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Dokumentenidentifikation DE69232716T2 28.11.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0514721
Titel Peptide mit thrombospondin-ähnlicher Aktivität und ihre therapeutische Verwendung
Anmelder W.R. Grace & Co.-Conn., New York, N.Y., US;
Philadelphia Health and Education Corp., Philadelphia, Pa., US
Erfinder Eyal, Jacob, Baltimore, US;
Tuszynski, George Paul, Williamstown, US;
Hamilton, Bruce King, Silver Spring, US
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69232716
Vertragsstaaten BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.05.1992
EP-Aktenzeichen 921077749
EP-Offenlegungsdatum 25.11.1992
EP date of grant 07.08.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.11.2002
IPC-Hauptklasse A61K 38/06
IPC-Nebenklasse A61K 38/07   A61K 38/08   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Verwendung von Peptidfragmenten und synthetischen Analoga von Thrombospondin (TSP), welche eine Thrombospondin-ähnliche Aktivität beibehalten, für die Herstellung eines Medikaments mit antimetastatischer Aktivität. Die Peptide behalten die biologische Aktivität von TSP als ein wirksamer Verstärker oder Inhibitor der Zelladhäsion und Bindung an verschiedene Zelllinien bei und ahmen diese nach. Die Peptide finden Verwendung als Mittel zum Hemmen einer Metastasierung, da bereits gezeigt worden ist, dass TSP die Tumorzellmetastasierung vermutlich über Mechanismen vermittelt, an denen die zelladhäsive Domäne von TSP beteiligt ist.

Hintergrund

Thrombospondin (auch als Thrombin-empfindliches Protein oder TSP bekannt) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 450.000, das aus drei identischen, durch Disulfidbindungen miteinander verbundenen Polypeptidketten besteht (Lawler et al. J. Cell Biol (1986) 101: 1059-71). TSP wird von Blutplättchen als Reaktion auf physiologische Aktivatoren wie z. B. Thrombin und Kollagen sezerniert (Lawler, J. Blood (1986) 67: 112-123). TSP macht 3% des Gesamtproteins von Blutplättchen und 25% des Gesamtproteins der Alpha-Granula von Blutplättchen aus (Tuszynski, G. P. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 12240-12245). TSP wird auch von anderen Zellen synthetisiert, u. a. von Fibroblasten (Jaffe, E. A. et al., (1983) Natl. Acad. Sci. USA 80: 999-1002), glatten Muskelzellen (Raugi, G. J. et al., (1982) J. Cell. Biol. 95: 351-354) und Endothelzellen (McPhearson, J. et al., J. Biol. Chem. 256: 11330-11336). TSP wurde in bestimmten Tumorgeweben wie etwa in Melanomzellen (Varani, J. et al., (1989) Clin. Expl. Metastais 7: 319-329), squamösem Lungenkarzinom (Riser, B. L. et al., (1988) Exp. Cell. Res. 174: 319-329) und Brustkarzinom (Pratt, D. A. et al., (1989) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 343-350). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die folgenden Tumorzellen in Kultur TSP synthetisieren: Fibrosarcom, Rhabdomyosarcom, Glioblastöm, Wilms- Tumor, Neuroblastom, Teratokarzinom, Choriokarzinom, Melanom und Lungenkarzinom (Mosher, D. F., (1990) Annu. Rev. Med. 41: 85-97). Eine Reihe neuerer Untersuchungen hat gezeigt, dass TSP eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell und Zell-Substrat-Adhäsion spielt (Tuszynski, G. P. et al., (1987) Seminars in Thrombosis Hemostasis (13: 361-368, Mosher, D. F., (1990) Annu. Rev. Med. 41: 85-97). In einem Modell für experimentelle Metastasierung in Mäusen fördert TSP die Zellbindung, die Aggregation von Blutplättchen und die Bildung von Tumorkolonien in der Lunge (Tuszynksi, G. P. et al., (1987) Science 236: 1570-1573, Tuszynski, G. P. et al., (1988) Blood 72: 109-115). Die Beobachtung, dass die extrazelluläre Matrix der meisten Gewebe TSP enthält, spricht für eine Funktion von TSP bei der Adhäsion.

TSP setzt sich aus linearen Polypeptiddomänen zusammen, die mit verschiedenen Makromolekülen wie etwa mit Plasma und Matrixkomponenten eine spezifische Wechselwirkung eingehen. Zum Beispiel bildet TSP einen Komplex mit Heparin (Yabkowitz, R. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 10888-10896), Fibrinogen (Tuszynski, G. P. et al., (1985) J. Biol. Chem. 260: 12240-12245), Kollagen (Mumby, S. M. et al. (1984) J. Cell. Biol. 98: 10888-10896) und Plasminogen (Depoli. P. et al. (1989) Blood 73: 976-902). Die Tatsache, dass der Antikörper gegen das menschliche Protein mit TSP aus Maus, Ratte, Schwein, Rind, Schaf, Hund und Pute kreuzreagiert (Switalska, H.I. et al., J. Lab Clin. Med. 106: 690-700) deutet darauf hin, dass die Struktur von TSP über verschiedene Tierarten hinweg konserviert ist.

Thrombospondin wurde mit verschiedenen Verfahren aufgereinigt, u. a. durch Ausschlusschromatographie (Lawler et al., J. Biol. Chem. (1978) 253: 8609-16), Heparin- Affinitätschromatographie (Lawler et al., Thromb. Res. (1981) 22: 267-269), Fibrinogen- Affinitätschromatographie (Tuszynski et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 12240-5), Bariumchloridfällung (Alexander et al., Biochem. J. (1984) 217: 67-71) und Anionenaustauschchromatographie mit HPLC (Clezarolin et al., J. Chromatop. (1984) 296: 249-56).

Die vollständige Aminosäuresequenz von TSP wurde von DNA-Klonen abgeleitet, die von verschiedenen Gruppen hergestellt wurden, u. a. von Lawler et al., J. Cell. Biol. (1986) 103: 163548; Kobayashi et al., Biochemistry (1986) 25: 8418-25; Dixit et al., Proc. Ntl. Acad. Sci. (1986) 83: 5449-53; und Hennessy et al., J. Cell. Biol. (1989) 108: 729-36.

Die Zelladhäsion ist für die Entwicklung und das Überleben von vielzelligen Organismen von entscheidender Bedeutung. Bei der Zelladhäsion handelt es sich um einen komplexen Vorgang, bei dem mehrere extrazelluläre Proteine wie etwa Fibronectin, Vitronectin, Kollagen, Laminin und TSP sowie mehrere Familien von zellulären Rezeptoren wie etwa die Integrine und die Zelladhäsionsmoleküle (cellular adhesion molecules, CAMS) benötigt werden. Diese Moleküle sind an der Adhäsion sowohl von normalen Zellen als auch von Tumorzellen beteiligt und wurden in den letzten Jahren ziemlich intensiv untersucht.

Die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp (RGD) wurde bei Fibronectin als eine Zellbindungsdomäne nachgewiesen (Pierschbacher, M. D. und Ruoslahti, E., (1984) Nature (London) 309: 30-32). Die gleiche Sequenz oder verwandte Sequenzen wurden in vielen Proteinen gefunden und dienen als Zellbindungsstellen für Makromoleküle wie Fibrinogen (Ginsberg, M. D. et al., (1985) J. Biol. Chem. 260: 11891-11896). Die adhäsive Funktion von Laminin scheint jedoch nicht auf der RGD-Sequenz zu beruhen, sondern auf einem Peptidsegment der B1-Kette, das die Aminosäuresequenz Tyrosin-Isoleucin- Glycin-Serin-Arginin (YIGSR) enthält (Sasaki, M. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci 84: 935-938). Synthetische Peptide, die die RGD- oder die YIGSR-Sequenz enthalten, fördern die Zelladhäsion.

Vor kurzem wurde über die therapeutische Anwendung von synthetischen Peptiden berichtet, die auf den adhäsiven Domänen von Fibronectin und Laminin beruhen. Humphries et al. (1986) Science 233: 467-470) zeigten erstmals, dass die Koinjektion des Pentapeptids GRGDS zusammen mit B16-F10-Melanomzellen der Maus die Bildung von Lungenkolonien in C57B1/6-Mäusen drastisch hemmte. Ein weiteres synthetisches Peptid, das von Laminin abgeleitet wurde, (YIGSR) führte ebenfalls zu einer drastischen Hemmung der Metastasierung von B16-F10-Melanomzellen bei C57B1/6-Mäusen (Kleinman, H. K. et al., (1987) Science 238: 1132-1133; Kleinman, H. K. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2279-2283). Die Hemmwirkung dieser Peptide könnte auf die Konkurrenz zu der von endogenem Laminin und Fibronectin abhängigen Adhäsion von Tumorzellen an das Blutgefäßsystem des Zielorgans während der metastatischen Dissemination der Tumorzellen zurückzuführen sein.

