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Dokumentenidentifikation DE69624993T2 21.08.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0757098
Titel Hitzebeständige Maltosephosphorylase, Prozess für ihre Herstellung, Bakterien,die für ihre Herstellung verwendet werden,und Methoden zur Verwendung des Enzyms
Anmelder Showa Sangyo Co., Ltd., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Ishii, Keiko, Funabashi-shi, Chiba-ken, 273, JP;
Inoue, Yasushi, Funabashi-shi, Chiba-ken, 273, JP;
Tomita, Tetsuji, Funabashi-shi, Chiba-ken, 273, JP
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 69624993
Vertragsstaaten DE, DK, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 26.07.1996
EP-Aktenzeichen 961121142
EP-Offenlegungsdatum 05.02.1997
EP date of grant 27.11.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.08.2003
IPC-Hauptklasse C12N 9/10
IPC-Nebenklasse C12P 21/00   C12N 1/20   C12P 19/02   C12P 19/12   C12N 1/26   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung und Angaben zum Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Maltosephosphorylase mit ausgezeichneter Hitzebeständigkeit, ein Verfahren zur Herstellung hiervon, zu ihrer Herstellung verwendete Bakterien und Verfahren zu ihrer Verwendung, und mehr im einzelnen bezieht sie sich auf neue Maltosephosphorylase mit hoher Hitzestabilität, welche zur genus Bacillus gehörende thermophile Bakterien bilden, ein Verfahren zur Herstellung hiervon, die thermophilen Bakterien und ein Verfahren zur Herstellung von β-Glucose-1-phosphorsäure oder Trehalose.

Trehalose ist ein Disaccharid weit verbreitet über Hefen, Schimmel, Bakterien, Insekten, etc., und es ist eine brauchbare Substanz, deren Verwendung als ein Schutzmittel gegenüber Austrocknen (WO 87/00196) in Betrachtung gezogen wird, da sie stabiler als andere Disaccharide ist.

Bislang sind als Verfahren zur Herstellung von Trehalose ein Extraktionsverfahren aus einer Hefe (japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 292986/1993), ein Fermentationsverfahren unter Verwendung eines Bakteriums (japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 211882/1993), etc. bekannt. Jedoch sind für Trehalose, welche bei diesen Verfahren hergestellt wird, ihre Herstellungskosten sehr hoch, beispielsweise weil die Massenproduktion unter Berücksichtigung von Verfahrensschritten schwierig ist, und die Einrichtungen und Stufen zur Entfernung von Verunreinigungen kompliziert sind, so daß Trehalose sehr kostspielig ist und es unmöglich war, sie für Nahrungsmittelzwecke zu verwenden.

Andererseits werden enzymatische Prozesse als ein effektives Verfahren zur preiswerten Herstellung von Trehalose erwähnt. Ein Beispiel hiervon ist ein Verfahren einer gleichzeitigen Reaktion unter Verwendung von Maltosephosphorylase und Trehalosephosphorylase (japanische veröffentlichte, geprüfte Patentanmeldung Nr. 60998/1988). Dieses Verfahren benutzt Reaktionen, daß die zwei Arten von Phosphorylasen auf Maltose bzw. Trehalose einwirken, um sie reversibel zu phosphorolysieren, und dabei werden Glucose und β-Glucose-1-phosphorsäure gebildet, und das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß beide Enzyme simultan zur Einwirkung auf Maltose als ein preiswertes Ausgangsmaterial zur Bildung von Trehalose gebracht werden.

Soweit bekannt, können als Maltosephosphorylasen solche erwähnt werden, welche durch Lactobacillus brevis ATCC 8287 (Agr. Biol. Chem. 37(12), 2813-2819, 1973), Lactobacillus sanfrancisco (japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 91778/1989), Lactobacillus brevis DMS 20054, NCIB 8836, 8561 und 8562, Lactobacillus plantarum DMS 20174 und FERM P-4628, Lactobacillus reuteri DMS 20016, Lactobacillus fermentum DMS 20052, Streptococcus spec. FERM P- 4624, FERM P-4625, P-4626 und FERM P-4627 (japanische veröffentlichte, geprüfte Patentanmeldung Nr. 54036/1985) und Plesiomonas SH-35 (Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 69 (außergewöhnliche Extranummer) 28, 1995; Oyo Toshitsu Kagaku, 42(I), 19- 25, 1995) erzeugt werden.

Unter diesen, deren physikochemische Eigenschaften geprüft sind, sind nur Maltosephosphorylasen, erzeugt durch Lactobacillus brevis ATCC 8287--(Agr. Biol. Chem. 37(12), 2813-2819, 1973), Lactobacillus sanfrancisco (japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 91778/1989) und Plesiomonas SH-35 (Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 69 (außergewöhnliche Extranummer), 28, 1995). Alle thermischen Stabilitäten dieser Enzyme sind so niedrig wie 40ºC oder darunter, und wenn die Trehaloseherstellung unter Verwendung dieser Enzyme durchgeführt wird, tritt ein Problem auf, daß die Möglichkeit einer Verunreinigung mit verschiedenen Mikroorganismen während der Herstellungsstufen hoch ist, da die Reaktionstemperatur niedrig ist und es damit schwierig ist, sie unter Bedingungen einer industriellen Herstellung zu verwenden.

Gegenstand und Zusammenfassung der Erfindung

Als ein Verfahren, um Trehalose preiswert und in einem industriellen Maßstab herzustellen, wird angenommen, daß das Enzymverfahren, bei welchem sowohl Maltosephosphorylase als auch Trehalosephosphorylase eingesetzt werden und Maltose als Ausgangsmaterial verwendet wird, am meisten effektiv ist.

Wenn andererseits die Herstellung durch enzymatische Reaktion industriell durchgeführt wird, wird üblicherweise versucht, die Reaktionstemperatur zum Zweck der Erniedrigung von Kontamination mit verschiedenen Mikroorganismen höher zu halten. Weiterhin erbringt die Erhöhung der Reaktionstemperatur solche Vorteile, z. B. daß die Charge pro Einheitsvolumen erhöht werden kann, da die Löslichkeiten des Substrates und Produktes erhöht werden, und die Reaktionszeit verkürzt werden kann, da die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion gesteigert wird, und dies ist vorteilhaft im Hinblick auf die Kosten.

Zur Herstellung von Trehalose durch enzymatische Reaktion bei hohen Temperaturen ist hitzebeständige Maltosephosphorylase mit hoher thermischer Stabilität erforderlich. Jedoch haben die oben genannten Maltosephosphorylasen, welche aus den genera Lactobacillus und Plesiomonas herrühren, nicht so hohe thermische Stabilität.

Daher sind Enzyme, welche für tatsächliche enzymatische Reaktion bei hoher Temperatur geeignet sind, spezifische Enzyme, welche bei 55ºC oder mehr stabil sind, erwünscht.

Die vorliegenden Erfinder stellten Untersuchungen auf hitzebeständige Maltosephosphorylase, welche Glucose und β- Glucose-1-phosphorsäure aus Maltose erzeugt, aus der Natur an und als Ergebnis haben sie gefunden, daß bestimmte thermophile Bakterien, die zur Genus Bacillus gehören, gut Enzyme bilden, die eine Antwort auf die obige Aufgabe sind, und so wurde die Erfindung abgeschlossen.

Weiter haben sie gefunden, daß hitzebeständige Maltosephosphorylasen, welche durch Flüssigkeitskultur dieser Stämme erzeugt werden, für die Herstellung von Trehalose, falls erforderlich nach Reinigung oder Immobilisierung, eingesetzt werden können. Die Erfindung liefert daher neue hitzebeständige Maltosephosphorylase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, bei der Herstellung hiervon verwendete Bakterien und Verfahren zur Herstellung von β-Glucose-1-phosphorsäure und Trehalose.

Diese Aufgaben der Erfindung wurden gelöst durch hitzebeständige Maltosephosphorylase mit den folgenden Eigenschaften:

(1) Wirkung

Phosphorolysiert Maltose reversibel; Nämlich, wenn sie zur Einwirkung auf Maltose in Anwesenheit von Phosphorsäure gebracht wird, erzeugt sie Glucose und β-Glucose-1- phosphorsäure in einer äquimolaren Menge, und wenn sie zur Einwirkung auf Glucose und β-Glucose-1-phosphorsäure gebracht wird, erzeugt sie Maltose und Phosphorsäure in einer äquimolaren Menge,

(2) Substrat-Spezifität

Wirkt spezifisch auf Maltose,

(3) Temperatur-Optimum

Das Temperatur-Optimum von Maltose-Phosphorylasereaktion ist von ungefähr 55ºC bis ungefähr 70ºC, und es zeigt etwa 50% oder mehr der maximalen Aktivität in dem Bereich von 50ºC bis 70ºC,

(4) Hitze-Stabilität

Hat eine Aktivität von etwa 80% der nicht behandelten nach einer Behandlung in 10 mM Acetatpuffer (pH 6,0) bei 60ºC für 15 Minuten.

