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Dokumentenidentifikation DE69716116T2 04.09.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0944644
Titel VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON 3-KETO-7alpha-ALKOXYCARBONYL- delta4,5-STEROIDEN SOWIE ZWISCHENPRODUKTE
Anmelder G.D. SEARLE & CO., Chicago, Ill., US
Erfinder NG, S., John, Chicago, US;
LIU, Chin, Chicago, US;
ANDERSON, K., Dennis, Chicago, US;
LAWSON, P., Jon, Chicago, US;
WIECZOREK, Joseph, Chicago, US;
KUNDA, A., Sastry, Chesterfield, US;
LETENDRE, J., Leo, Chicago, US;
POZZO, J., Mark, Chicago, US;
SING, L., Yuen-Lung, Chicago, US;
WANG, T., Ping, Chicago, US;
YONAN, E., Edward, Chicago, US;
WEIER, M., Richard, Chicago, US;
KOWAR, R., Thomas, Chicago, US;
BAEZ, A., Julio, Chicago, US;
ERB, Bernhard, CH-5073 Gipf-Oberfrick, CH
Vertreter Hansmann & Vogeser, 81369 München
DE-Aktenzeichen 69716116
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 11.12.1997
EP-Aktenzeichen 979541265
WO-Anmeldetag 11.12.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/23090
WO-Veröffentlichungsnummer 0098025948
WO-Veröffentlichungsdatum 18.06.1998
EP-Offenlegungsdatum 29.09.1999
EP date of grant 02.10.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 04.09.2003
IPC-Hauptklasse C07J 71/00
IPC-Nebenklasse C07J 21/00   C07J 53/00   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft neue Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-7α-alkoxycarbonylsubstituierten Δ 4,5-Steroiden, insbesondere umfassend eine 9,11 Epoxygruppe, insbesondere solche der 20-Spiroxanreihe und deren Analoge, neue Zwischenprodukte, die sich zur Herstellung von Steroidverbindungen eignen und Verfahren zur Herstellung von solchen neuen Zwischenprodukten. Ganz besonders ist diese Erfindung gerichtet auf neue und vorteilhafte Methoden zur Herstellung von Methyl-hydrogen-9,11α-epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton (auch bezeichnet als Eplerenon oder Epoxymexrenon)

Methoden zur Herstellung von Verbindungen aus 20-Spiroxanreihen werden beschrieben in U.S. Patent 4,559,332. Die gemäß dem Verfahren des '332 Patentes hergestellten Verbindungen haben einen offenen Sauerstoffhaltigen Ring E der allgemeinen Formel:

worin

-A-A- die Gruppe -CH&sub2;-CH&sub2;- oder -CH=CH- bedeutet;

R¹ einen α-orientierten Niederalkoxycarbonyl- oder Hydroxycarbonylrest bedeutet;

-B-B- die Gruppe -CH&sub2;-CH&sub2;- oder eine α- oder β-orientierte Gruppe bedeutet;

wobei R&sup6; und R&sup7; Wasserstoff ist;

X zwei Wasserstoffatome oder Oxo bedeutet;

Y¹ und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeuten oder

Y¹ Hydroxy bedeutet und

Y² Hydroxy, Niederalkoxy bedeutet oder wenn X H&sub2; bedeutet auch Niederalkanoyloxy;

und Salze solcher Verbindungen, worin X Oxo bedeutet und Y² Hydroxy bedeutet, d. h. dass es 17β-Hydroxy-21-carbonsäuren entspricht.

U.S. Patent 4,559,332 beschreibt eine Anzahl von Methoden zur Herstellung von Epoxymexrenon und verwandten Verbindungen der Formel IA. Das Kommen von, neuen und ausgedehnten klinischen Anwendungen für Epoxymexrenon schafft einen Bedarf für verbesserte Verfahren zur Herstellung dieser und anderer verwandter Steroide.

Zusammenfassung der Erfindung

Der primäre Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in der Beschaffung von verbesserten Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-7α-alkoxycarbonyl-substituierten Δ-4,5- Steroiden, Epoxymexrenon oder 20-Spiroxanen und anderen Steroiden mit üblichen strukturellen Eigenschaften.

Die Maßnahmen eines solchen Verfahrens bestehen darin, dass es ein Minimum an Isolierungsstufen umfaßt und dass es durchgeführt werden kann mit preiswerten Kapitalkosten und betrieben werden kann bei preiswerten Umwandlungskosten.

Demgemäß ist die vorliegende Erfindung auf eine Reihe von Syntheseschemen gerichtet für die vorstehenden Verbindungen, Zwischenprodukte, die sich zur Herstellung von Epoxymexrenon eignen und Synthesen für solche neuen Zwischenverbindungen.

Die neuen Syntheseschemen werden im einzelnen beschrieben in der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung:

Ein Verfahren zur Herstellung eines 3-Keto-7α-alkoxycarbonyl substituierten Δ-4,5-Steroids wird beschrieben, umfassend die Umsetzung eines Alkylierungsmittels mit einem 4,5-Dihydro-5,7- lactonsteroidsubstrat in Gegenwart einer Base, wobei dieses Lactonsubstrat substituiert ist mit Keto oder Dialkoxy am 3-Kohlenstoff und weiterhin umfassend die Gruppe:

worin C(5) das 5-Kohlenstoff und C(7) das 7-Kohlenstoff der Steroidstruktur des Substrats bedeutet.

Es wird bevorzugt wenn dieses Steroidsubstrat eine gesättigte oder ungesättigte Nuclearstruktur enthält, weiterhin umfassend:

Eine 9,11-Epoxidgruppe oder Vorläufer davon und einen Substituenten am 17-Kohlenstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Spirolacton, Keto oder anderem Vorläufer des Spirolactons und außerdem wenn dieses Steroidsubstrat und dieses Steroidprodukt substituiert sind an der 17-Position mit einem Spirolactonsubstituenten entsprechend der Formel XXXIII

oder wenn dieses Steroidsubstrat und Steroidprodukt substituiert sind an der 17-Position mit einem Ketosubstituenten

oder wenn dieses Lactonsubstrat 3-Dialkoxysubstituenten umfaßt

oder wenn dieses 5,7-Lacton umgesetzt wird mit einem Alkylhalogenid in Gegenwart einer Base.

So wird speziell ein Verfahren zur Herstellung einer 4,5-Dihydro-5,7-lactonsteroidverbindung beschrieben worin dieses Lactonsteroid substituiert ist mit Keto oder Dialkoxy am 3-Kohlenstoff und umfaßt die Gruppe

worin C(5) das 5-Kohlenstoff bedeutet und C(7) das 7-Kohlenstoff der Steroidstruktur der Lactonverbindung bedeutet,

wobei das Verfahren umfaßt:

Umwandlung eines 7-Cyano substituierten Steroids zur 7-Carbonsäure und danach Umwandlung der 7-Carbonsäure in das 5,7-Lacton.

Es wird bevorzugt wenn das Substrat ein 3-Keto-Δ-4,5-7-carboxysteroid umfaßt und sich ein Ketalzwischenprodukt bildet, umfassend ein 3-Dialkoxy-5,7-lacton, wobei dieses 3-Dialkoxy-5,7- lacton hydrolysiert wird unter sauren Bedingungen unter Bildung des 3-Keto-5,7-lactons.

Diese Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel II:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R¹ einen alpha-orientierten Niederalkoxycarbonyl- oder Hydroxycarbonylrest bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet und

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden, die an den pentacyclischen D-Ring kondensiert sind;

wobei das Verfahren umfaßt:

Alkylieren einer Verbindung der Formel EI durch Hydrolyse, gefolgt durch Reaktion mit einem Alkylierungsmittel in Gegenwart einer Base, wobei die Verbindung der Formel EI die Struktur hat:

worin -A-A-, R³, R&sup8;, R&sup9; und -B-B- vorstehende bedeutung haben und R¹&sup7; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist.

Vorzugsweise wird eine Verbindung entsprechend der Formel IIC

hergestellt, mit den Substituenten wie vorstehend beschrieben,

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

wobei das Verfahren umfaßt:

Alkylieren einer Verbindung der Formel E durch Hydrolyse, gefolgt durch Umsetzung mit einem Alkylierungsmittel in Gegenwart einer Base, wobei die Verbindung der Formel E die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben und R¹&sup7; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl bedeutet.

Eine solche Verbindung E kann hergestellt werden durch thermische Zersetzung einer Verbindung entsprechend der Formel DE2 in Gegenwart eines Alkalimetallhalogenids, wobei diese Verbindung der Formel DE2 die Struktur aufweist:

worin R¹² C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und -A-A-, -B-B-, R³ und R¹&sup7; vorstehende Bedeutung haben.

Die Verbindung DE2, worin die Substituenten vorstehende Bedeutung haben, kann hergestellt werden durch Kondensieren einer Verbindung der Formel DE1 mit einem Dialkylmalonat in Gegenwart einer Base, wobei diese Verbindung der Formel DE1 die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B-, R³ und R¹&sup7; vorstehende Bedeutung haben.

Die Verbindung DE1, worin die Substituenten vorstehende Bedeutung haben, kann hergestellt werden durch Umsetzung einer Verbindung der Formel D mit einem Sulfoniumylid in Gegenwart einer Base, wobei die Verbindung der Formel D die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B-, R³ und R¹&sup7; vorstehende Bedeutung haben.

Die Formel D Verbindung mit den Substituenten wie vorstehend definiert kann hergestellt werden durch Hydrolyse einer Verbindung der Formel C zur 7α-Carbonsäure und Umsetzung unter saueren Bedingungen mit einem Trialkylorthoformiat, wobei die Verbindung C die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben.

Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel I

worin

-A-A-, R³, R&sup4;, R&sup5;, -B-B-, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R&sup9; vorstehende Bedeutung haben und worin

R²&sup6; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und

R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus R&sup8; und R&sup9; oder R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen Keto bilden;

wobei das Verfahren umfaßt:

Alkylierung einer Verbindung der Formel A211 durch Umsetzung mit einem Alkylierungsreagenz in Gegenwart einer Base, worin die Verbindung der Formel A211 die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; vorstehende Bedeutung haben.

Die Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel IE:

worin

-A-A-, R³, R&sup4;, R&sup5;, R²&sup6;, -B-B-, R&sup6;, R&sup7; vorstehende Bedeutung haben und worin das Verfahren umfaßt:

Alkylierung einer Verbindung der Formel 211 durch Umsetzung mit einem Alkylierungsreagenz in Gegenwart einer Base, wobei die Verbindung der Formel 211 die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben.

Eine solche Verbindung [211], worin die Substituenten vorstehende Bedeutung haben kann hergestellt werden durch Oxidation einer Verbindung A210, wobei die Verbindung der Formel A210 folgende Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; vorstehende Bedeutung haben.

In der vorstehenden Methode wird bevorzugt, dass R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen mit C(17) die Verbindung umfassen

worin X zwei Wasserstoffatome, Oxo oder =S bedeutet;

Y¹ und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeuten oder

Y¹ Hydroxy bedeutet und

Y² Hydroxy, Niederalkoxy bedeutet oder wenn X H&sub2; bedeutet auch Niederalkanoyloxy bedeutet

oder wenn R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup9; zusammen mit (C17)

umfaßt.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der vorstehend gezeigten Formel A211, wobei das Verfahren umfaßt:

Umsetzung eines 3-Keto-5,7-hemiacetalzwischenproduktes der Formel A209C mit einem Peroxidoxidationsmittel, wobei die Verbindung der Formel A209C der Formel entspricht

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; vorstehende Bedeutung haben.

Es wird besonders bevorzugt in einer solchen Methode, wenn R&sup8; und R&sup9; zusammen mit C(17) umfassen

worin X zwei Wasserstoffatome, Oxo oder =S bedeutet;

Y¹ und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeuten oder

Y¹ Hydroxy bedeutet und

Y² Hydroxy, Niederalkoxy oder wenn X H&sub2; bedeutet auch Niederalkanoyloxy bedeutet

oder wenn R&sup8; und R&sup9; zusammen mit C(17) umfaßt

Die Erfindung beschreibt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der vorstehend gezeigten Verbindung der Formel [A210], wobei das Verfahren umfaßt:

Umsetzung eines 3-Keto-5,7-hemiacetalzwischenproduktes der Formel A209C mit einem Peroxidoxidationsmittel, wobei diese Verbindung der Formel A209C der Formel entspricht:

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; vorstehende Bedeutung haben.

Hierbei wird besonders bevorzugt wenn R&sup8; und R&sup9; zusammen mit C(17)

umfassen,

worin X zwei Wasserstoffatome, Oxo oder =S bedeutet;

Y¹ und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeutet oder

Y¹ Hydroxy bedeutet und

Y² Hydroxy, Niederalkoxy bedeutet oder wenn X H&sub2; bedeutet auch Niederalkanoyloxy

oder wenn R&sup8; und R&sup9; zusammen mit C(17)

umfassen.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel A209:

worin

-A-A-, R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup8;&sup0;, R&sup9;&sup0; vorstehende Bedeutung haben und worin

und -E-E- ausgewählt ist aus

worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus u. a. Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus u. a. Wasserstoff und Niederalkyl;

wobei das Verfahren umfaßt:

Hydrolysieren einer Verbindung entsprechend der Formel A208

worin -A-A-, -B-B-, -E-E-, R³, R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; vorstehende Bedeutung haben; R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist oder die R&sub1;&sub9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden und R²&sup0; C&sub1;-C&sub4;-Alkyl ist.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel A205:

worin

-A-A-, R³, -B-B-, -E-E-, R³ vorstehende Bedeutung haben und

R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden und

R²&sup0; C&sub1;-C&sub4; Alkyl ist und

wobei das Verfahren umfaßt:

Umsetzung einer Verbindung entsprechend der Formel A204 mit einem niederen Alkohol und einer Säure, wobei die Verbindung der Formel A204 folgende Struktur aufweist

worin -A-A-, -B-B-, -E-E-, R³ und R¹&sup9; vorstehende Bedeutung haben.

Eine solche Verbindung [A204] kann hergestellt werden durch Hydrolisieren einer Verbindung entsprechend der Formel A203 in Gegenwart eines Alkohols der Formel R²&sup0;OH wobei diese Verbindung der Formel A203 die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B-, -E-E-, und R³ vorstehende Bedeutung haben und R¹&sup8; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist oder die R¹&sup8;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden.

Eine solche Verbindung [A204] kann außerdem hergestellt werden durch Schützen der Ketosubstituenten einer Verbindung entsprechend der Formel A201 durch Umsetzung mit Alkanol unter sauren Bedingungen in Gegenwart von Orthoformiat, wobei die Verbindung der Formel A201 folgende Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B-, -E-E- und R³ vorstehende Bedeutung haben, wobei ein 3-Enoletherzwischenprodukt hergestellt wird entsprechend der Formel A202:

worin -A-A-, -B-B-, -E-E- und R³ vorstehende Bedeutung haben und R¹&sup8; ein C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist oder die R¹&sup8;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden und wobei diese Verbindung der Formel A202 reduziert wird unter Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel A203:

worin -A-A-, -B-B-, -E-E-, R³ und R¹&sup8; vorstehende Bedeutung haben und

Hydrolysieren dieser Verbindung entsprechend der Formel A203 in Gegenwart eines Alkohols der Formel R²&sup0;OH wobei diese Verbindung der Formel A204 produziert wird.

Die Verbindung[A203] kann hergestellt werden durch Reduktion einer Verbindung entsprechend der vorstehend gezeigten Formel A202.

In dem vorstehend beschriebenen Verfahren und bei den Verbindungen selbst wird besonders bevorzugt, wenn

R³ Wasserstoff ist, -A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5; und -B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- darstellt oder wenn R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; jeweils Wasserstoff sind.

Die Erfindung umfaßt außerdem Verbindungen der Formel E, D, [211], [210], [209], [208], [205], [204], [203] wie sie vorstehend gezeigt werden als auch Formel F

worin die Substituenten vorstehende Bedeutung haben.

Als auch Formel [A207]

worin

-A-A-, -B-B-, R¹&sup9;, R³ vorstehende Bedeutung haben und

R²&sup0;, R²&sup5; C&sub1;-C&sub4;-Alkyl sind.

Außerdem umfaßt durch die Erfindung ist eine Verbindung entsprechend der Formel A206:

mit allen Substituenten wie vorstehend definiert.

Eine Verbindung der Formel 101 weist die Struktur auf:

worin die Substituenten vorstehende Bedeutung haben.

Eine Verbindung der Formel 101A entspricht der Formel 101, worin -A-A- und -B-B- jeweils -CH&sub2;CH&sub2;- bedeuten und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel 101 können hergestellt werden durch Umsetzung von 11α-Hydroxyandrosten-3,17-dion oder anderen Verbindungen der Formel XXXVI wie nachstehend beschrieben mit einem Trialkylorthoformiat in Gegenwart einer Säure.

Eine Verbindung der Formel XL entspricht der Formel

mit -E-E- wie vorstehend definiert in den Strukturen XLIII, XLIV, XLVI, XLVII.

Eine Verbindung der Formel XLA entspricht der Formel XL, worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalkyl.

Eine Verbindung der Formel XLB entspricht der Formel XLA, worin -E-E- der Formel XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht. Eine Verbindung der Formel XLC entspricht der Formel XLB, worin -E-E- der Formel XLV entspricht. Eine Verbindung von XLD entspricht der Formel XLB, worin -E-Eder Formel XLVII entspricht.

Eine Verbindung der Formel XLE entspricht der Formel XL, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen mit dem Ringkohlenstoffatom, an das sie gebunden sind Keto umfassen oder

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben oder

bedeuten.

Verbindungen der Formel XLIE entsprechen der Formel XL, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen Keto bilden.

Verbindungen der Formeln XLF, XLG, XLH, XLJ, XLM und XLN entsprechen der Formel XL, XLA, XLB, XLC, XLD bzw. XLE, worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben.

Eine Verbindung der Formel XLI entspricht der Formel:

worin -E-E- ausgewählt ist aus

worin R¹&sup8; ein C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist oder die R¹&sup8;O- Gruppen zusammen eine O,O- Oxyalkylenbrücke bilden; R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl; R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Keto und den Substituenten, die aus R&sup8; und R&sup9; bestehen können und -A-A-, -B-B- und R³ die in Formel IV gegebenen Bedeutung besitzen.

Eine Verbindung der Formel XLIA entspricht der Formel XLI, worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalkyl.

Eine Verbindung der Formel XLIB entspricht der Formel XLIA, worin -E-E- der Formel XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht.

Eine Verbindung der Formel XLIC entspricht der Formel XLI, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen mit dem Ringkohlenstoffatom, an das sie gebunden sind Keto umfassen oder:

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben.

Verbindungen der Formel XLID entsprechen der Formel XLI, worin der Substituent XXXIV der Struktur XXXIII entspricht

Verbindungen der Formel XLIE entsprichen der Formel XL, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen Keto bilden.

Verbindungen der Formeln XLIF, XLIG, XLIH, XLIJ, XLIM und XLIN entsprechen der Formel XLI, XLIA, XLIB, XLIC, XLID bzw. XLIE, worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel XLI werden hergestellt durch Hydrolyse der entsprechenden Verbindungen der Formel XL wie nachstehend definiert.

Eine Verbindung der Formel XLII entspricht der Formel:

worin -E-E- ausgewählt ist aus

worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano; R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl; R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Keto und die Substituenten, die R&sup8; und R&sup9; darstellen können und -A-A-, -B-B- und R³, die in Formel IV gegebene Bedeutung aufweisen.

Eine Verbindung der Formel XLIIA entspricht der Formel XLIII, worin R²¹, R²² und R²&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalkyl.

Eine Verbindung der Formel XLIIB entspricht der Formel XLIIA, worin -E-E- der Formel XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht.

Eine Verbindung der Formel XLIIC entspricht der Formel XLII, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen mit dem Ringkohlenstoffatom, an das sie gebunden sind Keto umfassen oder:

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben.

Verbindungen der Formeln XLIID entsprechen der Formel XLII, worin der Substituent XXXIV der Struktur XXXIII entspricht

Verbindungen der Formel XLIIE entsprichen der Formel XLII, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen Keto bilden.

Verbindungen der Formeln XLIIF, XLIIG, XLIIH, XLIIJ, XLIIM und XLIIN entsprechen den Formeln XLII, XLIIA, XLIIB, XLIIC, XLIID bzw. XLIIE, worin -A-A- und -B-B- CH2-CH2 sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel XLII werden hergestellt durch Entfernung der Schutzgruppe aus einer entsprechenden Verbindung der Formel XLI.

Eine Verbindung der Formel XLIX entspricht der Struktur:

worin -E-E- die Bedeutung hat wie in Formel XL definiert und -A-A-, -B-B-, R¹, R³, R&sup8; und R&sup9; die Bedeutung wie in Formel IV haben.

Eine Verbindung der Formel XLIXA entspricht der Formel XLIX, worin R&sup8; und R&sup9; mit dem Ringkohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, die Struktur bilden:

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben.

Eine Verbindung der Formeln XLIXB entspricht der Formel XLIX, worin R&sup8; und R&sup9; zusammen die Struktur der Formel XXXIII bilden

Verbindungen der Formeln XLIXC, XLIXD bzw. XLIXE entsprechen einer der Formeln XLIX, XLIXA oder XLIXB, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- bedeuten, R³ Wasserstoff ist und R¹ Alkoxycarbonyl, vorzugsweise Methoxycarbonyl ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens XLIX können hergestellt werden durch Umsetzung eines alkoholischen oder wässrigen Lösungsmittels mit einer entsprechenden Verbindung der Formel VI in Gegenwart einer geeigneten Base.

Eine Verbindung der Formel A203 entspricht der Struktur:

worin -E-E- ausgewählt ist aus

worin R¹&sup8; ausgewählt ist aus C&sub1; bis C&sub4; Alkyl; R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano; R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl und -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel IV definiert sind.

Eine Verbindung der Formel A203A entspricht der Formel A203, worin R²¹, R²² und R²&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalkyl.

Eine Verbindung der Formel A203B entspricht der Formel A203A, worin -E-E- der Formel XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht.

Verbindungen der Formeln A203C, A203D bzw. A203E entsprechen der Formel A203, A203A und A203B, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel A203 werden hergestellt durch Reduzierung einer Verbindung der Formel A202 wie nachstehend definiert.

Eine Verbindung der Formel A204 entspricht der Struktur:

worin R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und -E-E-, -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel 203 definiert sind.

Eine Verbindung der Formel A204A entspricht der Formel A204, worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalkyl.

Eine Verbindung der Formel A204B entspricht der Formel A204A, worin -E-E- der Formel XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht.

Verbindungen der Formeln A204C, A204D bzw. A204E entsprechen den Formel A204, A204A und A204B, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel A204 werden hergestellt durch Hydrolyse der entsprechenden Verbindung der Formel A203.

Eine Verbindung der Formel A205 entspricht der Struktur:

worin R²&sup0; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und -E-E-, R¹&sup9;, -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel 204 definiert sind.

Eine Verbindung der Formel A205A entspricht der Formel A205, worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalkyl.

Eine Verbindung der Formel A205B entspricht der Formel A205A, worin -E-E- der Formel XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht.

Verbindungen der Formeln A205C, A205D bzw. A205E entsprechen den Formel A205, A205A und A205B, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel A205 können hergestellt werden durch Umsetzung einer entsprechenden Verbindung der Formel A204 mit einem Alkohol und einer Säure.

Eine Verbindung der Formel A206 entspricht der Struktur:

worin R¹&sup9;, R²&sup0;, -E-E-, -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel 205 definiert sind.

Eine Verbindung der Formel A206A entspricht der Formel A206, worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalkyl.

Eine Verbindung der Formel A206B entspricht der Formel A206A, worin -E-E- den Formeln XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht.

Verbindungen der Formeln A206C, A206D bzw. A206E entsprechen den Formel A206, A206A und A206B, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel A206 können hergestellt werden durch Umsetzung einer entsprechenden Verbindung innerhalb des Rahmens der Formel A205 mit einem Trialkylsulfoniumhalogenid.

Eine Verbindung der Formel A207 entspricht der Struktur

worin R²&sup5; C&sub1; bis C&sub4; Alkly ist und -E-E-, R¹&sup9;, R²&sup0;, -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel A205 definiert sind:

Eine Verbindung der Formel A207A entspricht der Formel A207, worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalkyl.

Eine Verbindung der Formel A207B entspricht der Formel A207A, worin -E-E- den Formeln XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht.

Verbindungen der Formeln A207C, A207D bzw. A207E entsprechen den Formel A207, A207A und A207B, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen der Formel A207 können hergestellt werden durch Umsetzung von Verbindungen der Formel A206 mit einem Dialkylmalonat.

Eine Verbindung der Formel A208 entspricht der Struktur:

worin -E-E-, R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; wie in Formel XLII definiert sind; -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel 104 definiert sind und R¹&sup9;, R²&sup0;, -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel 205 definiert sind.

Eine Verbindung der Formel A208A entspricht der Formel A208, worin R²¹ und R²² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalkyl.

Eine Verbindung der Formel A208B entspricht der Formel A208A, worin -E-E- den Formeln XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht.

Eine Verbindung der Formel A208C entspricht der Formel A208, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen mit dem Ringkohlenstoffatom, an das sie gebunden sind Keto umfassen oder:

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben.

Verbindungen der Formeln 208D entsprechen der Formel 208C, worin der Substituent XXXIV der Struktur XXXIII entspricht

Verbindungen der Formeln A208E, A208F, A208G, A208H bzw. A208J entsprechen der Formel A208, A208A, A208B, A208C und A208D, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel A208 können hergestellt werden durch thermische Zersetzung der entsprechenden Verbindungen der Formel A207.

Eine Verbindung der Formel A209 entspricht der Struktur:

worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; wie in Formel XLI definiert sind und -E-E- und -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel 205 definiert sind.

Eine Verbindung der Formel A209A entspricht der Formel A209, worin R²¹ und R²² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen und Niederalklyl.

Eine Verbindung der Formel A209B entspricht der Formel A209A, worin -E-E- der Formel XLIII, XLIV, XLV oder XLVII entspricht.

Eine Verbindung der Formel A209C entspricht der Formel A209B, worin -E-E- der Formel XLIV entspricht.

Eine Verbindung der Formel A209D entspricht der Formel A209, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen mit dem Ringkohlenstoffatom, an dass sie gebunden sind, Keto umfassen oder:

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben.

Verbindungen der Formeln 209E entsprechen der Formel 209D, worin der Substituent XXXIV der Struktur XXXIII entspricht

Verbindungen der Formeln A209F, A209G, A209H, A209J, A209L bzw. A209M entsprechen der Formel A209, A209A, A209B, A209C, A209D und A209E, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel A209 können hergestellt werden durch Hydrolyse einer entsprechenden Verbindung der Formel A208.

Eine Verbindung der Formel A210 entspricht der Struktur:

worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; wie in Formel XLI definiert sind und die Substituenten -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel IV definiert sind.

Eine Verbindung der Formel A210A entspricht der Formel A210, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen mit dem Ringkohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, Keto umfassen oder:

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben.

Verbindungen der Formeln A210B entsprechen der Formel A210A, worin der Substituent XXXIV der Struktur XXXIII

entspricht.

Verbindungen der Formel A210C entsprechen der Formel A210A, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen Keto bilden.

Verbindungen der Formel A210D, A210E, A210F bzw. A210G entsprechen der Formel A210, A210A, A210B und A210C, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel 210 können hergestellt werden durch Epoxidierung einer Verbindung der Formel 209, worin -E-E- =C=CH- ist.

Eine Verbindung der Formel A211 entspricht der Formel

worin--A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben.

Eine Verbindung der Formel A211A entspricht der Formel A211, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen Keto umfassen oder:

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben.

Verbindungen der Formeln A211B entsprechen der Formel A211A, worin der Substituent XXXIV der Struktur XXXIII

entspricht.

Verbindungen der Formel A211C entsprechen der Formel A210A, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen Keto bilden.

Verbindungen der Formeln A211D, A211E, A211F bzw. A211G entsprechen der Formel A211, A211A, A211B und A211C, worin jeweils -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist. Verbindungen innerhalb des Rahmens der Formel A211 können hergestellt werden durch Oxidation einer entsprechenden Verbindung der Formel A210 oder im Zuge von Epoxidierung der entsprechenden Verbindung der Formel A209, worin -E-E- =C=CH- ist. Verbindungen der Formel A211 können umgewandelt werden in Verbindungen der Formel I auf die nachstehend beschriebene Weise.

Eine Verbindung der Formel L entspricht der Struktur

worin R¹¹ C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und -A-A-, -B-B-, R¹, R², R³, R&sup8; und R&sup9; vorstehende Bedeutung haben.

Verbindungen der Formel LA entsprechen der Formel L, worin R&sup8; und R&sup9; zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind

umfaßt,

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben.

Verbindungen der Formel LB entsprechen er Formel L, worin R&sup8; und R&sup9; der Formel XXXIII

entsprechen.

Verbindungen der Formeln LC, LD, LE entsprechen den Formeln L, LA bzw. LB, worin -A-A- und -B-B- jeweils -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff ist.

Auf Grundlage der Offenbarung von spezifischen Reaktionsschemen, wie sie nachstehend wiedergegeben werden, wird es ersichtlich sein, welche dieser Verbindungen am meisten geeignet ist mit Bezug auf ein besonderes Reaktionsschema. Die Verbindungen dieser Erfindung eignen sich als Zwischenprodukte für Epoxymexrenon und andere Steroide.

Andere Gegenstände und Eigenschaften sind im Einzelnen ersichtlich und es wird im Einzelnen im Nachstehenden darauf hingewiesen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein schematisches Fließschema eines Verfahrens für die Bioumwandlung von Canrenon oder ein Canrenonderivat zur entsprechenden 11α-Hydroxyverbindung;

Fig. 2 ist ein schematisches Fließschema eines bevorzugten Verfahrens zur Bioumwandlung/11-α-Hydroxylierung von Canrenon und Canrenonderivaten;

Fig. 3 ist ein schematisches Fließschema eines besonders bevorzugten Verfahrens für die Bioumwandlung/11-α-Hydroxylierung von Canrenon und Canrenonderivaten;

Fig. 4 zeigt die Teilchengrößenverteilung für Canrenon, hergestellt gemäß dem Verfahren von Fig. 2 und

Fig. 5 zeigt die Teilchengrößenverteilung für Canrenon, wie es sterilisiert wurde im Umwandlungsfermenter gemäß dem Verfahren der Fig. 3.

Entsprechende Bezugscharakterisierungen zeigen entsprechende Teile innerhalb der Zeichnungen an.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Gemäß der vorliegenden Erfindung sind verschiedene neue Verfahrensschemen konstruiert worden für die Herstellung von Epoxymexrenon und anderen Verbindungen entsprechend der Formel I:

worin:

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

R¹ einen alpha-orientierten Niederalkoxycarbonyl- oder Hydroxyalkylrest bedeutet und

-B-B- die Gruppe =CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Hab, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur umfassen, die an den pentacyclischen-D-Ring kondensiert sind.

Außer, wenn etwas anderes angegeben wurde, enthalten organische Reste, die als "Nieder" in der vorstehenden Offenbarung bezeichnet wurden höchstens 7 und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome.

Ein Niederalkoxycarbonylrest ist vorzugsweise einer, der von einem Alkylrest stammt mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl und tert.-Butyl; insbesondere bevorzugt sind Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl and Isopropoxycarbonyl. Ein Niederalkoxyrest ist vorzugsweise einer, der von einem der vorstehend genannten C&sub1;-C&sub4;-Alkylresten stammt, insbesondere von einem primären C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest; besonders bevorzugt ist Methoxy. Ein Niederalkanoylrest ist vorzugsweise einer, der von einem geradkettigen Alkyl stammt mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen; insbesondere bevorzugt werden Formyl und Acetyl.

Eine Methylenbrücke in der 15,16-Position ist vorzugsweise β-orientiert.

Eine bevorzugte Klasse von Verbindungen, die gemäß den erfindungsgemäßen Methoden hergestellt werden kann sind die 20-Spiroxanverbindungen, die in U.S. Patent 4,559,332 beschrieben werden, d. h. solche, die der Formel IA entsprechen:

worin:

-A-A- die Gruppe -CH&sub2;CH&sub2;- oder -CH=CH- bedeutet;

-B-B- die Gruppe -CH&sub2;-CH&sub2; oder eine α- oder β-orientierte Gruppe der Formel IIIA:

bedeutet;

R¹ einen α-orientierten Niederalkoxycarbonyl- oder Hydroxycarbonylrest bedeutet;

X zwei Wasserstoffatome, Oxo oder =S bedeutet;

Y¹ und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeuten oder

Y¹ Hydroxy bedeutet und

Y² Hydroxy, Niederalkoxy bedeutet oder wenn X H&sub2; bedeutet auch Niederalkanoyloxy.

Vorzugsweise sind die nach den neuen erfindungsgemäßen Methoden hergestellten 20- Spiroxanverbindungen solche der Formel I, worin Y¹ und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeuten.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel I sind diejenigen, worin X Oxo bedeutet. Von den Verbindungen der 20-Spiroxanverbindungen der Formel IA, worin X Oxo bedeutet sind am meisten bevorzugt diejenigen, worin Y¹ zusammen mit Y² die Sauerstoffbrücke -O- bedeuten.

Wie bereits ausgeführt kann 17β-Hydroxy-21-carbonsäure außerdem in Form ihrer Salze vorliegen. Besonders in Frage kommen Metall- und Ammoniumsalze, wie Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, beispielsweise Natrium, Calcium, Magnesium und vorzugsweise Kaliumsalze und Ammoniumsalze, die von Ammoniak abstammen oder einer geeigneten vorzugsweise physiologisch tolerierbaren organischen Stickstoffhaltigen Base. Als Basen kommen nicht nur Amine in Frage, beispielsweise Niederalkylamine (wie Triethylamin), Hydroxy-nieder-alkylamine (wie 2-Hydroxyethylamin, di-(2-Hydroxyethyl)-amin oder tri-(2-Hydroxyethyl)-amin), Cycloalkylamine (wie Dicyclohexylamin) oder Benzylamine (wie Benzylamin und N,N'-Dibenzylethylendiamin) sondern auch Stickstoff-haltige heterocyclische Verbindungen wie diejenigen mit aromatischem Charakter (wie Pyridin oder Chinolin) oder solche, die mindestens teilweise gesättigte heterocyclische Ringe aufweisen (wie N-Ethylpiperidin, Morpholin, Piperazin oder N,N'-Dimethylpiperazin).

Außerdem umfaßt von bevorzugten Verbindungen sind Alkalimetallsalze, insbesondere Kaliumsalze von Verbindungen der Formel IA, worin R¹ Alkoxycarbonyl bedeutet, wobei X Oxo bedeutet und Y¹ und Y² jeweils Hydroxy bedeuten.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel I und IA sind beispielsweise die folgenden:

9α,11α-Epoxy-7α-methoxycarbonyl-20-spirox-4-en-3,21-dion,

9α,11α-Epoxy-7α-ethoxycarbonyl-20-spirox-4-en-3,21-dion,

9α,11α-Epoxy-7α-isopropoxycarbonyl-20-spirox-4-en-3,21-dion

und die 1,2-Dehydroanalogen jeder dieser Verbindungen;

9α,11α-Epoxy-6α,7α-methylen-20-spirox-4-en-3,21-dion,

9α,11α-Epoxy-6β,7β-methylen-20-spirox-4-en-3,21-dion,

9α,11α-Epoxy-6β,7β;15β,16β-bismethylen-20-spirox-4-en-3,21-dion

und die 1,2-Dehydroanalogen jeder dieser Verbindungen;

9α,11α-Epoxy-7α-methoxycarbonyl-17β-hydroxy-3-oxo-pregn-4-en-21-carbonsäure,

9α,11α-Epoxy-7α-ethoxycarbonyl-17β-hydroxy-3-oxo-pregn-4-en-21-carbonsäure,

9α,11α-Epoxy-7α-isopropoxycarbonyl-17β-hydroxy-3-oxo-pregn-4-en-21-carbonsäure,

9α,11-α-Epoxy-17β-hydroxy-6α,7α-methylen-3-oxo-pregn-4-en-21-carbonsäure,

9α,11α-Epoxy-17β-hydroxy-6β,7β-methylen-3-oxo-pregn-4-en-21-carbonsäure,

9α,11α-Epoxy-17β-hydroxy-6β,7β;15β,16β-bismethylen-3-oxo-pregn-4-en-21-carbonsäure

und Alkalimetallsalze, insbesondere die Kaliumsalze oder Ammoniumsalze jedes dieser Säuren

und außerdem ein entsprechendes 1,2-Dehydroanalog jeder der genannten Carbonsäuren oder eines Salzes davon;

9α,11α-Epoxy-15β,16β-methylen-3,21-dioxo-20-spirox-en-7α-carbonsäuremethylester, -ethylester und -isopropylester,

9α,11α-Epoxy-1565β,16β-methylen-3,21-dioxo-20-spiroxa-1,4-dien-7α-carbonsäuremethylester, -ethylester und -isopropylester,

9α,11α-Epoxy-3-oxo-20-spirox-4-en-7α-carbonsäuremethylester, -ethylester und -isopropylester,

9α,11α-Epoxy-6β,6β-methylen-20-spirox-4-en-3-on,

9α,11α-Epoxy-6β,7β;15β,16β-bismethylen-20-spirox-4-en-3-on,

9α,11α-Epoxy,17β-hydroxy-17α(3-hydroxy-propyl)-3-oxo-androst-4-en-7α- carbonsäuremethylester, -ethylester und -isopropylester,

9α,11α-Epoxy,17β-hydroxy-17α-(3-hydroxypropyl)-6α,7α-methylen-androst-4-en-3-on,

9α,11α-Epoxy-17β-hydroxy-17α-(3-hydroxypropyl)-6β,7β-methylen-androst-4-en-3-on,

9α,11α-Epoxy-17β-hydroxy-17α-(3-hydroxypropyl)-6β,7β;15β,16β-bismethylen-androst-4-en-3- on,

einschließlich 17α-(3-acetoxypropyl)- und 17α-(3-formyloxypropyl)-Analoge der genannten Androstanverbindungen

und außerdem 1,2-Dehydroanaloge aller genannten Verbindungen der Androst-4-en-3-on und 20-Spirox-4-en-3-on Reihe.

Die chemischen Namen der Verbindungen der Formeln I und IA und analoge-Verbindungen mit den gleichen charakteristischen Struktureigenschaften sind abgeleitet gemäß der laufenden Nomenclatur auf folgende Weise: Für Verbindungen, worin Y¹ zusammen mit Y² -O- bedeuten von 20-Spiroxan (beispielsweise einer Verbindung der Formel IA, worin X Oxo bedeutet und Y¹ zusammen mit Y² -O- bedeutet stammt von 20-Spiroxan-21-on); Für diejenigen, worin jeweils Y¹ und Y² Hydroxy bedeuten und X Oxo bedeutet von 17β-Hydroxy-17α-pregnen-21-carbonsäure und für diejenigen, worin jeweils Y¹ und Y² Hydroxy bedeuten und X zwei Wasserstoffatome bedeutet von 17β-Hydroxy-17α-(3-hydroxypropyl)-androstan. Da die cyclischen und offenkettigen Formen, d. h. Lactone und 17β-Hydroxy-21-carbonsäuren und deren Salze so eng miteinander verwandt sind, dass die letzteren nur als hydratisierte Form der ersteren erachtet werden können, ist im vorstehenden und nachstehenden zu verstehen, außer wenn speziell etwas anderes angegeben wird, beide in den Endprodukten der Formel I und in Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukten von analoger Struktur in allen Fällen die genannten Formen zusammen sind.

Gemäß der Erfindung sind einige getrennte Verfahrensschemen konstruiert worden für die Herstellung von Verbindungen der Formel I in hoher Ausbeute und preiswerten Kosten. Jede der Syntheseschemen verläuft durch die Herstellung einer Reihe von Zwischenprodukten. Eine Anzahl dieser Zwischenprodukte sind neue Verbindungen und die Methoden zur Herstellung dieser Zwischenprodukte sind neue Verfahren.

Schema 1 (Ausgehend von Canrenon und verwandtem Material)

Ein bevorzugtes Verfahrensschema zur Herstellung von Verbindungen der Formel I beginnt vorteilhafterweise mit Canrenon oder einem verwandten Ausgangsmaterial entsprechend der Formel XIII (oder wahlweise kann das Verfahren beginnen mit Androstendion oder einem verwandten Ausgangsmaterial)

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- bedeutet die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen ein Keto, carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur umfassen oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur umfassen, die an einen pentacyclischen D-Ring kondensiert sind.

Unter Anwendung eines Bioumwandlungsverfahrens des Typs wie es in Fig. 1 und 2 erläutert wird, wird eine 11-Hydroxygruppe mit α-Orientierung eingeführt in die Verbindung der Formel XIII, wodurch eine Verbindung der Formel VIII erzeugt wird

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die Bedeutung von Formel XIII haben. Vorzugsweise hat die Verbindung der Formel XIII die Struktur

und das 11α-Hydroxyprodukt hat die Struktur

wobei in jeder

-A-A- die Gruppe -CH&sub2;-CH&sub2;- oder -CH=CH- bedeutet;

-B-B- bedeutet die Gruppe -CH&sub2;-CH&sub2;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe

bedeutet;

R³ Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy bedeutet;

X zwei Wasserstoffatome, Oxo oder =S bedeutet;

Y¹ und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeutet oder

Y¹ Hydroxy bedeutet und

Y² Hydroxy, Niederalkoxy oder wenn X H&sub2; bedeutet auch Niederalkanoyloxy bedeutet;

und Salze der Verbindungen, worin X Oxo bedeutet und 9 Hydroxy bedeutet.

Bevorzugtererweise entsprechen die in der Reaktion hergestellten Verbindungen der Formel VIIIA einer Verbindung der Formel VIIIA, worin -A-A- und -B-B- jeweils -CH&sub2;-CH&sub2;- sind; R³ Wasserstoff ist; Y¹, Y² und X die in Formel XIIIA definierte Bedeutung haben und R&sup8; und R&sup9; zusammen die 20- Spiroxanstruktur

bilden.

Unter den bevorzugten Organismen, die in dieser Hydroxylierungsstufe verwendet werden können sind Aspergillus ochraceus NRRL 405, Aspergillus ochraceus ATCC 18500, Aspergillusniger ATCC 16888 und ATCC 26693, Aspergillus nidulans ATCC 11267, Rhizopus oryzae ATCC 11145, Rhizopus stolonifer ATCC 6227b, Streptomyces fradiae ATCC 10745, Bacillus megaterium ATCC 14945, Pseudomonas cruciviae ATCC 13262 und Trichothecium roseum ATCC 12543. Andere bevorzugte Organismen umfassen Fusarium Oxysporum f. sp. cepae ATCC 11171 und Rhizopus arrhizus ATCC 11145.

Andere Organismen, die Wirksamkeit für diese Reaktion zeigten umfassen Absidia coerula ATCC 6647, Absidia Glauca ATCC 22752, Actinomucor elegans ATCC 6476, Aspergillus flavipes ATCC 1030, Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Beauveria bassiana ATCC 7159 und ATCC 13144, Botryosphaeria obtusa IMI 038560, Calonectria decora ATCC 14767, Chaetomium cohcliodes ATCC 10195, Corynespora cassiicola ATCC 16718, Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella elegans ATCC 9245, Curvularia clavata ATCC 22921, Curvularia lunata ACTT 12017, Cylindrocarpon radicicola ATCC 1011, Epicoccum humicola ATCC 12722, Gongronella butleri ATCC 2282, Hypomyces chrysospermus ATCC IMI 109891, Mortierella isabellina ATCC 42613, Mucor mucedo ATCC 4605, Mucor griseo-cyanus ATCC 1207A, Myrothecium verrucaria ATCC 9095, Nocardia corallina ATCC 19070, Paecilomyces carneus ATCC 46579, Penicillum patulum ATCC 24550, Pithomyces atro-olivaceus IFO 6651, Pithomyces cynodontis ATCC 26150, Pycnosporium sp. ATCC 12231, Saccharopolyspora erythrae ATCC 11635, Sepedonium chrysospermum ATCC 13378, Stachylidium bicolor ATCC 12672, Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438, Streptomyces prupurascens ATCC 25489, Syncephalastrum racemosum ATCC 18192, Thamnostylum piriforme ATCC 8992, Thielavia terricola ATCC 13807 und Verticillium theobromae ATCC 12474.

Weitere Organismen, von denen man erwarten kann, dass sie Wirksamkeit für die 11α- Hydroxylierung zeigen umfassen Cephalosphorium aphidicola (Phytochemistry (1996), 42(2), 411- 415), Cochliobolus lunatas (J. Biotechnol. (1995), 42(2), 145-150), Tieghemella orchidis (Khim.- Farm.ZH. (1986), 20(7), 871-876), Tieghemella hyalospora (Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7), 871-876), Monosporium olivaceum (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), Aspergillus ustus (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), Fusarium graminearum (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), Verticillium glaucum (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110) und Rhizopus nigricans (J. Steroid Biochem. (1987), 28(2), 197-201).

Die 11β-Hydroxyderivate von Androstendion und Mexrenon können hergestellt werden gemäß dem Bioumwandlungsverfahren, wie es in den Beispielen 19A und 19B dargelegt ist. Die Erfinder stellen die Hypothese auf durch Analogie, dass die entsprechenden β-Hydroxyisomeren der Verbindungen der Formel VIII mit einem C11 β-Hydroxysubstituenten anstelle eines C11 α- Hydroxysubstituenten ebenfalls hergestellt werden können unter Anwendung eines ähnlichen Bioumwandlungsverfahrens unter Verwendung geeigneter Microorganismen, die in der Lage sind, die 11β-Hydroxylierung durchzuführen, wie einer oder mehrere der hier offenbarten Mikroorganismen.

Zur Vorbereitung zur Fermentation in der Produktionsgrößenordnung zur Hydroxylierung von Canrenon oder anderen Substraten der Formel XIII wird ein Inoculum von Zellen hergestellt in einem Impffermentationssystem, umfassend einen Impffermenter oder eine Reihe von zwei oder mehreren Impffermentoren. Eine Arbeitsvorratssporensuspension wird in den ersten Impffermenter eingeführt zusammen mit einer Nährmittellösung für das Wachstum der Zellen. Wenn das Volumen an gewünschten oder erforderlichen Inoculum zur Produktion überschritten wird, das in dem ersten Impffermenter produziert wurde kann das Inoculumvolumen progressiv und geometrisch vergrößert werden durch Progression durch die verbleibenden Fermenter in dem Impffermentationszug. Vorzugsweise weist das im Impffermentationssystem produzierte Inoculum ausreichend Volumen auf und lebensfähige Zellen zur Erzielung einer schnellen Initiierung der Reaktion im Produktionsfermenter relativ zu kurzen Produktionszyklen und hoher Produktionsfermenteraktivität. Wie immer auch die Anzahl an Gefäßen ist, im Zuge von Impffermentern, der zweite und anschließende Impffermentoren besitzen vorzugsweise eine solche Größe, so dass das Ausmaß an Verdünnung bei jeder Stufe im Zug im wesentlichen das gleiche ist. Die ursprüngliche Verdünnung des Inoculums in jedem Impffermenter kann etwa die gleiche sein, wie die Verdünnung im Produktionsfermenter. Canrenon oder ein anderes Formel XIII Substrat wird in den Produktionsfermenter gegeben zusammen mit Inoculum und Nährlösung und die Hydroxylierungsreaktion dort durchgeführt werden.

Die Sporensuspension, die dem Impffermentationssystem zugeführt wird besteht aus einer Phiole von Arbeitsvorratssporensuspension, die von einer Vielzahl von Phiolen entnommen wird, die eine Arbeitsvorratszellbank darstellen, die unter cryogenen Bedingungen vor der Verwendung gelagert wird. Die Arbeitsvorratszellbank stammt ihrerseits von einer Mastervorratszellbank ab, die hergestellt wurde auf folgende Weise. Eine Sporenspezies, erhalten von einer geeigneten Quelle, z. B. ATCC wird zunächst suspendiert in einem wässrigen Medium wie beispielsweise Kochsalzlösung, Nährlösung oder einer Oberflächen-aktiven Lösung (z. B. einen nicht-ionischen Tensid wie Tween 20 in einer Konzentration von etwa 0,001 Gewichtsprozent) und die Suspension verteilt auf Kulturplatten, wobei jede Platte ein festes Nährmittelgemisch enthält, typischerweise auf der Basis eines nicht-digestiblen Polysaccharids wie Agar, worin die Sporen propagiert werden. Das feste Nährmittelgemisch enthält vorzugsweise zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Glucose, zwischen etwa 0,05% und etwa 5 Gewichtsprozent einer Stickstoffquelle, z. B. Pepton, zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent einer Phosphorquelle, z. B. ein Ammonium- oder Alkalimetallphosphat wie Dikaliumhydrogenphosphat, zwischen etwa 0,25% und etwa 2,5 Gewichtsprozent Hefelysat oder Extrakt (oder andere Aminosäurequellen wie Fleischextrakt oder Hirn-Herz-Infusion), z wischen etwa 1% und etwa 2 Gewichtsprozent Agar oder ein anderes nicht- digestibles Polysaccharid. Gegebenenfalls kann das feste Nährstoffgemisch weiterhin umfassen und/oder enthalten zwischen etwa 0,1% und 5 Gewichtsprozent Malzextrakt. Der pH Wert des festen Nährstoffgemischs ist vorzugsweise zwischen etwa 5,0 und etwa 7,0, der eingestellt wird wie erforderlich durch Alkalimetallhydroxid oder Orthophosphorsäure. Zu den geeigneten festen Wachstumsmedien gehören die folgenden:

1. Festes Medium #1: 1% Glucose, 0,25% Hefeextrakt, 0,3% K&sub2;HPO&sub4; und 2% Agar (Bacto); pH eingestellt auf 6,5 mit 20% NaOH.

2. Festes Medium #2: 2% Pepton (Bacto), 1% Hefeextrakt (Bacto), 2% Glucose und 2% Agar (Bacto); pH Wert eingestellt auf 5 mit 10% H&sub3;PO&sub4;.

3. Festes Medium #3: 0,1% Pepton (Bacto), 2% Malzextrakt (Bacto), 2% Glucose und 2% Agar (Bacto; pH so wie es ist 5,3.

4. Flüssiges Medium: 5% Blackstrap Melasse, 0,5% Maisquellflüssigkeit, 0,25% Glucose, 0,25% NaCl und 0,5% KH&sub2;PO&sub4;, pH eingestellt auf 5,8.

5. Difco Mycologischer Agar (niedriger pH Wert).

Die Anzahl an Agarplatten, die bei der Entwicklung einer Mastervorratszellbank verwendet werden kann ausgewählt werden im Hinblick auf weitere Forderungen für Mastervorräte, jedoch werden typischerweise etwa 15 bis etwa 30 Platten so hergestellt. Nach einer ausreichenden Wachstumsperiode, z. B. 7 bis 10 Tagen, werden die Platten abgeschabt in Gegenwart eines wässrigen Vehikels, typischerweise Kochsalzlösung oder Puffer zum Ernten der Sporen und die dabei erhaltene Mastervorratssuspension wird aufgeteilt auf kleine Phiolen, beispielsweise 1 ml in jede von einer Vielzahl von 1,5 ml Phiolen. Um die Arbeitsvorratssporensuspension zur Verwendung für die Forschung oder Produktionsfermentationsarbeiten herzustellen, können die Inhalte von einer oder mehreren dieser Mastervorratsphiolen der zweiten Generation verteilt werden und inkubiert werden auf Agarplatten auf diese Weise, wie sie vorstehend für die Herstellung der Mastervorratssporensuspension beschrieben wurde. Da, wo Routineherstellungsarbeiten vorgesehen sind, können so viele wie 100 bis 400 Platten verwendet werden, um den Arbeitsvorrat der zweiten Generation zu erzeugen. Jede Platte wird abgekratzt in eine getrennte Arbeitsvorratsphiole, wobei jede Phiole typischerweise einen ml des produzierten Inoculums enthält. Zur dauerhaften Konservierung werden sowohl die Mastervorratssuspension und das Inoculum der zweiten Generationsproduktion vorteilhafterweise im Dampfraum eines cryogenen Vorratsbehältnisses aufbewahrt, das flüssigen N&sub2; oder eine andere cryogene Flüssigkeit enthält.

In dem in Fig. 1 erläuterten Verfahren wird wässriges Wachstumsmedium hergestellt, das eine Stickstoffquelle wie Pepton enthält, ein Hefederivat oder Äquivalent, Glucose und eine Phosphorquelle wie Phosphatsalz enthält. Sporen des Microorganismus werden kultiviert in diesem Medium in dem Impffermentationssystem. Der bevorzugte Microorganismus ist Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). Der so hergestellte Impfvorrat wird dann in den Produktionsfermenter eingeführt zusammen mit dem Substrat der Formel XIII. Die Fermentationsbrühe wird gerührt und belüftet so lange, wie es ausreicht für die Reaktion, um bis zum gewünschten Grad der Beendigung fortzuschreiten.

Das Medium für den Impffermenter umfaßt vorzugsweise ein wässriges Gemisch, welches enthält: Zwischen etwa 0,5% und etwa 5% Gewichtsprozent Glucose, zwischen etwa 0,05% und etwa 5 Gewichtsprozent einer Stickstoffquelle, z. B. Pepton, zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent einer Phosphorquelle, z. B. ein Ammonium- oder Alkalimetallphosphat wie Ammoniumphosphat monobasisch oder Dikaliumhydrogenphosphat, zwischen etwa 0,25% und etwa 2,5 Gewichtsprozent Hefelysat oder -extrakt (oder eine andere Aminosäurequelle wie distiller's solubles), zwischen etwa 1% und etwa 2 Gewichtsprozent Agar oder nicht-digestible Polysaccharide. Ein besonders bevorzugtes Impfwachstumsmedium enthält etwa 0,05% und etwa 5 Gewichtsprozent einer Stickstoffquelle wie Pepton, zwischen etwa 0,25% und etwa 2,5 Gewichtsprozent autolysierte Hefe oder Hefeextrakt, zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Glucose und zwischen etwa 0,05 Gewichtsprozent und etwa 0,5 Gewichtsprozent einer Phosphorquelle wie Ammoniumphosphat monobasisch. Besonders wirtschaftliche Verfahrensarbeitsgänge werden erreicht durch die Verwendung einer anderen bevorzugten Impfkultur, die etwa zwischen 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Maisquellflüssigkeit enthält, zwischen etwa 0,25% und etwa 2,5% autolysierte Hefe oder Hefeextrakt, zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Glucose und etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent Ammoniumphosphat monobasisch. Maisquellflüssigkeit ist eine besonders wirtschaftliche Quelle für Proteine, Peptide, Carbohydrate, organische Säuren, Vitamine, Metallionen, Spurenelemente und Phosphate. Maischflüssigkeiten von anderen Getreiden können verwendet werden anstelle von oder zusätzlich zu Maisquellflüssigkeit. Der pH Wert des Mediums wird vorzugsweise eingestellt innerhalb des Bereichs von etwa 5,0 und etwa 7,0, z. B. durch Zugabe eines Alkalimetallhydroxids oder Orthophosphorsäure. Da, wo Maisquellflüssigkeit als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle dient, wird der pH Wert vorzugsweise innerhalb des Bereichts von etwa 6,2 bis etwa 6,8 eingestellt. Das Medium, das Pepton und Glucose umfaßt wird vorzugsweise auf einen pH Wert zwischen etwa 5,4 und etwa 6,2 eingestellt. Zu den geeigneten Wachstumsmedien zur Verwendung bei der Impffermentation gehören:

1. Medium #1: 2% Pepton, 2% autolysierte Hefe (oder Hefeextrakt) und 2% Glucose; pH eingestellt auf 5,8 mit 20% NaOH.

2. Medium #2: 3% Maisquellflüssigkeit, 1,5% Hefeextrakt, 0,3% Ammoniumphosphat monobasisch und 3% Glucose; pH eingestellt auf 6,5 mit 20% NaOH.

Sporen dieses Mikroorganismus werden eingeführt in dieses Medium aus einer Phiole, die typischerweise in etwa 10&sup9; Sporen je ml Suspension enthält. Optimale Produktivität von Impferzeugung wird realisiert, wo die Verdünnung mit Wachstumsmedium bei Beginn einer Impfkultur die Sporenpopulationsdichte nicht unter etwa 10&sup7; je ml reduziert. Vorzugsweise werden die Sporen im Impffermentationssystem kultiviert, bis das gepackte Mycelvolumen (PMV)- im Impffermenter mindestens etwa 20%, vorzugsweise etwa 35% bis etwa 45% ausmacht. Da der Zyklus im Impffermentationsgefäß (oder irgendein Gefäß der Vielzahl, das einen Impffermentationszug ausmacht) von der ursprünglichen Konzentration in diesem Gefäß abhängt, kann es wünschenswert sein zwei oder drei Impffermentationsstadien zu liefern, um den Gesamtprozess zu beschleunigen. Jedoch ist vorzuziehen, die Verwendung von wesentlich mehr als drei Impffermentern in Serie zu vermeiden, da die Aktivität gefährdet werden kann, wenn die Impffermentierung durch eine übermäßige Anzahl von Stadien geprägt wird. Die Impfkulturfermentation erfolgt unter Rühren bei einer Temperatur im Bereich von etwa 23º bis etwa 37ºC, vorzugsweise im Bereich von etwa 24º und etwa 28ºC.

Die Kultur vom Impffermentationssystem wird eingeführt in einen Produktionsfermenter zusammen mit einem Produktionswachstumsmedium. In einer Ausführungsform der Erfindung dient nicht steriles Canrenon oder ein anderes Substrat der Formel XIII als das Substrat für die Reaktion. Vorzugweise wird das Substrat dem Produktionsfermenter zugesetzt in Form einer 10% bis 30 Gewichtsprozent Schlemme im Wachstumsmedium. Um den für die 11α-Hydroxylierungsreaktion verfügbaren Oberflächenbereich zu vergrößern, wird die Teilchengröße des Formel XIII Substrats reduziert, indem man das Substrat durch einen off line micronizer führt, vor der Einführung in den Fermenter. Ein steriler Nährstoffbeschickungsvorrat, enthaltend Glucose und eine zweite sterile Nährstofflösung, enthaltend ein Hefederivat wie autolysierte Hefe (oder äquivalente Aminosäureformulierungen auf der Basis von alternativen Quellen wie distiller's solubles) werden ebenfalls getrennt eingeführt. Das Medium umfaßt ein wässriges Gemisch, enthaltend zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Glucose, zwischen etwa 0,05% und etwa 5 Gewichtsprozent einer Stickstoffquelle, z. B. Pepton, zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent einer Phosphorquelle, z. B. einem Ammonium- oder Akalimetallphosphat wie Dikaliumhydrogenphosphat, zwischen etwa 0,25% und etwa 2,5 Gewichtsprozent Hefelysat oder Extrakt (oder eine andere Aminosäurequelle wie distiller's solubles), zwischen etwa 1% und etwa 2 Gewichtsprozent Agar oder einem anderen nicht-digestierbaren Polysaccharid. Ein besonders bevorzugtes Produktionswachstumsmedium enthält etwa 0,05% und etwa 5 Gewichtsprozent einer Stickstoffquelle wie Pepton, zwischen etwa 0,25% und etwa 2,5 Gewichtsprozent autolysierte Hefe oder Hefeextrakt, zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Glucose und zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent einer Phosphorquelle wie Ammoniumphosphat monobasisch. Ein anderes bevorzugtes Produktionsmedium enthält zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Maisquellflüssigkeit, zwischen etwa 0,25% und etwa 2,5% autolysierte Hefe oder Hefeextrakt, zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Glucose und etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent Ammoniumphosphat monobasisch. Der pH Wert des Produktionsfermentationsmediums wird vorzugsweise eingestellt auf die vorstehend beschriebene Weise für das Impffermentationsmedium mit den gleichen bevorzugten Bereichen für den pH Wert von Medien auf der Basis von Pepton/Glucose bzw. Medien auf der Basis von Maisquellflüssigkeit. Geeignete Bioumwandlungswachstumsmedien werden im Nachstehenden aufgeführt:

1. Medium #1: 2% Pepton, 2% autolysierte Hefe (oder Hefeextrakt) und 2% Glucose; pH Wert eingestellt auf 5,8 mit 20% NaOH.

2. Medium #2: 1% Pepton, 1% autolysierte Hefe (oder Hefeextrakt) und 2% Glucose; pH Wert eingestellt auf 5,8 mit 20% NaOH.

3. Medium #3: 0,5% Pepton, 0,5% autolysierte Hefe (oder Hefeextrakt) und 0,5% Glucose; pH Wert eingestellt auf 5,8 mit 20% NaOH.

4. Medium #4: 3% Maisquellflüssigkeit, 1,5% Hefeextrakt, 0,3% Ammoniumphosphat monobasisch und 3% Glucose; pH Wert eingestellt auf 6,5 mit 20% NaOH.

5. Medium #5: 2,55% Maisquellflüssigkeit, 1,275% Hefeextrakt, 0,255% Ammoniumphosphat monobasisch und 3% Glucose; pH Wert eingestellt auf 6,5 mit 20% NaOH.

6. Medium #6: 2,1% Maisquellflüssigkeit, 1,05% Hefeextrakt, 0,21% Ammoniumphosphat monobasisch und 3% Glucose; pH Wert eingestellt auf 6,5 mit 20% NaOH.