Da die Metastasierung ein schrittweiser Vorgang ist, der den Transfer von Tumorzellen von einem Ort an einen anderen über den Lymph- und Blutkreislauf umfasst, und bei Tieren eine Verringerung der Blutplättchen die Metastasierung in den Tieren wirksam blockiert (Gasic et al., (1968) Proc. Natl. Acad Sci. USA 48: 46-52), wurde angenommen, dass Blutplättchen bei der Entwicklung von Metastasen eine besondere Rolle spielen. Da TSP 25% des gesamten Alpha-Granula-Proteins ausmacht, das von Blutplättchen sezerniert wird, würde man erwarten, dass TSP eine wichtige Rolle bei dem Transfer von Tumorzellen über das Blut zu entfernten Organen spielt. Tatsächlich wurde in einem Maus-Modell gezeigt, dass TSP die Metastasierung von Tumorzellen fördert (Tuszynski et al., (1987) 47: 4130-4133). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass alle Vorgänge, die mit der Aktivierung von Blutplättchen einhergehen, wie z. B. die Sekretion von Adhäsionsproteinen, die Aggregation von Blutplättchen, die Aktivierung von proteolytischen Enzymen und die Aktivierung der Gerinnungskaskade eine wichtige Rolle bei der Metastasierung von Tumorzellen spielen (Gasic, G. J., (1984) Cancer Metastasis Rev. 3: 99-116).

Adhäsionsproteine, die Bestandteil der extrazellulären Matrix sind, steuern die Bewegung, das Wachstum und die Morphologie vieler Zelltypen. Die Proteine der extrazellulären Matrix gehen eine Wechselwirkung mit Tumorzellrezeptoren ein und beeinflussen die Adhäsion von Tumorzellen an das Kollagen der Basalmembran in unterschiedlicher Weise. Beispielsweise erhöhte die Behandlung von Melanomzellen mit Laminin in vitro die Fähigkeit von Tumorzellen, an der Basalmembran zu haften und Tumorkolonien in der Lunge zu bilden (Barsky, S. H. et al., (1984) J. Clin. Inv. 74: 843-848; Terranova, V. P. et al., (1984) Science 226: 982-985).

In Anbetracht der vorstehend angegebenen Information könnte TSP eine wichtige Rolle bei vielen unterschiedlichen und klinisch bedeutsamen Vorgängen spielen, wie z. B. bei der Zellwanderung, der Wundheilung, der Nervenregeneration und der Metastasierung von Tumorzellen. Die Zuordnung jeder dieser biologischen Aktivitäten von TSP zu einer bestimmten Unterdomäne oder einem bestimmten Oligopeptid von TSP würde wertvolle Information für ein besseres Verständnis der Pathophysiologie dieser Vorgänge auf molekularer Ebene liefern. Insbesondere könnten detaillierte Kenntnisse der Struktur der Domänen von TSP und TSP-Rezeptoren zur Konstruktion von TSP-antagonistischen Peptiden verwendet werden, welche pathophysiologische Aktivitäten von TSP wie z. B. die TSP-abhängige Bildung von Tumorzellmetastasen blockieren könnten.

TSPenthält drei homologe Peptidsequenzen, die als Typ I-, Typ II- und Typ III- Wiederholungen bezeichnet werden (Lawler und Hynes, (1986) J. Cell. Biol. 103: 1635-1648). Die drei Wiederholungen bestehen aus annähernd 60 Aminosäuren, die jeweils sechs Cysteinreste enthalten. Die Typ I-Wiederholungen weisen eine Homologie mit Peptidsegmenten auf, die in einer Reihe verschiedener Proteine vorkommen. Wir haben eine Tetrapeptidsequenz in TSP identifiziert (VTCG), die entweder in anderen Proteinen vollständig konserviert ist oder mit einer oder zwei konservativen Aminosäuresubstitutionen vorhanden ist. Die Verbreitung der konservierten Sequenzen ist in nachstehender Tabelle I angegeben.

Tabelle I

EP-A2-0 478 101, welches Stand der Technik nach Artikel 54(3) und (4) EPÜ ist, beschreibt Peptide, welche die Aminosäuresequenz R&sub1;-X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-X&sub4;-X&sub5;-R&sub2; umfassen, und ihre Verwendung in einem Verfahren zum Fördern oder Hemmen der Thrombospondinähnlichen Aktivität. X1 wird von neutralen oder kleinen Aminosäureresten eingenommen.

WO 90/01496 beschreibt die Aminosäure- und Nucleotidsequenz des TRAP-Proteins (mit Thrombospondin verwandtes unbekanntes Protein) (Thrombospondin related anonymous protein) aus dem Malariaparasiten Plasmodium falciparum und Derivate davon. Außerdem wird die Verwendung von TRAP und Derivaten davon für die Herstellung von Malariaimpfstoffen vorgeschlagen.

Rich et al., Science 249 (1990), 1574-1577 bezieht sich auf die zelladhäsive Einheit in Region II des Plasmodium-Circumsporozoit-Proteins.

Prater et al., J. Cell. Biol. 112 (März 1991), 1031-1040 beschreiben, dass die Properdinähnlichen Typ I-Wiederholungen von menschlichem Thrombospondin eine Zellbindungsstelle enthalten, und dass diese eine große Ähnlichkeit mit der Stelle VTCG aufweist, die in Region II des CS-Proteins von Malariaparasiten identifiziert wurde.

Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung von Thrombospondin-Fragmenten und Analoga, welche die biologische Aktivität von intaktem Thrombospondin nachahmen oder hemmen, für die Herstellung von Medikamenten vor, die auf verschiedenen biologischen, prophylaktischen oder therapeutischen Gebieten Verwendung finden.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun festgestellt, dass eine Klasse von Fragmenten oder synthetischen Analoga von einer spezifischen Domäne von Thrombospondin verschiedene Anwendungen hat. Diese Peptide sind mittels ihrer adhäsiven Aktivität in der Lage, die Metastasierung von Tumorzellen, die Zelladhäsion und die Aggregation von Blutplättchen bei Säugern in vivo zu modifizieren und zu hemmen. Diese Peptide sind auch bei der Wundheilung, als diagnostische Reagenzien und auf anderen verwandten Gebieten brauchbar. Die Peptide sind in der Lage, die Zellbindung zu fördern und können deshalb zum Herstellen von Oberflächen für eine optimale Zellkultur, zur Derivatisierung von verschiedenen prothetischen Materialien und zum Fördern der Bindung von umgebenden Geweben verwendet werden. Es können auch medizinische Vorrichtungen entworfen werden, welche solche Substrate verwenden, um Zellen zu einer Oberfläche in vivo anzuziehen oder sogar, um das Wachstum eines gewünschten Zelltyps auf einer bestimmten Oberfläche vor dem Verpflanzen zu fördern. Es ist gezeigt worden, dass die gemäß dieser Erfindung verwendeten TSP-Peptide und -Analoga eine Thrombospondin-ähnliche Aktivität aufweisen.

Daher ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung auf die Verwendung von Polypeptidverbindungen mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität zum Herstellen eines Medikaments mit antimetastatischer Aktivität gerichtet, wobei das Polypeptid durch die Formel:

R&sub1;-X&sub1;-X&sub2;-Cys-R&sub2;

bezeichnet wird, wobei:

R&sub1; Arg oder die Desaminoform davon bedeutet;

X&sub1; und X&sub2; gleich oder verschieden sind und aus der Gruppe bestehend aus Valin, Threonin und Serin ausgewählt werden;

R&sub2; eine geschützte oder ungeschützte carboxyterminale Gruppe umfassend Hydroxyl, Carboxyl oder einen Aminosäurerest, umfassend Carboxyamid- oder Alkylamidformen davon, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Glycin und Arginin, bedeutet.

Außerdem ist die Verwendung des Polypeptids mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität zum Herstellen von pharmazeutischen Zusammensetzungen beschrieben, welche die vorstehend genannten Polypeptidverbindungen zusammen mit einer pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeit, einem pharmazeutisch annehmbaren Gel oder festen Träger enthalten. Die Verabreichung von therapeutisch wirksamen Dosen dieser Zusammensetzungen kann eine wirksame Steigerung oder Hemmung der Thrombospondinähnlichen Aktivität bei Tieren, insbesondere Wirbeltieren wie beispielsweise Säugern und Vögeln ergeben.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, die Adhäsion von B&sub1;&sub6;F&sub1;&sub0;- Melanomzellen zu hemmen.