(5) pH-Optimum

6,0 bis 7,0.

(6) pH-Stabilität

Stabil bei pH 5,5 bis 8,0.

(7) Molekulargewicht

150.000 bis 190.000, wenn durch Gelfiltrationschromatographie gemessen.

Darüber hinaus hat das Enzym die folgenden zusätzlichen Eigenschaften:

(8) Inaktivierung

100% inaktiviert beim Erhitzen auf 100ºC für 10 Minuten,

(9) Isoelektrischer Punkt

4,7 bis 5,1,

(10) Inhibitor

Ihre Aktivität wird stark gehemmt mit HgCl&sub2;.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser Maltosephosphorylase, welches die Kultivierung in einem Nährmedium umfaßt von

Bacillus sp. RK-1 (FERM BP-5592) oder einer Mutante hiervon, welche die Fähigkeit zur Bildung von Maltosephosphorylase besitzt, oder

Bacillus sp. MK-1 (FERM BP-5593) oder einer Mutante hiervon, welche die Fähigkeit zur Bildung von Maltosephosphorylase besitzt, und

Gewinnen der gebildeten Maltosephosphorylase aus der Kulturbrühe.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von β-Glucose-1-phosphorsäure, welches das Umsetzen von Maltose mit Phosphorsäure oder einem Phosphatsalz in einem wässrigen Medium bei 55 bis 70ºC, bei pH 4,5 bis 8,0, in Anwesenheit dieser hitzebeständigen Maltosephosphorylase umfaßt.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose, welches das Umsetzen von Maltose mit Phosphorsäure oder einem Phosphatsalz in einem wässrigen Medium bei 55 bis 70ºC, bei pH 4,5 bis 8,0, in Anwesenheit dieser hitzebeständigen Maltosephosphorylase umfaßt.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt die optimale Temperatur einer hitzebeständigen Maltosephosphorylase, erhalten gemäß der Erfindung.

Fig. 2 zeigt die Hitzestabilität der hitzebeständigen Maltosephosphorylase, erhalten gemäß der Erfindung.

Fig. 3 zeigt das pH-Optimum der hitzebeständigen Maltosephosphorylase, erhalten gemäß der Erfindung.

Fig. 4 zeigt die pH-Stabilität der hitzebeständigen Maltosephosphorylase, erhalten gemäß der Erfindung.

Fig. 5 zeigt ein Diagramm, erhalten durch Analyse mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie einer Trehalose enthaltenden Zuckerlösung, erhalten durch Einwirkenlassen der hitzebeständigen Maltosephosphorylase der Erfindung und einer hitzebeständigen Trehalosephosphorylase auf eine Zuckerlösung mit hohem Maltosegehalt (Beispiel 5).

Fig. 6 zeigt das Temperatur-Optimum einer hitzebeständigen Trehalosephosphorylase, welche aus Bacillus stearothermophilus SK-1 erhalten wurde, und die zur Herstellung von Trehalose durch Reaktion auf Maltose mit Phosphorsäure oder einem Phosphatsalz verwendet werden kann.

Fig. 7 zeigt die Hitzestabilität der hitzebeständigen Trehalosephosphorylase, erhalten aus Bacillus stearothermophilus SK-1.

Fig. 8 zeigt das pH-Optimum der hitzebeständigen Trehalosephosphorylase, erhalten aus Bacillus stearothermophilus SK-1.

Fig. 9 zeigt die pH-Stabilität der hitzebeständigen Trehalosephosphorylase, erhalten aus Bacillus stearothermophilus SK-1.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die enzymologischen Eigenschaften der hitzebeständigen Maltosephosphorylase der Erfindung sind wie folgt. Als die hitzebeständige Maltosephosphorylase wurde eine in Beispiel 1 erhaltene und aus Bacillus sp. RK-1 hergestellte verwendet.

In diesem Zusammenhang wurde die Maltosephosphorylaseaktivität gemäß der folgenden Methode untersucht. Eine Enzymlösung (0,4 ml), 0,06 ml von 0,5 M Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0), 0,6 ml von 2 Gew./Vol.-% Maltose und 0,14 ml destilliertes Wasser wurden gemischt, und die Reaktion wurde bei 60ºC für 15 Minuten durchgeführt und durch Kochen für 10 Minuten beendet. Dann wurden 0,02 ml einer Probe aus der Lösung mit beendeter Reaktion entnommen, 3 ml eines Reagens für Glucoseprüfung (Glucose CII-Test Wako; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden zugesetzt, die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur für 10 Minuten durchgeführt, die spezifische Absorption bei 505 nm wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen, und die Menge von in der Reaktionslösung gebildeter Glucose wurde aus dem gemessenen Wert bestimmt. Aus der Menge der gebildeten Glucose wird die Menge des Enzyms, welche zur Phosphorolyse von 1 uMol Maltose in 1 Minute erforderlich ist, berechnet, und sie wird als 1 Einheit festgesetzt.

Weiterhin wurde, zur Bestätigung, daß das Enzym Phosphorylase ist, die Reaktionslösung nach Abschluß der Reaktion unter Verwendung einer Anionenaustauschersäule getrennt und unter Verwendung eines Refraktionsindexdetektors als Nachweiseinrichtung einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen, um β-Glucose-1-phosphorsäure zu bestimmen.

(1) Wirkung

Phosphorolysiert Maltose reversibel, wie in Formel (1) gezeigt. Nämlich, wenn sie zur Einwirkung auf Maltose in Anwesenheit von Phosphorsäure gebracht wird, erzeugt sie Glucose und β-Glucose-1-phosphorsäure in einer äquimolearen Menge, und wenn sie zur Einwirkung auf Glucose und β- Glucose-1-phosphorsäure gebracht wird, erzeugt sie Maltose und Phosphorsäure in einer äquimolaren Menge.

Formel (1) Maltose + Phosphorsäure Glucose + β-Glucose-1-phosphorsäure.

(2) Substrat-Spezifität

Die Phosphorolysereaktion wurde unter Verwendung von Trehalose, Neotrehalose, Maltose, Isomaltose, Cellobiose, Saccharose, p-Nitrophenyl-α-D-glucosid, p-Nitrophenyl-β- D-glucosid, etc. als Substrate durchgeführt, und als Ergebnis wurde die Bildung von Glucose kaum beobachtet, ausgenommen Maltose (Tabelle 1).

(3) Temperatur-Optimum

Die Reaktion wurde in 25 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0) bei verschiedenen Temperaturen (40 bis 85ºC) durchgeführt, und als Ergebnis betrug das Temperatur-Optimum der Maltosephosphorolysereaktion von ungefähr 55ºC bis ungefähr 70ºC, und das Enzym zeigte etwa 50% oder mehr der maximalen Aktivität in dem Bereich von 50 bis 70ºC (Fig. 1).

(4) Hitze-Stabilität

Das Enzym wurde in 10 mM Acetatpuffer (pH 6,0) inkubiert, und die zurückbleibende Aktivität wurde bestimmt, und als Ergebnis zeigte es eine Aktivität von 80% oder mehr des nicht behandelten Enzyms nach der Behandlung bei 60ºC für 15 Minuten (Fig. 2).

(5) pH-Optimum

Die Reaktion wurde unter Verwendung von 25 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 4,0 bis 8,0) oder 25 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,5 bis 9,0) durchgeführt, und als Ergebnis betrug das pH-Optimum 6,0 bis 7,0 (Fig. 3).

(6) pH-Stabilität

Das Enzym wurde bei 4ºC für 24 Stunden unter Verwendung von 100 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 4,0 bis 8,0) oder 100 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,5 bis 9,0) inkubiert, und die verbliebene Aktivität bei jedem pH wurde bestimmt, und als Ergebnis war das Enzym bei pH 5,5 bis 8,0 stabil (Fig. 4).

(7) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des Enzyms wurde mittels Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Superdex 200 pg (Pharmacia Biotec Co., Ltd.) aus der relativen Elutionsretentionszeit im Vergleich mit verschiedenen Standardproteinen bestimmt, und das Ergebnis war 150.000 bis 190.000.

Sein Molekulargewicht, bestimmt gemäß SDS-Gelelektrophorese aus der relativen Mobilität im Vergleich mit verschiedenen Standardproteinen war 75.000 bis 95.000. Aus den Ergebnissen der Gelfiltrationschromatographie und der SDS-Gelelektrophorese wird angenommen, daß das Enzym üblicherweise ein Dimeres bildet.

(8) Inaktivierung

100% inaktiviert, wenn auf 100ºC für 10 Minuten erhitzt.

(9) Isoelektrischer Punkt

Das Enzym wurde der isoelektrischen Chromatographie unter Verwendung einer Säule Mono P HR 5/20 (Pharmacia Biotec Co., Ltd.) unterzogen, und aus dem pH der Fraktion, aus welcher die Aktivität mit einem Entwicklungspuffer eluiert wurde, wurde der isoelektrische Punkt zu 4,7 bis 5,1 bestimmt.