Nicht-steriles Canrenon und sterile Nährlösungen werden kettenartig dem Produktionsferment dazugeführt in etwa fünf bis etwa zwanzig, vorzugsweise in etwa zehn bis etwa fünfzehn, vorzugsweise in in wesentlichen gleichen Portionen jeweils über den gesamten Produktionszyklus. Vorteilhafterweise wird das Substrat anfänglich eingeführt in einer Menge, die ausreicht, um eine Konzentration zu erzielen von etwa 0,1 Gewichtsprozent und etwa 3 Gewichtsprozent, vorzugsweise zwischen etwa 0,5% und etwa 2 Gewichtsprozent bevor der Inoculierung mit Impffermentationsbrühe, dann periodisch zugesetzt, zweckmäßigerweise alle 8 bis 24 Stunden, bis zu einer kumulativen Proportion von zwischen etwa 1% und etwa 8 Gewichtsprozent. Wo zusätzliches Substrat alle 8 Stunden zugesetzt wird, kann die Gesamtzugabe etwas niedriger sein, z. B. 0,25% bis 2,5 Gewichtsprozent als im Falle, wo das Substrat nur täglich zugesetzt wird. Im letzteren Falle kann die kumulative Canrenonzugabe im Bereich von 2% bis etwa 8 Gewichtsprozent betragen. Die zusätzliche Nährstoffgemischbeschickung während der Fermentationsreaktion ist vorzugsweise ein Konzentrat, beispielsweise ein Gemisch, enthaltend zwischen etwa 40% und etwa 60 Gewichtsprozent sterile Glucose und zwischen etwa 16% und etwa 32 Gewichtsprozent steriler Hefeextrakt oder eine andere sterile Quelle eines Hefederivates (oder einer anderen Aminosäurequelle). Da die Substratbeschickung zum Produktionsfermenter von Fig. 1 nicht-steril ist, werden periodisch Antibiotika der Fermentationsbrühe zugesetzt, um das Wachstum von unerwünschten Organismen zu kontrollieren. Antibiotika, wie Kanamycin, Tetracyclin und Cefalexin können zugesetzt werden, ohne das Wachstum und die Bioumwandlung zu beeinträchtigen. Vorzugsweise werden diese in die Fermentationsbrühe eingeführt in einer Konzentration von beispielsweise zwischen etwa 0,0004% und etwa 0,002% bezogen auf die Gesamtmenge der Brühe, enthaltend z. B. zwischen etwa 0,0002% und etwa 0,0006% Kanamixynsulfat, zwischen etwa 0,0002% und etwa 0,006% Tetracylin HCl und/oder zwischen etwa 0,001% und etwa 0,003% Cefalexin wiederum auf der Basis der Gesamtmenge der Brühe.

Typischerweise dauert der Produktionsfermentationszyklus in etwa 80-160 Stunden. Somit werden Portionen von jeweils der Formel XIII Substraten und Nährlösungen typischerweise zugesetzt etwa alle 2 bis 10 Stunden, vorzugsweise etwa alle 4 bis 6 Stunden. Vorteilhafterweise wird ein Schaumbremsmittel ebenfalls in das Impffermentationssystem und in den Produktionsfermenter eingeführt.

Vorzugsweise beträgt im Verfahren von Fig. 1 die Inoculumcharge zum Produktionsfermenter etwa 0,5% bis etwa 7%, bevorzugtererweise etwa 1% bis etwa 2% an Volumen bezogen auf das Gesamtgemisch im Fermenter und die Glucosekonzentration wird aufrechterhalten zwischen etwa 0,01% und etwa 1,0%, vorzugsweise zwischen etwa 0,025% und etwa 0,5%, bevorzugtererweise zwischen etwa 0,05% und etwa 0,25 Gewichtsprozent mit periodischen Zugaben, die vorzugsweise in Portionen erfolgen von etwa 0,05% bis etwa 0,25 Gewichtsprozent auf der Basis der Gesamtcharge. Die Fermentationstemperatur wird zweckmäßigerweise kontrolliert innerhalb eines Bereichs von etwa 20º bis etwa 37ºC, vorzugsweise etwa 24ºC bis etwa 28ºC, jedoch kann es wünschenswert sein, die Temperatur während der Reaktion herunterzufahren, z. B. in 2ºC Abständen, um das gepackte Mycelvolumen (PMV) unter etwa 60% zu halten, bevorzugtererweise unter etwa 50% und dadurch zu verhindern, dass die Viskosität der Fermentationsbrühe das zufriedenstellende Vermischen stört. Wenn das Biomassenwachstum über die Flüssigkeitsoberfläche hinaussteigt, kann das in der Biomasse zurückgebliebene Substrat über die Reaktioszone hinausgetragen werden und für die Hydroxylierungsreaktion nicht mehr verfügbar sein. Für die Produktivität ist es wünschenswert, ein- PMV Volumen zu erreichen im Bereich von 30 bis 50%, vorzugsweise 35% bis 45% innerhalb der ersten 24 Stunden der Fermentationsreaktion, jedoch werden danach die Konditionen vorzugsweise so gemanaged, um weiteres Wachstum innerhalb der vorstehend angegebenen Grenzen zu kontrollieren. Während der Reaktion wird der pH Wert des Fermentationsmediums kontrolliert zwischen etwa 5,0 und etwa 6,5, vorzugsweise zwischen etwa 5,2 und etwa 5,8 und der Fermenter wird gerührt mit einer Geschwindigkeit von zwischen etwa 400 und etwa 800 rpm. Eine gelöste Sauerstoffmenge von mindestens etwa 10% der Sättigung wird erreicht durch Belüftung der Masse bei zwischen etwa 0,2 und etwa 1,0 wm und Aufrechterhaltung des Drucks im oberen Zwischenraum des Fermenters bei zwischen etwa atmosphärischem Druck und etwa 1,0 bar gauge, am meisten bevorzugt bei etwa 0,7 bar gauge. Die Rührgeschwindigkeit kann ebenfalls erhöht werden, falls nötig, um Mindestspiegel an gelöstem Sauerstoff aufrechtzuerhalten. Vorteilhafterweise wird der gelöste Sauerstoff gut über etwa 10% gehalten, tatsächlich bei etwa 50%, um die Umwandlung des Substrats zu fördern. Die Aufrechterhaltung des pH Wertes im Bereich von 5,5 ± 0,2 ist ebenfalls optimal für die Bioumwandlung. Das Schäumen wird kontrolliert, falls erforderlich, durch Zugabe eines üblichen Schaumbremsmittels. Nachdem das gesamte Substrat zugegeben worden ist, wird die Reaktion vorzugsweise fortgesetzt bis das Molarverhältnis des Formel VIII Produktes zum verbleibenden, nicht umgesetzten Formel XIII Substrates mindestens etwa 9 zu 1 ist. Eine solche Umwandlung kann erzielt werden innerhalb des 80-160 Stunden Massezyklus wie vorstehend angegeben.

Es wurde gefunden, dass hohe Umwandlungen verbunden sind mit Dezimierung der ursprünglichen Nährstoffspiegel unter dem ursprünglichen Chargenspiegel und durch Kontrollieren der Belüftungsgeschwindigkeit und Rührgeschwindigkeit, um ein Herausspritzen des Substrats aus der flüssigen Brühe zu vermeiden. Im Verfahren von Fig. 1 wurde der Nährstoffspiegel dezimiert auf und dann gehalten bei nicht höher als etwa 60%, vorzugsweise etwa 50% des ursprünglichen Chargenspiegels, während in den Verfahren von Fig. 2 und 3 der Nährstoffspiegel reduziert wurde und gehalten wurde bei nicht höher als etwa 80%, vorzugsweise etwa 70% des ursprünglichen Chargenspiegels. Die Belüftungsgeschwindigkeit beträgt vorzugsweise nicht mehr als ein vvm, bevorzugtererweise im Bereich von etwa 0,5 vvm, während die Rührgeschwindigkeit vorzugsweise nicht höher als 600 rpm beträgt.

Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel VIII wird in Fig. 2 erläutert. Ein bevorzugter Microorganismus für die 11α-Hydroxylierung einer Verbindung der Formel XIII (beispielsweise Canrenon) ist Aspergillus ochraceus NRRI 405 (ATCC 18500). In diesem Verfahren umfaßt das Wachstumsmedium vorzugsweise zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Maisquellflüssigkeit, zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Glucose, zwischen etwa 0,1% und etwa 3 Gewichtsprozent Hefeextrakt und zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent Ammoniumphosphat. Jedoch können andere Produktionswachstumsmedien wie hier beschrieben ebenfalls verwendet werden. Die Impfkultur wird hergestellt im wesentlichen wie für das Verfahren von Fig. 1 beschrieben unter Verwendung von irgendeinem der hier beschriebenen Impffermentationsmedien. Eine Suspension von nicht-mikronisiertem Canrenon oder einem anderen Formel XIII Substrat im Wachstumsmedium wird aseptisch hergestellt in einem Mischer, vorzugsweise in relativ hoher Konzentration von zwischen etwa 10% und etwa 30 Gewichtsprozent Substrat.

Vorzugsweise kann die aseptische Herstellung Sterilisation oder Pasteurisierung der Suspension nach dem Mischen umfassen. Die Gesamtmenge an steriler Substratsuspension, die für eine Produktionsmasse erforderlich ist, wird in den Produktionsfermenter zu Beginn der Masse zugeführt oder durch periodische kettenartige Zufuhr. Die Teilchengröße des Substrats wird reduziert durch Naßvermahlen in einer on-line shear Pumpe, die die Schlemme dem Produktionsfermenter zuführt, wobei die Notwendigkeit der Verwendung eines off-line micronizers vermieden wird. Wo die aseptischen Bedingungen erzielt werden durch Pasteurisierung und nicht durch Sterilisierung, kann das Ausmaß an Agglomeration unwesentlich sein, jedoch die Verwendung einer Scher-Pumpe kann erwünscht sein, um eine positive Kontrolle der Teilchengröße sicherzustellen. Steriles Wachstumsmedium und Glucoselösung werden in den Produktionsfermenter eingeführt im wesentlichen auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben. Alle Beschickungskomponenten zum Produktionsfermenter werden sterilisiert vor der Einführung, so dass keine Antibiotika erforderlich sind.

Vorzugsweise wird bei der Arbeitsweise des Verfahrens von Fig. 2 das Inoculum in den Produktionsfermenter eingeführt in einer Proportion von zwischen etwa 0,5% und etwa 7%, die Fermentationstemperatur ist zwischen etwa 20º und etwa 37ºC, vorzugsweise zwischen etwa 24ºC und etwa 28ºC und der pH Wert wird kontrolliert zwischen etwa 4,4 und 6,5, vorzugsweise zwischen etwa 5,3 und etwa 5,5 beispielsweise durch Einführung von gasförmigem Ammoniak, wässrigem Ammoniumhydroxid, wässrigem Alkalimetallhydroxid- oder Orthophosphorsäure. Gemäß dem Verfahren von Fig. 1 wird die Temperatur vorzugsweise getrimmt, um das Wachstum der Biomasse zu kontrollieren, so dass PMV 55-60% nicht übersteigt. Die ursprüngliche Glucosebeschickung beträgt vorzugsweise zwischen etwa 1% und etwa 4 Gewichtsprozent, bevorzugtererweise 2,5% bis 3,5 Gewichtsprozent, jedoch wird vorzugsweise gestattet, dass sie unter etwa 1 Gewichtsprozent während der Fermentation abfällt. Zusätzliche Glucose wird periodisch zugeführt in Portionen von zwischen etwa 0,2% und etwa 1,0 Gewichtsprozent auf der Basis der Gesamtbeschickungscharge, um die Glucosekonzentration in der Fermentationszone innerhalb eines Bereichs zwischen etwa 0,1% und etwa 1,5 Gewichtsprozent, vorzugsweise zwischen etwa 0,25% und etwa 0,5 Gewichtsprozent aufrechtzuerhalten. Gegebenenfalls können Stickstoff- und Phosphorquellen zugesetzt werden zusammen mit der Glucose. Weil jedoch die gesamte Canrenoncharge zu Beginn des Beschickungszyklus hergestellt wird, kann der entsprechende Zusatz von Stickstoff- und Phosphor-haltigen Nährstoffen auch zu dem Zeitpunkt zugeführt werden, wodurch die Verwendung von nur einer Glucoselösung als Zusatz während der Reaktion gestattet wird. Die Geschwindigkeit und die Art des Rührens ist eine signifikante Variable. Mäßig heftiges Rühren fördert den Massentransfer zwischen dem festen Substrat und der wässrigen Phase. Jedoch sollte ein Impeller mit niedriger Scherkraft verwendet werden, um Abbau des Myelins des Mikroorganismus zu verhindern. Optimale Rührgeschwindigkeit schwankt innerhalb des Bereichs von 200 bis 800 rpm in Abhängigkeit von der Viskosität der Kulturbrühe, der Sauerstoffkonzentration und der Mischbedingungen, wie sie beeinflußt werden durch Konfiguration des Gefäßes, Prallblech und Impeller. Gewöhnlich liegt eine bevorzugte Rührgeschwindigkeit im Bereich von 350-600 rpm. Vorzugsweise weist der Rührimpeller eine nach unten gehende axiale Pumpfunktion auf, die zum guten Vermischen der fermentierten Biomasse beiträgt. Die Beschickung wird vorzugsweise belüftet mit einer Geschwindigkeit zwischen etwa 0,3 und etwa 1,0 vvm, vorzugsweise 0,4 bis 0,8 vvm und der Druck im oberen Zwischenraum des Fermenters beträgt vorzugsweise zwischen etwa 0,5 und etw 1,0 bar gauge. Temperatur, Rühren, Lüften und Rückdruck werden vorzugsweise kontrolliert, um den gelösten Sauerstoff im Bereich von mindestens etwa 10 Volumen-% während der Bioumwandlung aufrechtzuerhalten. Der gesamte Beschickungszyklus beträgt typischerweise zwischen etwa 100 und etwa 140 Stunden.

Obgleich das Prinzip der Arbeitsweise für das Verfahren von Fig. 2 auf einer frühen Einführung von im Wesentlichen der gesamten Canrenoncharge basiert, muß verstanden werden, dass das Wachstum der Fermentationsbrühe erfolgen kann, bevor die Gesamtmasse des Canrenons zugeführt wird. Gegebenenfalls kann ein Teil der Portion von Canrenon auch später der Beschickung zugesetzt werden. Im Allgemeinen jedoch sollten mindestens etwa 75% der sterilen Canrenoncharge in den Transformationsfermenter binnen 48 Stunden nach Initiierung der Fermentation zugesetzt werden. Außerdem ist es wünschenswert, mindestens etwa 25 Gewichtsprozent Canrenon beim Beginn der Fermentation zuzusetzen oder mindestens innerhalb der ersten 24 Stunden, um die Erzeugung des Bioumwandlungsenzyms oder -enzyme zu beschleunigen.

In einem weiteren bevorzugten Verfahren, wie in Fig. 3 erläutert, werden die gesamte Beschickungscharge und Nährlösung sterilisiert im Produktionsfermenfationsgefäß vor der Einführung des Inoculums. Die Nährlösungen, die verwendet werden können als auch die bevorzugten davon sind im Wesentlichen die gleichen wie im Verfahren von Fig. 2. In dieser Ausführungsform der Erfindung zerbricht die Scherwirkung des Rührimpellers die Substratagglomerate, die andernfalls dazu neigen, sich bei der Sterilisation zu bilden. Es wurde gefunden, dass die Reaktion zufriedenstellend verläuft, wenn die mittlere Teilchengröße von Canrenon weniger als etwa 300 u ist und mindestens 75 Gewichtsprozent der Teilchen kleiner als 240 u sind. Die Verwendung eines geeigneten Impellers, z. B. eines Scheibenturbinenimpellers bei einer adäquaten Geschwindigkeit im Bereich von 200 bis 800 rpm mit einer Spitzengeschwindigkeit von mindestens etwa 400 cm/Sekunde erwies sich dahingehend, dass eine Schergeschwindigkeit geschaffen wird, die ausreicht, um solche Teilchengrößencharakteristiken beizubehalten, trotz der Agglomeration, die dazu tendiert, bei der Sterilisation innerhalb des Produktionsfermenters aufzutreten. Die restliche Arbeitsweise des Verfahrens von Fig. 3 ist im wesentlichen die Gleiche wie das Verfahren von Fig. 2. Die Verfahren der Fig. 2 und 3 bieten einige wichtige Vorteile gegenüber dem Verfahren von Fig. 1. Ein besonderer Vorteil ist die Zugänglichkeit zur Verwendung einer preiswerten Nährbasis, wie Maisquellflüssigkeit. Weitere Vorteile werden jedoch erzielt durch die Vermeidung der Notwendigkeit von Antibiotika, wobei das Beschickungsverfahren vereinfacht wird und wodurch eine Beschickungssterilisierung von Canrenon oder anderen Formel XIII Substraten möglich ist. Ein anderer besonderer Vorteil ist die Fähigkeit eine einfache Glucoselösung zu verwenden anstelle einer komplexen Nährlösung als Zusatz während des Reaktionszyklus.

In den in den Fig. 1 und 3 gezeigten Verfahren ist das Produkt der Formel VIII ein kristalliner Feststoff, der zusammen mit der Biomasse abgetrennt werden kann von der Reaktionsbrühe durch Filtration oder Niedriggeschwindigkeitszentrifugierung. Wahlweise kann das Produkt extrahiert werden aus der gesamenten Reaktionsbrühe mit organischen Lösungsmitteln. Das Produkt der Formel VIII wird gewonnen durch Lösungsmittelextraktion. Für maximale Gewinnung werden sowohl das Flüssigphasenfiltrat und der Biomassenfilter- oder Zentrifugenkuchen behandelt mit Extraktionslösungsmittel, jedoch sind gewöhnlich ≥95% des Produktes mit der Biomasse verbunden. Typischerweise können Kohlenwasserstoffester, chlorierter Kohlenwasserstoff und Ketonlösungsmittel für die Extraktion verwendet werden. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist Ethylacetat. Andere typische geeignete Lösungsmittel umfassen Toluol und Methylisobutylketon. Für die Extraktion von der flüssigen Phase kann es zweckmäßig sein, ein Volumen des Lösungsmittels zu verwenden, das etwa gleich dem Volumen der Reaktionslösung ist, mit welchem er in Kontakt steht. Um das Produkt von der Biomasse zu gewinnen wird letzteres suspendiert im Lösungsmittel, vorzugsweise in großem Überschuss relativ zur ursprünglichen Charge des Substrats, z. B. 50 bis 100 ml Lösungsmittel je Gramm ursprünglicher Canrenoncharge und die dabei entstehende Suspension vorzugsweise unter Rückfluß gehalten werden für eine Zeitspanne von etwa 20 Minuten bis mehrere Stunden, um den Transfer des Produktes zur Lösungsmittelphase von Vertiefungen und Poren der Biomasse sicherzustellen. Danach wird die Biomasse durch Filtration oder Zentrifugierung entfernt und der Filterkuchen vorzugsweise gewaschen mit frischem Lösungsmittel und entionisiertem Wasser. Wässrige und Lösungsmittelwaschungen werden dann vereinigt und die Phasen getrennt. Formel VIII Produkt wird gewonnen durch Kristallisierung aus dem Lösungsmittel. Um die Ausbeute zu maximieren, wird das Mycel zweimal kontaktiert mit frischem Lösungsmittel. Nach dem Absetzen, um die vollständige Abtrennung der wässrigen Phase zu gestatten, wird das Produkt von der Lösungsmittelphase gewonnen. Am meisten bevorzugt wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt bis die Kristallisierung beginnt, dann wird der konzentrierte Extrakt gekühlt auf eine Temperatur von etwa 0ºC bis eta 20ºC, vorzugsweise etwa 10º bis etwa 15ºC für eine Zeit, die ausreicht für die Kristallausfällung und das Wachstum, typischerweise etwa 8 bis etwa 12 Stunden.

Die Verfahren von Fig. 2 und insbesondere das von Fig. 3 sind besonders bevorzugt. Diese Verfahren arbeiten bei niedriger Viskosität und ermöglichen eine enge Kontrolle der Verfahrensparameter wie pH Wert, Temperatur und gelöstem Sauerstoff. Außerdem werden sterile Bedingungen leicht beibehalten ohne dass man auf Antibiotika zurückgreifen muß.

Das Bioumwandlungsverfahren ist exotherm, so dass Hitze entfernt werden sollte, wobei ein ummantelter Fermenter oder eine Kühlschlange verwendet werden sollte, innerhalb des Produktionsfermenters. Wahlweise kann die Reaktionsbrühe zirkuliert werden durch einen äußeren Wärmeaustauscher. Gelöster Sauerstoff wird vorzugsweise aufrechterhalten in einer Menge von mindestens etwa 5%, vorzugsweise mindestens etwa 10 Gewichtsprozent, was ausreicht, um Energie für die Reaktion zu liefern und die Umwandlung der Glucose zu CO&sub2; und H&sub2;O sicherzustellen durch Regulierung der Luftgeschwindigkeit, die in den Reaktor eingeführt wird in Folge der Messung des Sauerstoffpotentials in der Brühe. Der pH Wert wird vorzugsweise kontrolliert bei zwischen etwa 4,5 und etwa 6,5.

In jedem der alternativen Verfahren für die 11-Hydroxylierung des Substrats der Formel XIII ist die Produktivität begrenzt durch Massentransfer von dem festen Substrat zur wässrigen Phase oder der Phasengrenzschicht, wo eine Reaktion stattfindet. Wie vorstehend angezeigt ist die Produktivität nicht wesentlich begrenzt durch Massentransfergeschwindigkeit solange die durchschnittliche Teilchengröße des Substrats reduziert ist auf weniger als etwa 300 u und mindestens 75 Gewichtsprozent der Teilchen kleiner sind als 240 u. Jedoch kann die Produktivität dieser Verfahren weiter erhöht werden in gewissen alternativen Ausführungsformen, die eine wesentliche Charge von Canrenon oder einem anderen Formel XIII Substrat für den Produktionsfermenter in einem organischen Lösungsmittel liefern. Gemäß einer Option wird das Substrat in einem Wasser nicht-mischbaren Lösungsmittel gelöst und vermischt mit dem wässrigen Wachstumsmedium Inoculum und einem Oberflächen-aktiven Mittel. Geeignete Wasser nicht- mischbare Lösungsmittel umfassen beispielsweise DMF, DMSO, C&sub6;-C&sub1;&sub2; Fettsäuren, C&sub6;-C&sub1;&sub2; n- Alkane, pflanzliche Öle, Sorbitane und wässrige Oberflächen-aktive Lösungen. Das Rühren dieser Charge erzeugt ein Emulsionsreaktionssystem, das einen ausgedehnteren Grenzflächenbereich aufweist, für den Massentransfer von Substrat aus der organischen flüssigen Phase zu den Reaktionsstellen.

Eine zweite Option ist diejenige, ursprünglich das Substrat in einem Wasser mischbaren Lösungsmittel zu lösen wie Aceton, Methylethylketon, Methanol, Ethanol oder Glycerin in einer Konzentration, die im Wesentlichen größer ist als dessen Löslichkeit in Wasser. Durch Herstellung der usprünglichen Substratlösung bei erhöhter Temperatur wird die Löslichkeit erhöht, wobei die Menge der Lösung vom Substrat weiter erhöht wird, die in den Reaktor eingeführt wird und schließlich die Reaktornutzlast erhöht wird. Die warme Substratlösung wird in den Produktionsfermentationsreaktor geschickt zusammen mit der relativ kühlen wässrigen Charge, die das Wachstumsmedium und das Inoculum enthält. Wenn die Substratlösung vermischt wird mit dem wässrigen Medium erfolgt Ausfällung des Substrats. Jedoch unter Bedingungen von wesentlicher Übersättigung und mäßig heftigem Rühren wird die Kernbildung favorisiert gegenüber dem Kristallwachstum und sehr feine Teilehen mit hohem Oberflächenbereich bilden sich. Der hohe Oberflächenbereich fördert den Massentransfer zwischen der flüssigen Phase und dem festen Substrat. Außerdem wird die Gleichgewichtskonzentration des Substrats in der wässrigen flüssigen Phase ebenfalls erhöht in Gegenwart eines Wasser mischbaren Lösungsmittels. Demgemäß wird die Produktivität gefördert.

Obgleich der Mikroorganismus nicht unbedingt eine hohe Konzentration eines organischen Lösungsmittels in der wässrigen Phase tolerieren kann, kann eine Konzentration von Ethanol z. B. im Bereich von etwa 3% bis etwa 5 Gewichtsprozent vorteilhafterweise verwendet werden.

Eine dritte Option ist, das Substrat in einer wässrigen Cyclodextrinlösung zu solubilisieren. Beispiele für Cyclodextrine umfassen Hydroxypropyl-β-cyclodextrin und Methyl-β-cyclodextrin. Das Molarverhältnis von Substrat zu Cyclodextrin kann etwa 1 : 0,5 bis etwa 1 : 1,5 sein, bevorzugtererweise etwa 1 : 0,8 bis etwa 1 : 1. Das Substrat : Cyclodextringemisch kann dann aseptisch dem Bioumwandlungsreaktor zugesetzt werden.

11α-Hydroxycanrenon und andere Produkte des 11α-Hydroxylierungsverfahrens (Formel VIII und VIIIA) sind neue Verbindungen, die isoliert werden können durch Filtrierung des Reaktionsmediums und Extrahierung des Produktes von der Biomasse, die vom Filtrationsmedium gesammelt wurde. Übliche organische Lösungsmittel, beispielsweise Ethylacetat, Aceton, Toluol, chlorierte Kohlenwasserstoffe und Methylisobutylketon können für die Extraktion verwendet werden. Das Produkt der Formel VIII kann dann umkristallisiert werden aus einem organischen Lösungsmittel des gleichen Typs. Die Verbindungen der Formel VIII haben wesentlichen Wert als Zwischenprodukte zur Herstellung von Verbindungen der Formel I und insbesondere von Formel IA.

Vorzugsweise können die Verbindungen der Formel VIII der Formel VIIIA entsprechen, worin -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind, R³ Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy ist und R&sup8; und R&sup9; zusammen den 20-Spiroxanring bilden:

Außerdem gemäß dem Verfahren des Schemas 1 wird die Verbindung der Formel VIII umgesetzt unter alkalischen Bedingungen mit einer Quelle von Cyanidionen, um eine Enaminverbindung der Formel VII

zu produzieren, worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; vorstehende Bedeutung haben. Wo das Substrat der Formel VIIIA entspricht, hat das Produkt die Formel VIIA

worin -A-A-, -B-B-, R³, Y¹, Y² und X die in Formel XIIIA definierte Bedeutung haben. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

Cyanidierung des 11α-Hydroxylsubstrats der Formel VIII kann erfolgen durch Umsetzung mit einer Cyanidionenquelle wie einem Ketoncyanohydrin, am meisten bevorzugt Acetoncyanohydrin in Gegenwart einer Base und einem Alkalimetallsalz, am meisten bevorzugt LiCl. Wahlweise kann die Cyanidierung erfolgen ohne ein Cyanohydrin durch Verwendung eines Alkalimetallcyanids in Gegenwart einer Säure.

In dem Keton-Cyanohydrinverfahren erfolgt die Reaktion in Lösung, vorzugsweise unter Verwendung eines aprotischen polaren Lösungsmittels wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Die Bildung des Enamins erfordert mindestens zwei Mol der Cyanidionenquelle je Mol Substrat und vorzugsweise wird ein geringer Überschuss der Cyanidquellen verwendet. Die Base ist vorzugsweise eine Stickstoff-haltige Base wie ein Dialkylamin, Trialkylamin, Alkanolamin, Pyridin oder dergleichen. Jedoch können ebenfalls anorganische Basen wie Alkalimetallcarbonate oder Alkalimetallhydroxide verwendet werden. Vorzugsweise liegt das Substrat der Formel VIII ursprünglich in einem Verhältnis von zwischen etwa 20 und etwa 50 Gewichtsprozent vor und die Base liegt in einem Verhältnis von zwischen 0,5 bis zwei Äquivalenten je Äquivalent des Substrates vor. Die Temperatur der Reaktion ist nicht kritisch, jedoch wird die Produktivität erhöht durch Arbeiten bei erhöhten Temperaturen. Somit wird, wo Triethylamin als die Base verwendet wird, die Reaktion vorteilhafterweise im Bereich von etwa 80ºC bis etwa 90ºC durchgeführt. Bei solchen Temperaturen verläuft die Reaktion bis zur Beendung in etwa 5 bis etwa 20 Stunden. Wenn Diisopropylethylamin als Base verwendet wird und die Reaktion bei 105ºC durchgeführt wird, ist die Reaktion in 8 Stunden beendet. Am Ende der Reaktionsperiode wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und das rückständige Öl gelöst in Wasser und neutralisiert auf pH 7 mit verdünnter Säure, vorzugsweise Salzsäure. Das Produkt fällt aus dieser Lösung aus und wird danach gewaschen mit destilliertem Wasser und luftgetrocknet. Freigesetztes HCN kann abgestrippt werden mit einem inerten Gas und abgeschreckt werden in einer alkalischen Lösung. Der getrocknete Niederschlag wird in Chloroform oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel aufgenommen, dann extrahiert mit konzentrierter Säure, z. B. 6 N HCl. Der Extrakt wird neutralisiert auf pH 7 durch Zugabe einer anorganischen Base, vorzugsweise einem Alkalimetallhydroxid und auf eine Temperatur im Bereich von 0ºC gekühlt. Der dabei entstehende Niederschlag wird gewaschen und getrocknet, dann umkristallisiert aus einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Aceton, um ein Produkt der Formel VII zu produzieren, das zur Verwendung in der nächsten Verfahrensstufe geeignet ist.

Wahlweise kann die Reaktion erfolgen in einem wässrigen Lösungsmittelsystem, umfassend Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wie Methanol oder in einem biphasischen System, umfassend Wasser und ein organisches Lösungsmittel wie Ethylacetat. Bei dieser Alternative kann das Produkt gewonnen werden durch Verdünnung der Reaktionslösung mit Wasser und danach Extrahieren des Produktes unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wie Methylenchlorid oder Chloroform und dann zurückextrahieren von dem organischen Extrakt unter Verwendung von konzentrierter Mineralsäure, z. B. 2 N HCl. Siehe U.S. Patent 3,200,113.

Gemäß einer noch weiteren Alternative kann die Reaktion erfolgen in einem Wassermischbaren Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, n-Methyl, Pyrolidon oder Dimethylsulfoxid, wonach die Reaktionsproduktlösung verdünnt wird mit Wasser und alkalisch gemacht wird, z. B. durch Zugabe eines Alkalimetallcarbonats, dann auf 0º bis 10ºC gekühlt wird, wobei das Produkt ausfällt. Vorzugsweise wird das System abgeschreckt mit einem Alkalimetallhypohalit oder anderem Reagenz, das wirksam ist, um die Entwicklung von Cyanid zu verhindern. Nach Filtration und Waschen mit Wasser ist das ausgefallene Produkt geeignet zur Verwendung in der nächsten Verfahrensstufe.

Gemäß einer noch weiteren Alternative kann das Enaminprodukt der Formel VII hergestellt werden durch Reaktion eines Substrats der Formel VIII in Gegenwart einer Protonenquelle mit einem Überschuss an Alkalimetallcyanid, vorzugsweise NaCN in einem wässrigen Lösungsmittel, umfassend ein aprotisches Wasser mischbares polares Lösungsmittel wie Dimethylformamid oder Dimethylacetamid. Die Protonenquelle ist vorzugsweise eine Mineralsäure oder C&sub1; bis C&sub5; Carbonsäure, wobei Schwefelsäure besonders bevorzugt wird. Anormalerweise braucht keine extra Protonenquelle zugesetzt werden, wo das Cyanidierungsreagenz im Handel erhältliches LiCN oder DMF ist.

Eine Quelle des Cyanidions wie ein Aklalimetallsalz wird vorzugsweise in den Reaktor gegeben in einem Verhältnis von z wischen etwa 2,05 bis etwa 5 Molar Äquivalenten je Äquivalent des Substrats. Die Mineralsäure oder eine andere Protonenquelle kann wahrscheinlich die Anlagerung von HCN über die 4,5 und 6,7 Doppelbindungen fördern und liegt vorzugsweise in einem Verhältnis von mindestens einem Mol Äquivalent je Mol Äquivalent Substrat vor; jedoch sollte das Reaktionssystem basisch bleiben durch Aufrechterhaltung eines Überschusses an Alkalimetallcyanid über der vorliegenden Säure. Die Reaktion erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens etwa 75ºC, typischerweise 60ºC bis 100ºC für einen Zeitabschnitt von etwa einer bis etwa 8 Stunden, vorzugsweise etwa 1,5 bis etwa 3 Stunden. Am Ende der Reaktionsperiode wird das Reaktionsgemisch gekühlt, vorzugsweise auf etwa Raumtemperatur und das Produkt Enamin wird ausgefällt durch Ansäuerung des Reaktionsgemischs und Vermischen desselben mit kaltem Wasser, vorzugsweise bei etwa Eisbadtemperatur. Man glaubt, dass Ansäuern das 17-Lacton schließt, was dazu tendiert, unter den basischen Bedingungen sich zu öffnen, wobei die Cyanidierung die Oberhand hat. Das Reaktionsgemisch wird zweckmäßigerweise angesäuert unter Verwendung der gleichen Säure, die während der Reaktion vorliegt, vorzugsweise Schwefelsäure. Wasser wird vorzugsweise zugesetzt in einem Verhältnis von zwischen etwa 10 und etwa 50 Mol Äquivalenten je Mol des Produktes.

Die Verbindungen der Formel VII sind neue Verbindungen und haben wesentlichen Wert als Zwischenprodukte für die Herstellung der Verbindung der Formel I und insbesondere der Formel IA. Vorzugsweise entsprechen die Verbindungen der Formel VII der Formel VIIA, worin -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2; sind, R³ Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy ist und R&sup8; und R&sup9; zusammen den 20- Spiroxanring formen:

Am meisten bevorzugt ist die Verbindung der Formel VII 5'R(5'α),7β-20'-Aminohexadecahydro-11'β-hydroxy-10'α,13'α-dimethyl-3',5-dioxospiro[furan- 2(3H),17'α(5'H)-[7,4]metheno[4H]cyclopenta[a]phenanthren]-5'-carbonitril.

Bei der Umwandlung der Verbindung der Formel VIII zum Enamin der Formel VII wurde das 7-Cyanoderivat der Verbindung der Formel VIII durch Chromatographie im Rohprodukt beobachtet. Es wird angenommen, dass die 7-Cyanoverbindung ein Zwischenprodukt im Umwandlungsverfahren ist. Es wird ferner angenommen, dass das 7-Cyanozwischenprodukt selbst reagiert unter Bildung eines zweiten Zwischenproduktes, dem 5,7-Dicyanoderivat der Verbindung der Formel VIII, das seinerseits reagiert unter Bildung des Enesters. Siehe beispielsweise R. Christiansen et al., The Reaction of Steroidal 4,6-Dien-3-Ones With Cyanid, Steroids, Band 1, Juni 1963, welches durch Bezugnahme hier enthalten ist. Die neuen Verbindungen besitzen außerdem Brauchbarkeit als chromatographische Marker als auch als synthetische Zwischenprodukte. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Stufe des Gesamtschema 1 Syntheseverfahrens sind diese Zwischenprodukte 7α-Cyano-11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-21-dicarbonsäure, γ-Lacton und 5β,7α- dicyano-11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregnan-21-dicarbonsäure, γ-Lacton.

In der nächsten Stufe der Schema 1 Synthese wird das Enamin der Formel VII hydrolisiert unter Bildung einer Diketonverbindung der Formel VI

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII definierte Bedeutung haben. Irgendeine wässrige organische oder Mineralsäure kann verwendet werden für die Hydrolyse. Salzsäure wird bevorzugt. Um die Produktivität zu erhöhen, wird ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wie Dimethylacetamid oder ein niederer Alkanol, vorzugsweise als co-Lösungsmittel verwendet. Bevorzugtererweise ist Dimethylacetamid das Lösungsmittel. Die Säure sollte vorliegen im Verhältnis von mindestens einem Äquivalent je Äquivalent des Formel VII Substrats. In einem wässrigen System kann das Enaminsubstrat VII im Wesentlichen umgewandelt werden zum Diketon der Formel VI in einem Zeitabschnitt von etwa 5 Stunden bei etwa 80ºC. Das Arbeiten bei erhöhten Temperaturen erhöht die Produktivität, jedoch ist die Temperatur nicht kritisch. Geeignete Temperaturen werden ausgewählt auf der Basis der Flüchtigkeit des Lösungsmittelsystems und der Säure.

Vorzugsweise entspricht das Enaminsubstrat der Formel VII der Formel VIIA

und das Diketonprodukt entspricht der Formel VIA

wobei in jeder -AA-, -B-B-, R³, Y¹, Y² und X die Definition in Formel XIIIA haben. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

Am Ende der Reaktionsperiode wird die Lösung gekühlt auf zwischen etwa 0º bis 25ºC, um das Produkt auszukristallisieren. Die Produktkristalle können umkristallisiert werden aus einem geeigneten Lösungsmittel wie Isopropanol oder Methanol, um ein Produkt der Formel VI herzustellen, das zur Verwendung in der nächsten Verfahrensstufe geeignet ist; jedoch Umkristallisation ist gewöhnlich nicht erforderlich. Die Produkte der Formel VI sind neue Verbindungen, die im Wesentlichen Wert als Zwischenprodukte für die Herstellung der Verbindungen der Formel I aufweisen und insbesondere der Formel IA. Vorzugsweise entsprechen die Verbindungen der Formel VI der Formel VIA, worin -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2; sind, R³ Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy ist und R&sup8; und R&sup9; zusammen den 20-Spiroxanring bilden;

Die am meisten bevorzugte Verbindung der Formel VI ist 4'S(4'α),7'α-Hexadecahydro-11'α-hydroxy-10'β,13'β-dimethyl-3',5,20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β- [4,7]methano[17H]cyclopenta[a]phenanthren]-5'β(2'H)-carbonitril.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Produkt Enamin der Formel VII hergestellt aus der Verbindung der Formel VIII auf die vorstehend beschriebene Weise und in situ umgewandelt zum Diketon der Formel VI. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Formel VIII Substrat umgesetzt mit einem Überschuss eines Alkalimetallcyanids in einem wässrigen Lösungsmittel, enthaltend eins Protonenquelle oder wahlweise einen Überschuss an Ketoncyanohydrin in Gegenwart einer Base und LiCl wie vorstehend beschrieben. Jedoch anstelle des Kühlens des Reaktionsgemischs, des Ansäuerns und Zusetzen von Wasser in den berechneten Proportionen, um die Ausfällung des Enamins zu verursachen, wird wesentliches Kühlen des Reaktionsgemischs vorzugsweise vermieden. Wasser und Säure, vorzugsweise eine Mineralsäure wie Schwefelsäure werden anstelle dessen dem Gemisch am Ende der Cyanidierungsreaktion zugesetzt. Das Verhältnis von zugesetzter Säure ist ausreichend, um überschüssiges Alkalimetallcyanid zu neutralisieren, was gewöhnlich die Zugabe von mindestens einem Molar Äquivalent Säure je Mol des Formel VIII Substrats erfordert, vorzugsweise zwischen etwa 2 und etwa 5 Mol Aquivalente je Äquivalent Substrat. Jedoch wird die Temperatur hoch genug gehalten und die Verdünnung groß genug, so dass wesentliches Ausfällen vermieden wird und Hydrolyse des Enamins zum Diketon in der flüssigen Phase fortschreiten darf. Somit erfolgt das Verfahren mit minimaler Unterbrechung und hoher Produktivität. Die Hydrolyse erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 80ºC, bevorzugtererweise im Bereich von etwa 90ºC bis etwa 100ºC für eine Zeitspanne von typischerweise etwa 1 bis etwa 10 Stunden, bevorzugterweise etwa 2 bis etwa 5 Stunden. Dann wird das Reaktionsgemisch gekühlt, vorzugsweise auf eine Temperatur von etwa 0ºC und etwa 15ºC, vorteilhafterweise in einem Eisbad auf etwa 5ºC bis etwa 10ºC zur Ausfällung des Produktdiketons der Formel VI. Das feste Produkt kann gewonnen werden wie durch Filtration und Verunreinigungen durch Waschen mit Wasser reduziert werden.

In der nächsten Stufe der Schema 1 Synthese wird die Diketonverbindung der Formel VI umgesetzt mit einem Metallalkoxid, um die Ketonbrücke zwischen der 4 und 7 Position zu öffnen durch Spaltung der Bindung zwischen der Carbonylgruppe und dem 4-Kohlenstoff, Bildung eines αorientierten Alkoxycarbonylsubstituenten in der 7 Position und Entfernung des Cyanids am 5- Kohlenstoffatom. Das Produkt dieser Umsetzung ist eine Hydroxyesterverbindung entsprechend der Formel V

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII definierte Bedeutung haben und R¹ ein Niederalkoxycarbonyl oder Hydroxycarbonyl ist. Das Metallalkoxid, das in der nächsten Umsetzung verwendet wird, entspricht der Formel R¹&sup0;OM, worin M Alkalimetall ist und R¹&sup0;O- dem Alkoxysubstituenten von R¹ entspricht. Ausbeuten dieser Reaktion sind am zufriedenstellendsten, wenn das Metallalkoxid Kaliummethoxid oder Natriummethoxid ist, jedoch andere Niederalkoxide können verwendet werden. Ein Kaliumalkoxid wird besonders bevorzugt. Phenoxide und andere Aryloxide können ebenfalls verwendet werden als auch Arylsulfide. Die Reaktion erfolgt zweckmäßigerweise in Gegenwart eines Alkohols entsprechend der Formel R¹&sup0;OH, worin R¹&sup0; vorstehende Bedeutung hat. Andere übliche Lösungsmittel können verwendet werden. Vorzugsweise liegt das Formel VI Substrat in einem Verhältnis vor von zwischen etwa 2% und etwa 12 Gewichtsprozent, bevorzugtererweise mindestens etwa 6 Gewichtsprozent. Vorzugsweise liegt R¹&sup0;OM in einem Verhältnis vor von zwischen etwa 0,5 und etwa 4 Mol je Mol des Substrates, bevorzugtererweise zwischen etwa 1 und etwa 2 Mol je Mol des Substrates und noch bevorzugtererweise etwa 1,6 Mol je Mol des Substrates.

Die Temperatur ist nicht kritisch, jedoch steigern erhöhte Temperaturen die Produktivität. Die Reaktionszeit ist typischerweise zwischen 4 und etwa 24 Stunden, vorzugsweise etwa 4 bis 16 Stunden. Zweckmäßigerweise erfolgt die Reaktion bei atmosphärischen Rückflußtemperaturen in Abhängigkeit vom verwendeten Lösungsmittel.

Die für die Reaktion erforderliche Zeit, um Gleichgewicht zu erreichen, wird beeinflußt durch die Menge an Alkoxid, das dem Reaktionsgemisch zugesetzt wurde und der Art, in der die Alkoxide zugesetzt wurden. Das Alkoxid kann zugesetzt werden in einer einmaligen Portion oder in mehreren Portionen oder es kann kontinuierlich zugesetzt werden. Wenn Alkoxid in mehreren Portionen zugesetzt wird, ist vorzuziehen, dass etwa 1,6 Äquivalente Kaliummethoxid in zwei Stufen zugesetzt werden. In dieser Zwei-Stufen-Zugabe wird 1 Äquivalent Kaliummethoxid ursprünglich zum Reaktionsgemisch zugesetzt, gefolgt durch die Zugabe von 0,6 Äquivalenten Kaliummethoxid etwa 90 Minuten später. Diese Zwei-Stufen-Zugabe verkürzt die Zeit, um ein Gleichgewicht zu erreichen relativ zu einer einzigen Portionszugabe von 1,6 Äquivalenten Kaliummethoxid.

Weil das Gleichgewicht günstiger ist für die Produktion von Hydroxyester bei niedrigen Konzentrationen des Diketons, erfolgt die Reaktion bei ziemlich hoher Verdünnung, d. h. so hoch wie 40 : 1 für die Reaktion mit Natriummethoxid. Man fand, dass wesentlich höhere Produktivität realisiert werden kann durch die Verwendung von Kaliummethoxid anstelle von Natriummethoxid, weil eine Verdünnung im Bereich von etwa 20 : 1 im allgemeinen genügt, um das Ausmaß an Umkehrcyanidierung zu minieren, wo Kaliummethoxid das Reagenz ist.

Gemäß der Erfindung wurde weiterhin entdeckt, dass die Umkehrcyanidierungsreaktion verhindert werden kann durch geeignete chemische oder physikalische Maßnahmen, um Nebenprodukt-Cyanidion von der Reaktionszone zu entfernen. Somit kann in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die Reaktion des Diketons mit Alkalimetallalkoxid in Gegenwart eines Fällmittels für Cyanidionen erfolgen, wie beispielsweise einem Salz, das ein Kation enthält, das eine unlösliche Cyanidverbindung bildet. Solche Salze können beispielsweise umfassen Zinkiodid, Ferriesulfat oder im Wesentlichen irgendein Halogenid, Sulfat oder anderes Salz von Erdalkalien oder Übergangsmetall, das löslicher ist als das entsprechende Cyanid. Wenn Zinkiodid in Proportionen vorliegt im Bereich von etwa einem Äquivalent je Äquivalent Diketonsubstrat wurde beobachtet, dass die Produktivität der Reaktion wesentlich zunimmt, verglichen mit dem Verfahren, das in Abwesenheit eines Alkalimetallhalogenids durchgeführt wird.

Selbst wenn ein Fällmittel verwendet wird zur Entfernung von Cyanidion bleibt es vorzuziehen, bei ziemlich hoher Verdünnung zu arbeiten, jedoch kann bei der Verwendung eines Fällmittels das Lösungsmittel zu Diketonsubstrat-Molarverhältnis wesentlich reduziert werden verglichen mit den Reaktionen in Abwesenheit eines solchen Mittels. Gewinnung des Hydroxyesters der Formel V kann gemäß irgendeinem der nachstehend beschriebenen extraktiven oder nicht extraktiven Verfahren durchgeführt werden.

Das Gleichgewicht der Reaktion kann außerdem kontrolliert werden, um die Produktion des Hydroxyesters der Formel V zu favorisieren durch Entfernung dieses Hydroxyesters vom Reaktionsgemisch nachdem es synthetisiert wurde. Die Entfernung des Hydroxyesters kann erfolgen, entweder stufenweise oder kontinuierlich durch Maßnahmen wie Filtration. Die Entfernung des Hydroxyesters kann angewendet werden, um das Gleichgewicht zu kontrollieren entweder allein oder in Kombination mit der chemischen oder physikalischen Entfernung des Cyanids vom Reaktionsgemisch. Erhitzen des dabei entstehenden Filtrats treibt das Reaktionsgleichgewicht zugunsten der Umwandlung des verbleibenden Diketons der Formel VI zum Hydroxyester von V.

Bei der Umwandlung des Diketons der Formel VI zum Hydroxyester der Formel V ist der 5- Cyanohydroxyester beobachtet worden im Rohprodukt in kleinen Mengen, typischerweise weniger als etwa 5 Gewichtsprozent. Es wird angenommen, dass der 5-Cyanohydroxyester ein Gleichgewichtszwischenprodukt ist zwischen dem Diketon der Formel VI und dem Hydroxyester der Formel V. Es wird außerdem angenommen, dass dieses Gleichgewichtszwischenprodukt gebildet wird aus dem Diketon durch Methoxidangriff auf die 5,7-Oxogruppe und Protonierung des Enolats und aus dem Hydroxyester durch eine Michael Addition des Nebenprodukt-Cyanidions zum 3-Keto- Δ4,5 Funktion des Hydroxyesters.

Außerdem sind die 5-Cyano-7-säure und das 17-Alkoxid des Hydroxyesters der Formel V beobachtet worden durch Chromatographie im Rohprodukt. Es wird angenommen, dass das 5- Cyanohydroxyesterzwischenprodukt reagiert mit dem Nebenprodukt-Cyanidion (vorliegend als ein Ergebnis der Decyanisierung, die die Δ4,5 Doppelbindung einführt), um die 5-Cyano-7-säure zu produzieren. Es wird angenommen, dass die Wirkung des Cyanidions die 7-Estergruppe des 5- Cyanohydroxyesters dealkyliert unter Bildung der 5-Cyano-7-säure und des entsprechenden Alkylnitrils.

Es wird ferner angenommen, dass Übergangszwischenprodukt 17-Alkoxid gebildet wird durch den Angriff des Methoxids auf das 17-Spirolacton des Hydroxyesters (oder ein vorangegangenes Zwischenprodukt, das anschließend zu dem Hydroxyester umgewandelt wurde). Das 17-Alkoxid wandelt sich leicht in den Hydroxyester um bei der Behandlung mit einer Säure. Demnach wird es im Allgemeinen in der Produktmatrix nicht beobachtet.

Der 5-Cyanohydroxyester, die 5-Cyano-7-säure und das 17-Alkoxid sind neue Verbindungen, die sich als chromatographische Marker und als Zwischenprodukte bei der Herstellung des Hydroxyesters eignen. Sie können isoliert werden vom Rohprodukt dieser Stufe in der Schema 1 Synthese. Wahlweise können sie direkt synthetisiert werden zur Verwendung als Marker oder Zwischenprodukte. Der 5-Cyanohydroxyester kann synthetisiert werden durch Umsetzung einer Lösung des isolierten Diketons der Formel VI mit einer Base wie einem Alkoxid oder einem Amin und Isolieren des dabei entstehenden Niederschlags. Die vorzugsweise hergestellte Verbindung ist 7-Mehtylhydrogen-5β-cyano-11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregnan- 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Die 5-Cyano-7-carbonsäure kann direkt synthetisiert werden durch Umsetzung des Diketons der Formel VI mit einer schwachen wässrigen Base wie Natriumacetat oder Natriumbicarbonat und Isolieren des dabei entstehenden Niederschlags. Die hergestellte Verbindung ist vorzugsweise 5-β- Cyano-11-α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregnan-7α,21-dicarbonsäure, γ-Lacton.

Das 17-Alkoxid kann synthetisiert werden direkt durch Umsetzung einer Lösung des Hydroxyesters der Formel V mit einem Alkoxid unter Bildung eines Gemischs aus dem 17-Alkoxid und dem entsprechenden Hydroxyester. Die hergestellte Verbindung ist vorzugsweise Dimethyl- 11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Vorzugsweise entspricht das Diketonsubstrat der Formel VI der Formel VIA

und das Hydroxyesterprodukt entspricht der Formel VA

wobei in jeder -A-A-, -B-B-, R³, Y¹, Y² und X die in Formel XIIIA definierte Bedeutung aufweisen und R¹ die in Formel V definierte Bedeutung aufweist. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

Die Produkte der Formel V sind neue Verbindungen, die wesentlichen Wert als Zwischenprodukte für die Herstellung von Verbindungen der Formel I aufweisen und insbesondere von Formel IA. Vorzugsweise entsprechen die Verbindungen der Formel V der Formel VA, worin -A- A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind, R³ Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy ist und R&sup8; und R&sup9; zusammen den 20-Spiroxanring bilden:

Am meisten bevorzugt ist die Verbindung der Formel V Methyl Hydrogen 11α,17α-Dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Die Verbindung der Formel V kann isoliert werden durch Filtration oder durch Ansäuern der Reaktionslösung beispielsweise mit einer Mineralsäure wie wässrige HCl oder Schwefelsäure, Kühlen auf Umgebungstemperatur und Extrahieren des Produktes mit einem organischen Lösungsmittel wie Methylenchlorid oder Ethylacetat. Der Extrakt wird gewaschen mit einer wässrigen alkalischen Waschlösung, getrocknet und filtriert, wonach das Lösungsmittel entfernt wird. Wahlweise kann die Reaktionslösung, die das Produkt der Formel V enthält, abgeschreckt werden mit konzentrierter Säure. Die Produktlösung wird eingeengt, gekühlt auf zwischen etwa 0º und 25ºC und der Produktfeststoff wird isoliert durch Filtration.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Methanol und HCN entfernt durch Destillation nach Schluß der Reaktionsperiode, wobei Mineralsäure (wie Salzsäure oder Schwefelsäure) zugesetzt wird vor der Destillation und Wasser zugesetzt wird nach der Destillation. Die Mineralsäure kann zugesetzt werden in einer einzigen Stufe, in mehreren Stufen oder kontinuierlich. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Mineralsäure kontinuierlich zugesetzt über einen Zeitraum von etwa 10 bis etwa 40 Minuten, bevorzugterweise etwa 15 bis etwa 30 Minuten. Auf ähnliche Weise kann Wasser zugesetzt werden zu den Destillierbodensätzen in einer einzigen Stufe, in mehreren Stufen oder kontinuierlich. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das konzentrierte Reaktionsgemisch auf Rückflußtemperatur vor der Zugabe von Wasser gekühlt. Vorzugsweise wird das Gemisch gekühlt auf eine Temperatur zwischen etwa 50ºC und etwa 70ºC, vorzugsweise zwischen etwa 60ºC und etwa 70ºC und bevorzugterweise etwa 65ºC vor der Zugabe des Wassers. Wasser wird dann zugesetzt, vorzugsweise kontinuierlich, über einen Zeitraum von etwa 15 Minuten bis etwa 3 Stunden und bevorzugtererweise über etwa 60 Minuten bis etwa 90 Minuten, während die Temperatur im wesentlichen konstant gehalten wird. Das Produkt der Formel V beginnt zu kristallisieren aus den Destillationsbodensätzen bei fortschreitender Wasserzugabe. Nachdem das Wasser dem Gemisch zugegeben worden ist, wird das verdünnte Reaktionsgemisch bei etwa dergleichen Temperatur eine Stunde lang gehalten und dann auf etwa 15ºC binnen einer zusätzlichen Zeitspanne von etwa 4 bis 5 Stunden gekühlt. Das Gemisch wird bei etwa 15ºC für einen Zeitraum von etwa 1 bis 2 Stunden gehalten. Ein längerer Aufrechterhaltungszeitraum bei 15ºC erhöht die Ausbeute des Cyanoesters im Gemisch. Diese Art der Gewinnung liefert ein hoch qualitatives kristallines Produkt ohne Extraktionsarbeitsschritte.

Gemäß einer anderen bevorzugten Art der Gewinnung des Produktes der Formel V werden Methanol und HCN entfernt durch Destillation nach Beendigung der Reaktionszeit, wobei Wasser und Säure zugesetzt werden vor oder während der Destillation. Zugabe von Wasser vor der Destillation vereinfacht die Arbeitsschritte, jedoch kann bei progressiver Zugabe während der Destillation das Volumen in dem Destilliergefäß im Wesentlichen konstant gehalten werden. Das Produkt der Formel V kristallisiert bei fortschreitender Destillation aus den Destillationsbodensätzen. Diese Art der Gewinnung liefert ein hoch qualifiziertes kristallines Produkt ohne Extraktionsarbeitsschritte.

Gemäß einer noch weiteren Alternative kann die Reaktionslosung, die das Produkt der Formel V enthält, abgeschreckt werden mit Mineralsäure, z B 4 N HCl, wonach das Lösungsmittel durch Destillation entfernt wird. Entfernung des Lösungsmittels ist außerdem wirksam zur Entfernung von restlicher HCN aus dem Reaktionsprodukt. Es wurde gefunden, dass mehrfache Lösungsmittelextraktionen zur Reinigung der Verbindung der Formel V nicht erforderlich sind, wo die Verbindung der Formel V als Zwischenprodukt in einem Verfahren zur Herstellung von Expoxymexrenon dient, wie hier beschrieben. Tatsächlich können solche Extraktionen oft vollständig weggelassen werden. Wo die Lösungsmittelextraktion angewandt wird zur Produktreinigung ist es wünschenswert, die Lösungsmittelwaschungen mit Kochsalzlösung und caustischen Waschungen zu ergänzen. Wo jedoch die Lösungsmittelextraktionen weggelassen werden, werden die Kochsalz- und caustischen Waschungen ebenfalls weggelassen. Das Weglassen der Extraktionen und Waschungen erhöht wesentlich die Produktivität des Verfahrens ohne die Ausbeute oder Produktqualität zu beeinträchtigen und schließt außerdem die Notwendigkeit aus, die gewaschene Lösung zu trocknen mit einem Trockenmittel wie Natriumsulfat.

Das rohe 11α-Hydroxy-7α-alkoxycarbonylprodukt wird wiederum in dem Lösungsmittel aufgenommen für die nächste Reaktionsstufe des Verfahrens, welches die Umwandlung der 11- Hydroxygruppe zu einer Abspaltgruppe in der 11 Position ist, wobei eine Verbindung der Formel IV produziert wird:

worin -A-A-, R³, -B-B-, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII definierte Bedeutung haben, R¹ die in Formel V definierte Bedeutung hat und R² Niederarylsulfonyloxy, Alkylsulfonyloxy, Acyloxy oder Halogenid ist. Vorzugsweise wird das 11α-Hydroxy verestert durch Reaktion mit einem Niederalkylsulfonylhalogenid, einem Acylhalogenid oder einem Säureanhydrid, welches der Lösung zugesetzt wird, enthaltend das Zwischenprodukt der Formel V. Niedere Säureanhydride wie Essigsäureanhydrid und trihalogenierte Säureanhydride wie Trifluoressigsäureanhydrid können verwendet werden, um geeignete Acyloxyabspaltgruppen herzustellen. Niederalkylsulfonylhalogenide und insbesondere Methansulfonylchlorid werden jedoch bevorzugt. Wahlweise könnte die 11-α Hydroxygruppe umgewandelt werden zu einem Halogenid durch Umsetzung eines geeigneten Reagenz wie Thionylbromid, Thionylchlorid, Sulfurylchlorid oder Oxalylchlorid. Andere Reagenzien zur Bildung von 11α-Sulfonsäureestern umfassen Tosylchlorid, Benzolsulfonylchlorid und Trifluormethansulfonsäureanhydrid. Die Reaktion erfolgt in einem Lösungsmittel, enthaltend einen Halogenwasserstoffreiniger wie Triethylamin oder Pyridin. Anorganische Basen wie Kaliumcarbonat oder Natriumcarbonat können ebenfalls verwendet werden. Die ursprüngliche Konzentration des Hydroxyesters der Formel V liegt vorzugsweise zwischen etwa 5% und etwa 50 Gewichtsprozent. Das Veresterungsreagenz liegt vorzugsweise in einem schwachen Überschuss vor. Methylenchlorid ist ein besonders geeignetes Lösungsmittel für die. Reaktion, jedoch können andere Lösungsmittel wie Dichlorethan, Pyridin, Chloroform, Methylethylketon, Dimethoxyethan, Methylisobutylketon, Aceton, andere Ketone, Ether, Actonitril, Toluol und Tetrahydrofuran ebenfalls verwendet werden. Die Reaktionstemperatur wird in erster Linie durch die Flüchtigkeit des Lösungsmittels beherrscht. In Methylenchlorid ist die Reaktionstemperatur vorzugsweise im Bereich von zwischen etwa -10ºC und etwa 10ºC.

Vorzugsweise entspricht das Hydroxyestersubstrat Formel V der Formel VA

und das Produkt entspricht der Formel IVA

worin in jedem -A-A-, -B-B-, R³, Y¹, Y² und X die in Formel XIIIA angegebene Bedeutung haben, R¹ ein Niederalkoxycarbonyl oder Hydroxycarbonyl ist und R² die in Formel IV angegebene Definition besitzt. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

Die Produkte der Formel IV sind neue Verbindungen, die wesentlichen Wert als Zwischenprodukte für die Herstellung der Verbindungen der Formel I besitzen und insbesondere der Formel IA. Vorzugsweise entsprechen die Verbindungen der Formel IVA der Formel VA, worin -A- A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind, R³ Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy ist und R&sup8; und R&sup9; zusammen den 20-Spiroxanring bilden:

Am meisten bevorzugt ist die Verbindung der Formel IV Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-11α-(methylsulfonyl)oxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton. Wo eine Acyloxyabspaltgruppe gewünscht wird, ist die Verbindung der Formel IV vorzugsweise 7-Methylhydrogen 17-hydroxy-3-oxo-11α-(2,2,2-trifluor-1-oxoethoxy)-17α-pregn-4-en- 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton oder 7-Methyl 11α-(acetyloxy)-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en- 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Gegebenenfalls kann die Verbindung der Formel IV isoliert werden durch Entfernung des Lösungsmittels. Vorzugsweise wird die Reaktionslösung zuerst gewaschen mit einer wässrigen alkalischen Waschlösung, z. B. 0,5-2 N NaOH, gefolgt durch eine saure Waschung, z. B. 0,5-2 N HCl. Nach Entfernung des Reaktionslösungsmittels wird das Produkt umrkistallisiert, z. B. durch Aufnahme des Produktes in Methylenchlorid und dann Zugabe eines anderen Lösungsmittels wie Ethylether, welches die Löslichkeit des Produktes der Formel IV verringert, wobei seine Ausfällung in kristalliner Form verursacht wird.

Bei der Gewinnung des Produktes der Formel IV oder bei der Herstellung der Reaktionslösung zur Umwandlung des Formel IV Zwischenproduktes zum Zwischenprodukt von Formel II wie es weiter im Nachstehenden beschrieben wird, können alle Extraktionen und/oder Waschstufen weggelassen werden, wenn die Lösung anstelle dessen behandelt wird mit Ionenaustauschharzen, zur Entfernung von sauren und basischen Verunreinigungen. Die Lösung wird zuerst behandelt mit einem Anionenaustauschharz, dann mit einem Kationenaustauschharz. Wahlweise kann die Reaktionslösung zuerst behandelt werden mit anorganischen Absorbenzien wie basischen Alumina oder basischen Silica gefolgt durch eine verdünnte saure Waschung. Basische Silica oder basisches Alumina kann typischerweise vermischt werden mit der Reaktionslösung in einem Verhältnis von zwischen etwa 5 und etwa 50 g je kg des Produktes, vorzugsweise zwischen etwa 15 und etwa 20 g je kg des Produktes. Gleichgültig ob Ionenaustauschharze oder anorganische Absorbenzien verwendet werden, die Behandlung kann erfolgen durch einfaches Aufschlemmen des Harzes oder des anorganischen Absorbenz mit der Reaktionslösung unter Rühren bei Umgebungstemperatur und dann Entfernen des Harzes oder anorganischen Absorbenz durch Filtration.