Fig. 2 zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, die Adhäsion von menschlichen Lungenkarzinomzellen zu hemmen.

Fig. 3 zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, die Adhäsion von Rinder- Endothelzellen zu hemmen.

Fig. 4 zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, die Adhäsion von glatten Muskelzellen von Kaninchen zu hemmen.

Fig. 5 zeigt, dass die Peptide der Erfindung eine antimetastatische Aktivität in vivo aufweisen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Klasse von Fragmenten oder Analoga von Thrombospondin, welche die Aktivität von Thrombospondin in Säugern in vivo hemmen oder nachahmen kann, für die Herstellung eines Medikaments mit antimetastatischer Aktivität vorgesehen.

A: Definitionen

"Thrombospondin-ähnliche Aktivität" wird hier als jede Aktivität definiert, die die bekannten biologischen Aktivitäten von Thrombospondin nachahmt. Zu diesen Aktivitäten gehören eine die Zelladhäsion fördernde Aktivität, eine zellmitogene Aktivität, zellchemotaktische Aktivitäten und hämostatische Aktivitäten sowie beliebige Aktivitäten, die sich von diesen Aktivitäten herleiten, wie etwa die Aktivität bei der Metastasierung von Tumorzellen, Mikroorganismen oder Parasiten, die Aktivität bei der Aggregation von Blutplättchen, die fibrinolytische Aktivität und die Immunmodulation.

"Antimetastatische Aktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, Tumorzellmetastasen zu verhindern oder deren Umfang oder Größe erheblich zu verringern, oder primäre feste Tumoren zu hemmen oder deren Rückbildung zu bewirken.

"Wundheilungsaktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, die Geschwindigkeit, mit der Wunden heilen, zu erhöhen oder die Ergebnisse des Heilungsvorgangs zu verbessern (d. h. weniger Narbenbildung, eine gute Reaktion auf einen taktilen Reiz, usw.).

"Angiogeneseaktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, die Bildung von Blutgefäßen oder Lymphgefäßen zu hemmen oder zu verstärken.

"Wachstumsfaktoraktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, die Zellproliferation zu hemmen oder zu fördern.

"Zelladhäsionsaktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, die Bindung von Zellen, vorzugsweise von Säugerzellen, an ein Substrat zu fördern oder zu hemmen.

Die Sequenz der Aminosäurereste der vorliegenden Polypeptidverbindungen, des Kern- Tetrapeptids und bevorzugter Ausführungsformen davon werden anhand der Aminosäuren verschiedener Unterklassen mit bestimmten Eigenschaften definiert.

Die Aminosäurereste können allgemein wie folgt in vier große Unterklassen eingeteilt werden:

Sauer, d. h. der Rest weist eine negative Ladung auf, die auf den Verlust eines H-Ions bei physiologischem pH zurückzuführen ist, und der Rest wird von der wässrigen Lösung angezogen und nimmt deshalb in der Konformation eines Peptids, das diesen Rest enthält, Positionen an der Oberfläche ein, wenn sich das Peptid in einem wässrigen Medium befindet.

Basisch, d. h. der Rest weist eine positive Ladung auf, die auf die Verbindung mit einem H-Ion bei physiologischem pH zurückzuführen ist, und der Rest wird von der wässrigen Lösung angezogen und nimmt deshalb in der Konformation eines Peptids, das den Rest enthält, Positionen an der Oberfläche ein, wenn sich das Peptid in einem wässrigen Medium befindet.

Neutral/Nichtpolar, d. h. die Reste sind bei physiologischem pH nicht geladen, und der Rest wird von der wässrigen Lösung abgestoßen und nimmt deshalb in der Konformation eines Peptids, das den Rest enthält, die Innenpositionen ein, wenn sich das Peptid in einem wässrigen Medium befindet.

Neutral/Polar, d. h. die Reste sind bei physiologischem pH nicht geladen, und der Rest wird von der wässrigen Lösung angezogen und nimmt deshalb in der Konformation eines Peptids, das den Rest enthält, die Außenpositionen ein, wenn sich das Peptid in einem wässrigen Medium befindet.

Es versteht sich natürlich, dass bei einer statistischen Anzahl von einzelnen Molekülen einige Moleküle geladen sind und andere nicht geladen sind. Um der Definition von "geladen" zu entsprechen, muss ein erheblicher Anteil (mindestens ungefähr 25%) der einzelnen Moleküle bei physiologischem pH geladen sein.

Die Aminosäurereste können außerdem in cyclische oder nichtcyclische Reste - eine selbstverständliche Unterteilung, die sich auf die Substituentengruppen in der Seitenkette der Reste bezieht - und in kleine oder große Aminosäurereste unterteilt werden. Der Rest wird als klein angesehen, wenn er insgesamt drei oder weniger Kohlenstoffatome enthält. Kleine Reste sind natürlich immer nichtcyclisch.

Gemäß dem vorstehenden Schema werden die in natürlichen Proteinen vorkommenden Aminosäuren wie folgt unterteilt:

Sauer: Asparaginsäure und Glutaminsäure;

Basisch/nichtcyclisch: Arginin und Lysin;

Basisch/cyclisch: Histidin;

Neutral/polar/klein: Glycin, Serin und Cystein;

Neutral/polar/groß/nichtcyclisch: Threonin, Asparagin und Glutamin;

Neutral/polar/groß/cyclisch: Tyrosin;

Neutral/nichtpolar/klein: Alanin;

Neutral/nichtpolar/groß/nichtcyclisch: Valin, Isoleucin, Leucin und Methionin;

Neutral/nichtpolar/groß/cyclisch: Phenylalanin und Tryptophan.

Die Protein-Aminosäure Prolin fällt zwar unter die Klasse der neutralen/nichtpolaren/großen/cyclischen Reste, sie wird jedoch wegen ihrer bekannten Wirkungen auf die sekundäre Konformation der Peptidketten nicht als Alternative berücksichtigt.

Bestimmte häufig auftretende, nicht natürliche Aminosäuren wie z. B. Desaminotyrosin (des Tyr), Agmatin (Agm), n-Formyltryptophan (f-Trp), alpha-Aminoisobuttersäure (Aib) und Sarcosin (Sar), Statin, Ornithin (Orn), Homolysin, Homoserin, Homoarginin, Norleucin (Nle) und Norvalin können ebenfalls in die Verbindungen der Erfindung eingebaut werden. Desaminotyrosin wird am N-Terminus eingebaut. Agmatin und Statin werden am C-Terminus eingebaut. Auf der Grundlage der vorstehenden Definition ist n-Formyl- Trp neutral/nichtpolar/groß/cyclisch, Sar ist neutral/nichtpolar/klein, Aib ist neutral/nichtpolar/nichtcyclisch, Orn ist basisch/nichtcyclisch, Homolysin ist basisch/nichtcyclisch, Homoserin ist neutral/polar/klein, Homoarginin ist basisch/nichtcyclisch, Norleucin ist neutral/nichtpolar/groß/nichtcyclisch und Norvalin ist neutral/nichtpolar/groß/nichtcyclisch.

Die zur Beschreibung der Polypeptidverbindungen der vorliegenden Erfindung verwendete Nomenklatur folgt der üblichen Praxis, nach der die Aminogruppe von jedem Aminosäurerest links und die Carboxygruppe rechts dargestellt wird. Sofern nichts anderes angegeben ist, wird angenommen, dass die nicht ausdrücklich gezeigten amino- und carboxyterminalen Gruppen in den Formeln, die bestimmte ausgewählte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, in der Form vorliegen, die sie bei physiologischen pH-Werten annehmen würden. In den Aminosäure-Strukturtormeln wird jeder Rest im Allgemeinen durch eine Ein-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben-Bezeichnung dargestellt, die dem Trivialnamen der Aminosäure entspricht, und zwar gemäß der folgenden Aufstellung:

In der vorliegenden Anmeldung handelt es sich bei einem Aminosäurerest mit optischer Isomerie um die L-Form, sofern nichts anderes ausdrücklich angegeben ist, beispielsweise durch das Symbol "[D-Xn]".

