazellulären Domäne sind katalytische Sub-Domänen, welche von Hanks (siehe oben) identifiziert wurden: 545-564, 618-623, 811-819, 832-834, 857-862, 872-878. Die Sequenz bei den Resten 709-785 ist eine kennzeichnende Sequenzcharakteristik von flk-2. Die Proteintyrosinkinasen haben allgemein eine kennzeichende Sequenz in diesem Abschnitt.

Die Fig. 1b zeigt die cDNA- und die Aminosäuresequenzen eines Teils der Menschen flk-2 von der extrazellulären Domäne. Die Aminosäuren 1-110 der Menschen flk-2 entsprechen den Aminosäuren 43-152 der Maus flk-2.

Die Fig. 1c zeigt die cDNA- und die Aminosäuresequenzen eines Abschnitts der Menschen flk-2 von der intrazellulären (Kinase) Domäne. Die Aminosäuren 1-94 der Menschen flk- 2 entsprechen den Aminosäuren 751-849 der Maus flk-2.

Die Fig. 2-2.3 zeigt die cDNA- und die Aminosäuresequenzen von flk-1. Die Aminosäurereste 763-784 stellen die transmembranöse Region von flk-1 dar.

Die Fig. 3 zeigt die zeitliche Reaktion der Bindung zwischen einer Maus-Stromazelllinie (2018) und APtag-flk-2 sowie APtag-flk-1.APtag ohne Rezeptor (SEAP) wird als Kontrolle verwendet. Siehe Beispiel 8.

Die Fig. 4 zeigt die Dosisreaktion der Bindung zwischen Stromazellen (2018) und APtag- flk-2 sowie APtag-flk-1.APtag ohne Rezeptor (SEAP) wird als Kontrolle verwendet. Siehe Beispiel 8.

Rezeptoren

Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein isoliertes Säugetier- Nukleinsäuremolekül, das für eine Rezeptorproteintyrosinkinase codiert, die in undifferenzierten, hämopoetischen Säugetierzellen exprimiert wird und nicht in reifen, hämopoetischen Zellen.

Das Nukleinsäuremolekül kann ein DNA-, ein cDNA- oder ein RNA-Molekül sein. Säugetiere, bei denen das Nukleinsäuremolekül existiert, kann jedes Säugetier sein, wie Maus, Ratte, Kaninchen oder der Mensch.

Das Nukleinsäuremolekül codiert eine Proteintyrosinkinase (pTK). Mitglieder der pTK- Familie können durch die konservierten Aminosäureregionen in den katalytischen Domänen erkannt werden. Beispiele für pTK Consensussequenzen wurden bereitgestellt durch Hanks et al. in Science 241, 42-52 (1988), siehe insbesondere Fig. 1, die auf Seite 46 beginnt, und durch Wilks in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1603-1607 (1989), siehe insbesondere Fig. 2 auf Seite 1605. Ein Methioninrest an der Position 205 in der konservierten Sequenz WMAPES ist charakteristisch für pTKs, die Rezeptoren sind.

Der Artikel von Hanks et al. identifiziert elf katalytische Subdomänen, welche pTK Consensusreste und -sequenzen enthalten. Die pTKs der vorliegenden Erfindung werden die meisten oder alle dieser Consensusreste und -sequenzen besitzen. Einige besonders stark konservierte Reste und Sequenzen sind in der Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1 Konservierte feste und Sequenzen in pTKs¹

1) siehe Hanks et al., Science 241, 42-52 (1988); 2) eingestellt gemäß Hanks et al., Id.

Ein pTK der vorliegenden Erfindung kann alle dreizehn dieser hochkonservierten Reste und Sequenzen enthalten. Als Ergebnis von natürlichen oder synthetischen Mutationen können die pTKs der vorliegenden Erfindung weniger als alle dreizehn, stark konservierten Reste und Sequenzen enthalten, wie 11, 9 oder 7 von solchen Sequenzen.

Die Rezeptoren gemäß der Erfindung gehören im allgemeinen zu der gleichen Klasse von pTK Sequenzen, zu denen c-Kit gehört. Es wurde überraschenderweise jedoch entdeckt, dass eine neue funktionelle Klasse von Rezeptor pTKs existiert. Diese neue funktionelle Klasse der Rezeptor p TKs wird in undifferenzierten hämopoetischen Zellen exprimiert, aber nicht in reifen hämopoetischen Zellen.

Für den Zweck dieser Beschreibung ist eine undifferenzierte hämopoetische Zelle totipotent, d. h. sie ist in der Lage, in vivo alle hämopoetischen Blutzellen herzustellen. Eine reife hämopoetische Zelle ist nicht selbsterneuernd und hat nur eine begrenzte proliferative Kapazität, d. h. eine beschränkte Fähigkeit zur Erzeugung von multiplen Zelllinien. Reife hämopoetische Zellen sind für die Zwecke dieser Beschreibung im allgemeinen in der Lage, nur zwei oder drei Zelllinien in vitro oder in vivo zu erzeugen.

Es sollte verstanden sein, dass das hämopoetische System komplex ist und viele Zwischenzellen zwischen der undifferenzierten, totipotenten, hämopoetischen Stammzelle und den ganz fixierten, reifen, hämopoetischen Zellen, wie oben definiert, enthält. Die Stammzelle entwickelt sich in zunehmend reifere, auf den Stammbaum beschränkte Zellen und verliert so ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung.

Die Rezeptoren der vorliegenden Erfindung können in diesen Zwischenzellen exprimiert werden oder nicht. Die notwendige und ausreichende Bedingung, welche Mitglieder der neuen Klasse an Rezeptoren definiert, besteht darin, dass diese Mitglieder in den undifferenzierten, totipotenten Stammzellen oder Zellen vorhanden sind, aber nicht in reifen Zellen, die auf eine oder höchstens zwei Abstammungslinien beschränkt sind.

Die Rezeptor pTK gemäß der vorliegenden Erfindung wird als fetale Leberkinase 2 (flk-2) gemäß dem Organ, in dem sie gefunden wurde, bezeichnet. Es gibt annähernd eine totipotente Stammzelle pro 10&sup4; Zellen in der fetalen Mäuseleber im mittleren Schwangerschaftsstadium (Tag 14). Zusätzlich zu der fetalen Leber wird flk-2 auch in der fetalen Milz, im fetalen Thymus, im adulten Gehirn und im adulten Knochenmark exprimiert.

flk-2 wird beispielsweise in individuellen, multipotenten CFU-Stammkolonien exprimiert, die zur Erzeugung von zahlreichen Multistammbaum-Kolonien nach erneuter Ausplattierung in der Lage sind. Es ist somit wahrscheinlich, dass flk-2 in dem gesamten undifferenzierten (d. h. selbsterneuernden) Abschnitt der hämopoetischen Hierarchie exprimiert wird. Diese Entdeckung stimmt damit überein, dass flk-2 für die Übertragung von mutmaßlichen Signalen für die Selbsterneuerung aus der Umgebung wichtig ist.

Es ist besonders relevant, dass die Expression der flk-2 mRNA in der am stärksten undifferenzierten Thymuszellen-Untergruppe auftritt. Selbst in zwei stark miteinander verbundenen, unreifen Untergruppierungen, die hinsichtlich der Expression des IL-2 Rezeptors unterschiedlich sind, spaltet sich die flk-2 Expression zu der mehr undifferenzierten Untereinheit, der ein IL-2 Rezeptor fehlt, auf. Es wird angenommen, dass die früheste Thymuszellen- Untergruppierung nicht fixiert ist. Somit können die Thymuszellen, welche flk-2 exprimieren, multipotent sein. flk-2 ist die erste Rezeptorproteintyrosinkinase, von der bekannt ist, dass sie in der T-Lymphozyten-Stammbaumlinie exprimiert wird.

Die fetale Leber mRNA wandert auf Formaldehyd-Agarosegelen relativ zu den 285 und 185 ribosomalen Banden zu etwa 3,5 kb, wobei das Botschaftermolekül aus dem Gehirn deutlich größer ist. In adulten Geweben wandert die flk-2 mRNA aus dem Gehirn und aus dem Knochenmark zu etwa 3,5 kb.

Ein zweiter pTK Rezeptor, der nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, wird auch beschrieben. Dieser zweite Rezeptor, der als fetale Leberkinase 1 (flk-1) bezeichnet wird, ist nicht ein Mitglied der gleichen Klasse von Rezeptoren wie flk-2, da flk-1 in etwas reiferen, hämopoetischen Zellen gefunden werden kann. Die Aminosäuresequenz von flk-1 wird in der Fig. 1 wiedergegeben.

Die DNA-Sequenz von flk-1 ist auch in der Fig. 2 angegeben. flk-1 kann in den gleichen Organen wie flk-2 gefunden werden sowie in fetalem Gehirn, Magen, Niere, Lunge, Herz und Darm sowie in adulter Niere, Herz, Milz, Lunge, Muskel und Lymphknoten.

Die Rezeptorproteintyrosinkinase gemäß der Erfindung kann in einfach aufzufindende Domänen aufgeteilt werden. Die DNA-Sequenz, welche pTK entspricht, codiert am Beginn an ihrem 5'-Ende für eine hydrophobe Leader-Sequenz, gefolgt von einer hydrophilen, extrazellulären Domäne, die an einen spezifischen Liganden bindet und dadurch aktiviert wird. Sofort stromabwärts von der extrazellulären Rezeptordomäne folgt eine hydrophobe, transmembranöse Region. Die transmembranöse Region wird sofort gefolgt von einer basischen, katalytischen Domäne, die einfach durch Hinweis auf die Artikel von Hanks et al. und Wilks, die oben diskutiert wurden, identifiziert werden kann.

Die vorliegende Erfindung umfasst die extrazelluläre Rezeptordomäne, der die Transmembranregion und die katalytische Domäne fehlt. Vorzugsweise wird die hydrophobe Leader-Sequenz auch von der extrazellulären Domäne entfernt. Im Falle von flk-2 umfasst die hydrophobe Leader-Sequenz die Aminosäuren 1-27.

Diese Regionen und Domänen können einfach visuell von Fachleuten identifiziert werden, in dem die Aminosäuresequenz einer angenommenen pTK mit der von bekannten pTKs verglichen wird. Die Transmembranregion von flk-2, welche die extrazelluläre Rezeptordomäne von der katalytischen Domäne trennt, wird beispielsweise codiert von den Nukleotiden 1663 (T) bis 1722 (C), wie dies in der Fig. 1 dargestellt ist. Diese Nukleotide entsprechen den Aminosäureresten 545 (Phe) bis 564 (Cys). Die Aminosäuresequenz zwischen der Transmembranregion und der katalytischen Subdomäne (Aminosäuren 618-623), die von Hanks et al. als Subdomäne I identifiziert wurde (d. h. GXGXXG), ist charakteristisch für Rezeptorproteintyrosinkinasen.