In einer alternativen und bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Produktverbindung der Formel IV gewonnen in roher Form als eine konzentrierte Lösung durch Entfernung eines Teiles des Lösungsmittels. Diese konzentrierte Lösung wird direkt verwendet in der folgenden Verfahrensstufe, welche Entfernung der 11α-Abspaltgruppe von der Verbindung der Formel IV bedeutet, wobei ein Enester der Formel II hergestellt wird:

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII angegebene Definition aufweisen und R¹ die in Formel V angegebene Definition aufweist. Für Zwecke dieser Reaktion kann der R² Substituent der Verbindung der Formel IV irgendeine Abspaltgruppe sein, wobei deren Abstraktion wirksam ist für die Bildung einer Doppelbindung zwischen den 9- und 11-Kohlenstoffen. Vorzugsweise ist die Abspaltgruppe ein Alkylsulfonyloxy- oder Acyloxysubstituent, der entfernt wird durch Reaktion mit einer Säure und einem Alkalimetallsalz. Mineralsäuren können verwendet werden, jedoch werden Niederalkansäuren bevorzugt. Vorteilhafterweise umfaßt das Reagenz für die Reaktion weiterhin ein Alkalimetallsalz oder die verwendete Alkansäure. Es wird besonders bevorzugt, dass die Abspaltgruppe Mesyloxy und das Reagenz für die Reaktion umfaßt, Ameisensäure oder Essigsäure und ein Alkalimetallsalz von einem dieser Säuren oder eine andere Niederalkansäure umfaßt. Wo die Abspaltgruppe Mesyloxy ist und das zu entfernende Reagenz entweder Essigsäure und Natriumacetat oder Ameisensäure und Kaliumformiat sind, wird ein relativ hohes Verhältnis von 9,11-Olefin zu 11,12-Olefin beobachtet. Wenn freies Wasser vorliegt während der Entfernung der Abspaltgruppe tendieren Verunreinigungen sich zu bilden, insbesondere ein 7,9-Lacton

worin -A-A-, R³, -B-B-, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII definierte Bedeutung besitzen, welches schwierig ist, aus dem Endprodukt zu entfernen. Essigsäureanhydrid und andere Trockenmittel werden verwendet, um das in der Ameisensäure vorliegende Wasser zu entfernen. Der freie Wassergehalt des Reaktionsgemischs vor der Reaktion sollte auf einem Spiegel von unter etwa 0,5% gehalten werden, vorzugsweise unter etwa 0,1 Gewichtsprozent, wie durch Karl Fischer Analyse für Wasser gemessen wurde auf der Basis der Gesamtreaktionslösung. Obgleich es vorzuziehen ist, dass das Reaktionsgemisch so trocken wie möglich gehalten wird, sind zufriedenstellende Ergebnisse erzielt worden mit 0,3 Gewichtsprozent Wasser. Vorzugsweise enthält das Reaktionschargengemisch zwischen etwa 4% und etwa 50 Gewichtsprozent des Substrats der Formel IV in der Alkanonsäure. Zwischen etwa 4% und etwa 20 Gewichtsprozent des Alkalimetallsalzes der Säure ist vorzugsweise eingeschlossen. Wo Essigsäureanhydrid verwendet wird als Trockenmittel liegt es vorzugsweise in einem Verhältnis von zwischen etwa 0,05 Mol und etwa 0,2 Mol je Mol Alkansäure vor.

Es wurde gefunden, dass Proportionen des Nebenproduktes 7,9-Lacton und 11,12-Olefin im Reaktionsgemisch relativ gering ist, wo das Abspaltreagenz eine Kombination von Trifluoressigsäure, Trifluoressigsäureanhydrid und Kaliumacetat als Reagenz zur Entfernung der Abspaltgruppe und der Bildung des Enesters (9,11-Olefin) umfaßt. Trifluoressigsäureanhydrid dient als Trockenmittel und sollte in einer Proportion von mindestens etwa 3 Gewichtsprozent vorliegen, bevorzugtererweise mindestens etwa 15 Gewichtsprozent, am meisten bevorzugt etwa 20 Gewichtsprozent bezogen auf das Trifluoressigsäureentfernungsmittel.

Außer dem 7,9-Lacton sind andere Verunreinigungen und Nebenprodukte geeignet als synthetische Zwischenprodukte und chromatographische Marker sind beobachtet worden in dieser Stufe der Schema 1 Synthese. Das neue 4,9,13-Trien des Enesters der Formel II (beispielsweise 7- Methyl-hydrogen-17-methyl-3-oxo-18-norpregna-4,9(11),13-trien-7α,21-dicarboxylat) ist chromatographisch isoliert worden von der Produktlösung. Die Menge dieses Verbindungsproduktes scheint sich zu erhöhen mit einer Verlängerung der Reaktionszeit für diese Synthesestufe. Es wird angenommen, dass die Verbindung sich bildet, wenn das Lacton protoniert wird und das dabei sich bildende C17 Carboniumion die Migration der angularen Methylgruppe von der C13 Position erleichtert. Deprotonierung dieses Zwischenprodukts ergibt das 4,9,13-Trien.

Der neue 5-Cyano-Δ11,12 des Enesters der Formel II (beispielsweise 7-Methyl-hydrogen-5β- cyano-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-11-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton) und das neue 5-Cyano des Enesters der Formel II (beispielsweise 7-Methyl-hydrogen-5-cyano-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-11- en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton) sind ebenfalls chromatographisch isoliert worden aus dem Rohprodukt. Es wird angenommen, dass diese Verbindungen gebildet werden über die Dehydrierung der rückständigen 5-Cyano-7-säure und dem 5-Cyanohydroxyester, die in der Rohproduktlösung vorliegen als ein Ergebnis der dritten Stufe der Schema 1 Synthese.

Das neue C17 Epimer des Enesters der Formel II (beispielsweise 7-Methyl-hydrogen-17- hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton) ist ebenfalls chromatographisch vom Rohprodukt isoliert worden. Es wird angenommen, dass die sauren Bedingungen der Eliminationsreaktion in einer Razemisierung des C17 chiralen Zentrums resultieren unter Bildung des 17-Epimers des Enesters. Das 17-Epimer kann direkt synthetisiert werden durch Umsetzung einer Verbindung der Formel IV mit einer Lösung von Kaliumformiat, Ameisensäure und Essigsäureanhydrid und Isolieren des 17-Epimers.

Obgleich als eine Verunreinigung in der Rohproduktlösung nicht beobachtet, kann das 11- Keton des Hydroxyesters der Formel V hergestellt werden durch Oxidation des 11-Hydroxys des entsprechenden Hydroxyesters mit einem geeigneten Oxidationsmittel wie einem Jones Reagenz. Das vorzugsweise hergestellte 11-Keton ist 7-Methyl-hydrogen-17-hydroxy-3,11-dioxo-17α-pregna- 4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Wahlweise kann die 11α-Abspaltgruppe von der Verbindung der Formel IV eliminiert werden, um ein Enester der Formel II zu bilden durch Erhitzen einer Lösung der Formel IV in einem organischen Lösungsmittel wie DMSO, DMF oder DMA.

Außerdem wird gemäß der Erfindung die Verbindung der Formel IV zunächst umgesetzt mit einem Alkenylalkanoat wie Isopropenylacetat in Gegenwart einer Säure wie Toluolsulfonsäure oder einer Wasserfreien Mineralsäure wie Schwefelsäure unter Bildung des 3-Enolesters:

der Verbindung der Formel IV. Wahlweise kann der 3-Enolester gebildet werden durch Behandlung der Verbindung der Formel IV mit einem Säureanhydrid und einer Base wie Essigsäure und Natriumacetat. Weitere Alternativen umfassen die Behandlung der Verbindung der Formel IV mit Keten in Gegenwart einer Säure, zur Herstellung der Verbindung der Formel IV(Z). Das Zwischenprodukt der Formel IV(Z) wird danach umgesetzt mit einem Alkalimetallformiat oder Acetat in Gegenwart von Ameisen- oder Essigsäure, unter Bildung des Δ9,11 Enolacetats der Formel IV(Y):

die dann umgewandelt werden kann in den Enester der Formel II in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem Alkohol wie Methanol entweder durch thermische Zersetzung des Enolacetats oder Umsetzung desselben mit einem Alkalimetallalkoxid. Die Eliminierungsreaktion ist hochselektiv gegenüber dem Enester der Formel II zugunsten des 11,12-Olefins und 7,9-Lactons und diese Selektivität wird während der Umwandlung des Enolacetats zum Enon beibehalten.

Vorzugsweise entspricht das Substrat der Formel IV der Formel IVA

und das Enesterprodukt entspricht der Formel IIA

wobei in jedem -A-A-, -B-B-, R³, Y¹, Y² und X die in Formel XIIIA definierte Bedeutung haben und R¹ die in Formel V definierte Bedeutung aufweist, vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

Gegebenenfalls kann die Verbindung der Formel II isoliert werden durch Entfernung des Lösungsmittels, Aufnehmen des Feststoffproduktes in kaltem Wasser und Extrahieren mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat. Nach geeigneten Wasch- und Trockenstufen wird das Produkt gewonnen durch Entfernung des Extraktionslösungsmittels. Der Enester wird dann gelöst in einem Lösungsmittel, das sich für die Umwandlung des Produktes in Formel I eignet. Wahlweise kann der Enester isoliert werden durch Zugabe von Wasser zu der konzentrierten Produktlösung und Filtrieren des Festproduktes, wodurch vorzugsweise das 7,9-Lacton entfernt wird. Umwandlung des Substrats der Formel II zum Produkt der Formel IA kann erfolgen auf die in U.S. Patent 4,559,332 beschriebene Weise, die ausdrücklich hier durch Bezugnahme enthalten ist oder bevorzugtererweise durch die neue Reaktion unter Anwendung eines Haloacetamidpromoters wie nachstehend beschrieben.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann der Hydroxyester der Formel V umgewandelt werden zum Enester der Formel II ohne Isolierung der Zwischenproduktverbindung der Formel IV. Bei dieser Methode wird der Hydroxyester aufgenommen in einem organischen Lösungsmitel wie Methylenchlorid und es wird entweder ein Acylierungsmittel, z. B. Methansulfonylchlorid oder ein Halogenierungsreagenz, z. B. Sulfurylchlorid der Lösung zugesetzt. Das Gemisch wird gerührt und wo Halogenierung beteiligt ist wird ein HCL Wäscher wie Imidazol zugesetzt. Diese Reaktion ist hoch exotherm und sollte deshalb bei einer kontrollierten Geschwindigkeit mit voller Kühlung durchgeführt werden. Nach der Basenzugabe wird das dabei entstehende Gemisch auf mäßige Temepratur erwärmt, z. B. etwa 0ºC bis Raumtemperatur oder etwas darüber und umgesetzt binnen eines Zeitraums von typischerweise etwa einer bis etwa 4 Stunden. Nachdem die Reaktion beendet ist wird das Lösungsmittel abgestreift, vorzugsweise unter Hochvakuum (z. B. etwa 24" bis 28" Hg) Bedingungen bei etwa -10º bis etwa +15ºC, bevorzugtererweise etwa 0º bis etwa 5ºC zum Konzentrat der Lösung und überschüssige Base wird entfernt. Das Substrat wird dann wieder gelöst in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem halogenierten Lösungsmittel wie Methylenchlorid zur Umwandlung zum Enester.

Das Abspaltgruppeneliminierungsreagenz wird vorzugsweise hergestellt durch Vermischen einer organischen Säure, eines organischen Säuresalzes und einem Trockenmittel, vorzugsweise Ameisensäure, Alkalimetallformiat bzw. Essigsäureanhydrid in einem trockenen Reaktor. Die Zugabe von Essigsäureanhydrid ist exotherm und resultiert in einer Freisetzung von CO, so dass die Zugabegeschwindigkeit entsprechend kontrolliert werden muss. Um die Wasserentfernung zu fördern, wird die Temepratur dieser Reaktion vorzugsweise im Bereich von etwa 60º bis etwa 90ºC gehalten, am meisten bevorzugt etwa 65º bis etwa 75ºC. Dieses Reagenz wird dann der Produktlösung der Verbindung der Formel IV zugesetzt, um die Eliminierungsreaktion zu bewirken. Nach etwa 4 bis etwa 8 Stunden wird das Reaktionsgemisch vorzugsweise auf eine Temperatur von mindestens etwa 85ºC erhitzt, jedoch vorzugsweise nicht über etwa 95ºC, bis das gesamte flüchtige Destillat entfernt worden ist und dann für einen weiteren Zeitabschnitt, um die Reaktion zu beenden, typischerweise etwa eine bis etwa 4 Stunden. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt und nach Gewinnung durch Standardextraktionstechniken kann der Enester gewonnen werden wie gewünscht durch Verdampfen des Lösungsmittels.

Es wurde außerdem gefunden, dass der Enester der Formel II gewonnen werden kann aus der Reaktionslösung durch ein alternatives Verfahren, das die Notwendigkeit der Extraktionsstufen nach der Eliminationsreaktion vermeidet, wobei Kosten gespart werden, Verbesserung der Ausbeute erzielt wird und/oder Verbesserung der Produktivität. In diesem Verfahren wird das Enesterprodukt ausgefällt durch Verdünnung des Reaktionsgemischs mit Wasser nach Entfernung der Ameisensäure. Das Produkt wird dann isoliert durch Filtration. Keine Extraktionen sind erforderlich.

Gemäß einer weiteren Alternative für die Umwandlung des Hydroxyesters der Formel V zum Enester der Formel II ohne Isolierung der Verbindung der Formel IV wird die 11α-Hydroxygruppe des Formel V Hydroxyesters ersetzt durch Halogen und der Formel II Enester bildet sich dann in situ durch thermische Dehydrohalogenierung. Ersatz der Hydroxygruppe durch Halogen wird bewirkt durch Umsetzung mit Sulfurylhalogenid, vorzugsweise Sulfurylchlorid in der Kälte in Gegenwart eines Hydrogenhalogenidwäschers wie Imidazol. Der Hydroxyester wird gelöst in einem Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran und gekühlt auf etwa 0ºC bis etwa -70ºC. Das Sulfurylhalogenid wird zugesetzt und das Reaktionsgemisch wird auf mäßige Temperatur erwärmt, z. B. Raumtemperatur, so lange bis die Eliminationsreaktion beendet ist, typischerweise etwa eine bis etwa 4 Stunden. Das Verfahren dieser Ausführungsform kombiniert nicht nur zwei Stufen in einer, sondern eliminiert die Verwendung von: einem halogenierten Reaktionslösungsmittel; einer Säure (wie Essigsäure) und einem Trockenreagenz (wie Essigsäureanhydrid oder Natriumsulfat). Außerdem erfordert die Reaktion keine Rückflußbedingungen und vermeidet die Entwicklung von Nebenprodukt CO, was geschieht, wenn Essigsäure als Trockenmittel verwendet wird.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Diketonverbindung der Formel VI umgewandelt werden zum Epoxymexrenon oder einer anderen Verbindung der Formel I ohne Isolierung irgendeines Zwischenproduktes in gereinigter Form. Gemäß diesem bevorzugten Verfahren wird die Reaktionslösung, die den Hydroxyester enthält, abgeschreckt mit einer Lösung einer starken Säure, gekühlt auf Umgebungstemperatur und dann extrahiert mit einem geeigneten Extraktionslösungsmittel. Vorteilhafterweise wird eine wässrige Lösung eines anorganischen Salzes, beispielsweise 10 Gewichtsprozent einer Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch vor der Extraktion zugesetzt. Der Extrakt wird gewaschen und getrocknet durch azeotrope Destillation zur Entfernung des Methanollösungsmittels, das von der Ketonspaltungsreaktion zurückblieb.

Die dabei entstehende konzentrierte Lösung, die zwischen etwa 5% und etwa 50 Gewichtsprozent der Verbindung der Formel V enthält, wird dann kontaktiert in der Kälte mit einem Acylierungs- oder Alkylsulfonylierungsmittel unter Bildung des Sulfonesters oder Dicarbonsäureesters. Nachdem die Alkylsulfonierungs- oder Carboxylierungsreaktion beendet ist, wird die Reaktionslösung über eine saure und dann eine basische Austauschharzsäule geführt, um die basischen und sauren Verunreinigungen zu entfernen. Nach jeder Passage wird die Säule gewaschen mit einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid für die Gewinnung von restlichem Sulfonsäure- oder Dicarbonsäureester davon. Das kombinierte Eluat und Waschfraktionen werden vereinigt und reduziert, vorzugsweise unter Vakuum, um eine konzentrierte Lösung herzustellen, die den Sulfonsäureester oder den Dicarbonsäureester der Formel IV enthält. Diese konzentrierte Lösung wird dann kontaktiert mit einem Trockenreagenz, das ein Mittel enthält, das die Entfernung der 11α-Esterabspaltgruppe bewirkt und Abstraktion des Wasserstoffs unter Bildung einer 9,11 Doppelbindung. Vorzugsweise enthält das Reagenz zur Entfernung der Abspaltgruppe die vorstehend beschriebene Ameisensäure/Alkalimetallformiat/Essigsäureanhydrid- Trockenreagenzlösung. Nachdem die Reaktion beendet ist wird das Reaktionsgemisch gekühlt und Ameisensäure und/oder andere flüchtige Komponenten werden unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wird auf Umgebungstemperatur gekühlt, geeigneten Waschstufen unterworfen und dann getrocknet unter Bildung einer konzentrierten Lösung, die den Enester der Formel II enthält. Dieser Enester kann dann umgewandelt werden zum Epoxymexrenon oder einer anderen Verbindung der Formel I unter Anwendung der hier beschriebenen Methode oder der Methode gemäß U.S. Patent 4,559,332.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Lösungsmittel entfernt von der Reaktionslösung unter Vakuum und das Produkt der Formel IV wird aufgeteilt zwischen Wasser und einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B. Ethylacetat. Die wässrige Schicht wird dann Rückextrahiert mit dem organischen Lösungsmittel und der Rückextrakt gewaschen mit einer alkalischen Lösung, vorzugsweise einer Lösung eines Alkalimetallhydroxids, das ein Alkalimetallhalogenid enthält. Die organische Phase wird eingeengt, vorzugsweise unter Vakuum, unter Bildung des Enesterproduktes der Formel II. Das Produkt der Formel II kann dann aufgenommen werden in einem organischen Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid und weiter umgesetzt werden auf die im '332 Patent beschriebene Weise, um das Produkt der Formel I herzustellen.

Wo Trihaloacetonitril verwendet wird in der Epoxidationsreaktion wurde gefunden, dass die Auswahl des Lösungsmittels wichtig ist, wobei halogenierte Lösungsmittel höchst bevorzugt sind und Methylenchlorid besonders bevorzugt wird. Lösungsmittel wie Dichlorethan und Chlorbenzol ergeben einigermaßen zufriedenstellende Ausbeuten, jedoch sind die Ausbeuten allgemein besser in einem Methylenchloridreaktionsmedium. Lösungsmittel wie Acetonitril und Ethylacetat ergeben im allgemeinen schlechte Ausbeuten, während die Reaktion in Lösungsmitteln wie Methanol oder Wasser/Tetrahydrofuran wenig vom gewünschten Produkt ergeben.

Weiterhin wurde gemäß der vorliegenden Erfindung entdeckt, dass zahlreiche Verbesserungen bei der Synthese von Epoxymexrenon realisiert werden können durch die Verwendung eines Trihaloacetamids anstelle eines Trihaloacetonitrils als ein Peroxidaktivator für die Epoxidationsreaktion. Gemäß einem besonders bevorzugten Verfahren erfolgt die Epoxidation durch Reaktion des Substrats der Formel IIA mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart eines Trichloracetamids und eines geeigneten Puffers. Vorzugsweise erfolgt die Reaktion in einem pH Bereich von etwa 3 bis etwa 7, am meisten bevorzugt zwischen etwa 5 und etwa 7. Jedoch trotz dieser Überlegungen wurde eine erfolgreiche Reaktion außerhalb dieses bevorzugten pH Bereiches realisiert.

Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erzielt mit einem Puffer, umfassend Dikaliumhydrogenphosphat und/oder mit einem Puffer, umfassend eine Kombination aus Dikaliumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat in relativen Proportionen von zwischen etwa 1 : 4 und 2 : 1, am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 2 : 3. Boratpuffer können ebenfalls verwendet werden, jedoch liefern sie langsamere Umwandlungen, als Dikaliumphosphat oder K&sub2;HPO&sub4;/KH&sub2;PO&sub4; Gemische. Woraus immer auch der Puffer besteht, er sollte einen pH in dem vorstehend angegebenen Bereich liefern. Abgesehen von der Gesamtzusammensetzung des Puffers oder des genauen pH Wertes, den er liefert, wurde beobachtet, dass die Reaktion wesentlich effektiver verläuft, wenn mindestens eine Portion des Puffers dibasisches Hydrogenphosphation enthält. Man glaubt, dass dieses Ion im Wesentlichen Teil hat als ein homogener Katalysator bei der Bildung eines Adduktes oder Komplexes, enthaltend den Promoter und Hydroperoxidionen, deren Erzeugung ihrerseits wesentlich sei für den Gesamtepoxidationsreaktionsmechanismus. Somit kann das quantitative Erfordernis für dibasisches Hydrogenphosphat (vorzugsweise von K&sub2;HPO&sub4;) nur eine geringe katalytische Konzentration sein. Im Allgemeinen wird vorgezogen, dass K&sub2;HPO&sub4; in einer Proportion vorliegt von mindestens etwa 0,1 Äquivalent, z. B. zwischen etwa 0,1 und 0,3 Äquivalenten je Äquivalent Substrat.

Die Reaktion erfolgt in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Methylenchlorid, jedoch können wahlweise andere halognierte Lösungsmittel wie Chlorbenzol oder Dichlorethan verwendet werden. Toluol und Gemische von Toluol und Acetonitril erwiesen sich ebenfalls als zufriedenstellend. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, wird postuliert, dass die Reaktion am wirkungsvollsten verläuft in einem Zwei-Phasen-System, worin sich ein Hydroxyperoxidzwischenprodukt bildet und sich in der organischen Phase mit geringem Wassergehalt verteilt und mit dem Substrat in der organischen Phase reagiert. Somit sind die bevorzugten Lösungsmittel diejenigen, in denen die Wasserlöslichkeit gering ist. Wirksame Gewinnung aus Toluol wird gefördert durch Einschluß eines anderen Lösungsmittels wie Acetonitril.

Bei der Umwandlung der Substrate der Formel II zu Produkten der Formel I liefert Toluol einen Verfahrensvorteil, da die Substrate in Toluol frei löslich sind und die Produkte nicht. Somit fällt das Produkt aus während der Reaktion, wenn die Umwandlung 40-50% erreicht, wobei ein Drei- Phasen-Gemisch hergestellt wird, aus dem das Produkt bequem durch Filtration abgetrennt werden kann. Methanol, Ethylacetat, Acetonitril allein, THF und THF/Wasser erwiesen sich nicht als so wirksam wie die halogenierten Lösungsmittel oder Toluol bei der Durchführung der Umwandlung dieser Verfahrensstufe.

Während Trichloracetamid ein höchst bevorzugtes Reagenz ist, können andere Trihaloacetamide wie Trifluoracetamid und Chlordifluoracetamid ebenfalls verwendet werden. Trihalomethylbenzamid und andere Verbindungen, die eine Arylen-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe aufweisen (oder andere Gruppen, die den Transfer der Elektronen entziehenden Wirkung der Elektronen entziehenden Gruppe zu dem Amidcarbonyl gestatten) zwischen der Elektronen entziehenden Trihalomethylgruppe und dem Carbonyl des Amids können ebenfalls geeignet sein. Heptafluorbutyramide können ebenfalls verwendet werden, jedoch mit weniger günstigen Ergebnissen. Generisch kann der Peroxidaktivator der Formel:

RºC(O)NH&sub2;

entsprechen, worin Rº eine Gruppe mit Elektronen entziehender Kraft ist (wie durch Sigma. Konstante gemessen) von mindestens so hoch wie diejenige, der Monochlormethylgruppe. Die Elektronen entziehende Gruppe wird vorzugsweise direkt an das Amidcarbonyl angelagert für maximale Wirksamkeit. Insbesondere kann der Peroxidaktivator der Formel:

entsprechen, worin RP eine Gruppe ist, die den Transfer der Elektronen entziehenden Wirkung einer Elektronen entziehenden Gruppe zum Amidcarbonyl gestattet und vorzugsweise ausgewählt ist aus Arylen, Alkenyl, Alinyl und -(CX&sup4;X&sup5;)n- Resten; X¹, X², X³, X&sup4; und X&sup5; sind unabhängig voneinander ausgewählt aus Halo, Wasserstoff, Alkyl, Haloalkyl und Cyano und Cyanoalkyl und n ist 0, 1 oder 2; mit der Maßgabe, dass, wenn n 0 ist, dann mindestens eines von X¹, X² und X³ Halo ist und wenn RP -(CX&sup4;X&sup5;)n- ist und n 1 oder 2 ist dann mindestens eines von X&sup4; und X&sup5; Halo ist. Wo eines von X¹, X², X³, X&sup4; oder X&sup5; nicht Halo ist, ist es vorzugsweise Haloalkyl, am meisten bevorzugt Perhaloalkyl. Besonders bevorzugte Aktivatoren umfassen diejenigen, worin n 0 ist und mindestens zwei von X¹, X² und X³ Halo sind oder solche worin RP -(CX&sup4;X&sup5;)n- ist, n 1 oder 2 ist, oder mindestens eines von X&sup4; und X&sup5; Halo ist, das andere von X&sup4; und X&sup5; Halo oder Perhaloalkyl ist und X¹, X² und X³ Halo oder Perhaloalkyl sind. Jedes von X¹, X², X³, X&sup4; und X&sup5; ist vorzugsweise Cl oder F, am meisten bevorzugt Cl, obgleich gemischte Halogenide ebenfalls geeignet sein können, wie Perchloralkyl oder Perbromalkyl und Kombinationen davon, vorausgesetzt, dass das direkt an das Amidcarbonyl gebundene Kohlenstoff substituiert ist mit mindestens einer Halogruppe.

Vorzugsweise liegt der Peroxidaktivator in einer Proportion von mindestens etwa einem Äquivalent, bevorzugtererweise zwischen etwa 1,5 und 2 Äquivalenten vor, je Äquivalent des ursprünglich vorliegenden Substrates. Wasserstoffperoxid sollte der Reaktion zugesetzt werden in mindestens geringem Überschuss oder progressiv zugesetzt werden, in dem Maße, wie die Epoxidationsreaktion fortschreitet. Obgleich die Reaktion nur ein oder zwei Äquivalente Wasserstoffperoxid je Mol des Substrats verbraucht, wird Wasserstoffperoxid vorzugsweise in wesentlichem Überschuss zugesetzt relativ zum Substrat und dem ursprünglich vorliegenden Aktivator. Ohne die Erfindung auf eine bestimmte Theorie zu begrenzen, glaubt man, dass der Reaktionsmechanismus die Bildung eines Adduktes des Aktivators und des Peroxidanions umfaßt, dass die Bildung dieser Reaktion umkehrbar ist, wobei das Gleichgewicht die Umkehrreaktion vorzieht und dass ein wesentlicher ursprünglicher Überschuss an Wasserstoffperoxid somit erforderlich ist, um die Reaktion in Forwärtsrichtung zu treiben. Die Temperatur der Reaktion ist nicht engerweise kritisch und kann wirksamerweise durchgeführt werden innerhalb des Bereichs von etwa 0º bis etwa 100ºC. Die optimale Temperatur hängt von der Auswahl des Lösungsmittels ab. Im Allgemeinen ist die bevorzugte Temperatur zwischen etwa 20ºC und etwa 30ºC, jedoch bei gewissen Lösungsmitteln beispeilsweise Toluol kann die Reaktion vorteilhafterweise im Bereich von etwa 60º bis etwa 70ºC liegen. Bei etwa 25ºC erfordert die Reaktion typischerweise weniger als etwa 10 Stunden, typischerweise etwa 3 bis 6 Stunden. Falls erforderlich können zusätzlicher Aktivator und Wasserstoffperoxid am Ende des Reaktionszyklus zugesetzt werden, um vollständige Umwandlung des Substrats zu erzielen.

Am Ende dieses Reaktionszyklus wird die wässrige Phase entfernt, die organische Reaktionslösung wird vorzugsweise gewaschen zur Entfernung von Wasserlöslichen Verunreinigungen, wonach das Produkt durch Entfernen des Lösungsmittels gewonnen werden kann. Vor der Entfernung des Lösungsmittels sollte die Reaktion gewaschen werden mit mindestens einer milden mäßig alkalischen Waschung, z. B. Natriumcarbonat. Vorzugsweise wird das Reaktionsgemisch nacheinander gewaschen mit: Einer milden reduzierenden Lösung wie einer schwachen (z. B. etwa 3 Gewichtsprozent) Lösung von Natriumsulfit in Wasser; einer alkalischen Lösung, z. B. NaOH oder ROH (vorzugsweise etwa 0,5 N); einer sauren Lösung wie HCl (vorzugsweise etwa 1 N) und einer end neutralen Waschung, enthaltend Wasser oder Kochsalzlösung, vorzugsweise gesättigte Kochsalzlösung, um Produktverlust zu minimieren. Vor der Entfernung des Reaktionslösungsmittels kann ein anderes Lösungsmittel wie ein organisches Lösungsmittel, vorzugsweise Ethanol vorteilhafterweise zugesetzt werden, so dass das Produkt gewonnen werden kann durch Kristallisation nach Destillation zur Entfernung des flüchtigeren Reaktionslösungsmittels.

Es sollte verstanden werden, dass die neue Epoxidationsmethode unter Verwendung von Trichloracetamid oder anderen neuen Peroxidaktivatoren wohl Anwendung findet neben den verschiedenen Schemen zur Herstellung von Epoxymexrenon und in der Tat verwendet werden kann für die Bildung von Epoxiden über olefinische Doppelbindungen in einer großen Vielzahl von Substraten, die Gegenstand einer Reaktion in der flüssigen Phase sind. Die Reaktion ist besonders wirksam bei ungesättigten Verbindungen, worin die Olefine tetrasubstituiert und trisubstituiert sind, d. h. RaRbC=CRcRd und RaRbC=CRcH, worin Ra bis Rd Substituenten bedeuten, die kein Wasserstoff sind. Die Reaktion verläuft sehr schnell und vollständig, wo das Substrat eine cyclische Verbindung ist mit einer trisubstituierten Doppelbindung oder entweder eine cyclische oder acyclische Verbindung mit einer tetrasubstituierten Doppelbindung. Beispiele für Substrate für die Epoxidierungsreaktion umfassen Δ9,11-Canrenon und die folgenden Substrate:

Da die Reaktion schneller und vollständiger verläuft mit trisubstituierten und tetrasubstituierten Doppelbindungen ist es besonders wirksam für die selektive Epoxidation über solche Doppelbindungen in Verbindungen, die andere Doppelbindungen enthalten können, worin die olefinischen Kohlenstoffe monosubstituiert oder sogar disubstituiert sind.

Andere nicht begrenzende Beispiele, die die generische Epoxidationsreaktion erläutern, umfassen die folgenden Epoxidationsreaktionen:

Es sollte weiterhin verstanden werden, dass die Reaktion mit Vorteil angewendet werden kann, bei der Epoxidation von monosubstituierten oder disubstituierten Doppelbindungen wie das 11,12-Olefin in unterschiedlichen steroiden Substraten.

Da es jedoch vorzugsweise die höher substituierten Doppelbindungen epoxidiert, z. B. das 9,11-Olefin mit höher Selektivität ist das erfindungsgemäße Verfahren wirksam zur Erzielung von hohen Ausbeuten und Produktivität in den Epoxidationsstufen der verschiedenen Reaktionsschemen, die hier irgendwo beschrieben werden.

Das verbesserte Verfahren hat sich gezeigt als eine besonders vorteilhafte Anwendung für die Herstellung von:

durch Epoxidation von:

und

die Herstellung von:

durch Epoxidation von:

Mehrfache Vorteile sind demonstriert worden für das erfindungsgemäße Verfahren, worin Trichloracetamid anstelle von Trichloracetonitril verwendet wurde als Sauerstofftransferreagenz für die Epoxidationsreaktion. Das Trichloracetamidreagenzsystem hat eine geringe Affinität für elektronisch unzureichende Olefine wie α,β-ungesättigte Ketone. Dies gestattet selektive Epoxidation eines nicht-konjugierten Olefins in Substraten, die beide Typen von Doppelbindungen enthalten. Außerdem können in komplexen Substraten wie Steroide disubstituierte und trisubstituierte Olefine durch Reaktion differenziert werden. Somit wird eine gute Selektivität beobachtet bei der Epoxidierung der Isomeren Δ-9,11 und Δ-11,12 Verbindungen. In diesem Falle bildet sich das 9,11 Epoxid mit minimaler Reaktion des Isomers, das die Δ-11,12 Doppelbindung enthält. Demgemäß sind Reaktionsausbeute, Produktprofil und Endreinheit im wesentlichen erhöht im Vergleich zu Reaktionen, worin ein Trihaloacetonitril verwendet wird. Es ist außerdem entdeckt worden, dass die beobachtete im Wesentlichen überschüssige Sauerstoffentwicklung bei der Verwendung von Trihaloacetonitril verringert wurde mit Trichloracetamid, wodurch dem Epoxidationsverfahren verbesserte Sicherheit verliehen wurde. Außerdem zeigt im Gegensatz zur Trichloracetonitril geförderten Reaktion die Trichloracetamidreaktion minimale exotherme Wirkungen, wodurch die Kontrolle des thermalen Profils der Reaktion erleichtert wird. Es wurde beobachtet, dass Rührwirkungen minimal sind und der Reaktorzustand konsistenter ist, ein weiterer Vorteil über das Trichloracetonitrilverfahren. Die Reaktion ist zugänglicher zur Herstellung im größeren Maßstab, als die von Trichloracetonitril geförderte Reaktion. Produktisolierung und Reinigung ist einfach. Es gibt keine beobachtbare Bayer-Villager Oxidation der Carbonylfunktion (Peroxid geförderte Umwandlung des Ketons zum Ester) wie erfahrungsgemäß bei der Verwendung von m-Chlorperoxybenzoesäure oder anderen Benzoesäuren. Das Reagenz ist preiswert, leicht erhältlich und leicht zu handhaben.

Außerdem sind folgende Verbindungen beobachtet worden durch Chromatographie im Rohprodukt aus der Stufe der Schema 1 Synthese, worin der Enester der Formel II umgewandelt wurde zur Verbindung der Formel I:

(1) Das neue 11α,12α Epoxid des Enesters der Formel II, beispielsweise 7-Methyl- hydrogen-11α-12α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton;

(2) das neue 4,5:9,11-Diepoxid des Enesters der Formel II, beispielsweise 7-Methyl- hydrogen-4α,5α:9α,11α-diepoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregnan-7α,21,dicarboxylat, γ-Lacton;

(3) das neue 12-Keton des Enesters der Formel II, beispielsweise 7-Methyl-hydrogen-17- hydroxy-3,12-dioxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton;

(4) das neue 9,11-Dihydroxy des Enesters der Formel II, beispielsweise 7-Methyl-hydrogen- 9α,11β,17-trihydroxy-3-oxo-17α-pregna-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton;

(5) das neue 12-Hydroxyanalog des Enesters der Formel II, beispielsweise 7-Methyl- hydrogen-12α,17-dihydroxy 3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton und

(6) die neue 7-Säure der Verbindung der Formel I, beispielsweise 9,11α-Epoxy-17-hydroxy- 3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarbonsäure, γ-Lacton.

Diese Verbindungen eignen sich als synthetische Zwischenprodukte und/oder chromatographische Marker bei der Herstellung der Verbindung der Formel 1, insbesondere Epoxymexrenon.

Es wird vermutet, dass das 11α,12α-Epoxid des Enesters der Formel II sich über ein Verunreinigungsprodukt bildet während der vorangegangenen Stufe, worin eine Verbindung der Formel IV umgewandelt wird zum Enester der Formel II. Diese Verunreinigung wurde chromatographisch isoliert und ist der Δ11,12 Enester. Er wird typischerweise produziert mit dem Δ9,11 Enester in einem Verhältnis von etwa 90 : 10 (Δ9,11 Enester: Δ11,12 Enester) obgleich dieses Verhältnis schwanken kann. Oxidation des Δ11,12 Enesters während der Umwandlung des Enesters der Formel II zur Verbindung der Formel I ergibt das 11α,12α-Epoxid.

Das 4,5:9,11-Diepoxid des Enesters der Formel I wurde chromatographisch isoliert. Es wird angenommen, dass es aus der Überepoxidierung des Enesters stammt. Es wurde typischerweise im Rohprodukt beobachtet in Mengen von etwa 5 Gewichtsprozent oder weniger, wobei diese Menge schwanken kann.

Das 12-Keton des Enesters der Formel II wurde chromatographisch isoliert. Es wird angenommen, dass es von der allylischen Oxidation des Enesters stammt. Es wird typischerweise beobachtet im Rohprodukt bei Mengen von etwa 5 Gewichtsprozent oder weniger wobei diese Menge schwanken kann. Die Menge an entdecktem 12-Keton im Rohprodukt, wenn Trichloracetonitril als Wasserstoffperoxidaktivator verwendet wurde, war höher als die entdeckte Menge, wenn Trichloracetamid als Aktivator verwendet wurde.

Das 9,11-Dihydroxy des Enesters der Formel II wurde chromatographisch isoliert. Es wird typischerweise beobachtet im Rohprodukt in Mengen von etwa 5 Gewichtsprozent oder weniger, wobei diese Menge schwanken kann. Es wird vermutet, dass es von der Hydrolyse des Epoxids der Formel I stammt.

Das 12-Hydroxy des Enesters der Formel II wurde chromatographisch isoliert. Es wird typischerweise beobachtet im Rohprodukt in Mengen von etwa 5 Gewichtsprozent oder weniger, wobei diese Menge schwanken kann. Es wird vermutet, dass es von der Hydrolyse des 11,12 Epoxids mit anschließender Eliminierung des 11β-Hydroxys stammt.

Außerdem können die Verbindungen der Formel I, hergestellt gemäß dieser Offenbarung weiter modifiziert werden, um einen Metaboliten, Derivat, Vorarzneimittel oder dergleichen mit verbesserten Eigenschaften zu liefern (wie verbesserte Löslichkeit und Absorption), die die Verabreichung und/oder Wirksamkeit von Epoxymexrenon erleichtern. Das 6-Hydroxy der Verbindung der Formel I (beispielsweise 8-Methyl-hydrogen-6β,17-dihydroxy-9,11α-epoxy-3-oxo- 17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton) ist eine neue Verbindung, die identifiziert wurde als ein möglicher Metabolit in der Ratte. Der 6-Hydroxymetabolit kann hergestellt werden aus dem entsprechenden Ethylenolether, beispielsweise 7-Methyl-hydrogen-9,11α-epoxy-3-ethoxy-17- hydroxy-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton). Der Ethylenolefher der Verbindung der Formel I kann hergestellt werden gemäß dem Verfahren dargelegt in R. M. Weier und L. M. Hofmann (J. Med. Chem. 1977, 1304), welches hier durch Bezugnahme enthalten ist. Der Ethylenolether wird dann umgesetzt mit m-Chlorperbenzoesäure unter Bildung des entsprechenden 6-Hydroxys der Verbindung der Formel I.

Es wird weiterhin angenommen, dass die Monocarbonsäuresalze von Epoxymexrenon, insbesondere die Kalium- und Natriumsalze geeignete Alternativen sind, um die Verabreichung einer Verbindung der Formel I an jemanden zu erleichtern, für den die Verabreichung eines Aldosteronantagonisten angezeigt ist. Unter milden basischen Bedingungen ist es möglich, das Spirolacton der Verbindungen der Formel I selektiv zu öffnen ohne den C7 Estersubstituenten zu hydrolysieren unter Bildung des entsprechenden 17β-Hydroxy-17α-(3-propionsäure)analogs. Diese offenkettigen Analoge sind polarer als ihre Lactongegenstücke und haben kürzere Verweilzeiten, wenn sie analysiert werden durch Umkehrphasen HPLC. Saure Bedingungen verursachen im Allgemeinen die Regeneration des Lactonringes.

Unter stärkeren Bedingungen wird das Spirolacton geöffnet und der C7 Ester wird hydrolysiert unter Bildung des entsprechenden Nebenproduktes, 17β-Hydroxy-17α-(3- propionsäure)-7-säureanalogen der Verbindungen der Formel I. Diese Dicarbonsäuren haben kürzere Verweilzeiten als die Monocarbonsäuren, wenn sie durch Umkehrphasen HPLC analysiert werden. Saure Bedingungen (z. B. Behandlung mit verdünnter Säure wie 0,1-4 M Salzsäure) verursachen im Allgemeinen die Regeneration des Lactonringes der Dicarbonsäure.

Die neue Epoxidationsmethode der Erfindung ist höchst brauchbar als abschließende Stufe des Syntheseschemas 1. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verläuft das Gesamtverfahren von Schema 1 wie folgt:

Schema 2

Das zweite der neuen Reaktionsschemen (Schema 2) dieser Erfindung beginnt mit Canrenon oder einem anderen Substrat entsprechend der Formel XIII

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII gegebene Bedeutung aufweisen. In der ersten Stufe dieses Verfahrens wird das Substrat der Formel XIII umgewandelt zum Produkt der Formel XII

unter Anwendung eines Cyanidierungsreaktionsschemas, das im wesentlichen das gleiche ist wie vorstehend für die Umwandlung des Substrats der Formel VIII zum Zwischenprodukt der Formel VII beschrieben. Vorzugsweise entspricht das Substrat der Formel XIII der Formel XIIIA

und das Enaminprodukt entspricht der Formel XIIA

wobei jeweils -A-A-, -B-B-, R³, Y¹, Y² und X die in Formel XIIIA definierte Bedeutung haben. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

In der zweiten Stufe von Schema 2 wird das Enamin der Formel XII hydrolysiert zu einem Zwischenprodukt-Diketonprodukt der Formel XI

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII definierte Bedeutung haben, unter Anwendungen eines Reaktionsschemas, das im Wesentlichen das Gleiche ist wie das vorstehend beschriebene für die Umwandlung des Substrats der Formel VIII zum Zwischenprodukt der Formel VII. Vorzugsweise entspricht das Substrat der Formel XII der Formel XIIA

und das Diketonprodukt entspricht der Formel XIA

wobei jeweils -A-A-, -B-B-, R³, Y¹, Y² und X die in Formel XIIIA definierte Bedeutung haben. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

Weiter gemäß dem Reaktionsschema 2 wird das Diketon der Formel XI umgesetzt mit einem Alkalimetallalkoxid unter Bildung von Mexrenon oder einem anderen Produkt entsprechend der Formel X

wobei jeweils -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII definierte Bedeutung aufweisen und R¹ die in Formel V definierte Bedeutung hat. Das Verfahren erfolgt unter Anwendung des im Wesentlichen gleichen Reaktionsschemas wie es vorstehend für die Umwandlung der Verbindungen der Formel VI zu denjenigen der Formel V beschrieben, wurde. Vorzugsweise entspricht das Substrat der Formel XI der Formel XIA

und das Zwischenprodukt entspricht der Formel XA

wobei jeweils -A-A-, -B-B-, R³, Y¹, Y² und X die in Formel XIIIA gegebene Bedeutung haben und R¹ die in Formel V gegebene Bedeutung aufweist. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

Mexrenon und andere Verbindungen der Formel X werden zunächst 9α-hydrolysiert durch ein neues Bioumwandlungsverfahren unter Bildung von Produkten der Formel IX

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII gegebene Bedeutung haben und R¹ die in Formel V gegebene Bedeutung hat. Unter den Organismen, die in dieser Hydroxylierungsstufe verwendet werden können befinden sind Nocardia conicruria ATCC 31548, Nocardia aurentia ATCC 12674, Corynespora cassiicola ATCC 16718, Streptomyces hydroscopicus ATCC 27438, Mortierella isabellina ATCC 42613, Beauvria bassiana ATCC 7519, Penicillum purpurogenum ATCC 46581, Hypomyces chrysospermus IMI 109891, Thamnostylum piriforme ATCC 8992, Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella elegans ATCC 9245, Trichothecium roseum ATCC 12543, Epicoccum humicola ATCC 12722, Saccharopolyspora eythrae ATCC 11635, Beauvria bassiana ATCC 13144, Arthrobacter simplex, Bacterium cyclooxydans ATCC 12673, Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011 Nocardia aurentia ATCC 12674, Nocardia restrictus ATCC 14887, Pseudomonas testosteroni ATCC 11996, Rhodococcus equi ATCC 21329, Mycobacterium fortuitum NRRL B8119 und Rhodococcus rhodochrous ATCC 19150. Die Reaktion erfolgt im Wesentlichen auf die vorstehend beschriebene Weise im Zusammenhang mit Fig. 1 und 2. Das Verfahren von Fig. 1 wird besonders bevorzugt.

Das bei den Bioumwandlungen verwendete Wachstumsmedium enthält vorzugsweise zwischen etwa 0,05% und etwa 5 Gewichtsprozent verfügbaren Stickstoff; zwischen etwa 0,5% und etwa 5 Gewichtsprozent Glucose; zwischen etwa 0,25% und etwa 2,5 Gewichtsprozent eines Hefederivates und zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent verfügbaren Phosphor. Besonders bevorzugte Wachstumsmedien enthalten folgendes:

Sojabohnenmehl: Zwischen etwa 0,5% und etwa 3 Gewichtsprozent Glucose; zwischen etwa 0,1% und etwa 1 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl; zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent Alkalimetallhalogenid; zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent eines Hefederivates wie autolysierte Hefe oder Hefeextrakt; zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent eines Phosphatsalzes wie K&sub2;HPO&sub4;; pH = 7;

Pepton-Hefeextrakt-Glucose: Zwischen etwa 0,2% und etwa. 2 Gewichtsprozent Pepton; zwischen etwa 0,05% und etwa 0,5 Gewichtsprozent Hefeextrakt und zwischen etwa 2% und etwa 5 Gewichtsprozent Glucose;

Mueller-Hinton: Zwischen etwa 10% und etwa 40 Gewichtsprozent Rinderinfusion; zwischen etwa 0,35% und etwa 8,75 Gewichtsprozent Casaminosäuren; zwischen etwa 0,15% und etwa 0,7 Gewichtsprozent Stärke.

Fungi können gezüchtet werden in Sojabohnenmehl oder Peptonnährstoffen, während Actinomyceten und Eubacterien gezüchtet werden können in Sojabohnenmehl (plus 0,5% bis 1 Gewichtsprozent Carbonsäuresalz wie Natriumformiat für die Bioumwandlungen) oder in Mueller- Hinton Brühe.

Die Produktion von 11β-Hydroxymexrenon aus Mexrenon durch Fermentation wird diskutiert in Beispiel 19B. Ähnliche Bioumwandlungsverfahren können angewandt werden, um andere Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte herzustellen. Beispiel 19A beschreibt die Bioumwandlung von Androstendion zu 11β-Mydroxyandrostendion. Beispiel 19C beschreibt die Bioumwandlung von Mexrenon zu 11α-Hydroxymexrenon, Δ1,2-Mexrenon, 6β-Hydroxymexrenon, 12β-Hydroxymexrenon und 9α-Hydroxymexrenon. Beispiel 19D beschreibt die Bioumwandlung von Canrenon zu Δ9,11-Canrenon.

Die Produkte der Formel IX sind neue Verbindungen, die abgetrennt werden können durch Filtration, gewaschen mit geeignetem organischem Lösungsmittel, z. B. Ethylacetat und umkristallisiert aus dem gleichen oder einem ählichen Lösungsmittel. Sie haben wesentlichen Wert als Zwischenprodukte für die Herstellung von Verbindungen der Formel I und insbesondere der Formel IA. Vorzugsweise entsprechen die Verbindungen der Formel IX der Formel IXA, worin -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R³ Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy ist und R&sup8; und R&sup9; zusammen den 20-Spiroxanring bilden:

In der nächsten Stufe der Schema 2 Synthese wird das Produkt der Formel IX umgesetzt mit einem Dehydratisierungsreagenz (geeignete Dehydratisierungsreagenzien wie PhSOCl oder ClSO&sub3;H sind dem Fachmann bekannt) unter Bildung einer Verbindung der Formel II

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII definierte Bedeutung haben und R³ die in Formel V definierte Bedeutung hat. Vorzugsweise entspricht das Substrat der Formel IX der Formel IXA

und das Zwischenprodukt entspricht der Formel IIA

worin jeweils -A-A-, -B-B-, R³, Y¹, Y² und X die in Formel XIIIA definierte Bedeutung haben und R¹ die in Formel V definierte Bedeutung hat. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

In der Endstufe dieses Syntheseschemas wird das Produkt der Formel II umgewandelt in das der Formel I durch Epoxidierung gemäß der im U.S. Patent 4,559,332 beschriebenen Methode oder vorzugsweise durch die neue Epoxidationsmethode der Erfindung wie vorstehend beschrieben.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verläuft das Gesamtverfahren des Schemas 2 wie folgt:

Schema 3

Die Synthese in diesem Fall beginnt mit einem Substrat entsprechend der Formel XX

worin -A-A- und R³ die in Formel XIII definierte Bedeutung haben, -B-B- die in Formel XIII definierte Bedeutung hat, außer dass weder R&sup6; noch R&sup7; ein Teil eines Ringes sind, der mit dem D Ring in der 16, 17 Position verschmolzen ist und R²&sup6; Niederalkyl, vorzugsweise Methyl ist. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff. Die Reaktion des Substrats der Formel XX mit einem Sulfoniumylid ergibt das Epoxidzwischenprodukt entsprechend der Formel XIX

worin -A-A-, -B-B-, R³ und R²&sup6; die in Fromel XX definierte Bedeutung haben. Vorzugsweise ist Ra Wasserstoff.

In der nächsten Stufe des Syntheseschemas 3 wird das Zwischenprodukt der Formel XIX umgewandelt zu einem weiteren Zwischenprodukt der Formel XVIII

worin -A-A-, -B-B- und R³ die in Formel XX gegebene Bedeutung aufweisen. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff. In dieser Stufe wird das Formel XIX Substrat umgewandelt zu Formel XVIII Zwischenprodukt durch Umsetzung mit NaCH(COOEt)&sub2; in Gegenwart einer Base in einem Lösungsmittel.

Erhitzen der Verbindung der Formel XVIII und Zugabe von Wasser und Alkalihalogenid erzeugt eine decarboxylierte Zwischenproduktverbindung entsprechend der Formel XVII

worin -A-A-, -B-B- und R³ die in Formel XX gegebene Bedeutung aufweisen. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff. Das Verfahren zur Umwandlung der Verbindung der Formel XX zur Verbindung der Formel XVII entspricht im Wesentlichen demjenigen wie in den U.S. Patenten 3,897,417, 3,413,288 und 3,300,489 beschriebenen Verfahren, die ausdrücklich hier durch Bezugnahme enthalten sind. Während die Substrate unterschiedlich sind, sind die Reagenzien, die Mechanismen und die Bedingungen zur Einführung der 17-Spirolactongruppe im Wesentlichen die gleichen.

Die Umsetzung des Zwischenproduktes der Formel XVII mit dem Dehydrierungsreagenz ergibt das weitere Zwischenprodukt der Formel XVI:

worin -A-A-, -B-B- und R³ die in Formel XX definierte Bedeutung haben. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff.

Typischerweise geeignete Dehydrierungsreagenzien umfassen Dichlordicyanobenzochinon (DDQ) und Chloranil (2,3,5,6-Tetrachlor-p-benzochinon). Wahlweise könnte die Dehydrierung erzielt werden durch eine aufeinanderfolgende Halogenierung am 6-Positionskohlenstoff, gefolgt durch Dehydrohalogenierungsreaktion.

Das Zwischenprodukt der Formel XVI wird zunächst umgewandelt in das Enamin der Formel XVB

worin -A-A-, -B-B- und R³ die Bedeutung wie in Formel XX definiert haben. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff. Umwandlung erfolgt durch Cyanidierung im Wesentlichen auf die vorstehend beschriebene Weise für die Umwandlung der 11α-Hydroxyverbindung der Formel VIII zum Enamin der Formel VII. Typischerweise kann die Cyanidionenquelle ein Alkalimetallcyanid sein. Die Base ist vorzugsweise Pyrrolidin und/oder Tetramethylguanidin. Ein Methanollösungsmittel kann verwendet werden.

Die Produkte der Formel XVB sind neue Verbindungen, die isoliert werden können durch Chromatographie. Diese und andere neue Verbindungen der Formel XV haben wesentlichen Wert als Zwischenprodukte zur Herstellung von Verbindungen der Formel I und insbesondere der Formel IA. Verbindungen der Formel XV entsprechen der Struktur

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; die in Formel XIII definierte Bedeutung haben. In den bevorzugtesten Verbindungen der Formel XV und Formel XVB sind -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- und R³ ist Wasserstoff.

Gemäß der vorstehend beschriebenen Hydrolyse zur Herstellung der Diketonverbindungen der Formel VI können die Enamine der Formel XVB umgewandelt werden zu den Diketonen der Formel XIVB

worin -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel XX definiert sind. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff. Besonders bevorzugt für die Synthese von Epoxymexrenon sind diejenigen der Formel XIV, die auch in den Rahmen der Formel XIVB wie nachstehend definiert fallen.

Die Produkte der Formel XIVB sind neue Verbindungen, die durch Ausfällung isoliert werden können. Diese und andere neue Verbindungen der Formel XIV haben wesentlichen Wert als Zwischenprodukte zur Herstellung von Verbindungen der Formel I und insbesondere der Formel IA. Verbindungen der Formel XIV entsprechen der Struktur

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; wie in Formel XIII definiert sind. In den bevorzugtesten Verbindungen der Formel XIV und XIVB sind -A-A- und -B- B- -CH&sub2;-CH&sub2;- und R³ ist Wasserstoff.

Die Verbindungen der Formel XIVB werden weiter umgewandelt zu Verbindungen der Formel XXXI unter Anwendung im Wesentlichen des vorstehend beschriebenen Verfahrens für die Umwandlung des Diketons der Formel VI zum Hydroxyester der Formel V. In diesem Falle ist es erforderlich das Zwischenprodukt XXXI

zu isolieren vor der weiteren Umwandlung zu einem Produkt der Formel XXXII

worin -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel XX definiert sind und R¹ wie in Formel V definiert ist. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff. Bevorzugte Verbindungen der Formel XXXI sind diejenigen, die in die Formel IIA fallen. Die Verbindungen der Formel XXXI werden umgewandelt zu Verbindungen der Formel XXXII unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Methode oder beschrieben in U.S. Patent 4,559,332.

Vorzugsweise ist die Verbindung der Formel XIV 4'S(4'α),7'α-1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',10',12',13',14',15',16'-Hexadecahydro-10β-,13'β-dimethyl- 3',5,20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β-[4,7]methano[17H]-cyclopenta[a]phenanthren]5'-carbonitril und die Verbindung der Formel XV ist 5'R(5'α),7'β-20'-Amino-1',2',3',4,5,6',7',8',10',12',13',14',15',16'- tetradecahydro-10'α(5'H)-[7,4]metheno[4H]-cyclopenta[a]phenanthren]-5'-carbonitril. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verläuft das Gesamtverfahren des Schemas 3 wie folgt:

Schema 4

Die ersten drei Stufen des Schemas 4 sind die Gleichen wie diejenigen von Schema 3, d. h. Herstellung eines Zwischenprodukts der Formel XVII ausgehend von einer Verbindung entsprechend der Formel XX.

Danach wird das Zwischenprodukt der Formel XVII epoxidiert beispielsweise unter Anwendung des Verfahrens des U.S. Patentes 4,559,332, um die Verbindung der Formel XXIV herzustellen

worin -A-A-, -B-B- und R³ die Bedeutung wie in Formel XX haben. Jedoch in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Substrat der Formel XVII epoxidiert über die 9,11-Doppelbindung unter Verwendung eines Oxidationsreagenz, umfassend einen Amid-artigen Peroxidaktivator, am meisten bevorzugt Trichloracetamid gemäß dem vorstehend in Schema 1 beschriebenen Verfahren für die Umwandlung des Enesters der Formel II zum Produkt der Formel I. Die Bedingungen und Proportionen der Reagenzien für diese Reaktion werden im Wesentlichen beschrieben für die Umwandlung des Formel II Enesters zu Epoxymexrenon. Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel XXIV sind diejenigen, worin -A-A- und -B-B- wie in Formel XIII definiert und R³ Wasserstoff ist.

Es wurde gefunden, dass die Epoxidierung des Substrats der Formel XVII außerdem erfolgen kann in sehr guter Ausbeute unter Verwendung einer Persäure wie beispielsweise m- Chlorperoxybenzoesäure. Jedoch liefert das Trichloracetamidreagenz außergewöhnliche Resultate bei der Minimierung der Bildung des Bayer-Villager Oxidationsnebenproduktes. Das letztgenannte Nebenprodukt kann entfernt werden, jedoch erfordert dies Triturierung von einem Lösungsmittel wie Ethylacetat, gefolgt durch Kristallisation aus einem anderen Lösungsmittel wie Methylenchlorid. Die Epoxyverbindung der Formel XXIV wird dehydriert unter Bildung einer Doppelbindung zwischen den 6- und 7-Kohlenstoffen durch Umsetzung mit einem Dehydrierungsmittel (Oxidation) wie DDQ oder Chloranil oder unter Verwendung von Brominierung/Dehydrobrominierung (oder einer anderen Halogenierung/Dehydrohalogenierung) Sequenz, um ein anderes neues Zwischenprodukt der Formel XXIII herzustellen

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; wie in Formel XX definiert sind.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel XXIII sind diejenigen, worin -A-A- und -B- B- wie in Formel XIII definiert sind und R³ Wasserstoff ist.

Während die direkte Oxidation wirksam ist für die Bildung des Produktes von Formel XXIII, sind die Ausbeuten im Allgemeinen gering. Vorzugsweise wird deshalb die Oxidation durchgeführt in zwei Stufen, zuerst Halogenierung des Substrats der Formel XXIV in der C-6 Position, dann Dehydrohalogenierung zum 6,7-Olefin. Halogenierung erfolgt vorzugsweise mit einem N- haloorganischen Reagenz wie beispielsweise N-Bromsuccinamid. Brominierung erfolgt in einem geeigneten Lösungsmittel wie beispielsweise Acetonitril in Gegenwart eines Halogenierungspromoters wie Benzoylperoxid. Die Reaktion verläuft wirksam bei einer Temperatur im Bereich von etwa 50º bis etwa 100ºC, zweckmäßigerweise bei atmosphärischer Rückflußtemperatur in einem Lösungsmittel wie Tetrachlorkohlenstoff, Acetonitril oder Gemische davon. Jedoch ist eine Reaktion von 4 bis 10 Stunden typischerweise erforderlich für die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionslösungsmittel wird abgestreift und der Rückstand in einem Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel aufgenommen, z. B. Ethylacetat. Die dabei entstehende Lösung wird nacheinander gewaschen mit einer milden alkalischen Lösung (wie einem Alkalimetallbicarbonat) und Wasser oder vorzugsweise gesättiger Kochsalzlösung, um Produktverlust zu minimieren, wonach das Lösungsmittel abgestreift wird und der Rückstand in einem anderen Lösungsmittel aufgenommen wird (wie Dimethylformamid), das brauchbar ist für die Dehydrohalogenierungsreaktion.

Ein geeignetes Dehydrohalogenierungsreagenz, beispielsweise 1,4-Diazabicyclo[2,2,2]octan (DABCO) wird der Lösung zugesetzt zusammen mit einem Alkalimetallhalogenid wie LiBr, die Lösung auf eine geeignete Reaktionstemperatur erhitzt, z. B. 60º bis 80ºC und die Reaktion für einige Stunden fortgesetzt, typischerweise 4 bis 15 Stunden, um die Dehydrobrominierung zu beenden. Zusätzliches Dehydrobrominierungsreagenz kann, falls erforderlich, zugesetzt werden während des Reaktionszyklus, um die Reaktion zur Beendigung zu bringen. Das Produkt der Formel XXIII kann dann gewonnen werden z. B. durch Zugabe von Wasser, um das Produkt auszufällen, was dann durch Filtration abgetrennt wird und vorzugsweise gewaschen wird mit weiteren Mengen an Wasser. Das Produkt wird vorzugsweise umkristallisiert, beispielsweise aus Dimethylformamid.

Die Produkte der Formel XXIII, wie 9,11-Epoxycanrenon sind neue Verbindungen, die isoliert werden können durch Extraktion/Kristallisation. Sie haben wesentlichen Wert als Zwischenprodukte für die Herstellung von Verbindungen der Formel I und insbesondere der Formel IA. Beispielsweise können sie verwendet werden als Substrate für die Herstellung der Verbindungen der Formel XXII.

Unter Anwendung von im Wesentlichen des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Verbindungen der Formel VII werden die Verbindungen der Formel XXIII umgesetzt mit einem Cyanidion zur Herstellung neuer Epoxyenaminverbindungen entsprechend der Formel XXII

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; wie in Formel XX definiert sind. Insbesondere bevorzugte Verbindungen der Formel XXII sind diejenigen, worin -A-A- und -B-B- wie in Formel XIII definiert sind und R³ Wasserstoff ist.

Die Produkte der Formel XXII sind neue Verbindungen, die isoliert werden können durch Ausfällung und Filtration. Sie haben wesentlichen Wert als Zwischenprodukte zur Herstellung von Verbindungen der Formel I und insbesondere der Formel IA. In den bevorzugtesten Verbindungen der Formel XXII sind -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- und R³ ist Wasserstoff. Unter Anwendung im Wesentlichen des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Verbindungen der Formel VI werden die Epoxyenaminverbindungen der Formel XXII umgewandelt zu den neuen Epoxydiketonverbindungen der Formel XXI

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; wie in Formel XIII definiert sind. In den bevorzugtesten Verbindungen der Formel XXI sind -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- und R³ ist Wasserstoff.

Die Produkte der Formel XXI sind neue Verbindungen, die isoliert werden können durch Ausfällung und Filtration. Sie haben wesentlichen Wert als Zwischenprodukte zur Herstellung von Verbindungen der Formel I und insbesondere der Formel IA. Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel XXI sind diejenigen, worin -A-A- und -B-B- wie in Formel XIII definiert sind. In den bevorzugtesten Verbindungen der Formel XXI sind -A-A- und -B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- und R³ ist Wasserstoff.