(10) Inhibitor

99% Inhibierung der Aktivität wurde mit 1 mM HgCl&sub2; und 37% Inhibierung mit 1 mM ZnSO&sub4; beobachtet (Tabelle 2). Weiterhin wurde die N-Endaminosäuresequenz der gereinigten hitzebeständigen Maltosephosphorylase aus dem oben genannten, in Beispiel 1 erhaltenen Stamm RK-1 unter Anwendung eines Proteinsequenzer (Protein Sequencer "Model 477A"; Applied Biosystems Co.) bestimmt, und sie war wie folgt:

Die enzymologischen Eigenschaften der hitzebeständigen Maltosephosphorylase der Erfindung und diejenigen von bislang bekannten Maltosephosphorylasen, welche in Mikroorganismen ihren Ursprung haben, sind im Vergleich in Tabelle 3 und Tabelle 4 gezeigt. Wie aus Tabelle 3 und Tabelle 4 ersichtlich ist, unterscheidet sich die hitzebeständige Maltosephosphorylase der Erfindung von den bekannten Maltosephosphorylasen wenigstens hinsichtlich der Bakterien als Ursprünge, Temperatur-Optimum und Hitze-Stabilität, und daher wird sie als neu angesehen.

Die hitzebeständige Maltosephosphorylase der Erfindung kann durch Kultivierung eines Mikroorganismus, der eine Fähigkeit zur Bildung von hitzebeständiger Maltosephosphorylase besitzt, in einem Nährmedium und Gewinnen der gebildeten hitzebeständigen Maltosephosphorylase aus der Kulturbrühe hergestellt werden.

Bezüglich des für die Herstellung verwendeten Mikroorganismus kann ein beliebiger Mikroorganismus verwendet werden, so lange er ein Mikroorganismus ist, welcher zu der genus Bacillus gehört und eine Fähigkeit zur Bildung von hitzebeständiger Maltosephosphorylase besitzt. Spezifisch können erwähnt werden der Stamm RK-1, abgetrennt aus Erde in Ibaraki Prefecture, und der Stamm MK-1, abgetrennt aus Erde in Chiba Prefecture.

Die bakteriologischen Eigenschaften dieser Stämme sind wie in Tabelle 5 gezeigt. Beide Stämme wurden als ein Bakterium identifiziert, das zu der genus Bacillus gehört, aus diesen Eigenschaften gemäß "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" Vol. 2 (1986), jedoch als Spezies stimmen sie nicht mit den bislang beschriebenen Stämmen hinsichtlich der Eigenschaften überein, und sie werden als neue Spezies beurteilt. Gemäß dem Bergey's Manual sind Bakterien des genus Bacillus, welche mit dem Stamm RK-1 hinsichtlich Kulturtemperaturen, bei denen Vermehrung möglich ist, übereinstimmen, Bacillus coagulans und Bacillus licheniformis. Jedoch kann Bacillus licheniformis von dem Stamm RK-¹ als unterschiedlich beurteilt werden, da der erstgenannte Eigenschaften der Vermehrung bei pH 5,7 und 7% NaCl zeigt und Gelatine verflüssigt. Weiterhin kann Bacillus coagulans als unterschiedlich vom Stamm RK-1 beurteilt werden, da der erstgenannte bei pH 5,7 vermehrt und bei 5% NaCl nicht vermehrt. Weiterhin ist der Stamm MK-1 übereinstimmend mit dem Stamm RK-1 hinsichtlich der Kulturtemperaturen, bei denen Vermehrung möglich ist, von Bacillus coagulans und Bacillus licheniformis in einigen der oben genannten Punkte verschieden. Beide Stämme sind thermophile Bakterien, da sie bei einer Temperatur von 55ºC sich vermehren können und sie wurden als Bacillus sp. RK-1 bzw. Bacillus sp. MK-1 bezeichnet. Diese Stamm RK-1 und Stamm MK-1 wurden zuerst am 12. Juli 1995 am National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan, unter den Zugangsnummern FERM P-15044 bzw. FERM P-15045 hinterlegt und dann zur Hinterlegung entsprechend dem Budapest Treaty on microorganisms am 17. Juli 1996 überführt und mit den Zugangsnummern FERM BP-5592 bzw. FERM BP-5593 bezeichnet.

Mikroorganismen, die in der Erfindung verwendet werden, sind nicht auf Wildtypstämme und Mutanten, welche durch Mutation von Wildtypstämmen erhalten wurden, beschränkt, z. B. die oben genannten entsprechen den bekannten künstlichen Mutationsmitteln einschließlich Ultraviolettstrahlung, Röntgenstrahlung, Strahlungen, Chemikalien (NTG (N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidin)), EMS (Ethylmethansulfonat), etc.), etc. können ebenfalls verwendet werden, sofern sie die Fähigkeit zur Bildung von hitzebeständiger Maltosephosphorylase besitzen.

Hinsichtlich der in der Erfindung verwendeten Nährmedien können beliebige der natürlichen Medien und synthetischen Medien verwendet werden, sofern sie geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Materie und, falls überhaupt, Mikronährstoffe enthalten, die für die verwendeten Stämme erforderlich sind. Als Kohlenstoffquellen können Kohlehydrate wie Maltose, Glucose, Fructose, Saccharose, Stärken, Dextrin und Glycerin, etc. verwendet werden. Als Stickstoffquellen können anorganische und organische Stickstoffverbindungen wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Aminosäuren (Glutaminsäure, etc.) und Harnsäure verwendet werden.

Als Stickstoffquellen können ebenfalls stickstoffhaltige natürliche Produkte wie Pepton, Polypepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Sojabohnenkuchen, Trockenhefe, Casaminosäure und lösliches pflanzliches Protein verwendet werden.

Als anorganisches Material können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(II)- sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Alciumchlorid, etc. verwendet werden. Zusätzlich werden, falls erforderlich, Mikronährstoffe wie Biotin und Thiamin verwendet.

Obwohl es möglich ist, hitzebeständige Maltosephosphorylase ohne das Vorhandensein von Maltose in dem Medium als eine Maltosephosphorylase induzierende Substanz herzustellen, gibt es einen Fall, bei welchem die gebildete Menge von hitzebeständiger Maltosephosphorylase durch die Anwesenheit von Maltose erhöht werden kann.

Als Kulturverfahren sind Flüssigkeits-Kulturverfahren (Schüttelkulturverfahren und Belüftungs-Rührkulturverfahren) bevorzugt, und industriell sind Belüftungs-Kulturverfahren besonders bevorzugt. Die Kulturtemperatur kann in dem Bereich von 30 bis 60ºC liegen, jedoch beträgt sie bevorzugt 50 bis 55ºC. Der Kultur-pH beträgt bevorzugt 6,5 bis 7,5. Die Kulturzeit variiert in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen, jedoch liegt sie üblicherweise in der Größenordnung von 15 bis 48 Stunden, und wenn die Bildung von hitzebeständiger Maltosephosphorylase bestätigt wurde, bevorzugt wenn die Bildung ein Maximum erreicht hat, wird die Kultur abgebrochen.

Für die Gewinnung der hitzebeständigen Maltosephosphorylase der Erfindung aus der so erhaltenen Kulturbrühe wird die Kulturbrühe zuerst in die Kultur-Flüssigkeitsfraktion und die Zellfraktion durch Zentrifugenverfahren oder Filterverfahren fraktioniert. Die hitzebeständige Maltosephosphorylase wird in beiden der oben genannten Fraktionen nachgewiesen, jedoch wird sie hauptsächlich aus der Kultur-Flüssigkeitsfraktion erhalten, und daher wird diese Fraktion einer oder beliebigen Kombinationen von wohlbekannten Isolier- oder Reinigungsmethoden unterzogen, wie Ultrafiltration, Aussalzen, Dialyse, Lösungsmittelausfällung, Ionenaustauschchromatographie, hydrophober Chromatographie, Adsorptionschromatographie und isoelektrischer Chromatographie, wodurch konzentrierte oder gereinigte Präparationen von hitzebeständiger Maltosephosphorylase erhalten werden können. Ein spezifisches Beispiel der Isolation oder Reinigung der hitzebeständigen Maltosephosphorylase der Erfindung ist in Beispiel 1 gezeigt.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung von β-Glucose-1-phosphorsäure, welches das Umsetzen von Maltose mit Phosphorsäure oder einem Phosphatsalz in einem wässrigen Medium bei 55 bis 70ºC, bei pH 4,5 bis 8,0, in Anwesenheit von hitzebeständiger Maltosephosphorylase, welche eine Aktivität von 80% oder mehr einer nicht behandelten nach der Behandlung in einem Puffer von pH 6,0 bei einer Temperatur von 50 bis 60ºC für 15 Minuten besitzt, umfaßt.