Verbindungen, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, können durch Abwandeln der offenbarten Formeln auf verschiedene Weise erhalten werden, solange die Aktivität der so erhaltenen Polypeptidverbindungen erhalten bleibt. Zum Beispiel kann eine oder mehrere, gewöhnlich zwei oder weniger und vorzugsweise eine der Aminosäuren dieser Verbindungen, die normalerweise als optisches Isomer der natürlichen L-Form vorliegen, durch das optische Isomer der D-Form ersetzt werden, oder es kann ein racemisches Gemisch der D- und L-Formen in den Molekülen, die die Polypeptidverbindung umfassen, vorliegen.

Außerdem kann in den Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung eine Disulfidbindung vorhanden oder abwesend sein, sofern die Aktivität beibehalten wird. Wie Fachleute auf dem Gebiet erkennen würden, können durch die Bildung einer Peptidbindung mit Aminosäure-Seitengruppen, welche Amino- oder Carboxylgruppen enthalten, verzweigte oder cyclische Ketten gebildet werden. Zu Aminosäuren, die solche Seitengruppen enthalten, gehören beispielsweise Glutaminsäure (Carboxylgruppe), Asparaginsäure (Carboxylgruppe) und Lysin (Amidgruppe). Verzweigte oder cyclische Ketten können auch durch die Bildung einer kovalenten Disulfidbindung zwischen Aminosäureresten mit schwefelhaltigen Seitengruppen wie beispielsweise Cystein erzeugt werden.

So wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich "geschützte" aminoterminale Gruppe auf eine aminoterminale Gruppe, die mit einer beliebigen der verschiedenen Schutzgruppen für den Aminoterminus gekuppelt ist, die herkömmlicherweise in der Peptidsynthese eingesetzt werden. Zu Beispielen für geeignete Gruppen gehören Acyl- Schutzgruppen, z. B. Formyl, Acetyl, Benzoyl, Trifluoracetyl, Succinyl und Methoxysuccinyl; aromatische Urethan-Schutzgruppen, z. B. Benzyloxycarbonyl; und aliphatische Urethan-Schutzgruppen, z. B. tert-Butoxycarbonyl oder Adamantyloxycarbonyl. Gross und Mienhofer Hrsg, The Peptides, Band 3, Seite 3-88 (Academic Press, New York, 1981) offenbaren zahlreiche geeignete Schutzgruppen für den Aminoterminus.

So wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich "geschützte" carboxyterminale Gruppe auf eine carboxyterminale Gruppe, die mit einer der verschiedenen Schutzgruppen für den Carboxyterminus gekuppelt ist. Wie für einen Fachmann leicht ersichtlich ist, gehören zu geeigneten Gruppen tert-Butyl, Benzyl und andere annehmbare Gruppen, die über eine Ester- oder Etherbindung mit der carboxyterminalen Gruppe verbunden sind.

In den Verbindungen enthaltene Aminosäurereste und besonders solche am Carboxy- oder Aminoterminus können auch durch Methylierung, Amidierung, Acetylierung oder Substitution mit anderen chemischen Gruppen modifiziert werden, welche z. B. die Zirkulationshalbwertzeit, die Beständigkeit gegen Proteasen und die Löslichkeit der Verbindungen ändern können, ohne ihre Aktivität zu beeinträchtigen.

Zusätzlich zu den vorangegangenen Definitionen werden bei der Beschreibung der Erfindung die folgenden Abkürzungen verwendet:

BCA Bicinchoninsäure

BSA Rinderserumalbumin

t-Boc t-Butyloxycarbonyl

Bzl Benzyl

ºC Grad Celsius

DCM Dichlormethan

DIEA Diisopropylethylamin

DMEM Dulbecco-Minimalmedium (Dulbecco's minimum essential medium)

DMF Dimethylformamid

HF Fluorwasserstoff

HOBT 1-Hydroxybenzotriazol

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie

mBHA Methylbenzhydrylamin

ug Mikrogramm

ul Mikroliter

ml Milliliter

mM Millimolar

nm Nanometer

NMP N-Methylpyrrolidon

Prozent

PAM Phenylacetamidomethyl

PBS phosphatgepufferte Salzlösung

TFA Trifluoressigsäure

B. Bevorzugte Ausführungsformen

Sämtliche Polypeptidverbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung enthalten die Kern-Tripeptidsequenz:

R&sub1;-X&sub1;-X&sub2;-Cys-R&sub2;

wobei:

R&sub1; Arg oder die Desaminoform davon bedeutet;

X&sub1; und X&sub2; gleich oder verschieden sind und aus der Gruppe bestehend aus Valin, Threonin und Serin ausgewählt werden;

R&sub2; eine geschützte oder ungeschützte carboxyterminale Gruppe umfassend Hydroxyl, Carboxyl, oder einen Aminosäurerest, umfassend Carboxyamid- oder Alkylamidformen davon, vorzugsweise ausgewählt aus der aus Lysin, Glycin und Arginin bestehenden Gruppe, bedeutet.

Besonders bevorzugt sind diejenigen Ausführungsformen, bei denen die Sequenz ausgewählt ist aus:

RVTCG-NH&sub2; (SEQ ID No. 2)

Die Verbindungen zur Verwendung innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung können mittels im Stand der Technik bekannter Methoden wie z. B. durch Festphasen- Peptidsynthese chemisch synthetisiert werden. Die Synthese beginnt am carboxyterminalen Ende des Peptids, wobei eine an der alpha-Aminogruppe geschützte Aminosäure verwendet wird. t-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppen (Boc-Schutzgruppen) können für alle Aminogruppen verwendet werden, wenngleich auch andere Schutzgruppen geeignet sind. Siehe Stewart et al., "Solid-Phase Peptide Synthesis," W. H. Freeman Co., San Francisco (1969) und Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 : 2149-2154 (1963), Vale et al., Science 213, 1394-1397 (1981) und Marke et al., J. Am. Chem. Sci. 103, 3178 (1981). Zu weiteren präparativen Verfahren, die eingesetzt werden können, gehören das Verfahren von Houghton Proc. Natl. ACAD Sci. 82: 5132 (1981) oder ein anderes bevorzugtes Syntheseverfahren insbesondere für kleine verzweigte oder cyclische Peptide, einschließlich herkömmlicher Flüssigphasenverfahren. Das Flüssigphasenverfahren sowie andere Synthesemethoden sind in "Principle of Peptide Synthesis" M. Bodansky Hrsg. (Spring-Verlag 1984) beschrieben. Diese und andere Verfahren zur Peptidsynthese sind auch in den US-Patenten Nr. 3,862,925, 3,842,067, 3,972,859 und 4,105,602, 4,683,291, 4,244,946 und 4,305,872 beispielhaft angegeben.

Zweckmäßigerweise können die Verbindungen mittels manueller Methoden oder automatisch synthetisiert werden, wobei z. B. ein Peptidsynthesegerät 430A Peptide Synthesizer von Applied BioSystems (Foster City, Kalifornien) oder ein automatisches Peptidsynthesegerät SAM II von Biosearch (Biosearch, Inc., San Rafael, Kalifornien) gemäß den Anweisungen in dem Bedienungshandbuch des Herstellers eingesetzt wird.

Wenngleich eine Reinheit des synthetisierten Peptids von mehr als 95% bevorzugt ist, kann eine geringere Reinheit hingenommen werden. Cyclische Peptide, bei denen z. B. zwei Cystein-Aminosäuren miteinander verbunden sind, oder bei denen die Reste eine Disulfidbrücke enthalten, können durch Oxidieren einer verdünnten wässrigen Lösung des Peptids mit K&sub3;[Fe(CN)&sub6;] gebildet werden. Von anderen im Fachgebiet bekannten Cyclisierungsmethoden kann ebenfalls Gebrauch gemacht werden. Das stabilisierte cyclisierte Peptid der vorliegenden Erfindung kann auch durch Bilden einer Peptidbindung zwischen nicht benachbarten Aminosäureresten hergestellt werden. Ein Verfahren zum Bilden einer solchen Peptidbindung ist in Schiller et al., Int. J. Peptide Protein Res. (1985) 25: 171 angegeben.

Fachleute auf dem Gebiet der Peptidsynthese sind sich darüber im klaren, dass die Zwischenprodukte, die gemäß der vorliegenden Offenbarung im Verlauf der Synthese der vorliegenden Verbindungen aufgebaut werden, selbst nützliche Verbindungen sind und somit innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen.

Alternativ können ausgewählte Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung durch Expression von rekombinanten DNA-Konstrukten erzeugt werden, die gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden. Ein solches Herstellungsverfahren kann zur Bereitstellung großer Mengen oder alternativer Ausführungsformen von solchen Verbindungen zweckmäßig sein.