Die extrazelluläre Domäne kann auch mittels allgemein anerkannter Kriterien für extrazelluläre Aminosäuresequenzen identifiziert werden. Die Bestimmung der geeigneten Kriterien ist für Fachleute ein bekanntes Verfahren und wurde beispielsweise beschrieben von Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824-3828 (1981); Kyte et al., J. Mol. Biol. 157 105- 132 (1982); Emini, J. Virol. 55, 836-839 (1985); Jameson et al., CA. BIOS 4 181-186 (1988) und Karplus et al., Naturwissenschaften 72, 212-213 (1985). Die durch diese Kriterien vorgegebenen Aminosäuredomänen sind oberflächenexponierte Eigenschaften der extrazellulären Domänen.

Wie weiter unten im Detail diskutiert wird, kann das Nukleinsäuremolekül, welches für den Rezeptor nach der Erfindung codiert, in bekannte Vektoren für die Verwendung bei rekombinanten DNA-Standardtechniken eingesetzt werden. Rekombinante DNA-Standardtechniken sind solche, die beschrieben sind von Sambrock et al., "Molecular Cloning", zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und von Ausubel et al., Hrsg., "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley-Intersciences, New York (1987). Die Vektoren können ringförmig (d. h. Plasmide) oder nicht ringförmig sein. Standardvektoren sind für das Klonieren und die Expression in einem Wirt verfügbar. Der Wirt kann ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Wirt sein. Ein prokaryotischer Wirt ist vorzugsweise E. coli. Bevorzugte eukaryotische Wirte umfassen Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen. Bevorzugte Säugetierzellen umfassen beispielsweise CHO, COS und menschliche Zellen.

Antikörper

Die Erfindung umfasst auch Antikörper, die an die Rezeptor pTK nach der Erfindung binden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stimulieren die Antikörper zusätzlich zu ihrer Bindung die Proliferation von zusätzlichen undifferenzierten Stammzellen, die Differenzierung in reifere Vorläuferzellen oder beides. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Antikörper die Spezifität für den extrazellulären Abschnitt einer Rezeptorproteintyrosinkinase gemäß der Erfindung.

Der Antikörper kann auch ein Molekül sein, der nicht in natürlicher Weise in einem Säugetier vorkommt. Antikörper, vorzugsweise monoclonale, welche gegen die Rezeptoren nach der Erfindung geschaffen wurden oder gegen Anti-Liganden-Antikörper, ahmen die Form von Liganden nach und wirken als Liganden, wenn sie das Negativbild der Rezeptor- oder der Anti- Liganden-Antikörper-Bindungsstelle darstellen.

Gemäß einer anderen Ausführungsform werden Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, welche für die Antikörper nach der Erfindung kodieren. Das Nukleinsäuremolekül kann RNA, DNA oder cDNA sein. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Antikörpers für die Herstellung eines Medikamentes für die Stimulierung der Proliferation und/oder der Differenzierung von undifferenzierten, hämopoetischen Säugetierzellen.

Stimulierung der Proliferation von Stammzellen

Die Erfindung stellt ferner ein in vitro Verfahren für die Stimulierung der Proliferation und/oder der Differenzierung von undifferenzierten, hämopoetischen Säugetierstammzellen, wie oben definiert, bereit. Das Verfahren umfasst den Kontakt der Stammzellen mit einem Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung.

Der Antikörper kann auch verwendet werden für die Herstellung eines Medikamentes für die Stimulierung der Proliferation und/oder der Differenzierung von undifferenzierten, hämopoetischen Stammzellen in vivo.

Die Fähigkeit eines Liganden gemäß der Erfindung zur Stimulierung der Proliferation der Stammzellen in vitro und in vivo hat bedeutende therapeutische Anwendungsmöglichkeiten. Solche Anwendungen umfassen die Behandlung von Säugetieren, einschließlich des Menschen, deren undifferenzierte Stammzellen keiner ausreichenden Selbsterneuerung unterliegen. Beispiele für solche medizinischen Probleme umfassen solche, die auftreten, wenn Defekte in den hämopoetischen Stammzellen oder ihren entsprechenden Wachstumsfaktoren die Zahl der weißen Blutzellen reduzieren. Beispiele für solche medizinischen Probleme umfassen die Anämie, wie die makrozytische und die aplastische Anämie. Knochenmarksschäden, die von einer Krebschemotherapie und Bestrahlung abstammen, sind ein weiteres Beispiel für ein medizinisches Problem, dem mit den Stammzellfaktoren nach der Erfindung geholfen werden könnte.

Funktionelle Äquivalente

Die Erfindung umfasst funktionelle Äquivalente des pTK Rezeptors, der Rezeptordomänen und der oben beschriebenen Antikörper sowie der Nukleinsäuresequenzen, welche diese codieren. Ein Protein wird als ein funktionelles Äquivalent eines anderen Proteins für eine spezifische Funktion angesehen, wenn das äquivalente Protein immunologisch mit den Rezeptoren und den Antikörpern der Erfindung kreuzreagiert und die gleiche Funktion wie diese Rezeptoren und Antikörper nach der Erfindung hat. Das Äquivalent kann beispielsweise ein Fragment des Proteins oder einer Substitutions-, Additions- oder Deletionsmutante des Proteins sein.

Es ist beispielsweise möglich, die Aminosäuren in einer Sequenz durch äquivalente Aminosäuren zu ersetzen. Gruppen von bekannten Aminosäuren, die normalerweise äquivalent sind, sind die folgenden:

Die Substitutionen, Additionen und/oder Deletionen in den Rezeptoren und den Antikörpern können hergestellt werden, sofern die erzielten, äquivalenten Rezeptoren und Antikörper immunologisch kreuzreagieren mit, und die gleiche Funktion haben wie die nativen Rezeptoren und die Antikörper.

Die äquivalenten Rezeptoren und Antikörper werden normalerweise im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die nativen Rezeptoren und Antikörper haben. Eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen mit einer anderen Sequenz gleich ist, aber aufgrund von einer oder mehreren Substitutionen, Additionen und/oder Deletionen von der anderen Sequenz unterschiedlich ist, wird als eine äquivalente Sequenz betrachtet. Es werden vorzugsweise weniger als 25%, mehr bevorzugt sind 10% und am meisten bevorzugt sind weniger als 5% der Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz der nativen Rezeptoren und Antikörper substituiert, addiert oder deletiert.

Äquivalente Nukleinsäuremoleküle umfassen Nukleinsäuresequenzen, die für äquivalente Rezeptoren und Antikörper, wie oben definiert, codieren. Äquivalente Nukleinsäuremoleküle umfassen auch Nukleinsäuresequenzen, die von nativen Nukleinsäuresequenzen in solch einer Weise unterschiedlich sind, dass sie die entsprechende Aminosäuresequenzen nicht beeinflussen.

Isolierung von Nukleinsäuremolekülen und Proteinen Isolierung von Nukleinsäuremolekülen, die für Rezeptoren codieren

Um Nukleinsäuremoleküle, die für Säugetier-Stammzellrezeptoren codieren, herzustellen, wird eine Quelle für Stammzellen bereitgestellt. Geeignete Quellen umfassen fetale Leber-, Milz- oder Thymuszellen oder adulte Knochenmarks- oder Gehirnzellen. Geeignete fetale Leberzellen von der Maus können beispielsweise am 14. Tag der Schwangerschaft erzielt werden. Fetale Thymuszellen von der Maus können am Tag 14-18, vorzugsweise am 15. Tag der Schwangerschaft erzielt werden. Geeignete fetale Zellen von anderen Säugetieren werden zu Schwangerschaftszeitpunkten erzielt, die denen der Maus entsprechen.

Die Gesamt-RNA wird mittels Standardverfahren aus dem Gewebe, welches den Stammzell-Rezeptor enthält, isoliert. Die Gesamt-RNA wird für die cDNA-Synthese verwendet. Standardverfahren für die Isolierung von RNA und für die Synthese von cDNA sind in Standardhandbüchern der Molekularbiologie beschrieben, wie beispielsweise in Sambrook et al., "Molecular Cloning", zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und in Ausubel et al., (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Associates/Wiley Interscience, New York (1990).

Die cDNA des Rezeptors wird durch bekannte Verfahren amplifiziert. Die cDNA kann als ein Templat für die Amplifikation mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet werden, siehe Saiki et al., Science, 239, 487 (1988) oder Mullis et al., U.S.-Patent 4 683 195. Die Sequenzen für die Oligonukleotidprimer für die PCR-Amplifikation stammen von Sequenzen von bekannten Rezeptoren ab, wie von den in der Fig. 1 gezeigten Sequenzen für flk-2. Die Oligonukleotide werden durch bekannte Verfahren synthetisiert. Geeignete Verfahren umfassen solche, die von Caruthers in Science 230, 281-285 (1985) beschrieben wurden.

Um die gesamten Protein codierenden Regionen für die Rezeptoren nach der Erfindung zu isolieren, ist das stromaufwärts liegende Oligonukleotid komplementär zu der Sequenz am 5'-Ende und umfasst vorzugsweise das ATG-Startcodon und wenigstens 5-10 Nukleotide, die stromaufwärts von dem Startcodon liegen. Das stromabwärts liegende Oligonukleotid ist komplementär zu der Sequenz an dem 3'-Ende und umfasst optional das Stoppcodon. Eine Mischung der stromaufwärts und stromabwärts liegenden Oligonukleotide wird bei der PCR- Amplifikation verwendet. Die Bedingungen werden für jedes einzelne Primerpaar gemäß den Standardverfahren optimiert. Das PCR-Produkt wird mit der Elektrophorese hinsichtlich der korrekten cDNA-Größe entsprechend zu der Sequenz zwischen den Primern analysiert.

Alternativ kann die codierende Region in zwei oder mehr überlappende Fragmente amplifiziert werden. Überlappende Fragmente werden so aufgebaut, dass sie einen Restriktionsort umfassen, der den Zusammenbau einer intakten cDNA von den Fragmenten erlaubt.

Die amplifizierte DNA, welche für die Rezeptoren nach der Erfindung codiert, kann in einem großen Bereich von Klonierungsvektoren in eine große Bandbreite von Wirtszellen repliziert werden. Die Wirtszelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Die DNA kann von natürlichen Quellen abstammen und wahlweise modifiziert werden oder sie kann insgesamt oder teilweise synthetisiert werden.

Der Vektor, in den die DNA eingesetzt wird, kann Segmente von chromosomalen, nicht- chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen umfassen. Die geeigneten prokaryotischen Klonierungsvektoren umfassen Plasmide von E. coli, wie colE1, pCR1, Bp R322, pMB9, pUC, pKSM und RP4. Prokaryotische Vektoren umfassen ferner Derivate von Phagen-DNA, wie M13 und andere filamentöse, einzelsträngige DNA-Phagen.