Als hitzebeständige Maltosephosphorylase, welche in diesem Fall eingesetzt wird, kann bevorzugt eine verwendet werden, welche eine Aktivität von 80% oder mehr der einer nicht behandelten nach der Behandlung in einem Puffer von pH 6,0, z. B. 10 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0) bei einer Temperatur von 50 bis 60ºC, bevorzugt bei einer Tempereatur von 55 bis 60ºC, besonders bevorzugt bei 60ºC, für 15 Minuten besitzt. Spezifisch kann ein Enzym erwähnt werden, welches die Eigenschaften von wenigstens (1) bis (6) oder wenigstens (1) bis (7) von den enzymologischen Eigenschaften der zuvor genannten (1) bis (10) besitzt. Diese Enzyme können entweder gereinigte Enzyme oder rohe Enzyme sein, welche andere Enzyme enthalten, die keinen schädlichen Einfluß auf das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung von β-Glucose-1- phosphorsäure haben. Als rohe Enzyme können erwähnt werden ein rohes Enzym, erhalten durch Ausfällung der hitzebeständigen Maltosephosphorylase aus einer das Enzym enthaltenden Fraktion, wie der oben genannten Kultur-Flüssigkeitsfraktion, durch Aussalzen oder durch Lösungsmittelausfällung, oder ein rohes Enzym in einer mittleren Stufe der Reinigung, erhalten durch weiteres Reinigen des oben genannten rohen Enzyms mit Hilfe der oben genannten Mittel zur Reinigung. Weiterhin ist es möglich, ein immobilisiertes Enzym zu verwenden, welches durch Immobilisierung eines solchen Enzyms auf einem Träger nach einer üblichen Methode erhalten wurde.

Als Maltose kann Maltose oder Maltose enthaltendes Material (z. B. Maltose in hohen Konzentrationen enthaltende Zuckerlösungen) verwendet werden. Als Phosphatsalz können wasserlösliche Phosphatsalze wie Trikalium- (oder Trinatrium)- phosphat, Dikalium- (oder Dinatrium)-hydrogenphosphat und Kalium- (oder Natrium)-dihydrogenphosphat verwendet werden. Als wässriges Medium können Wasser, Pufferlösungen, etc. genannt werden. Als Puffer können Acetatpuffer, Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer, Zitratpuffer, Succinatpuffer, Tris-Salzsäurepuffer, etc. verwendet werden.

Hinsichtlich der Anwendungsmenge des Enzyms gibt es keine besondere Beschränkung, jedoch ist es üblich, es in einer Menge von 0,1 bis 50 Einheiten, bevorzugt 1 bis 20 Einheiten pro g Maltose einzusetzen. Obwohl es keine besondere Beschränkung gibt, ist es geeignet, Phosphorsäure und/oder das Phosphatsalz in einer Menge vom 0,1- bis 10-fachen, bevorzugt 0,5- bis 2-fachen der molaren Menge von Maltose zu verwenden. Wenn der Puffer ein Phosphorsäure enthaltender Puffer (oder ein Phosphatsalz), z. B. ein Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer ist, reicht es in diesem Zusammenhang aus, wenn die Gesamtmenge von Phosphorsäure und das Phosphatsalz in dem oben genannten Bereich liegen.

Zur Vermeidung von Kontamination mit verschiedenen Keimen und zur Erhöhung der Ausbeute wird die oben genannte Reaktion bei 55 bis 70ºC, bevorzugt 55 bis 65ºC, mehr bevorzugt 60 bis 65ºC durchgeführt. Es ist geeignet, wenn der pH im allgemeinen 4,5 bis 8,0, bevorzugt 5,0 bis 6,0 beträgt. Mehr spezifisch ist es weiter zur Vermeidung von Kontamination mit verschiedenen Keimen bevorzugt, die Reaktion bei pH 4,5 bis 5,0 im Fall der Temperatur von 55 bis 60ºC, bei pH 5,0 bis 5,5 im Fall der Temperatur von 60 bis 65ºC und bei pH 5,5 bis 6,5 im Fall der Temperatur von 65 bis 70ºC durchzuführen. Die Reaktion wird zu dem Zeitpunkt abgebrochen, zu dem ausreichende Bildung von β-Glucose-1-phosphorsäure unter den oben genannten Bedingungen beobachtet wird, jedoch wird die Reaktion üblicherweise in 1 bis 144 Stunden beendet.

Nach Abschluß der Reaktion wird die Reaktion durch ein geeignetes Mittel wie Inaktivierung des Enzyms mit Erhitzen der Reaktionslösung oder Inaktivierung des Enzyms mit Erniedrigung des pH (Zugabe einer Säure wie Salzsäure) beendet, und Isolier- und Reinigungsverfahren wie einer Behandlung mit Aktivkohle und einer Behandlung mit Ionenaustauscherharz werden in einer geeigneten Kombination angewandt, um β-Glucose-1- phosphorsäure zu erhalten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose, welche die Umsetzung von Maltose mit Phosphorsäure oder einem Phosphatsalz in einem wässrigen Medium bei 55 bis 70ºC, bei pH 4,5 bis 8,0, in Anwesenheit von hitzebeständiger Maltosephosphorylase, welche eine Aktivität von 80% oder mehr der einer nicht behandelten nach Behandlung in einem Puffer von pH 6,0 bei einer Temperatur von 50 bis 60ºC für 15 Minuten besitzt, und von hitzebeständiger Trehalosephosphorylase umfaßt.

Als hitzebeständige Maltosephosphorylase bei dem oben genannten Verfahren sind dieselben verwendet worden, wie sie bei dem oben genannten Verfahren zur Herstellung von β- Glucose-1-phosphorsäure verwendet wurden. Als hitzebeständige Trehalosephosphorylase kann eine verwendet werden, sofern sie Trehalose aus Maltose und Phosphorsäure oder einem Phosphatsalz bei einer der oben genannten Reaktionstemperaturen und bei einem der oben genannten pH-Werte unter Zuhilfenahme der hitzebeständigen Maltosephosphorylase bilden kann. Jedoch kann bevorzugt hitzebeständige Trehalosephosphorylase verwendet werden, welche eine Aktivität von 95% oder mehr einer nicht behandelten nach der Behandlung in einem Puffer von pH 6,0 bei einer Temperatur von 50 bis 65ºC, bevorzugt bei einer Temperatur von 55 bis 65ºC, noch mehr bevorzugt bei einer Temperatur von 60 bis 65ºC, besonders bevorzugt bei 65ºC, für 15 Minuten besitzt. Als ein Beispiel von hitzebeständiger Trehalosephosphorylase mit solch einer Eigenschaft kann die hitzebeständige Trehalosephosphorylase erwähnt werden, welche Bacillus stearothermophilus SK-1, gefunden von den vorliegenden Erfindern, bildet. Der Stamm SK-1 wurde zuerstes am 29. September 1994 am National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan unter einer Zugangsnummer FERM P-14567 hinterlegt, und dann in die Hinterlegung gemäß dem Budapest Treaty on microorganisms am 17. Juli 1996 überführt und erhielt eine Zugangsnummer von FERM BP-5594, Ein Beispiel der Herstellung der oben genannten hitzebeständigen Trehalosephosphorylase ist in Beispiel 4 (rohes Enzym) und im Vergleichsbeispiel 1 (gereinigtes Enzym) gezeigt. Die enzymologischen Eigenschaften dieses gereinigten Enzyms sind wie folgt.

(1) Wirkung

Phosphoroylsiert Trehalose reversibel, wie in Formel (2) gezeigt. Nämlich, wenn sie zur Einwirkung auf Trehalose in Anwesenheit von Phosphorsäure gebracht wird, erzeugt sie Glucose und β-Glucose-1-phosphorsäure in einer äquimolaren Menge, und wenn sie zur Einwirkung auf Glucose und β-Glucose-1-phosphorsäure gebracht wird, erzeugt sie Trehalose und Phosphorsäure in einer äquimolaren Menge.

Formel (2) Trehalose + Phosphorsäure Glucose + β-Glucose-1-phosphorsäure

(2) Substrat-Spezifität

Die Phosphorolysereaktion wurde unter Verwendung von Trehalose, Neotrehalose, Maltose, Isomaltose, Cellobiose, Saccharose, p-Nitrophenyl-α-D-glucosid und p-Nitrophenylβ-D-glucosid als Substrate durchgeführt, und als Ergebnis wurde die Bildung von Glucose mit Ausnahme von Trehalose kaum beobachtet (Tabelle 6).

(3) Temperatur-Optimum

Die Reaktion wurde in 40 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0) bei verschiedenen Temperaturen (40 bis 90ºC) durchgeführt, und als Ergebnis betrug das Temperatur-Optimum von Trehalosephosphorolysereaktion von ungefähr 70ºC bis ungefähr 75ºC, und das Enzym zeigte etwa 50% oder mehr des Aktivitätsmaximums in dem Bereich von 60ºC bis 75ºC (Fig. 6).

(4) Hitze-Stabilität

Das Enzym wurde in 10 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0) inkubiert, und die zurückbleibende Aktivität wurde untersucht, wobei als Ergebnis gefunden wurde, daß es eine Aktivität von 95% oder mehr einer nicht behandelten nach der Behandlung bei 65ºC für 15 Minuten zeigte (Fig. 7).