C. Verabreichung

Die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung haben im unversehrten Tier eine Thrombospondin-ähnliche Aktivität. Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung und Zusammensetzungen, welche diese Verbindungen enthalten, von denen gezeigt wurde, dass sie die physiologische Wirkung der Hemmung oder Nachahmung der Wirkung von intaktem Thrombospondin aufweisen, können in zahlreichen therapeutischen und prophylaktischen Anwendungen wie beispielsweise bei einer Krebstherapie, bei der Wundheilung, bei thrombotischen oder thrombolytischen Zuständen, bei der Angiogenese oder der Zellbindung eingesetzt werden.

Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Polypeptiden mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität zum Herstellen von Zusammensetzungen bereit, die eine wirksame Menge von Verbindungen der vorliegenden Erfindung, einschließlich der nicht toxischen Additionssalze, Amide und Ester davon, enthalten, welche allein den vorstehend erwähnten therapeutischen Nutzen ergeben können. Solche Zusammensetzungen können auch zusammen mit physiologisch verträglichen flüssigen, gelartigen oder festen Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und Exzipientien bereitgestellt werden.

Diese Verbindungen und Zusammensetzungen können an Tiere, wie beispielsweise Haustiere, zur tierärztlichen Verwendung und zur klinischen Verwendung bei Menschen auf ähnliche Weise wie andere therapeutische Mittel verabreicht werden. Im Allgemeinen liegt die für die therapeutische Wirksamkeit erforderliche Dosis im Bereich von ungefähr 1 ug bis 300 mg/kg, häufiger im Bereich von 10 ug bis 30 mg/kg Körpergewicht des Wirtsorganismus. Alternativ können Dosen in diesen Bereichen durch kontinuierliche Infusion über einen längeren Zeitraum, in der Regel länger als 24 Stunden, verabreicht werden, bis der gewünschte therapeutische Nutzen erhalten worden ist.

Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als injizierbare flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt; feste Formen, die für eine Lösung oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Das Präparat kann auch emulgiert werden. Der Wirkstoff wird oft mit Verdünnungsmitteln oder Exzipientien vermischt, die physiologisch verträglich und mit dem Wirkstoff vereinbar sind. Geeignete Verdünnungsmittel und Exzipientien sind z. B. Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin oder ähnliches sowie Kombinationen von diesen. Außerdem können die Zusammensetzungen auch kleinere Mengen an Hilfssubstanzen wie Netzmittel oder Emulgatoren, Stabilisatoren oder pH-Puffersubstanzen und dergleichen enthalten, falls dies gewünscht wird.

Die Zusammensetzungen werden herkömmlicherweise parenteral, durch Injektion, z. B. subkutan oder intravenös verabreicht. Zu weiteren Formulierungen, die sich für andere Verabreichungsarten eignen, gehören Zäpfchen, intranasale Aerosole und in einigen Fällen orale Formulierungen. Für Zäpfchen können herkömmliche Bindemittel und Exzipientien z. B. Polyalkylenglycole oder Triglyceride umfassen: solche Zäpfchen können aus Gemischen gebildet werden, die den Wirkstoff in einer Menge im Bereich von 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1% bis 2% enthalten. Orale Formulierungen enthalten üblicherweise eingesetzte Exzipientien wie beispielsweise Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen mit der zur Verwendung in Arzneimitteln erforderlichen Reinheit. Diese Zusammensetzungen liegen in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen zur verzögerten Freigabe oder Pulvern vor und enthalten 10% bis 95%, vorzugsweise 25% bis 70% Wirkstoff. Diese oralen Formulierungen schließen Formulierungen ein, die dazu bestimmt sind, das Peptid zu schützen, bis es absorbiert werden kann.

Die Peptidverbindungen können in den Zusammensetzungen in neutraler Form oder als Salz formuliert werden. Zu pharmazeutisch annehmbaren, nicht toxischen Salzen gehören die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen), welche mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure oder Phosphorsäure oder mit organischen Säuren wie beispielsweise Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen gebildet werden. Salze der freien Carboxylgruppen können mit anorganischen Basen wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)hydroxiden und mit organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen gebildet werden.

Außer den Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, welche eine Thrombospondin-ähnliche Aktivität aufweisen, können Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung auch als Zwischenprodukte bei der Synthese von solchen nützlichen Verbindungen eingesetzt werden.

Die Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung können mit sich selbst homopolymerisiert sein (d. h. (Peptid)n) oder miteinander heteropolymerisiert sein (d. h. (Peptid 1 - Peptid 2). Die Verbindungen können auch durch Disulfidbindungen oder auf andere Weise cyclisiert sein. Die Verbindungen können auch mit bioverträglichen polymeren Verbindungen wie beispielsweise BIOPOLTM-Polymeren (W. R. Grace & Co.-Conn.) konjugiert sein.

Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass die Zusammensetzungen der Erfindung als Agonisten oder Antagonisten des natürlichen Thrombospondins wirken. Es wird auch angenommen, dass diese Verbindungen als Agonisten oder Antagonisten des Circumsporozoit-Proteins, des mit Thrombospondin verwandten unbekannten Proteins, des Antistasins und des Properdin-Komplementproteins wirken. Da die Verbindungen der Erfindung eine geringe Größe (im Vergleich zu intaktem Thrombospondin) aufweisen, sind außerdem die Eigenschaften, welche sie aufweisen, mit größerer Wahrscheinlichkeit spezifisch, im Gegensatz zu den Wirkungen von anderen allgemein adhäsiven Verbindungen wie beispielsweise RGD enthaltenden Verbindungen (deren Sequenz in über 100 Proteinen vorkommt) und Fibronectin. Die Nebenwirkungen der Peptidverbindungen der Erfindung sind im Vergleich mit diesen unspezifisch adhäsiven Verbindungen erheblich verringert.

D. Verwendung

Wie bereits erwähnt, können die Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung auf verschiedenen biologischen, prophylaktischen oder therapeutischen Gebieten verwendet werden. Es kommt in Betracht, dass diese Verbindungen zur Verhütung oder Behandlung von Krankheitszuständen oder -bedingungen brauchbar sind, bei denen die Thrombospondin-ähnliche Aktivität eine Rolle spielt. Zu diesen Krankheitszuständen und -bedingungen gehören die Metastasierung, die Wundheilung, thrombotische Zustände, die Angiogenese und die Zellproliferation, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Es wird beschrieben, dass Antikörper, die gegen die Verbindungen der Erfindung gerichtet sind, als diagnostische Reagenzien, Therapeutika oder Träger von anderen Verbindungen brauchbar sind. Die Verbindungen können auch in biomedizinischen Vorrichtungen verwendet werden.

Zum Nachweis von Verbindungen mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität können zahlreiche in vitro und in vivo-Tests verwendet werden. Zu diesen Tests gehören Zelladhäsionstest, Tests der Blutplättchenaggregation und Zellproliferationstests, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.

Metastasierung

Metastasierung ist die Ausbreitung einer Erkrankung von einem Teil des Körpers auf einen anderen, nicht mit ihm in Verbindung stehenden Teil des Körpers, beispielsweise bei dem Transfer der Zellen eines bösartigen Tumors über den Blutstrom oder Lymphkreislauf. Es wird angenommen, dass die Metastasierung über einen Kaskadenmechanismus erfolgt, welcher die Adhäsion von Tumorzellen an das Endothel, die Retraktion des Endothels, den Abbau der Matrix der Basalmembran und das Eindringen der Tumorzellen in den Blutstrom umfasst. Ein Eingriff in einer beliebigen Phase in dieser Kaskade könnte zur Behandlung oder Verhütung von metastasierenden Krebsarten nützlich sein.

Es wurde gezeigt, dass das natürliche Thrombospondinmolekül die Metastasierung von Tumorzellen verstärkt (Tuszynski et al., Cancer Research (1987) 47: 4130-4133). Die Mechanismen, auf denen die Verstärkung durch Thrombospondin beruht, sind bisher nicht hinreichend geklärt.

Eine antimetastatische Aktivität ist gekennzeichnet durch die Fähigkeit der Verbindungen zur Bindung an Melanomzellen in vitro (Tuszynski et al., Anal. Bio. (1990) 184: 189-91) und durch die Fähigkeit, die Größe und Anzahl von Tumorkolonien in vivo zu verringern (Tuszynski et al., Cancer Research (1987) 47: 4130-4133).