Unter Anwendung im Wesentlichen des Verfahrens wie vorstehend beschrieben zur Herstellung der Hydroxyesterverbindungen der Formel V aus den Diketonverbindungen der Formel VI werden die Epoxydiketonverbindungen der Formel XXI umgewandelt in die Verbindungen der Formel XXXII

worin -A-A-, -B-B- und R³ wie in Formel XX definiert sind und R¹ wie in Formel V definiert ist.

Wie in der Umwandlung des Diketons der Formel V zum Hydroxyester der Formel VI bildet sich ein 5-β-Cyano-7-esterzwischenprodukt ebenfalls bei der Umwandlung des Epoxydiketons der Formel XXI zu Verbindungen der Formel XXXII. Die 5-β-Cyano-7-esterzwischenprodukte in beiden Reihen können isoliert werden durch Behandlung des entsprechenden Diketons mit einem Alkohol wie Methanol in Gegenwart einer Base wie Triethylamin. Vorzugsweise werden die Zwischenprodukte hergestellt durch Rückflußbehandlung eines Gemischs des Diketons in einem Alkohol wie Methanol, enthaltend etwa 0,1 bis etwa 2 Äquivalente Triethylamin je Mol Diketon etwa 4 bis etwa 16 Stunden lang. Die Produkte werden isoliert in reiner Form durch Kühlen des Gemischs auf 25 Grad gefolgt durch Filtration. Die isolierten Zwischenprodukte können umgewandelt werden in die Verbindungen der Formel XXXII bei Behandlung mit einer Base wie ein Alkalimetallalkoxid in einem Lösungsmittel, vorzugsweise ein Alkohol wie Methanol. Verwendung eines Alkoxids in einem Alkohol ergibt ein Gleichgewichtsgemisch ähnlich demjenigen das sich bildet, wenn das entsprechende Diketon der Formel XXI unter den gleichen Bedingungen behandelt wurde.

Außerdem wurde der 7β-Ester der Verbindung von Formel XXXII (beispielsweise 7-Methylhydrogen-9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7β,21-dicarboxylat, γ-Lacton) beobachtet durch Chromatographie im Rohprodukt der letzten Verfahrensstufe von Schema 4. Alkoxid und/oder Cyanid in der Lösung reagiert und wandelt den 7α-Ester in ein epimeres Gemisch von 7α-Ester und dessen 7β-Esterepimer um. Der reine 7β-Ester kann isoliert werden aus dem epimeren Gemisch durch selektive Kristallisation.

Vorzugsweise ist die Verbindung der Formel XXI 4'S(4'α),7'α-9',11α-Epoxyhexadecahydro-10β-,13'β-dimethyl-3'5,20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β- [4,7]methano[17H]-cyclopenta[a]phenanthren-5'-carbonitril; die Verbindung der Formel XXII ist 5'R(5'α),7'β-20'-Amino-9,11B-epoxyhexadecahydro-10',13'-dimethyl-3',5-dioxospiro[furan- 2(3H),17'a(5'H)-[7,4]methen[4H]cyclopenta[a]phenanthren-5'-carbonitril und die Verbindung der Formel XXIII ist 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregna-4,6-dien-21-carbonsäure, γ-Lacton.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verläuft das Gesamtverfahren von Schema 4 wie folgt:

Schema 5

Das Verfahren des Schemas 5 beginnt mit einem Substrat entsprechend der Formel XXIX

worin -A-A-, -B-B- und R³ definiert sind wie in Formel XX. Die folgenden Mikroorganismen sind in der Lage die 9α-Hydroxylierung einer Verbindung der Formel XXXV durchzuführen (wie Androstendion)

worin -A-A-, -B-B- und R³ definiert sind wie in Formel XIII zu einer Verbindung der Formel XXIX unter Bedingungen ähnlich denjenigen, wie sie in Beispiel 19B beschrieben werden:

Asperigillus niger ATCC 16888 und 26693, Corynespora cassiicola ATCC 16718, Curvularia clavata ATCC 22921, Mycobacterium fortuitum NRRL B8119, Nocardia canicruria ATCC 31548, Pycnosporium spp. ATCC 12231, Stysanus microsporus ATCC 2833, Syncephalastrum racemosum ATCC 18192 und Thamnostylum piriforme ATCC 8992.

Das Substrat entsprechend der Formel XXIX wird umgewandelt zum Produkt der Formel XXVIII

durch Reaktion mit Trimethylorthoformiat, worin -A-A-, -B-B- und R³ definiert sind wie in Formel XX. Nach der Bildung der Verbindungen der Formel XXVIII werden diese Verbindungen umgewandelt in die Verbindungen der Formel XXVII unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Methode für die Umwandlung des Substrats der Formel XX zu Formel XVII. Verbindungen der Formel XXVII haben die Struktur:

worin -A-A-, -B-B- und R³ definiert sind wie in Formel XX und RX eine der üblichen Hydroxyschutzgruppen ist. Wahlweise kann die C9 α-Hydroxygruppe geschützt werden in einer früheren Stufe dieses Syntheseschemas, wenn Schutz in dieser Stufe gewünscht wird, d. h. das C9 Hydroxy der Verbindung der Formel XXVIII oder das C9 Hydroxy der Verbindung der Formel XXIX kann geschützt werden mit irgendeinem der üblichen Hydroxyschutzgruppen.

Unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Methode für die Herstellung der Verbindungen der Formel XVI werden Verbindungen der Formel XXVII oxidiert unter Bildung von neuen Verbindungen entsprechend der Formel XXVI

worin -A-A-, -B-B- und R³ definiert sind wie in Formel XX. Besonders bevorzugte Verbindungen der Formeln XXIX, XXVIII, XXVII und XXVI sind diejenigen, worin -A-A- und -B-B- definiert sind wie in Formel XIII und R³ Wasserstoff ist.

Die Produkte der Formel XXVI sind neue Verbindungen, die isoliert werden können durch Ausfällung/Filtration. Sie besitzen wesentlichen Wert als Zwischenprodukte für die Herstellung von Verbindungen der Formel I und insbesondere der Formel IA. Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel XXVI sind diejenigen, worin -A-A- und -B-B- definiert sind wie in Formel XIII und R³ Wasserstoff ist. In den am meisten bevorzugten Verbindungen der Formel XXVI sind -A-A- und -B- B- -CH&sub2;-CH&sub2;- und R³ ist Wasserstoff.

Unter Anwendung der vorstehend definierten Methode für die Cyanidierung von Verbindungen der Formel VIII werden die neuen Zwischenprodukte der Formel XXVI umgewandelt in die neuen 9-Hydroxyenaminzwischenprodukte der Formel XXV

worin -A-A-, -B-B- und R³ definiert sind wie in Formel II.

Die Produkte der Formel XXV sind neue Verbindungen, die isoliert werden können durch Ausfällung/Filtration. Sie besitzen wesentlichen Wert als Zwischenprodukte für die Herstellung von Verbindungen der Formel I und insbesondere der Formel IA. Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel XXB sind diejenigen, worin -A-A- und -B-B- definiert sind wie in Fromel XIII und R³ Wasserstoff ist. In den meist bevorzugten Verbindungen der Formel XXVI sind -A-A- und -B-B- - CH&sub2;-CH&sub2; und R³ ist Wasserstoff.

Unter Anwendung im Wesentlichen der vorstehend beschriebenen Bedingungen für die Herstellung der Diketonverbindungen der Formel VI werden die 9-Hydroxyenaminzwischenprodukte der Formel XXV umgewandelt in die Diketonverbindungen der Formel XIVB. Es sei bemerkt, dass in diesem Falle die Reaktion wirksam ist für die simultane Hydrolyse der Enaminstruktur und Dehydratisierung an den 9,11-Positionen zur Einführung der 9,11 Doppelbindung. Die Verbindung der Formel XIV wird dann umgewandelt in die Verbindung der Formel XXXI und somit zu der Verbindung der Formel XIII, unter Anwendung der gleichen Stufen, wie sie vorstehend in Schema 3 beschrieben wurden.

Vorzugsweise ist die Verbindung der Formel XIV 4'S(4'α),7'α-1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',10',12',13',14',15',16',Hexadecahydro-10β-,13'β-dimethyl- 3',5,20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β-[4,7]methano[17H]-cyclopenta[a]phenanthren]5'carbonitril; die Verbindung der Formel XXV ist 5'R(5'α),7'β-20'-Aminohexadecahydro-9'β-hydroxy-10'a,13'α- dimethyl-3',5-dioxospiro[furan-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]metheno[4H]cyclopenta[a]phenanthren]-5'- carbonitril; die Verbindung der Formel XXVI ist 9α,17α-Dihydroxy-3-oxopregna-4,6-dien-21- carbonsäure, γ-Lacton und die Verbindung der Formel XXVII ist 9α,17α-Dihydroxy-3-oxopregn-4-en- 21-carbonsäure, γ-Lacton.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verläuft das Gesamtverfahren von Schema 5 wie folgt:

Schema 6

Schema 6 liefert eine vorteilhafte Methode zur Herstellung von Epoxymexrenon und anderen Verbindungen entsprechend der Formel I, ausgehend von der 11α- oder 11β- Hydroxylierung von Androstendion oder anderen Verbindungen der Formel XXXV

worin -A-A-, -B-B- und R³ definiert sind wie in Formel XIII, unter Bildung eines Zwischenproduktes entsprechend der Formel XXXVI oder dessen entsprechendes 11β-Hydroxyisomer

worin -A-A-, -B-B- und R³ definiert sind wie in Formel XIII. Außer für die Auswahl des Substrates ist das Verfahren zur Durchführung der 11α-Hydroxylierung im Wesentlichen wie vorstehend für Schema 1 beschrieben. Die folgenden Mikroorganismen sind in der Lage die 11α-Hydroxylierung von Androstendion oder anderen Verbindungen der Formel XXXV durchzuführen:

Absidia glauca ATCC 22752, Aspergillus flavipes ATCC 1030, Asgergillus foetidus ATCC 10254, Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500), Asperpillus niger ATCC 1-1394, Aspergillus nidulans ATCC 11267, Beauveria bassiana ATCC 7159, Fusarium oxysporum ATCC 7601, Fusarium oxysporum cepae ATCC 11171, Fusarium lini ATCC IFO 7156, Gibberella fujikori ATCC 14842, Hypomyces chyrsospermus IMI 109891, Mycobaterium fortuitum NRRL B8119, Penicillum patulum ATCC 2455, Pycnosporium spp. ATCC 12231, Rhizopus arrhizus ATCC 11145, Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635, Thamnostylum piriforme ATCC 8992, Rhizopus oryzae ATCC 11145, Rhizopus stolonifer ATCC 6227b und Trichothecium roseum ATCC 12519 und ATCC 8685.

Die folgenden Mikroorganismen sind in der Lage die 11β-Hydroxylierung von Androstendion oder anderen Verbindungen der Formel XXXV durchzuführen:

Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Aspergillus niger ATCC 16888 und ATCC 26693, Epicoccum oryzae ATCC 7156, Curvularia lunata ATCC 12017, Cunnghamella blakesleeana ATCC 8688a und Pithomyces atro-olivaceous IFO 6651.

11α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion oder eine andere Verbindung der Formel XXXVI wird zunächst umgewandelt zum 11α-Hydroxy-3,4-enolether der Formel (101):

worin -A-A-, -B-B- und R³ definiert sind wie in Formel XIII und R¹¹ Methyl oder ein anderes Niederalkyl ist (C&sub1; bis C&sub4;) durch Reaktion mit einem Veresterungsreagenz wie Trialkylorthoformiat in Gegenwart eines sauren Katalysators. Um diese Umwandlung durchzuführen, wird das 11α- Hydroxysubstrat angesäuert durch Vermischen mit einer Säure wie z. B. Benzolsulfonsäurehydrat oder Toluolsulfonsäurehydrat und gelöst in einem niederen Alkohollösungsmittel, vorzugsweise Ethanol. Ein Trialkylorthoformiat, vorzugsweise Triethylorthoformiat, wird nach und nach binnen einer Zeitspanne von 5 bis 40 Minuten eingeführt, während das Gemisch kalt gehalten wurde, vorzugsweise bei etwa 0ºC bis etwa 15ºC. Das Gemisch wird dann erwärmt und die Reaktion bei einer Temperatur zwischen 20ºC und etwa 60ºC durchgeführt. Vorzugsweise erfolgt die Reaktion bei 30º bis 50ºC 1 bis 3 Stunden lang, wird dann auf Rückfluß einen weiteren Zeitabschnitt, typischerweise 2 bis 6 Stunden, erhitzt, um die Reaktion zu beenden. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt, vorzugsweise auf 0º bis 15ºC, vorzugsweise etwa 5ºC und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt.

Unter Anwendung des gleichen Reaktionsschemas wie in vorstehendem Schema 3 beschrieben für die Umwandlung der Verbindung der Formel XX zur Verbindung der Formel XVII wird ein, 17-Spirolactonrest der Formel XXXIII eingeführt in die Verbindung der Formel 101. Beispielsweise kann das Formel 101 Substrat umgesetzt werden mit einem Sulfoniumylid in Gegenwart einer Base wie einem Alkalimetalihydroxid in einem geeigneten Lösungsmittel wie DMSO, um ein Zwischenprodukt entsprechend der Formel 102 herzustellen:

worin -A-A-, R³, R¹¹ und -B-B- definiert sind wie in Formel 101. Das Zwischenprodukt der Formel 102 wird dann umgesetzt mit einem Malonsäurediester in Gegenwart eines Alkalimetallalkoxids unter Bildung des fünf-gliedrigen Spirolactonringes und Herstellung des Zwischenproduktes der Formel 103

worin -A-A-, R³, R¹¹ und -B-B- definiert sind wie in Formel 102 und R¹² ein C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist, vorzugsweise Ethyl. Schließlich wird die Verbindung der Formel 103 in einem geeigneten Lösungsmittel wie Dimethylformamid Hitze unterworfen in Gegenwart eines Alkalimetallhalogenids, wobei die Alkoxycarbonylgruppe abgespalten wird und das Zwischenprodukt der Formel 104 hergestellt wird:

worin wiederum -A-A-, R³, R¹¹ und -B-B- definiert sind wie in Formel 102.

Danach wird die 3,4-Enoletherverbindung umgewandelt in die Verbindung der Formel XXIII, d. h. die Verbindung der Formel VIII, worin R&sup8; und R&sup9; zusammen die Gruppe der Formel XXXII bilden. Diese Oxidationsstufe erfolgt im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie die Oxidationsstufe für die Umwandlung der Verbindung der Formel XXIV zum Zwischenprodukt der Formel XXIII in der Synthese von Schema 4. Direkte Oxidation kann erfolgen unter Verwendung eines Reagenz wie 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-1,4-benzochinon (DDQ) oder Tetrachlorbenzochinon (Chloranil) oder vorzugsweise wird eine Zwei-Stufen-Oxidation durchgeführt durch zuerst Bromierung, d. h. mit einem N-Halobromierungsmittel wie N-Bromsuccinamid (NBS) oder 1,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin (DBDMH) und dann Dehydrobromierung mit einer Base, beispielsweise mit DABCO in Gegenwart von LiBr und Erhitzen. Wo NBS für die Bromierung verwendet wurde muss außerdem eine Säure verwendet werden, um den 3-Enolether zum Enon umzuwandeln. DBDMH und ein ionisches anstelle eines freie Radikal Bromierungsmittel ist selbst wirksam für die Bromierung und Umwandlung des Enolethers zum Enon.

Die Verbindung der Formel VIII wird dann umgewandelt zum Epoxymexrenon oder einer anderen Verbindung der Formel I durch die vorstehend beschriebenen Stufen für Schema 1.

Jedes der Zwischenprodukte der Formeln 101, 102, 103 und 104 ist eine neue Verbindung mit wesentlichem Wert als ein Zwischenprodukt für Epoxymexrenon oder anderen Verbindungen der Formeln IA und I. In jeder der Verbindungen der Formeln 101, 102, 103 und 104 sind -A-A- und -B- B- vorzugsweise -CH&sub2;-CH&sub2;- und R³ ist Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy. Vorzugsweise ist R³ Wasserstoff. Am meisten bevorzugt ist die Verbindung der Formel 101 3-Ethoxy-11α- hydroxandrost-3,5-dien-17-on, die Verbindung der Formel 102 ist 3-Ethoxyspiro[androst-3,5-dien- 17β,2'-oxiran]-11α-ol, die Verbindung der Formel 103 ist Ethylhydrogen-3-ethoxy-11α-17α- dihydroxypregna-3,5-dien-21,21-dicarboxylat, gamma-lacton und die Verbindung der Formel 104 ist 3-Ethoxy-11α-17α-dihydroxypregna-3,5-dien-21-carbonsäure, gamma-lacton.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verläuft das Gesamtverfahren von Schema 6 wie folgt:

Es wird angenommen, dass Epoxymexrenon und andere Verbindungen entsprechend der Formel I ebenfalls hergestellt werden können aus 11β-Hydroxyandrostendion oder anderen Verbindungen der Formel XXXV, die 11β-hydroxyliert wurden. Mit anderen Worten können Epoxymexrenon und andere Verbindungen entsprechend der Formel I hergestellt werden gemäß dem allgemeinen Verfahren wie in Schema 6 dargelegt unter Verwendung von entweder einem α- hydroxylierten Substrat der Formel XXXV oder dem entsprechenden β-hydroxylierten Substrat.

Schema 7

Schema 7 dient der Synthese von Epoxymexrenon und anderen Verbindungen der Formel I, unter Verwendung eines Ausgangssubstrats, umfassend β-Sitosterol, Cholesterol, Stigmasterol oder anderen Verbindungen der Formel XXXVII

worin -A-A-, R³ und -B-B- definiert sind wie in Formel XIII; D-D -CH&sub2;-CH&sub2;- oder -CH=CH- ist und jedes von R¹³, R¹&sup4;, R¹&sup5; und R¹&sup6; unabhängig voneinander ausgewählt ist aus Wasserstoff oder C&sub1; bis C&sub4; Alkyl. R³ ist vorzugsweise Wasserstoff.

In der ersten Stufe der Synthese wird 11α-Hydroxyandrostendion oder eine andere Verbindung der Formel XXXVI hergestellt durch Bioumwandlung der Verbindung der Formel XXXVII. Das Bioumwandlungsverfahren erfolgt im Wesentlichen gemäß der vorstehend beschriebenen Methode für die 11α-Hydroxylierung von Canrenon (oder anderem Substrat der Formel XIII).

In der Synthese wird 11α-Hydroxyandrostendion, 4-Androsten-3,17-dion zunächst hergestellt durch Bioumwandlung der Verbindung der Formel XXXVII. Diese anfängliche Bioumwandlung kann erfolgen auf die in U.S. Patent 3,759,791 beschriebene Weise, die ausdrücklich durch Bezugnahme hierin enthalten ist. Danach wird 4-Androsten-3,17-dion umgewandelt zum 11α-Hydroxyandrostendion im Wesentlichen gemäß der vorstehend beschriebenen Methode für die 11α-Hydroxylierung von Canrenon (oder einem anderen Substrat der Formel XIII).

Der Schluß der Synthese von Schema 7 ist identisch mit Schema 6. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verläuft das Gesamtverfahren von Schema 7 wie folgt:

Es wird angenommen, dass Epoxymexrenon und andere Verbindungen entsprechend der Formel I ebenfalls hergestellt werden können gemäß dem allgemeinen Verfahren, wie es in Schema 7 dargelegt ist, wenn das Produkt der Bioumwandlung von β-Sitosterol oder anderen Verbindungen der Formel XXXVIII 11β-Hydroxyandrostendion oder andere Verbindungen der Formel XXXV, die 11β-hydroxyliert wurden sind. Mit anderen Worten, Epoxymexrenon und andere Verbindungen entsprechend der Formel I können hergestellt werden gemäß dem allgemeinen Verfahren, wie in Schema 7 dargelegt, wenn die Bioumwandlung von β-Sitosterol oder anderen Verbindungen der Formel XXXVIII in der Herstellung von entweder einem α-hydroxylierten Substrat der Formel XXXV oder dem entsprechenden β-hydroxylierten Substrat resultieren.

Schema 8

Eine wesentliche Komplikation bei der Synthese von Epoxymexrenon und verwandten Verbindungen ist die Notwendigkeit der stereoselektiven Einführung eines α-Alkoxycarbonylsubstituenten am 7-Kohlenstoff, ohne unerwünschte Modifikationen an anderen Stellen der steroidalen Struktur. Gemäß der Erfindung wurde entdeckt, dass ein wirksamer Syntheseweg für die Einführung eines 7α-Alkoxycarbonylsubstituenten folgende Stufen umfaßt: (i) Anfängliche Cyanidierung am 7-Kohlenstoff des Steroids, (ii) Hydrolyse des 7-Cyanosteroids unter Bildung eines Gemischs aus 7α-Carbonsäure und 7β-Carbonsäuresteroiden, (iii) Bildung eines 5,7-Lactonsteroids aus dem 7α-Carbonsäuresteroid und (iv) Abtrennung des 7β-Carbonsäuresteroids vom 5,7- Lactonsteroid. Eine Basen-vermittelte Öffnungsreaktion des 5,7-Lactonsteroids mit einem Alkylierungsreagenz erzeugt das gewünschte 7α-Alkoxycarbonylsteroid.

Demgemäß ist das Verfahren von Schema 8 allgemein gerichtet auf ein Verfahren zur Herstellung eines 3-Keto-7α-alkoxycarbonylsubstituierterten Δ4,5-Steroids, umfassend die Umsetzung eines Alkylierungsmittels mit einem 3-Keto-4,5-dihydro-5,7-lactonsteroidsubstrats in Gegenwart einer Base. Das Lactonsubstrat ist substituiert mit Keto am 3-Kohlenstoff und umfaßt weiterhin die Gruppe:

worin C(5) den 5-Kohlenstoff darstellt und C(7) den 7-Kohlenstoff der Steroidstruktur des Substrats darstellt. Umwandlung des 5,7-Lactons zum 7α-Alkoxycarbonyl erfolgt vorzugsweise durch Reaktion mit einem Alkylhalogenid in Gegenwart der Base. Das Alkylhalogenidreagenz ist vorzugsweise Iodid, am meisten bevorzugt Methyliodid.

Außerdem gemäß der Erfindung ist ein vorteilhaftes Verfahren entdeckt worden für die Herstellung der 4,5-Dihydro-5,7-lactonsteroidverbindung vorstehend beschrieben. In diesem Verfahren wird ein 3-Keto-Δ4,5-7α-cyano substituiertes Steroidsubstrat umgewandelt zur 7- Carbonsäure und die Säure ihrerseits reagiert mit dem Trialkylorthoformiat in einem angesäuerten Niederalkohollösungsmittel unter Bildung des 5,7-Lactons. Umsetzung mit Orthoformiatestern wandeln ebenfalls die 3-Ketogruppe zum 3-acyclischen oder cyclischen Ketal-5,7-lacton um (es muss verstanden werden, dass das Lacton sich zuerst bildet). Vorzugsweise ist das 3-Ketal 5,7- lacton ein 3-Dialkylketal-5,7-lacton. Bevorzugtererweise ist die Alkylgruppe des Alkohollösungsmittels die Gleiche wie die Alkylgruppe der Orthoformiatalkoxygruppen (und am meisten bevorzugt sind alle Methyl) weil: Die Alkoxygruppen des Ketals entweder vom Orthoformiat oder vom Alkohol stammen können; gemischte Ketale nicht bevorzugt sind und 3-Dimethoxy bevorzugt wird. Wo das Ketal ein Ethylenketal ist, braucht die Alkylgruppe des Alkohollösungsmittels nicht die gleiche zu sein wie die Alkylgruppe der Orthoformiatalkoxygruppen. Das 3-Ketal-5,7-lacton wird leicht hydrolysiert zum 3-Keto-5,7-lacton, eine kristalline Verbindung, die leicht gereinigt werden kann. Da nur die 7α-Carbonsäure der Lactonisierungsreaktion unterliegt, wird eine vollständige Stereospezifität realisiert. Die 7β-Säure kann dann entfernt werden vom Reaktionsgemisch in Form ihres Salzes, beispielsweise durch Behandlung der 7-Säure mit einer milden Base wie Natriumbicarbonat.

Das 7-Cyanosubstrat zur Bildung des 5,7-Lactons kann auf bekannte Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann ein Substrat, das am 7-Kohlenstoff nicht substituiert ist, umgesetzt werden mit einem schwachen Überschuss des Cyanidions, vorzugsweise etwa 1,05 bis etwa 1,25 Äquivalente je Äquivalent Substrat in einer schwach sauren Lösung, umfassend ein Wasser/DMSO Lösungsmittelgemisch. Vorzugsweise umfaßt das Reaktionsgemisch eine Carbonsäure, z. B. etwa ein Äquivalent Essigsäure je Äquivalent Substrat. Es werden beide, das 7α- und 7β-CN Isomer gebildet, wobei das 7α-Isomer das Hauptisomer ist. Das 7α-Cyanosteroid kann gewonnen werden auf übliche Weise. Andere in der Technik bekannte Methoden sind bei dieser untergeordneten Herstellung brauchbar.

Im Allgemeinen kann gemäß Schema 8 das 5,7-Lacton gebildet werden aus einem 7- Carboxyzwischenprodukt (welches als solches hergestellt wird durch Hydrolysieren eines 7- Cyanozwischenproduktes), das substituiert ist an der 17-Position mit entweder Keto, R&sup8; oder R&sup9;, worin R&sup8; und R&sup9; wie vorstehend beschrieben sind und die entweder eine aliphatische, olefinische, Epoxid- oder Hydroxy-substituierte Konfiguration aufweisen am C-9 und C-11, d. h.

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben, R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; das Gleiche sind wie R&sup8; und R&sup9; oder R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen Keto bilden und R¹&sup8; wie nachstehend beschrieben mit Bezug auf Schema 9 und -E-E- ausgewählt ist aus

Die Verbindung der Formel XLII wird dann umgewandelt zum 7α-Alkoxy-carbonyl:

wobei in jedem von XL, XLI, XLII und XLVIII, R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen vorzugsweise Keto umfassen oder

worin Y¹, Y², X und C(17) vorstehende Bedeutung haben und am meisten bevorzugt R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen

umfassen, wobei R³ vorzugsweise H ist, R¹ vorzugsweise Methoxycarbonyl ist und -A-A- und -B-B- jeweils vorzugsweise -CH&sub2;-CH&sub2;- sind. Es muss verstanden werden, dass die Reaktionen auch erfolgen können mit der 3-Ketogruppe, geschützt durch Umwandlung derselben zu und Beibehaltung derselben in jeweils der Ether- oder Ketalform während des Reaktionsablaufs.

Alternative Verfahren von Schema 8 umfassen die Verwendung von verschiedenen Zwischenprodukten innerhalb des Rahmens der Formel XLI und XLII wie vorstehend angegeben.

Bei der Feststellung, dass das Reagenz zur Bildung des 5,7-Lactons aus der 3-Keto-Δ4,5-7- carbonsäure gemäß Schema 8 das Trialkylorthoformiat ist, das gleiche Reagenz, das bei der Umwandlung des 11α-Hydroxyandrostendion zum 3-Enolether-3,5-dien-11α-hydroxy-Zwischenprodukt 101 von Schema 6 verwendet wurde, ist anzunehmen, dass der Weg der Schema 8 Reaktion abhängig ist von der Substituierung am C-7. Reaktion mit Orthoformiat in Gegenwart von H bildet ein Zwischenprodukt Carboniumion mit einem Carboxyl am C-7 und einer positiven Ladung im Gleichgewicht zwischen C-3 und C-5. Beim Verlust des Protons ergibt das C-3 Carboniumion die Verbindung der Formel 101, während das C-5 Carboniumion das Lacton ergibt. Mit Wasserstoff am C-7 wird angenommen, dass 3,5-Dien-3-alkoxy (Enolether) favorisiert wird wegen der Doppelbindungkonjugation. Mit dem 7α-CO&sub2; Substituenten am C-7 wird das C-5 Carboniumion eingefangen durch das Carboxy und es bildet sich das 5,7-Lacton. An diesem Punkt wird die 3- Ketogruppe vorzugsweise umgewandelt zum Ketal, wodurch die Reaktion zur Beendigung geführt wird.

Bevorzugte Ausführungsformen von Schema 8 werden beschrieben in nachstehenden Schemen 9 und 10.

Schema 9

Schema 9 beginnt mit dem gleichen Substrat wie Schema 4, d. h. der Verbindung von Formel XX. Dieses Substrat wird zuerst oxidiert zur Verbindung der Formel B:

worin -A-A-, R³ und -B-B- definiert sind wie in Formel XIII. Die Oxidationsreaktion erfolgt gemäß irgendeinem der vorstehenden Reaktionsschemen für die Umwandlung der Verbindung der Formel XXIV zum Zwischenprodukt der Formel XXIII in der Synthese von Schema 4. Unter Anwendung der für Schema 8 beschriebenen Methoden wird die Verbindung von Formel B umgewandelt zum 7- Cyano-Zwischenprodukt von Formel C:

worin -A-A-, R³ und -B-B- definiert sind wie in Formel XIII. Danach wird die Verbindung der Formel C umgewandelt zum 5,7-Lacton der Formel D:

worin -A-A-, R³ und -B-B- definiert sind wie in Formel XIII und R¹¹ C&sub1;-C&sub4;-Alkyl ist unter Verwendung des Trialkylorthoformiat-Reagenz, das im vorangegangenen Schema 6 verwendet wurde. Das 5,7- Lacton der Formel D wird leicht abgetrennt vom nicht-umgesetzten 7-β-COOH, z. B. durch Entfernen der Säure über eine Bicarbonatwaschung, wobei die gewünschte C-7 Stereochemie geschaffen wird und die Epimerisierung in den anschließenden Reaktionen vermieden wird, die unter basischen Bedingungen erfolgen. Veresterung des Lactons durch Reaktion mit Alkylhalogenid wie in Schema 8 beschrieben ergibt das Enester-Zwischenprodukt der Formel II.

In Fortsetzung der Schema 9 Synthese wird die Verbindung der Formel D umgewandelt zur Verbindung von Formel II. Mit der geschützten 3-Ketogruppe, die zum Ketal umgewandelt worden ist, wird eine 20-Spiroxangruppe der Formel XXXIII selektiv in die 17-Position eingeführt gemäß dem vorstehend beschriebenen Reaktionsschema für Schemen 3 und 6, wodurch eine Verbindung der Formel E hergestellt wird

Da das 3-Keton geschützt ist, können die Hydrolysebedingungen ausgewählt werden, die optimal sind für den Angriff des 17-Ketons ohne die Bildung von Nebenprodukten zu befürchten durch Reaktion an der 3-Position. Nach Hydrolyse der 3-Ketalverbindung von Formel E zur 3- Ketogruppenstruktur der Formel F

wird das letztere Zwischenprodukt umgesetzt mit Alkyliodid in Gegenwart einer Base gemäß der Umwandlung von Schema 8 unter Bildung des Zwischenprodukt-Enesters der Formel II. Schließlich wird das letztere Zwischenprodukt umgewandelt zum Epoxymexrenon oder einer anderen Verbindung der Formel I, unter Anwendung einer der vorstehend beschriebenen Methoden für Schema 1.

Schema 9 profitiert nicht nur von der Kontrolle der Stereochemie, die durch das 5,7-Lacton- Zwischenprodukt geleistet wird, sondern erfreut sich des weiteren Vorteils, dass größere Bereiche von Hydrolysebedingungen gestattet sind ohne Störung des 17-Spirolactons.

Genau wie die Reaktion für andere Syntheseschemen dieser Erfindung können die Reaktionen von Schema 9 angewandt werden zur Umwandlung von anderen Substraten als diejenigen, die besonders vorstehend beschrieben wurden. Somit kann die Umwandlung von 3- Keto- oder 3-Ketal-7-Cyanosteroiden zu 3-Keto- oder 3-Ketal-5,7-lacton oder die Umwandlung des 3-Keto- oder 3-Ketal-5,7-lactons zu 7α-Alkoxycarbonyl durchgeführt werden bei Verbindungen, die am 17-Kohlenstoff substituiert sind durch R&sup8; und R&sup9; wie vorstehend definiert oder insbesondere bei einem Substituenten der Formel:

worin X, Y und Y vorstehende Bedeutung haben und C(17) das 17-Kohlenstoff anzeigt. Jedoch werden wichtige Vorteile realisiert, insbesondere bei der Verfahrenswirtschaftlichkeit durch Anwendung der spezifischen Reaktionsfolge unter Verwendung von 17-Keto-Substraten und gemäß dem spezifischen Reaktionsschema vorstehend beschrieben für die Einführung von 17-Spirolacton und 7α-Alkoxycarbonyl in ein 3-Keto-Δ9,11 Steroid.

Die Lactone der Formeln D, E und F sind neue Verbindungen, die sich bei der Herstellung von Epoxymexrenon und anderen Verbindungen der Formel I und IA eignen gemäß der Synthese von Schema 9. In diesen Verbindungen sind -A-A- und -B-B- vorzugsweise -CH&sub2;-CH&sub2;- und R³ ist Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy. Die am meisten bevorzugte Verbindung der Formel D ist diejenige, worin R¹¹ Methoxy ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verläuft das Gesamtverfahren von Schema 9 wie folgt:

Schema 10

Schema 10 ist das Gleiche wie Schema 9 bis zur Bildung des 7-Cyano-Zwischenproduktes von Formel C. In der nächsten Stufe von Schema 10 wird 7-Cyanosteroid umgesetzt mit Trialkylorthoformiat in einem Alkanollösungsmittel, vorzugsweise Trimethylorthoformiat in Methanol, um gleichzeitig die 3-Keto- und 17-Keto-Gruppen zu schützen, durch Umwandlung des Ersteren zum Enolether und das Letztere zum Ketal. Danach wird die 7-Cyanogruppe reduziert zu 7-Formyl, z. B. durch Reaktion mit einem Dialkylaluminiumhydrid, vorzugsweise Diisobutylaluminiumhydrid, wodurch eine Verbindung der Formel 203 hergestellt wird:

worin -A-A-, R³ und -B-B- definiert sind wie in Formel XIII und R¹&sup8; C&sub1;-C&sub4;-Alkyl ist. Das vorherige Schützen der Ketogruppen wie vorstehend beschrieben verhindert deren Reduktion durch das Dialkylaluminiumhydrid. Das Zwischenprodukt von Formel 203 wird dann umgesetzt mit verdünnter wässriger Säure, um selektiv das 17-Ketal zu hydrolysieren in Gegenwart von überschüssigem Alkohol (R¹&sup9;OH), wobei das Zwischenprodukt von Formel 204 hergestellt wird:

worin R¹&sup9; ausgewählt ist aus Niederalkyl (vorzugsweise C&sub1; bis C&sub4;) oder die R¹&sup9; Gruppe an der 3- Position einen cyclischen O,O-Oxyalkylenoxysubstituenten am 3-Kohlenstoff bildet. Das Hemiacetal [204] wird weiter geschützt durch Behandlung mit Alkanol (R²&sup0;OH) in Gegenwart einer nicht- wässrigen Säure, um das Zwischenprodukt der Formel 205 herzustellen:

worin -A-A-, -B-B-, R³ und R¹&sup9; vorstehende Bedeutung haben und R²&sup0; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist. Die 17-Spirolactongruppe kann dann eingeführt werden gemäß den vorstehend beschriebenen Reaktionsstufen für Schemen 3 und 6, was gemäß der nachstehenden Reihenfolge geschieht:

worin -A-A-, -B-B-, R³, R¹&sup9; und R²&sup0; vorstehende Bedeutung haben und R²&sup5; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist.

Danach wird von der 3-Position die Schutzgruppe entfernt durch übliche Hydrolyse, um die 3-Ketogruppe und 5,7-Hemiacetal einzuführen, wobei das weitere Zwischenprodukt entsprechend der Formel 209 hergestellt wird:

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben. Danach wird eine 9,11-Epoxygruppe eingeführt gemäß irgendeiner der vorstehend beschriebenen Methoden zur Umwandlung der Verbindungen der Formel II zu den Verbindungen der Formel I. Unter den Oxidationsbedingungen der Epoxidierungsreaktion wandelt sich das Hemiacetal teilweise zum 5,7-Lacton um, wodurch ein weiteres Zwischenprodukt entsprechend der Formel 211 hergestellt wird

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben. Irgendwelches rückständiges 9,11-Epoxy- 5,7-hemiacetal-Zwischenprodukt-Reaktionsprodukt der Formel 210

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben, wird leicht oxidiert durch übliche Maßnahmen zur Verbindung der Formel 211. Schließlich wird das Zwischenprodukt der Formel 211 umgewandelt zum Epoxymexrenon oder einer anderen Verbindung der Formel I unter Anwendung der in Schema 8 beschriebenen Methode zur Umwandlung des 5,7-Lactons zur 7α- Alkoxycarbonylverbindung. Somit verläuft das Gesamtschema 10 wie folgt, wobei verstanden werden muß, dass mindestens die folgenden Stufen in situ ausgeführt werden können ohne Gewinnung des Zwischenprodukts. Insgesamt verläuft die Synthese von Schema 10 wie folgt:

Wie im Fall von Schema 9 bieten die vorstehend für Schema 10 beschriebenen Reaktionen wichtige Fortschritte, insbesondere mit Bezug auf Verfahrenswirtschaftlichkeit, jedoch haben die neuen Reaktionen von Schema 10 auch mehr generische Anwendung zu anderen Substraten als die besonders beschriebenen. Beispielsweise kann die Einführung der 7-Formylgruppe in ein 3- Enolethersteroid, Schützen des dabei entstehenden 7-Formyl-Δ-5,6-3,4-enolethers, Hydrolyse zum 5,7-Hemiacetal und anschließende Entfernung der Schutzgruppe durchgeführt werden an Steroiden, die substituiert sind an der 17-Position durch R&sup8; und R&sup9; wie vorstehend definiert oder insbesondere durch einen Substituenten der Formel

worin X, Y¹, Y² und C(17) vorstehende Bedeutung haben.

Alternative Verfahren zum Schema 10 umfassen die Verwendung der verschiedenen Zwischenprodukte innerhalb des Rahmens der vorstehenden Formeln A203 bis A210. Jedes der Zwischenprodukte der Formeln A203 bis A211 ist eine neue Verbindung, die geeignet ist zur Herstellung von Epoxymexrenon und anderen Verbindungen der Formel I und IA gemäß der Synthese von Schema 10.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verläuft das Gesamtverfahren des Schemas 10 wie folgt:

Von den verschiedenen Schemen, die vorstehend erläutert sind, muss verstanden werden, dass die Reaktionsstufen, die für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren ausgewählt wurden, wesentliche Flexibilität bei der Herstellung von Epoxymexrenon und verwandten Verbindungen aufweisen. Die Schlüsseleigenschaften umfassen u. a.: (a) Bioumwandlung eines Substrats wie Canrenon, Androstendion oder β-Sitosterol zu einem 11α- oder 9α-Hydroxyderivat (mit gleichzeitiger Umwandlung von β-Sitosterol zu einer 17-Ketostruktur; (b) Einführung der 9,11 Doppelbindung durch Dehydratisierung einer Verbindung enthaltend entweder eine 11α- oder 9α- Hydroxygruppe, gefolgt durch Einführung der Epoxygruppe durch Oxidation der 9,11 Doppelbindung; (c) Anlagerung eines 7α-Alkoxycarbonyls durch Bildung des Enamins, Hydrolyse des Enamins zum Diketon und Umsetzung des Diketons mit einem Alkalimetallalkoxid; (d) Bildung des 20-Spiroxanringes an der 17-Positoin; (e) Bildung des 5,7-Lactons und Veresterung des Lactons zum 7-Alkoxycarbonyl; (f) Schützen des 3-Ketons durch Umwandlung zum 3-Enolether oder 3-Ketal während verschiedener Umwandlungen an anderen Positionen (einschließlich Bildung des 20-Spiroxanringes an der 17-Position). Mit einigen Beschränkungen können diese 4 Verfahrenskomponenten-Elemente (b) bis (d) in fast allen Sequenzen durchgeführt werden. Verfahrenselemente (e) und (f) bieten vergleichbare Flexibilität. Sie liefern eine Route zu Epoxymexrenon und anderen Verbindungen der Formel I, die wesentlich vereinfacht ist verglichen mit dem Verfahren des U.S. Patentes 4,559,332. Außerdem liefern sie wichtige Vorteile bei der Produktivität und Ausbeute.

In den Beschreibungen der vorstehenden Reaktionsschemen, können Gewinnung, Isolierung und Reinigung der Reaktionsprodukte im Allgemeinen erfolgen durch in der Technik bekannte Methoden. Außer, wo anderes angegeben wurde, sind Bedingungen, Lösungsmittel und Reagenzien entweder üblich oder nicht besonders kritisch oder beides. Jedoch bieten gewisse der spezifischen Arbeitsweisen wie vorstehend besonders beschrieben Vorteile, die verantwortlich sind für die vorteilhafte Gesamtausbeute und/oder Produktivität der verschiedenen Verfahrensstufen und Verfahrensschemen und/oder für hohe Qualität der Zwischenprodukte und schließlich 9,11-Epoxy- Steroidprodukte.

Die Verwendbarkeit der gemäß der Erfindung hergestellten 20-Spiroxanverbindungen wird beschrieben in Grob U.S. Patent 4,559,332, das ausdrücklich durch Bezugnahme hier enthalten ist.

Gemäß der Erfindung hergestellte 20-Spiroxanverbindungen unterscheiden sich durch vorteilhafte biologische Eigenschaften und sind somit wertvolle pharmazeutisch wirksame Bestandteile. Beispielsweise besitzen sie eine starke Aldosteron-antagonistische Wirksamkeit dahingehend, dass sie unmäßig hohe Natriumretention und Kaliumausscheidung reduzieren und normalisieren, die durch Aldosteron verursacht wurden. Sie haben somit als Kalium-schonende Diuretika eine wichtige therapeutische Anwendung beispielsweise bei der Behandlung von Bluthochdruck, Herzinsuffizienz oder Leberzirrhose.

20-Spiroxanderivate mit einer Aldosteron-antagonistischen Wirksamkeit sind bekannt, siehe beispielsweise Fieser und Fieser: Steroids; Seite 708 (Reinhold Publ. Corp., New York, 1959) und Britische Patentanmeldung Nr. 1,041534, ebenfalls bekannt als analogerweise wirksame 17β- Hydroxy-21-carbonsäuren und deren Salze, siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 3,849,404. Verbindungen dieser Art, die bisher in Therapien verwendet wurden haben jedoch einen wesentlichen Nachteil dahingehend, dass sie immer eine gewisse Geschlechts-spezifische Wirksamkeit aufweisen, welches die unangenehme Konsequenz früher oder später bei der üblichen Langzeittherapie aufweist. Insbesondere unerwünscht sind unangenehme Wirkungen, die auftreten können, bei der anti-androgenen Wirksamkeit der bekannten anti-Aldosteron Präparate.

Die Methoden, Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung und die hier verwendeten Bedingungen und Reagenzien sind weiter beschrieben in den folgenden Beispielen.

Beispiel 1

Schrägkulturen wurden hergestellt mit einem Wachstumsmedium wie in Tabelle 1 dargelegt.

TABELLE 1 - YPDA (Medium für Schrägkulturen und Platten)

Hefeextrakt 20 g

Pepton 20 g

Glucose 20 g

Agar 20 g

Destilliertes Wasser, aufgefüllt auf 1000 ml

- pH wie es ist 6,7

- eingestellt auf pH 5 mit H&sub3;PO&sub4; 10% G/V

Verteilung

- für Schrägkulturen: 7,5 ml in 180 · 18 mm Röhrchen

- für Platten (10 cm 25 ml in 200 · 20 mm Röhrchen

- Sterilisieren bei 120ºC 20 Minuten lang

- pH nach Sterilisation: 5

Um Kulturen der ersten Generation herzustellen, wurde eine Kolonie von Aspergillus ochraceus suspendiert in destilliertem Wasser (2 ml) in einem Teströhrchen und 0,15 ml aliquote Mengen dieser Suspension auf jede der Schrägkulturen aufgebracht, die wie vorstehend beschrieben hergestellt worden waren. Die Schrägkulturen wurden 7 Tage lang bei 25ºC inkubiert, wonach das Aussehen der Oberflächenkultur das eines weißen Baumwoll-artigen Mycels war. Die Rückseite war pigmentiert in orange im unteren Teil, in gelb-orange im oberen Teil.

Die erste Generation der Schrägkulturen wurde suspendiert in einer sterilen Lösung (4 ml), enthaltend Tween 80 nicht-ionisches Oberflächen-aktives Mittel (3 Gewichtsprozent) und 0,15 ml aliquote Mengen dieser Suspension wurden verwendet, um die zweite Generation der Schrägkulturen zu impfen, die hergestellt worden war mit dem Wachstumsmedium, dargestellt in Tabelle 2

TABELLE 2 (für die zweite Generation und Routineschrägkulturen)

Malzextrakt 20 g

Pepton 1 g

Glucose 20 g

Agar 20 g

destilliertes Wasser aufgefüllt auf 1000 ml

- pH wie es ist 5,3

- verteilt in Röhrchen (180 · 18 mm) ml 7,5

- sterilisiert bei 120ºC 20 Minuten lang

Die Schrägkulturen der zweiten Generation wurden inkubiert 10 Tage lang bei 25ºC, wodurch eine schwere Masse von gold-farbigen Sporen produziert wurde; die Rückseite war in braun-orange pigmentiert.

Ein Schutzmedium wurde hergestellt mit der Zusammensetzung wie in Tabelle 3 wiedergegeben.

TABELLE 3 - SCHUTZMEDIUM

Magermilch 10 g

destilliertes Wasser 100 ml

In einem 250 ml Kolben, enthaltend 100 ml destilliertes Wasser bei 50ºC, Zusetzen von Magermilch. Sterilisieren bei 120ºC 15 Minuten lang. Kühlen bei 33ºC und Verwendung bevor der Tag zuende ist.

Schrägkulturen von fünf der zweiten Generation wurden suspendiert in der Schutzlösung (15 ml) in einem 100 ml Kolben. Die Suspension wurde aufgeteilt in aliquote Mengen (jeweils 0,5 ml) zwischen 100 · 10 ml Röhrchen zur Lyophilisierung. Diese wurden vorgefroren bei -70º bis -80ºC in einem Aceton/Trockeneisbad 20 Minuten lang, dann sofort transferiert in einen Trockenraum vorgekühlt auf -40º bis -50ºC. Die vorgefrorenen aliquoten Mengen wurden lyophilisiert bei einem Restdruck von 50 u Hg und ≤-30ºC. Am Ende der Lyophilisierung wurden zwei bis drei Granulate von sterilem Silicagel jedem Röhrchen zugesetzt mit Feuchtigkeitsindikator und Flammenverschluss.

Um Mutterschrägkulturen zu erhalten, die für industrielle Fermentation geeignet sind, wurde ein einziges Aliquot von lyophilisierter Kultur, das hergestellt wurde auf die vorstehend beschriebene Weise, suspendiert in destilliertem Wasser (1 ml) und 0,15 ml aliquate Mengen der Suspension wurden verwendet, am die Schrägkulturen zu inoculieren, die ausgestattet worden waren mit einem Wachstumsmedium, das die in Tabelle 2 angegebene Zusammensetzung hatte. Die Mutterschrägkulturen wurden inkubiert sieben Tage lang bei 25ºC. Am Ende der Inkubation wurde die Kultur, die sich auf den Schrägkulturen entwickelt hatte bei 4ºC konserviert.

Um eine Routine-Schrägkultur herzustellen wurde die Kultur von einer Mutterschrägkultur suspendiert in einer sterilen Lösung (4 ml), enthaltend Tween 80-(3 Gewichtsprozent) und die dabei entstehende Suspension verteilt in 0,15 ml aliquoten Mengen unter den Schrägkulturen, die beschichtet worden waren mit einem in Tabelle 2 beschriebenen Wachstumsmedium. Die Routine- Schrägkulturen können verwendet werden, um die primären Impfkolben zu beimpfen für Laboratoriums- oder industrielle Fermentationen.

Um eine primäre Impfkolbenkultur herzustellen, wurde eine Kultur von einer Routine- Schrägkultur, die wie vorstehend beschrieben hergestellt worden war, entfernt und suspendiert in einer Lösung (10 ml) enthaltend Tween 80 (3 Gewichtsprozent). Eine 0,1 aliquote Menge der dabei entstehenden Suspension wurde eingeführt in einen 500 ml Prallkolben, enthaltend ein Wachstumsmedium, das die in Tabelle 4 wiedergegebene Zusammensetzung aufweist.

TABELLE 4 (für primäre und Transformationskolbenkultur und Rundkolben)

Glucose 20 g

Pepton 20 g

Hefeautolysat 20 g

destilliertes Wasser aufgefüllt auf

- pH wie es ist 5,2

- eingestellt auf pH 5,8 mit NaOH 20%

- verteilt in 500 ml Prallkolben 100 ml

- verteilt in 2000 ml Rundkolben (3 Pralleinrichtungen) 500 ml

- sterilisiert bei 120ºC · 20 Minuten

- pH nach Sterilisierung etwa 5,7

Der Impfkolben wurde inkubiert auf einem Rotationsschüttler (200 rpm, 5 cm Verdrängung) 24 Stunden lang bei 28ºC, wodurch eine Kultur in Form von Pellet-artigem Mycel erzeugt wurde mit Durchmessern von 3 bis 4 mm. Bei mikroskopischer Betrachtung erwies sich die Impfkultur als eine reine Kultur mit synnematischem Wachstum, mit großen Hyphen und gut gewunden. Der pH Wert der Suspension war 5,4 bis 5,6. PMX war 5 bis 8% wie durch Zentrifugation bestimmt (3000 rpm · 5 Minuten).

Eine Transformationskolbenkultur wurde hergestellt durch Impfen eines Wachstumsmediums (100 ml), das die in Tabelle 4 wiedergegebene Zusammensetzung enthielt in einem zweiten 500 ml Schüttelkolben mit Biomasse (1 ml) vom Impfkulturkolben. Das dabei entstehende Gemisch wurde inkubiert auf einem Rotationsschüttler (200 rpm, 5 cm Verdrängung) 18 Stunden lang bei 28ºC. Die Kultur wurde untersucht und man fand, dass sie Pellet-artiges Mycel enthielt mit einem 3-4 mm Durchmesser. Bei mikroskopischer Prüfung wurde bestimmt, dass die Kultur eine reine Kultur war mit synnematischem und fadenartigem Wachstum, worin die Spitzenzellen voll von Cytoplasma waren und die alten Zellen etwas entleert waren. Der pH Wert der Kultursuspension betrug 5 bis 5,2 und PMV wurde bestimmt durch Zentrifugierung auf zwischen 10% und 15%. Demgemäß erwies sich die Kultur als geeignet für die Transformation von Canrenon zu 11α- Hydroxycanrenon.

Canrenon (1 g) wurde mikronisiert auf etwa 5 u und suspendiert in sterilem Wasser (20 ml). Dieser Suspension wurde zugesetzt: Eine 40% (G/V) sterile Glucoselösung; eine 16% (G/V) sterile Lösung von autolysierter Hefe und eine sterile Antibiotikumlösung, alle in den Proportionen wie sie für 0 Stunden Reaktionszeit in Tabelle 5 angegeben sind. Die antibiotische Lösung war hergestellt worden durch Lösen von Kanamicynsulfat (40 mg), Tetracyclin HCl (40 mg) und Cefalexin (200 mg) in Wasser (100 ml). Die Steroidsuspension, Glucoselösung und autolysierte Hefelösung wurden nach und nach der Kultur zugesetzt, die in dem Schüttelkolben enthalten war.

Während des Reaktionsverlaufs wurde das Reaktionsgemisch periodisch analysiert, um den Glucosegehalt zu bestimmen und durch Dünnschichtchromatographie die Umwandlung zu 11α- Hydroxycanrenon zu bestimmen. Zusätzliches Canrenonsubstrat und Nährstoffe wurden dem Fermentations- und Reaktionsgemisch zugesetzt während der Reaktion bei kontrollierten Geschwindigkeiten, um den Glucosegehalt im Bereich von etwa 0,1 Gewichtsprozent aufrechtzuerhalten. Das Zugabeprogramm für Steroidsuspension, Glucoselösung, autolysierte Hefelösung und antibiotische Lösung wird in Tabelle 5 dargelegt. Die Transformationsreaktion erfolgte 96 Stunden lang bei 25ºC auf einem Rotationsschüttler (200 rpm und 5 cm Verdrängung). Der pH Wert lag in einem Bereich zwischen 4,5 und 6 während der Fermentation. Wenn immer PMV auf über 60% stieg wurde eine 10 ml Portion Brühenkultur abgezogen und ersetzt durch 10 ml destilliertes Wasser. Das Verschwinden von Canrenon und das Auftreten von 11α-Hydroxycanrenon wurde verfolgt während der Reaktion durch Probennahme der Brühe in Intervallen von 4, 7, 23, 31, 47, 55, 71, 80 und 96 Stunden nach dem Start des Fermentationszyklus und Analysieren der Probe durch TLC. Das Fortschreiten der Reaktion wurde bestimmt aus Proben wie in Tabelle 6 dargelegt.

Beispiel 2

Eine primäre Impfkolbenkultur wurde hergestellt auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise. Ein Nährstoffgemisch wurde hergestellt mit der in Tabelle 7 dargelegten Zusammensetzung.

Eine anfängliche Beschickung dieses Nährstoffgemischs (4 l) wurde eingeführt in einen Transformationsfermenter von 10 l geometrischem Volumen. Der Fermenter hatte eine zylindrische Form mit einem Verhältnis von Höhe zu Durchmesser von 2,58. Er war ausgestattet mit einem 400 rpm Turbinenrührwerk mit zwei Nr. 2 Scheibenrädern mit jeweils 6 Blättern. Der äußere Durchmesser des Impellers betrug 80 mm, wobei jedes der Blätter eine Radialdimension von 25 mm aufweis und 3 mm Höhe, wobei das oberste Rad angeordnet war 280 mm unter dem oberen Rand des Gefäßes, das unterste Rad war 365 mm unter dem oberen Rand und die Prallbleche für das Gefäß waren 210 mm hoch und ragten radial inwärts 25 mm von der inneren vertikalen Wand des Gefäßes.

Impfkultur (40 ml) wurde vermischt mit der Nährstoffbeschickung in dem Fermenter und eine Transformationskultur geschaffen durch Inkubierung 22 Stunden lang bei 280C und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 l/1 Minute bei einem Druck von 0,5 kg/cm². Nach 22 Stunden war PMV der Kultur 20-25% und der pH Wert 5 bis 5,2.

Eine Suspension wurde hergestellt, enthaltend Canrenon (80 g) in sterilem Wasser (400 ml) und eine 10 ml Portion wurde dem Gemisch im Transformationsfermenter zugesetzt. Zur gleichen Zeit wurden 40% (G/V) sterile Glucoselösung, eine 16% (G/V) sterile Lösung von autolysierter Hefe und eine sterile antibiotische Lösung in den in Tabelle 8 angegebenen Proportionen zugesetzt bei Stunde 0 der Reaktionszeit. Die antibiotische Lösung wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt.

Während des Fortschreitens der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch periodisch analysiert, um den Glucosegehalt zu bestimmen und durch Dünnschichtchromatographie, um die Umwandlung zu 11α-Hydroxycanrenon zu bestimmen. Auf der Basis von TLC Analyse von Proben der Reaktionsbrühe wie nachstehend beschrieben, wurde zusätzliches Canrenon zum Reaktionsgemisch zugesetzt, wenn Canrenonsubstrat verbraucht worden war. Glucosemengen wurden ebenfalls beobachtet und wenn immer die Glucosekonzentration auf etwa 0,05 Gewichtsprozent oder darunter abfiel, wurde zusätzliche Glucoselösung zugesetzt, um die Konzentration hoch bis auf etwa 0,25 Gewichtsprozent zu bringen. Nährstoffe und Antibiotika wurden ebenfalls zugesetzt zu verschiedenen Zeiten während des Reaktionszyklus. Der Zugabeplan für Steroidsuspension, Glucoselösung, autolysierte Hefelösung und antibiotische Lösung wurde in Tabelle 8 wiedergegeben. Die Transformationsreaktion dauerte 90 Stunden bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 Volumen Luft je Volumen Flüssigkeit je Minute (VVM) bei einem positiven Kopfdruck von 0,3 kg/cm². Die Temperatur wurde bei 28ºC gehalten bis PVM 45% erreichte, dann auf 26ºC gesenkt und bei dieser Temperatur gehalten, bis PVM von 45% auf 60% wuchs und danach bei 24ºC kontrolliert. Die ursprüngliche Rührgeschwindigkeit betrug 400 rpm, wobei sie nach 40 Stunden auf 700 rpm erhöht wurde. Der pH Wert wurde auf zwischen 4,7 und 5,3 gehalten durch Zugabe von 2 M Orthophosphorsäure oder 2 M NaOH wie angegeben. Das Schäumen wurde kontrolliert durch Zugabe einiger Tropfen des Schaumbremsmittels SAG 471, wenn sich Schaum entwickelte. Das Verschwinden von. Canrenon und das Auftreten von 11α-Hydroxycanrenon wurde beobachtet in 4 stündigen Abständen während der Reaktion durch TLC Analyse der Brühenproben. Wenn das meiste Canrenon verschwunden war aus der Brühe wurden zusätzliche Teilmengen zugesetzt.

Nachdem alle Canrenonzugaben gemacht worden waren, wurde die Reaktion beendet, wenn die TLC Analyse zeigte, dass die Konzentration des Canrenonsubstrats relativ zum 11α- Hydroxycanrenonprodukt auf etwa 5% gefallen war.

Am Ende des Reaktionszyklus wurde die Fermentationsbrühe filtriert durch Käsetuch zur Abtrennung des Mycels von der flüssigen Brühe. Die Mycelfraktion wurde wieder suspendiert in Ethylacetat unter Verwendung von etwa 65 Volumen (5,2 Litern) je Gramm Canrenon, das während des Verlaufs der Reaktion zugesetzt worden war. Die Suspension von Mycel in Ethylacetat wurde eine Stunde lang unter Rühren unter Rückfluß gehalten, gekühlt auf 20ºC und auf einem Buchnerfilter filtriert. Der Mycelkuchen wurde nacheinander gewaschen mit Ethylacetat (5 Volumen je g zugesetztem Canrenon; 0,4 l) und entionisiertem Wasser (500 ml), um den Ethylacetatextrakt vom Kuchen abzutrennen. Ver Filterkuchen wurde verworfen. Der angereicherte Extrakt, Lösungsmittelwaschungen und Wasserwaschungen wurden in einem Separator gesammelt und dann 2 Stunden stehengelassen zur Abtrennung der Phase.

Die wässrige Phase wurde dann verworfen und die organische Phase eingeengt unter Vakuum zu einem Rückstandsvolumen von 350 ml. Die Destillationsgefäße wurden gekühlt auf 15ºC und unter Rühren etwa eine Stunde darauf gehalten. Die dabei entstehende Suspension wurde filtriert, um das kristalline Produkt zu entfernen und der Filterkuchen wurde gewaschen mit Ethylacetat (40 ml). Nach dem Trocknen wurde die Ausbeute von 11α-Hydroxycanrenon bestimmt und betrug 60 g.

Beispiel 3

Eine Sporensuspension wurde hergestellt aus einer Routine-Schrägkultur auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise. In einem 2000 ml mit Prallblechen ausgestatteten Rundkolben (3 Prallbleche, jeweils 50 mm · 30 mm), wurde eine aliquote Menge (0,5 ml) der Sporensuspension zugesetzt in eine Nährlösung (500 ml), die die in Tabelle 4 angegebene Zusammensetzung hatte. Das dabei entstehende Gemisch wurde inkubiert in dem Kolben 24 Stunden lang bei 25ºC auf einem Wechselschüttler (120 Takte pro Minute; Verdrängung 5 cm), wodurch eine Kultur hergestellt wurde, die bei mikroskopischer Untersuchung als eine reine Kultur erschien mit Hyphen, die gut gewunden waren. Der pH Wert der Kultur war zwischen etwa 5,3 und 5,5 und PMV (bestimmt durch Zentrifugation bei 3000 rpm 5 Minutenlang) war 8 bis 10%.

Unter Verwendung der so hergestellten Kultur wurde eine Impfkultur hergestellt in einem nicht rostenden Stahlfermenter von vertikaler zylindrischer Form, der ein geometrisches Volumen von 160 l hatte und ein Aspektverhältnis von 2,31 (Höhe = 985 mm; Durchmesser = 425 mm). Der Fermenter war ausgestattet mit einem Scheibenturbinenrührwerk mit zwei Rädern, wobei jedes Rad sechs Blätter aufwies mit einem äußeren Durchmesser von 240 mm, wobei jedes Blatt eine radiale Dimension von 80 mm aufwies und eine Höhe von 50 mm. Das oberste Rad war positioniert in einer Tiefe von 780 mm vom oberen Rand des Fermenters und das zweite in einer Tiefe von 995 mm. Vertikale Prallbleche mit einer Höhe von 890 mm ragten radial inwärts 40 mm von der inneren vertikalen Wand des Fermenters. Die Rührvorrichtung wurde betrieben bei 170 rpm. Ein Nährlösungsgemisch (100 l) mit der Zusammensetzung wie sie in Tabelle 9 wiedergegeben wird wurde in den Fermenter eingeführt, gefolgt durch eine Portion Vorinoculum (1 l), hergestellt wie vorstehend beschrieben und mit einem pH Wert von 5,7.

Das inoculierte Gemisch wurde 22 Stunden lang inkubiert bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 l/l-min. bei einem Kopfdruck von 0,5 kg/cm². Die Temperatur wurde kontrolliert bei 28ºC bis PMV 25% erreichte und dann auf 25ºC verringert. Der pH Wert wurde kontrolliert im Bereich von 5,1 bis 5,3. Wachstum des Mycelvolumens wird in Tabelle 10 gezeigt zusammen mit dem pH Wert und gelösten Sauerstoffprofilen der Impfkulturreaktion.