(5) pH-Optimum

Die Reaktion wurde bei 60ºC unter Verwendung von 25 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 4,0 bis 7,7) oder 25 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,7 bis 9,0) durchgeführt, und als Ergebnis betrug das pH-Optimum 6,5 bis 7,5 (Fig. 8).

(6) pH-Stabilität

Das Enzym wurde bei 60ºC für 24 Stunden unter Verwendung von 100 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 4,0 bis 8,0) oder 100 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,5 bis 9,0) inkubiert, und die zurückbleibende Aktivität bei jedem pH wurde untersucht, und als Ergebnis war das Enzym bei pH 6,0 bis 8,0 stabil (Fig. 9).

(7) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des Enzyms wurde mittels Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Superdex 200 pg (Pharmacia Biotec Co., Ltd.) aus der relativen Elutionsretentionszeit im Vergleich mit verschiedenen Standardproteinen bestimmt, und als Ergebnis betrug es 110.000 bis 150.000.

(8) Inaktivierung

100% inaktiviert, wenn auf 100ºC für 10 Minuten erhitzt.

(9) Isoelektrischer Punkt

Das Enzym wurde der isoelektrischen Scharfeinstellung unterzogen, und sein isoelektrischer Punkt wurde zu 4,6 bis 5,2 aus den relativen Beweglichkeiten der verschiedenen Standardproteine bestimmt.

(10) Inhibitor

99% Inhibierung der Aktivität wurde mit 1 mM HgCl&sub2; und 80% Inhibierung mit 1 mM ZnSO&sub4; beobachtet (Tabelle 7).

Die hitzebeständige Trehalosephosphorylase kann gereinigt oder roh sein, wie im Fall der hitzebeständigen Maltosephosphorylase, und diese gereinigten Enzyme und rohen Enzyme können erhalten werden, wie im Fall der hitzebeständigen Maltosephosphorylase.

Als Maltose, Phosphorsäure, Phosphatsalz und wässriges Medium können dieselben verwendet werden, wie bei dem oben genannten Verfahren zur Herstellung von β-Glucose-1-phosphorsäure.

Hinsichtlich der Verwendungsmenge des Enzyms gibt es keine besondere Beschränkung, jedoch ist es geeignet, jedes Enzym in einer Menge von 0,1 bis 50 Einheiten, bevorzugt 1 bis 20 Einheiten pro g Maltose zu verwenden. Obwohl es keine besondere Beschränkung hinsichtlich des Anwendungsverhältnisses zwischen der hitzebeständigen Maltosephosphorylase und der hitzebeständigen Trehalosephosphorylase gibt, ist es weiterhin geeignet, daß das Verhältnis der ersteren zu der letzteren = 1 : 5 bis 5 : 1, bevorzugt 1 : 2 bis 2 : 1, angegeben als Einheiten, ist.

In diesem Zusammenhang wurde die Aktivität der Trehalosephosphorylase nach der folgenden Methode bestimmt. Eine Enzymlösung (0,4 ml), 0,06 ml 0,5 M Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0), 0,6 ml 2 Gew./Vol.-% Trehalose und 0,14 ml destilliertes Wasser wurden gemischt, und die Reaktion wurde bei 60ºC für 20 Minuten durchgeführt und durch Kochen für 10 Minuten abgebrochen. Dann wurden 0,02 ml einer Probe aus der Lösung mit der abgebrochenen Reaktion entnommen, 3 ml eines Reagens für Glucosebestimmung (Glucose CII - Test Wako; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurde zugesetzt, die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur für 20 Minuten durchgeführt, und die spezifische Absorption bei 505 nm wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen und die in der Reaktionslösung gebildete Glucosemenge wurde aus dem gemessenen Wert bestimmt. Hinsichtlich der Definition der Trehalosephosphorylaseaktivität wird die Menge des Enzyms, welche zur Phosphorolyse von 1 uMol Trehalose in 1 Minute unter den oben angegebenen Versuchsbedingungen erforderlich ist, als 1 Einheit festgelegt.

Reaktionen können gleichzeitig durch Zugabe der hitzebeständigen Maltosephosphorylase und der hitzebeständigen Trehalosephosphorylase zu Maltose oder durch zuerst Herbeiführen des Einwirkens der hitzebeständigen Maltosephosphorylase auf Maltose und dann Zugabe der hitzebeständigen Trehalosephosphorylase durchgeführt werden. Wenn die hitzebeständige Trehalosephosphorylase später zugesetzt wird, gibt es keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Zugabezeit, jedoch wird es bevorzugt, die Zugabe zu dem Zeitpunkt durchzuführen, wenn die Bildung von β-Glucose-1-phosphorsäure ein Maximum wird.

Obwohl es keine besondere Beschränkung gibt, ist es geeignet, Phosphorsäure oder ein Phosphatsalz in einer Menge vom 0,001- bis 1-fachen, bevorzugt 0,005- bis 0,5-fachen der molaren Menge von Maltose zu verwenden.

Die Reaktionstemperatur, der Reaktions-pH und die Reaktionszeit können dieselben wie bei der Herstellung von β- Glucose-1-phosphorsäure sein. Die Isolierung und Reinigung der Trehalose nach Abschluß der Reaktion kann durch eine geeignete Kombination von Mitteln wie Behandlung mit Aktivkohle, Ionenaustauscherbehandlung und Behandlung mit Kristallisation durch Ethanol durchgeführt werden.

Die Erfindung wird im einzelnen im folgenden anhand von Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung und Reinigung von hitzebeständiger Maltosephosphorylase durch Bacillus sp. RK-1 (FERM BP-5592) wurden wie folgt durchgeführt.

(Kultur)

Ein Medium (pH 7,0) (100 ml), das 1 Gew./Vol.-% Hefeextrakt, 2 Gew./Vol.-% Polypepton und 1 Gew./Vol.-% Maltose enthielt, wurde in einen 500 ml Meyerkolben mit Wallplatten eingegeben und im Autoklaven bei 121ºC für 20 Minuten sterilisiert. Eine Schleife von Bacillus sp. RK-1 wurde in das erhaltene Medium eingeimpft, und durch Schütteln bei 55ºC für 16 Stunden kultiviert, um eine Saatkultur zu erhalten.

Ein Medium (etwa 3 l) mit derselben Zusammensetzung wie bei der Saatkultur wurde in einen 5 l Fermentor eingegeben, sterilisiert und auf eine Temperatur von 55ºC erwärmt. Die Saatkultur wurde in einem Verhältnis von 2 Vol./Vol.-% eingeimpft und unter Belüftung und Rühren für 18 Stunden kultiviert, während die Temperatur und der pH auf 55ºC bzw. 6,0 bis 7,0 gehalten wurden.

(Herstellung von rohem Enzym)

Nach Abschluß der Kultivierung wurde die Kulturbrühe zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, Ammoniumsulfat wurde in der überstehenden Flüssigkeit aufgelöst, so daß die Sättigung 40 bis 60% war. Der resultierende Proteinniederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 10 mM Acetatpuffer (pH 6,0) aufgelöst, und die Lösung wurde gegen denselben Puffer dialysiert und dann konzentriert, um 20 ml einer Lösung des rohen Enzyms von etwa 300 Einheiten/ml zu erhalten.

(Ionenaustauscherchromatographie)

Die Lösung des rohen Enzyms wurde zu einer Kolonne gegeben, welche mit TSKgel DEAE TOYO Pearl 650 M (TOSOH CORPORATION) gepackt und mit 10 mM Acetatpuffer (pH 6,0) ins Gleichgewicht gesetzt war, die Elution wurde mit ansteigendem Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,5. M NaCl durchgeführt, und das Eluat wurde in Portionen aufgenommen. Aktive Fraktionen wurden kombinieret, konzentriert und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt und weiter einer Reihe derselben Chromatographieoperationen zur Erhöhung des Reinigungsgrades unterworfen.

(Gelfiltrationschromatographie)

Die resultierende Lösung des partiell gereinigten Enzyms wurde zu einer Superdex 200 pg Kolonne (Pharmacia Biotec Co., Ltd.), die mit 10 mM Acetatpuffer (pH 6,0) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, unter Auflösen von 0,2 M NaCl zugesetzt, die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt, und das Eluat wurde in Portionen aufgenommen. Aktive Fraktionen wurden konzentriert und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt.

(Isoelektrische Chromatographie)

Die resultierende Lösung des partiell gereinigten Enzyms wurde zu einer Mono P HR 5/20 Kolonne (Pharmacia Biotec Co., Ltd.), die mit 25 mM bisTris-Salzsäurepuffer (pH 7,1) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, zugegeben, die Elution wurde mit einem Entwicklungspuffer (Polypuffer; Pharmacia Biotec Co., Ltd.), eingestellt auf pH 4,0, durchgeführt, und das Eluat wurde portionsweise aufgenommen. Aktive Fraktionen wurden konzentriert und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt.