Die Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung sind als antimetastatische Mittel, insbesondere als Mittel gegen eine Metastasierung in der Lunge brauchbar. Diese Verbindungen hemmen die Adhäsion von metastatischen Tumorzellen, insbesondere von solchen, die auf Thrombospondin reagieren. Die Verbindungen verringern auch die Anzahl der Tumorkolonien sowie die Größe der Tumorkolonien.

Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch welche eine solche antimetastatische Aktivität ausgeübt werden kann. Die Peptide können cytotoxisch sein oder die Zellproliferation hemmen. Als Inhibitoren der Zellproliferation können die Verbindungen (1) eine Hemmung der Mitogenese, (2) eine Hemmung der Angiogenese oder (3) eine Aktivierung des Komplementweges und der damit verbundenen Killerzellen bewirken.

Außerdem können die Verbindungen als Träger zum gezielten Hinführen von Toxinen, Arzneimitteln, Hormonen oder bildgebenden Mitteln zu metastatischen Tumorzellen für diagnostische oder therapeutische Zwecke verwendet werden. Diese Träger würden auch an Hepatome binden.

Wundheilung

Die Wundheilung ist das Verschließen von Wunden und kann in vier wesentliche Komponenten unterteilt werden; Entzündung, Angiogenese, Kollagenabscheidung und Epithelisierung. Alle vier Komponenten spielen bei der Heilung von Wunden eine Rolle.

Die Wundheilungsaktivität ist gekennzeichnet durch die Fähigkeit der Verbindungen, eine angiogene Aktivität aufzuweisen, die Fähigkeit der Verbindungen, die Kollagenabscheidung und die DNA-Synthese in dem in vivo-Schwamm-Modell zu stimulieren, oder die Fähigkeit der Verbindungen, die Wundheilung zu verbessern oder die Heilungsdauer in einem in vivo-Modell einer Wunde mit partieller oder vollständiger Dicke zu verringern.

Blutplättchenaggregationshemmung

Die Blutplättchenaggregation ist ein normaler und nutzbringender Vorgang zum Beenden des Blutens von beschädigtem Gewebe. Die Blutplättchenaggregation kann jedoch Probleme im Anschluss an eine kardiovaskuläre Behandlung wie eine Angioplastie, eine thrombolytische Therapie oder eine Gefäßverpflanzung verursachen. Blutplättchen enthalten bis zu 25% TSP-Protein in dem gesamten Alpha-Granula-Protein, das von Blutplättchen sezerniert wird. Deshalb kann die Einbringung eines Peptids, das die Pentapeptidsequenz enthält, welche in dem TSP-Molekül konserviert ist, und welche an Rezeptoren an der Oberfläche eines Blutplättchens bindet, die Aggregation des Blutplättchens und die Bildung eines Gerinnsels verhindern.

Es wird erwartet, dass ein auf dem Pentapeptid beruhendes Arzneimittel ein Hilfsmittel für die Angioplastie und thrombolytische Therapie zur Verwendung zusammen mit anderen gerinnselauflösenden Mitteln ist, welche derzeit auf dem Markt sind (z. B. tPA, Streptokinan). Ein solches Mittel verschlimmert nicht das Bluten und weist auch nicht das Risiko von Nebenwirkungen auf, die bei synthetischen Thrombozyten- Aggregationshemmern üblich sind. Außerdem kann ein solches Peptid dazu beitragen, Gefäßverpflanzungen mit kleinem Durchmesser (wie sie in der Herz-Bypass-Chirurgie verwendet werden) offen zu halten. Ähnliche Anwendungen werden für Patienten mit einem Schlaganfallrisiko ins Auge gefasst.

Die gegen die Blutplättchenaggregation gerichtete Aktivität wird durch eine Reihe von Tests bestimmt, u. a. durch (1) die Hemmung der durch ADP oder Thrombin induzierten Blutplättchenaggregation bei gewaschenen Blutplättchen; (2) die Hemmung der durch ADP induzierten Blutplättchenaggregation in blutplättchenreichem Plasma; und (3) die Hemmung einer durch Kollagen induzierten Blutplättchenaggregation, die in vivo gemessen wird.

Angiogenese

Die Angiogenese ist die Bildung von Blut- und Lymphgefäßen. Die Angiogenese ist während der Entwicklung, bei der Wundheilung und für das Wachstum eines soliden Tumors unentbehrlich. Die Angiogenese ist ein komplexer Vorgang, der das Sprießen und die Wanderung von Endothelzellen, ihre Proliferation und ihre Differenzierung zu einer röhrenartigen Struktur und die Erzeugung einer Basalmembranmatrix um das Gefäß herum erfordert (Herbert et al. 1988, L. Cell. Biol. 106, 1365-1373). Die Angiogenese ist auch für die Entwicklung und das Wachstum von Tumoren und die Metastasierung unentbehrlich. Die Verhinderung der Angiogenese kann das Wachstum eines soliden Tumors hemmen. Die Verwendung der Verbindungen dieser Erfindung kann einen oder mehrere Schritte in dem Kaskadenprozess der Angiogenese hemmen, und deshalb kann ein solches Peptid zum Hemmen der Metastasierung klinisch brauchbar sein. Die Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung sind bei der Modulation der Angiogenese, insbesondere beim Fördern der Wundheilung und beim Hemmen oder Verhindern des Tumorwachstums brauchbar. Die Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung sind auch zum Hemmen oder Verhindern einer diabetischen Retinopathie, eines neovaskulären Glaukoms und der rheumatoiden Arthritis brauchbar. Herkömmliche Angiogenesetests sind im Fachgebiet bekannt. Zu diesen Tests gehören Proliferations- und Migrationsuntersuchungen unter Verwendung verschiedener Zelllinien, die Kollagenasehemmung und eine in vivo-Gefäßneubildung an Chorioallantoismembranen von Hühnereiern (CAM-Test), sie sind aber nicht darauf beschränkt.

Adhäsion und Zellbindung

Die Peptide zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können zum Herstellen einer Oberfläche für eine optimale Zellkultur und für Prothesenmaterialien zum Fördern der Bindung mit dem umgebenden Gewebe verwendet werden. Diese Peptide können als Zellbindungsprotein nützlich sein, um durch Behandeln einer hydrophoben Oberfläche wie beispielsweise unbehandeltes synthetisches Kunststoffharz und insbesondere Materialien, die für verschiedene Membrananwendungen verwendet werden, z. B. Nitrocellulose oder Polysulfon oder vergleichbares Material, mit dem Peptid ein Substrat, an das Zellen binden, bereitzustellen. Die Zellbindungseigenschaften der Peptide können auch dazu verwendet werden, Polypeptide kovalent an einen festen Träger wie beispielsweise Gele oder Kunstharze oder langkettiges Polysaccharid zu binden. Die letztgenannte Vorgehensweise kann für verschiedene Affinitätschromatographieanwendungen eingesetzt werden.

Die Peptide zur Verwendung gemäß der Erfindung können auch zum Isolieren von Thrombospondin-Zelloberflächenrezeptoren aus Extrakten von Zellen oder Zellmembranen verwendet werden. Es können herkömmliche Arbeitsweisen wie beispielsweise eine Affinitätschromatographie eingesetzt werden. Die Thrombospondin- Zelloberflächenrezeptoren können dazu verwendet werden, bessere Thrombospondinanaloga zu entwickeln oder überschüssiges Thrombospondin aus Serum zu entfernen.

Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung angegeben und bringen keinerlei Beschränkung des Erfindungsgegenstandes mit sich.

Beispiele

Die Peptide zur Verwendung gemäß der Erfindung können durch herkömmliche Peptidsynthese-Verfahren synthetisiert werden. Die bevorzugten herkömmlichen Värfahren machen von den Arbeitsweisen Gebrauch, die in Int. J. Pegt. Proc. Res. 21, 57-63 (1983) beschrieben sind. Die Festphasen-Synthese von Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Science 150, 178-185 (1965); ebenda 232, 341-347 (1986) ist ebenfalls bevorzugt. Die Festphasen-Synthese beginnt im Allgemeinen am C-Terminus des Peptids durch Kupplung einer geschützten alpha-Aminosäure an ein geeignetes Harz, z. B. an Phenylacetamidomethyl(PAM)-Polystyrol-Harz oder p- Methylbenzhydrylamin(mBHA)-Harz, wenn ein Peptid mit einem C-terminalen Carboxyamid synthetisiert wird. Bei der Synthese werden je nach Bedarf geeignete Schutzgruppen für die Aminosäure-Seitenketten verwendet. So wird Asparaginsäure an der beta- Carboxylgruppe als Benzylester geschützt, und Arginin wird an der Guanidinogruppe durch Tosyl geschützt. Nach der Synthese des gewünschten Peptids wird das Peptid von dem Harz abgespalten, und die Schutzgruppen werden durch Behandlung mit einem Reagenz wie beispielsweise Fluorwasserstoff (HF) entfernt. Das Peptid kann dann durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder andere solche Methoden zur Peptidaufreinigung gereinigt werden. Hintergrundinformation über die etablierten Methoden zur Festphasen-Peptidsynthese findet man in "Solid Phase Peptide Synthesis" von Stewart und Young, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1969.