Unter Verwendung der so hergestellten Impfkultur erfolgte eine Transformationsfermentation in einem vertikalen zylindrischen nicht rostenden Fermenter mit einem Durchmesser von 1,02 m, einer Höhe von 1,5 m und einem geometrischen Volumen von 1,4 m³. Der Fermenter war ausgestattet mit einem Turbinenrührwerk mit zwei Impellern, wobei der eine 867 cm unter dem oberen Rand des Reaktors angebracht war und der andere 1435 cm vom oberen Rand. Jedes Rad war ausgestattet mit sechs Blättern, wobei jedes 95 cm Radialdimension aufwies und 75 cm Höhe. Vertikale Prallbleche 1440 cm hoch ragten radial einwärts 100 cm von der inneren vertikalen Wand des Reaktors. Ein Nährmittelgemisch wurde hergestellt mit der in Tabelle 11 angegebenen Zusammensetzung.

Eine anfängliche Beschickung (700 l) dieses Nährstoffgemischs (pH = 5,7) wurde in den Fermenter eingeführt, gefolgt durch das Impfinoculum dieses Beispiels (7 l), hergestellt wie vorstehend beschrieben.

Das Nährstoffgemisch, enthaltend Inoculum, wurde 24 Stunden lang inkubiert bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 l/l-min. bei einem Kopfdruck von 0,5 kg/cm². Die Temperatur wurde kontrolliert bei 28ºC und die Rührgeschwindigkeit betrug 110 rpm. Das Wachstum des Mycelvolumens wird in Tabelle 12 gezeigt zusammen mit dem pH Wert und gelösten Sauerstoffprofilen der Impfkulturreaktion.

Am Ende der Inkubation wurde Pelletesierung des Mycels beobachtet, jedoch waren die Pellets im Allgemeinen klein und relativ lose gepackt. Diffuses Mycel wurde suspendiert in der Brühe. End pH Wert war 5,1 bis 5,3.

Zu der so hergestellten Transformationskultur wurde eine Suspension von Canrenon (1,250 kg; mikronisiert zu 5 u) in sterilem Wasser (5 l) zugesetzt. Sterile Additivlösung und antibiotische Lösung wurde in den in Tabelle 14 angegebenen Proportionen zum Reaktionszeitpunkt 0 zugesetzt. Die Zusammensetzung der Additivlösung wird in Tabelle 13 wiedergegeben.

TABELLE 13 ADDITIVLÖSUNG (für transformative Kultur)

Menge

Dextrose 40 kg

Hefeautolysat 8 kg

Schaumbremsmittel SAG 471 0,010 kg

entionisiertes Wasser aufzufüllen auf 100 l

- Sterilisieren eines 150 l leeren Fermenters 1 Stunde lang bei 130ºC

- Beladen mit 70 l entionisiertem Wasser; Erhitzen auf 40ºC

- Zusetzen der Komponente der "additiven Lösung" während des Rührens

- 30 minütiges Rühren, das Volumen auf 95 l bringen

- pH Wert wie er ist 4,9

- Sterilisieren bei 120ºC · 20 Minuten

- pH Wert nach der Sterilisiation etwa 5

Die Bioumwandlung erfolgte etwa 96 Stunden unter Belüftung bei 0,5 l/l-min. bei einem Kopfdruck von 0,5 kg/cm² und einem pH Wert im Bereich von zwischen 4,7 und 5,3, eingestellt, falls erforderlich, durch Zugaben von 7,5 M NaOH oder 4 M H&sub3;PO&sub4;. Die Rührgeschwindigkeit betrug ursprünglich 100 rpm, erhöht auf 165 rpm nach 40 Stunden und 250 rpm nach 64 Stunden. Die ursprüngliche Temperatur betrug 28ºC, erniedrigt auf 26ºC wenn PMV 45% erreichte und erniedrigt auf 24ºC wenn PMV auf 6000 stieg. SAG 471 wurde in feinen Tropfen zugesetzt falls erforderlich, um das Schäumen zu kontrollieren. Glucosemengen in der Fermentation wurden beobachtet in 4 Stunden Intervallen und wenn immer die Glucosekonzentration unter 1 gpl fiel, wurde ein Bruchteil der sterilen Additivlösung (10 l) der Beschickung zugesetzt. Verschwinden von Canrenon und Auftreten von 11α-Hydroxycanrenon wurden ebenfalls beobachtet während der Reaktion durch HPLC. Wenn mindestens 90% der ursprünglichen Canrenonbeschickung umgewandelt worden war zu 11α-Hydroxycanrenon, wurde eine Teilmenge von 1,250 kg Canrenon zugesetzt. Wenn 90% des Canrenons in der Teilmenge sich als umgewandelt erwies, wurde eine weitere 1,250 kg Teilmenge zugegeben. Unter Anwendung der gleichen Kriterien wurden weitere Teilmengen (1,250 kg jeweils) zugesetzt, bis die gesamte Reaktorbeschickung (20 kg) eingeführt worden war. Nachdem die gesamte Canrenoncharge zum Reaktor zugegeben worden war, wurde die Reaktion beendet, wenn die Konzentration von nicht umgesetztem Canrenon 5% betrug im Verhältnis zur Menge an hergestelltem 11α-Hydroxycanrenon. Der Zugabeplan zur Zugabe von Canrenon, sterile Additivlösung und antibiotische Lösung werden in Tabelle 14 gezeigt.

Wenn die Bioumwandlung beendet war wurde das Mycel getrennt von der Brühe durch Zentrifugation in einer Korbzentrifuge. Das Filtrat wurde bestimmt durch HPLC und enthielt nur 2% der gesamten Menge an 11α-Hydroxycanrenon in der gesammelten Brühe und wurde somit beseitigt. Das Mycel wurde suspendiert in Ethylacetat (1000 l) in einem Extraktionstank mit einer Kapazität von 2 m³. Diese Suspension wurde eine Stunde lang unter Rühren und Ethylacetatrückfluß-Bedingungen gerührt, dann gekühlt und zentrifugiert in einer Korbzentrifuge. Der Mycelkuchen wurde gewaschen mit Ethylacetat (200 l) und danach verworfen. Den steroidreichen Lösungsmittelextrakt ließ man eine Stunde lang stehen zum Abtrennen der Wasserphase. Die Wasserphase wurde extrahiert mit einer weiteren Menge an Ethylacetatlösungsmittel (200 l) und dann verworfen. Die vereinigten Lösungsmittelphasen wurden geklärt durch Zentrifugierung und in einen Konzentrator getan (500 l geometrisches Volumen) und im Vakuum eingeengt zu einem Restvolumen von 100 l. Bei der Durchführung der Verdampfung betrug die ursprüngliche Beschickung zum Konzentrator des vereinigten Extraktes und der Waschlösungen 100 l und dieses Volumen wurde konstant gehalten durch kontinuierliche oder periodische Zugaben der kombinierten Lösung, wenn Lösungsmittel abgezogen wurde. Nachdem die Verdampfungsstufe vollständig war, wurden die Destilliergefäße gekühlt auf 20ºC und zwei Stunden lang gerührt, dann filtriert auf einem Buchnerfilter. Der Konzentratortopf wurde gewaschen mit Ethylacetat (20 l) und diese Waschlösung wurde dann verwendet, um den Kuchen auf dem Filter zu waschen. Das Produkt wurde unter Vakuum 16 Stunden lang bei 50ºC getrocknet. Ausbeute von 11α-Hydroxycanrenon betrug 14 kg.

Beispiel 4

Lyophilisierte Sporen von Aspergillus ochraceus NRRL 405 wurden suspendiert in einem Maisquellflüssigkeitswachstumsmedium (2 ml) mit einer in Tabelle 15 wiedergegebenen Zusammensetzung:

TABELLE 15 - Maisquellflüssigkeitsmedium (Wachstumsmedium für primäre Impfkultivierung)

Maisquellflüssigkeit 30 g

Hefeextrakt 15 g

Ammoniumphosphat, monobasisch 3 g

Glucose (Zugabe nach Sterilisaton) destilliertes Wasser, aufzufüllen auf 1000 ml pH wie es ist: 4,6, eingestellt auf pH 6,5 mit 20% NaOH, Verteilen von 50 ml auf 250 ml Erlenmeyerkolben sterilisiert auf 121ºC 20 Minuten lang. 30 g

Die dabei entstehende Suspension wurde verwendet in einem Inoculum für die Fortpflanzung von Sporen auf Agarplatten. Zehn Agarplatten wurden hergestellt, wobei jede ein festes Glucose/Hefeextrakt/Phosphat/Agarwachstumsmedium trug mit der in Tabelle 16 angegebenen Zusammensetzung:

TABELLE 16 - GYPA (Glucose/Hefeextrakt/Phosphat/Agar für die Platten)

Glucose (Zugabe nach Sterilisation 10 g

Hefeextrakt 2,5 g

K&sub2;HPO&sub4; 3 g

Agar destilliertes Wasser aufzufüllen auf 1000 ml Einstellung des pH Wertes auf 6,5 Sterilisieren bei 121ºC 30 Minuten lang 20 g

Eine 0,2 ml aliquote Menge der Suspension wurde übertragen auf die Oberfläche jeder Platte. Die Platten wurden inkubiert bei 25ºC zehn Tage lang, wonach die Sporen von allen Platten gesammelt wurden in ein cryogenes Schutzmedium mit der in Tabelle 17 angegebenen Zusammensetzung:

TABELLE 17 - GYP/Glycerin (Glucose/Hefeextrakt/Phosphat/Glycerinmedium für Vorratsphiolen)

Glucose (Zugabe nach Sterilisation) 10g

Hefeextrakt 2,5 g

K&sub2;HPO&sub4; 3 g

Glycerin destilliertes Wasser aufzufüllen auf 1000 ml Sterilisieren bei 121ºC 30 Minuten lang 20 g

Die dabei entstehende Suspension wurde aufgeteilt auf zwanzig Phiolen, wobei ein ml in jede Phiole getan wurde. Diese Phiolen stellen eine Masterzellbank dar, die abgezogen werden kann auf Produktionsarbeitszellbanken zur Verwendung für die Erzeugung von Inoculum für die Bioumwandlung von Canrenon zu 11α-Hydroxycanrenon. Die Phiolen, die die Masterzellbank umfassen wurden aufbewahrt in der Dampfphase einer Flüssigstickstoff-Gefriereinrichtung bei -130ºC.

Um die Herstellung einer Arbeitszellbank zu beginnen, wurden die Sporen von einer einzigen Masterzellbankphiole resuspendiert in einem sterilen Wachstumsmedium (1 ml) mit der in Tabelle 15 angegebenen Zusammensetzung. Diese Suspension wurde aufgeteilt in zehn 0,2 ml aliquote Mengen und jede aliquote Menge verwendet, um eine Agarplatte zu inoculieren, die das feste Wachstumsmedium trägt mit der in Tabelle 16 angegebenen Zusammensetzung. Diese Platten wurden 10 Tage lang bei 25ºC inkubiert. Am dritten Tag der Inkubation war die Unterseite des Wachstumsmediums braun-orange. Am Ende der Inkubation war eine starke Produktion von gold-farbigen Sporen. Die Sporen von jeder Platte wurden gesammelt gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren für die Herstellung der Masterzellbank. Eine Gesamtmenge von hundert Phiolen wurde hergestellt, wobei jede 1 ml Suspension enthielt. Diese Phiolen stellten die Arbeitszellbank dar. Die Arbeitszellbankphiolen wurden ebenfalls konserviert durch Lagerung in der Dampfphase einer Flüssigstickstoff-Gefriereinrichtung bei -130ºC.

Wachstumsmedium (50 ml) mit der in Tabelle 15 wiedergegebenen Zusammensetzung wurde in einen 250 ml Erlenmeyerkolben gegeben. Eine aliquote Menge (0,5 ml) der Arbeitszellsuspension wurde in den Kolben gegeben und vermischt mit dem Wachstumsmedium. Das inoculierte Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 25ºC inkubiert, um eine primäre Impfkultur zu produzieren, die ein prozentuales gepacktes Mycelvolumen von etwa 45% aufwies. Bei der visuellen Inspektion fand man, dass die Kultur Pellet-artiges Mycel mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm enthielt und bei der mikroskopischen Beobachtung erschien sie als eine reine Kultur.

Kultivierung einer sekundären Impfkultur wurde eingeleitet durch Einführung eines Wachstumsmediums mit der in Tabelle 15 dargelegten Zusammensetzung in einen 2,8 l Fernbachkolben und Inoculieren des Mediums mit einer Portion (10 ml) der primären Impfkultur dieses Beispiels, dessen. Herstellung vorstehend beschrieben wurde. Das inoculierte Gemisch wurde inkubiert bei 25ºC 24 Stunden lang auf einem Rotationsschüttler (200 rpm, 5 cm Verdrängung). Am Ende der Inkubation zeigte die Kultur die gleichen Eigenschaften wie vorstehend für die primäre Impfkultur beschrieben und war geeignet zur Verwendung in einer Transformationsfermentation, worin Canrenon bioumgewandelt wurde zu 11α-Hydroxycanrenon.

Die Transformation erfolgte in einem Braun E Biostat Fermenter, der folgende Konfiguratoin aufwies:

Kapazität: 15 Liter mit Rundboden

Höhe: 53 cm

Durchmesser: 20 cm

H/D: 2,65

Impeller: 7,46 cm Durchmesser, sechs Paddel 2,2 · 1,4 cm jeweils

Impellerabstand: 65,5,14,5 und 25,5 cm vom Boden des Tanks

Prallbleche: vier 1,9 · 48 cm

Sprinkler: 10,1 cm Durchmesser, 21 Löcher, etwa 1 mm Durchmesser

Temperaturkontrolle: geliefert durch Vorrichtungen einer äußeren Gefäßummantelung

Canrenon bei einer Konzentration von 20 g/l wurde suspendiert in entionisiertem Wasser (4 l) und eine Portion (2 l) Wachstumsmedium mit der in Tabelle 18 angegebenen Zusammensetzung wurde zugesetzt, während das Gemisch im Fermenter bei 300 rpm gerührt wurde.

Die dabei entstehende Suspension wurde 15 Minuten lang gerührt wonach das Volumen auf 7,5 l gebracht wurde mit zusätzlichem entionisiertem Wasser. An diesem Punkt wurde der pH Wert der Suspension eingestellt auf 5,2 bis 6,5 durch Zugabe von 20 Gewichtsprozent NaOH Lösung und die Suspension wurde dann sterilisiert durch Erhitzen auf 121ºC 30 Minuten lang in dem Braun E Fermenter. Der pH Wert nach der Sterilisation betrug 6,3 ± 0,2 und das Endvolumen betrug 7,0 l. Die sterilisierte Suspension wurde inoculiert mit einer Portion (0,5 l) der sekundären Impfkultur dieses Beispiels, das wie vorstehend beschrieben hergestellt worden war und das Volumen auf 8,0 l gebracht durch Zugabe von 50% steiler Glucoselösung. Die Fermentation erfolgte bei einer Temperatur von 28ºC bis das PMV 50% erreichte, dann herabgesetzt auf 26ºC und weiter herabgesetzt auf 24ºC, wenn PMV 50% überschritt, um ein gleichmäßiges PMV unter etwa 60% zu halten. Luft wurde eingeführt durch einen Sprinkler bei einer Geschwindigkeit von 0,5 vvm auf der Basis des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens und der Druck im Fermenter wurde auf 700 Millibar gauge gehalten. Das Rühren begann bei 600 rpm und wurde stufenweise gesteigert auf 1000 rpm falls erforderlich, um den gelösten Sauerstoffgehalt über 30% Volumen zu halten. Die Glucosekonzentration wurde überwacht. Nach der ursprünglich hohen Glucose fiel die Konzentration unter 1% aufgrund des Verbrauchs durch die Fermentationsreaktion, zusätzliche Glucose wurde geliefert über eine 50 Gewichtsprozent sterile Glucoselösung, um die Konzentration im Bereich von 0,05% bis 1% während des Restes des Beschickungszyklus zu halten. Vor der Inoculierung betrug der pH Wert 6,3 ± 0,2. Nachdem der pH Wert abfiel auf etwa 5,3 während der anfänglichen Fermentationsperiode, wurde er im Bereich von 5,5 ± 0,2 für den Rest des Zyklus gehalten durch Zugabe von Ammoniumhydroxid. Der Schaum wurde kontrolliert durch Zugabe eines Polyethylenglycolschaumbremsmittels, vertrieben unter der Handelsbezeichnung SAG 471 durch OSI Specialities, Inc.

Wachstum der Kultur erfolgte in erster Linie während der ersten 24 Stunden des Zyklus wo das PMV etwa 40% betrug, der pH Wert etwa 5,6 betrug und der gelöste Sauerstoffgehalt etwa 50 Volumenprozent betrug. Die Canrenonumwandlung begann gerade als die Kultur wuchs. Konzentrationen von Canrenon und 11α-Hydroxycanrenon wurden überwacht während der Bioumwandlung durch tägliches Analysieren von Proben. Die Proben wurden extrahiert mit heißem Ethylacetat und die dabei entstehenden Probelösungen analysiert durch TLC und HPLC. Die Bioumwandlung wurde als vollständig erachtet, als die restliche Canrenonkonzentration etwa 10% der ursprünglichen Konzentration betrug. Die etwaige Umwandlungszeit betrug 110 bis 130 Stunden.

Als die Bioumwandlung vollständig war, wurde die Mycelbiomase getrennt von der Brühe durch Zentrifugation. Der Überstand wurde extrahiert mit einem gleichen Volumen von Ethylacetat und die wässrige Schicht wurde verworfen. Die Mycelfraktion wurde wieder suspendiert in Ethylaceat unter Verwendung von etwa 65 Volumen je Gramm Canrenon, das in den Fermentationsreaktor geschickt worden war. Die Mycelsuspension wurde eine Stunde lang unter Rühren unter Rückfluß gehalten, gekühlt auf etwa 20ºC und filtriert auf einem Buchner Trichter. Der Mycelfilterkuchen wurde zweimal gewaschen mit 5 Volumen Ethylacetat je Gramm Canrenon, das in den Fermenter gegeben worden war und dann gewaschen mit entionisiertem Wasser (1 l), um restliches Ethylacetat zu verdrängen. Der wässrige Extrakt, angereichertes Lösungsmittel, Lösungsmittelwaschung und Wasserwaschung wurden vereinigt. Der rückständige getrocknete Mycelkuchen wurde entweder verworfen oder nochmal extrahiert, je nach der Analyse für rückständiges Steroid darin. Die vereinigten flüssigen Phasen ließ man sich zwei Stunden lang absetzen. Danach wurde die wässrige Phase abgetrennt und verworfen und die organische Phase unter Vakuum eingeengt, bis das Rückstandsvolumen etwa 500 ml betrug. Die Destillierflasche wurde dann gekühlt auf etwa 15ºC unter langsamen Rühren etwa eine Stunde lang. Das kristalline Produkt wurde gewonnen durch Filtration und gewaschen mit abgekühltem Ethylacetat (100 ml). Das Lösungsmittel wurde entfernt von den Kristallen durch Verdampfen und das kristalline Produkt getrocknet unter Vakuum bei 50ºC.

Beispiel 5

Lyophilisierte Sporen von Aspergillus ochraceus ATCC 18500 wurden suspendiert in Maisquellflüssigkeitswachstumsmedium (2 ml) wie in Beispiel 4 beschrieben. Zehn Agarplatten wurden hergestellt ebenfalls auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4. Die Platten wurden inkubiert und geerntet wie in Beispiel 4 beschrieben, um eine Masterzellbank zu liefern. Die Phiolen, die von der Masterzellbank umfaßt waren, wurden gelagert in der Dampfphase einer Flüssigstickstoff- Gefriereinrichtung bei -130ºC.

Aus einer Phiole der Masterzellbank wurde eine Arbeitszellbank hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben und aufbewahrt in der Stickstoffgefriereinrichtung bei -130ºC.

Wachstumsmedium (300 ml) mit der in Tabelle 19 angegebenen Zusammensetzung wurde in einen 2 l Prallblechkolben gegeben. Eine aliquote Menge (3 ml) der Arbeitszellsuspension wurde in den Kolben eingeführt. Das inoculierte Gemisch wurde incubiert 20 bis 24 Stunden lang bei 28ºC auf einem Rotationsschüttler (200 rpm, 5 cm Verdrängung), um eine primäre Impfkultur zu bilden mit einem prozentualen gepackten Mycelvolumen von etwa 45%. Bei visueller Inspektion fand man, dass die Kulturen Pellet-artiges Mycel aufwiesen mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm und bei mikroskopischer Beobachtung erschien sie als eine reine Kultur.

TABELLE 19 Wachstumsmedium für primäre und sekundäre Impfkultivierung

Menge/l

Glucose (zugesetzt nach Sterilisation) 20 g

Pepton 20 g

Hefeextrakt 20 g

destilliertes Wasser aufzufüllen auf 1000 ml Sterilisieren bei 121ºC 30 Minuten lang

Kultivierung einer sekundären Impfkultur wurde eingeleitet durch Einführung von 8 l Wachstumsmedium mit der in Tabelle 19 angegebenen Zusammensetzung in einen 14 l Glasfermenter. Der Fermenter wurde inoculiert mit 160 ml bis 200 ml der primären Impfkultur dieses Beispiels. Die Herstellung desselben war wie oben beschrieben.

Das inoculierte Gemisch wurde kultiviert bei 28ºC 18-20 Stunden lang, 200 rmp Rühren, Belüftungsgeschwindigkeit betrug 0,5 vvm. Am Ende der Fortpflanzung zeigte die Kultur die gleichen Eigenschaften wie vorstehend für die primäre Impfung beschrieben.

Transformation erfolgte in einem 60 l Fermenter, im Wesentlichen auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise, außer dass das Wachstumsmedium die in Tabelle 20 wiedergegebene Zusammensetzung hat und die ursprüngliche Charge der sekundären Impfkultur 350 ml bis 700 ml betrug. Die Rührgeschwindigkeit war ursprünglich 200 rpm, wurde jedoch erhöht auf 500 rpm falls erforderlich, um gelösten Sauerstoff über 10 Volumenprozent zu halten. Die ungefähre Bioumwandlungszeit für 20 g/l Canrenon betrug 80 bis 160 Stunden.

Beispiel 6

Unter Verwendung einer Sporensuspension aus der Arbeitszellenbank, hergestellt gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Methode wurden primäre und sekundäre Impfkulturen hergestellt, auch im Wesentlichen auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise. Unter Verwendung der sekundären Impfkultur, hergestellt auf diese Weise, wurden zwei Bioumwandlungsreihen gemacht, gemäß einem modifizierten Verfahren des Typs wie es in Fig. 1 erläutert wird und zwei Reihen wurden gemacht mit dem Verfahren erläutert in Fig. 2. Das Transformationswachstumsmedium, Canrenonzusatzpläne, Erntezeiten und Umsetzungsgrad dieser Reihen werden in Tabelle 21 wiedergegeben. Reihe R2A verwendete ein Canrenonzusatzschema basierend auf dem gleichen Prinzip wie Beispiel 3, während Reihe R2C das Beispiel 3 Schema modifizierte, wobei nur zwei Zugaben von Canrenon erfolgten, eine bei Beginn der Beschickung und eine nach 24 Stunden. In Reihen R2B und R2D wurde die gesamte Canrenoncharge zugesetzt zu Beginn der Beschickung und das Verfahren im Allgeimeinen auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise durchgeführt, außer, dass die Canrenoncharge sterilisiert wurde in einem getrennten Gefäß, bevor es dem Fermenter zugesetzt wurde und Glucose wurde zugesetzt während die Beschickung fortschritt. Ein Waring Mischer wurde verwendet, um Klumpen, die sich bei der Sterilisation gebildet hatten, zu zerkleinern. In Reihen R2A und R2B wurde Canrenon in die Beschickung eingeführt in Methanollösung, worin in diesem Punkte diese Reihen weiter differierten von den Reihen der Bieispiele 3 bzw. 4.

In den Reihen R2A und R2B akkumulierte die Methanolkonzentration auf etwa 6,0% in der Fermentationsbrühe, was als hemmend auf das Wachstum der Kultur und die Bioumwandlung erachtet wurde. Jedoch auf der Basis der Ergebnisse dieser Reihen folgerte man, dass Methanol oder andere mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wirksamer dienen könnten bei niedrigeren Konzentrationen, um die Canrenoncharge zu steigern und Canrenon als einen feinteiligen Niederschlag zu liefern, wobei ein großer Grenzflächenbereich zur Verfügung gestellt wird, um Canrenon dem Gegenstand der Reaktion zuzuliefern.

Canrenon erwies sich stabil bei Sterilisationstemperaturen (121ºC), aggregierte jedoch in Klumpen. Ein Waring Mischer wurde verwendet, um die Klumpen in feine Teilchen zu zerkleinern, die erfolgreich zum Produkt umgewandelt wurden.

Beispiel 7

Unter Verwendung einer Sporensuspension von der Arbeitszellbank, hergestellt gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Methode, wurden primäre und sekundäre Impfkulturen hergesellt ebenfalls im Wesentlichen auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise. Die Beschreibung und Ergebnisse des Beispiels 7 sind in Tabelle 22 gezeigt. Unter Verwendung der sekundären Impfkultur, die auf diese Weise hergestellt worden war, wurde eine Bioumwandlung (R3C) im Wesentlichen durchgeführt wie in Beispiel 3 beschrieben und drei Bioumwandlungen wurden durchgeführt gemäß dem Verfahren, das im Allgemeinen im Beispiel 5 beschrieben wurde. In den letzteren 3 Reihen (R3A, R3B und R3D) wurde Canrenon in einem tragbaren Tank sterilisiert zusammen mit dem Wachstumsmedium, außer Glucose. Glucose wurde aseptisch von einem anderen Tank zugeführt. Die sterilisierte Canrenonsuspension wurde in den Fermenter eingeführt entweder vor der Impfung oder während des frühen Stadiums der Bioumwandlung. In Reihe R3B wurden zusätzliches steriles Canrenon und Wachstumsmedium nach 46,5 Stunden eingeführt. Klumpen von Canrenon, die sich bei der Sterilisation gebildet hatten, wurden zerkleinert durch einen Waring Mischer, wodurch eine feinteilige Suspension hergestellt wurde, die in den Fermenter eintrat. Das Transformationswachstumsmedium, Canrenonzugabepläne, Nährstoffzugabepläne, Erntezeiten und Umwechslungsgrade für diese Reihen werden in den Tabellen 22 und 23 dargelegt.

Aufgrund des Faserwachstums wurde eine hochviskose Fermenterbrühe in allen vier Reihen dieses Beispiels gesehen. Um Hindernisse zu überwinden, die mit hoher Viskosität verbunden sind, die mit Bezug auf die Belüftung geschaffen werden, wurden das Vermischen, pH Kontrolle und Temperaturkontrolle, Belüftungsgeschwindigkeit und Rührgeschwindigkeit während dieser Reihen erhöht. Die Umwandlungen erfolgten zufriedenstellend unter den strengeren Bedingungen, jedoch bildete sich ein dichter Kuchen oberhalb der Flüssigbrühenoberfläche. Einiges nicht umgesetztes Canrenon wurde aus der Brühe hinausgetragen durch diesen Kuchen.

Beispiel 8

Die Beschreibung und Ergebnisse von Beispiel 8 sind in Tabelle 24 zusammengefaßt. Vier Fermentationsreihen wurden gemacht, worin 11α-Hydroxycanrenon hergestellt wurde durch Bioumwandlung von Canrenon. In zwei dieser Reihen (R4A und R4D) erfolgte die Bioumwandlung im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie die Reihen R3A und R3D von Beispiel 6. In Reihe R4C wurde Canrenon umgewandelt zu 11α-Hydroxycanrenon im Allgemeinen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 beschrieben. In Reihe R4B erfolgte das Verfahren allgemein wie in Beispiel 4 beschrieben, d. h. mit Sterilisation von Canrenon und Wachstumsmedium im Fermenter direkt vor der Inoculierung, alle Stickstoff und Phosphornährstoffe wurden eingeführt am Beginn der Beschickung und eine zusätzliche Lösung, enthaltend nur Glucose wurde in den Fermenter eingeführt, um den Glucosespiegel während des Fortschreitens aufrechtzuerhalten. Im letzteren Verfahren (Reihe R4B) wurde die Glucosekonzentration alle 6 Stunden lang beobachtet und Glucoselösung wurde zugesetzt wie angezeigt, um Glucosespiegel im Bereich von 0,5 bis 1% zu halten. Die Canrenonzugabepläne für diese Reihen werden in Tabelle 25 wiedergegeben.

Alle Fermenter wurden betrieben unter starkem Rühren und starker Belüftung während des größten Teiles des Fermentationszyklus, da die Fermentationsbrühe hoch viskos geworden war innerhalb eines Tages oder nachdem Inoculieren.

Beispiel 9

Das Transformationswachstumsmedium, Canrenonzugabepläne, Erntezeiten und Umwandlungsgrade für die Reihen dieses Beispiels sind in Tabelle 26 wiedergegeben.

Vier Bioumwandlungsreihen erfolgten im Wesentlichen auf die in Beispiel 8, Reihe R4B beschriebene Weise, außer wie nachstehend beschrieben. In Reihe R5B wurde der für das Rühren benutzte Top-Turbinenscheiben-Impeller der anderen Reihen ersetzt durch einen abwärts pumpenden Marineimpeller. Die axial abwärts pumpende Wirkung schüttete die Brühe in das Zentrum des Fermenters und reduzierte die Kuchenbildung. Methanol (200 ml) wurde sofort nach dem Inoculieren in Reihe R5D zugesetzt. Da Canrenon im Fermenter sterilisiert wurde, wurden alle Nährstoffe, außer Glucose, beim Beginn der Beschickung zugesetzt, wodurch die Notwendigkeit der Kettenbeschickung von Stickstoffquellen, Phosphorquellen oder Antibiotika vermieden wurde.

Um die Immersion der festen Phase aufrechtzuerhalten, die oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche wuchs, wurde Wachstumsmedium (2 l) jedem Fermenter 96 Stunden nach Beginn der Beschickung zugesetzt. Mischprobleme wurden nicht vollständig überwunden durch entweder Zugabe von Wachstumsmedium oder Verwendung von nach unten pumpendem Impeller (Reihe R5B), jedoch die Ergebnisse der Reihen demonstrierten die Einfachheit und die Vorteile des Verfahrens und zeigten an, dass zufriedenstellendes Mischen durch übliche Praxen erzielt werden konnte.

Beispiel 10

Drei Bioumwandlungsreihen erfolgten im Wesentlichen auf die in Beispiel 9 beschriebene Weise. Das Transformationswachstumsmedium, Canrenonzugabepläne, Erntezeiten und Umwandlungsgrade für die Reihen dieses Beispiels werden in Tabelle 27 wiedergegeben:

Wachstumsmedium (1,3 l) und steriles Wasser (0,8 l) wurden zugesetzt nach 71 Stunden in Reihe R6A, um Mycelkuchen unterzutauchen, der oberhalb der Oberfläche der Flüssigkeitsbrühe gewachsen war. Zum gleichen Zweck wurden Wachstumsmedium (0,5 l) und steriles Wasser (0,5 l) nach 95 Stunden in Reihe R6B zugesetzt. Materialgleichgewichtsdaten zeigten, dass ein besseres Massengleichgewicht bestimmt werden konnte, wo der Kuchenaufbau oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche minimiert worden war.

Beispiel 11

Fermentationsreihen erfolgten, um die Vorsterilisierung von Canrenon mit Sterilisierung von Canrenon und Wachstumsmedium im Transformationsfermenter zu vergleichen. In Reihe R7A erfolgte das Verfahren wie in Fig. 2 erläutert unter Bedingungen vergleichbar mit denjenigen der Reihen R2C, R2D, R3A, R3B, R3D, R4A und R4D. Reihe R7B wurde in Fig. 3 erläutert unter Bedingungen vergleichbar mit denjenigen der Beispiele 4, 9 und 10 und Reihe R4B. Das Transformationswachstumsmedium, Canrenonzugabepläne, Erntezeiten und Umwandlungsgrade für die Reihen dieses Beispiels werden in Tabelle 28 wiedergegeben:

Ein Massengleichgewicht auf der Basis der letzten Probe, die von Reihe R7B entnommen wurde, betrug 89,5%, wodurch angezeigt wurde, dass kein wesentlicher Substratverlust oder Abbau in der Bioumwandlung stattfand. Das Mischen erwies sich als ausreichend für beide Reihen.

Restliche Glucosekonzentration war über dem gewünschten 5-10 g je Liter Kontrollbereich während der ersten 80 Stunden. Die Leistung der Reihen war offensichtlich unbeeinträchtigt durch einen leichten Kuchen, der sich in dem oberen Zwischenraum beider Fermenter angesammelt hatte.

Beispiel 12

Extraktionsleistung wurde bestimmt in einer Reihe von 1 l Extraktionsreihen, wie in Tabelle 29 zusammengefaßt. In jeder dieser Reihen wurden Steroide extrahiert vom Mycel unter Verwendung von Ethylacetat (1 l/l Fermentationsvolumen). Zwei nacheinander erfolgende Extraktionen wurden in jeder Reihe durchgeführt. Auf der Basis von RP-HPLC wurden etwa 80% des Gesamtsteroids in der ersten Extraktion gewonnen und die Gewinnung wurde gesteigert auf 95% durch die zweite Extraktion. Eine dritte Extraktion würde weitere 3% Steroid gewonnen haben. Die restlichen 2% gingen verloren im Überstand der wässrigen Phase. Der Extrakt wurde zur Trockne eingeengt unter Anwendung von Vakuum, wurde jedoch nicht mit irgendeinem zusätzlichen Lösungsmittel gewaschen. Vertreiben mit Lösungsmittel würde die Gewinnung von der ersten Extraktion verbessern, falls durch Verfahrenswirtschaftlichkeit dies gerechtfertigt wäre.

Methylisobutylketon (MIBK) und Toluol wurden bewertet als Extraktions/Kristallisationslösungsmittel für 11α-Hydroxycanrenon bei der Größenordnung von 1 l Brühe. Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Extraktionsprotokolls waren MIBK und Toluol vergleichbar mit Ethylacetat sowohl bei der Extraktionseffizienz als auch bei der Kristallisationsleistung.

Beispiel 13

Als Teil der Bewertung der Verfahren der Fig. 2 und 3 wurden Teilchengrößenstudien durchgeführt am Canrenonsubstrat, das zu Beginn des Fermentationszyklus in jedem dieser Verfahren geliefert wurde. Wie vorstehend beschrieben wurde die Canrenonbeschickung zum Verfahren der Fig. 1 mikronisiert vor der Einführung in den Fermenter. In diesem Verfahren wird das Canrenon nicht sterilisiert, wobei Wachstum und unerwünschte Mikrooranismen kontrolliert werden durch Zugabe von Antibiotika. Die Verfahren der Fig. 2 und 3 sterilisieren das Canrenon vor der Reaktion. Im Verfahren der Fig. 2 erfolgt dies in einem Mischer vor der Zuführung von Canrenon in den Fermenter. Im Verfahren der Fig. 3 wird eine Suspension von Canrenon im Wachstumsmedium im Fermenter sterilisiert beim Start der Beschickung. Wie vorstehend diskutiert tendiert die Sterilisierung dazu, Agglomerierung von Canrenonpartikeln zu verursachen. Wegen der begrenzten Löslichkeit von Canrenon im wässrigen Wachstumsmedium hängt die Produktivität des Verfahrens vom Massentransfer von der festen Phase ab und somit kann erwartet werden, dass sie abhängt vom Grenzflächenbereich, der durch das Festpartikelsubstrat zur Verfügung gestellt wird, was seinerseits wieder von der Teilchengrößenverteilung abhängt. Diese Überlegungen dienten anfänglich als Abschreckung gegenüber den Verfahren der Fig. 2 und 3.

Jedoch stellte man fest, dass das Rühren im Mischer von Fig. 2 und im Fermentationstank von Fig. 3 zusammen mit der Wirkung der verwendeten Scherpumpe für den Transfer der Beschickung in Fig. 2 die Agglomerate zu einem Teilchengrößenbereich abbaut, der in etwa demjenigen entspricht, der nicht sterlisierten und mikronisierten Canrenonbeschickung zum Verfahren der Fig. 1. Dies wird erläutert durch die Teilchengrößenverteilungen für Canrenon, wie sie zu Beginn des Reaktionszyklus in jedem der drei Verfahren zur Verfügung stehen. Siehe Tabelle 30 und Fig. 4 und 5.

Von den Daten in Tabelle 30 kann festgestellt werden, dass Rührer und Scherpumpen wirksam sind, um die mittlere Teilchengröße des sterilisierten Canrenons zu reduzieren auf die gleiche Größenordnung wie das nicht sterilisierte Substrat, jedoch bleibt ein beachtlicher Größenunterschied zugunsten des nicht sterilisierten Substrats. Trotz dieses Unterschiedes zeigten die Reaktionsleistungsdaten, dass die Vorsterilisationsverfahren mindestens so produktiv waren wie das Verfahren von Fig. 1. Weitere Vorteile können realisiert werden im Verfahren von Fig. 2 durch gewisse Stufen zum weiteren Reduzieren und Kontrollieren der Teilchengröße, z. B. Naßvermahlen des sterilisierten Canrenons und/oder durch Pasteurisieren anstelle von Sterilisieren.

Beispiel 14

Eine Impfkultur wurde hergestellt auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise. Nach 20 Stunden war das Mycel in dem Inoculumfermenter pulpig mit 40% PMV. Sein pH Wert betrug 5,4 und 14,8 gpl Glucose blieb unverwendet.

Ein Transformationswachstumsmedium (35 l) wurde hergestellt mit der in Tabelle 20 gezeigten Zusammensetzung. Bei der Herstellung des Beschickungsmediums wurden Glucose und Hefeextrakt gesondert sterilisiert und vermischt als eine einzige Beschickung bei einer anfänglichen Konzentration von 30 Gewichtsprozent Glucose und 10 Gewichtsprozent Hefeextrakt. pH der Beschickung wurde eingestellt auf 5,7.

Unter Verwendung dieses Mediums (Tabelle 20) erfolgten zwei Bioumwandlungsreihen für die Umwandlung von Canrenon zu 11α-Hydroxycanrenon. Jede dieser Reihen wurde durchgeführt in einem 60 l Fermenter, der ausgestattet war mit einem Rührer, umfassend einen Rushton Turbinenimpeller und zwei Lightnin' A315 Impeller.

Ursprüngliche Beschickung des Wachstumsmediums zum Fermenter betrug 35 l. Mikronisiertes und nicht sterilisiertes Canrenon wurde in einer anfänglichen Konzentration von 0,5% zugesetzt. Das Medium im Fermenter wurde inoculiert mit einer Impfkultur, die auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise hergestellt worden war mit einem anfänglichen Inoculationsverhältnis von 2,5%. Die Fermentation erfolgte bei einer Temperatur von 28ºC, einer Rührgeschwindigkeit von 200 bis 500 rpm, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 vvm und einem Rückdruck, der ausreicht, um den gelösten Sauerstoffspiegel auf mindestens 20 Volumenprozent zu halten Die während der Produktionsreihe entwickelte Transformationskultur lag in der Form von sehr kleinen ovalen Pellets vor (etwa 1-2 mm). Canrenon und zusätzliche Nährstoffe wurden in Kette zugesetzt zum Fermenter im Allgemeinen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise. Nährstoffzugaben erfolgten alle vier Stunden in einem Verhältnis von 3,4 g Glucose und 0,6 g Hefeextrakt je Liter Brühe im Fermenter.

In Tabelle 31 werden die Belüftungsgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit, entwickelter Sauerstoff, PMV und pH wiedergegeben, die Vorlagen bei den angegebenen Intervallen während jeder der Reihen dieses Beispiels, als auch die Glucosezugaben, die während der Beschickung erfolgten. Tabelle 32 zeigt das Canrenonumwandlungsprofil. Reihe R11A wurde nach 46 Stunden bestimmt; Reihe R11B dauerte 96 Stunden. In der letzteren Reihe wurden 93% Umwandlung erreicht nach 81 Stunden; eine weitere Beschickungszugabe erfolgte nach 84 Stunden und das Beschicken wurde dann beendet. Es wird bemerkt, dass eine wesentliche Änderung der Viskosität auftrat zwischen der Zeit, wo die Beschickung gestoppt wurde und dem Ende der Reihe.

Beispiel 15

Verschiedene Kulturen wurden getestet auf ihre Wirksamkeit bei der Bioumwandlung von Canrenon zu 11α-Hydroxycanrenon gemäß den allgemeinen vorstehend beschriebenen Verfahren.

Eine Arbeitszellbank von jeweils Aspergillus niger ATCC 11394, Rhizopus arrhizus ATCC 11145 und Rhizopus stolonifer ATCC 6227b wurde auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise hergestellt. Wachstumsmedium (50 ml) mit der in Tabelle 18 dargelegten Zusammensetzung wurde inoculiert mit einer Sporensuspension (1 ml) von der Arbeitszellbank und in einen Inkubator getan. Eine Impfkultur wurde hergestellt im Inkubator durch Fermentation bei 26ºC etwa 20 Stunden lang. Der Inkubator wurde gerührt mit einer Geschwindigkeit von 200 rpm.

Aliquote Mengen (2 ml) der Impfkultur von jedem der Mikroorganismen wurde verwendet, um Transformationskolben zu impfen, die Wachstumsmedium (30 ml) von Tabelle 18 enthielten. Jede Kultur wurde verwendet zur Inokulierung von zwei Kolben, insgesamt sechs. Canrenon (200 mg) wurde gelöst in Methanol (4 ml) bei 36ºC und 0,5 ml aliquote Mengen dieser Lösung wurde in jeden dieser Kolben hineingetan. Die Bioumwanldung erfolgte im Allgemeinen unter denen in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen mit Zugaben von 50 Gewichtsprozent Glucoselösung (1 ml) täglich. Nach den ersten 72 Stunden wurden folgende Beobachtungen gemacht bei der Entwicklung von Mycel in den jeweiligen Transformations-Fermentationskolben:

ATCC 11394 - gutes gleichmäßiges Wachstum

ATCC 11145 - gutes Wachstum in den ersten 48 Stunden, jedoch das Mycel klumpte zu einem Ball, kein sichtbares Wachstum in den letzten 24 Stunden;

ATCC 6227b - gutes Wachstum; die Mycelmasse bildete einen verklumpten Ball.

Proben der Brühe wurden genommen, um sie auf das Ausmaß der Bioumwandlung zu analysieren. Nach drei Tagen lieferte die Fermentation unter Verwendung von ATCC 11394 Umwandlung zu 11α-Hydroxycanrenon 80 bis 90%; ATCC 11145 lieferte eine Umwandlung von 50% und ATCC 6227b lieferte eine Umwandlung von 80 bis 90%.

Beispiel 16

Unter Anwendung von im Wesentlichen der in Beispiel 15 beschriebenen Methode wurden die zugesetzten Mikroorganismen getestet auf Wirksamkeit bei der Umwandlung von Canrenon zu. 11α-Hydroxycanrenon. Die getesteten Organismen und die Ergebnisse dieser Tests werden in Tabelle 33 wiedergegeben:

Beispiel 17

Verschiedene Mikroorganismen wurden testet auf ihre Wirksamkeit in der Umwandlung von Canrenon zu 9α-Hydroxycanrenon. Fermentationsmedien für die Reihen dieses Beispiels wurden wie in Tabelle 34 dargelegt hergestellt:

TABELLE 34

Sojabohnenmehl:

Dextrose 20 g

Sojabohnenmehl 5 g

NaCl 5 g

Hefeextrakt 5 g

KH&sub2;PO&sub4; 5 g

Wasser auf 1 l

pH 7,0

Pepton/Hefeextrakt/Glucose:

Glucose 40 g

Bactopepton 10 g

Hefeextrakt 5 g

Wasser auf 1 l

Mueller-Hinton:

Rinderinfusion 300 g

Casamino-Säuren 17,5 g

Stärke 1,5 g

Wasser auf 1 l

Fungi wurden gezüchtet in Sojabohnenmehlmedium und in Pepton-Hefeextrakt-Glucose; Atinomyceten und Eubacterien wurden gezüchtet in Sojabohnenmehl (plus 0,9 Gewichtsprozent Na Formiat für die Bioumwandlungen) und in Mueller-Hinton Brühe.

Starter-Kulturen wurden inoculiert mit gefrorenen Sporenvorräten (20 ml Sojabohnenmehl in 250 ml Erlenmayerkolben). Die Kolben wurden bedeckt mit einem Milchfilter und Bioschutzschild. Starterkulturen (24 oder 48 Stunden alt) wurden verwendet, um Metabolismuskulturen zu inoculieren (ebenfalls 20 ml in 250 ml Erlenmayerkolben) - mit einem 10% bis 15% Kreuzungsvolumen - und die letzteren wurden inkubiert 24 bis 48 Stunden vor der Zugabe von Steroidsubstrat für die Transformationsreaktion.

Canrenon wurde gelöst/suspendiert in Methanol (20 mg/ml), Filter sterilisiert und der Kultur zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml. Alle Transformations-Fermentations-Kolben wurden geschüttelt bei 250 rpm (2" Hub) in einem Raum mit kontrollierter Temperatur bei 26ºC und 60% Feuchtigkeit.

Die Biotransformationen wurden geerntet nach 5 und 48 Stunden oder nach 24 Stunden nach Zugabe des Substrates. Die Ernte begann mit der Zugabe von Ethylacetat (23 ml) oder Methylenchlorid zum Fermentationskolben. Die Kolben wurden dann zwei Minuten lang geschüttelt und der Inhalt jedes Kolbens in ein konisches 50 ml Rohr gegossen. Um die Phasen zu trennen, wurden die Rohre zentrifugiert bei 4000 rpm 20 Minuten lang in einer Raumtempecatureinheit. Die organische Schicht von jedem Rohr wurde übertragen in eine 20 ml Borsilicatglasphiole und verdampft in einem Geschwindigkeitsvakuum. Die Phiolen wurden verschlossen und bei -20ºC aufbewahrt.

Um Material für die Strukturbestimmung zu erhalten, wurden die Biotransformationen hochgefahren auf 500 ml durch Erhöhung der Anzahl an Schüttelkolben-Fermentationen auf 25. Zur Zeit der Ernte (24 ode 48 Stunden nach Zugabe des Substrates) wurde Ethylacetat jedem einzelnen Kolben zugesetzt und die Kolben wurden verschlossen und zurück in den Schüttler 20 Minuten lang getan. Der Inhalt der Kolben wurde dann in Polypropylenflaschen geschüttet und zentrifugiert, um die Phasen zu trennen oder in einen Scheidetrichter, worin sich die Phasen durch Schwerkraft absetzen konnten. Die organische Phase wurde getrocknet, unter Erzielung von rohem Extrakt der Steroide, die in dem Reaktionsgemisch enthalten waren.

Das Reaktionsprodukt wurde zuerst analysiert durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel (250 um) Platten mit Fluoreszenzrückseite (254 nM). Ethylacetat (500 ul) wurde jeder Phiole zugesetzt, die getrockneten Ethylacetatextrakt vom Reaktionsgemisch enthielten. Weitere Analysen erfolgten durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektronomie. TLC Platten wurden entwickelt in einem 95 : 5 V/V Chloroform/Methanollösungsmittelgemisch.

Weitere Analysen erfolgten durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektronomie. Eine Waters HPLC mit Millennium Software, Photodioden-Reihendetektor und Autosampler wurden verwendet. Umkehrphasen HPLC verwendete eine Waters NovaPak C-18 (4 um Partikelgröße) RadialPak 4 mm Patrone. Der 25-minütige lineare Lösungsmittelgradient begann mit der initialisierten Säule in Wasser : Acetonitril (75 : 25) und endete bei Wasser : Acetonitril (25 : 75). Darauf folgte ein drei-minütiger Gradient zu 100% Acetonitril und vier Minuten einer isocratischen Waschung vor der Säulenregeneration zu den ursprünglichen Bedingungen.

Für LC/MS wurde Ammoniumacetat zu Acetonitril und zu den Wasserphasen zugesetzt bei einer Konzentration von 2 nM. Chromatographie wurde nicht wesentlich beeinträchtigt. Die Eluierung von der Säule wurde gesplittet 22 : 1, wobei die Hauptmenge des Materials zum PDA Detektor gerichtet war. Die verbleibenden 4,5% des Materials wurden gerichtet zur Elektrospray- Ionisierungskammer eines Sciex API III Massenspektrometers. Die Massenspektronomie erfolgte auf positive Weise. Eine analoge Datenlinie vom PDA Detektor auf die HPLC transferierte ein einziges Wellenlängenchromatogramm zum Massenspektrometer für co-Analysen der UV und MS Daten.

Massenspektrometrische Fragmentationsmuster erwiesen sich als geeignet zum Sortieren unter den hydroxylierten Substraten. Die beiden erwarteten hydroxylierten Canrenone, 11α- Hydroxy und 9α-Hydroxy, verloren Wasser bei unterschiedlichen Frequenzen auf konsistente Weise, was als eine Diagnose verwendet werden konnte. Außerdem bildete das 9α- Hydroxycanrenon ein Ammoniumaddukt leichter als dies 11α-Hydroxycanrenon tat. In Tabelle 35 ist eine Zusammenfassung der TLC, HPLC/UV und LC/MS Daten für Canrenon-Fermentationen dargelegt, wobei gezeigt wird, welche der getesteten Mikroorganismen wirksam waren bei der Bioumwandlung von Canrenon zu 9α-Hydroxycanrenon. Von diesen war Corynespora cassiicola ATCC 16718 der bevorzugte Mikroorganismus.

Beispiel 18

Verschiedene Kulturen wurden getestet auf ihre Wirksamkeit bei der Bioumwandlung von Androstendion zu 11α-Hydroxyandrostendion gemäß den allgemeinen vorstehend beschriebenen Verfahren.

Eine Arbeitszellbank von jeweils Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500); Aspergillus niger ATCC 11394; Aspergillus nidulans ATCC 11267; Rhizopus oryzade ATCC 11145; Rhizopus stolonifer ATCC 6227b; Trichothecium roseum ATCC 12519 und ATCC 8685 wurde hergestellt im Wesentlichen auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise. Wachstumsmedium (50 ml) mit der in Tabelle 18 angegebenen Zusammensetzung wurde inoculiert mit einer Sporensuspension (1 ml) von der Arbeitszellbank und in einen Inkubator getan. Eine Impfkultur wurde hergestellt im Inkubator zur Fermentation bei 26ºC 20 Stunden lang. Der Inkubator wurde gerührt mit einer Geschwindigkeit von 200 rpm.

Aliquote Mengen (2 ml) der Impfkultur von jedem Mikroorganismus wurden verwendet, um Transformationskolben zu inoculieren, die das Wachstumsmedium (30 ml) von Tabelle 15 enthielten. Jede Kultur wurde verwendet zum Inoculieren von zwei Kolben, eine Gesamtmenge von 16. Androstendion (300 mg) wurde gelöst in Methanol (6 ml) bei 36ºC und eine 0,5 ml aliquote Menge dieser Lösung wurde in jeden der Kolben eingeführt. Die Bioumwandlung erfolgte im Allgemeinen unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen 48 Stünden lang. Nach 48 Stunden wurden Proben der Brühe gepoolt und extrahiert mit Ethylacetat wie in Beispiel 17. Das Ethylacetat wurde eingeengt durch Verdampfen und Proben wurden analysiert durch Dünnschichtchromatographie, um zu bestimmen, ob ein Produkt vorlag, das die chromatographische Mobilität aufwies ähnlich derjenigen von 11α-Hydroxy-Androstendion Standard (Sigma Chemical Co., St. Louis). Die Ergebnisse werden in Tabelle 36 gezeigt. Positive Ergebnisse werden als "+" angezeigt.

Die Daten in Tabelle 36 demonstrieren, dass jede der aufgelisteten Kulturen in der Lage war eine Verbindung von Androstendion zu produzieren mit dem gleichen Rf-Wert wie derjenige des 11α-Hydroxyandrostendion-Standards.

Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500) wurde nochmals getestet durch das gleiche Verfahren wie vorstehend beschrieben und die Kulturprodukte wurden isoliert und gereinigt durch Normal-Phasen-Silicagelsäulenchromatographie unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel. Fraktionen wurden analysiert durch Dünnschichtchromatographie. TLC Platten waren Whatman K6F Silicagel 60 Å, 10 · 20 Größe, 250 u Dicke. Das Lösungsmittelgemisch war Chloroform : Methanol, 95 : 5, V/V. Das kristallisierte Produkt und 11α-Hydroxyandrostendion- Standard wurden beide analysiert durch LC-MS und NMR Spektroskopie. Beide Verbindungen ergaben gleiche Profile und Molekulargewichte.

Beispiel 19A

Verschiedene Mikroorganismen wurden getestet auf Wirksamkeit bei der Bioumwandlung von Androstendion zu 11β-Hydroxyandrostendion im Wesentlichen nach den vorstehenden in den Beispielen 17 und 18 beschriebenen Methoden.

Kulturen von jeweils Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Aspergillus niger ATCC 16888 und ATCC 26693, Epicoccum oryzae ATCC 7156, Curvularia lunata ATCC 12017, Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a und Pithomyces atro-olivaceus IFO 6651 wurden gezüchtet im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 17 beschrieben. Wachstums- und Fermentationsmedien (30 ml) hatten die in Tabelle 34 gezeigte Zusammensetzung.

Die 11β-Hydroxylierung von. Androstendion durch die vorstehend aufgelisteten Mikroorganismen wurde analysiert unter Anwendung von im Wesentlichen den gleichen Methoden für die Produktidentifizierung beschrieben in den Beispielen 17 und 18. Die Ergebnisse werden in Tabelle 19A-1 wiedergegeben.

In Tabelle 19A-1 zeigt ein "+" ein positives Ergebnis an, d. h. ein Rf wie in Dünnschichtchromatographie erwartet und ein etwa korrektes Molekulargewicht bei LC/MS.

Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die aufgelisteten Mikroorganismen in der Lage sind, die 11β-Hydroxylierung von Androstendion durchzuführen.

Beispiel 19B

Verschiedene Mikroorganismen wurden getestet auf ihre Wirksamkeit bei der Umwandlung von Mexrenon zu 11β-Hydroxymexrenon. Fermentationsmedien für dieses Beispiel wurden hergestellt wie in Tabelle 34 beschrieben.

Die Fermentationsbedingungen und Analysenmethoden waren diegleichen wie diejenigen in Beispiel 17. TLC Platten und das Lösungsmittelsystem war wie in Beispiel 18 beschrieben. Die Rationale für chromatographische Analyse ist wie folgt: 11α-Hydroxymexrenon und 11α- Hydroxycanrenon haben die gleiche chromatographische Mobilität. 11α-Hydroxycanrenon und 9α- Hydroxycanrenon zeigen das gleiche Mobilitätsmuster wie 11α-Hydroxyandrostendion und 11β- Hydroxyandrostendion. Somit sollte 11β-Hydroxymexrenon die gleiche Mobilität aufweisen wie 9α- Hydroxycanrenon. Somit liefen die vom Wachstumsmedium extrahierten Verbindungen gegen 9α- Hydroxycanrenon als ein Standard. Die Ergebnisse werden in Tabelle 37 gezeigt.

¹ M = Mueller-Hinton

P = PYG (Pepton/Hefeextrakt/Glucose)

S = Sojabohnenmehl

SF = Sojabohnenmehl plus Formiat

² ? = fraglicher Unterschied von keiner Substratkontrolle

Diese Daten legen nahe, dass die Mehrzahl der in dieser Tabelle aufgelisteten Organismen ein Produkt produzieren, das ähnlich oder identisch ist mit 11β-Hydroxymexrenon aus Mexrenon.

Beispiel 19C

Verschiedene Mikroorganismen wurden getestet auf ihre Wirksamkeit bei der Umwandlung von Mexrenon zu 11α-Hydroxymexrenon, Δ1,2-Mexrenon, 6β-Hydroxymexrenon, 12β-Hydroxymexrenon und 9α-Hydroxymexrenon. Mexrenon kann hergestellt werden auf die gleiche Weise wie dargelegt in Weier, U.S. Patent Nr. 3,787,396 und R. M. Weier et al., J. Med. Chem., Band 18, Seiten 817-821 (1975), welche durch Bezugnahme hier enthalten sind. Fermentationsmedien wurden hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, außer, dass Mexrenon eingearbeitet wurde. Die Fermentationsbedingungen waren diegleichen wie diejenigen in Beispiel 17; Analysenmethoden waren ebenfalls die gleichen wie diejenigen in den Beispielen 17 und 18. TLC Platten und das Lösungsmittelsystem waren wie in Beispielen 17 und 18 beschrieben.

Die getesteten Mikroorganismen und damit erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 19C-1 gezeigt.

In Tabelle 19C-1 zeigt ein "+" ein positives Ergebnis an, d. h. ein Rf wie in Dünnschichtchromatographie erwartet und eine Verweilzeit wie in HPLC erwartet. m/z 417 : 399 zeigt das Peak Höhenverhältnis des 417 Moleküls (Hydroxymexrenon) und des 399 Moleküls (Mexrenon) an. Der Standard hat ein 10 : 1 Verhältnis von Peak Höhe von m/z 417 zu m/z 399.

Das aus Beauveria bassiana ATCC 13144 erhaltene Produkt wurde isoliert vom Inkubationsgemisch und analysiert durch NMR und das strukturelle Profil dadurch bestätigt, dass es 11α-Hydroxymexrenon ist. Analogerweise wurde angenommen, dass die Produkte, die von den anderen in Tabelle 19C-1 aufgelisteten Organismen erhalten wurden, ebenfalls 11α- Hydroxymexrenon sind.

In Tabelle 19C-2 zeigt ein "+" ein positives Ergebnis an, d. h. ein Rf wie in Dünnschichtchromatographie erwartet, eine Verweilzeit, wie in HPLC erwartet, usw.

Das vom Bacterium cyclo-oxydans ATCC 12673 erhaltene Produkt wurde isoliert vom Inkubationsgemisch und analysiert durch NMR und das strukturelle Profil dadurch bestätigt, dass es Δ1,2-Mexrenon ist. Analogerweise wurde angenommen, dass die Produkte, die von den anderen in Tabelle 19C-2 aufgelisteten Organismen erhalten wurden ebenfalls Δ1,2-Mexrenon sind.

Produktion von 6β- und 12β-Hydroxymexrenon

Mortierella isabella ATCC 42613 wurde gezüchtet wie in Beispiel 17 in Gegenwart von Mexrenon. Die Fermentationsprodukte wurden isoliert und gereinigt durch Schnellchromatographie. Die gereinigten Produkte wurden analysiert durch LC/MS wie in den Beispielen 17 und 18 und Protonen NMR und Carbon-13 NMR. Die Daten zeigten an, dass die Produkte 6β- und 12β- Hydroxymexrenon enthielten.

Die in Tabelle 19C-3 aufgelisteten Mikroorganismen wurden gezüchtet unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 17 in Gegenwart von Mexrenon. Die Fermentationsprodukte wurden analysiert durch TLC und LG/MS wie in Beispiel 17 und 18. Ein "+" zeigt ein positives Ergebnis an, z. B. ein Rf wie in Dünnschichtchromatographie erwartet, eine Verweilzeit wie in HPLC erwartet, usw. Die Daten legen nahe, dass die Produkte 9α-Hydroxymexrenon enthalten.

Beispiel 19D

Verschiedene Mikroorganismen wurden getestet auf ihre Wirksamkeit bei der Umwandlung von Canrenon zu Δ9,11-Canrenon. Die Fermentationsmedien und Wachstumsbedingungen waren wesentlich die Gleichen wie in Beispiel 17, außer, dass Canrenon im Medium enthalten war. Die Analysemethoden waren wie in Beispielen 17 und 18 beschrieben. Die Mikroorganismen und Ergebnisse werden in Tabelle 19D-1 nachstehend gezeigt.

Die Fermentationsprodukte wurden analysiert durch TLC und LC/MS wie in den Beispielen 17 und 18. Ein "+" zeigt ein positives Ergebnis an, d. h. ein Rf wie in Dünnschichtchromatographie erwartet, eine Verweilzeit wie in HPLC erwartet, usw.

Das von Comomonas testosteroni ATCC 11996 erhaltene Produkt wurde isoliert vom Wachstumsmedium und analysiert durch UV Spektroskopie. Das spektroskopische Profil bestätigte die Gegenwart von Δ9,11-Canrenon. Analogerweise wurde angenommen, dass die von anderen in Tabelle 19D-1 aufgelisteten Organismen erhaltenen Produkte ebenfalls Δ9,11-Canrenon waren.

Beispiel 20A Schema 1: Stufe 1: Methode A: Herstellung von 5'R(5'α),7'β-20'-Aminohexadecahydro-11'β-hydroxy-10'a,13'α-dimethyl-3',5-dioxospiro[furan- 2(3H),17'α(5'H)-[7,4]metheno[4H[cyclopenta[a]phenanthren]-5'-carbonitril.

Ein 50 Gallonen mit Glas ausgekleideter Reaktor wurde beschickt mit 61,2 l (57,8 kg) DMF gefolgt durch 23,5 kg 11-Hydroxycanrenon 1 unter Rühren. Dem Gemisch wurden 7,1 kg Lithiumchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Minuten lang gerührt und 16,9 kg Acetoncyanohydrin wurde zugesetzt gefolgt durch 5,1 kg Triethylamin. Das Gemisch wurde auf 85ºC erhitzt und auf dieser Temperatur 13-18 Stunden lang gehalten. Nach der Reaktion wurden 353 l Wasser zugesetzt gefolgt durch 5,6 kg Natriumbicarbonat. Das Gemisch wurde auf 0ºC gekühlt, transferiert in einen 200 Gallonen mit Glas ausgekleideten Reaktor und langsam abgeschreckt mit 130 kg 6,7% Natriumhypochlorit-Lösung. Das Produkt wurde filtriert und gewaschen mit 3 · 40 l Portionen Wasser unter Bildung von 21,4 kg des Produktenamins.