(Gelelektrophorese mit nativem Polyacrylamid)

Die resultierende Lösung des gereinigten Enzyms wurde mit nativem Polyacrylamid der Gelelektrophorese unterworfen, das resultierende Gel wurde mit CBB (Coomassie Brilliant Blue) gefärbt und auf Proteinbanden überprüft. Als Ergebnis wurde nur eine Bande festgestellt, und daher wurde bestätigt, daß das Enzym ein einzelnes Protein war.

(Bestätigung von Maltosephosphorylase)

Die oben genannte Lösung des gereinigten Enzyms (0,4 ml) wurde mit 0,06 ml 0,5 M Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0), 0,6 ml 2 Gew./Vol.-% Maltose und 0,15 ml destilliertem Wasser gemischt, und die Reaktion wurde bei 60ºC für 15 Minuten durchgeführt und durch Kochen von 10 Minuten abgebrochen.

Dann wurden 0,02 ml einer Probe aus der Lösung mit abgebrochener Reaktion entnommen, es wurden 3 ml eines Reagens zur Glucoseprüfung (Glucose CII - Test Wako; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zugegeben, die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur für 20 Minuten durchgeführt, die spezifische Absorption bei 505 nm wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen, und die gebildete Glucosemenge in der Reaktionslösung wurde aus dem gemessenen Wert bestimmt.

Weiterhin wurde ein Teil der Lösung mit abgebrochener Reaktion durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Ionenaustauschersäule (TSKgel SAX (150 · 6,0 mm ; TOSOH CORPORATION), Eluens 0,1 M wässrige Kaliumacetatlösung (pH 5,0), Strömungsgeschwindigkeit 1,0 ml/min. Kolonnentemperatur 30ºC) abgetrennt, und dann wurde β-Glucose-1- phosphorsäure festgestellt und quantitaiv mittels eines Differentialrefraktometers (Shodex; Showa Denko Co., Ltd.) bestimmt. Das Ergebnis war, daß der Glucosegehalt und der Gehalt von β-Glucose-1-phosphorsäure in der Lösung mitabgebrochener Reaktion derselbe war, hierdurch wurde bestätigt, daß das gereinigte Enzym Maltosephosphorylase war.

Beispiel 2

Die Herstellung von hitzebeständiger Maltosephosphorylase durch Bacillus sp. MK-1 (FERM BP-5593) wurde wie folgt durchgeführt.

Ein Medium (pH 7,0) (100 ml) mit einem Gehalt von 1 Gew./Vol.-% Hefeextrakt, 2 Gew./Vol.-% Polypepton und 1 Gew./ Vol.-% Maltose wurde in einen 500 ml Meyerkolben mit Wallplatten eingegeben und im Autoklaven bei 121ºC für 20 Minuten sterilisiert. Eine Schleife von Bacillus sp. MK-1 wurde in das resultierende Medium eingeimpft und es wurde bei 55ºC für 16 Stunden schüttelkultiviert, um eine Saatkultur zu erhalten. Ein Medium (etwa 3 l), welches dieselbe Zusammensetzung wie in der Saatkultur besaß, wurde in einen 5 l Fermentor eingegeben, sterilisiert und auf eine Temperatur von 55ºC erwärmt. Die Saatkultur wurde in einem Verhältnis von 2 Vol./ Vol.-% eingeimpft und unter Belüftung und Rühren für 48 Stunden kultiviert, während die Temperatur und der pH auf 55ºC bzw. 6,0 bis 7,0 gehalten wurden.

Nach Abschluß der Kultivierung wurde die Kulturbrühe zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Diese Zellen wurden gewaschen, in einem 10 mM Acetatpuffer suspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen, und das feste Material wurde durch Zentrifugieren entfernt, um 20 ml einer Lösung des rohen Enzyms zu erhalten. Diese Lösung des rohen Enzyms hatte eine Maltosephosphorylaseaktivität von etwa 10 Einheiten/ml.

Beispiel 3

Es wurde der Versuch unternommen, die Lösung des hitzebeständigen rohen Maltosephosphorylaseenzyms (demjenigen bei der Stufe der Ammoniumsulfatfraktionierung), hergestellt in Beispiel 1, auf Maltose als Substrat zur Bildung von β-Glucose-1-phosphorsäure einwirken zu lassen.

Eine Lösung für die Reaktion von 30 Gew./Vol.-% Maltose, 10 U/g des Enzyms und 0,5 M Phosphorsäure (pH 6,0) wurde unter Einstellung mit 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) hergestellt, und die Reaktion wurde bei 60ºC für 4 Stunden durchgeführt. Das Unterbrechen der Reaktion wurde durch Erhitzen auf 100ºC für 10 Minuten durchgeführt. Nach Abschluß der Reaktion wurde ein Teil der Reaktionslösung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Anionenaustauscherkolonne (TSKgel SAX (150 · 6,00 mm ; TOSOH CORPORATION), Eluens 0,1 M wässrige Kaliumacetatlösung (pH 5,0), Strömungsrate 1,0 ml/min. Kolonnentemperatur 30ºC) getrennt, und dann wurde β-Glucose-1-phosphorsäure quantitativ mittels eines Differentialrefraktometers (Shodex; Showa Denko Co., Ltd.) bestimmt. Das Ergebnis war, daß β-Glucose-1-phosphorsäure mit einer Konzentration von 4,6 Gew./Vol.-% gebildet worden war.

Die restliche Reaktionslösung wurde mittels Chromatographie unter Bedingungen einer Ionenaustauscherkolonne: TSKgel SAX (200 · 55 mm ) (TOSOH CORPORATION), Eluens: 0,1 M wässrige Kaliumacetatlösung (pH 5,0) und Strömungsgeschwindigkeit: 10,0 ml/min getrennt, und die Fraktionen von β-Glucose-1-phosphorsäure wurden aufgenommen. Die Fraktionenlösung wurde auf pH 8,5 mit 20% NaOH eingestellt, 2 Volumina Ethanol wurden zugesetzt, das resultierende Gemisch wurde bei 0 bis 4ºC für 24 Stunden stehengelassen, und ausgefallenes Dinatrium-β-glucose-1-phosphat wurde durch Zentrifugieren gewonnen. Als Ergebnis wurde Dinatrium-β-glucose-1-phosphat mit einer Reinheit von 95% oder mehr in einer Ausbeute von 90% erhalten.

Beispiel 4 (Herstellung von hitzebeständiger Trehalosephosphorylase)

Ein Medium (pH 7,0) (100 ml) mit einem Gehalt von 0,12 Gew./Vol.-% Fleischextrakt, 0,4 Gew./Vol.-% Polypepton und 0,2 Gew./Vol.-% NaCl wurde in einen 500 ml Meyerkolben mit Wallplatten eingegeben und im Autoklaven bei 121ºC für 20 Minuten sterilisiert. Eine Schleife von Bacillus stearothermophilus SK-1 (FERM BP-5594) wurde in das resultierende Medium eingeimpft, und es wurde bei 55ºC für 16 Stunden schüttelkultiviert, um eine Saatkultur zu erhalten.

Ein Medium (pH 7,0) (etwa 3 l), das 1 Gew./Vol.-% Hefeextrakt, 2 Gew.-/Vol-% Polypepton und 1 Gew.-/Vol.-% Trehalose enthielt, wurde in einen 5 l Fermentor eingegeben, sterilisiert und auf eine Temperatur von 55ºC erwärmt. Die Saatkultur wurde in einem Verhältnis von 2 Vol./Vol.-% eingeimpft und unter Belüften und Rühren für 40 Stunden kultiviert, während die Temperatur und der pH auf 55ºC bzw. 6,0 bis 7,0 gehalten wurden.

Nach Abschluß der Kultivierung wurde die Kulturbrühe zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, es wurde Ammoniumsulfat in der überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Sättigung von 80% aufgelöst. Die resultierende Proteinausfällung wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 10 mM Acetatpuffer (pH 6,0) aufgelöst, und die Lösung wurde gegen denselben Puffer dialysiert und dann konzentriert, um 20 ml einer Lösung von rohem Enzym mit einer Trehalosephosphorylaseaktivität von etwa 220 Einheiten/ml zu erhalten.

(Reaktion der Bildung von Trehalose aus Maltose)

Die so hergestellte Lösung des hitzebeständigen rohen Trehalosephosphorylaseenzyms und die Lösung des hitzebeständigen rohen Maltosephosphorylaseenzyms (d. h. in der Stufe der Ammoniumsulfatfraktionierung), hergestellt in Beispiel 1, wurden auf Maltose als Substrat zu ihrer Umwandlung zu Trehalose einwirken gelassen.

Hierzu wurde die enzymatische Reaktion unter den Bedingungen einer Maltosekonzentration (20 oder 30 Gew./Vol.-%), Phosphorsäurekonzentration (5 bis 300 mM), Menge jedes Enzyms (1 bis 10 Einheiten/ml) (jedes Enzym wurde mit derselben Einheitenmenge eingesetzt), der Temperatur, des pH und der Zeit, wie in Tabelle 6 gezeigt, durchgeführt. In diesem Zusammenhang wurde die pH-Einstellung mit einem Acetatpuffer durchgeführt.