Isolierung der Rezeptoren

Die DNA, welche die Rezeptoren nach der Erfindung codiert, wird in einen geeigneten Vektor eingesetzt und in einem geeigneten, prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt exprimiert. Vektoren für die Expression von Proteinen in Bakterien, insbesondere E. coli, sind bekannt. Solche Vektoren umfassen die PATH-Vektoren, die beschrieben sind von Dieckmann and Tzagoloff in J. Biol. Chem. 250, 1513-1520 (1985). Diese Vektoren enthalten die DNA-Sequenzen, welche für die Anthranilatsynthetase (TrpE) codieren, wobei sich ein Polylinker an dem Carboxyende anschließt. Andere Expressions-Vektorsysteme basieren auf der beta-Galactosidase (pEX; lambda PL; Maltose-Bindungsprotein (pMAL) und der Glutathion-S-Transferase (pGST) - siehe Gene 67, 31 (1988) und Peptide Research 3, 167 (1990).

Für Hefe nützliche Vektoren sind verfügbar. Ein geeignetes Beispiel ist das 2 u Plasmid.

Ferner sind geeignete Vektoren zur Verwendung in Säugetierzellen bekannt. Solche Vektoren umfassen die gut bekannten Derivate von SV-40, Adenovirus, DNA-Sequenzen, die vom Retrovirus abstammen, sowie Vektoren, die von einer Kombination von Plasmid und Phagen-DNA abstammen.

Ferner sind im Stand der Technik eukaryotische Expressionsvektoren bekannt (z. B. P. J. Southern und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982); S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854-864 (1981); R. J. Kaufmann und P. A. Sharp, "Amplifikation and Expression of Sequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene", J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); R. J. Kaufmann und P. A. Sharp, Mol. Cell. Biol. 159 601-664 (1982); S. I. Scahill et al., "Expression And Characterization of The Product of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4654-4659 (1983); G. Urlaub und L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220, (1980).

Die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlichen Expressionsvektoren enthalten zumindest eine Expressionskontrollsequenz, die operativ mit der zu exprimierenden DNA-Sequenz oder dem Fragment verbunden ist. Die Kontrollsequenz wird in den Vektor eingefügt, um die Expression der klonierten DNA-Sequenz zu steuern und zu regulieren. Beispiele für nützliche Expressionskontrollsequenzen sind das lac-System, das trp-System, das tao-System, das tro- System, die Hauptoperator- und Promoterregionen von dem Lambda-Phagen, die Kontrollregion des fd-Hüllproteins, die glykolytischen Promotoren von der Hefe, z. B. der Promoter für die 3- Phosphoglyceratkinase, die Promotoren der sauren Hefephosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren der Alpha-Paarungsfaktoren bei der Hefe sowie Promotoren, die von Polyoma, Adenovirus, Retrovirus und Simianvirus abstammen, z. B. die frühen und späten Promotoren von SV40, sowie weitere Sequenzen, die für die Steuerung der Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und ihren Viren bekannt sind, oder Kombinationen davon.

Vektoren, welche die Rezeptor codierende DNA und Kontrollsignale enthalten, werden in eine Wirtszelle für die Expression des Rezeptors eingefügt. Einige nützliche Wirtszellen für diese Expression umfassen bekannte prokaryotische und eukaryotische Zellen. Einige geeignete, prokaryotische Wirte umfassen beispielsweise E. coli, wie E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI und E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, wie Bacillus subtilis und Streptomyces. Geeignete eukaryotische Zellen umfassen Hefe und andere Pilze, Insekten, tierische Zellen, wie COS-Zellen und CHO-Zellen, menschliche Zellen und pflanzliche Zellen in Gewebekultur.

Das menschliche Homologe zu dem Mausrezeptor, der oben beschrieben ist, wird mit einer ähnlichen Strategie isoliert. Die RNA, welche den Rezeptor codiert, wird aus menschlichen Zellen, die hinsichtlich undifferenzierten Stammzellen angereichert sind, erzielt. Geeignete menschliche Zellen umfassen fetale Milz-, Thymus- und Leberzellen und Nabelschnurblut sowie adulte Gehirn- und Knochenmarkszellen. Die menschlichen fetalen Zellen werden vorzugsweise an dem Tag der Schwangerschaft erzielt, der dem mittleren Schwangerschaftsstadium bei Mäusen entspricht. Die Aminosäuresequenz des menschlichen flk-2 Rezeptors sowie die Nukleinsäuresequenz, die dafür codiert, ist homolog zu der Aminosäure- und Nukleotidsequenz des Mausrezeptors.

Bei der vorliegenden Beschreibung wird die Sequenz eines ersten Proteins, wie ein Rezeptor oder ein Antikörper, oder ein Nukleinsäuremolekül, welches für dieses Protein codiert, als homolog zu einem zweiten Protein oder einem Nukleinsäuremolekül angesehen, wenn die Aminosäure- oder Nukleotidsequenz des ersten Proteins oder des ersten Nukleinsäuremoleküls zu wenigstens 30% homolog, vorzugsweise zu wenigstens etwa 50% homolog und mehr bevorzugt zu wenigstens etwa 65% homolog, zu den entsprechenden Sequenzen des zweiten Proteins oder des zweiten Nukleinsäuremoleküls ist. Im Falle von Proteinen mit einer hohen Homologie ist die Aminosäuresequenz oder die Nukleotidsequenz des ersten Proteins oder des ersten Nukleinsäuremoleküls zu wenigstens 75% homolog, vorzugsweise zu wenigstens 85% homolog und weiterhin bevorzugt zu wenigstens etwa 95% homolog, zu der Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz des zweiten Proteins oder des zweiten Nukleinsäuremoleküls.

Kombinationen von Maus-Oligonukleotidpaaren werden als PCR-Primer verwendet, um das menschliche Homologe von den Zellen zu amplifizieren und die Sequenzdivergenz zu berechnen. Das restliche Verfahren zur Erzielung des menschlichen flk-Homologen ist ähnlich zu dem oben beschriebenen Verfahren für die Erzielung des flk-2 Mausrezeptors. Die weniger als perfekte Homologie zwischen dem menschlichen flk-Homologen und den Maus-Oligonukleotiden wird bei der Bestimmung der Strenge der Hybridisierungsbedingungen berücksichtigt.

Assay für die Expression von Rezeptoren auf Stammzellen

Um die Expression des flk-2 Rezeptors auf der Oberfläche von undifferenzierten hämopoetischen Stammzellen zu zeigen, werden Antikörper, die den Rezeptor erkennen, erstellt. Der Rezeptor kann das gesamte Protein, wie es in der Natur existiert, oder ein antigenes Fragment des gesamten Proteins darstellen. Vorzugsweise umfasst das Fragment den vorhergesagten extrazellulären Abschnitt des Moleküls.

Antigene Fragmente können durch Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, identifiziert werden. Fragmente, die antigene Sequenzen enthalten, können auf Basis von allgemein akzeptierten Kriterien einer möglichen Antigenwirkung und/oder Belastung selektiert werden. Solche Kriterien umfassen die Hydrophilie und den relativen antigenen Index, wie dies durch Oberflächen-Expositionsanalyse der Proteine bestimmt wird. Die Bestimmung der geeigneten Kriterien ist für Fachleute bekannt und wurde beispielsweise beschrieben von Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824-3828 (1981); Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982); Emini, J. Virol. 55, 836-839 (1985); Jameson et al., CA BIOS 4, 181-186 (1988) und Karplus et al., Naturwissenschaften 72, 212-213 (1985). Die durch diese Kriterien als oberflächenexponiert vorhergesagten Aminosäuredomänen werden bevorzugt gegenüber Domänen selektiert, die als hydrophob oder versteckt prognostiziert werden.

Die Proteine und die Fragmente der Rezeptoren, die als Antigene verwendet werden, können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen die Isolierung oder die Synthese der DNA, welche die Proteine und die Fragmente codiert, sowie die Verwendung der DNA für die Herstellung von rekombinanten Proteinen, wie dies oben beschrieben wurde.

Die Fragmente der Proteine und die DNA, welche die Fragmente codiert, können chemisch durch bekannte Verfahren ausgehend von einzelnen Aminosäuren und Nukleotiden synthetisiert werden. Geeignete Verfahren für die Synthese von Proteinfragmenten sind beschrieben von Stuart und Young in "Solid Phase Peptide Synthesis", zweite Ausgabe, Pierce Chemical Company (1984). Geeignete Verfahren für die Synthese von DNA-Fragmenten sind beschrieben von Caruthers in Science 230, 281-285 (1985).

Wenn das Rezeptorfragment das Epitop definiert, aber zu kurz ist, um als Antigen zu wirken, kann es mit einem Trägermolekül verbunden werden, um Antikörper herzustellen. Einige geeignete Trägermoleküle umfassen das Napfschnecken-Hämocyanin, Ig-Sequenzen, TrpE, und Serumalbumin vom Menschen oder vom Rind. Die Konjugation kann durch bekannte Verfahren durchgeführt werden. Ein solches Verfahren besteht in der Kombination eines Cysteinrestes des Fragmentes mit einem Cysteinrest des Trägermoleküls.

Die Antikörper sind vorzugsweise monoklonal. Monoklonale Antikörper können durch Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Diese Verfahren umfassen das immunologische Verfahren, welches beschrieben ist von Köhler und Milstein in Nature 256, 495-497 (1975) und Campbell in "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hydridomas" in Burdon et al., Hrsg., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985), sowie das rekombinante DNA-Verfahren, das von Huse et al. in Science 246, 1275-1281 (1989) beschrieben ist.

Polyklonale oder monoklonale Antiseren, die mit Rezeptor-codierten, nativen Proteinen reaktiv sind, d. h. flk-2 codierte Proteine, die an der Oberfläche von lebensfähigen Zellen exprimiert werden, werden verwendet, um Antikörperpositive Zellen zu isolieren. Ein Verfahren für die Isolierung von solchen Zellen ist die Durchflusszytometrie, siehe z. B. Loken et al., Europäische Patentanmeldung 317 156. Die erzielten Zellen werden durch Transplantatakzeptanz in bestrahlundsabladierten Wirten mit Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, auf Stammzellen überprüft, siehe z. B. Jordan et al., Cell 61, 953-963 (1990).