In Übereinstimmung mit der vorstehenden Beschreibung wurden die folgenden Arbeitsweisen für die chemische Synthese von neuartigen synthetischen Peptiden verwendet:

Vergleichsbeispiel 1 Synthese der Peptidsequenz VTCG (SEC ID No. 1) mit einem C-terminalen Amid

Ein für ein C-terminales Amid geeignetes 4-Methylbenzhydrylamin(MBHA)-Harz wurde in Päckchen aus Polypropylengewebe (64 u) eingeschlossen. Alle Päckchen wurden in ein gemeinsames Gefäß mit CH&sub2;Cl&sub2; gegeben und kräftig geschüttelt, um das Harz zu waschen und quellen zu lassen. Alle nachfolgenden Schritte wurden unter kräftigem Schütteln durchgeführt, um einen ausreichenden Lösungsmitteltransfer zu gewährleisten. Anschließend wurde das N-α-Butoxycarbonyl durch 30 Minuten dauernde Acidolyse unter Verwendung von 55% Trifluoressigsäure (TFA)/CH&sub2;Cl&sub2; entfernt, wobei die α-Aminosäuregruppe in Form eines TFA-Salzes zurückblieb. Die Päckchen wurden dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (2x), IPA (2x) und CH&sub2;Cl&sub2; (2x) gewaschen, um überschüssige TFA zu entfernen und die Neutralisierung vorzubereiten. Das IFA-Salz wurde neutralisiert, indem die Päckchen dreimal jeweils zwei Minuten lang mit 5% Diisopropylethylamin in CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen wurden. Anschließend wurden sie zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen, um überschüssige Base zu entfernen. Die Päckchen wurden dann aus dem gemeinsamen Gefäß entnommen und zu ihren jeweiligen 0,2 M Aminosäurelösungen zugegeben, welche vor der Neutralisierung anhand von computergenerierter Information hergestellt worden waren. Anschließend wurde ein gleiches Volumen von 0,2 M Dipropylcarbodiimid zugegeben, um die Kupplungsreaktion zu aktivieren. Nach einer einstündigen Kupplung bei Raumtemperatur wurden die Päckchen mit Dimethylformamid und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und in das gemeinsame Gefäß zurückgegeben. Dieser Vorgang wurde für jede Aminosäure wiederholt. Zur Abspaltung wurde das Peptid 90 Minuten lang bei -10ºC bis 0ºC mit 92,5% Fluorwasserstoff/7,5% Anisol umgesetzt. Anisol wurde als Fängersubstanz verwendet, die mit Carbokationen reagiert, die beim Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen erzeugt werden. Diese Lösung wurde anschließend unter Verwendung eines starken N&sub2;-Flusses, gefolgt von der Verwendung eines Saugvakuums entfernt, wobei die Temperatur bei 0ºC gehalten wurde. Übrig gebliebenes Anisol wurde mit zwei Waschungen mit Ethylether entfernt. Das Peptid wurde dann mit 10% Essigsäure extrahiert.

Die Reinheit des ungereinigten Peptids wurde durch analytische RP-HPLC unter Verwendung eines Beckman-System Gold mit einer Vydac C-18-Säule bei einer Flussrate von 1 ml/min überprüft. Das verwendete Lösungsmittelsystem war 0,05% wässrige TFA (A) und 0,05% TFA in Acetonitril (B) mit einem Gradienten von 5-65% B in 30 Minuten, wobei die Extinktion bei 215 um gemessen wurde. Die Reinigung erfolgte durch präparative "Waters delta prep. 3.000"-HPLC mit einer "Waters prep. Pak Nodule Radial Compression C18"-Säule (25 cm · 5 cm, 10-20 u). Das Lösungsmittelsystem war 0,05% wässrige TFA (A) und 0,05% TFA in Acetonitril (B). Es wurden verschiedene lineare Gradienten benutzt, wobei dia Extinktion bei 230 nm gemessen wurde und Fraktionen von 40 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden dann mit dem analytischen System von Beckman analysiert. Die Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Das trockene Endprodukt wurde nochmals mittels analytischer RP-HPLC analysiert.

Vergleichsbeispiel 2 Chemische Synthese der Peptidsequenz VTCG-Säure (SEQ ID No. 1)

Ein für eine C-terminale Säure geeignetes Phenylacetamidomethyl(PAM)-Harz wurde in Päckchen aus Polypropylengewebe (64 u) eingeschlossen. Alle Päckchen wurden in ein gemeinsames Gefäß mit CH&sub2;Cl&sub2; gegeben und kräftig geschüttelt, um das Harz zu waschen und quellen zu lassen. Alle nachfolgenden Schritte wurden mit kräftigem Schütteln durchgeführt, um einen ausreichenden Lösungsmitteltransfer zu gewährleisten. Das N-α-Butoxycarbonyl wird dann durch 30-minütige Acidolyse unter Verwendung von 55% Trifluoressigsäure (TFA)/CH&sub2;Cl&sub2; entfernt, wobei die α-Aminosäuregruppe in der Form eines TFA-Salzes zurückbleibt. Die Päckchen werden dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (2x), IPA (2x) und CH&sub2;Cl&sub2; (2x) gewaschen, um überschüssige TFA zu entfernen und die Neutralisierung vorzubereiten. Das TFA-Salz wurde neutralisiert, indem die Päckchen dreimal jeweils zwei Minuten lang mit 5% Diisopropylethylamin in CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen wurden. Darauf folgten zwei Waschungen mit CH&sub2;Cl&sub2;, um überschüssige Base zu entfernen. Die Päckchen wurden dann aus dem gemeinsamen Gefäß entnommen und zu ihren jeweiligen 0,2 M Aminosäurelösungen zugegeben, welche vor der Neutralisierung anhand von computergenerierter Information hergestellt wurden. Dann wurde ein gleiches Volumen von 0,2 M Diisopropylcarbodiimid zugegeben, um die Kupplungsreaktion zu aktivieren. Nach 1 Stunde langem Kuppeln bei Raumtemperatur wurden die Päckchen mit Dimethylformamid und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und in das gemeinsame Gefäß zurückgegeben. Dieser Vorgang wurde für jede Aminosäure wiederholt. Zur Abspaltung wurde das Peptid 90 Minuten lang bei -10ºC bis 0ºC mit 91,5% Fluorwasserstoff/7,5% Anisol umgesetzt. Anisol wurde als Fängersubstanz verwendet, um mit Carbokationen zu reagieren, die infolge der Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppe erzeugt werden. Diese Lösung wurde anschließend unter Verwendung eines starken N&sub2;-Flusses, gefolgt von der Verwendung eines Saugvakuums entfernt, wobei die Temperatur bei 0ºC gehalten wurde. Übrig gebliebenes Anisol wird mit zwei Waschungen mit Ethylether entfernt. Das Peptid wird dann mit 10% Essigsäure extrahiert.