Das Unterbrechen der Reaktion wurde durch Erhitzen auf 100ºC für 10 Minuten durchgeführt. Nach Abschluß der Reaktion wurde jede Reaktionslösung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung als Nachweismittel TSKgel Amido 80 Kolonne (TOSOH CORPORATION), Eluens: Acetonitrl/Wasser (76/24), Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min. Kolonnentemperatur: 80ºC und Differentialrefraktometer: Shodex (Showa Denko Co., Ltd.) unterzogen, und hierdurch wurde die Zuckerzusammensetzung jeder Reaktionslösung quantitativ bestimmt.

Weiterhin wurde β-Glucose-1-phosphorsäure durch Unterwerfen der Reaktionslösung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Anwendung derselben Anionenaustauscherkolonne wie in Beispiel 1 quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.

Maltose wurde zu Trehalose mit Ausbeuten von 18 bis 65% unter den Reaktionsbedingungen der Reaktionstemperatur von 60 bis 70ºC und pH 5,0 bis 6,0 durchgeführt.

Beispiel 5 (Herstellung von Trehalose enthaltender Zuckerlösung und Trehalose stark enthaltender Zuckerlösung und Pulfer hiervon)

Ein Zweig-Schnittenzym (vertrieben von Amano Seiyaku Co., Ltd./Pullulanase "Amano") und β-Amylase (vertrieben von NAGASE & CO., LTD./β-Amylase) wurden auf eine stärkeverflüssigte Lösung, erhalten durch Einwirken von α-Amylase auf Maisstärke, einwirken gelassen, wodurch eine Maltose stark enthaltende Zuckerlösung (Feststoffgehalt 30 Gew./Gew.-%, Maltosereinheit pro Feststoffkomponenten 80%) hergestellt würde. Die Lösung des hitzebeständigen rohen Maltosephosphorylaseenzyms (desjenigen bei der Stufe der Ammoniumsulfatfraktionierung), hergestellt in Beispiel 1 unter Verwendung von Bacillus sp. RK-1, und die Lösung des hitzebeständigen rohen Trehalosephosphorylaseenzyms, hergestellt in Beispiel 4 unter Verwendung von Bacillus stearothermonhilus SK-1, wurden hinzugegeben, so daß die Mengen der zugesetzten Enzyme jeweils 10 Einheiten pro g der Feststoffkomponenten wurden. Weiterhin wurde Kaliumphosphat hinzugegeben, so daß die Phosphorsäurekonzentration 10 mM wurde, die Reaktion wurde bei 60ºC und pH 5,0 für 72 Stunden durchgeführt, und die resultierende Lösung wurde zur Inaktivierung der Enzyme auf 100ºC für 10 Minuten erhitzt.

Die resultierende Reaktionslösung wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt und auf eine Konzentration von etwa 70% konzentriert, um eine Trehalose enthaltende Zuckerlösung zu erhalten. Diese Zuckerlösung wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 4 analysiert, und das resultierende Diagramm ist in Fig. 5 gezeigt. Die Antreile (Gew./Gew.) für die Feststoffkomponenten waren: Glucose 1,5%, Trehalose 64,5%, Maltose 18,0%, Maltotriose 11,2% und andere Maltooligosaccharide 4,8%.

Weiterhin wurde Glucoamylase (vertrieben von Seikagaku Kogyo Co., Ltd., gluco amylase) zu der oben genannten Reaktionslösung zugesetzt, so daß die Menge 1 Einheit pro g der Feststoffkomponenten wurden, und dann wurde das Gemisch der Reaktion bei 55ºC für 8 Stunden unterworfen und dann zum Inaktivieren des Enzyms auf 100ºC für 10 Minuten erhitzt. Die resultierende Reaktionslösung wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauscherharz entsalzt, auf eine Konzentration von etwa 50% konzentriert und der Trennung mit einer Ionenaustauscherkolonne vom Natriumtyp unterworfen, und das Eluat wurde in Portionen aufgefangen. Die Trehalosefraktionen wurden entnommen und konzentriert, um eine Zuckerlösung mit hohem Trehalosegehalt, die einen Feststoffgehalt von 70% hatte und Trehalose in einem Anteil von 92%, bezogen auf die Feststoffkomponenten, enthielt, zu erhalten.

Weiterhin konnte Pulvertrehalose durch Konzentrieren und dann Trocknen dieser Zuckerlösung mit hohem Trehalosegehalt erhalten werden.

Vergleichsbeispiel 1

Die Herstellung und Reinigung von hitzebeständiger Trehalosephosphorylase durch Bacillus tearothermophilus SK-1 (FERM BP-5594) wurde wie folgt durchgeführt.

(Kultur)

Eine Schleife des Stammes SK-1 wurde in einer flüssiges Medium (pH 7,0), das 0,5 Gew./Vol.-% Hefeextrakt, 2 Gew./ Vol.-% Polypepton und 1 Gew./Vol.-% Maltose enthielt und im Autoklaven bei 121ºC für 20 Minuten sterilisiert worden war, eingeimpft und unter Belüftung und Schütteln bei 55ºC für 72 Stunden kultiviert. Dann wurde die resultierende Kulturbrühe in Zellen und Kulturlösung durch Zentrifugieren aufgetrennt.

(Herstellung von rohem Enzym)

Ammoniumsulfat wurde in der Kulturlösung bis zu einer Sättigung von 40 bis 60% aufgelöst, die resultierende Proteinausfällung wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 10 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0) aufgelöst, und die Lösung wurde gegen denselben Puffer dialysiert, um eine Lösung von rohem Enzym zu erhalten.

(Ionenaustauscher-Chromatographie)

Die Lösung des rohen Enzyms wurde zu einer Kolonne gegeben, die mit TSKgel DEAE TOYO Pearl 650M (TOSOH CORPORATION) gepackt und mit 10 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, gegeben, die Elution wurde mit zunehmendem Konzentrationsgradienten unter Verwendung von 5 Kolonnenvolumina von 0 bis 0,4 M NaCl durchgeführt, und das Eluat wurde in Portionen aufgenommen. Aktive Fraktionen wurden kombiniert und konzentriert und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt, und dann weiter einer Reihe derselben Chromatographieoperationen unterzogen, um den Reinigungsgrad zu erhöhen.

(Hydrophobe Chromatographie)

Die resultierende Lösung des partiell gereinigten Enzyms wurde zu einer Kolonne, die mit TSKgel Phenyl TOYO Pearl 650 M (TOSOH CORPORATION) gepackt und mit 10 mM Kaliumphosphat- Zitronensäurepuffer (pH 6,0) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, unter Auflösen von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 40% gegeben, die Elution wurde mit absteigendem Konzentrationsgradienten unter Verwendung von 8 Kolonnenvolumina von 40 bis 0% gesättigten Ammoniumsulfatlösungen durchgeführt, und das Eluat wurde in Portionen aufgenommen. Aktive Fraktionen wurden kombiniert und konzentriert und unter Verwendung einer Ultafiltrationsmembran entsalzt.

(Absorptionschromatographie)

Die resultierende Lösung des partiell gereinigten Enzyms wurde zu einer PENTAX GH-0810 M Kolonne (Asahi Optical Co., Ltd.), die mit 10 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0) unter Auflösung von CaCl&sub2; bis zu 0,3 mM ins Gleichgewicht gesetzt worden war, gegeben, die Elution wurde mit aufsteigendem Konzentrationsgradienten unter Verwendung von 10 Kolonnenvolumina von 10 bis 300 mM Kaliumphosphat-Zitronensäurepuffer (pH 6,0) durchgeführt, und das Eluat wurde in Portionen aufgenommen. Aktive Fraktionen wurden kombiniert und konzentriert und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran entsalzt.

(Gelfiltrationschromatographie)

Die resultierende Lösung des partiell gereinigten Enzyms wurde zu einer Kolonne, die mit Superdex 200 pg (Pharmacia Biotec Co., Ltd.) gepackt und mit 10 mM Kaliumphosphat- Zitronensäurepuffer (pH 6,0) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, unter Auflösen von NaCl bis zu 0,2 M gegeben, die Elution wurde unter Verwendung desselben Puffers durchgeführt, und das Eluat wurde in Portionen aufgenommen. Aktive Fraktionen wurden kombiniert und konzentriert und unter Verwendung einer Ultafiltrationsmembran entsalzt.

(Gelelektrophorese auf nativem Polyacrylamid)

Die resultierende Lösung des gereinigten Enzyms wurde über nativem Polyacrylamid der Gelelektrophorese unterzogen, das resultierende Gel wurde mit CBB gefärbt und auf Banden von Proteinen überprüft. Als Ergebnis wurde nur eine Bande festgestellt, und daher wurde bestätigt, daß das Enzym ein einzelnes Protein ist.