H¹ NMR (DMSO-d&sub6;): 7,6 (2H, bd), 4,53 (1H, d, J = 5,9), 3,71 (1H, m), 3,0-1,3 (17H, m), 1,20 (5H, m), 0,86 (3H, s), 0,51 (1H, t, J = 10).

Beispiel 20B Herstellung von 7α-Cyano-11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-21-carbonsäure, γ- Lacton

50,0 g 11-Hydroxycanrenon und 150,0 ml Dimethylacetamid wurden in einen sauberen, trockenen Dreihals-Kolben gegeben, der ausgestattet war mit einem mechanischen Rührer, Kühler, Thermoanschluß und Heizmantel. 16,0 ml einer Schwefelsäurelösung (hergestellt durch Vermischen von 50,0 ml Schwefelsäure (98,7% Baker Grad) mit 50,0 ml Wasser) wurde diesem Gemisch zugesetzt. Eine Natriumcyanidlösung, enthaltend 15,6 g Natriumcyanid und 27,0 ml Wasser wurde dann zugesetzt.

Das dabei entstehende Gemisch wurde auf 80ºC 7 Stunden lang erhitzt, wobei der Umwandlungsgrad periodisch durch TLC oder HPLC überprüft wurde. Nach etwa 7 Stunden zeigte HPLC des Gemischs die Gegenwart der 7-Cyanoverbindung an. Das Gemisch wurde dann übernacht gerührt und man ließ es sich auf Raumtemperatur abkühlen (etwa 22ºC). 200 ml Wasser wurden dem Gemisch zugesetzt, gefolgt durch 200 ml Methylenchlorid und das dabei entstehende Zwei-Phasen-Gemisch gerührt und man ließ die Phasen sich trennen. Die wässrige Schicht war ein Gel. 100 ml Natriumbicarbonatlösung wurden der wässrigen Schicht zugesetzt in einem erfolglosen Versuch, das Gel aufzubrechen. Die wässrige Schicht wurde dann verworfen.

Die abgetrennte Methylenchloridschicht wurde gewaschen mit 100 ml Wasser und das dabei entstehende Zwei-Phasen-Gemisch gerührt. Man ließ die Phasen sich trennen und die abgetrennte Methylenchloridschicht wurde filtriert durch 200 g Silicagel (Aldrich 200-400 mesh, 60 Å). Das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt unter vermindertem Druck bei 45ºC unter Verwendung eines Wasseraspirators, unter Bildung von etwa 53,9 g eines rohen festen Produktes. Das rohe feste Produkt wurde dann gelöst in 50 ml Methylenchlorid und behandelt mit 40 ml 4 N Salzsäure in einem Scheidetrichter und man ließ das Zwei-Phasen-Gemisch sich trennen. Die Methylenchloridschicht wurde gewaschen mit 50 ml Wasser. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden extrahiert mit 50 ml Methylenchlorid. Die vereinigten Methylenchloridschichten wurden dann getrocknet über Natriumsulfat unter Bildung von 45 g eines Feststoffes, der ein Gemisch aus 11α- Hydroxycanrenon und dem Produkt 7α-Cyano-11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-21- carbonsäure, γ-Lacton war.

Eine Probe des Produktes wurde analysiert durch HPLC (Säule: 25 cm · 4,6 mm, 5 u Altima C&sub1;&sub8;LL); Lösungsmittelgradient: Lösungsmittel A = Wasser/Trifluoressigsäure = 99,9/0,1, Lösungsmittel B = Acetonitril/Trifluoressigsäure = 99,9/0,1, Fließgeschwindigkeit = 1,00 ml/Minute, Gradient = 65 : 30 (V/V) (A : B-ursprünglich), 35 : 65 (V/V) (A : B-nach20 Minuten), 10 : 90 (V/V) (A : B- nach 25 Minuten); Diodenreihendetektor) der einen λmax von 238 nm ergab.

Das Reaktionsgemisch wurde analysiert durch HPLC-NMR unter Anwendung folgender Bedingungen: HPLC-Säule: Zorbax RX-C8 (25 cm · 4,6 mm, 5 u) unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von 75% D&sub2;O, 25% Acetonitril zu 25% D&sub2;O, 75% Acetonitril über 25 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute; ¹H NMR (erhalten unter Verwendung von WET Lösungsmittel-Suppression): 5,84 (s, 1H), 4,01 (m, 1H), 3,2 (m, 1H), 2,9-1,4 (m, integral, nicht bedeutungsvoll aufgrund der Lösungsmittel-Suppression von Acetonitril), 0,93-0,86 (s, überlappend 3H und t, 2H).

Beispiel 20C Herstellung von 5β,7α-Dicyano-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregnan-21-carbonsäure, γ-Lacton

102 g (0,3 Mol) 17-Hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,6-dien-21-carbonsäure, γ-Lacton (Canrenon) wurde aufgeschlemmt mit 46,8 g (0,72 Mol) Kaliumcyanid, 78,6 ml (1,356 Mol) Essigsäure und 600 ml Methanol in einem drei Liter Dreihals-Rundkolben. 64,8 ml (0,78 Mol) Pyrrolidin wurden dem Gemisch zugesetzt und die vereinigte Schlemme auf Rückfluß (64ºC) erhitzt und darauf etwa 1,5 Stunden gehalten. Die Temperatur der Schlemme wurde dann auf 25ºC bis 30ºC binnen 10 Minuten mit einem Kühlbad erniedrigt. 120 ml einer konzentrierten Salzsäure wurde langsam während des Abkühlens zugesetzt, wobei ein bräunlicher Feststoff ausfiel.

Das Gemisch wurde gerührt bei 25ºC bis 30ºC 1,5 Stunden lang, dann weitere 500 ml Wasser binnen 30 Minuten zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 5ºC mit einem Eisbad gekühlt und der pH Wert von 3 auf 5,5 eingestellt (beobachtet unter Verwendung von pH Streifen) mit der Zugabe von 100 ml wässrigem 9,5 M Natriumhydroxid (0,95 Mol). Überschüssiges Cyanid wurde zerstört durch Zugabe von Haushaltsbleichmittel. 25 ml (0,020 Mol) wurden zugesetzt, um einen negativen Stärkeiodidtest zu erzielen. Das kalte Gemisch (10ºC) wurde filtriert und der Feststoff gewaschen mit Wasser, bis das Spülwasser einen neutralen pH Wert zeigte (pH Streifen). Der Feststoff wurde getrocknet bei 60ºC zu einem Konstantgewicht von 111,4 g.

Der isolierte Feststoff schmolz bei 244ºC bis 246ºC auf einem Fisher Johns Block. Eine Methanollösung, die den Feststoff enthielt, zeigte keine Absorption durch die UV Region von 210 bis 240 nm. IR (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹ 2222 (Cyanid), 1775 (Lacton), 1-732 (3-Keto). ¹H NMR (Pyridin d&sub5;) ppm 0,94 (s, 3H), 1,23 (s, 3H).

Beispiel 21A Schema 1: Stufe 2: Herstellung von 4'S(4'α),7'α-Hexadecahydro-11'α-hydroxy-10'β,13'β- dimethyl-3',5-20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β-[4,7]methano[17H]cyclopenta[a]phenanthren]-5'β(2'H)- carbonitril.

In einen 200 Gallonen mit Glas ausgekleideten Reaktor wurden 50 kg Enamin 2, etwa 445 l einer 0,8 N verdünnten Salzsäure und 75 l Methanol gegeben. Das Gemisch wurde auf 80ºC 5 Stunden lang erhitzt, auf 0ºC binnen 2 Stunden gekühlt. Das feste Produkt wurde filtriert unter Bildung von 36,5 kg des trockenen Produkt-Diketons.

H¹ NMR (DMSO-d&sub6;): 4,53 (1H, d, J = 6), 3,74 (2H, m), 2,73 (1H, dd, J = 14,7) 2,65-2,14 (8H, m), 2,05 (1H, t, J = 11), 1,98-1,71 (4H, m), 1,64 (1H, m), 1,55 (1H, dd, J = 13,5), 1,45-1,20 (7H, m), 0,86 (3H, s).

Beispiel 21B Schema 1: Stufen 1 und 2: In Situ Herstellung von 4'S(4'α),7'α-Hexadecahydro-11'α-hydroxy-10'β,13'β-dimethyl-3',5,20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β- [4,7]methano-[17H]cyclopenta[a]phenanthren]-5'β(2'H)-carbonitril aus 11α-Hydroxycanrenon.

In einem Reaktor, der ausgestattet war mit einem Kühler, mechanischem Rührer, Heizmantel und Regulator und einem Trichter wurde beschickt mit 100 g (280,54 mMol) 11- Hydroxycanrenon, hergestellt auf die Weise von Beispiel 1, gefolgt durch 300 ml Dimethylacetamid (Aldrich). Das Gemisch wurde gerührt bis das 11-Hydroxycanrenon verschwand. Diesem Gemisch wurden 31,5 ml einer 50% Schwefelsäure (Fisher) zugesetzt, die das Ansteigen der Temperatur des dabei entstehenden Gemischs auf 10ºC bis 15ºC verursachte. Eine Natriumcyanidlösung, hergestellt durch Lösen von 31,18 g (617,20 mMol) (Aldrich) Natriumcyanid in 54 ml entionisiertem Wasser wurde dann dem 11α-Hydroxycanrenongemisch binnen 2 bis 3 Minuten zugesetzt. Die Temperatur des dabei entstehenden Gemisches stieg auf etwa 20ºC bis 25ºC nach Zugabe der Natriumcyanidlösung.

Das Gemisch wurde auf 80ºC erhitzt und auf dieser Temperatur 2-3 Stunden lang gehalten. Nachdem HPLC Analyse angezeigt hatte, dass die Reaktion für die Umwandlung von 11α- Hydroxycanrenon zum Enamin im Wesentlichen beendet war (mehr als 98% Umwandlung), wurde die Wärmequelle entfernt. Ohne Isolierung des in dem Gemisch enthaltenen Enamins wurden weitere 148 ml einer 50% Schwefelsäure dem Gemisch binnen 3-5 Minuten zugesetzt. Nach 10 Minuten, wurden 497 ml entionisiertes Wasser dann dem Gemisch zugesetzt.

Das Gemisch wurde auf 102ºC erwärmt und bei dieser Temperatur gehalten bis etwa 500 g des Destillats vom Gemisch entfernt worden waren. Während der Reaktion/Destillation wurden 500 ml entionisiertes Wasser dem Gemisch in vier getrennten 125 ml Portionen zugesetzt. Jede Portion wurde dem Gemisch zugesetzt, nachdem eine äquivalente Menge des Destillats (etwa 125 ml) entfernt worden waren. Die Reaktion dauerte über 2 Stunden. Als HPLC Analyse anzeigte, dass die Reaktion, die das Enamin zum Diketon hydrolysierte im Wesentlichen beendet war (mehr als 98% Umwandlung), wurde das Gemisch auf etwa 80ºC binnen 20 Minuten gekühlt.

Das Gemisch wurde filtriert durch einen Glastrichter. Der Reaktor wurde gespült mit 1,2 l entionisiertem Wasser, um restliches Produkt zu entfernen. Der Feststoff auf dem Filter wurde dreimal gewaschen unter Verwendung von etwa gleichen Portionen (etwa 0,4 l) des Spülwassers. Eine 1 l Lösung von Methanol und entionisiertem Wasser(1 : 1 V/V) wurde im Reaktor hergestellt und das Filtrat wurde gewaschen mit 500 ml dieser Lösung. Das Filtrat wurde dann ein zweites Mal gewaschen mit den restlichen 500 ml der Methanol/Wasserlösung. Vakuum wurde auf den Trichter ausgeübt, um das Filtrat ausreichend zu trocknen für den Transfer. Das Filtrat wurde transferiert zu einem Trockenofen, wo es getrocknet wurde unter Vakuum 16 Stunden lang unter Bildung von 84 g des trockenen Produkt-Diketons, 4'S(4'α),7'α-Hexadecahydro-11'α-hydroxy-10'β,13'β-dimethyl- 3',5,20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β-[4,7]methano-[17H]cyclopenta[a]phenanthren]-5'β(2'H)- carbonitril aus 11α-Hydroxycanrenon. HPLC Untersuchung zeigt 94% des gewünschten Diketons an.

Beispiel 22 Schema 1: Stufe 3A: Methode A: Herstellung von Methyl Hydrogen 11α,17α,Dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton

Ein 4-Hals 5 l Rundkolben wurde ausgestattet mit mechanischem Rührer, Druckausgleichszugabetrichter mit Stickstoffeinlaßrohr, Thermometer und Kühler mit Einblasvorrichtung. Die Einblasvorrichtung wurde angeschlossen über ein Tygon Rohr an zwei 2-L Fallen, wobei die erste davon leer war und angebracht wurde, um ein Zurücksaugen des Materials in die zweite Falle zu verhindern (1 l konzentrierte Natriumhypochloritlösung) in das Reaktionsgefäß. Das Diketon 3 (79,50 g; [das Gewicht war nicht korrigiert auf Reinheit, die 85% betrug]) wurden dem Kolben in 3 l Methanol zugesetzt. Eine 25% methanolische Natriummethoxidlösung (64,83 g) wurde in den Trichter getan und tropfenweise zugesetzt unter Rühren unter Stickstoff binnen 10 Minuten. Nachdem die Zugabe beendet war, wurde das orange-gelbe Reaktionsgemisch auf Rückfluß 20 Stunden lang erhitzt. Nach diesem Zeitabschnitt wurden 167 ml 4 N HCl zugesetzt (Vorsicht: HCN Entwicklung an diesem Punkt!) tropfenweise durch den Zugabetrichter zum Destillierrückflußreaktionsgemisch. Das Reaktionsgemisch hellte sich in der Farbe auf zu einem blaß goldenen Orange. Der Kühler wurde dann ersetzt durch einen Abzugskopf und 1,5 l Methanol wurde entfernt durch Destillation, während 1,5 l Wasser gleichzeitig dem Kolben durch den Trichter zugegeben wurde in Übereinstimmung mit der Destillationsgeschwindigkeit. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt und zweimal extrahiert mit 2,25 l aliquoten Mengen Methylenchlorid. Die vereinigten Extrakte wurden nacheinander gewaschen mit 750 ml aliquoten Mengen an kalter gesättigter NaCl Lösung, 1 N NaOH und nochmals mit gesättigtem NaCl. Die organische Schicht wurde getrocknet über Natriumsulfat übernacht, filtriert und im Volumen reduziert auf etwa 250 ml im Vakuum. Toluol (300 ml) wurde zugesetzt und das rückständige Methylenchlorid wurde abgestreift unter vermindertem Druck, während dem das Produkt sich an den Wänden des Kolbens als ein weißer Feststoff zu bilden begann. Der Inhalt des Kolbens wurde übernacht gekühlt und der Feststoff durch Filtration entfernt. Er wurde gewaschen mit 250 ml Toluol und zweimal mit 250 ml aliqoten Mengen an Ether und auf einem Vakuumtrichter getrocknet unter Bildung von 58,49 g eines weißen Feststoffes, das 97,3% rein war gemäß HPLC. Beim Einengen der Mutterflüssigkeit wurden weitere 6,76 g eines 77,1% reinen Produktes erhalten. Die Gesamtausbeute eingestellt für Reinheit betrug 78%.

H¹ NMR (CDCl&sub3;): 5,70 (1H, s), 4,08 (1H, s), 3,67 (3H, s), 2,9-1,6 (19H, m), 1,5-1,2 (5H, m), 1,03 (3H, s).

Beispiel 23 Schema 1: Stufe 3B: Umwandlung von Methyl Hydrogen 11α,17α,Dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton zu Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-11α-(methylsulfonyl)oxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton.

Ein 5 l 4-Hals-Kolben wurde ausgestattet wie in vorstehendem Beispiel außer, dass kein Fallensystem neben dem Einblassystem installiert wurde. Eine Menge von 138,70 g des Hydroxyesters wurde dem Kolben zugegeben, gefolgt durch 1425 ml Methylenchlorid unter Rühren unter Stickstoff. Das Reaktionsgemisch wurde auf -5ºC gekühlt unter Verwendung eines Salz/Eisbades. Methansulfonylchlorid (51,15 g, 0,447 Mol) wurde schnell zugesetzt, gefolgt durch die langsame tropfenweise Zugabe von Triethylamin (54,37 g) in 225 ml Methylenchlorid. Zugabe, die etwa 30 Minuten dauerte, wurde so eingestellt, dass die Temperatur der Reaktion niemals über 5ºC stieg. Rühren wurde 1 Stunde fortgesetzt nach der Zugabe und der Inhalt der Reaktion wurde transferiert zu einem 12 l Scheidetrichter, dem 2100 ml Methylenchlorid zugesetzt wurden. Die Lösung wurde nacheinander gewaschen mit 700 ml aliquoten Mengen von jeweils kalter 1 N HCl, 1 N NaOH und gesättiger wässriger NaCl Lösung. Die wässrigen Waschungen wurden vereinigt und zurückextrahiert mit 3500 ml Methylenchlorid. Alle organischen Waschungen wurden vereinigt in einer 9 l Kanne, zu der 500 g neutrale Tonerde, Aktivitätsgrad II, zugesetzt wurde und 500 g wasserfreies Natriumsulfat. Der Inhalt der Kanne wurde 30 Minuten lang gemischt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft unter Bildung eines Gummi-artigen gelben Schaumes. Dieser wurde gelöst in 350 ml Methylenchlorid und 1800 ml Ether wurden tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Die Zugabegeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass ungefähr die Hälfte des Ethers binnen 30 Minuten zugesetzt worden war. Nachdem etwa 750 ml zugesetzt worden waren, begann das Produkt sich abzutrennen als ein kristalliner Feststoff. Der restliche Ether wurde binnen 10 Minuten zugesetzt. Der Feststoff wurde entfernt durch Filtration und der Filterkuchen wurde gewaschen mit 2 l Ether und in einem Vakuumofen getrocknet bei 50ºC übernacht, unter Bildung von 144,61 g (88%) eines fast weißen Feststoffes, Schmelzpunkt 149º-150ºC. Das auf Biese Weise hergestellte Material ist typischeweise 98-99% rein gemäß HPLC (Bereichs-%). In einem Durchgang wurde Material mit einem Schmelzpunkt von 153º-153,5ºC erhalten, mit einer Reinheit wie durch HPLC Bereich bestimmt von 99,5%.

H¹ NMR (CDCl&sub3;): 5,76 (1H, s), 5,18 (1H, dt), 3,68 (3H, s), 3,06 (3H, s), 2,85 (1H, m), 2,75-1,6 (19H, m), 1,43 (3H, s), 1,07 (3H, s).

Beispiel 24 Schema 1: Stufe 3C: Methode A: Herstellung von 7-Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Ein 1 l 4-Hals-Kolben wurde ausgestattet wie im zweiten Beispiel. Ameisensäure (250 ml) und Essigsäureanhydrid (62 ml) wurden dem Kolben unter Rühren unter Stickstoff zugesetzt. Kaliumformiat (6,17 g) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde erhitzt auf einem Ölbad zu einer Innentemperatur von 40ºC (dies wurde später wiederholt bei 70ºC mit besseren Ergebnissen) 16 Stunden lang. Nach 16 Stunden wurde das Mesylat zugesetzt und die Innentemperatur wurde auf 100ºC erhöht. Erhitzen und Rühren wurden 2 Stunden lang fortgesetzt, wonach das Gemisch entfernt wurde im Vakuum auf einem Rotationsverdampfer. Der Rückstand wurde gerührt mit 500 ml Eiswasser fünfzehn Minuten lang, dann zweimal extrahiert mit 500 ml aliquoten Mengen Ethylacetat. Die organischen Phasen wurden vereinigt und nacheinander gewaschen mit kalten 250 ml aliquoten Mengen gesättigter Natriumchloridlösung (zweimal), 1 N Natriumhydroxidlösung und nochmals mit gesättigtem Natriumchlorid. Die organische Phase wurde dann getrocknet über Natriumsulfat, filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft unter Bildung eines gelblich weißen Schaumes, der zu einem Glas pulverisierte, wenn er mit einem Spatel berührt wurde. Das gebildete Pulver 14,65 g wurde analysiert (gemäß HPLC Bereichs-%) als ein Gemisch aus 82,1% 7-Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy -3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton; 7,4% 7-Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3-oxopregna-4,11-dien 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton und 5,7% 9α,17-Dihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarbonsäure, bis(γ-Lacton).

H¹ NMR (CDCl&sub3;): 5,74 (1H, s), 5,67 (1H, m), 3,61 (3H, s), 3,00 (1H, m), 2,84 (1H, ddd, J = 2,6, 15), 2,65-2,42 (6H, m), 2,3-2,12 (5H, m), 2,05-1,72 (4H, m), 1,55-1,45 (2H, m), 1,42 (3H, s), 0,97 (3H, s).

Beispiel 25 Schema 1: Stufe 3C: Methode B: Herstellung von Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Ein 5 l 4-Hals-Kolben wurde ausgestattet wie in vorstehendem Beispiel und 228,26 g Essigsäure und 41,37 g Natriumacetat wurden unter Rühren unter Stickstoff zugesetzt. Unter Anwendung eines Ölbades wurde das Gemisch auf eine Innentemperatur von 100ºC erhitzt. Das Mesylat (123,65 g) wurde zugesetzt und das Erhitzen wurde 30 Minuten fortgesetzt. Am Ende dieses Abschnitts wurde das Erhitzen gestoppt und 200 ml Eiswasser wurden zugesetzt. Die Temperatur fiel auf 40ºC und das Rühren wurde 1 Stunde lang fortgesetzt, wonach das Reaktionsgemisch langsam in 1,5 l kaltes Wasser in einem 5 l Rührkolben gegossen wurde. Das Produkt trennte sich ab als ein Gummiartiges Öl. Das Öl gelöst in 1 l Ethylacetat und gewaschen mit 1 l von jeweils kalter gesättigter Chloridlösung, 1 N Natriumhydroxid und schließlich nochmals gesättigtem Natriumchlorid. Die organische Phase wurde getrocknet über Natriumsulfat und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft unter Bildung eines Schaumes, der zusammenfiel zu einem Gummi-artigen Öl. Dies wurde trituriert mit Ether für einige Zeit und erstarrte schließlich. Der Feststoff wurde filtriert und mit weiterem Ether gewaschen unter Bildung von 79,59 g eines gelb-weißen Feststoffes. Dieser bestand aus 70,4% des gewünschten Δ9,11-Enesters 6, 12,3% des Δ11,12-Enesters 8, 10,8% des 7-α,9-α-Lactons 9 und 5,7% nicht umgesetztem 5.

Beispiel 26 Schema 1: Stufe 3D: Methode A: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Ein 500 ml ummantelter 4-Hals-Reaktor wurde ausgestattet mit mechanischem Rührer, Kühler/Einblasvorrichtung, Thermometer und Zugabetrichter mit Stickstoffeinlassrohr. Der Reaktor wurde beschickt mit 8,32 g des rohen Enesters in 83 ml Methylenchlorid unter Rühren unter Stickstoff. Dem wurden 4,02 g dibasisches Kaliumphosphat zugesetzt, gefolgt durch 12 ml Trichloracetonitril. Externes Kühlwasser floß durch den Reaktormantel und das Reaktionsgemisch wurde auf 8ºC gekühlt. Dem Zugabetrichter wurden 36 ml 30% Wasserstoffperoxid binnen 10 Minuten zugesetzt. Das ursprünglich blaß gelbe Reaktionsgemisch wurde allmählich farblos, nachdem die Zugabe beendet war. Das Reaktionsgemisch blieb auf 9 ± 1ºC während der Zugabe und beim fortgesetzten Rühren übernacht (23 Stunden insgesamt). Methylenchlorid (150 ml) wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt und der gesamte Inhalt wurde zu etwa 250 ml Eiswasser gegeben. Dies wurde dreimal extrahiert mit 150 ml aliquoten Mengen Methylenchlorid. Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden gewaschen mit 400 ml kalter 3% Natriumsulfitlösung, um jegliches restliches Peroxid zu zersetzen. Danach erfolgte eine Waschung mit 330 ml kalter 1 N Natriumhydroxidwäsche, einer 400 ml kalten 1 N Salzsäurewasche und schließlich einer 400 ml Kochsalzlösungwäsche. Die organische Phase wurde getrocknet über Magnesiumsulfat, filtriert und der Filterkuchen wurde gewaschen mit 80 ml Methylenchlorid. Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt unter Bildung von 9,10 g Rohprodukt als ein blaß gelber Feststoff. Dieser wurde umkristallisiert aus ungefähr 25 ml 2-Butanon unter Bildung von 5,52 g fast weißen Kristallen. Eine Endumkristallisierung aus Aceton (etwa 50 ml ergab 3,16 g lange, nadelförmige Kristalle, Schmelzpunkt 241-243ºC.

H¹ NMR (CDCl&sub3;): 5,92 (1H, s), 3,67 (3H, s), 3,13 (1H, d, J = 5), 2,89 (1H, m), 2,81-2,69 (15H, m), 1,72 (1H, dd, J = 5, 15), 1,52-1,22 (5H, m), 1,04 (3H, s).

Beispiel 27 Schema 1: Stufe 3: Option 1: Aus 4'S(4'α),7'α-Hexadecahydro-11'α-hydroxy-10'β,13'β- dimethyl-3',5,20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β-[4,7]methano[1 7H]cyclopenta[a]phenantren]-5'β(2'H)- carbonitril zu Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton.

Diketon (20 g) wurde in einen sauberen und trockenen Reaktor gegeben gefolgt durch die Zugabe von 820 ml MeOH und 17,6 ml 25% NaOMe/MeOH Lösung. Das Reaktionsgemisch wurde auf Rückflußbedingungen erhitzt (etwa 67ºC) 16-20 Stunden lang. Das Produkt wurde abgeschreckt mit 40 ml 4 N HCl. Das Lösungsmittel wurde entfernt bei Atmosphärendruck durch Destillation. 100 ml Toluol wurden zugesetzt und das rückständige Methanol wurde entfernt durch azeotrope Destillation mit Toluol. Nach Einengen wurde der rohe Hydroxyester 4 gelöst in 206 ml Methylenchlorid und auf 0ºC gekühlt. Methansulfonylchlorid (5 ml) wurde zugesetzt, gefolgt durch eine langsame Zugabe von 10,8 ml Triethylamin. Das Produkt wurde 45 Minuten lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt durch Vakuumdestillation unter Bildung des rohen Mesylats 5.

In einem getrennten trockenen Reaktor wurden 5,93 g Kaliumformiat, 240 ml Ameisensäure gegeben, gefolgt durch 118 ml Essigsäureanhydrid. Das Gemisch wurde auf 70ºC 4 Stunden lang erhitzt.

Das Ameisensäuregemisch wurde der konzentrierten vorstehend hergestellten Mesylatlösung 5 zugesetzt. Das Gemisch wurde erhitzt auf 95-105ºC 2 Stunden lang. Das Produktgemisch wurde gekühlt auf 50ºC und die flüchtigen Komponenten wurden entfernt durch Vakuumdestillationen bei 50ºC. Das Produkt wurde aufgeteilt zwischen 275 ml Ethylacetat und 275 ml Wasser. Die wässrige Schicht wurde zurückextrahiert mit 137 ml Ethylacetat, gewaschen mit 240 ml kalter 1 N Natriumhydroxidlösung und dann 120 ml gesättigtem NaCl. Nach Phasentrennung wurde die organische Schicht eingeengt unter Vakuumdestillation unter Bildung des rohen Enesters.

Das Produkt wurde gelöst in 180 ml Methylenchlorid und gekühlt auf 0 bis 15ºC. 8,68 g Dikaliumhydrogenphosphat wurden zugesetzt, gefolgt durch 2,9 ml Trichloracetonitril. Eine 78 ml Lösung von 30% Wasserstoffperoxid wurde dem Gemisch binnen 3 Minuten zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gerührt bei 0-15ºC 6-24 Stunden lang. Nach der Reaktion wurde das Zwei-Phasen-Gemisch getrennt. Die organische Schicht wurde gewaschen mit 126 ml 3% Natriumsulfitlösung, 126 ml 0,5 N Natriumhydroxidlösung, 126 ml 1 N Salzsäure und 126 ml 10% Kochsalzlösung. Das Produkt wurde getrocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat oder filtriert über Celit und das Lösungsmittel Methylenchlorid wurde entfernt durch Destillation bei Atmosphärendruck. Das Produkt wurde kristallisiert aus Methylethylketon zweimal unter Bildung von 7,2 g des Epoxymexrenons.

Beispiel 28 Schema 1: Stufe 3: Option 2: Umwandlung von 1'S(4'α),7'α-Hexadecahydro-11'α-hydroxy-10'β,13'β-dimethyl-3',5,20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β- [4,7]methano[17H]cyclopenta[a]phenanthren]-5'β(2'H)-carbonitril zu Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy- 17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton ohne Zwischenproduktisolierung.

Ein 4-Hals 5 l Rundkolben wurde ausgestattet mit mechanischem Rührer, Zugabetrichter mit Stickstoffeinlaßrohr, Thermometer und Kühler mit Einblasvorrichtung angeschlossen an einen Natriumhypochloritwäscher. Das Diketon (83,20 g) wurde dem Kolben in 3,05 l Methanol zugesetzt. Der Zugabetrichter wurde beschickt mit 67,85 g einer 25% (G : G) Lösung von Natriummethoxid in Methanol. Unter Rühren unter Stickstoff wurde das Methoxid tropfenweise dem Kolben binnen 15 Minuten zugesetzt. Es entwickelte sich eine dunkelorange/gelbe Schlemme. Das Reaktionsgemisch wurde auf Rückfluß 20 Stunden lang erhitzt und 175 ml 4 N Salzsäure wurden tropfenweise zugesetzt, während weiter Rückflußbehandelt wurde. (Achtung: HCN Entwicklung während dieses Arbeitsganges!). Der Rückflußkühler wurde ersetzt durch einen Abzugskopf und 1,6 l Methanol wurden durch Destillation entfernt, während 1,6 l wässrige 10% Natriumchloridlösung tropfenweise durch den Trichter zugesetzt wurden bei einer Geschwindigkeit, die sich der Destillationsgeschwindigkeit anpaßte. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt und zweimal extrahiert mit 2,25 l aliquoten Mengen von Methylenchlorid. Die vereinigten Extrakte wurden gewaschen mit 750 ml aliquoten Mengen 1,N Natriumhydroxid und gesättigter Natriumchloridlösung. Die organische Schicht wurde getrocknet durch azeotrope Destillation des Methanols bei einer Atmosphäre zu einem Endvolumen von 1 l (0,5% des Gesamten wurden für Analyse entfernt).

Die konzentrierte organische Lösung (Hydroxyester) wurde zurückgeführt zum ursprünglichen Reaktionskolben, der wie vorstehende ausgestattet war, jedoch ohne HCN Falle. Der Kolben wurde auf 0ºC gekühlt und 30,7 g Methansulfonylchlorid wurden unter Rühren unter Stickstoff zugesetzt. Der Zugabetrichter wurde beschickt mit 32,65 g Triethylamin, welches tropfenweise binnen 15 Minuten zugesetzt wurde, wobei die Temperatur auf 5ºC gehalten wurde. Das Rühren wurde 2 Stunden lang fortgesetzt, während das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur erwärmt wurde. Eine Säule bestehend aus 250 g Dowex 50 W · 8-100 saurem Ionenaustauscherharz wurde hergestellt und gewaschen vor der Verwendung mit 250 ml Wasser, 250 ml Methanol und 500 ml Methylenchlorid. Das Reaktionsgemisch lief durch diese Säule durch und wurde gesammelt. Eine frische Säule wurde hergestellt und der vorstehende Prozess wurde wiederholt. Eine dritte 250 g Säule, bestehend aus Dowex 1 · 8-200 basischem Ionenaustauscherharz wurde hergestellt und vorbehandelt wie bei der vorstehend beschriebenen sauren Harzbehandlung. Das Reaktionsgemisch lief durch diese Säule durch und wurde gesammelt. Eine vierte Säule aus basischem Harz wurde hergestellt und das Reaktionsgemisch lief wieder durch die Säule und wurde gesammelt. Jeder Säulendurchgang war gefolgt durch zwei 250 ml Methylenchloridwaschungen durch die Säule und jeder Durchgang erforderte etwa 10 Minuten. Die Lösungsmittelwaschungen wurden vereinigt mit dem Reaktionsgemisch und das Volumen wurde reduziert im Vakuum auf etwa 500 ml und 2% davon wurden entfernt für qc. Der Rest wurde weiter reduziert zu einem Endvolumen von 150 ml (rohe Mesylatlösung).

Zu der ursprünglichen 5 l Reaktionszusammenstellung wurden 960 ml Ameisensäure, 472 ml Essigsäureanhydrid und 23,70 g Kaliumformiat zugesetzt. Dieses Gemisch wurde erhitzt unter Rühren unter Stickstoff auf 70ºC 16 Stunden lang. Die Temperatur wurde dann erhöht auf 100ºC und die rohe Mesylatlösung wurde binnen dreißig Minuten zugesetzt über einen Zugabetrichter. Die Temperatur wurde gesenkt auf 85ºC während Methylenchlorid aus dem Reaktionsgemisch herausdestillierte. Nachdem alles davon entfernt worden war, stieg die Temperatur zurück auf 100ºC und wurde dort 2,5 Stunden lang gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde auf 40ºC gekühlt und die Ameisensäure wurde entfernt unter Druck, bis das minimale Rührvolumen erreicht worden war (etwa 150 ml). Der Rückstand wurde gekühlt auf Umgebungstemperatur und 375 ml Methylenchlorid wurden zugesetzt. Der verdünnte Rückstand wurde gewaschen mit kalten 1 l Portionen gesättigter Natriumchloridlösung, 1 N Natriumcarbonat und wiederum mit Natriumchloridlösung. Die organische Phase wurde getrocknet über Magnesiumsulfat (150 g) und filtriert unter Bildung einer dunkel rötlich-braunen Lösung (rohe Enesterlösung).

Ein ummantelter 1 l 4-Hals-Reaktor wurde ausgestattet mit mechanischem Rührer, Kühler/Einblasvorrichtung, Thermometer und Zugabetrichter mit Stickstoffeinlaßrohr. Der Reaktor wurde beschickt mit der rohen Enesterlösung (geschätzt 60 g) in 600 ml Methylenchlorid unter Rühren unter Stickstoff. Dem wurden 24,0 g dibasisches Kaliumphosphat zugesetzt, gefolgt durch 87 ml Trichloracetonitril. Äußeres Kühlwasser floß durch die Reaktorummantelung und das Reaktionsgemisch wurde auf 10ºC gekühlt. Dem Zugabetrichter wurden 147 ml 30% Wasserstoffperoxid dem Gemisch binnen 30 Minuten zugesetzt. Das ursprüngliche dunkel rötlich- braun gefärbte Reaktionsgemisch wurde hellgelb nachdem die Zugabe beendet war. Das Reaktionsgemisch blieb auf 10 ± 1ºC während der Zugabe und beim fortgesetzten Rühren übernacht (23 Stunden insgesamt). Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Portion wurde zweimal extrahiert mit 120 ml Portionen Methylenchlorid. Die vereinigten organischen Phasen wurden dann gewaschen mit 210 ml 3% Natriumsulfitlösung. Dies wurde ein zweites Mal wiederholt, wonach der organische und der wässrige Teil negativ wurden für Peroxid gemäß Stärke/Iodid-Testpapier. Die organische Phase wurde nacheinander gewaschen mit 210 ml aliquoten Mengen kaltem 1 N Natriumhydroxid, 1 N Salzsäure und schließlich zwei Waschungen mit Kochsalzlösung. Die organische Phase wurde azeotrop getrocknet auf ein Volumen von etwa 100 ml, frisches Lösungsmittel wurde zugesetzt (250 ml) und azeotrop destilliert zu den gleichen 100 ml und das restliche Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt unter Bildung von 57,05 g des Rohproduktes als ein Gummiartiger gelber Schaum. Eine Portion (51,01 g) wurde weiter getrocknet auf ein Konstantgewicht von 44,3 g und quantitativ analysiert durch HPLC. Es wurden festgestellt 27,1% Epoxymexrenon.

Beispiel 29 - Bildung von 3-Ethoxy-11α-hydroxy-androsta-3,5-dien-17-on aus 11α-Hydroxyandrostendion

11α-Hydroxyandrostendion (429,5 g) und Toluolsulfonsäurehydrat (7,1) wurden dem Reaktionskolben unter Stickstoff zugesetzt. Ethanol (2,58 l) wurde dem Reaktor zugesetzt und die dabei entstehende Lösung auf 5ºC gekühlt. Triethylorthoformiat (334,5 g) wurde der Lösung binnen 15 Minuten bei 0º bis 15ºC zugesetzt. Nachdem die Triethylorthoformiatzugabe beendet war wurde das Reaktionsgemisch auf 40ºC erwärmt und. umgesetzt bei dieser Temperatur 2 Stunden lang, wonach die Temperatur erhöht wurde auf Rückfluß und die Reaktion unter Rückfluß weitere 3 Stunden lang fortgesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum gekühlt und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt unter Bildung von 3-Ethoxy-11α-hydroxy-androsta-3,5-dien-17- on.

Beispiel 30 - Bildung von Enamin aus 11α-Hydroxycanrenon Schema 1: Stufe 1: Methode B: Herstellung von 5'R(5'α),7'β-20'-Aminohexadecahydro-11'β- hydroxy-10'a,13'α-dimethyl-3',5-dioxospiro[furan-2(3H),17'α(5'H)- [7,4]metheno[4H[cyclopenta[a]phenanthren]-5'-carbonitril.

Natriumcyanid (1,72 g) wurde in einen 25 ml 3-Hals-Kolben gegeben, der ausgestattet war mit einem mechanischen Rührer. Wasser (2,1 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde unter Erhitzen gerührt bis sich die Feststoffe gelöst hatten. Dimethylformamid (15 ml) wurde zugesetzt, gefolgt durch 11α-Hydroxycanrenon (5,0 g). Ein Gemisch aus Wasser (0,4 ml) und Schwefelsäure (1,49 g) wurde dem Gemisch zugesetzt. Das Gemisch wurde erhitzt auf 85ºC 2,5 Stunden lang, wonach HPLC Analyse vollständige Umwandlung des Produktes zeigte. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt. Schwefelsäure (0,83 g) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch eine halbe Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde 60 ml kaltem Wasser in einem Eisbad zugesetzt. Der Kolben wurde gewaschen mit 3 ml DMF und 5 ml Wasser. Die Schlemme wurde 40 Minuten lang gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wurde zweimal gewaschen mit 40 ml Wasser und getrocknet in einem Vakuumofen bei 60ºC übernacht unter Bildung des 11α-Hydroxyenamins, d. h. 5'R(5'α),7'β-20'-Aminohexadecahydro-11'β-hydroxy- 10'a,13'α-dimethyl-3',5-dioxospiro[furan-2(3H),17'α(5'H)- [7,4]metheno[4H[cyclopenta[a]phenanthren]-5'-carbonitril (4,9 g).

Beispiel 31 - Ein-Topf Umwandlung von 11α-Hydroxycanrenon zu Diketon

Natriumcyanid (1,03 g) wurde einem 50 ml 3-Hals-Kolben zugesetzt, der mit einem mechanischen Rührer ausgestattet war. Wasser (1,26 ml) wurde zugesetzt und der Kolben wurde schwach erhitzt, um den Feststoff zu lösen. Dimethylacetamid [oder Dimethylformamid] (9 ml) wurde zugesetzt gefolgt durch 11α-Hydroxycanrenon (3,0 g). Ein Gemisch aus Schwefelsäure (0,47 ml) und Wasser (0,25 ml) wurde dem Reaktionskolben unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 95ºC 2 Stunden lang erwärmt HPLC Analyse zeigte an, dass die Reaktion beendet war.

Schwefelsäure (0,27 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch 30 Minuten lang gerührt. Weiteres Wasser (25 ml) und Schwefelsäure (0,90 ml) wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch 16 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde dann in einem Eisbad auf 5-10ºC gekühlt. Der Feststoff wurde isoliert durch Filtrieren durch einen Sinterglasfilter, gefolgt durch zweimaliges Waschen mit Wasser (20 ml). Das feste Diketon, d. h. 4'S(4'α),7'α-Hexadecahydro-11'α-hydroxy-10'β,13'β- dimethyl-3',5,20'-trioxospiro[furan-2(3H),17'β-[4,7]methano[17H]cyclopenta[a]phenantrenl-5'β(2'H)- carbonitril wurde im Vakuumofen getrocknet unter Bildung von 3,0 g eines Feststoffes.

Beispiel 32A-1 Schema 1: Stufe 3A: Methode B: Herstellung von Methyl Hydrogen 11α,17α-Dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21,dicarboxylat, γ-Lacton.

Eine Suspension von 5,0 g des Diketons, hergestellt auf die in Beispiel 31 beschriebene Methode, in Methanol (10 ml) wurde auf Rückfluß erhitzt und 25% einer Lösung von Kaliummethoxid in Methanol (5,8 ml) wurde binnen einer Minute zugesetzt. Das Gemisch begann homogen zu werden. Nach 15 Minuten lag ein Niederschlag vor. Das Gemisch wurde auf Rückfluß erhitzt und wurde nochmal nach etwa 4 Stunden homogen. Erhitzen bei Rückfluß wurde insgesamt 23,5 Stunden fortgesetzt und 4,0 N HCl (10 ml) wurden zugesetzt. Eine Gesamtmenge von 60 ml einer Lösung von Cyanwasserstoff in Methanol wurde durch Destillation entfernt. Wasser (57 ml) wurde dem Destillationsrückstand binnen 15 Minuten zugesetzt. Die Temperatur der Lösung wurde auf 81,5ºC erhöht während Wasserzugabe und weitere 4 ml Cyanwasserstoff/Methanollösung wurden durch Destillation entfernt. Nachdem die Wasserzugabe beendet war wurde das Gemisch trübe und die Hitzequelle wurde entfernt. Das Gemisch wurde 3,5 Stunden lang gerührt und das Produkt kristallisierte langsam aus. Die Suspension wurde filtriert und der gesammelte Feststoff wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet in einem Luftstrom auf dem Trichter und bei 92ºC getrocknet (26 in. Hg) 16 Stunden lang unter Bildung von 2,98 g eines schmutzig weißen Feststoffes. Der Feststoff betrug 91,4 Gewichtsprozent des Hydroxyesters, d. h. Methyl Hydrogen 11α,17α-dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton. Die Ausbeute betrug 56,1%.

Beispiel 32A-2 Herstellung von Methyl Hydrogen 11α,17α-Dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Das auf die in Beispiel 31 beschriebene Weise hergestellte Diketon (40 g) wurde in einen sauberen trockenen ummantelten 1 l Reaktor gegeben, der ausgestattet war mit einem Bodenabzug, Kühler, RTD Sonde und Fraktionssammelbehälter. Methanol (800 ml) wurde dann dem Reaktor zugegeben und das Gemisch gerührt. Die dabei entstehende Schlemme wurde auf etwa 60ºC bis 65ºC erhitzt und eine 25% Lösung von Kaliummethoxid (27,8 ml) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde homogen.

Das Gemisch wurde auf Rückfluß erhitzt. Nach etwa 1,5 Stunden bei Rückfluß wurden weitere 16,7 ml 25% Kaliummethoxidlösung dem Gemisch zugesetzt, während Rückfluß aufrechterhalten wurde. Das Gemisch wurde weitere 6 Stunden bei Rückfluß gehalten. Umwandlung des Diketons zum Hydroxyester wurde analysiert durch HPLC. Nachdem HPLC anzeigte, dass das Verhältnis von Diketon zu Hydroxyester weniger als etwa 10% betrug, wurde eine Beschickung von 77 ml 4 M HCl (eine vergleichbare Menge von 1,5 M zu 3 M Schwefelsäure könnte verwendet werden anstelle Salzsäure) dem Gemisch binnen etwa 15 Minuten zugesetzt, während Rückfluß fortgesetzt wurde.

Das Gemisch wurde dann destilliert und etwa 520 ml Methanol/HCN Destillat wurden gesammelt und verworfen. Das konzentrierte Gemisch wurde auf etwa 65ºC gekühlt. Etwa 520 ml Wasser wurden dem Gemisch binnen etwa 90 Minuten zugesetzt und die Temperatur auf etwa 65ºC während der Zugabe gehalten. Das Gemisch wurde nach und nach auf etwa 15ºC gekühlt binnen etwa 4 Stunden und dann gerührt und bei etwa 15ºC weitere zwei Stunden lang gehalten. Das Gemisch wurde filtriert und das filtrierte Produkt zweimal mit etwa 200 ml Wasser jeweils gewaschen. Das filtrierte Produkt wurde im Vakuum getrocknet (90ºC, 25 mm Hg). Etwa 25 bis 27 g eines schmutzig weißen Feststoffes, der im Wesentlichen Methyl Hydrogen 11α,17α-dihydroxy-3- oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Laoton enthielt, wurden erhalten.

Beispiel 32B-1 Herstellung von 7-Methyl hydrogen 5β-cyano-11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregnan-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton

Ein Reaktionskolben wurde beschickt mit 4,1 g des Diketons, das auf die in Beispiel 31 beschriebene Weise hergestellt worden war, 75 ml Methanol und 1 ml 1 N methanolischem Natriumhydroxid. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur gerührt. Eine homogene Lösung wurde binnen Minuten erhalten und ein Niederschlag nach etwa 20 Minuten beobachtet. Das. Rühren wurde 70 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Am Ende dieser Zeit wurde der Feststoff filtriert und mit Methanol gewaschen. Der Feststoff wurde in einer Dampfkammer getrocknet, wobei. 3,6 g 7-Methyl hydrogen 5β-cyano-11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregnan-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton entstanden.

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 0,95 (s, 3H), 1,4 (s, 3H9, 3,03 (d, 1H, J15), 3,69 (s, 3H), 4,1 (m, 1H).

¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm 14,6, 19,8, 22,6, 29,0, 31,0, 33,9, 35,17, 35,20, 36,3, 37,7, 38,0, 38,9, 40,8, 42,8, 43,1, 45,3, 45,7, 47,5, 52,0, 68,0, 95,0, 121,6, 174,5, 176,4, 207,0.

Beispiel 32B-2 Herstellung von 7-Methyl hydrogen 5β-cyano-9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregnan- 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton

2,0 g (4,88 mMol) des 9,11-Epoxydiketons von Formel 21 suspendiert in 30 ml wasserfreiem Methanol wurden 0,34 ml (2,4 mMol) Triethylamin zugesetzt. Die Suspension wurde auf Rückfluß erhitzt und nach 4,5 Stunden war kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden, wie durch HPLC ermittelt wurde (Zorbax SB-C8 150 · 4,6 mm, 2 ml/min., Lineargradient 35 : 65 A : B zu 45 : 55 A : B über 15 Minuten, A = Acetonitril/Methanol 1 : 1, B = Wasser/0,1% Trifluoressigsäure, Feststellung bei 210 nm). Man ließ das Gemisch sich abkühlen und hielt es bei etwa 25 Grad etwa 16 Stunden lang. Die dabei entstehende Suspension wurde filtriert unter Bildung von 1,3 g 7-Methyl hydrogen 5β- cyano-9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregnan-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton als ein weißer Feststoff. Das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt auf einem Rotationsverdampfer und der Rückstand wurde trituriert mit 3-5 ml Methanol. Filtration ergab weitere 260 mg 7-Methyl hydrogen 5β-cyano-9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregnan-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton. Die Ausbeute betrug 74,3%.

¹H-nmr (400 MHz, Deuterochloroform) d 1,00 (s, 3H), 1,45 (m, 1H), 1,50 (s, 3H), 1,65 (m, 2H), 2,10 (m, 2H), 2,15-2,65 (m, 8H), 2,80 (M, 1H), 2,96 (m, 1H), 3,12 (d, J = 13, 1H), 3,35, (d, J = 7, 1H9, 3,67 (s, 3H).

Beispiel 32C Herstellung von 5β-Cyano-11-α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregnan-7α,21-dicarbonsäure, γ- Lacton

Ein Reaktionskolben wurde beschickt mit 6,8 g des Diketons (hergestellt auf die in Beispiel 31 beschriebene Weise), 68 ml Acetonitril, 6,0 g Natriumacetat und 60 ml Wasser. Das Gemisch wurde erwärmt und unter Rückfluß gerührt. Nach etwa 1,5 Stunden war das Gemisch fast homogen. Am Ende von drei Stunden wurden 100 ml Wasser zugesetzt als 50 ml Acetonitril abdestilliert worden waren. Das Gemisch wurde gekühlt und der ausgefallene Feststoff (1,7 g) wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat (pH = 5,5) wurde behandelt mit Salzsäure, um den pH Wert auf etwa 4,5 zu senken und ein Feststoff fiel aus. Der Feststoff wurde isoliert, gewaschen mit Wasser und getrocknet unter Bildung von 4,5 g 5β-Cyano-11-α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregnan-7α,21- dicarbonsäure, γ-Lacton.

¹H NMR (DMSO) ppm 0,8 (s, 3H), 1,28 (s, 3H), 3,82 (m, 1H).

¹³C NMR (DMSO) ppm 14,5, 19,5, 22,0, 28,6, 30,2, 33,0, 34,1, 34,4, 36,0, 37,5, 37,7, 38,5, 42,4, 42,6, 45,08, 45,14, 47,6, 94,6, 122,3, 176,08, 176,24, 207,5.

Beispiel 33 Schema 1: Stufe 3A: Methode C: Herstellung von Methyl Hydrogen 11α,17α-Dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Diketon (30 g), hergestellt auf die in Beispiel 31 beschriebene Weise wurde in einen gereinigten und getrockneten 3-Hals-Reaktionskolben gegeben, der ausgestattet war mit einem Thermometer, einer Dean Stark Falle und einem mechanischen Rührer. Methanol (24 ml) wurde dem Reaktor bei Raumtemperatur (22ºC) zugesetzt und die dabei entstehende Schlemme 5 Minuten lang gerührt. Eine 25 gewichtsprozentige Lösung von Natriummethoxid in Methanol (52,8 ml) wurde dem Reaktor zugesetzt und das Gemisch 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, während dem das Reaktionsgemisch eine hellbraune klare Lösung wurde und eine schwache Exotherme wurde beobachtet (2-3ºC). Die Zugabegeschwindigkeit wurde kontrolliert, um zu vermeiden, dass die Topftemperatur 30ºC überstieg. Das Gemisch wurde danach auf Rückflußbedingungen erhitzt (etwa 67ºC) und 16 Stunden lang unter Rückfluß gehalten. Eine Probe wurde dann genommen und analysiert durch HPLC auf Umwandlung. Die Reaktion wurde unter Rückfluß fortgesetzt, bis das restliche Keton nicht mehr als 3% der Diketonbeschickung betrug. Während des Rückflusses wurden 4 N HCl (120 ml) dem Reaktionsgefäß zugegeben, wobei sich HCN entwickelte, dass in einem Wäscher abgeschreckt wurde.

Nach Beendigung der Reaktion wurden 90-95% des Methanollösungsmittels aus dem Reaktionsgemisch bei Atmosphärendruck abdestilliert. Die Kopftemperatur während der Destillation schwankte zwischen 67 und 75ºC und das HCN enthaltende Destillat wurde behandelt mit einem caustischen und einem Bleichmittel vor der Weiterverwendung. Nach Entfernung des Methanols wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gekühlt, Feststoffprodukt begann auszufallen, während das Gemisch auf 40-45ºC gekühlt wurde. Eine wässrige Lösung, enthaltend gegebenenfalls 5% Natriumbicarbonat (1200 ml) bei 25ºC wurde der kalten Schlemme zugegeben und das dabei entstehende Gemisch dann auf 0ºC binnen etwa einer Stunde gekühlt. Natriumbicarbonatbehandlung war wirksam, um restliches nicht umgesetztes Diketon vom Reaktionsgemisch zu entfernen. Die Schlemme wurde bei 0ºC 2 Stunden lang gerührt, um das Ausfällen und Kristallisieren zu beenden, nachdem das feste Produkt, Methyl Hydrogen 11α,17α- Dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton durch Filtration entfernt worden war und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen worden war (100 ml). Das Produkt wurde getrocknet bei 80-90ºC unter 26" Quecksilbervakuum zu einem Konstantgewicht. Der Wassergehalt nach dem Trocknen betrug weniger als 0,25 Gewichtsprozent. Die eingestellte molare Ausbeute betrug etwa 77-80 Gewichtsprozent.

Beispiel 34 Schema 1: Stufe 3A: Methode D: Herstellung von Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Diketon wurde hergestellt gemäß Beispiel 31 (1 Äquivalent) und wurde umgesetzt mit Natriummethoxid (4,8 Äquivalente) in einem Methanollösungsmittel in Gegenwart von Zinkiodid (1 Äquivalent). Aufarbeitung des Reaktionsproduktes kann entweder erfolgen gemäß dem hier beschriebenen extraktiven Verfahren oder durch nicht-extraktives Verfahren, worin Methylenchloridextraktionen, Kochsalz- und caustische Waschungen und Natriumsulfattrockenstufen weggelassen werden. Auch in den nicht-extraktiven Verfahren wurde Toluol ersetzt durch 5 Gewichtsprozent Natriumbicarbonatlösung. Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3- oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton wurde isoliert als Produkt.

Beispiel 35 Schema 1: Stufe 3C: Methode C: Herstellung von Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton

Der wie in Beispiel 34 hergestellte Hydroxyester (1,97 g)- wurde vereinigt mit Tetrahydrofuran (20 ml) und das dabei entstehende Gemisch auf -70ºC gekühlt. Sulfurylchlorid (0,8 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt, wonach Imidazol (1,3 g) zugesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 2 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde dann verdünnt mit Methylenchlorid und extrahiert mit Wasser. Die organische Schicht wurde eingeengt unter Bildung des Rohproduktes Methyl Hydrogen 17α- Hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton (1,97 g). Eine kleine Probe des Rohproduktes wurde durch HPLC analysiert. Die Analyse zeigte, dass das Verhältnis von 9,11- Olefin zu 11,12-Olefin: 7,9-Lacton 75,5 : 7,2 : 17,3 betrug. Wenn die Reaktion bei 0ºC erfolgte, jedoch im übrigen wie vorstehend beschrieben, ergab sie ein Produkt, worin die 9,11-Olefin : 11,12- Olefin : 7,9-Lacton-Verteilung 77,6 : 6,7 : 15,7 betrug. Dieses Verfahren vereinigt in einer Stufe die Einführung einer Abspaltgruppe und Abspalten derselben für die Einführung von 9,11-Olefinstruktur des Enesters, d. h., dass durch die Reaktion mit Sulfurylchlorid die 11α-Hydroxygruppe des Hydroxyesters der Formel V ersetzt wird durch Halogenid und dies gefolgt wird durch Dehydrohalogenierung zur Δ9,11-Struktur. Somit wird die Bildung des Enesters bewirkt ohne die Verwendung einer starken Säure (wie Ameisensäure) oder eines Trockenmittels wie Essigsäureanhydrid. Außerdem wird die Rückflußstufe in dem alternativen Verfahren weggelassen, die Kohlenmonoxid erzeugt.

Beispiel 36A Schema 1: Stufe 3C: Methode D: Herstellung von Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Hydroxyester (20 g), hergestellt wie durch Beispiel 34 und Methylenchlorid (400 ml) wurden einem sauberen, trockenen 3-Hals-Rundkolben zugesetzt, der ausgestattet war mit einem mechanischen Rührer, Zugabetrichter und Thermoverbindung. Das dabei entstehende Gemisch wurde gerührt bei Umgebungstemperatur, bis die vollständige Lösung erhalten worden war. Die Lösung wurde auf 5ºC gekühlt unter Verwendung eines Eisbades. Methansulfonylchlorid (5 ml) wurde der Lösung von CH&sub2;Cl&sub2; zugesetzt, die den Hydroxyester enthielt, schnell gefolgt durch langsame tropfenweise Zugabe von Triethylamin (10,8 ml). Die Zugabegeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass die Temperatur der Reaktion nicht 5ºC überstieg. Die Reaktion war sehr exotherm; deshalb war Kühlen notwendig. Das Reaktionsgemisch wurde bei etwa 5ºC 1 Stunde lang gerührt. Als die Reaktion beendet war (HPLC und TLC Analyse) wurde das Gemisch eingeengt bei etwa 0ºC unter 26 in. Hg Vakuum, bis es zu einer dicken Schlemme wurde. Die dabei entstehende Schlemme wurde verdünnt mit CH&sub2;Cl&sub2; (160 ml) und das Gemisch wurde eingeengt bei etwa 0ºC unter 26 in. Hg Vakuum, um ein Konzentrat zu erhalten. Die Reinheit des Konzentrats (Mesylatprodukt von Formel IV, worin R³=H und -A-A- und -B-B- beide -CH&sub2;-CH&sub2;- waren), d. h. Methyl hydrogen 11α,17α- dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton zu Methyl hydrogen 17α,hydroxy-11α- (methylsulfonyl)oxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton erwies sich als 82% (HPLC Bereich %). Dieses Material wurde verwendet für die nächste Reaktion ohne Isolierung.

Kaliumformiat (4,7 g), Ameisensäure (16 ml) und Essigsäureanhydrid (8 ml, 0,084 Mol) wurden einem sauberen, trockenen Reaktor zugesetzt, der ausgestattet war mit mechanischem Rührer, Kühler, Thermoverbindung und Heizmantel. Die dabei entstehende Lösung wurde auf 70ºC erhitzt und etwa 4-8 Stunden lang gerührt. Die Zugabe von Essigsäureanhydrid ist exotherm und entwickelt Gas (CO), so dass die Zugabegeschwindigkeit eingestellt werden muß, um sowohl Temperatur als auch Gasentwicklung zu kontrollieren (Druck). Die Reaktionszeit zur Herstellung des aktiven Abspaltreagenz hing ab von der Menge an Wasser, das in der Reaktion vorlag (Ameisensäure und Kaliumformiat enthielten etwa 3-5% Wasser jeweils). Die Abspaltreaktion ist empfindlich gegenüber der vorliegenden Wassermenge; wenn mehr als 0,1% Wasser vorliegt (KF), kann die Menge der 7,9-Lactonverunreinigung sich erhöhen. Dieses Nebenprodukt ist schwierig vom Endprodukt zu entfernen. Wenn KF < 0,1% Wasser zeigte, wurde das aktive Abspaltmittel transferiert zu dem Konzentrat von Mesylat (0,070 Mol), das in der vorangegangenen Stufe hergestellt worden war. Die dabei entstehende Lösung wurde auf 95ºC erhitzt und das flüchtige Material wurde abdestilliert und in einer Dean Stark Falle gesammelt. Als die Entwicklung des flüchtigen Materials aufhörte, wurde die Dean Stark Falle ersetzt durch einen Kühler und das Reaktionsgemisch wurde eine weitere Stunde auf 95ºC erhitzt. Nach Beendigung (TLC und HPLC Analyse; < 0,1% Ausgangsmaterial) wurde der Inhalt auf 50ºC gekühlt und Vakuumdestillation begann (26 in. Hg/50ºC). Das Gemisch wurde zu einer dicken Schlemme eingeengt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die dabei entstehende Schlemme wurde verdünnt mit Ethylacetat (137 ml) und die Lösung wurde 15 Minuten lang gerührt und mit Wasser verdünnt (137 ml). Die Schichten wurden getrennt und die wässrige untere Schicht wurde nochmals extrahiert mit Ethylacetat (70 ml). Die vereinigten Ethylacetatlösungen wurden einmal gewaschen mit Kochsalzlösung (120 ml) und zweimal mit eiskalter 1 N NaOH Lösung (120 ml jeweils). Der pH Wert der wässrigen Lösung wurde gemessen und die organische Schicht nochmals gewaschen, falls der pH Wert der verbrauchten Waschflüssigkeit weniger als 8 betrug. Wenn der pH der verbrauchten Waschflüssigkeit als > 8 beobachtet wurde, wurde die Ethylacetatschicht einmal mit Kochsalzlösung gewaschen (120 ml) und zur Trockne eingeengt durch Rotationsverdampfung unter Verwendung eines 50ºC warmen Wasserbades. Der dabei entstehende Enester, Festprodukt, d. h. Methyl hydrogen 17α-hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton wog 92 g (77 Mol-% Ausbeute).

Beispiel 36B Herstellung von Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton.

Einem sauberen, trockenen 250 ml 3-Hals-Rundkolben, ausgestattet mit einem mechanischen Rührer, Zugabetrichter und Thermoverbindung, wurden 25 g (53,12 mMol) des Hydroxyesters, Methyl Hydrogen 11α,17α-Dihydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton hergestellt wie in Beispiel 34, zugesetzt, gefolgt durch 150 ml Methylenchlorid (Burdick & Johnson). Das dabei entstehende Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur gerührt, bis eine helle Schlemme erhalten worden war. Die Lösung wurde gekühlt auf -5ºC unter Verwendung eines Eisbades. Methansulfonylchlorid (7,92 g, 69,06 mMol) (Aldrich) wurde der Lösung von Methylenchlorid zugesetzt, enthaltend den Hydroxyester, schnell gefolgt durch langsame tropfenweise Zugabe von Triethylamin (7,53 g) (Aldrich). Die Zugabegeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass die Temperatur der Reaktion 0ºC nicht überstieg. Die Reaktion war sehr exotherm; deshalb war Kühlen notwendig. Die Zugabezeit betrug 35 Minuten. Das Reaktionsgemisch wurde bei etwa 0ºC weitere 45 Minuten lang gerührt. Als die Reaktion beendet war (weniger als 1% rückständiger Hydroxyester, angezeigt durch HPLC und TLC Analyse), wurde das Gemisch eingeengt durch Abstreifen von etwa 110 ml bis 125 ml des Methylenchloridlösungsmittels bei Atmosphärendruck. Dia Reaktortemperatur erreichte etwa 40ºC bis 45ºC während des Abstreifens. Wo die Reaktion nach den zusätzlichen 45 Minuten nicht beendet war, können weitere 0,1 Äquivalent Methansulfonylchlorid und weitere 0,1 Äquivalent Triethylamin dem Reaktor zugesetzt werden und die Reaktion überwacht werden für Beendigung. Das dabei entstehende Gemisch enthielt das Rohprodukt Methyl hydrogen 17α- hydroxy-11α-(methylsulfonyl)oxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton. Dieses Material wurde für die nächste Reaktion ohne Isolierung verwendet.