Kriterien für neue Stammzell-Rezeptortyrosinkinasen, die in Stammzellen exprimiert werden

Weitere neue Rezeptortyrosinkinase-cDNAs werden durch Amplifikation von cDNAs aus Stammzellpopulationen unter Verwendung von Oligonukleotiden als PCR-Primer, wie oben dargestellt, erzielt. Beispiele für geeignete Oligonukleotide sind PTK1 und PTK2, die beschrieben wurden von Wilks et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1603-1607 (1989). Neue cDNA wird auf Basis eines differentiellen Hybridisierungsscreenings mit Proben, welche bekannte Kinasen darstellen, ausgewählt. cDNA-Klone, die nur mit einer geringen Stringenz hybridisieren, werden ausgewählt und sequenziert. Die Gegenwart des Aminosäure-Tripletts DFG bestätigt, dass die Sequenz eine Kinase darstellt. Der diagnostische Methioninrest in dem WMAPES Motiv zeigt, wie oben beschrieben, eine Rezeptor-ähnliche Kinase an. Die erzielten, potentiell neuen Sequenzen werden mit den verfügbaren Sequenzen unter Verwendung von Datenbanken, wie Genbank, verglichen, um die Einmaligkeit zu bestätigen. Genspezifische Oligonukleotide werden hergestellt, wie dies oben beschrieben wurde, auf Basis der erzielten Sequenzen. Die Oligonukleotide werden verwendet, um mit Stammzellen angereicherte und mit Stammzellen abgereicherte Populationen für die Expression zu analysieren. Solche Zellpopulationen sind bei Mäusen beschrieben, beispielsweise von Jordan et al. in Cell 61, 953-956 (1990); Ikuta et al. in Cell 62 863-864 (1990); Spangrude et al. in Science 241, 58-62 (1988) und Szilvassy et al. in Blood 74 930-939 (1989). Beispiele für solche menschlichen Zellpopulationen sind beschrieben als CD33 CD34 durch Andrews et al. im Journal of Experimental Medicine 169, 1721-1731 (1989). Andere menschliche Stammzellpopulationen wurden beispielsweise beschrieben in Civin et al., Europäische Patentanmeldung 395 355, und in Loken et al., Europäische Patentanmeldung 317 156.

Beispiele

Anmerkung: flk-1 ist nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1. Zellen, die flk-1 und flk-2 Liganden der Maus enthalten. Stroma-Mauszelllinie 2018.

Um Stromazelllinien zu etablieren, werden fetale Leberzellen mit Kollagen aufgeschlossen und wachsen in einer Mischung von "Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)" und 10% hitzeinaktiviertem, fetalem Kälberserum bei 37ºC. Die Zellen wurden mit bekannten Verfahren unsterblich gemacht. Ein geeignetes Verfahren beinhaltet die Einführung von DNA, welche für eine Wachstums-regulierende oder Onkogen-codierende Sequenz codiert, in die Zielwirtszelle. Die DNA kann mittels Transduktion in ein rekombinantes virales Partikel oder mittels Transfektion in ein Plasmid eingeführt werden, siehe z. B. Hammerschmidt et al., Nature 340, 393-397 (1989) und Abcouwer et al., Biotechnology 7, 939-946 (1989). Retroviren sind bevorzugte virale Vektoren, obgleich SV40 und Epstein-Barr-Virus auch als Geber für wachstumsfördernde Sequenzen dienen können. Ein geeigneter Retrovirus ist das ecotrope Retrovirus, welches ein Temperaturempfindliches SV40 T-Antigen (tsA58) und ein G418 Resistenzgen enthält, wie dies beschrieben ist von McKay in Cell 66, 713-729 (1991). Nach einigen Tagen bei 37ºC wird die Temperatur des Mediums auf 32ºC abgesenkt. Die Zellen werden mit G418 (0.5 mg/ml) selektiert. Die selektierten Zellen werden ausgebreitet und erhalten.

Eine Maus-Stromazelllinie, die durch dieses Verfahren hergestellt wurde, wird als 2018 bezeichnet und wurde am 30. Oktober 1991 hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC); Hinterlegungsnummer CRL 10907.

Beispiel 2. Zellen, die menschliche flk-1 und flk-2 Liganden enthalten.

Fetale Menschenleber (18, 20 und 33 Wochen nach Abort), Milz (18 Wochen nach Abort) oder Thymus (20 Wochen nach Abort) wurden zum Zeitpunkt des Aborts entfernt und auf Eis in einem Mineralsalzmedium gelagert. Nach Zerkleinerung in 1 mm Fragmente und nach Passieren durch ein Drahtgewebe wird das Gewebe einmal in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) gewaschen.

Das zerkleinerte Gewebe wird bei 200 · g für 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das erzielte Pellet wird in 10-20 ml einer Trypsin-EDTA-Lösung von Gewebekulturqualität (Flow Laboratories) resuspendiert. Das resuspendierte Gewebe wird in einen sterilen Kolben überführt und mit einem Rührstab bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. 1 ml eines hitzeinaktivierten, fetalen Kälberserums (Hyclone) wird bis zu einer Endkonzentration von 10% hinzugefügt, um die Trypsinaktivität zu hemmen. Kollagenase Typ IV (Sigma) wird aus einer Stammlösung (10 mg/ml in HBSS) bis zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml zugesetzt, um die Stromazellen zu zertrümmern. Das Gewebe wird bei Raumtemperatur für weitere 2,5 Stunden gerührt, durch Zentrifugation gesammelt (400 · g, 15 Minuten) und in "Stroma-Medium" resuspendiert, das die Iscove's Modifikation von DMEM enthält, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem, fetalem Kälberserunn, 5% hitzeinaktiviertem, menschlichem Serum (Sigma), 4 mM L-Glutamin, 1 · Natriumpyruvat (Stammlösung 100 x, Sigma), 1 · nicht-essentielle Aminosäure (Stammlösung 100 x, Flow) und eine Mischung von den folgenden Antibiotika: Kanamycin, Neomycin, Penicillin, Streptomycin. Vor der Resuspension des Pellets in dem Stroma-Medium wurde das Pellet einmal mit HBSS gewaschen. Es ist günstig, die Zellen in 60 ml Medium zu suspendieren. Die Zahl der Kulturen hängt von der Menge des Gewebes ab.

Beispiel 3. Isolierung der Stromazellen

Die resuspendierten Zellen (Beispiel 2), die bei 37ºC mit 5% Kohlendioxid inkubiert werden, beginnen sich an den Plastikschalen innerhalb von 10-48 Stunden anzuheften. Zusammenwachsende Einzelschichten wurden innerhalb von 7-10 Tagen in Abhängigkeit von der Zahl der Zellen beobachtet, die mit dem Anfangsinnokulum platiert wurden. Nicht-anhaftende und hoch zerbrechliche Zellen, die an der Stromazellschicht als Kolonien hängen, werden durch Pipettieren und Einfrieren separat entfernt. Die nicht-anhaftenden Zellen sind wahrscheinlich die Ursprünge von Populationen von sich selbst erneuernden Stammzellen, die flk-2 enthalten. Die anhaftenden Stromazellachichten wurden in Aliquots für zukünftige Studien eingefroren oder für das Wachstum in Kultur expandiert.

Ein unerwartet hohes Niveau an APtag-flk-2 Fusionsprotein, welches an den fetalen Milzzellen gebunden ist, wird beobachtet. Zwei fetale Milzlinien wuchsen in dem "Stromamedium", das im Beispiel 2 beschrieben ist.

Nicht-anhaftende fetale Stammzellen haften an den Stromazellen und bilden Kolonien (Kolonie-bildende Einheiten - CFU). Die Stromazellen und CFU werden mit sterilen Glaszylindern isoliert und in Kultur expandiert. Ein Klon, der Fsp 62891 genannt wird, enthält den flk-2 Liganden. Fsp 62891 wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. am 21. November 1991, Hinterlegungsnummer CRL 10935.

Fetale Leber- und fetale Thymuszellen werden in einer ähnlichen Weise hergestellt. Beide Zelltypen produzieren Liganden von flk-1 und im Falle der Leber auch etwas flk-2. Eine fetale Thymuszelllinie, genannt F.thy 62891, und eine fetale Leberzelllinie, genannt FL 62891, wurden hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. am 21. November 1991 bzw. 2. April 1992, Hinterlegungsnummer CRL 10936 bzw. CRL 11005.

Stabile menschliche Zellinien wurden aus den fetalen Zellen mit dem gleichen Temperaturempfindlichen, unsterblich machenden Virus hergestellt, der auch bei der Herstellung der Mauszelllinie, die im Beispiel 1 beschrieben ist, verwendet wurde.

Beispiel 4. Isolierung des menschlichen Stromazellklons

Hoch zerbrechliche Zellen wachsen über einigen Abschnitten der Stromazellen, da die Stromazellen wahrscheinlich Faktoren produzieren, welche eine Bildung von CFU erlauben. Um die Stromazellklone zu isolieren, werden sterile Glaszylinder, die mit Vakuumfett beschichtet sind, über die CFU angeordnet. Eine Trypsin-EDTA-Lösung (100 ml) wird hinzugefügt, um die Zellen abzulösen. Die Zellen werden zu 5 ml Stromamedium gegeben und jede (Klon) wird in einer einzelnen Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen platiert.

Beispiel 5. Plasmid (AP-taq) für die Expression einer sekretionsfähigen alkalischen Phosphatase (SEAP)

Plasmide, die eine sekretionsfähige alkalische Phosphatase exprimieren, sind beschrieben von Flanagan und Leder in Cell 63, 185-194 (1990). Die Plasmide enthalten einen Promoter, wie den LTR-Promoter, einen Polylinker, einschließlich Hind III und Bgl II, die SEAP codierende DNA, ein Poly-A Signal und das Ampicillin-Resistenzgen sowie einen Replikationsort.

Beispiel 6. Plasmid für die Expression von APtag-flk-2 und APtag-flk-1 Fusionsproteinen

Plasmide, welche Fusionsproteine von SEAP exprimieren, und die extrazellulären Teile von flk-1 oder flk-2 werden gemäß den Protokollen von Flanagan und Leder in Cell 63, 185-194 (1990) und Berger et al., Gene 66, 1-10 (1988) hergestellt. Ein Hind III-Bam HI Fragment, das den extrazellulären Anteil von flk-1 oder flk-2 enthielt, wird hergestellt und in den Hind III-Bgl II-Ort des im Beispiel 5 beschriebenen Plasmides eingesetzt.

Beispiel 7. Herstellung des APtag-flk-1 oder des -flk-2 Fusionsproteins

Die Plasmide vom Beispiel 6 werden mit DEAE-Dextran (wie beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, Unit 16.13, "Transient Expression of Proteins Using Cos Cells", 1991) in Cos-7 Zellen transfiziert und mit einem selektierbaren Marker, wie pSV7neo, durch Kalziumniederschlag in NIH/3T3-Zellen cotransfiziert. Die NIH/3T3-Zellen werden mit 600 ug/ml G418 in 100 mm Platten selektiert. Über 300 Klone werden hinsichtlich der Sekretion von plazentaler alkalischer Phosphataseaktivität entdeckt. Dieser Test wird durch Erhitzen eines Teils des Überstandes auf 65ºC für 10 Minuten durchgeführt, um die Phosphataseaktivität im Hintergrund zu inaktivieren, wobei der OD&sub4;&sub0;&sub5;-Wert gemessen wird nach Inkubation mit 1 M Diethanolamin (pH 9,8), 0,5 mM MgCl&sub2;, 10 mM L-Homoarginin (ein Phosphatase-Inhibitor), 0,5 mg/ml BSA und 12 mM p-Nitrophenylphosphat. Menschliche, plazentale, alkalische Phosphatase wird verwendet, um eine Eichkurve zu erstellen. Die APtag-flk-1 Klone (F-1AP21-4) stellen bis zu 10 ug alkalische Phosphataseaktivität/ml her und die APtag-flk-2 Klone (F-2AP26-0) synthetisieren bis zu 0,5 ug alkalische Phosphataseaktivität/ml.