Wie zuvor beschrieben, weist Maltosephosphorylase, welche durch die Erfindung bereitgestellt wird, Hitzebeständigkeit auf und erzeugt β-Glucose-1-phosphorsäure aus Maltose und Phosphorsäure. Unter Verwendung dieses Enzyms oder dieses Enzyms und von Trehalosephosphorylase ist es möglich, β-Glucose-1-phosphorsäure bzw. Trehalose herzustellen, und zwar industriell vorteilhaft unter Verminderung der Kontamination mit verschiedenen Keimen und Verkürzung der Reaktionszeit.

Tabelle 1 Substrat-Spezifität (Hitzebeständige Maltosephosphorylase)

Substrat / Relative Aktivität (%)

Maltose 100

Isomaltose 2

Trehalose 0

Neotrehalose 0

Cellobiose 0

Gentiobiose 2

Lösliche Stärke 2

Saccharose 0

Lactose 0

p-Nitrophenyl-α-D-glucosid 0

p-Nitrophenyl-β-D-glucosid 0

Tabelle 2 Inhibitor (Hitzebeständige Maltosephosphorylase

Inhibitor* / Relative Aktivität (%)

FeCl&sub2; 94

MgCl&sub2; 100

MnSO&sub4; 111

CaCl&sub2; 101

Pb(CH&sub3;COO)&sub2; 99

Ba(OH)&sub2; 100

ZnSO&sub4; 63

CuSO&sub4; 91

HgCl&sub2; 1

EDTA·2Na 100

β-Mercaptoethanol 94

DTT** 101

PCMB*** 20

Keine Zugabe 100

* 1 mM

** Dithiothreit

*** p-(Chlortnercuri)-benzoesäure

Tabelle 3 Vergleich unter Maltosephosphorylasen

*: β-Glucose-1-phosphorsäure

Tabelle 4 Vergleich unter Maltosephosphorylasen

*: β-Glucose-1-phosphorsäure

Tabelle 5 - Mikrobiologische Merkmale von Stamm RK-1 und Stamm MK-1

*1 Nährbrühe wurde verwendet

Tabelle 6 Substrat-Spezifität (Hitzebeständige Trehalosephosphorylase)

Substrat / Relative Aktivität (%)

Trehalose 100

Neotrehalose 1

Maltose 1

Isomaltose 3

Cellobiose 2

Saccharose 1

p-Nitrophenyl-α-D-glücosid 2

p-Nitrophenyl-β-D-glucosid 2

Tabelle 7 Inhibitor (Hitzebeständige Trehalosephosphorylase)

Inhibitor* / Relative Aktivität (%)

FeCl&sub2; 96

MgCl&sub2; 103

MnSO&sub4; 108

CaCl&sub2; 102

Pb(CH&sub3;COO)&sub2; 93

Ba(OH)&sub2; 106

ZnSO&sub4; 20

CuSO&sub4; 89

HgCl&sub2; 1

EDTA 99

DTT 86

PCMB 0

β-Mercaptoethanol 96

Keine Zugabe 100

* 1 mM

Tabelle 8


Anspruch[de]

1. Hitzebeständige Maltosephosphorylase mit den folgenden enzymologischen Eigenschaften:

(1) Wirkung

Phosphorolysiert Maltose reversibel; Nämlich, wenn sie zur Einwirkung auf Maltose in Anwesenheit von Phosphorsäure gebracht wird, erzeugt sie Glucose und β-Glucose-1-phosphorsäure in einer äquimolaren Menge, und wenn sie zur Einwirkung auf Glucose und β-Glucose-1-phosphorsäure gebracht wird, erzeugt sie Maltose und Phosphorsäure in einer äquimolaren Menge,

(2) Substrat-Spezifität

Wirkt spezifisch auf Maltose,

(3) Temperatur-Optimum

Das Temperatur-Optimum von Maltose-Phosphorolysereaktion ist von ungefähr 55ºC bis ungefähr 70ºC, und es zeigt etwa 50% oder mehr der maximalen Aktivität in dem Bereich von 50 bis 70ºC,

(4) Hitze-Stabilität

Behält wenigstens 80% ihrer Aktivität nachdem sie einer Temperatur von 50 bis 60ºC für 15 Minuten in einem Puffer von pH 6,0 unterworfen wurde,

(5) pH-Optimum

6,0 bis 7,0,

(6) pH-Stabilität

Stabil bei pH 5,5 bis 8,0, und

(7) Molekulargewicht

150.000 bis 190.000 bei der Messung durch Gelfiltrationschromatographie.

2. Hitzebeständige Maltosephosphorylase nach Anspruch 1 mit den folgenden enzymologischen Eigenschaften zusätzlich zu (1) bis (7)

(8) Inaktivierung

100% inaktiviert beim Erhitzen auf 100ºC für 10 Minuten,

(9) Isoelektrischer Punkt

4,7 bis 5,1, und

(10) Inhibitor

Ihre Aktivität wird stark gehemmt mit HgCl&sub2;.

3. Verfahren zur Herstellung der hitzebeständigen Maltosephosphorylase nach Anspruch 1, welches umfasst: Züchtung von Bacillus sp. RK-1 (FERM BP-5592) oder Bacillus sp. MK-1 (FERM BP-5593) oder einer Mutante von einem der Bakterien, welche die Fähigkeit zum Erzeugen der hitzebeständigen Maltosephosphorylase nach Anspruch 1 oder 2 hat, in einem Nährmedium und Gewinnen der gebildeten Maltosephosphorylase aus der Kulturbrühe.

4. Bacillus sp. RK-1 (FERM BP-5592) oder Bacillus sp. MK-1 (FERM BP-5593) oder einer Mutante von einem der Bakterien, welche die Fähigkeit zum Erzeugen der hitzebeständigen Maltosephosphorylase nach Ansprüch 1 oder 2 hat.

5. Verfahren zur Herstellung von β-Glucose-1-phosphorsäure, welches das Umsetzen von Maltose mit Phosphorsäure oder einem Phosphatsalz in einem wässrigen Medium bei 55 bis 70ºC, bei pH 4,5 bis 8,0 in Anwesenheit der hitzebeständigen Maltosephosphorylase nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die hitzebeständige Maltosephosphorylase hitzebeständige Maltosephosphorylase ist, die durch Bacillus sp. RK-1 (FERM BP-5592) oder Bacillus sp. MK-1 (FERM BP-5593) hergestellt worden ist.

7. Verfahren zur Herstellung von Trehalose, welches das Umsetzen von Maltose mit Phosphorsäure oder einem Phosphatsalz in einem wässrigen Medium bei 55 bis 70ºC, bei pH 4,5 bis 8,0 in Anwesenheit der hitzebeständigen Maltosephosphorylase von Anspruch 1 oder und hitzebeständiger Trehalosephosphorylase umfasst.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem die hitzebeständige Maltosephosphorylase hitzebeständige Maltosephosphorylase ist, die durch Bacillus sp. RK-1 (FERM BP-5592) oder Bacillus sp. MK-1 (FERM BP-5593) hergestellt worden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei welchem die hitzebeständige Trehalosephophorylase hitzebeständige Trehalosephosphorylase ist, welche wenigstens 95% ihrer Aktivität beibehält, nachdem sie einer Temperatur von 50 bis 65ºC für 15 Minuten in einem Puffer bei pH 6,0 unterworfen worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem die hitzebeständige Trehalosephosphorylase hitzebeständige Trehalosephosphorylase ist mit den folgenden enzymologischen Eigenschaften ist:

(1) Wirkung

Phosphorylisiert Trehalose reversibel. Nämlich, wenn sie zur Einwirkung auf Trehalose in Anwesenheit von Phosphorsäure gebracht wird, erzeugt sie Glucose und β-Glucose-1-phosphorsäure in einer äquimolaren Menge, und wenn sie zur Einwirkung auf Glucose und β-Glucose-1-phosphorsäüre gebracht wird, erzeugt sie Trehalose und Phosphorsäure in einer äquimolaren Menge,

(2) Substrat-Spezifität

Wirkt spezifisch auf Trehalose,

(3) Temperatur-Optimum

Das Temperatur-Optimum von Trehalose-Phosphorolysereaktion ist von ungefähr 70ºC bis ungefähr 75ºC, und es zeigt etwa 50% oder mehr der maximalen Aktivität in dem Bereich von 60 bis 75ºC,

(4) Hitze-Stabilität

Behält wenigstens 95% ihrer Aktivität nachdem sie einer Temperatur von 65ºC für 15 Minuten in 10 mM Kaliumphosphat- Zitronensäure-Puffer (pH 6,0) unterworfen wurde,

(5) pH-Optimum

6,5 bis 7,5,

(6) pH-Stabilität

Stabil bei pH 6,0 bis 8,0, und

(7) Molekulargewicht

110.000 bis 150.000 bei der Messung durch Gelfiltrationschromatographie.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, bei welchem die hitzebeständige Trehalosephosphorylase hitzebeständige Trehalosephosphorylase ist, die durch Bacillus stearothermophilus SK-1 (FERM BP-5594) erzeugt worden ist.







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