Wasserfreies Natriumacetat (8,7 g) (Mallinkrodt), Eisessig (42,5 ml) (Fisher) und Essigsäureanhydrid (0,5 ml) (Fisher) wurden zugesetzt zu einem zweiten 250 ml sauberen trockenen Reaktor, der ausgestattet war mit mechanischem Rührer, Kühler, Thermoanschluß und Heizmantel. Die dabei enstehende Lösung wurde auf 90ºC erhitzt und etwa 30 Minuten lang gerührt. Die Zugabe von Essigsäureanhydrid ist exotherm, so dass die Zugabegeschwindigkeit eingestellt werden muß, um sowohl Temperatur als auch Druck zu kontrollieren. Essigsäureanhydrid wurde zugesetzt, um den Wassergehalt der Lösung auf einem akzeptablen Spiegel zu halten (weniger als etwa 0,1%). Wenn KF < 0,1% Wasser zeigte, wurde die Essigsäurelösung transferiert zum Konzentrat des Mesylats, hergestellt wie im ersten Paragraphen dieses Beispiels diskutiert. Die Temperatur des dabei entstehenden Gemischs betrug etwa 55ºC bis 60ºC nach dem Transfer. Durch Verwendung von Essigsäure und Natriumacetat anstelle von Ameisensäure und Kaliumformiat wie in Beispiel 36A wurde die Gasentwicklung reduziert.

Das Gemisch wurde erhitzt auf 135ºC und bei dieser Temperatur etwa 60 bis 90 Minuten lang gehalten, bis die Entwicklung von flüchtigem Material aufhörte. Das von dem Gemisch destillierte flüchtige Material wurde gesammelt in einer Dean Stark Falle. Nach Beendigung (TLC und HPLC Analyse; < 0,1% Ausgangsmaterial) wurde die Hitzequelle entfernt. Als die Temperatur des Gemischs 80ºC erreicht hatte, wurden 150 ml Wasser langsam dem Gemisch binnen 60 bis 90 Minuten zugesetzt. Am Ende der Wasserzugabe hatte sich das Gemisch abgekühlt auf eine Temperatur von etwa 35ºC bis 45ºC und es begann sich eine Schlemme zu bilden. Das Gemisch wurde weiter gekühlt auf 15ºC und bei dieser Temperatur etwa 30 bis 60 Minuten lang gehalten.

Das Gemisch wurde filtriert durch einen Glastrichter. Das Filtrat wurde gespült mit 100 ml Wasser. Das Filtrat wurde dann ein zweites Mal gewaschen mit weiteren 100 ml Wasser. Das dabei entstehende Filtrat wurde getrocknet bei 70ºC im Vakuum unter Bildung von 25,0 g des trockenen Produktenesters Methyl hydrogen 17α-hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton. HPLC Probe zeigte 70% des gewünschten 9,11-Olefins, 15% des 11,12-Olefins und 5% des 7,0-Lactons an.

Diese Methode hatte das günstige Ergebnis (relativ zu ähnlichen Verfahren) von (i) Reduzierung der Lösungsmittelvolumen, (ii) Reduzierung der Anzahl an getrennten Arbeitsstufen, die erforderlich sind, um den Enester vom Hydroxyester herzustellen, (iii) Reduzierung der erforderlichen Waschungen, (iv) Ersatz der Extraktion mit Wasserausfällung beim Isolieren des Endproduktes und (v) das Weglassen von Sicherheitsvorkehrungen, die früher verbunden waren mit der gemischten Anhydridbildung und Gasentwicklung, wenn Ameisensäure verwendet wird anstelle von Essigsäure.

Beispiel 37A Schema 1: Stufe 3C: Methode E: Herstellung von Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Hydroxyester (100 g; 0,22 Mol), hergestellt wie in Beispiel 34, wurde in einen 2 l 3-Hals- Rundkolben gegeben, der ausgestattet war mit mechanischem Rührer, Zugabetrichter und Thermoverbindung. Ein zirkulierendes Kühlbad wurde verwendet mit automatischer Temperaturkontrolle. Der Kolben wurde getrocknet vor der Reaktion wegen der Empfindlichkeit von Methansulfonylchlorid gegenüber Wasser.

Methylenchlorid (1 l) wurde dem Kolben zugesetzt und der Hydroxyester darin unter Rühren gelöst. Die Lösung wurde gekühlt auf 0ºC und Methansulfonylchlorid (25 ml; 0,32 Mol) wurde dem Kolben zugesetzt über einen Zugabetrichter. Triethylamin (50 ml; 0,59 Mol) wurde dem Reaktor zugesetzt über den Zugabetrichter und der Trichter wurde gespült mit weiterem Methylenchlorid (34 ml). Zugabe von Triethylamin war hoch exotherm. Die Zugabezeit betrug etwa 10 Minuten unter Rühren und Kühlen. Das Beschickungsgemisch wurde auf 0ºC gekühlt und bei dieser Temperatur gehalten unter Rühren weitere 45 Minuten, währenddem der Kopfzwischenraum des Reaktionskolbens mit Stickstoff gespült wurde. Eine Probe des Reaktionsgemischs wurde dann analysiert durch Dünnschichtchromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, um die Reaktion auf ihre Vollständigkeit zu prüfen. Das Gemisch wurde danach gerührt bei 0ºC weitere 30 Minuten und wieder auf Vollständigkeit der Reaktion überprüft. Die Analyse zeigte, dass die Reaktion an diesem Punkt im Wesentlichen beendet war; das Lösungsmittel Methylenchlorid wurde abgestreift bei 0ºC unter 26" Quecksilbervakuum. Gaschromatographieanalyse des Destillats zeigte die Gegenwart sowohl von Methansulfonylchlorid als auch Triethylamin an. Methylenchlorid (800 ml) wurde danach dem Reaktor zugesetzt und das dabei entstehende Gemisch 5 Minuten lang bei einer Temperatur im Bereich von 0-15ºC gerührt. Das Lösungsmittel wurde nochmal abgestreift bei 0-5ºC unter 26" Quecksilbervakuum unter Bildung des Mesylats der Formel IV, worin R³ H ist, -A-A- und - B-B- -CH&sub2;-CH&sub2;- sind und R¹ Methoxycarbonyl ist. Die Reinheit des Produktes betrug etwa 90-95 Bereichsprozent.

Um ein Abspaltreagenz herzustellen, wurden Kaliumformiat (23,5 g; 0,28 Mol), Ameisensäure (80 ml) und Essigsäureanhydrid (40 ml) vermischt in einem getrennten, getrockneten Reaktor. Ameisensäure und Essigsäureanhydrid wurden in den Reaktor gepumpt und die Temperatur wurde nicht über 40ºC gehalten während der Zugabe von Essigsäureanhydrid. Das Abspaltreagenzgemisch wurde erhitzt auf 70ºC, um Wasser aus dem Reaktionssystem herauszuwaschen. Diese Reaktion wurde fortgesetzt bis der Wassergehalt niedriger als 0,3 Gewichtsprozent betrug, wie durch Karl Fisher Analyse gemessen. Die Abspaltreagenzlösung wurde dann transferiert zum Reaktor, enthaltend die konzentrierte rohe Mesylatlösung, hergestellt wie vorstehend beschrieben. Das dabei entstehende Gemisch wurde erhitzt auf eine maximale Temperatur von 95ºC und flüchtiges Destillat gesammelt, bis kein weiteres Destillat entwickelt wurde. Die Destillation härte bei etwa 90ºC auf. Nachdem die Destillation beendet war, wurde das Reaktionsgemisch bei 95ºC weitere zwei Stunden lang gerührt und das Ende der Reaktion wurde überprüft durch Dünnschichtchromatographie. Als die Reaktion beendet war, wurde der Reaktor gekühlt auf 50ºC und die Ameisensäure und das Lösungsmittel vom Reaktionsgemisch entfernt unter 26" Quecksilbervakuum bei 50ºC. Das Konzentrat wurde gekühlt auf Raumtemperatur und danach wurde Ethylacetat (688 ml) zugesetzt und das Gemisch aus Ethylacetat und Konzentrat 15 Minuten lang gerührt. An diesem Punkt wurde eine 12% Kochsalzlösung (688 ml) zugeführt, um bei der Entfernung von wasserlöslichen Verunreinigungen aus der organischen Phase beizutragen. Diese Phasen konnten sich dann 20 Minuten lang absetzen. Die wässrige Schicht wurde transferiert in ein anderes Gefäß, dem eine weitere Menge Ethylacetat (350 ml) zugesetzt wurde. Diese Rückextraktion der wässrigen Schicht erfolgte 30 Minuten, wonach die Phasen sich absetzen konnten und die Ethylacetatschichten wurden vereinigt. Den vereinigten Ethylacetatschichten wurde gesättigte Natriumchloridlösung (600 ml) zugesetzt und das Rühren 30 Minuten lang fortgesetzt. Die Phasen konnten sich dann absetzen. Die wässrige Schicht wurde entfernt. Eine weitere Natriumchlorid (600 ml) Waschung wurde durchgeführt. Die organische Phase wurde abgetrennt von der zweiten verbrauchten Waschflüssigkeit. Die organische Phase wurde dann gewaschen mit 1 N Natriumhydroxid (600 ml) unter Rühren 30 Minuten lang. Die Phasen setzten sich 30 Minuten lang ab, um die wässrige Schicht zu entfernen. Der pH Wert der wässrigen Schicht wurde überprüft und als > 7 festgestellt. Eine weitere Waschung erfolgte mit gesättigtem Natriumchlorid (600 ml) 15 Minuten lang. Die organische Phase wurde schließlich eingeengt unter 26" Quecksilbervakuum bei 50ºC und das Produkt durch Filtration gewonnen. Das Endprodukt war ein schaumiger brauner Feststoff nach dem Trocknen. Weiteres Trocknen bei 45ºC unter vermindertem Druck 24 Stunden lang ergab 95,4 g des Enesterproduktes Methyl Hydrogen 17α-Hydroxy-3-oxopregna-4,9(11)-dien- 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton, das mit 68,8% ermittelt wurde. Die molare Ausbeute betrug 74,4%, korrigiert auf den Ausgangshydroxyester und den Endenester.

Beispiel 37B Herstellung von 7-Methyl hydrogen 17-methyl-3-oxo-18-norpregna-4,9(11),13-trien-7α,21- dicarboxylat

Ein Reaktionskolben wurde beschickt mit 5,5 g des Mesylats, hergestellt auf die Weise von Beispiel 23, 55 ml 94,3% Ameisensäure und 1,38 g Kaliumformiat. Das Gemisch wurde erhitzt und unter Rückfluß (104ºC) zwei Stunden lang gerührt. Am Ende dieser zwei Stunden wurde die Ameisensäure destilliert unter vermindertem Druck. Der Rückstand wurde gelöst in Ethylacetat und gewaschen mit 10% Kaliumcarbonat (50 ml). Die gewonnene wässrige Portion hatte eine gelbe Farbe. Das Ethylacetat wurde gewaschen mit 5% Natriumhydroxid (50 ml). Die wässrigen Portionen wurden vereinigt und angesäuert mit verdünnter Salzsäure und das unlösliche Material mit Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wurde zur Trockne eingedampft unter vermindertem Druck unter Bildung von 1,0 g eines Rückstandes, 7-Methyl hydrogen 17-methyl-3-oxo-18-norpregna- 4,9(11),13-trien-7α,21-dicarboxylat.

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 1,5 (s, 3H), 1,4 (s, 3H), 3,53 (s, 3H), 5,72 (m, 1H).

¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm 25,1 und 25,4 (18 CH&sub3; und 19 CH&sub3;), 40,9 (10 C), 48,5 (17 C), 51,4 (OCH&sub3;), 118,4 (11 CH), 125,4 (4 CH), 132,4 (9 C), 138,5 und 139,7 (13 C und 14 C), 168,2 (5 C), 172,4 (7 CO), 179,6 (22 CO), 198,9 (3 CO).

Beispiel 37C Herstellung von 7-Methyl hydrogen 5β-cyano-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-11-en-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton

Ein Reaktionskolben wurde beschickt mit 5,5 g des Mesylats, hergestellt auf die Weise des Beispiels 23, 55 ml 94,3% Ameisensäure und 1,38 g Kaliumformiat. Das Gemisch wurde erhitzt und unter Rückfluß gerührt (104ºC) zwei Stunden lang. Am Ende dieser zwei Stunden wurde die Ameisensäure destilliert unter vermindertem Druck. Der Rückstand wurde gelöst in Ethylacetat und gewaschen mit 10% Kaliumcarbonat (50 ml). Die gewonnene wässrige Portion hatte eine gelbe Farbe. Das Ethylacetat wurde gewaschen mit 5% Natriumhydroxid (50 ml). Das Ethylacetat wurde zur Trockne eingedampft unter vermindertem Druck unter Bildung eines 3,7 g Rückstandes. Eine 3,4 g Portion des Rückstandes wurde chromatographiert an 267 g Merck Silicagel (40-63 u). Das Produkt wurde gewonnen mit einem Eluierungsschema von Ethylacetat und Toluol 37 : 63 (V/V). Nach Trocknen dieses Produktes wurden 0,0698 g eines Rückstandes 7-Methyl hydrogen 5β-cyano- 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-11-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton erhalten.

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 1,03 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 5,60 (d, 1H, J10), 5,98 (d, 1H, J10). MIR cm&supmin;¹ 2229 (CN), 1768 (Lacton), 1710 (Ester).

Beispiel 37D Isolierung von 9α,17-Dihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-1α,21-dicarbonsäure, bis(γ-Lacton)

9α,17-Dihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarbonsäure, bis(γ-Lacton) ist ein Nebenprodukt der 11-Mesylateliminierung. Eine reine Probe wurde isoliert aus dem Reaktionsgemisch von Beispiel 37A über präparative Flüssigchromatographie gefolgt durch Umkehrphasen präparative HPLC. Somit wurden 73 g Rückstand chromatographiert über 2,41 kg Merck Silicagel (40-63 u) mit einem Gradienten-Eluierungsschema von Ethylacetat und Toluol (20 : 80, 30 : 70, 40 : 60, 60 : 40, V/V). Ein angereichertes Gemisch (10,5 g) des Enamins und des 7,9-Lactons wurde erhalten in der 60 : 40 Fraktion. Der Fortschritt der Reinigung wurde beobachtet durch TLC auf EMF Platten mit 60 : 40 (V/V) Ethylacetat, Toluoleluierungsmittel und Sichtbarmachung über Schwefelsäure, SMUV. Eine Portion (10,4 g) des Gemischs wurde weiter gereinigt über Umkehrphasen HPLC an Kromasil C8 (7 u) und 30 : 70 (V/V) milliQ Waser und mobiler Acetonitrilphase. Das 7,9-Lacton (2,27 g) wurde isoliert als Kristalle von der mobilen Phase.

MIR cm&supmin;¹ 1762 (7,9-Lacton und-17-Lacton), 1677, 1622 (3-Keto-Δ4,5).

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 1,00 (s, 3H), 1,4 (s, 3H), 2,05 (d, 1H), 2,78-(d, 1H), 5,87 (s, 1H).

¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm 13,2, 19,0, 22,2, 23,2, 26,8, 28,8, 29,5, 30,8, 33,1, 34,4, 35,1, 42,5, 43,6, 43,9, 45,0, 45,3, 89,9, 94,7, 129,1, 161,5, 176,0, 176,4, 196,9.

Theoretisch C 71,85 und H 7,34; Gefunden C 71,68 und H 7,30.

Beispiel 37E Isolierung von 7-Methyl hydrogen 5-cyano-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-11-en-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton

Die Verbindung 7-Methyl hydrogen 5-cyano-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-11-en-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton wurde isoliert nach mehrfacher präparativer Flüssigkeitschromatographie am Reaktionsgemisch, das erhalten worden war nach Eliminierung der 11-Mesyloxygruppe (Beispiel 24). Es war ein Teil eines Haufens von weniger polaren Verunreinigungen, wie festgestellt wurde durch TLC auf EMF Platten mit einem 30 : 70 (V/V) Ethylacetat und Methylenchlorid- Eluierungssystem und sichtbar gemacht wurde durch Schwefelsäure, SMUV. Im Allgemeinen wurden diese weniger polaren Verunreinigungen abgetrennt vom rohen Enamin durch präparative Flüssigkeitschromatographie. Insbesondere wurden 9,6 g der rohen Enaminlösung chromatographiert über 534 g Merck Silicagel (40-63 u) unter Verwendung eines Ethylacetat und Toluol- Gradienteneluierungsschemas (20 : 80, 30 : 70, 40 : 60, 60 : 40, V/V). Die weniger polaren Verunreinigungen wurden eingeengt in den 30 : 70 Fraktionen. Ein 12,5 g Pool der weniger polaren Verunreinigungen wurde auf diese Weise gesammelt. Dieses Material wurde weiter chromatographiert über 550 g Merck Silicagel (40-63 u) unter Verwendung eines Ethylacetat und Methylchlorid-Gradienteneluierungsschemas (5 : 95, 10 : 90, 20 : 80, 30 : 70, V/V). Eine angereicherte Portion der 20 : 80 Fraktionen ergab 1,2 g des Rückstandes. Weitere Chromatographie des 1,2 g Rückstandes über 53 g Merck Silicagel (40-63 u) unter Verwendung eines Aceton- und Methylenchloridgradienten (3 : 97, 6 : 94, 10 : 90, 15 : 85, V/V) ergab 0,27 g 7-Methyl hydrogen 5-cyano- 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-11-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton aus einer angereicherten Portion der 10 : 90 Fraktionen.

MS M + 425, berechnet für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub1;NO&sub5; (425,52).

MIR 2222 cm&supmin;¹ (Nitril), 1767 cm&supmin;¹ (Lacton), 1727 cm&supmin;¹ (Ester und 3-Keton).

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 0,92 (s, 3H), 1,47 (s, 3H), 2,95 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 5,90 (m, 1H).

¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm 14,0 (18 CH&sub3;), 23,5 (15 CH&sub2;), 27,0 (19 CH&sub3;), 37,8, 38,5 und 40,9 (7, 8 und 14 CH), 52,0 (OCH&sub3;), 95,0 (17 C), 121,5 (23 CN), 123,5 (11 CH), 135,3 (9 C), 174,2- und 176,2 (22 und 24 CO), 206 (3 CO).

Beispiel 37F Herstellung von 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-11α-(2,2,2-trifluor-1-oxoethoxy)-17α- pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat

Hydroxyester (2,0 g, 4,8 mMol), hergestellt auf die Weise von Beispiel 34, wurde 40 ml Methylenchlorid zugesetzt in einem sauberen, trockenen 3-Hals-Rundkolben, der ausgestattet war mit einem mechanischen Rührer. Triethylamin (0,61 g, 6,10 mMol) und Trifluoressigsäureanhydrid (1,47 g, 7,0 mMol) wurden dann der Lösung zugesetzt. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur übernacht gerührt.

Das Gemisch wurde dann verdünnt mit weiteren 40 ml Methylenchlorid. Das Gemisch wurde dann nacheinander gewaschen mit 40 ml Wasser, 40 ml 1 N HCl und 40 ml 1 N NaOH Lösung. Die dabei entstehende Lösung wurde dann getrocknet über Magnesiumsulfat und zur Trockne eingeengt unter Bildung von 3,2 g eines hellbraunen Feststoffes 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3- oxo-11α-(2,2,2-trifluor-1-oxoethoxy)-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat.

Der Rückstand wurde weiter analysiert und gereinigt durch Chromatographie. HPLC Bedingungen: Säule - Waters Symmetrie C18 (150 mm · 4,6 mm i. d., 5 Micron Teilchengröße); Säulentemperatur - Umgebung; mobile Phase - Acetonitril/Wasser, 30/70 Volumen; Fließgeschwindigkeit - 1,0 ml/Minute; Injektionsvolumen - 20 Mikroliter; Probenkonzentration - 1,0 mg/ml; Ermittlung - UV bei 210 nm; Druck - 1500 psi und Durchlaufzeit - 45 Minuten. TLC Bedingungen: Absorbenz - Merck Silicagel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;; Lösungsmittelsystem - Ethylacetat/Toluol, 65/35 Volumen; Sichtbarmachungstechnik - Kurzwelle und Anwendungsmenge - 100 Mikrogramm.

Beispiel 37G Herstellung von 7-Methyl hydrogen 11α-(acetyloxy)-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7,21- dicarboxylat, γ-Lacton

Hydroxyester (2,86 g, 6,87 mMol), hergestellt auf die Weise von Beispiel 34, wurde 15 ml Methylenchlorid zugesetzt in einem sauberen, trockenen 3-Hals-Rundkolben, der mit einem mechanischen Rührer ausgestattet war. Triethylamin (1,39 g, 13,7 mMol), Dimethylaminopyridin (0,08 g, 0,6 mMol) und Essigsäureanhydrid (1,05 g, 10,3 mMol) wurden dann der Lösung zugesetzt. Dieses Gemisch wurde gerührt bei Raumtemperatur übernacht.

Das Gemisch wurde dann verdünnt mit 150 ml Ethylacetat und 25 ml Wasser. Diese Ethylacetatlösung wurde dann gewaschen mit 25 ml Zitronensäurelösung. Die Lösung wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt unter Bildung von 3,33 g eines hellbraunen Feststoffes 7-Methyl hydrogen 11α-(acetyloxy)-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7,21- dicarboxylat, γ-Lacton.

Der Rückstand wurde weiter analysiert und gereinigt durch Chromatographie. HPLC Bedingungen: Säule - Waters Symmetrie C18 (150 mm · 4,6 mm i. d., 5 Micron Teilchengröße); Säulentemperatur - Umgebung; mobile Phase - Acetonitril/Wasser, 30/70 Volumen; Fließgeschwindigkeit - 1,0 ml/Minute; Injektionsvolumen - 20 Mikroliter; Probenkonzentration - 1,0 mg/ml; Ermittlung - UV bei 210 nm; Druck - 1500 psi und Durchlaufzeit - 45 Minuten. TLC Bedingungen: Absorbenz - Merck Silicagel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;; Lösungsmittelsystem - Methylenchlorid/Methanol, 95/5 Volumen; Sichtbarmachungstechnik - Kurzwelle und Anwendungsmenge - 100 Mikrogramm.

Beispiel 37H Schema 1: Stufe 3C: Methode F: Herstellung von 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α- pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton

Kaliumformiat (1,5 g, 0,018 Mol), Ameisensäure 60 ml, 1,6 Mol) und Essigsäureanhydrid (29,5 ml, 0,31 Mol) wurden einem sauberen, trockenen 250 ml Reaktor zugesetzt, der ausgestattet war mit einem mechanischen Rührer, Kühler, Thermoanschluß und Heizmantel. Die Lösung wurde dann bei 70ºC 4 Stunden lang gerührt und auf Umgebungstemperatur gekühlt, um ein Eliminierungsreagenz zu liefern, dass sich für die Umwandlung des Mesylats der Formel IV zum Produkt dieses Beispiels eignete.

Das vorher hergestellte TFA/TFA Anhydrid-Eliminierungsreagenz wurde 70,0 g (0,142 Mol) des Mesylats zugesetzt, das auf die Weise von Beispiel 23 hergestellt worden war. Das dabei entstehende Gemisch wurde auf 95ºC bis 105ºC 2,5 Stunden lang erhitzt, wobei der Umwandlungsgrad periodisch durch TLC oder HPLC geprüft wurde. Der dabei entstehende Rückstand wurde auf 50ºC gekühlt, verdünnt mit Eiswasser (1,4 l) und eine Stunde lang gerührt. Das Gemisch wurde übernacht bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Phase wurde nochmals extrahiert mit Ethylacetat (75 ml). Die Ethylacetatlösung wurde dann nacheinander gewaschen mit einem Wasser/Kochsalzlösungsgemisch (70 ml), einem weiteren Wasser/Kochsalzlösungsgemisch (60 ml), 1 N Natriumhydroxid, (60 ml) und einem dritten Wasser/Kochsalzlösungsgemisch (60 ml). Die Stärke der Kochsalzlösung betrug 12 Gewichtsprozent. Die Ethylacetatlösung wurde dann getrocknet über Natriumsulfat, filtriert und zur Trockne eingeengt durch Rotationsverdampfer unter Bildung von 4,5 g eines Gemischs aus dem gewünschten Produkt und einer unbekannten Verunreinigung. Das Verhältnis von Verunreinigung/Produkt, festgestellt durch HPLC Bereich betrug etwa 50/15. Das Hauptprodukt dieser Reaktion war die Verunreinigung, die identifiziert wude als 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Das Gemisch wurde gereinigt durch Säulenchromatographie unter Bildung von 1,9 g analytisch reinem 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Der Rückstand wurde weiter analysiert und gereinigt durch Chromatographie. HPLC Bedingungen: Säule - Waters Symmetrie C18 (150 mm · 4,6 mm i. d., 5 Micron Teilchengröße); Säulentemperatur - Umgebung; mobile Phase - Acetonitril/Wasser, 30/70 Volumen; Fließgeschwindigkeit - 1,0 ml/Minute; Injektionsvolumen - 20 Mikroliter; Probenkonzentration - 1,0 mg/ml; Ermittlung - UV bei 210 nm; Druck - 1500 psi und Durchlaufzeit - 45 Minuten. TLC Bedingungen: Absorbenz - Merck Silicagel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;; Lösungsmittelsystem - Chloroform/Methyl t- Butylether/Isopropanol, 70/28/2 Volumen; Sichtbarmachungstecknik - 50 Volumenprozent wässriges H&sub2;SO&sub4;/LWUV und 50 Volumenprozent H&sub2;SO&sub4;/Phosphomolybdänsäure und Anwendungsmenge - 100 Mikrogramm.

Beispiel 37I Herstellung von 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3,11-dioxoxo-17α-pregn-4-en-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton

Ein Jones Reagenz wurde hergestellt durch Lösen von 6,7 g Chromsäureanhydrid (CrO&sub3;) in 6 ml konzentrierter Schwefelsäure und vorsichtigem Verdünnen dieses Gemischs mit destilliertem Wasser auf 50 ml. Ein ml dieses Reagenz genügt, um 2 mMol eines sekundären Alkohols zu einem Keton zu oxidieren.

Hydroxyester (10,0 g, 24,0 mMol), hergestellt auf die Weise von Beispiel 34, wurde gelöst/suspendiert in 1200 ml Aceton. Diesem Gemisch wurden 8,982 ml des Jones Reagenz zugesetzt und das vereinigte Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt. Eine aliquote Menge des Reaktionsgemischs wurde, nachdem es mit Wasser behandelt worden war und mit Methylenchlorid extrahiert worden war, analysiert durch HPLC (Säule: Beckmann Ultrasphäre ODS C18, 4,6 mm · 250 mm, 5 Micron; Lösungsmittelgradient. Acetonitril/Wasser = 1/99 zu 100/0 in 20 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute; Ermittlung: UV 210 nm). Die Reaktion war beendet, wie festgestellt wurde, durch das Fehlen von jeglichen wesentlichen Mengen des Ausgangsmaterials im Reaktionsgemisch. Die HPLC Verweilzeit für das Ausgangsmaterial (Hydroxyester) beträgt 13,37 Minuten und für das Produkt-Keton 14,56 Minuten.

Die Reaktion wurde aufgearbeitet durch Zugabe von 200 ml Wasser und 300 ml Methylenchlorid. Die organische Schicht wurde abgetrennt von der wässrigen Schicht und nochmals gewaschen mit 200 ml Wasser. Die organische Schicht wurde abgetrennt von der wässrigen Schicht und getrocknet über Magnesiumsulfat. Das Lösungsmittel wurde verdampft unter Bildung von 9,52-g des schmutzig weißen Feststoffes (95,6% Rohausbeute) 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3,11-dioxo- 17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Die Strukturzuordnung basierte auf dem Massenspektrum (m/e 414), HNMR(DMF-d7) und CNMR (DMF-d7). Beim HNMR war das charakteristische Peak von 11-H (4,51 ppm, Doublet, j = 5,8 Hz), das im Hydroxyester gefunden wurde, nicht vorhanden. In CNMR erschien ein Peak bei 208,97 ppm, das man für das 11-Ketokohlenstoff erwartete.

CNMR (400 MHz, DMF-d7) 208,97 (11-Keto), 197,70 (3-Keto), 176,00 (22-Lacton), 173,34 (7-COOMe), 167,21 (C5), 125,33 (C4), 93,63 (C17) und andere Peaks im Bereich von 15 bis 57 ppm.

Beispiel 37J Herstellung von Dimethyl 11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton

Eine Lösung von 3,5 g (8,4 mMol) des Hydroxyesters, hergestellt auf die Weise von Beispiel 34, in 42 ml Methanol wurde vermischt mit 4 ml methanolischem 4 N Kaliumhydroxid (8 mMol). Die Schlemme wurde bei Raumtemperatur übernacht gerührt und eine Stunde lang auf Rückfluß erhitzt. Das Methanol wurde unter Vakuum verdampft und der Rückstand vermischt mit 50 ml Ethylacetat. Das Ethylacetat wurde unter Vakuum verdampft und der Rückstand digestiert mit 50 ml Ethylacetat. Der trockene Feststoff wurde vereinigt mit 50 ml Aceton und 2 ml Methyliodid (32,1 mMol). Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit löste sich der größte Teil der Feststoffe auf. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde digestiert mit Ethylacetat, die Feststoffe dann durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel unter Vakuumdestillation entfernt. Der Rückstand wurde bestimmt als 78 : 22 (V/V) Gemisch aus Dimethyl 11α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton und dem Ausgangsmaterial Hydroxyester gemäß H¹ NMR. Dieses Gemisch reichte aus zur Verwendung als ein HPLC Marker ohne weitere Reinigung.

¹H-NMR (CDCl&sub3;) zeigte die folgenden Eigenschaften an: ppm 0,93 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 3,64 (s, 3H), 3,69 (s, 3H).

Beispiel 37K Herstellung von 11α,17-Hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton

11,86 g (28,5 mMol) des Hydroxyesters, hergestellt auf die Weise des Beispiels 34, wurde versetzt mit 50 ml Methanol und 20 ml 2,5 M NaOH. Die Suspension wurde auf Rückfluß erhitzt. Nach 25 Minuten blieb ein Teil des Ausgangsesters nicht umgesetzt, wie durch HPLC festgestellt (Zorbax SB-C8 150 · 4,6 mm, 2 ml/min., Lineargradient 35 : 65 A : B zu 45 : 55 A : B binnen 15 Minuten, A = Acetonitril/Methanol 1 : 1, B = Wasser/0,1% Trifluoressigsäure, Ermittlung bei 210 nm) und 10 ml 10 M NaOH wurden zugesetzt. Nach 1,5 Stunden blieb eine Spur des Esters nicht umgesetzt wie durch HPLC festgestellt wurde. Das Reaktionsgemisch ließ man bei 25 Grad 64 Stunden lang stehen.

Das Gemisch wurde verdünnt mit 100 ml Wasser und dann stark sauer gemacht mit 20 ml konzentrierter HCL. Der dabei entstehende Gummi-artige Niederschlag wurde gerührt bis der Niederschlag eine Suspension wurde. Der Feststoff wurde isoliert durch Filtration, nochmals suspendiert in Methanol und filtriert unter Bildung von 3,75 g eines braunen Feststoffes. Das Material wurde gelöst in 8 ml heißem DMF und das Gemisch wurde verdünnt mit 40 ml Methanol. Die Säure kristallisierte aus und wurde durch Filtraton isoliert unter Bildung von 1,7 g eines flockigen weißen Feststoffes, 11α,17-Hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

1H-nmr (400-MHz, Deuterodimethylsulfoxid) d 0,80 (s, 3H), 1,25 (s, 3H), 1,2-2,7 (m, 2hH), 3,8 (brs, 1H), 4,45 (m, 1H), 5,50 (s, 1H). Das Carboxylproton wurde nicht beobachtet aufgrund der Gegenwart eines HOD Peaks bei 3,4 ppm.

Beispiel 38 Schema 1: Stufe 3C: Methode G: Herstellung von 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton

Das Verfahrensbeispiel 37A wurde wiederholt, außer, dass die mehrfachen Waschstufen vermieden wurden durch Behandlung der Reaktionslösung mit einem Ionenaustauscherharz, basischer Tonerde oder basischer Kieselerde. Bedingungen für die Behandlung mit basischer Tonerde oder basischer Kieselerde sind in Tabelle 38 wiedergegeben. Jede dieser Behandlungen erwies sich als wirksam für die Entfernung von Verunreinigungen ohne die mehrfachen Waschungen von Beispiel 44 unter Herstellung von 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α- pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Beispiel 39 Schema 1: Stufe 3C: Methode H: Herstellung von 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton

Kaliumacetat (4 g) und Trifluoressigsäure (42,5 ml) wurden vermischt in einem 100 ml Reaktor. Trifluoressigsäureanhydrid (9,5 ml) wurde dem Gemisch mit einer Geschwindigkeit zugesetzt, die so kontrolliert war, dass die Temperatur während der Zugabe unter 30ºC gehalten wurde. Die Lösung wurde dann auf 30ºC 30 Minuten lang erhitzt, um ein Eliminationsreagenz zu liefern, das sich zur Umwandlung des Mesylats der Formel IV zum Enester der Formel II eignete.

Das zuvor hergestellte TFA/TFA Anhydrid-Eliminierungsreagenz wurde einer Lösung vom Mesylat der Formel IV zugesetzt, das vorher wie in Beispiel 37A hergestellt worden war. Das dabei entstehende Gemisch wurde auf 40ºC 4% Stunden lang erhitzt, wobei der Umwandlungsgrad periodisch überprüft wurde durch TLC oder HPLC. Als die Reaktion beendet war, wurde das Gemisch transferiert in einen Einhalskolben und zur Trockne eingeengt unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur (22ºC). Ethylacetat (137 ml) wurde dem Gemisch zugesetzt, um vollständige Auflösung des Festphasenmaterials zu erzielen, wonach ein Wasser/Kochsalzlösungsgemisch (137 ml) zugesetzt wurde und das dabei entstehende Zwei-Phasen-Gemisch 10 Minuten lang gerührt wurde. Die Phasen konnten sich 20 Minuten lang absetzen. Die Stärke der Kochsalzlösung betrug 24 Gewichtsprozent. Die wässrige Phase wurde in Berührung gebracht mit einer weiteren Menge Ethylacetat (68 ml) und das so hergestellte Zwei-Phasen-Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt, wonach es 15 Minuten stehen konnte zur Phasentrennung. Die Ethylacetatschichten von den zwei Extraktionen wurden vereinigt und gewaschen mit 24 Gewichtsprozent Kochsalzlösung (120 ml), einer weiteren aliquoten Menge von 24 Gewichtsprozent Kochsalzlösung (60 ml), 1 N Natriumhydroxidlösung (150 ml) und einer anderen Portion Kochsalzlösung (60 ml). Nach jeder Wässrig-Phasen-Zugabe wurde das Gemisch 10 Minuten lang gerührt und 15 Minuten lang stehengelassen zur Abtrennung. Die dabei entstehende Lösung wurde zur Trockne eingeengt unter vermindertem Druck bei 45ºC unter Verwendung eines Wasseraspirators. Das Feststoffprodukt (8,09 g) wurde analysiert durch HPLC und es wurde gefunden, dass es 83,4 Bereichs-% des Enesfers 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton enthielt; 2,45 Bereichs-% des 11,12-Olefins; 1,5% des 7,9-Lactons und 1,1% nicht umgesetztes Mesylat.

Beispiel 40 Schema 1: Stufe 3C: Methode I: Herstellung von 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton

Das Mesylat, das die Struktur hergestellt per Beispiel 23 aufwies (1,0 g), Isopropylacetat (10 g) und p-Toluolsulfonsäure (5 mg) wurden in einen 50 ml Kolben getan und auf 90ºC unter Rühren erhitzt. Nach 5 Stunden wurde das Gemisch auf 25ºC gekühlt und im Vakuum eingeengt bei 10 mm Hg. Der Rückstand wurde gelöst in CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) und gewaschen mit 5% wässrigem NaHCO&sub3;. Die CH&sub2;Cl&sub2;-Schicht wurde im Vakuum eingeengt unter Bildung von 1,47 g eines hellbraunen Öles. Dieses Material wurde umkristallisiert aus CH&sub2;Cl&sub2;/Et&sub2;O unter Bildung von 0,50 g des Enolacetats der Formel IV(Z).

Dieses Material wurde einem Gemisch aus Natriumacetat (0,12 g) und Essigsäure (2,0 ml) zugesetzt, das vorher auf 100ºC unter Rühren erhitzt worden war. Nach 60 Minuten wurde das Gemisch auf 25ºC gekühlt und verdünnt mit CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml). Die Lösung wurde gewaschen mit Wasser (20 ml) und getrocknet über MgSO&sub4;. Das Trockenmittel wurde durch Filtration entfernt und das Filträt wurde im Vakuum eingeengt unter Bildung von 0,4 g des gewünschten 9,11-Olefins, 7- Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton. Das Rohprodukt enthielt weniger als 2% der 7,9-Lactonverunreinigung.

Beispiel 41 - Thermische Eliminierung von Mesylat in DMSO. Schema 1: Stufe 3C: Methode J: Herstellung von 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton

Ein Gemisch aus 2 g Mesylat und 5 ml DMSO in einem Kolben wurde auf 80ºC 22,4 Stunden lang erhitzt. HPLC Analyse dieses Reaktionsgemischs zeigte an, dass kein Ausgangsmaterial gefunden wurde. Dem Reaktionsgemisch wurde Wasser zugesetzt (10 ml) und der Niederschlag wurde extrahiert mit Methylenchlorid drei Mal. Die vereinigten Methylenchloridschichten wurden gewaschen mit Wasser, getrocknet über Magnesiumsulfat und eingeengt unter Bildung des Enesters 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Beispiel 42 Schema 1: Stufe 3D: Methode B: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

In einen 50 ml Birnenförmigen Kolben wurden unter Rühren der Enester von Formel IIA (1,07 g, 74,4% Enester), Trichloracetamid (0,32 g), Dikaliumhydrogenphosphat (0,70 g) als Feststoff mit Methylenchlorid (15,0 ml) vermischt. Wasserstoffperoxid (30 Gewichtsprozent, 5,0 ml) wurde mit Hilfe einer Pipette binnen einer Minute zugesetzt. Das dabei entstehende Gemisch wurde 6 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wonach HPLC Analyse zeigte, dass das Verhältnis von Epoxymexrenon zu Enester im Reaktionsgemisch etwa 1 : 1 betrug. Weiteres Trichloracetamid (0,32 g) wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Reaktion unter Rühren 8 weitere Stunden fortgesetzt, wonach die verbleibende Proportion des Enesters zeigte, dass sie auf 10% reduziert worden war. Weiteres Trichloracetamid (0,08 g) wurde zugesetzt und man ließ das Reaktionsgemisch übernacht stehen, wonach nur noch 5% nicht umgesetzter Enester verblieb, relativ zum Epoxymexrenon im Gemisch.

Beispiel 43 Schema 1: Stufe 3D: Methode C: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Enester der Formel IIA (5,4 g, 74,4% Enester) wurde einem 100 ml Reaktor zugesetzt. Trichloracetamid (4,9 g) und Dikaliumhydrogenphosphat (3,5 g), beide in fester Form, wurden dem Enester zugesetzt, gefolgt durch Methylenchlorid (50 ml). Das Gemisch wurde auf 15ºC gekühlt und 30% Wasserstoffperoxid (25 g) wurde binnen 10 Minuten zugesetzt. Das Reaktionsgemisch konnte sich auf 20ºC erwärmen und wurde bei dieser Temperatur 6 Stunden lang gerührt, wonach die Umwandlung durch HPLC überprüft wurde. Der verbleibende Enester wurde bestimmt und betrug weniger als 1 Gewichtsprozent.

Das Reaktionsgemisch wurde Wasser zugesetzt (100 ml), die Phasen durften sich trennen und die Methylenchloridschicht wurde entfernt. Natriumhydroxid (0,5 N; 50 ml) wurde der Methylenchloridschicht zugesetzt. Nach 20 Minuten durften sich die Phasen trennen und HCl (0,5 N; 50 ml) wurde der Methylenchloridschicht zugesetzt, wonach die Phasen sich trennen konnten und die organische Phase wurde gewaschen mit gesättigter Kochsalzlösung (50 ml). Die Methylenchloridschicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Ein weißer Feststoff (5,7 g) wurde erhalten. Die wässrige Natriumhydroxidschicht wurde angesäuert und extrahiert und der Extrakt aufgearbeitet unter Bildung von weiteren 0,2 g des Produktes. Die Ausbeute von Expoxymexrenon betrug 90,2%.

Beispiel 44 Schema 1: Stufe 3D: Methode D: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Enester der Formel IIA wurde umgewandelt zum Epoxymexrenon auf die in Beispiel 43 beschriebene Weise mit den folgenden Unterschieden: Die ursprüngliche Charge umfasste den Enester (5,4 g, 74,4% Enester), Trichloracetamid (3,3 g) und Dikaliumhydrogenphosphat (3,5 g). Wasserstoffperoxidlösung (12,5 ml) wurde zugesetzt. Die Reaktion erfolgte übernacht bei 20ºC, nachdem HPLC eine 90%-ige Umwandlung des Enesters zum Epoxymexrenon zeigte. Zusätzliches Trichloracetamid (3,3 g) und 30% Wasserstoffperoxid (5,0 ml) wurden zugesetzt und die Reaktion weitere 6 Stunden durchgeführt, wonach der restliche Enester nur 2% betrug, bezogen auf die Enestercharge. Nach der Aufarbeitung wie in Beispiel 43 beschrieben, erhielt man 5,71 g Epoxymexrenon.

Beispiel 45 Schema 1: Stufe 3D: Methode E: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Der Enester von Formel IIA wurde umgewandelt zum Epoxymexrenon auf die im Allgemeinen im Beispiel 43 beschriebene Weise. Bei der Reaktion dieses Beispiels betrug die Enestercharge 5,4 g (was 74,4% Enester entsprach), die Trichloracetamidcharge betrug 4,9 g, Wasserstoffperoxidcharge betrug 25 g, Dikaliumhydrogenphosphatcharge betrug 3,5 g.

Die Reaktion dauerte bei 20ºC 18 Stunden. Der rückständige Ester war weniger als 2%. Nach der Aufarbeitung erhielt man 5,71 g Epoxymexrenon.

Beispiel 46 Schema 1: Stufe 3D: Methode F: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Enester der Formel IIA wurde umgewandelt zu Epoxymexrenon auf die in Beispiel 43 beschriebene Weise, außer, dass die Reaktionstemperatur in diesem Beispiel 28ºC betrug. Die in den Reaktor gegebenen Materialien enthielten Enester (2,7 g), Trichloracetamid (2,5 g), Dikaliumhydrogenphosphat (1,7 g), Wasserstoffperoxid (17,0 g) und Methylenchlorid (50 ml). Nach 4 Stunden Reaktion betrug nicht umgesetzter Enester nur 2% bezogen auf die Enestercharge. Nach der Aufarbeitung wie in Beispiel 43 beschrieben wurden 3,0 g Epoxymexrenon erhalten.

Beispiel 47-1 Schema 1: Stufe 3D: Methode G: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Enester der Formel IIA (40,0 g, entsprechend 68,4% Enester) wurde in einen 1000 ml ummantelten Reaktor gegeben und in 175 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wurde gerührt während Trichloracetamid (22,3 g) und Dikaliumhydrogenphosphat (6,0 g) als Feststoffe zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde gerührt bei 400 RPM und die Temperatur auf 27ºC eingestellt mit einem konstanten Temperaturbad, um die Flüssigkeitszirkulierung durch den Reaktormantel zu kontrollieren. Wasserstoffperoxid (72,8 ml, was 30% entsprach) wurde binnen 3 bis 10 Minuten zugesetzt. Nach der Wasserstoffperoxidzugabe wurde das Gemisch bei 400 RPM und 27ºC gerührt. HPLC Bestimmung ergab, dass die Reaktion zu 99% vollständig war binnen 5 Stunden. Am Ende von 6 Stunden wurden 72,8 ml Wasser zugesetzt. Das wässrige Wasserstoffperoxid wurde abgetrennt und einmal rückextrahiert mit 50 ml Methylenchlorid. Die vereinigten Methylenchloride wurden gewaschen mit 6% Natriumsulfit (62,3 ml), um jegliches enthaltenes Peroxid zu zerstören. Die Entfernung des Methylenchlorids begann mit atmosphärischer Destillation und wurde im Vakuum fortgesetzt. Ein gelblicher Rückstand (48,7 g, entsprechend 55,4%) wurde erhalten. Dies entsprach einer 94,8%-igen eingestellten molaren Ausbeute.

Eine Portion (47,8 g) des Rückstandes wurde vereinigt mit 498 ml Ethanol 3A (95% Ethanol denaturiert mit 5% Methanol). Das Gemisch wurde auf Rückfluss erhitzt und 249 ml des Destillats bei Atmosphärendruck entfernt. Das Gemisch wurde auf 25ºC gekühlt und filtriert. Eine Ethanol 3A Spülung (53 ml) wurde angewendet, um zum Transfer beizutragen. Der getrocknete Feststoff wog 27,6 g (entsprechend 87,0%), was einer 91% Gewinnung entsprach. Eine Portion des Feststoffes (27,0 g) wurde gelöst in 292 ml Methylethylketon unter Rückfluß. Die heiße Lösung wurde filtriert durch ein Polster aus Solka Floc (pulverisierte Zellulose), wobei weitere 48,6 ml Methylethylketon verwendet wurden, um zum Transfer beizutragen. Eine 146 ml Portion des Methylethylketons wurde entfernt mit Hilfe atmosphärischer Destillation. Die Lösung wurde auf 50ºC gekühlt und eine Stunde lang gerührt als das Produkt kristallisierte. Nach einer Stunde wurde das Gemisch auf 25ºC gekühlt. Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt und der Feststoff filtriert, wobei 48,6 ml Methylethylketon als Spülung verwendet wurden. Der Feststoff wurde getrocknet zu einem Konstantgewicht von 20,5 g; das einer 87,2% Umkristallisationsgewinnung entsprach. Die Reaktionsausbeute und Ethanol, Methylethylketongewinnungen ergaben zusammen eine 75% Gesamtausbeute.

Die Methylethylketon-Mutterflüssigkeit war geeignet für Recycling mit einer zugesetzten Methylenchloridlösung von einer anschließenden Reaktion. Das vereinigte Methylenchlorid und Methylethylketongemisch wurde zur Trockne eingedampft mit Hilfe von atmosphärischer und Vakuumdestillation. Der Rückstand wurde vereinigt mit 19 Volumen Ethanol 3A bezogen auf Epoxymexrenongehalt. Die Hälfte des Lösungsmittels wurde unter atmosphärischer Destillation entfernt. Nach dem Kühlen auf 25ºC wurde der Feststoff filtriert und getrocknet. Der trockene Feststoff wurde gelöst in 12 Volumen Methylethylketon unter Rückfluß. Die heiße Lösung wurde filtriert durch ein Solka Floc Polster, wobei 2 Volumen Methylethylketon als Spülung zugesetzt wurden. Das Filtrat wurde eingeengt mit Hilfe von atmosphärischer Destillation auf 6 Volumen Methylethylketon. Die Lösung wurde auf 50ºC gekühlt und eine Stunde lang gerührt, als das Produkt kristallisierte. Nach einer Stunde wurde das Gemisch auf 25ºC gekühlt. Das Rühren wurde eine Stunde fortgesetzt und der Feststoff filtriert, wobei 2 Volumen Methylethylketon als Spülung benutzt wurden. Der Feststoff wurde zu einem Konstantgewicht getrocknet. Die Einarbeitung der Methylethylketonmutterflüssigkeit steigerte die Gesamtausbeute auf 80-85%.

Diese Methode scheint besonders geeignet für die Großherstellung, da sie den Umsatz maximiert und die Waschvolumen und Abfallprodukte minimiert.

Beispiel 47A Schema 1: Stufe 3D: Methode H: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α-Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Enester der Formel IIA (17 g, entsprechend 72% Enester) wurde gelöst in Methylenchlorid (150 ml) wonach Trichloracetamid (14,9 g) unter langsamem Rühren zugesetzt wurde. Die Temperatur des Gemischs wurde auf 25ºC eingestellt und eine Lösung von Dikaliumhydrogenphosphat (10,6 g) in Wasser (10,6 ml) wurde in die Enester-Substratlösung hineingerührt unter 400 rpm Rühren. Wasserstoffperoxid (30 Gewichtsprozent Lösung; 69,4 ml) wurde dem Substrat/Phosphat/Trichloracetamid-Gemisch binnen 3-5 Minuten zugesetzt. Es wurde keine exotherme Reaktion oder Sauerstoffentwicklung beobachtet. Das so hergestellte Reaktionsgemisch wurde bei 400 rpm und 25ºC 18,5 Stunden lang gerührt. Keine Sauerstoffentwicklung wurde beobachtet während des Reaktionsverlaufs, jedoch Analyse des Wasserstoffperoxidverbrauchs zeigte an, dass einiger Sauerstoff sich während der Reaktion gebildet hatte. Das Reaktionsgemisch wurde verdünnt mit Wasser (69,5 ml) und das Gemisch gerührt bei etwa 52 rpm 15 Minuten lang. Es war keine Temperaturkontrolle erforderlich für diesen Arbeitsgang und er wurde im Wesentlichen bei Raumtemperatur durchgeführt (wobei irgendeine Temperatur im Bereich von 5-25ºG akzeptabel ist). Die wässrige und die organische Schicht durften sich absetzen und die untere Methylenchloridschicht wurde entfernt.

Die wässrige Schicht wurde zurückextrahiert mit Methylenchlorid (69,4 ml) 15 Minuten lang unter Rühren bei 250 rpm. Man ließ die Schichten sich abtrennen und die untere Methylenchloridschicht wurde entfernt. Die wässrige Schicht (177 g; pH = 7) wurde entnommen für Wasserstoffperoxidbestimmung. Das Ergebnis. (12,2%) zeigte an, dass 0,0434 Mol Wasserstoffperoxid in der Reaktion verbraucht worden war von 0,0307 Mol Olefin. Der übermäßige Wasserstoffperoxidverbrauch war ein Maß der Sauerstoffentwicklung in der Reaktion. Zurückextraktion mit einer kleinen Menge Methylenchloridvolumen reichte aus, um sicherzustellen, dass kein Verlust an Epoxymexrenon in der wässrigen Schicht stattfand. Diese Ergebnis wurde bestätigt durch die Anwendung einer zweiten großen Methylenchloridextraktion, worin nur Trichloracetamid entdeckt wurde.

Die vereinigten Methylenchloridlösungen von den vorstehend beschriebenen Extraktionen wurden vereinigt und gewaschen mit 3 Gewichtsprozent Natriumsulfitlösung (122 ml) mindestens 15 Minuten bei etwa 250 rpm. Ein negativer Stärke-Iodid-Test (KI Papier; keine Farbe beobachtet; in einem positiven Test zeigt eine purpurne Färbung die Gegenwart von Peroxid an) wurde am Ende der Rührperiode beobachtet.

Die wässrige und die organische Schicht konnten sich abtrennen und die untere Methylenchloridschicht wurde entfernt. Die wässrige Schicht (pH = 6) wurde verworfen. Es sei angemerkt, dass die Zugabe von Natriumsulfitlösung eine schwach exotherme Reaktion verursachen kann, so dass eine solche Zugabe unter Temperaturkontrolle durchgeführt werden sollte.

Die Methylenchloridphase wurde gewaschen mit 0,5 N Natriumhydroxid (61 ml) 45 Minuten lang bei etwa 250 rpm und einer Temperatur im Bereich von 15-25ºC (pH = 12-13). Vom Trichloracetamid stammende Verunreinigungen wurden in diesem Verfahren entfernt. Ansäuerung der alkalischen wässrigen Fraktion, gefolgt durch Extraktion mit dem Methylenchlorid bestätigte, dass sehr wenig Epoxymexrenon bei dieser Arbeitsweise verlorengegangen war.

Die Methylenchloridphase wurde einmal gewaschen mit 0,1 N Salzsäure (61 ml) 15 Minuten lang unter 250 rpm Rühren bei einer Temperatur im Bereich von 15-25ºC. Man ließ die Schichten sich trennen und die untere Methylenchloridschicht wurde entfernt und nochmals gewaschen mit 10 Gewichtsprozent wässrigem Natriumchlorid (61 ml) 15 Minuten lang bei 250 rpm bei einer Temperatur im Bereich von 15-25ºC. Wiederum ließ man die Schichten sich abtrennen und entfernte die organische Schicht. Die organische Schicht wurde filtriert durch ein Kissen aus Solkafloc und dann zur Trockne eingedampft unter vermindertem Druck. Das Trocknen wurde vervollständigt mit einer Wasserbadtemperatur von 65ºC. Ein schmutzig-weißer Feststoff (17,95 g) wurde erhalten und einer HPLC Bestimmung unterworfen. Epoxymexrenonbestimmung ergab 66,05%. Eine eingestellte molare Ausbeute für die Reaktion betrug 93,1%.

Das Produkt wurde gelöst in heißem Methylethylketon (189 ml) und die dabei entstehende Lösung wurde bei Atmosphärendruck destilliert bis 95 ml des Ketonlösungsmittels entfernt worden waren. Die Temperatur wurde herabgesetzt auf 50ºC als das Produkt kristallisierte. Das Rühren wurde fortgesetzt bei 50ºC eine Stunde lang. Die Temperatur wurde herabgesetzt auf 20-25ºC und das Rühren weitere 2 Stunden lang fortgesetzt. Der Feststoff wurde filtriert und gespült mit MEK (24 ml) und der Feststoff getrocknet auf ein Konstantgewicht von 9,98 g, was durch HPLC Bestimmung einem Gehalt an 93,63% Epoxymexrenon entsprach. Dieses Produkt wurde nochmals gelöst in heißem MEK (106 ml) und die heiße Lösung filtriert durch einen 10 Micron Stofffilter unter Druck. Weitere 18 ml MEK wurden verwendet als eine Spülung und die filtrierte MEK Lösung bei Atmosphärendruck destilliert bis 53 ml Lösungsmittel entfernt worden waren. Die Temperatur wurde auf 50ºC herabgesetzt als das Produkt kristallisierte und das Rühren wurde bei 50ºC eine Stunde lang fortgesetzt. Die Temperatur wurde dann herabgesetzt auf 20-25ºC und bei dieser Temperatur gehalten, während das Rühren weitere 2 Stunden fortgesetzt wurde. Das Feststoffprodukt wurde filtriert und gespült mit MEK (18 ml). Das Feststoffprodukt wurde getrocknet zu einem Konstantgewicht von 8,32 g, das 99,6% Epoxymexrenon per quantitativer HPLC Analyse enthielt. Der Endverlust beim Trocknen war weniger als 1,0%. Die Gesamtausbeute von Epoxymexrenon gemäß der Reaktion und der Aufarbeitung dieses Beispiels betrug 65,8%. Diese Gesamtausbeute reflektiert eine Reaktionsausbeute von 93%, eine ursprüngliche Kristallisationsgewinnung von 78,9% und eine Umkristallisationsgewinnung von 89,5%.

Beispiel 47B Herstellung von 7-Methyl Hydrogen 11α,12α-Epoxy-17-hydroxy-3-oxo 17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Das Δ11,12-Olefin des Enesters ist ein Nebenprodukt der 11-Mesylateliminierung. Eine reine Probe wurde isoliert von einem Reaktionsgemisch, hergestellt auf die Weise des Beispiels 37A mit Hilfe einer repetiven präparativen Flüssigkeitschromatographie. Somit wurde ein 73 g Rest (hergestellt wie in Beispiel 37A beschrieben) chromatographiert über 2,41 kg Merck Silicagel (40- 63 u) mit einem Ethylacetat, Toluol-Gradienten-Elutionsschema (20 : 80, 30 : 70, 40 : 60, 60 : 40, V/V). Angereicherte Δ11,12-Olefinportionen wurden vereinigt aus ausgewählten 30 : 70 Fraktionen. TLC auf EMF Platten unter Verwendung von Ethylacetat/Toluol 60 : 40 (V/V) mit Schwefelsäure SMUV Sichtbarmachung diente als Hilfe zur Auswahl der geeigneten Fraktionen. Die 7,9 g des rohen Δ11,12- Olefins (80 Bereichs-% mit Hilfe von HPLC), erhalten nach Entfernung des Lösungsmittels, wurde chromatographiert über 531 g Merck Silicagel (40-63 u) mit einem Ethylacetat/Methylenchlorid- Gradienten-Elutionsschema (10 : 90, 20 : 80, 35 : 65, V/V). Reines 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3- oxo-17α-pregna-4,11-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton (3,72 g) wurde erhalten aus ausgewählten 20 : 80 Fraktionen. Die Auswahl der Fraktionen basierte auf TLC Bewertung wie in der vorangegangenen Situation.

MIR cm&supmin;¹ 1767 (Lacton), 1727 (Ester), 1668 und 1616 (3-Keto-Δ4,5).

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 1,05 (s, 3H), 1,15 (s, 3H), 3,66 (s, 3H), 5,58 (dd, 1H9, 5,80 (s, 1H), 5,88 (dd, 1H).

¹³C NMR(CDCl&sub3;) ppm 17,41, 18,58, 21,73, 28,61, 32,28, 33,63, 34,91, 35,64, 35,90, 38,79, 42,07, 44,12, 48,99, 49,18, 51, 52, 93,81, 126,43, 126,69, 133,76, 166,24, 172,91, 176,64, 198,56.

Eine Lösung von 1,6 g (3,9 mMol) 7-Methyt hydrogen 17-hydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,11- dien-7α,21-dicacboxylat, γ-Lacton in 16 ml Methylenchlorid wurde vermischt mit 2,2 ml Trichloracetonitril (22,4 mMol) und 0,75 g Dikaliumphosphat (4,3 mMol). Das Gemisch wurde gerührt und vereinigt mit 6,7 ml 30% Wasserstoffperoxid (66 mMol). Das Rühren wurde bei 25ºC 45 Stunden lang fortgesetzt. Am Ende dieser Zeit wurden 28 ml Methylenchlorid und 39 ml Wasser zugesetzt. Die organische Portion wurde isoliert und nacheinander gewaschen mit a) 74 ml 3% Natriumsulfit, b) 62 ml 1 N Natriumhydroxid, c) 74 ml 1 N Salzsäure und d) 31 ml 10% Kochsalzlösung. Die organische Portion wurde nochmals abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne unter Vakuum eingedampft. Der 1,25 g Rückstand wurde chromatographiert über 138,2 g Merck Silicagel (40-63 u) unter Verwendung eines Methyl-t-butylether und Toluol- Gradientensystem (40 : 60, 60 : 40, 75 : 25, V/V). Geeignete Portionen der 60 : 40 und 75 : 25 Fraktionen wurden vereinigt nach TLG Bewertung unter Bildung von 0,66 g reinem 7-Methyl Hydrogen 11α,12α-Epoxy-17-hydroxy-3-oxo 17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton. Das TLC System verwendete EMF Platten und ein 75 : 25 (V/V) Methyl-t-butylether und Toluol-Eluierungsschema mit Schwefelsäure und SMUV zur Sichtbarmachung.

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 1,09 (S, 3H), 1,30 (S, 3H), 3,05 (AB11,12 2H für), 3,67 (s, 3H), 5,80 (s, 1H).

¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm 14,2, 18,0, 21,2, 28,8, 31,9, 33,5, 34,6, 34,7, 35,1, 35,5, 37,5, 37,4, 38,3, 41,8, 46,0, 47,2, 50,4, 51,7, 56,7, 94,0, 126,7, 165,2, 172,5, 176,7, 198,1.

Theorie: C 69,54 und H 7,30; Gefunden: C 69,29 und H 7,17.

Beispiel 47C Isolierung von 7-Methyl hydrogen 4α,5α:9α,11α-diepoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregnan- 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton

Rohes Epoxymexrenon (157 g), hergestellt aus 200 g des Enesters auf die Weise von Beispiel 26 wurde Chromatographie unterworfen über 4,4 kg Merck Silicagel (40-63 u). Eine 88,1 g Portion wurde gewonnen mit einem Acetonitril und Toluol 10 : 90 (V/V) Eluierungsschema. Der isolierte Feststoff wurde gelöst in 880 ml heißem Methylethylketon und filtriert durch ein Polster von Solkafloc. Weitere 88 ml Methylethylketon wurden als Spülung verwendet. Das Filtrat wurde eingeengt, indem 643 ml des Lösungsmittels entfernt wurden und das Gemisch auf Raumtemperatur gekühlt. Die Feststoffe wurden filtriert und gespült mit Methylethylketon. Nach dem Trocknen wurden 60,2 g Epoxymexrenon erhalten, entsprechend 96,8% gemäß HPLC. Das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt unter vermindertem Druck. Der 9,3 g Rückstand wurde umkristallisiert aus 99 ml Methylethylketon unter Bildung von 2,4 g eines trockenen Feststoffes. Eine 400 mg Portion wurde präparativer Umkehrphasen HPLC auf einer YMC ODS AQ Säule unterworfen. Reines 7-Methyl hydrogen 4α,5α:9α,11α-diepoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregnan-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton (103 mg) wurde isoliert mit einem Eluierungsschema aus Acetonitril (24%), Methanol (4%) und Wasser (72%).

¹H NMR-(CDCl&sub3;) ppm 0,98 (s, 3H), 1,32 (s, 3H), 2,89 (m, 1H), 3,07 (s, d, 2H), 3,73 (s, 3H).

MS, M + 430, berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub0;O&sub7; (430,50).