Beispiel 8. Assay für die APtag-flk-1 Bindung oder die APtag-flk-2 Bindung an Zellen

Die Bindung von APtag-flk-1 oder APtag-flk-2 an Zellen, welche den entsprechenden Liganden enthalten, wird mit Standardverfahren geprüft, siehe z. B. Flanagan und Leder, Cell 63: 185-194, 1990. Zellen (d. h. Maus-Stromazellen, menschliche fetale Leber-, Milz- oder Thymus- sowie verschiedene Kontrollzellen) wachsen zusammenfließend in Platten mit sechs Vertiefungen und werden mit HBHA gewaschen (Hanks Mineralsalzmedium mit 0,5 mg/ml BSA, 0,02% NaN&sub3;, 20 mM HEPES, pH 7,0). Die Überstände von transfizierten COS oder NIH/3T3-Zellen, die entweder das APtag-flk-1 Fusionsprotein, das APtag-flk-2 Fusionsprotein oder das APtag ohne einen Rezeptor (als Kontrolle) enthalten, werden den Zell-Monoschichten hinzugefügt und inkubieren für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einer Drehplattform. Die Konzentration des APtag-flk-1 Fusionsproteins, APtag-flk-2 Fusionsproteins oder von APtag ohne einen Rezeptor beträgt 60 ng/ml an alkalischer Phosphatase, wie dies mit einer alkalischen Phosphatase- Standardkurve (siehe oben) ermittelt wurde. Die Zellen werden dann sieben Mal mit HBHA gespült und in 350 ul von 1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) lysiert. Die Lysate werden in ein Mikrozentrifugationsröhrchen zusammen mit 150 ul der gleichen Lösung übertragen. Nach heftigem Schütteln werden die Proben für fünf Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, für zwölf Minuten auf 65ºC erhitzt, um die zellulären Phosphatasen zu inaktivieren, und, wie zuvor beschrieben, auf Phosphataseaktivität überprüft. Die Ergebnisse der Experimente, welche die Zeit- und Dosisreaktionen der Bindung zwischen den Stromazellen zeigen, welche die Liganden zu flk-2 und flk-1 (2018) und APtag-flk-2, APtag-flk-1 und APtag ohne Rezeptor (als eine Kontrolle) enthielten, sind in der Fig. 3 bzw. 4 dargestellt.

Beispiel 8A. Plasmide für die Expression von fLk-1/fms und flk-2/fms Fusionsproteinen

Plasmide, welche die Fusionsproteine der extrazellulären Abschnitte von flk-1 und flk-2 und die intrazellulären Abschnitte von c-fms (bekannt als Rezeptor für den Koloniestimulierenden Faktor-1) exprimieren, werden in einer ähnlichen Weise hergestellt, wie dies unter Beispiel 6 (Plasmid für die Expression der APtag-flk-2 und APtag-flk-1 Fusionsproteine) beschrieben wurde. Ein Hind III-Bam HI Fragment, das den extrazellulären Abschnitt von flk-1 oder flk-2 enthielt, wird hergestellt und in den Hind III-Bg II Ort eines pLH-Expressionsvektors eingefügt, der den intrazellulären Abschnitt von c-fms enthält.

8B. Expression von flk-1/fms oder flk-2/fms in 3T3-Zellen

Die Plasmide von Beispiel 11 wurden mittels Calcium in NIH//3T3-Zellen transfiziert. Der intrazelluläre Abschnitt von c-fms wird durch Western Blotting nachgewiesen.

Beispiel 9. Klonierung und Expression von cDNA, die für Mausliganden an flk-1 und flk-2 Rezeptoren codiert

cDNA, die für den Mausliganden für flk-1 und flk-2 exprimiert, wird mit bekannten Verfahren hergestellt, siehe beispielsweise Seed, B. und Aruffo, A. PNAS 84: 3365-3369, 1987; Simmons, D. und Seed, B. J., Immunol. 141: 2797-2800, und D'Andrea, A. D., Lodish, H. F. und Wong, G. G., Cell 57: 277-285, 1989).

Die Protokolle sind nachfolgend in der Reihenfolge aufgeführt: (a) RNA Isolierung; (b) Poly A RNA Herstellung; (c) cDNA Synthese; (d) cDNA Größenfraktionierung; (e) Vermehrung der Plasmide (Vektor); (f) Isolierung der Plasmid DNA; (g) Herstellung des Vektors pSV Sport (BRL Gibco) für die Klonierung; (h) Zusammenstellung der Puffer für die obigen Schritte; (i) Transfektion der cDNA, welche die Liganden in den Cos 7 Zellen codieren; (j) Panning-Verfahren; (k) Expressionsklonierung des flk-1 oder flk-2 Liganden durch Etablierung einer autokrinen Schleife.

9A. Guanidinthiocyanat/LiCl-Protokoll für die RNA-Isolierung

Für jeden ml der gewünschten Mischung wird 0,5 g Guanidinthiocyanat (GuSCN) in 0,55 ml 25% LiCl (Stammlösung, gefiltert durch einen 0,45 Mikronfilter) gelöst. 20 ul von Mercaptoethanol wird hinzugefügt. (Die erzielte Lösung ist nur für eine Woche bei Raumtemperatur zu verwenden.)

Die 2018 Stromazellen werden zentrifugiert und 1 ml der oben beschriebenen Lösung wird bis zu 5 · 10&sup7; Zellen hinzugefügt. Die Zellen werden mit einem Polytron geschert, bis die Mischung nicht mehr viskos ist. Für kleine Aufarbeitungen (< 10&sup8; Zellen) wird die gescherte Mischung auf 1,5 ml von 5,7 M CsCl geschichtet (RNase-frei; 1,26 g CsCl wird zu jeweils 10 mM EDTA, pH 8 hinzugefügt) und, falls notwendig, mit RNase-freiem Wasser überschichtet. Die Mischung wird in einem SW55-Rotor bei 50.000 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden zentrifugiert. Für große Aufbereitungen werden 25 ml der Mischung auf 12 ml CsCl in einem SW28-Röhrchen geschichtet und wie oben überlagert und bei 24.000 Umdrehungen pro Minute für acht Stunden zentrifugiert. Der Inhalt des Röhrchens wird vorsichtig mit einer sterilen Pasteurpipette, die mit einem Vakuumgefäß verbunden ist, aufgesaugt. Nachdem die CsCl-Zwischenschicht durchdrungen ist, wird eine Bande um das Röhrchen mit der Pipettenspitze abgekratzt, um ein Kriechen der Schicht an der Wand nach unten des Röhrchens zu verhindern. Die verbleibende CsCl-Lösung wird aufgesaugt. Das erzielte Pellet wird in Wasser aufgenommen, aber nicht gelöst. 1/10 Volumen an Natriumacetat und 3 Volumen Ethanol werden der Mischung zugesetzt und zentrifugiert. Das Pellet wird in Wasser bei 70ºC resuspendiert, falls notwendig. Die Konzentration wird auf 1 mg/ml eingestellt und die RNA wird eingefroren.

Es sei angemerkt, dass kleine RNA-Moleküle (z. B. 5S) nicht sedimentieren. Für kleine Zellmengen werden die Volumen entsprechend reduziert und die Mischung wird mit GuSCH in RNase-freiem Wasser auf einem Gradienten überschichtet (der Niederschlag ist nicht effizient, wenn die RNA verdünnt ist).

9b. Poly A&supmin; RNA-Herstellung

(Alle erwähnten Puffer sind unten getrennt zusammengestellt.)

Eine Einmal-Polypropylensäule wird vorbereitet durch Waschen mit 5M NaOH und Spülen mit RNase-freiem Wasser. Für jedes Milligramm an Gesamt-RNA werden 0,3 ml (gepacktes Endbett) an Oligo dT-Zellulose zugefügt. Die Oligo dT-Zellulose wird vorbereitet durch Resuspendieren von etwa 0,5 ml Trockenpulver in 1 ml 0,1 M NaOH und anschließender Übertragung in die Säule, oder durch Durchsickern von 0,1 M NaOH durch eine zuvor verwendete Säule. Die Säule wird dann mit mehreren Säulenvolumen an RNase-freiem Wasser gewaschen, bis der pH neutral ist. Anschließend erfolgt die Spülung mit 2-3 ml an Ladepuffer. Das Säulenbett wird auf ein steriles 15 ml Röhrchen unter Verwendung von 4-6 ml Ladepuffer übertragen.

Die Gesamt-RNA aus der 2018-Zelllinie wird für 2-3 Minuten auf 70ºC erhitzt. LiCl von einer RNase-freien Stammlösung wird der Mischung bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugesetzt. Die Mischung wird mit der Oligo dT-Zellulose in dem 15 ml Röhrchen kombiniert, welches dann für 10 Minuten geschüttelt oder gerührt wird. Die Mischung wird auf die Säule gegossen und mit 3 ml Ladepuffer gewaschen und dann mit 3 ml mittlerem Waschpuffer. Die mRNA wird direkt in ein SW55-Röhrchen mit 1,5 ml 2 mM EDTA und 0,1% SDS eluiert, wobei die ersten zwei oder drei Tropfen verworfen werden.

Die eluierte mRNA wird durch Zugabe von 1/10 Volumen an 3M Natriumacetat und Auffüllen des Röhrchens mit Ethanol gefällt. Der Inhalt des Röhrchens wird gemischt, für 30 Minuten bei -20ºC gefroren und dann bei 50.000 Umdrehungen pro Minute bei 5ºC für 30 Minuten zentrifugiert. Nach Abschütten des Ethanols und Lufttrocknung des Röhrchens wird das mRNA-Pellet in 50-100 ul RNase-freiem Wasser resuspendiert. 5 ul der resuspendierten mRNA wird auf 70ºC in MOPS/EDTA/Formaldehyd erhitzt und auf einem RNase-freien 1% Agarosegel überprüft.

9c. cDNA-Synthese

Das verwendete Protokoll ist eine Variation des Verfahrens, das beschrieben ist von Gubler und Hoffman in Gene 25, 263-270 (1983).

1. Erster Strang. 4 ug mRNA wird zu einem Mikrozentrifugationsröhrchen zugegeben, für 30 Sekunden auf etwa 100ºC erhitzt und auf Eis abgeschreckt. Das Volumen wird mit 70 ul RNAse-freiem Wasser eingestellt. 20 ul RT1-Puffer, 2 ul RNAse-Inhibitor (Boehringer 36 U/ul, 1 ul von 5 ug/pl von Oligo dT (Collaborative Research), 2,5 ul von 20 mM dXTP's (ultrarein - US Biochemicals), 1 ul von 1 M DTT und 4 ul von RT-XL (Life Sciences, 24 U/ul) werden zugesetzt. Die Mischung wird bei 42ºC für 40 Minuten inkubiert und dann durch Erhitzen für 10 Minuten auf 70ºC inaktiviert.