Die Reinheit des ungereinigten Peptids wurde durch analytische RP-HPLC unter Verwendung eines Beckman-System Gold mit einer Vydac C-18-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min überprüft. Das verwendete Lösungsmittelsystem war 0,05% wässrige TFA (A) und 0,05% TFA in Acetonitril (B) mit einem Gradienten von 5-65% B in 30 Minuten, wobei die Extinktion bei 215 nm gemessen wurde. Die Reinigung erfolgte durch präparative "Waters delta prep. 3.000"-HPLC mit einer "Waters Prep. Pak Nodule Radial Compression C18"-Säule (25 cm · 5 cm, 10-20 u). Das Lösungsmittelsystem war 0,05% wässrige TFA (A) und 0,05% TFA in Acetonitril (B). Es wurden verschiedene lineare Gradienten verwendet, wobei die Extinktion bei 230 nm gemessen wurde und Fraktionen von 40 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden dann in dem analytischen System von Beckman analysiert. Die gewünschten Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Das trockene Endprodukt wurde nochmals unter Verwendung einer analytischen RP-HPLC analysiert. Ein typisches HPLC-Chromatogramm für dieses Peptid nach der Aufreinigung ist in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 3 Chemische Synthese von weiteren Peptiden

Nach den in den Beispielen 1 und 2 und in Int. J. Peot. Proc. Res. 21, 57-65 (1983) dargestellten Arbeitsweisen mit geeigneter Abwandlung wurden die folgenden Peptide synthetisiert. Alle Peptide der Erfindung wurden mit herkömmlichen LAL-Testverfahren auf Endotoxine getestet, und dabei wurde festgestellt, dass sie endotoxinfrei waren:

RVTCG-NH&sub2; (SEQ ID No. 2)

Beispiel 4 Adhäsion verschiedener Zellen an TSP und die Peptide

In diesem Beispiel wurde eine Reihe von Peptiden getestet, um die Fähigkeit der Peptide zur Bindung an verschiedene Zellen im Vergleich zu Thrombospondin zu bestimmen. Die in diesen Tests verwendeten Zellen sind B&sub1;&sub6;F&sub1;&sub0;-Melanomzellen, menschliche Lungenkarzinomzellen, Rinderendothelzellen und glatte Muskelzellen von Kaninchen. Es wird angenommen, dass die Wirkung von Thrombospondin bei der Metastasierung durch seine adhäsiven Eigenschaften vermittelt wird. In allgemeiner Übereinstimmung mit der Offenbarung von Tuszynski et al. (Anal. Bio. (1990) 184: 189-91) wurde ein Test entwickelt, bei dem die Fähigkeit von Zellen bestimmt wird, an den Thrombospondinfragmenten oder -analoga der Erfindung zu haften. In diesem Test diente Thrombospondin (das mit dem Verfahren von Tuszynski et al. J. Biol. Chem. (1985) 260: 12240-5 gereinigt wurde) als positive Kontrolle und Gemische der Peptide VCTGSC, ANKHYF und TCVCGS dienten als negative Kontrollen. Die Thrombospondinanaloga der Erfindung wurden wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben synthetisiert. Zwei Mikrogramm des Peptids oder der Kontrollproteine wurden über Nacht in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen an der Luft getrocknet. Die Vertiefungen wurden dann mit HEPES-gepufferter Salzlösung gewaschen und 1 Stunde lang mit 1% fettsäurefreier BSA in HEPES-gepufferter Salzlösung blockiert.

Die verschiedenen Zellen wurden mit herkömmlichen Methoden kultiviert und in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Die geernteten Zellen wurden zweimal mit serumfreiem Dulbecco Minimalmedium (DMEM) (Flow Laboratories) gewaschen und in HEPES-gepufferter Salzlösung, die 5 mM Glucose und 100 uM MgCl&sub2; enthielt, in einer Endkonzentration von 2 · 10&sup5;-Zellen/ml suspendiert. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte, welche die verschiedenen Liganden enthielt, wurden 200.000 Zellen von der Zellsuspension zugegeben und die Platte bei 37ºC 30 Minuten lang in einen CO&sub2;- Inkubator inkubiert. Nicht anhaftende Zellen wurden durch Absaugen entfernt, und die Vertiefungen wurden dreimal mit 200 ul PBS gewaschen. Das zellgebundene Gesamtprotein wurde durch Auflösen der anhaftenden Zellen in den Mikrotiterplattenvertiefungen mit 200 ul der Pierce BCA-Arbeitslösung (Pierce Chem. Co. Booklet No. 23225 (1987)) direkt bestimmt. Die Platte wurde mit einer Mylar-Klebefolie (Flow Labs) bedeckt und 30 Minuten lang bei 60ºC inkubiert. Die Platten wurden auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, die Deckfolien wurden entfernt, und die Extinktion jeder Vertiefung wurde bei 562 nm mit einem Mikrotiterplattenlesegerät (Biotek, Burlington, Vermont) bestimmt. Die Extinktionswerte wurden mit Hilfe eines empirisch bestimmten Umwandlungsfaktors in die Anzahl der anhaftenden Zellen umgerechnet.

Die in den Fig. 1 bis 4 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Peptide zur Verwendung gemäß der Erfindung adhäsive Eigenschaften gegenüber verschiedenen Zelllinien aufweisen.

Beispiel 5 Die Wirkung der Peptide auf die Metastasierung von B&sub1;&sub6;F&sub1;&sub0;-Lungentumorzellen

Das in vivo-Modell, das zum Nachweis der antimetastatischen Aktivität der Peptidverbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung verwendet wird, ist von Tuszynski et al. (Cancer Res. (1987) 47: 4130-4133) beschrieben. Kurz zusammengefasst wurden schwarzen C57-Mäusen 1 · 10&sup5; B&sub1;&sub6;F&sub1;&sub0;-Maus-Melanomzellen in Gegenwart von Kontrollpuffer (Hepes-gepufferter Salzlösung, pH 7,4) oder von 1 mg der angegebenen Peptidverbindung intravenös injiziert. Für jede Verbindung wurde fünf oder sechs Tiere verwendet. Die in dem Test verwendeten Peptide hatten keine Auswirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen, wie durch Ausschluss von Trypanblau-Farbstoff bestimmt wurde. Außerdem zeigten die Peptide in einer Konzentration von 1 mg/ml nach 24stündiger Co-Kultivierung keine Wirkung auf das Zellwachstum. Nach 14 Tagen wurden die Mäuse getötet und die Anzahl der Lungentumore ausgezählt.

Die in Fig. 5 gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Peptide eine antimetastatische Aktivität aufweisen. Die Balkendiagramme zeigen den Mittelwert der Anzahl der in den Behandlungsgruppen beobachteten Lungentumore, und die Fehlerbalken geben die Standardabweichung vom Mittelwert wieder.

SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Eyal, Jacob Hamilton, Bruce King Tuszynski, George Paul

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Peptide mit Thrombospondinähnlicher Aktivität und ihre therapeutische Verwendung

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2

(iv) KORRESPONDENZADRESSE:

(A) ADRESSAT: W. R. Grace & Co.-Conn.

(B) STRASSE: 7379 Route 32

(C) ORT: Columbia

(D) STAAT: Maryland

(E) LAND: USA

(F) PLZ: 21044

(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:

(A) TYP DES MEDIUMS: Floppy-Diskette

(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Word Perfect 5.0

(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER:

(B) ANMELDEDATUM:

(C) KLASSIFIKATION: 530

(viii) INFORMATION ÜBER DEN ANWALT/VERTRETER:

(A) NAME: Appleby, Vanessa L.

(B) REGISTRIERNUMMER: 33223

(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 01-7847

(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:

(A) TELEFON: (301) 531-4515

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:


Anspruch[de]

1. Verwendung eines Polypeptids mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität zum Herstellen eines Medikaments mit antimetastatischer Aktivität, wobei das Polypeptid die Sequenz:

R&sub1;-X&sub1;-X&sub2;-Cys-R&sub2;

aufweist, worin:

R&sub1; Arg oder die Desaminoform davon bedeutet;

X&sub1; Ser, Thr oder Val bedeutet;

X&sub2; Ser, Thr oder Val bedeutet; und

R&sub2; eine geschützte oder ungeschützte carboxyterminale Gruppe umfassend Hydroxyl, Carboxyl, oder einen Aminosäurerest, umfassend Carboxyamid- oder Alkylamidformen davon, bedeutet.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei R&sub2; aus der Gruppe bestehend aus Lys, Gly und Arg ausgewählt ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Polypeptidverbindung aus der Gruppe bestehend aus:

RVTCG-NH&sub2; (SEQ ID NO: 2)

ausgewählt ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments, welches eine Tumorzellmetastasierung hemmt.

5. Verwendung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments, welches eine auf Krebs zurückzuführende Blutplättchenaggregation verhindert.

6. Verwendung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments, welches ein Hilfsmittel bei einer thrombolytischen Therapie von Blutgerinnseln, die auf Krebs zurückzuführen sind, ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments, welches eine mit einem Tumorwachstum verbundene Angiogenese hemmt.

8. Verwendung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments, welches eine mit einer Tumorzellmetastasierung verbundene Angiogenese hemmt.

9. Verwendung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments, welches die Tumorgröße verringert.

10. Verwendung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments, welches die Anzahl der Tumorkolonien verringert.

11. Verwendung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments, welches außerdem ein Toxin, Arzneimittel, Hormon oder bildgebendes Mittel umfasst, wobei das Polypeptid als Träger dient, der das Toxin, Arzneimittel, Hormon oder bildgebende Mittel zu metastatischen Tumorzellen hinführt.







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