2. Zweiter Strang. 320 pl von RNAse-freiem Wasser, 80 ul von RT2-Puffer, 5 ul von DNA- Polymerase I (Boehringer, 5 U/ul), 2 ul RNAse H (BRL 2 U/ul) werden zu der Lösung, welche den ersten Strang enthält, hinzugefügt. Die Lösung wird für eine Stunde bei 15ºC inkubiert und dann bei 22ºC eine weitere Stunde. Nach Hinzugabe von 20 ul von 0,5 M EDTA, pH 8,0, wird die Lösung mit Phenol extrahiert und durch Zugabe von NaCl zu 0,5 M linearem Polyacrylamid (Träger) bis zu 20 ug/ml gefällt. Das Röhrchen wird dann mit EtOH gefüllt. Das Röhrchen wird für 2-3 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, geschüttelt, um von der Wand des Röhrchens gefälltes Material zu entfernen und dann wieder für 1 Minute zentrifugiert.

3. Adaptoren. Adaptoren stellen spezifische Restriktionsorte bereit, um das Klonieren zu erleichtern und sind verfügbar von BRL Gibco, New England Biolabs, etc. Rohadaptoren werden bei einer Konzentration von 1 ug/ul resuspendiert. MgSO&sub4; wird bis zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzugefügt, gefolgt von fünf Volumen an Ethanol. Der erzielte Niederschlag wird mit 70% Ethanol gewaschen und dann in TE bis zu einer Konzentration von 1 ug/ul resuspendiert. Für die Kinase werden 25 ul der resuspendierten Adaptoren zu 3 ul an 10X Kinasepuffer und 20 Einheiten Kinase zugegeben. Die Mischung wird über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die gefällte cDNA wird in 240 ul TE (10/1) resuspendiert. Nach Zugabe von 30 ul von 10X Niedrigsalzpuffer, 30 ul von 10X Ligationspuffer mit 0,1 mM ATP, 3 ul (2,4 ug) 12-mer Adaptorsequenz mit Kinase, 2 ul (1,6 ug) an 8-mer Adaptorsequenz mit Kinase und 1 ul T4 DNA-Ligase (BioLabs, 400 U/ul, oder Boehringer, 1 Weiss-Einheit ml) wird die Mischung über Nacht bei 15ºC inkubiert. Die cDNA wird mit Phenol extrahiert und, wie oben dargestellt, gefällt, wobei aber der Extraträger weggelassen wird, und anschließend in 100 ul TE resuspendiert.

9d. cDNA-Größenfraktionierung

Eine 20% KOAc, 2 mM EDTA, 1 ug/ml Ethidiumbromid-Lösung und eine 5% KOAc, 2 mM EDTA, 1 ug/ml Ethidiumbromid-Lösung werden vorbereitet. 2,6 ml der 20% KOAc-Lösung wird zu der hinteren Kammer eines kleinen Gradientenmischers hinzugefügt. Die Luftblasen werden aus den die zwei Kammern verbindenden Röhrchen entfernt, indem die 20% Lösung in die vordere Kammer strömt und anschließend durch Kippen des Gradientenmischers zurück in die hintere Kammer fließt. Der Durchgang zwischen den Kammern wird geschlossen und 2,5 ml der 5% Lösung werden in die vordere Kammer gegeben. Jede Flüssigkeit in der Leitung aus einem vorherigen Lauf wird entfernt, indem die 5% Lösung zu einem Ende der Leitung strömt und dann wieder zu ihrer Kammer zurückkehrt. Das Gerät wird auf eine Rührplatte angeordnet und unter heftigem Rühren wird der obere Hahn, der die zwei Kammern miteinander verbindet, und der vordere Stockhahn geöffnet. Ein Polyallomer 5W55-Röhrchen wird vom Boden aus mit der KOAc- Lösung gefüllt. Der Gradient wird mit 100 ul der cDNA-Lösung überschichtet und dann bei 50.000 Umdrehungen pro Minute bei 22ºC zentrifugiert. Um die Fraktionen aus dem Gradienten zu sammeln, wird das SW55-Röhrchen nahe am Boden des Röhrchens mit einem Flügelinfusionsset (mit abgeschnittener Luernabe durchbohrt). Drei 0,5 ml Fraktionen und anschließend sechs 0,25 ml Fraktionen werden in Mikrozentrifugationsröhrchen (etwa 22 bzw. 11 Tropfen) gesammelt.

Durch Zugabe von linearem Polyacrylamid bis 20 ug/ml und durch Auffüllen des Röhrchens mit Ethanol werden die Fraktionen gefällt. Die Röhrchen wurden gekühlt und in einer Mikrozentrifuge für drei Minuten zentrifugiert, geschüttelt und wieder für eine Minute zentrifugiert. Die erzielten Pellets werden mit 70% Ethanol gewaschen und dann wieder zentrifugiert, wobei darauf geachtet wird, dass die Pellets nicht vollständig trockneten. Jede 0,25 ml Fraktion wird in 10 ul TE resuspendiert und 1 ul läuft auf einem 1% Agarose-Minigel. Die ersten drei Fraktionen und die letzten sechs Fraktionen, die kein Material kleiner als 1 kb enthalten, werden vereinigt.

9e. Vermehrung der Plasmide

SupF Plasmide werden in nicht-unterdrückenden, bakteriellen Wirten selektiert, die ein zweites Plasmid p3 enthalten, welches Amber mutierte Ampicillin- und Tetracyclinresistenzelemente enthält, siehe Seed, Nucleic Acids Res., 11, 2427-2445 (1983). Das p3-Plasmid stammt von RP1 ab und ist 57 kb lang und stellt ein stabil erhaltenes Einzelkopieepisom dar. Die Ampicillinresistenz dieses Plasmides kehrt mit einer hohen Rate zurück, so dass ampr Plasmide normalerweise nicht in p3-haltigen Stämmen verwendet werden können. Die Selektion für die Tetracyclinresistenz allein ist fast so gut wie die Selektion auf Ampicillin-Tetracyclin-Resistenz. Das spontane Auftreten von chromosomalen tRNA Suppressormutationen stellt jedoch bei diesem System einen nicht vermeidbaren Hintergrund dar (Frequenz etwa 10&supmin;&sup9;). Die Kolonien, welche aus spontanen Suppressormutationen entstehen, sind normalerweise größer als die Kolonien, die aus der Plasmidtransformation entstehen. Suppressorplasmide werden in Luria Broth (LB)-Medium selektiert, welches 12,5 ug/ml Ampicillin und 7,5 ug/ml Tetracyclin enthält. Für größere Plasmidaufarbeitungen wird das M9 Caseinhydrolysat-Medium, welches Glyzerin (0,8%) enthält, als Kohlenstoffquelle verwendet. Die Bakterien werden bis zur Sättigung herangezogen.

Alternativ kann pSV Sport (BRL, Gaithersberg, Maryland) verwendet werden, um von SV40 abstammende Sequenzen für die Replikation, Transkription, Initiation und Termination in COS 7 Zellen bereitzustellen, sowie solche Sequenzen, die für eine Replikation und Ampicillinresistenz in E. Coli notwendig sind.

9f. Isolierung von Vektor DNA/Plasmid

Ein Liter an gesättigten Bakterienzellen werden in J6-Bechern bei 4.200 Umdrehungen pro Minute für 25 Minuten zentrifugiert. Die Zellen werden in 40 ml 10 mM EDTA, pH 8, resuspendiert. 80 ml von 0,2 M NaOH und 1% SDS werden hinzugefügt und die Mischung wird bis zur Klarheit und Viskosität geschwenkt. 40 ml 5M KOAC, pH 4,7 (2,5 M KOAc, 2,5 M HOAc) werden hinzugefügt und die Mischung wird halb-heftig geschüttelt, bis die Klumpen etwa 2-3 mm groß sind. Der Becher wird bei 4.200 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wird durch Gaze in einen 250 ml Becher gegossen, der dann mit Isopropylalkohol aufgefüllt wird und bei 4.200 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten zentrifugiert wird. Der Becher wird vorsichtig entleert und mit 70% Ethanol gespült, wobei darauf zu achten ist, dass das Pellet nicht fragmentiert wird. Nach Umdrehen des Bechers und Entfernung der restlichen Spuren an Ethanol wird die Mischung in 3,5 ml Tris-Base/EDTA (2 g mM/10 mM) resuspendiert. 3,75 ml des resuspendierten Pellets und 0,75 ml von 10 mg/ml Ethidiumbromid werden zu 4,5 g CsCl hinzugegeben. VTi8D Röhrchen werden mit der Lösung gefüllt und für wenigstens 2,5 Stunden bei 80.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die Banden werden mit sichtbarem Licht mit einer 1 mm Spritze und einer 20-er oder kleineren Nadel extrahiert. Die Spitze des Röhrchen wird mit einer Schere abgeschnitten und die Nadel wird nach unten in das Röhrchen mit einem Winkel von etwa 30º zu dem Röhrchen bis zu einer Position von 3 mm oberhalb des Bandes eingeführt, wobei die abgeschrägte Seite der Nadel nach oben zeigt. Nach Entfernung der Bande wird der Inhalt des Röhrchens in ein Bleichmittel gegossen. Die extrahierte Bande wird in einem 13 ml Sarstedt- Röhrchen gelagert, welches dann bis zur Spitze mit n-Butanol aufgefüllt wird, welches mit einem 1 M NaCl-Extrakt gesättigt ist. Wenn die Menge an DNA groß ist, wird das Extraktionsverfahren wiederholt. Nach Absaugen des Butanols in einen Abscheider, der zur Zerstörung des Ethidums 5 M NaOH enthält, wird ein etwa gleiches Volumen an 1 M Ammoniumacetat sowie das etwa zweifache Volumen an 95% Ethanol der DNA zugesetzt, die dann bei 10.000 Umdrehungen pro Minute für 5 Minuten zentrifugiert wird. Das Pellet wird vorsichtig mit 70% Ethanol gewaschen und dann mit einem Tupfer oder Lyophilisierergetrocknet.

9g. Herstellung des Vektors für die Klonierung

20 ug des Vektors wird in einer 200 ul Reaktion mit 100 Einheiten an BstXI (New York Biolabs) bei 50ºC über Nacht in einem gut kontrollierten, umlaufenden Wasserbad geschnitten. Kaliumacetat-Lösungen (5 und 20%) werden in 5W55-Röhrchen, wie oben beschrieben, hergestellt. 100 ul des geschnittenen Vektors werden dann zu jedem Röhrchen zugefügt und für drei Stunden bei 22ºC und 50.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Unter einem 300 nm UV-Licht wird die gewünschte Bande beobachtet, die entlang 2/3 der Länge des Röhrchens wandert. Eine Vorwärtsschwanzbildung der Bande zeigt an, dass der Gradient überladen ist. Die Bande wird mit einer 1 ml Spritze und einer 20-er Nadel entfernt. Nach Zugabe von linearem Polyacrylamid und Fällung des Plasmides durch Zugabe von 3 Volumen Ethanol wird das Plasmid in 50 ul TE resuspendiert. Versuchsligationen werden mit einer konstanten Menge des Vektors und mit zunehmenden Mengen an cDNA durchgeführt. Ein größerer Ligationsansatz wird auf Basis dieser Versuchsligation durchgeführt. Normalerweise erfordert die gesamte cDNA-Aufarbeitung 1- 2 ug des geschnittenen Vektors.

9h. Puffer

Ladepuffer 0,5 M LiCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS

mittlerer Waschpuffer 0,15 M LiCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS

RT1-Puffer 0,25 M Tris pH 8,8 (8,2 bei 42º), 0,25 M KCl, 30 mM MgCl&sub2;

RT2-Puffer 0,1 M Tris pH 7,5, 25 mM MgCl&sub2;, 0,5 M KCl, 0,25 mg/ml BSA, 50 mM Dithiothreitol (DTT)

10X Niedrigsalz 60 mM Tris pH 7,5, 60 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 2,5 mg/ml BSA, 70 mM DME

10X Ligationszugaben 1 mM ATP, 20 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 10 mM Spermidin

10X Kinasepuffer 0,5 m Trist pH 7,5, 10 mM ATP, 20 mM DTT, 10 mM Spermidin, 1 mg/ml BSA, 100 mM MgCl&sub2;

9i: Transfektion der cDNA, welche für die Liganden codiert, in Cos 7 Zellen

Cos 7 Zellen werden 1 : 5 in 100 mm Platten in Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DME)/10%. fetales Kälberserum (FCS) aufgeteilt und wachsen über Nacht. 3 ml Tris/DME (0,039 M Tris, pH 7,4 in DME), das 400 ug/ml DEAE-Dextran enthält (Sigma, D-9885), wird für jede 100 mm Platte der zu transfizierenden Cos 7 Zellen hergestellt. 10 ug der Plasmid-DNA- Zubereitung wird pro Platte zugesetzt. Das Medium wird von den Cos 7 Zellen entfernt und die DNA/DEAE-Dextran-Mischung wird zugefügt. Die Zellen werden für 4,5 Stunden inkubiert. Das Medium wird von den Zellen entfernt und ersetzt durch 3 ml DME, welches 2% fetales Kälberserum (FCS) und 0,1 mM Chloroquin enthält. Die Zellen werden für eine Stunde inkubiert. Nach Entfernung von Chloroquin und Zugabe von 1,5 ml 20% Glyzerin in PBS stehen die Zellen bei Raumtemperatur für eine Minute. 3 ml Tris/DME wird zugefügt und die Mischung wird angesaugt und zweimal mit Tris/DME gewaschen. 10 ml DME/10% FCS wird zugesetzt und die Mischung wird über Nacht inkubiert. Die transfizierten Cos 7 Zellen werden 1 : 2 in frische 100 mm Platten mit (DME)/10% FCS aufgeteilt und wachsen gelassen.

9j. Panningverfahren für Cos 7 Zellen, die den Liganden exprimieren 1) Antikörper-beschichtete Platten:

Bakteriologische 100 mm Platten werden für 1,5 Stunden beschichtet mit plazentaler alkalischer Kaninchen-Anti-Mensch-Phosphatase (Dako, Kalifornien), verdünnt 1 : 500 in 10 ml von 50 mM TrisHCl, pH 9,5. Die Platten werden dreimal mit 0,15 M NaCl gewaschen und mit 3 mg BSA/ml PBS über Nacht inkubiert. Die Blockierlösung wird angesaugt und die Platten werden sofort verwendet oder für eine spätere Anwendung eingefroren.

2) Panning-Zellen:

Das Medium von den transfizierten Cos 7 Zellen wird abgesaugt und 3 ml PBS/0,5 mM EDTA/0,02% Natriumazid wird zugesetzt. Die Platten werden für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um die Zellen abzulösen. Die Zellen werden stark mit einer Pasteurpipette zerrieben und in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt. Die Platte wird mit 2 ml PBS/EDTA/Azidlösung gewaschen, welches dann den Zentrifugenröhrchen hinzugefügt wird. Nach Zentrifugation bei 2000 xg für fünf Minuten werden die Zellen in 3 ml von APtag-flk-1 (F-1AP21-4) oder von flk-2 (F-2AP26-0)-Überstand aus den transfizierten NIH/3T3 Zellen (siehe Beispiel 7) resuspendiert und auf Eis für 1,5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden für fünf Minuten dann wieder bei 2000 xg zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und die Zellen werden in 3 ml PBS/EDTA/Azid-Lösung resuspendiert. Dis Zellsuspension wird vorsichtig auf 3 ml PBS/EDTA/Azid/2% Ficoll geschichtet und für vier Minuten bei 2000 xg zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und die Zellen werden resuspendiert in 0,5 ml PBS/EDTA/Azid-Lösung. Die Zellen werden den Antikörper-beschichteten Platten zugegeben, welche 4 ml PBS/EDTA/Azid/5% FBS enthalten, und stehen dann bei Raumtemperatur für ein bis drei Stunden. Nicht-angeheftete Zellen werden durch zwei- bis dreimaliges Waschen mit 3 ml PBS/5% FBS entfernt.

3) Hirt-Überstand:

0,4 ml von 0,6% SDS und 10 mM EDTA werden den mit der Panning-Technik behandelten Platten zugegeben, die dann für 20 Minuten stehen. Die viskoseartige Mischung wird mittels einer Pipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. 0,1 ml 5 M NaCl wird dem Röhrchen zugesetzt, gemischt und auf Eis für wenigstens fünf Stunden gekühlt. Das Röhrchen wird für vier Minuten zentrifugiert und der Überstand wird vorsichtig entfernt. Der Inhalt des Röhrchens wird einmal mit Phenol extrahiert oder, falls die erste Grenzfläche nicht klar ist, zweimal. Zehn Mikrogramm an linearem Polyacrylamid (oder einem anderen Träger) wird zugegeben und das Röhrchen wird mit Ethanol bis zur Spitze aufgefüllt. Der erzielte Niederschlag wird in 0,1 ml Wasser oder TE resuspendiert. Nach Zugabe von 3 Volumen EHOH/NaOAc werden die Zellen wieder gefällt und in 0,1 ml Wasser oder TE resuspendiert. Die erzielte cDNA wird durch Elektroporation in jeden geeigneten E. coli-Wirt transfiziert. Geeignete Wirte sind in verschiedenen Katalogen beschrieben und umfassen MC1061/p3 oder Electromax DH10B Zellen von BRL Gibco. Die cDNA wird mit bekannten Verfahren extrahiert.

Das obige Panning-Verfahren wird wiederholt, bis ein reiner E. coli-Klon isoliert ist, der die cDNA als einheitliche Plasmidrekombinante trägt, die zur Transfektion von Säugehierzellen in der Lage ist und die einen positiven Panning-Test ergibt. Normalerweise sind drei Wiederholungen ausreichend.

9k. Expressionsklonierung eines flk1- oder flk2-Liganden durch Etablierung einer autokrinen Schleife

Zellen, welche flk1/fms oder flk2/fms (Beispiel 10) exprimieren, werden mit 20-30 ug einer cDNA-Bibliothek aus Stromazellen transfiziert, die entweder den flk1-Liganden oder den flk2- Liganden exprimieren. Die cDNA-Bibliothek wird, wie oben dargestellt (a-h), hergestellt. Die Zellen werden mit 1 ug pLTR neo cDNA cotransfiziert. Nach der Transfektion werden die Zellen 1 : 2 überimpft und in 800 ug/ml von G418 in Dulbecco's-Medium (DME) kultiviert, das ergänzt ist mit 10 % CS. Nach etwa 12 Tagen werden die Zellkolonien übergeimpft und auf Schalen plattiert, die beschichtet sind mit Poly-D-Lysin (1 mg/ml) und mit menschlichem Fibronectin (15 ug/ml). Das Kulturmedium ist ein Serum-freies Medium und stellt eine Mischung (3 : 1) von DME und Ham's F12-Medium dar. Die Ergänzungen des Mediums sind 8 mM NaHCO&sub3;; 15 mM HEPES pH 7,4; 3 mM Histidin; 4 uM MnCl&sub2;; 10 uM Ethanolamin; 0,1 uM selenige Säure, 2 uM Hydrocortison; 5 ug/ml Transferrin; 500 ug/ml Rinderserumalbumin/Linolsäure-Komplex und 20 ug/ml Insulin (Ref. Zhan, X. et al. Oncogene 1: 369-376, 1987). Die Kulturen werden am nächsten Tag und jeden dritten Tag erneuert, bis nur noch Zellen verbleiben, die unter der definierten Mediumzusammensetzung wachsen können. Die verbleibenden Zellkolonien werden expandiert und auf die Gegenwart des Liganden getestet, indem ein Bindungstest von APtag-flk1 oder APtag -flk2 an die Zellen (beschrieben im Beispiel 8) durchgeführt wird. Die DNA würde aus den Zellen entnommen, welche die Gegenwart von flk1- oder flk2-Ligand und die Sequenz zeigen.

Beispiel 10. Expression von Liganden cDNA

Die cDNA wird sequenziert und in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert, wie eine Säugetierzelle, vorzugsweise COS-Zellen, CHO-Zellen oder NIH/3T3-Zellen. Die Gegenwart des Liganden wird durch die Darstellung der Bindung des Liganden an das APtag-flk2-Fusionsprotein (siehe oben) bestätigt.

Beispiel 11. Chemische Vernetzung von Rezeptor und Ligand

Vernetzungsexperimente werden an intakten Zellen durchgeführt, wobei eine Modifikation des Verfahrens durchgeführt wird, welches beschrieben ist von Blume-Jensen et al., EMBO J., 10, 4121-4128 (1991). Die Zellen werden in 100 mm Gewebekulturplatten kultiviert und einmal mit PBS-0,1% BSA gewaschen.

Um die chemische Vernetzung des löslichen Rezeptors mit dem Membran-gebundenen Liganden zu überprüfen, werden die Stromazellen von der 2018-Stromazelllinie mit konditionierten Medien (CM) aus transfizierten 3T3-Zellen inkubiert, welche den löslichen Rezeptor flk2 APtag exprimieren. Die Vernetzungsstudien von dem löslichen Liganden an den Membran-gebundenen Rezeptor werden durch Inkubation von konditionierten Medien von 2018-Zellen mit transfizierten 3T3-Zellen durchgeführt, die ein flk2-Fms-Fusionskonstrukt exprimieren.

Die Bindung wird für zwei Stunden durchgeführt entweder bei Raumtemperatur mit cm, das 0,02% Natriumacid enthält, um eine Rezeptor-Internalisierung zu vermeiden, oder bei 4ºC mit cm (und Puffer), welches mit Natriumvanadat ergänzt ist, um eine Rezeptor-Dephosporilierung zu vermeiden. Die Zellen werden zweimal mit PBS-0,1% BSA gewaschen und viermal mit PBS.

Die Vernetzung wird in PBS, das 250 mM Disuccinimidylsuberat (DSS; Pierce) enthält, für 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktion wird mit Tris-HCl pH 7,4 bis zu einer Endkonzentration von 50 mM gelöscht.

Die Zellen werden in Solubilisierungspuffer löslich gemacht: 0,5% Triton - X100, 0,5% Deoxycholsäure, 20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMFS, 50 mg/ml Aprotinin, 2 mg/ml Bestatin, 2 mg/ml Pepstatin und 10 mg/ml Leupetin. Die lysierten Zellen werden sofort in 1,5 ml Nalgene-Röhrchen überführt und für 45 Minuten bei 4ºC durch End-zu-End-Rollen löslich gemacht. Die Lysate werden dann in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Löslich gemachte, vernetzte Rezeptorkomplexe werden dann von den Lysaten geholt, indem die Überstände mit 10% (Volumen/Volumen) Weizenkeimlectin-Sepharose 6MB Perlen (Pharmacia) bei 4ºC für zwei Stunden oder über Nacht inkubiert werden.

Die Perlen werden einmal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) gewaschen und in 2X nicht-reduzierender SDS-Polyacrylamid-Probenpuffer resuspendiert. Die gebundenen Komplexe werden durch Erhitzen auf 95ºC für fünf Minuten von den Perlen abgetrennt. Die Proben werden auf 4-12% Gradientgelen (NOVEX) unter nicht-reduzierenden und unter reduzierenden Bedingungen (0,35 M 2-Mercaptoethanol) analysiert und dann auf PVDF-Membranen für zwei Stunden unter Verwendung eines Novex-Blotting-Gerätes transferiert. Die Blots werden in TBS-3% BSA für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert und dann mit einem geeigneten Antikörper inkubiert.

Vernetzte flk2-APtag- und flk2-fms-Rezeptoren werden unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern nachgewiesen, die gegen menschliche alkalische Phosphatasen bzw. gegen das fms-Protein erzeugt wurden. Das restliche Verfahren wird gemäß den Instruktionen durchgeführt, die in dem ABC-Kit (Pierce) angegeben sind. Der Kit basiert auf der Verwendung eines biotinylierten, sekundären Antikörpers und eines Avidin-biotinylierten Meerrettichperoxidase- Komplexes für den Nachweis.

Ergänzende Ausführungen

Die beanspruchte Erfindung kann gemäß der obigen Beschreibung und der leicht verfügbaren Literaturangaben und Ausgangsmaterialien durchgeführt werden. Trotzdem haben die Anmelder bei der "American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC)" die folgenden Zelllinien hinterlegt.

2018, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 10907, hinterlegt am 30. Oktober 1991.

Fsp 62891, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 10935, hinterlegt am 21. November 1991.

F.thy 62891, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 10936, hinterlegt am 21. November 1991.

FL 62891, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 11005, hinterlegt am 2. April 1992.

Diese Hinterlegungen wurden gemacht gemäß den Regelungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter fallenden Vorschriften (Budapester Vertrag). Vom Zeitpunkt der Hinterlegung wird dadurch die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur für 30 Jahre sichergestellt. Die Organismen werden durch das ATCC gemäß den Regelungen des Budapester Vertrages verfügbar gemacht. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Stämme stellt jedoch keine Lizenz dar, um die Erfindung in Übertretung der Rechte auszuüben, die von behördlicher Seite gemäß den Patentgesetzen erteilt wurden.

SEQUENZLISTUNG (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) ANMELDER: TRUSTEES OF PRINCETON UNIVERSITY

(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Totipotente, hämopoetische Stammzell-Rezeptoren und ihre Liganden

(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 8

(iv) KORRESPONDENZADRESSE:

(A) ADRESSAT: IMCLONE SYSTEMS INCORPORATED

(B) STRASSE: 180 VARICK STREET

(C) STADT: NEW YORK

(D) STAAT: NEW YORK

(E) LAND: USA

(F) POSTLEITZAHL: 10014

(v) COMPUTERLESBARE FORM:

(A) SPEICHERMEDIUM: Floppy-Disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatibel

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:

(A) ANMELDENUMMER:

(B) EINREICHUNGSDATUM: 2. April 1992

(C) KLASSIFIZIERUNG:

(viii) INFORMATION ZU ANWALT/AGENT:

(A) NAME: FEIT, IRVING N.

(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 28 601

(C) REFERENZ/AKTEnZEICHEN: LEM-3-PPPPT

(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:

(A) TELEFON: 212-645-1405

(B) FAX: 212-645-2054

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:

(A) LÄNGE: 3453 Basenpaare

(B) TYP: Nukleinsäure

(C) STRANG: einfach

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii)MOLEKÜLTYP: cDNA

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) ORT: 31..3009

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat Peptid

(B) ORT: 31....3006

(xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:

(2) Information für SEQ ID Nr. 2:

(i) Sequenzcharakteristik:

(A) Länge: 992 Aminosäuren

(B) Typ: Aminosäure

(D) Topologie: linear

(ii) Molekültyp: Protein

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 2:

(2) Information für SEQ ID Nr. 3:

(i) Sequenzcharakteristik:

(A) Länge: 332 Basenpaare

(B) Typ: Nukleinsäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekültyp: cDNA

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: CDS

(B) Ort: 1..332

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 3:

(2) Information für SEQ ID Nr. 4:

(i) Sequenzcharakteristik:

(A) Länge: 110 Aminosäuren

(B) Typ: Aminosäure

(D) Topologie: linear

(ii) Molekültyp: Protein

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 4:

(2) Information für SEQ ID Nr. 5:

(i) Sequenzcharakteristik:

(A) Länge: 284 Basenpaare

(B) Typ: Nukleinsäure

(C) Strang: linear

(D) Topologie: linear

(ii) Molekültyp: cDNA

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: CDS

(B) Ort: 1..262

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 5:

(2) Information für SEQ ID Nr. 6:

(i) Sequenzcharakteristik:

(A) Länge: 94 Aminosäuren

(B) Typ: Aminosäure

(D) Topologie: linear

(ii) Molekültyp: Protein

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 6:

(2) Information für SEQ ID Nr. 7:

(i) Sequenzcharakteristik:

(A) Länge: 5406 Basenpaare

(B) Typ: Nukleinsäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekültyp: cDNA

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: CDS

(B) Ort: 208..4311

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: mat-Peptid

(B) Ort: 208..4308

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 7:

(2) Information für SEQ ID Nr. 8:

(i) Sequenzcharakteristik:

(A) Länge: 1367 Aminosäuren

(B) Typ: Aminosäure

(D) Topologie: linear

(ii) Molekültyp: Protein

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 8:


Anspruch[de]

1. Rezeptorproteintyrosinkinase, flk-2, umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus

(i) der in der Fig. 1a gezeigten Sequenz,

(ii) funktionellen Äquivalenten von der in der Fig. 1a gezeigten Sequenz, welche eine Substitution, Addition oder Deletion der Sequenz von Fig. 1a enthalten, und

(iii) Fragmenten der vorhergehenden Sequenzen, welche eine Aktivität der Rezeptorproteintyrosinkinase bewahrt haben.

2. Rezeptorproteintyrosinkinase nach Anspruch 1, welche die flk-2 vom Menschen ist.

3. Rezeptorproteintyrosinkinase nach Anspruch 1, welche die flk-2 von der Maus ist.

4. Extrazelluläre Rezeptordomäne einer Rezeptorproteintyrosinkinase, flk-2, umfassend:

(i) ein Segment mit den Aminosäureresten 28-544 von der in der Fig. 1a gezeigten Aminosäuresequenz,

(ii) funktionelle Äquivalente des Segmentes, welche eine Substitution, Addition oder Deletion enthalten, oder

(iii) Fragmente der vorhergehenden Sequenzen, welche eine Rezeptoraktivität bewahrt haben.

5. Extrazelluläre Rezeptordomäne nach Anspruch 4, wobei dieses Segment von flk-2 vom Menschen abstammt.

6. Extrazelluläre Rezeptordomäne nach Anspruch 4, wobei dieses Segment von flk-2 von der Maus abstammt.

7. Nukleinsäuremolekül, welches für eine Rezeptorproteintyrosinkinase nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder für eine extrazelluläre Rezeptordomäne nach einem der Ansprüche 4 bis 6 codiert.

8. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, wobei das Nukleinsäuremolekül DNA ist.

9. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, wobei das Nukleinsäuremolekül cDNA ist.

10. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, wobei das Nukleinsäuremolekül RNA ist.

11. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, welches für eine Rezeptorproteintyrosinkinase nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder für eine extrazelluläre Rezeptordomäne nach einem der Ansprüche 4 bis 6 codiert.

12. Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor in einen Wirt kloniert werden kann.

13. Vektor nach Anspruch 12, wobei der Wirt ein prokaryotischer Wirt ist.

14. Vektor nach Anspruch 12, wobei der Wirt ein eukaryotischer Wirt ist.

15. Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 14, der in einem Wirt das Nukleinsäuremolekül exprimieren kann.

16. Vektor nach Anspruch 15, der in einem Wirt flk-2 oder die extrazelluläre Rezeptordomäne von flk-2 exprimieren kann.

17. Spezifischer Antikörper für eine Rezeptorproteintyrosinkinase nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

18. Spezifischer Antikörper für eine extrazelluläre Rezeptordomäne nach einem der Ansprüche 4 bis 6.

19. Antikörper nach Anspruch 17 oder 18, wobei der Antikörper die Proliferation und/oder die Differenzierung von undifferenzierten hämopoetischen Zellen stimuliert.

20. Antikörper nach einem der Ansprüche 17 bis 19, der gegen flk-2 vom Menschen spezifisch ist.

21. Antikörper nach einem der Ansprüche 17 bis 19, der gegen flk-2 von der Maus spezifisch ist.

22. Antikörper nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

23. Nukleinsäuremolekül, das für einen Antikörper nach einem der Ansprüche 17 bis 22 codiert.

24. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 23, wobei das Nukleinsäuremolekül DNA ist.

25. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 24, wobei das Nukleinsäuremolekül cDNA ist.

26. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 23, wobei das Nukleinsäuremolekül RNA ist.

27. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 17 bis 22 zur Herstellung eines Medikamentes für die Stimulierung der Proliferation und/oder Differenzierung von undifferenzierten hämopoetischen Säugetierstammzellen.

28. In vitro Verfahren zur Stimulierung der Proliferation und/oder Differenzierung von undifferenzierten hämopoetischen Säugetierstammzellen, welches das Kontaktieren der Stammzellen mit einem Antikörper nach einem der Ansprüche 17 bis 22 umfasst.







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