Beispiel 47D Isolierung von 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3,12-dioxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton

Eine Methylethylketon-Mutterflüssigkeit, erhalten auf die Weise des Beispiels 26, wurde zur Trockne eingedampft unter vermindertem Druck. Eine 4,4 g Portion des Rückstandes wurde Chromatographie unterworfen auf 58,4 g BTR Zorbax LP (40 u). Eluierung mit einem Gradienten aus Methylethylketon und Methylenchlorid (25 : 75 bis 50 : 50, V/V) ergab 1,38 g des Materials. Eine 1,3 g Portion dieses Materials wurde weiter gereinigt mit Hilfe von präparativer Umkehrphasen HPLC unter Verwendung von Acetonitril (30%), Methanol (5%) und Wasser (65%) als mobile Phase und einer YMC ODA AQ Säule (10 u). Das Produkt wurde erhalten von den angereicherten Fraktionen mit Hilfe von Methylenchloridextraktion. Das Methylenchlorid wurde zur Trockne eingedampft und der 175 mg Rückstand nochmals gereinigt mit Hilfe von präparativer Umkehrphasen HPLC unter Verwendung von Acetonitril (24%), Methanol (4%) und Wasser (72%) als mobile Phase und einer YMC ODS AQ Säule. Methylenchloridextraktion der angereicherten Fraktionen ergab 30,6 mg des reinen 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-3,12-dioxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton.

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 1,17 (s, 3H), 1,49 (s, 3H), 3,13 (m, 1H), 3,62 (s, 3H), 5,77 (s, 1H), 5,96 (s, 1H).

¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm 13,1, 21,0, 28,0, 29,4, 33,1, 33,4, 33,9, 35,5, 36,7, 40,3, 41,5, 43,0, 43,4, 52,0, 55,0, 91,0, 123,7, 126,7, 163,2, 167,9, 171,9, 176,8, 197,4, 201,0.

Beispiel 47E Herstellung von 9,11α-Epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarbonsäure, dihydrat, kaliumsalz

Eine Suspension, enthaltend 2,0 g (4,8 mMol) Epoxymexrenon, hergestellt auf die Weise des Beispiels 43, 10 ml Wasser, 3 ml Dioxan und 9,3 ml 1,04 N wässriges Kaliumhydroxid (9,7 mMol) wurde hergestellt. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 25ºC gerührt. Eine gelbe homogene Lösung bildete sich während der ersten beiden Stunden. Die Temperatur wurde auf 70ºC erhöht und das Rühren weitere 3 Stunden fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde entfernt mit Hilfe von Vakuumdestillation und der Rückstand gereinigt mit Hilfe von Umkehrphasenchromatographie über 90 g C18 Silicagel unter Verwendung von Wasser als Eluierungsmittel. Die gewünschten Fraktionen wurden vereinigt nach Besichtigung mit Hilfe von TLC auf EMF Platten unter Verwendung von Methylenchlorid, Methanol (7 : 3) als das Eluierungsmittel und SMUV zur Sichtbarmachung. Die vereinigten Fraktionen wurden zur Trockne unter Vakuum eingeengt und der Rückstand Umkehrphasenreinigung unterworfen, was wiederholt wurde wie vorstehend beschrieben. Die gewünschten Fraktionen wurden zur Trockne eingeengt unter vermindertem Druck und der Rückstand in Ethanol gelöst. Ethylacetat wurde bis zum Trübungspunkt zugesetzt, dann wurde Heptan zugesetzt, um die Ausfällung zu beenden. 0,55 g des Produktes, 9,11α-Epoxy-17- hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarbonsäure, dihydrat, kaliumsalz wurden isoliert als gelber Feststoff. Die Kohlenstoffanalyse entsprach einer hydratisierten Struktur C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub8;O&sub7;K&sub2;·1,75 H&sub2;O: Theorie: C 52,50 gegenüber 55,85 für die wasserfreie Form; Gefunden C 52,49. Nach TLC auf EMF Platten mit Methylenchlorid, Methanol, Wasser (6 : 3 : 0,5, v/v) als Eluierungsmittel und Sichtbarmachen mit SMUV wurde Rf von 0,29 beobachtet

Beispiel 47F Herstellung von 9,11α-Epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarbonsäure, natriumsalz

Etwa 5 g (0,01 mMol) Epoxymexrenon, hergestellt auf die Weise des Beispiels 43, wurde suspendiert in etwa 200 ul Methanol in einer 4 ml Phiole und verdünnt mit etwa 200 ul 2,5 N NaOH. Das dabei entstehende Gemisch wurde gelb und homogen. Das Gemisch wurde dann erhitzt in einem Ölbad bei 70ºC. Nach 10 Minuten wurde eine 1 um Probe aus dem Gemisch analysiert durch HPLC (Zorbax SB-C8 150 · 4,6 nn, 2 ml/Minute, Gradient = 35 : 65 (V/V) A : B, A = Acetonitril/Methanol (1 : 1), B = Wasser/0,1% Trifluoressigsäure, Ermittlung bei 210 nm) zeigte zwei Materialien bei 4,86 und 2,93 Minuten Verweilzeiten, was übereinstimmte mit der Hydroxysäure (offenes Lacton) bzw. der offenen Lacton-7-carbonsäure. Nach 30 Minuten wurde eine zweite Probe (0,05 ml) entfernt und angesäuert mit 0,05 ml 3 N HCl, gefolgt durch Neutralisierung mit etwa 0,5 ml Natriumbicarbonat. HPLC Analyse wie oben zeigte die erwarteten Ring-geschlossenen Steroide mit Verweilzeiten von 6,59 und 10,71 Minuten. Das Verhältnis von 7-Methyl hydrogen 9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α- pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton (10,71 Minuten) zur entsprechenden 7-Carbonsäure betrug 7 : 89.

Selektive Hydrolyse des Lactons war möglich unter milden Bedingungen. Eine zweite 4 ml Phiole wurde wie vorstehend hergestellt jedoch nicht erhitzt. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang beschallt. Eine 0,05 ml Probe wurde verdünnt in 0,5 ml eines 1 : 1 (V/V) Gemischs aus Methanol/Acetonitril und wurde analysiert durch HPLC ohne vorherige Ansäuerung. Der dabei entstehende offene Lactoncarbonsäure-7-ester hatte eine Verweilzeit von 4,85 Minuten wie vorstehend beobachtet und war nicht verunreinigt durch 7-Carbonsäure.

Beispiel 47G Isolierung von 7-Methyl hydrogen 9α,11β,17-trihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton und 7-Methyl hydrogen 12α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton

7-Methyl hydrogen 9α,11β,17-trihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton und 7-Methyl hydrogen 12α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton wurden isoliert nach präparativer Flüssigkeitschromatographie der 2-Butanon-Mutterflüssigkeit, gewonnen aus der Epoxidierung des Enesters wie in Beispiel 26 beschrieben (Trichloracetonitril-Protokoll). Somit erfolgte die erste Kristallisierung unter Verwendung von 2- Butanon wie angegeben. Die Umkristallisierung jedoch verwendete 2-Butanon (1 Volumen je g) anstelle von Aceton. Ein 2,8 g Rückstand wurde auf diese Weise erhalten und wurde gereinigt durch präparative Umkehrphasen HPLC. Cromasil C8 (10 u) wurde als stationäre Phase verwendet mit einer mobilen Phase, die zusammengesetzt war aus milliQ Wasser und Acetonitril in einem Verhältnis von 70 : 30 (V/V). Die Kristallisierung wurde in einer der angereicherten Fraktionen beobachtet. Der Feststoff (46,7 mg) wurde isoliert und identifiziert als 7-Methyl hydrogen 9α,11β,17- trihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton. Die Mutterflüssigkeit wurde zur Trockne eingedampft unter vermindertem Druck und der Rückstand (123 mg) identifiziert als 7-Methyl hydrogen 12α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

7-Methyl hydrogen 9α,11β,17-trihydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton:

MS M + 432, berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub2;O&sub5; (432,51).

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 1,23 (s, 3H), 1,54 (s, 3H), 3,00 (m, 1H), 3,14 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 5,14 (s, 1H, langsam austauschbar), 5,79 (s, 1H).

¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm 16,8, 22,7, 24,8, 29,0, 29,3, 32,1, 34,1, 34,7, 35,2, 35,7, 36,8, 40,7, 43,0, 45,0, 45,9, 52,9, 72,8, 77,4, 95,9, 127,4, 163,7, 176,7, 177,3, 199,4.

7-Methyl hydrogen 12α,17-dihydroxy-3-oxo-17α-pregna-4,9(11)-dien-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton:

MS M + 441, berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub0;O&sub6; (414,50).

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 0,87 (s, 1H), 1,40 (s, 1H), 3,05 (m, 1H), 3,63 (s, 3H), 3,99 (m, 1H), 5,72 (s, 1H), 5,96 (m, 1H).

¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm 14,8, 24,0, 26,1, 29,7, 33,6, 33,8, 34,0, 36,3, 37,0, 37,4, 40,7, 40,9, 43,8, 48,1, 51,9, 69,1, 95,5, 122,7, 126,3, 145,9, 164,5, 173,2, 177,6, 198,2.

Beispiel 47H Herstellung von 7-Methyl hydrogen 9,11α,epoxy-3-ethoxy-17-hydroxy-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton und 7-Methyl hydrogen 6β,17-dihydroxy-9,11α-epoxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton

7-Methyl hydrogen 9,11α,epoxy-3-ethoxy-17-hydroxy-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton wurde hergestellt gemäß der Methode von R. M. Weier und L. M. Hofmann (J. Med. Chem. 1977, 1304), welche durch Bezugnahme enthalten ist. 148 g (357 mMol) 7-Methylhydrogen 6β,17- dihydroxy-9,11α-epoxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton, hergestellt auf die Weise von Beispiel 43 wurde vereinigt mit 311 mf absolutem Ethanol und 155 ml (932 mMol) Triethylorthoformiat. Die Schlemme wurde bei Raumtemperatur gerührt und 10,4 g (54,7 mMol) Toluolsulfonsäure (Monohydrat) wurde als Katalysator zugesetzt. Das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt und die Reaktion abgeschreckt durch Zugabe von 41,4 g (505 mMol) von Pulverförmigem Natriumacetat und 20,7 ml (256 mMol) Pyridin. Die Feststoffe (70,2 g) wurden durch Filtration entfernt und das Filtrat unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde digestiert mit 300 ml Ethylacetat und 9,8 g der Feststoffe wurden durch Filtration entfernt.

Das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt und der Rückstand digestiert mit 100 ml Methanol, enthaltend 2 ml Pyridin. 29,7 g der Feststoffe wurden entfernt durch Filtration. Weitere Ausfällung wurde im Filtrat beobachtet. Deshalb wurde das Filtrat nochmals filtriert, um zusätzliche 21,9 g der Feststoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt und der Rückstand digestiert mit 50 ml Methanol, enthaltend 1 ml Pyridin. 33,8 g der Feststoffe wurden durch Filtration isoliert. Qualitative HPLC zeigte an, dass diese letzte Portion von Feststoffen genügend rein war (90 Bereichs-% 7-Methyl hydrogen 9,11α,epoxy-3-ethoxy-17-hydroxy-17α-pregn-4-en-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton) zur Verwendung in der nächsten Stufe der Reaktion.

7-Methyl hydrogen 9,11α,epoxy-3-ethoxy-17-hydroxy-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton:

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 1,02 (s, 3H), 1,27 (s, 3H), 1,30 (t, 3H), 3,12 (m, 1H), 3,28 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,78 (m, 2H), 5,20 (s, 1H), 5,29 (d, 1H).

Eine 8 g Portion des Enolethers (7-Methyl hydrogen 9,11α,epoxy-3-ethoxy-17-hydroxy-17α- pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton) (18 mMol), hergestellt in der vorangegangenen Stufe, wurde gelöst in 120 ml 1,4-Dioxan. Die Lösung wurde vereinigt mit einem Gemisch aus 6,8 g 53% m-Chlorperbenzoesäure (20,9 mMol), 18,5 ml 1,0 N Natriumhydroxid (18,5 mMol) und 46 ml Dioxan/Wasser (9 : 1). Die Temperatur wurde auf -3ºC gehalten und das Gemisch 2 Stunden lang gerührt. Die Temperatur wurde auf 25ºC erhöht und das Rühren weitere 20 Stunden fortgesetzt. Das Gemisch wurde vereinigt mit 400 ml kaltem Wasser (10ºC) und 23,5 ml 1,0 N Natriumhydroxid (23,5 mMol). Das Gemisch wurde viermal extrahiert mit jeweils 100 ml Portionen Methylenchlorid. Die vereinigten Methylenchloridportionen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das überstehende Lösungsmittel unter Vakuumdestillation entfernt. Der 13,9 g Rückstand wurde trituriert mit 50 ml Ethylether unter Bildung von 2,9 g eines weißen Feststoffes. Eine 2,4 g Portion des Feststoffes wurde chromatographiert über 100 g Merck Silicagel (60 u). Nach einer ersten Waschung mit 1 l 1 : 1 Ethylacetat/Heptan wurde das Produkt eluiert mit einem 7 : 3 Verhältnis von Ethylacetat/Heptan. Angereicherte Fraktionen wurden vereinigt auf der Basis von TLC Bewertung (EMF Platten; Ethylacetat/Heptan 7 : 3 (V/V) Eluierungsmittel; SMUV Sichtbarmachung). Somit wurden 0,85 g des angereicherten Materials erhalten und umkristallisiert aus 10 ml Isopropanol unter Bildung von 0,7 g 7-Methyl hydrogen 6β,17-dihydroxy-9,11α-epoxy-3-oxo-17α-pregn-4-en- 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton. Die verunreinigteren Fraktionen wurden vereinigt und 0,87 g rohes 7- Methyl hydrogen 6β,17-dihydroxy-9,11α-epoxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton wurde erhalten. Dieses Material wurde chromatographiert über 67,8 g Merck Silicagel (40-63 u). Weitere 0,69 g des Produktes wurden gewonnen mit Toluol, enthaltend 0,5 bis 2,5% Methanol.

7-Methyl hydrogen 6β,17-dihydroxy-9,11α-epoxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ- Lacton:

Theorie: C 66,96 und H 7,02; Gefunden: C 66,68 und H 7,16.

¹H NMR (CDCl&sub3;) ppm 1,06 (s, 3H), 1,36 (dm, 1H), 1,63 (s, 3H), 2,92 (m, 1H), 3,02 (dd, 1H), 3,12 (d, 1H), 3,64 (s, 3H), 4,61 (d, 1H), 5,96 (s, 1H).

¹³C NMR (CDCl&sub3;) ppm 16, 17, 21,32, 21,79, 24,36, 27,99, 28,94, 30,86, 31,09, 32,75, 33,19, 34,92, 36,77, 39,16, 43,98, 47,74, 51,56, 51,66, 65,36, 72,23, 94,79, 165,10, 171,36, 176,41, 199,59.

Beispiel 47I Herstellung von 7-Methyl hydrogen 9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7β,21-dicarboxylat, γ-Lacton

2 g (4,8 mMol) 7-Methyl hydrogen 9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en-7α,21- dicarboxylat, γ-Lacton, hergestellt auf die Weise von Beispiel 43, wurden 3,3 ml (14,4 mMol) 25% Natriummethoxid in Methanol zugesetzt. Die dabei entstehende gelbe Suspension wurde auf 50ºC erhitzt. Der Feststoff löste sich nicht auf. Dem Gemisch wurden 3,3 ml Methanol (Aldrich wasserfrei) zugesetzt. Das Gemisch wurde auf Rückflußbedingungen erhitzt (65ºC) und wurde homogen. Nach 30 Minuten verhinderte ein fester Niederschlag das Rühren.

Etwa 25 ml wasserfreies Methanol wurden zugesetzt und das Gemisch wurde in einen 100 ml Kolben getan. Das Gemisch wurde auf Rückflußbedingungen 16 Stunden lang erhitzt, wonach das Gemisch dunkel und homogen wurde. Das Gemisch wurde auf 25ºC gekühlt und 70 ml 3 N HCl wurden zugesetzt (exotherm). Mehrere Gramm Eis wurden zugesetzt, um das Gemisch zu kühlen und die Lösung wurde extrahiert mit zwei nacheinander folgenden 25 ml Portionen Methylenchlorid. Die dunkle Lösung wurde getrocknet über Natriumsulfat und filtriert durch ein 2,5 cm Polster Silicagel (E. Merk, 70-230 mesh 60 Å Porengröße). Das Silica wurde eluiert mit 100 ml Methylenchlorid. Das eluierte Methylenchlorid wurde dann eingeengt im Vakuum unter Bildung von 1 g eines braunen Schaumes, der nach Zugabe von Ethylacetat kristallisierte. Das Silicapolster wurde eluiert ein zweites Mal mit 100 ml 10% Ethylacetat/Methylenchlorid und die eluierte Lösung wurde eingeengt unter Bildung von 650 mg eines braunen Schaumes.

Dünschichtchromatographie (E. Merck 60 F-254 Silicagel 0,25 mm, Toluol/Ethylacetat (1 : 1, V/V)) ergab die Gegenwart von 7-Methyl hydrogen 9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en- 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton und 7-Methyl hydrogen 9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4- en-7β,21-dicarboxylat, γ-Lacton in Proben, obgleich sehr wenig des 7α-Carboxyepimers in der ersten Probe vorhanden war. Die erste Probe wurde trituriert mit heißem Ethylacetat. (77ºC) und man ließ es abkühlen auf 25ºC. Das Gemisch wurde dann filtriert unter Bildung von 400 mg eines schmutzig weißen Feststoffes, Schmelzpunkt 254-258ºC. H, ¹³C und ¹³C-APT stimmten überein mit der zugeordneten Struktur. Eine kleine Menge Ethylacetat blieb in der Probe zurück, jedoch kein. Ausgangsmaterial wurde festgestellt durch HPLC (Zorbax SB-C8 150 · 4,6 nn, 2 ml/Minute, isocratisch 40 : 60 (V/V) A : B, A = Acetonitril/Methanol (1 : 1), B = Wasser/0,1% Trifluoressigsäure, ermittelt bei 210 nm) (HPLC zeigte 98,6 Bereichs-%) und durch TLC (Toluol-Ethylacetat 1 : 1, V/V).

FAB-MS bestätigte ein Molekulargewicht von 414 mit M&sbplus;H bei 415,2.

¹H NMR (400 MHz, Deuterochloroform) δ 0,95 (s, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,45 (m, 3H), 1,55-2,7 (m, 15H), 2,85 (t, J = 13, 1H), 3,25 (d, J = 6,1H), 3,65 (s, 3H), 5,78 (s, 1H).

Beispiel 47J Herstellung von 9,11α,Epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn4-en-7α,21-dicarbonsäure, γ- Lacton

774 mg (1,82 mMol) 7-Methyl hydrogen 9,11α-epoxy-17-hydroxy-3-oxo-17α-pregn-4-en- 7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton, hergestellt auf die Weise des Beispiels 43 und suspendiert in 3 ml Acetonitril wurden 3 ml (7,5 mMol, 2,0 Äquivalente) 2,5 M Natriumhydroxid zugesetzt. Das Gemisch wurde gelb und nach 10 Minuten war es homogen.

Um das Fortschreiten der Reaktion zu beobachten, wurden aliquote Mengen (0,1 ml) des Gemischs abgeschreckt in 0,01 ml 3 M Schwefelsäure und extrahiert in einer 4 ml Glasphiole mit Ethylacetat (0,2 ml). Die Phasen wurden getrennt durch Entfernen der unteren wässrigen Phase mit einer Pipette. Die organische Phase wurde abgestreift und der Rückstand analysiert durch HPLC unter Verwendung der in Beispiel 47H beschriebenen Methode. Nach 50 Minuten bei 2500 lag eine geringe Veränderung in der Zusammensetzung des Gemischs vor.

Das Gemisch wurde auf Rückflußbedingungen erhitzt (etwa 90ºC) 50 Minuten lang. HPLC Analyse des Gemischs zeigte 6 Bereichs-% des rückständigen Ausgangsmaterials. Das Gemisch wurde bei 25ºC 65 Stunden lang gerührt. Ansäuerung, Extraktion und HPLC Analyse einer aliquoten Menge wie vorstehend beschrieben bestätigte, dass kein Ausgangsmaterial zurückgeblieben war.

Das Gemisch wurde stark sauer gemacht durch Zugabe von etwa 4 ml 3 M Schwefelsäure und wurde extrahiert mit zwei Portionen (etwa 10 ml) Methylenchlorid. Die organischen Phasen wurden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet. Einengen auf einem Rotationsverdampfer ergab 780 g des Feststoffes. Der Feststoff wurde umkristallisiert aus Dimethylformamid/Methanol unter Bildung von 503 mg (67%) eines hellbraunen kristallinen Feststoffes. Die Probe schmolz mit Gasentwicklung in der Nähe von 260ºC, als sie schnell erhitzt wurde. Die Probe wurde langsam dunkel, blieb jedoch fest, wenn sie langsam erhitzt wurde auf 285ºC.

¹H NMR (Dimethylsulfoxid d-6, 400 MHz) δ 0,85 (s, 3H), 1,4 (s, 3H), 1,3-2,9 (m, 19H), 3,15 (m, 1H), 5,55 (s, 1H), 11,8 (br, 1H).

Beispiel 47K Schema 1: Stufe 3D: Methode I: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α,Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Eine 0,2 M Lösung des Enesters der Formel IIA in Methylenchlorid wurde vereinigt mit 2 Äquivalenten Dikaliumphosphat, gelöst in einem gleichen Gewicht Wasser (50% G/G wässrige Lösung), 3 Äquivalenten Chlordifluoracetamid und 22 Äquivalenten Wasserstoffperoxid (zugesetzt als eine 30% wässrige Lösung). Das Gemisch wurde bei 25ºC 23 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde verdünnt mit einer Menge an Wasser, die gleich war mit der Wasserstoffperoxidzugabe und das Methylenchlorid abgetrennt. Die Methylenchloridportion wurde einmal gewaschen mit einer 3% Natriumsulfitlösung (Volumen gleich 1,75 Mal der Wasserstoffperoxidzugabe). Die Methylenchloridportion wurde abgetrennt und getrocknet über Natriumsulfat. Die Lösung wurde eingeengt unter atmosphärischer Destillation bis eine Kopftemperatur von 70ºC erreicht worden war. Der Rückstand wurde bewertet mit Hilfe von HPLC, &sub1;H und ¹³C NMR (CDCl&sub3;). Die Ausbeute an Epoxymexrenon wurde bestimmt durch HPLC und betrug 54,2 Bereichs-%.

Beispiel 47L Schema 1: Stufe 3D: Methode J: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α,Epoxy-17α-hydroxy-3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Das Verfahren des Beispiels 47K wurde wiederholt unter Verwendung von Heptafluorbutyramid (CF&sub3;CF&sub2;CF&sub2;CONH&sub2;) anstelle von Chlordifluoracetamid. Die Ausbeute an Epoxymexrenon wurde durch HPLC bestimmt und betrug 58,4 Bereichs-%.

Beispiel 48 - Epoxidierung des Enesters der Formel IIA unter Verwendung von Toluol Schema 1: Stufe 3D: Methode K: Synthese von Methyl Hydrogen 9,11α,Epoxy-17α-hydroxy- 3-oxopregn-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-Lacton.

Der Enester der Formel IIA wurde umgewandelt zum Epoxymexrenon auf die im Allgemeinen im Beispiel 46 beschriebene weise, außer, dass Toluol verwendet wurde als Lösungsmittel. Die dem Reaktor zugesetzten Materialien umfaßten Enester (2,7 g), Trichloracetamid (2,5 g), Dikaliumhydrogenphosphat (1,7 g), Wasserstoffperoxid (17,0 g) und Toluol (50 ml). Die Reaktion durfte exotherm bis auf 28ºC steigen und war in 4 Stunden beendet. Das dabei entstehende Drei-Phasen-Gemisch wurde auf 15ºC gekühlt, filtriert, gewaschen mit Wasser und im Vakuum getrocknet unter Bildung von 2,5 g des Produktes.

Beispiel 49 - Schema 4: Methode A: Epoxidierung des 9,11-Dienons

Eine Verbindung bezeichnet als XVIIA (Verbindung XVII, worin -A-A- und -B-B- beide -CH&sub2;- CH&sub2;- sind) (40,67 g) wurde gelöst in Methylenchlorid (250 ml) in einem ein Liter 3-Hals-Kolben und gekühlt durch ein äußeres Eis-Salz-Gemisch. Dikaliumphosphat (22,5 g) und Trichloracetonitril (83,5 g) wurden zugesetzt und das Gemisch auf 2ºC gekühlt, wonach 3D% Wasserstoffperoxid (200 g) langsam zugesetzt wurde binnen einer Stunde. Das Reaktionsgemisch wurde gerührt bei 12ºC 8 Stunden lang und 14 Stunden lang bei Raumtemperatur. Ein Tropfen der organischen Schicht wurde entnommen und geprüft auf jegliches Ausgangsenon, wobei weniger als 0,5% gefunden wurden. Wasser (400 ml) wurde zugesetzt, 15 Minuten lang gerührt und die Schichten getrennt. Die organische Schicht wurde nacheinander gewaschen mit 200 ml Kaliumiodid (10%), 200 ml Natriumthiosulfat (10%) und 100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung, wobei die Schichten jedesmal getrennt wurden. Die organische Schicht wurde getrocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und eingeengt unter Bildung des rohen Epoxids (41 g). Das Produkt kristallisierte aus Ethylacetat : Methylenchlorid aus unter Bildung von 14,9 g des reinen Materials.

Beispiel 50 - Schema 4: Methode B: Epoxidierung der Verbindung XVIIA unter Verwendung von m- Chlorperbenzoesäure

Verbindung XVIIA (18,0 g) wurde gelöst in 250 ml Methylenchlorid und auf 10ºC gekühlt. Unter Rühren wurde feste m-Chlorperbenzoesäure zugesetzt (50-60% rein, 21,86 g) binnen 15 Minuten. Keine Temperaturerhöhung wurde beobachtet. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stundenlang gerührt und überprüft auf die Gegenwart des Dienons. Das Reaktionsgemisch wurde nacheinander behandelt mit Natriumsulfitlösung (10%), Natriumhydroxidlösung (0,5 N), Salzsäurelösung (5%) und schließlich mit 50 ml gesättigter Kochsalzlösung. Nach Trocknen mit wasserfreiem Magnesiumsulfat und Eindampfen erhielt man 17,64 g des Epoxids, das direkt in der nächten Stufe verwendet wurde. Es erwies sich, dass das Produkt Baeyer-Villiger Oxidations-Produkt enthielt, das durch Triturierung von Ethylacetat, gefolgt durch Kristallisation aus Methylenchlorid entfernt werden mußte. In der Größenordnung von 500 g wurde die ausgefallene m-Chlorbenzoesäure filtriert gefolgt durch übliche Aufarbeitung.

Beispiel 51 - Schema 4: Methode C: Epoxidation von Verbindung XVIIA unter Verwendung von Trichloracetamid

Verbindung XVIIA (2 g) wurde gelöst in 25 ml Methylenchlorid. Trichloracetamid (2 g), Dikaliumphosphat (2 g) wurden zugesetzt. Unter Rühren bei Raumtemperatur wurden 30% Wasserstoffperoxid (10 ml) zugesetzt und das Rühren wurde 18 Stunden fortgesetzt unter Bildung des Epoxids (1,63 g). Baeyer-Villiger Produkt bildete sich nicht.

Beispiel 52

Kaliumhydroxid (56,39 g; 1005,03 mMol; 3,00 Äquivalente) wurde in einen 2000 ml Kolben gegeben und mit Dimethylsulfoxid (750,0 ml) bei Umgebungstemperatur aufgeschlemmt. Ein Trienon entsprechend der Formel XX (worin R³ H ist und -A-A- und -B-B- jeweils -CH&sub2;-CH&sub2;- sind) (100,00 g; 335,01 mMOl; 1,00 Äquivalent) wurde in den Kolben gegeben zusammen mit THF (956,0 ml). Trimethylsulfoniummethylsulfat (126,14 g; 670,02 mMol; 2,00 Äquivalente) wurde in den Kolben gegeben und das dabei entstehende Gemisch auf Rückfluß erhitzt, 80-85ºC eine Stunde lang. Umwandlung zum 17-Spirooxymethylen wurde durch HPLC überprüft. THF, etwa 1 l, wurde vom Reaktionsgemisch unter Vakuum abgestreift, wonach Wasser (460 ml) binnen 30 Minuten zugesetzt wurde, während das Reaktionsgemisch auf 15ºC gekühlt wurde. Das dabei entstehende Gemisch wurde filtriert und das feste Oxiranprodukt zweimal gewaschen mit 200 ml aliquoten Mengen Wasser. Das Produkt wurde als hoch kristallin beobachtet und die Filtration wurde leicht durchgeführt. Das Produkt wurde danach unter Vakuum bei 40ºC getrocknet. 104,6 g des 3-Methylenolethers Δ-5,6,9,11,-17-Oxiransteroidprodukt wurde isoliert.

Beispiel 53

Natriumethoxid (41,94 g; 616,25 mMol; 1,90 Äquivalente) wurde in einen trockenen 500 ml Reaktor unter einer Stickstoffdecke gegeben. Ethanol (270,9 ml) wurde dem Reaktor zugesetzt und das Natriummethoxid im Ethanol aufgeschlemmt. Diethylmalonat (103,90 g; 648,68 mMol; 2,00 Äquivalente) wurde der Schlemme zugesetzt, wonach das Oxiransteroid, hergestellt auf die in Beispiel 52 beschriebene Weise (104,60 g; 324,34 mMol; 1,00 Äquivalente), zugesetzt wurde und das dabei entstehende Gemisch auf Rückfluß erhitzt wurde, d. h. 80 bis 85ºC. Das Erhitzen wurde 4 Stunden lang fortgesetzt, wonach die Beendigung der Reaktion geprüft wurde durch HPLC. Wasser (337,86 ml) wurde dem Reaktionsgemisch binnen 30 Minuten zugesetzt, während das Gemisch auf 15ºC gekühlt wurde. Das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt und dann die Reaktionsschlemme filtriert unter Bildung eines Filterkuchens, der ein feines amorphes Pulver enthielt. Der Filterkuchen wurde zweimal mit Wasser gewaschen (jeweils 200 ml) und danach bei Umgebungstemperatur im Vakuum getrocknet. 133,8 g des 3-Methylenolether-Δ-5,6,9,11-17- spirolacton-21-ethoxycarbonyl-Zwischenproduktes wurde isoliert.

Beispiel 54

Das 3-Methylenolether-Δ-5,6,9,11-17-spirolacton-21-ethoxycarbonyl-Zwischenprodukt (Formel XVIII, worin R³ H ist und -A-A- und -B-B- jeweils -CH&sub2;-CH&sub2;- sind; 133,80 g; 313,68 mMol; 1,00 Äquivalent, hergestellt wie in Beispiel 53) wurde dem Reaktor zugesetzt zusammen mit Natriumchlorid (27,50 g; 470,52 mMol; 1,50 Äquivalente). Dimethylformamid (709 ml) und Wasser (5 ml) wurden einem 2000 ml Reaktor unter Rühren zugesetzt. Das dabei entstehende Gemisch wurde auf Rückfluß, 138 bis 142ºC 3 Stunden lang erhitzt, wonach das Reaktionsgemisch auf Vollständigkeit der Reaktion durch HPLC geprüft wurde. Wasser wurde danach dem Gemisch binnen 30 Minuten zugesetzt, während das Gemisch auf 15ºC gekühlt wurde. Das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt, wonach die Reaktionsschlemme filtriert wurde unter Gewinnung eines amorphen festen Reaktionsproduktes als ein Filterkuchen. Der Filterkuchen wurde zweimal gewaschen (200 ml aliquote Mengen an Wasser) wonach er getrocknet wurde.

Das Produkt 3-Methylenolether-17-spirolacton wurde getrocknet unter Bildung von 91,6 g (82,3% Ausbeute; 96 Bereichs-% Analyse).

Beispiel 55

Der Enolether, hergestellt gemäß Beispiel 54 (91,60 g; 258,36 mMol; 1,00 Äquivalente), Ethanol (250 ml), Essigsäure (250 ml) und Wasser (250 ml) wurden einem 2000 ml Reaktor zugesetzt und die dabei entstehende Schlemme 2 Stunden lang auf Rückfluß erhitzt. Wasser (600 ml) wurde binnen 30 Minuten zugesetzt, während das Reaktionsgemisch auf 15ºC gekühlt wurde. Die Reaktionsschlemme wurde danach filtriert und der Filterkuchen zweimal mit Wasser gewaschen (200 ml aliquote Mengen). Der Filterkuchen wurde dann getrocknet; 84,4 g des Produktes 3-Keto Δ4,5,9,11,-17-spirolacton wurde isoliert (Verbindung der Formel XVII, worin R³ Wasserstoff ist und -A-A- und -B-B- -OH&sub2;-CH&sub2;- sind; 95,9% Ausbeute).

Beisniel 56

Verbindung XVIIA (1 kg; 2,81 Mol) wurde zusammen mit Tetrachlorkohlenstoff (3,2 l) einem 22 l 4-Hals-Kolben zugesetzt. N-Bromsuccinamid (538 g) wurde dem Gemisch zugesetzt gefolgt durch Acetonitril (3,2 l). Das dabei entstehende Gemisch wurde auf Rückfluß erhitzt und auf der 68ºC Rückflußtemperatur etwa 3 Stunden lang gehalten, wobei sich eine klare orangefarbige Lösung bildete. Nach 5 Stunden Erhitzen wurde die Lösung dunkel. Nach 6 Stunden wurde die Hitze entfernt und es wurden Proben vom Reaktionsgemisch genommen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum abgestreift und Ethylacetat (6 l) dem Rückstand im Boden des Destillierapparates zugesetzt. Das dabei entstehende Gemisch wurde gerührt, wonach eine 5% Natriumbicarbonatlösung (4 l) zugesetzt wurde und das Gemisch 15 Minuten lang gerührt wurde, wonach sich die Phasen abtrennen konnten. Die wässrige Schicht wurde entfernt und gesättigte Kochsalzlösung (4 l) in das Gemisch eingeführt, was dann 15 Minuten lang gerührt wurde. Die Phasen wurde nochmal getrennt und die organische Phase unter Vakuum abgestreift unter Bildung einer dicken Schlemme. Dimethylformamid (4 l) wurde dann zugesetzt und das Abstreifen fortgesetzt bis zu einer Topftemperatur von 55ºC. Die Bodensätze im Destilliergefäß konnten sich übernacht absetzen und DABCO (330 g) und Lithiumbromid (243 g) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde dann auf 70ºC erhitzt. Nach 1 1/2 stündigem Erhitzen wurde eine Flüssigkeitschromatographieprobe entnommen und nach 3,5 Stunden Erhitzen wurde weiteres DABCO (40 g) zugesetzt. Nach 4,5 stündigem Erhitzen wurde Wasser (4 l) zugesetzt und das dabei entstehende Gemisch auf 15ºC gekühlt. Die Schlemme wurde filtriert und der Kuchen mit Wasser gewaschen (3 l) und auf dem Filter übernacht getrocknet. Der nasse Kuchen (978 g) wurde zurückgegeben in den 22 l Kolben und Dimethylformamid (7 l) wurde zugesetzt. Das so hergestellte Gemisch wurde auf 105ºC erhitzt, wonach der Kuchen vollständig von der Lösung aufgenommen worden war. Die Hitze wurde entfernt und das Gemisch im Kolben wurde gerührt und gekühlt. Eiswasser wurde dem Reaktormantel zugegeben und das Gemisch innerhalb des Reaktors auf 14ºC gekühlt und zwei Stunden auf dieser Temperatur gehalten. Die dabei entstehende Schlemme wurde filtriert und zweimal gewaschen mit 2,5 l aliquoten Mengen Wasser. Der Filterkuchen wurde unter Vakuum übernacht getrocknet. Ein hellbraunes festes Produkt 510 g wurde erhalten.

Beispiel 57

Einem 2 l 4-Hals-Kolben wurden: 9,11-Epoxycanrenon, wie in Beispiel 56 hergestellt (100,00 g; 282,1 mMol; 1,00 Äquivalente), Dimethylformamid (650,0 ml), Lithiumchlorid (30,00 g; 707,7 mMol; 2,51 Äquivalente), und Acetoncyanohydrin (72,04 g; 77,3 ml; 846,4 mMol; 3,00 Äquivalente) zugegeben. Die dabei entstehende Suspension wurde mechanisch gerührt und behandelt mit Tetramethylguanidin (45,49 g; 49,6 ml; 395,0 mMol; 1,40 Äquivalente). Das System wurde dann filtriert mit einem Wasser-gekühlten Kühler und einem Trockeneiskühler (gefüllt mit Trockeneis in Aceton), um das Entweichen von HCN zu verhindern. Die Entlüfungsleitung von dem Trockeneiskühler führte in einen Wäscher, der mit einem großen Überschuß an Chlorbleichmittel gefüllt war. Das Gemisch wurde auf 80ºC erhitzt.

Nach 18 Stunden wurde eine dunkle rötlich-braune Lösung erhalten, die auf Raumtemperatur unter Rühren gekühlt wurde. Während des Kühlens wurde Stickstoff in die Lösung eingesprüht, um restliches HCN zu entfernen, wobei die Abzugsleitung in das Bleichmittel im Wäscher geführt wurde. Nach zwei Stunden wurde die Lösung mit Essigsäure (72 g) behandelt und 30 Minuten lang gerührt. Das rohe Gemisch wurde dann unter Rühren in Eiswasser gegossen (2 l). Die gerührte Lösung wurde weiter behandelt mit 10% wässriger HCl (400 ml) und eine Stunde lang gerührt. Dann wurde das Gemisch filtriert unter Bildung eines dunkel backsteinroten-Feststoffes (73 g). Das Filtrat wurde in einen 4 l Scheidetrichter getan und extrahiert mit Methylenchlorid (3 · 800 ml) und die organischen Schichten wurden vereinigt und zurückextrahiert mit Wasser (2 · 2 l). Die Methylenchloridlösung wurde im Vakuum eingeengt unter Bildung von 61 g eines dunkelroten Öles.

Nachdem die wässrigen Waschfraktionen sich übernacht absetzen konnten entwickelte sich ein beachtlicher Niederschlag. Dieser Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und als reines Produkt-Enamin (14,8 g) bestimmt.

Nach dem Trocknen wurde der ursprüngliche rote Feststoff (73 g) analysiert durch HPLC und es wurde bestimmt dass die Hauptkomponente 9,1-Epoxyenamin war. HPLC zeigte außerdem, dass Enamin die Hauptkomponente des roten Öles war, das von der Aufarbeitung des Methylenchlorids erhalten worden war. Berechnete molare Ausbeute des Enamins war 46%.

Beispiel 58

9,11-Epoxyenamin (4.600 g; 0,011261 Mol; 1,00 Äquivalente), hergestellt gemäß Beispiel 57, wurde in einen 1000 ml Rundkolben getan. Methanol (300 ml) und 0,5 Gewichtsprozent wässrige HCl (192 ml) wurden dem Gemisch zugesetzt, das danach 17 Stunden lang unter Rückfluß gehalten wurde. Methanol wurde danach unter Vakuum entfernt, wonach die Menge des Materials im Destilliergefäß auf 50 ml reduziert wurde und verursacht wurde, dass sich ein weißer Niederschlag bildete. Wasser (100 ml) wurde der Schlemme zugesetzt, die danach filtriert wurde, wobei sich ein weißer fester Kuchen bildete, der dreimal mit Wasser gewaschen wurde. Ausbeute des festen 9,11-Epoxydiketonproduktes betrug 3,747 g (81,3%).

Beispiel 59

Das gemäß Beispiel 58 hergestellte Epoxydiketon (200 mg; 0,49 mMol) wurde in Methanol (3 ml) suspendiert und 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]undec-7-en(DBU) wurde dem Gemisch zugesetzt. Beim 24 stündigen Erhitzen unter Rückfluß wurde das Gemisch homogen. Es wurde dann zur Trockne eingeengt bei 30ºC auf einem Rotationsverdampfer und der Rückstand aufgeteilt zwischen Methylenchlorid und 3,0 N HCl. Einengender organischen Phase ergab einen gelben Feststoff (193 mg) der als 22 Gewichtsprozent Epoxymexrenon bestimmt wurde. Die Ausbeute betrug 20%.

Beispiel 60

Zu 100 mg Diketon (hergestellt gemäß Beispiel 58), suspendiert in 1,5 ml Methanol, wurden 10 Mikroliter (0,18 Äquivalente) einer 25% (G/G) Lösung Natriummethoxid in Methanol zugesetzt. Die Lösung wurde auf Rückfluß erhitzt. Nach 30 Minuten blieb kein Diketon zurück und der 5-Cyanoester lag vor. Dem Gemisch wurden 46 Mikroliter 25% (G/G) Natriummethanollösung in Methanol zugesetzt. Das Gemisch wurde 23 Stunden lang auf Rückfluß erhitzt, wonach das Hauptprodukt Epoxymexrenon war, wie durch HPLC festgestellt wurde.

Beispiel 61

Zu 2 g Diketon (hergestellt gemäß Beispiel 58), suspendiert in 30 ml trockenem Methanol, wurden 0,34 ml Triethylamin zugesetzt. Die Suspension wurde 4,5 Stunden lang auf Rückfluß erhitzt. Das Gemisch wurde bei 25ºC 16 Stunden lang gerührt. Die dabei entstehende Suspension wurde filtriert unter Bildung von 1,3 g des 5-Cyanoesters als ein weißer Feststoff.

Zu 6,6 g des Diketons, suspendiert in 80 ml Methanol, wurden 2,8 ml Triethylamin zugesetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang auf Rückfluß erhitzt und bei 25 rpm 88 Stunden lang gerührt, währenddessen das Produkt aus der Lösung auskristallisierte. Filtration gefolgt durch eine Methanolwaschung ergab 5,8 g des Cyanoesters als ein weißes Pulver. Das Material wurde umkristallisiert aus Chloroform/Methanol unter Bildung von 3,1 g kristallinem Material, das homogen war wie durch HPLC bestimmt.

Im Hinblick auf Vorstehendes ist ersichtlich, dass die verschiedenen Gegenstände der Erfindung erreicht wurden und andere vorteilhafte Ergebnisse erzielt wurden.

Da verschiedene Veränderungen in den vorstehenden Zusammensetzungen und Verfahren gemacht werden könnten, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, ist beabsichtigt, dass alle in der vorstehenden Beschreibung enthaltenen und in den anliegenden Zeichnungen enthaltenen Gegenstände als Erläuterung und nicht als Begrenzung verstanden werden sollen.

Die neuen Verbindungen

Die vorliegende Erfindung ist weiter gerichtet auf zusätzliche polycyclische organische Gruppen, die sich als chromatographische Marker bei der Herstellung von Steroidverbindungen eignen, die vorteilhafte biologische Wirksamkeit haben wie Spironolacton oder Epoxymexrenon.

Kurz gesagt, es wurde gefunden, das gewisse Verbindungen, die einen substituierten oder nicht substituierten Steroidkern enthalten und einen substituierten oder nicht substituierten carbocyclischen Ring, kondensiert an die 13,17 Position des Steroidkerns, verwendet werden können als interne oder chromatographische Marker bei der Herstellung von Steroiden wie Spironolacton und Epoxymexrenon. Insbesondere ist die Verbindung Methyl 2,3,3a,4,6,7,9,10,11, 11a,12,13-Dodecahydro-3aβ,11aβ-dimethyl-1,9-dioxo-1H-pentaleno[1,6a-a]phenanthren-6α- carboxylat:

geeignet als ein chromatographischer Marker. Eine der neuen Eigenschaften dieser Verbindung und der verwandten Verbindungen dieser Erfindung ist der kondensierte carbocyclische Ring, der an den D Ring des Steroidkerns gebunden ist. Spironolacton und Epoxymexrenon besitzen diese Eigenschaft nicht und besitzen anstelle dessen einen 20-Spirolactonring.

Im vorliegenden entspricht der Steroidkern der Erfindung der folgenden Struktur:

Diese Struktur reflektiert die übliche Nummerierung und Ringbezeichnung für Steroidverbindungen. Der Steroidkern kann gesättigt, ungesättigt, substituiert oder nicht substituiert sein. Vorzugsweise enthält er mindestens einen bis vier ungesättigte Bindungen.

Bevorzugtererweise enthalten die A, C und D Ringe jeweils mindestens eine ungesättigte Bindung. Der Steroidkern kann außerdem substituiert sein wie im nachstehenden noch eingehender diskutiert. Vorzugsweise ist der Kern substituiert mit mindestens einer C7 Estergruppe.

Im Vorliegenden entspricht der an den Steroidkern kondensierte carbocyclische Ring einem vier, fünf oder sechs Kohlenstoff-cyclischen Skelett. Es kann gesättigt, ungesättigt, substituiert oder nicht substituiert sein. Vorzugsweise ist es gesättigt oder hat eine Doppelbindung und ist substituiert mit einer Hydroxy- oder Ketogruppe. Außerdem besitzt der carbocyclische Ring vorzugsweise die α- Orientierung relativ zum Steroidkern.

In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt der carbocyclische Ring ein cyclisches fünf- Kohlenstoffskelett und besitzt die α-Orientierung und die Verbindung ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus denjenigen Verbindungen entsprechend den folgenden Formeln:

worin

-A-A- die Gruppe -CR¹&sup0;²R102a-CR¹&sup0;³R103a- oder -CR¹&sup0;²=CR¹&sup0;³-, worin -CR¹&sup0;²R102a- und -CR¹&sup0;²= dem C2 Kohlenstoff entspricht und -CR¹&sup0;³R103a- und =CR¹&sup0;³- dem C3 Kohlenstoff entspricht;

-D-D- bedeutet die Gruppe -CHR¹&sup0;&sup4;-CH- oder -CR¹&sup0;&sup4;=C;

-E-E- bedeutet die Gruppe -CH&sub2;-CR¹¹&sup0;- oder CH=C;

-A-E- bedeutet die Gruppe -CR¹&sup0;²R102a-CH&sub2;- oder -CR¹&sup0;²=CH, worin -CR¹&sup0;²R102a- und -CR¹&sup0;²= dem C2 Kohlenstoff entspricht und -CH&sub2;- und =CH- dem C1 Kohlenstoff entspricht;

-G-G- bedeutet die Gruppe -CR¹&sup0;&sup6;R106a-CHR¹&sup0;&sup7;- oder -CR¹&sup0;&sup6;=CR¹&sup0;&sup7;-, worin -CR¹&sup0;&sup6;R106a- und -CR¹&sup0;&sup6;= dem C6 Kohlenstoff entsprechen und -CHR¹&sup0;&sup7;- und =CR¹&sup0;&sup7;- dem C7 Kohlenstoff entsprechen;

-J-J- bedeutet die Gruppe -CR¹&sup0;&sup8;-CR¹&sup0;&sup9;- oder -C=C-, worin -CR¹&sup0;&sup8;- dem C8 Kohlenstoff und -CR¹&sup0;&sup9;- dem C9 Kohlenstoff entsprechen;

-L-L- bedeutet die Gruppe -CR¹¹¹R111a-CH&sub2;- oder -CR¹¹¹=CH-, worin -CR¹¹¹R111a- und -CR¹¹¹= dem C11 Kohlenstoff und -CHR²- und =CH- dem C12 Kohlenstoff entsprechen;

-J-L- bedeutet die Gruppe -CR¹&sup0;&sup9;-CR¹¹¹R111a- oder -C=CR¹¹¹-, worin -CR¹&sup0;&sup9;- und -C= dem C9 Kohlenstoff und -CR¹¹¹R111a- und -CR¹¹¹- dem C11 Kohlenstoff entsprechen;

-M-M- bedeutet die Gruppe -CR¹¹&sup4;-CH&sub2;- oder -C=CH-, worin -CR¹¹&sup4;- und -C= dem C14 Kohlenstoffatom und -CH&sub2;- und -C=H- dem C15 Kohlenstoff entsprechen;

-J-M- bedeutet die Gruppe -CR¹&sup0;&sup8;-CR¹¹&sup4;- oder -C=C-, worin -CR¹&sup0;&sup8;- dem C8 Kohlenstoff und -CR¹¹&sup4;- dem C14 Kohlenstoff entsprechen;

-Q-Q- bedeutet die Gruppe CR¹²&sup0;R120a-CR¹¹&sup9;R119a- oder CR¹²&sup0;=CR¹¹&sup9;-, worin -CR¹²&sup0;R120a- und -CR¹²&sup0;=CR¹¹&sup9;- dem C20 Kohlenstoff und -CR¹¹&sup9;R119a- und =CR¹¹&sup9;- dem C19 Kohlenstoff entsprechen;

-Q-T- bedeutet die Gruppe -CR¹¹&sup9;R119a-CHR¹¹&sup8;- oder -CR¹¹&sup9;=CR¹¹&sup8;-, worin -CR¹¹&sup9;R119a- und -CR¹¹&sup9;= dem C19 Kohlenstoff und -CHR¹¹&sup8;- und =CR¹¹&sup8;- dem C18 Kohlenstoff entsprechen;

R¹&sup0;² ist Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl;

R102a ist Wasserstoff oder entspricht der Bindung zwischen dem C2 Kohlenstoffatom und dem C3 Kohlenstoffatom, wenn -A-A- die Gruppe =CR¹&sup0;²=CR¹&sup0;³- und -A-E- die Gruppe -CR¹&sup0;²R102a-CH&sub2;- bedeutet oder eine Bindung zwischen dem C1 Kohlenstoffatom und dem C2 Kohlenstoffatom darstellt, wenn -A-E- die Gruppe -CR¹&sup0;²=CH- bedeutet und -A-A- die Gruppe -CR¹&sup0;²R102a-CR¹&sup0;³R103a- bedeutet;

R¹&sup0;³ ist Wasserstofff, Hydroxy, geschütztets Hydroxy, R¹³&sup0;O-, R¹³&sup0;C(O)-, R¹³&sup0;OC(O)O- oder zusammen mit R103a ein Oxo bildet, mit der Maßgabe, dass -A-A- -CR¹&sup0;²R102a-CR¹&sup0;³R103a- ist, wenn R¹&sup0;³ zusammen mit R103a ein Oxo bildet;

R103a ist Wasserstoff oder bildet zusammen mit R¹&sup0;³ eini Oxo, mit der Maßgabe, dass -A-A- -CR¹&sup0;²R102a-CR¹&sup0;³R103a- ist, wenn R103a zusammen mit R¹&sup0;³ Oxo bildet;

R¹&sup0;&sup4; ist Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl;

R¹&sup0;&sup6; ist Wasserstoff, Hydroxy oder geschütztes Hydroxy oder bildet zusammen mit R106a ein Oxo oder zusammen mit R106a und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Cyclopropyl-, Cyclobutyl- oder Cyclypentylring bilden; mit der Maßgabe, dass -G-G- CR¹&sup0;&sup6;R106a- CR¹&sup0;&sup7;R107a- ist, wenn R¹&sup0;&sup6; zusammen mit R106a ein Oxo bilden;

R106a ist Wasserstoff, Hydroxy oder geschütztes Hydroxy oder bildet zusammen mit R106a ein Oxo oder bildet zusammen mit R¹&sup0;&sup6; und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropyl-, Cydobutyl- oder Cyclopentylring oder R106a zusammen mit R¹&sup0;&sup7; und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind bilden einen Cyclopropyl-, Cyclobutyl- oder Cyclopentylring;

R¹&sup0;&sup7; ist Wasserstoff, Hydroxcarbonyl; Niederalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl oder Aralkyl; Haloalkyl; Hydroxyalkyl; Alkoxyalkyl; Niederalkanoyl, Alkenoyl, Alkinoyl, Aryloyl, Heteroaryloyl oder Aralkanoyl; Niederalkoxycarbonyl, Alkenoxycarbonyl, Alkinoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, Heteroaryloxycarbonyl oder Aralkoxycarbonyl; Niederalkanoylthio, Alkenoylthio, Alkinoylthio, Aryloylthio, Heteraroylthio oder Aralkanoylthio; Niederalkylthio, Alkenylthio, Alkinylthio, Arylthio, Heteroarylthio oder Aralkylthio; Carbamyl; Alkoxycarbonylamino oder Cyano oder

R¹&sup0;&sup7; bildet zusammen mit R106a und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropyl-, Cyclobutyl- oder Cyclopentylring oder

R¹&sup0;&sup7; und R¹¹&sup4; bilden zusammen mit den C7, C8 und C14 Kohlenstoffatomen ein γ-Lacton;

R¹&sup0;&sup8; ist Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes Hydroxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, R¹&sup4;&sup0;O-, R¹&sup4;&sup0;C(O)O- oder R¹&sup4;&sup0;OC(O)O oder bedeutet eine Bindung zwischen dem C8 Kohlenstoffatom und dem C9 Kohlenstoffatom, wenn -J-J- die Gruppe -C=C- bedeutet und -J-M- die Gruppe CR¹&sup0;&sup8;- CR¹¹&sup4;- bedeutet oder eine Bindung bedeutet zwischen dem C8 Kohlenstoffatom und dem C14 Kohlenstoffatom, wenn

-J-M- die Gruppe -C=C- bedeutet und -J-J- die Gruppe CR¹&sup0;&sup8;-CR¹¹&sup4; bedeutet;

R¹&sup0;&sup9; ist Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes Hydroxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, R¹&sup5;&sup0;O-, R¹&sup5;&sup0;C(O)O- oder R¹&sup5;&sup0;OC(O)O- oder bedeutet eine Bindung zwischen dem C9 Kohlenstoffatom und dem C11 Kohlenstoffatom, wenn -J-L- die Gruppe -C=CR¹¹¹- bedeutet und -J-J- die Gruppe - CR¹&sup0;&sup8;-CR¹&sup0;&sup9;- bedeutet oder eine Bindung zwischen dem C9 Kohlenstoffatom und dem C8 Kohlenstoffatom wenn -J-J- die Gruppe -C=C- bedeutet und -J-L- die Gruppe -CR¹&sup0;&sup9;-CR¹¹¹R111a- bedeutet;

R¹¹&sup0; ist Wasserstoff oder Methyl;

R¹¹¹ ist Wasserstoff, Hydroxy oder geschütztes Hydroxy oder bildet zusammen mit R111a ein Oxo, mit der Maßgabe, dass -J-L- die Gruppe -CR¹&sup0;&sup9;-CR¹¹¹R11a bedeutet und -L-L- die Gruppe -CR¹¹¹R111a-CH&sub2;- bedeutet, wenn R¹¹¹ zusammen mit R111a ein Oxo bildet;

R111a ist Wasserstoff oder bildet zusammen mit R¹¹¹ ein Oxo mit der Maßgabe, dass -J-L- die Gruppe -CR¹&sup0;&sup9;-CR¹¹¹R111a- bedeutet und -L-L- die Gruppe -CR¹¹¹R111a-CH&sub2;- bedeutet wenn R111a zusammen mit R¹¹¹ ein Oxo bildet oder R111a eine Bindung zwischen dem C11 Kohlenstoffatom und dem C9 Kohlenstoffatom bedeutet, wenn -J-L- die Gruppe -C=CR¹¹¹- bedeutet und -L-L- die Gruppe -CR¹¹¹R111a-CH&sub2;- bedeutet oder R111a bedeutet eine Bindung zwischen dem C11 Kohlenstoffatom und dem C12 Kohlenstoffatom, wenn -L-L- die Gruppe -CR¹¹¹=CH- bedeutet und -J-L- die Gruppe -CR¹&sup0;&sup9;R109a-CR¹¹¹R111a- bedeutet;

R¹¹&sup4; ist Wasserstoff, Hydroxy, geschütztets Hydroxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, R¹&sup6;&sup0;O-, R¹&sup6;&sup0;C(O)O- oder R¹&sup6;&sup0;OC(O)O-; oder R¹¹&sup4; und R¹&sup0;&sup7; bilden zusammen mit den C7, C8 und C14 Kohlenstoffen ein γ-Lacton; oder R¹¹&sup4; bedeutet eine Bindung zwischen dem C14 Kohlenstoffatom und dem C8 Kohlenstoffatom wenn -J-M- die Gruppe -C=C- bedeutet und -M-M- die Gruppe -CR¹¹&sup4;-CH&sub2;- bedeutet; oder R¹¹&sup4; bedeutet eine Bindung zwischen dem C14 Kohlenstoffatom und dem C15 Kohlenstoffatom, wenn -M-M- die Gruppe -C=CH- bedeutet und -J-M- die Gruppe -CR¹&sup0;&sup8;-CR¹¹&sup4;- bedeutet;

R¹¹&sup8; ist Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Alkylthio, Alkenylthio oder Cyano;

R118a ist Wasserstoff oder bedeutet eine Bindung zwischen dem C18 Kohlenstoffatom und dem C19 Kohlenstoffatom wenn -Q-T- die Gruppe -CR¹¹&sup8;=CR¹¹&sup9;- bedeutet und -Q-Q- die Gruppe -CR¹¹&sup9;R119a-CR¹²&sup0;R120a- bedeutet;

R¹¹&sup9; ist Wasserstoff, Alkyl oder Alkenyl;

R119a ist Wasserstoff oder bedeutet eine Bindung zwischen dem C19 Kohlenstoffatom und dem C20 Kohlenstoffatom, wenn -Q-Q- die Gruppe -CR¹²&sup0;=CR¹¹&sup9;- bedeutet und -Q-T- die Gruppe -CR¹¹&sup9;R119a-CR¹¹&sup8;R118a- bedeutet; oder bedeutet eine Bindung zwischen dem C19 Kohlenstoffatom und dem C18 Kohlenstoffatom wenn -Q-T- -CR¹¹&sup9;=CR¹¹&sup8;- bedeutet und -Q-Q- bedeutet die Gruppe -CR¹¹&sup9;R119a-CR¹²&sup0;R120a;

R¹²&sup0; ist Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes Hydroxy oder bildet zusammen mit R120a ein Oxo, mit der Maßgabe, dass -Q-Q- die Gruppe -CR¹¹&sup9;R119a-CR¹²&sup0;R120a bedeutet wenn R¹²&sup0; zusammen mit R120a ein Oxo bildet;

R120a ist Wasserstoff oder bildet zusammen mit R¹²&sup0; ein Oxo, mit der Maßgabe, dass -Q-Q- die Gruppe -CR¹¹&sup9;R119a-CR¹²&sup0;R120a bedeutet wenn R120a zusammen mit R¹²&sup0; ein Oxo bildet und

R¹³&sup0;, R¹&sup4;&sup0;, R¹&sup5;&sup0; und R¹&sup6;&sup0; unabhängig voneinander Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl oder Heteroaryl sind.

Bevorzugtererweise entsprechen die Verbindungen der Formel C-3, worin R¹&sup0;&sup7; Wasserstoff, Hydroxycarbonyl, Niederalkyl, Niederalkanoyl, Niederalkoxycarbonyl, Niederalkanoylthio, Niederalkylthio, Carbamyl ist oder R¹&sup0;&sup7; zusammen mit R106a und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropylring bilden; R¹&sup0;&sup6; ist Wasserstoff, Hydroxy oder zusammen mit R106a und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropylring bilden; R106a ist Wasserstoff, Hydroxy oder zusammen mit R¹&sup0;&sup6; und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropylring bilden; oder R106a zusammen mit R¹&sup0;&sup7; und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropylring bilden und R¹²&sup0; Keto ist.

Die folgenden Definitionen betreffen die Diskussion mit Bezug auf die 13,17-kondensierten Ringverbindungen, die in der vorstehenden Beschreibung offenbart sind:

Der Ausdruck "Niederalkyl" bedeutet einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl und tert-Butyl, Pentyl und Hexyl. Der Rest kann gerad- oder verzweigtkettig oder cyclisch und substituiert (insbesonderte mit Aryl), nicht substituiert oder heterosubstituiert sein.

Der Ausdruck "Niederalkanoyl" bedeutet einen Rest vorzugsweise stammend von einem geradkettigten Alkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen und gebunden an die Stammmolekulargruppe über eine Carbonylgruppe. Besonders bevorzugt sind Formyl und Acetyl.

Der Ausdruck "Niederalkoxycarbonyl" bedeutet einen Rest, vorzugsweise stammend von einem geradkettigen Alkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen und gebunden an ein Sauerstoffatom, wobei dieses Sauerstoffatom gebunden ist an die Stammmolekulargruppe über eine Carbonylgruppe. Besonders bevorzugt sind Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl und n- Hexyloxycarbonyl.

Der Ausdruck "Niederalkenyl" bedeutet einen Alkenylrest mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Ethenyl, Propenyl, Isopropenyl, Butenyl, Isobutenyl, sec-Butenyl und tert-Butenyl, Pentenyl und Hexenyl. Der Rest kann gerad- oder verzweigtkettig sein und substituiert, nicht substituiert oder heterosubstituiert. Die Ausdrücke "Niederalkenoyl" und "Niederalkenoxycarbonyl" werden definiert auf die gleiche Weise wie "Niederalkanoyl" und "Niederalkoxycarbonyl", außer, dass sie von einem geradkettigen Alkenyl stammen anstelle eines geradkettigen Alkyls. Vorzugsweise ist der an den Alkenylrest irgendeiner Alkenoxycarbonylgruppe gebundene Sauerstoff getrennt von einem ungesättigten Kohlenstoffatom durch mindestens eine Methylengruppe.

Der Ausdruck "Niederalkinyl" bedeutet einen Alkinylrest mit 2 bis 6 Kichlenstoffatomen, wie Ethinyl, Propinyl, Isopropinyl, Butinyl, Isobutinyl, sec-Butinyl und tert-Butinyl, Pentinyl und Hexinyl. Der Rest kann gerad- oder verzweigtkettig sein und substituiert, nicht substituiert oder heterosubstituiert. Die Ausdrücke "Niederalkinoyl" und "Niederalkinoxycarbonyl" werden auf die gleiche Weise definiert wie "Niederalkanoyl" und "Niederalkoxycarbonyl", außer, dass sie von einem geradkettigen Alkinyl stammen anstelle eines geradkettigten Alkyls. Vorzugsweise ist der an den Alkinylrest irgendeiner Alkinoxycarbonylgruppe gebundene Sauerstoff getrennt von irgendeinem ungesättigten Kohlenstoff durch mindestens eine Methylengruppe.

Ein "Aryl"rest enthält vorzugsweise entweder allein oder mit verschiedenen Substituenten 5 bis 15 Atome und umfaßt Phenyl.

Der Ausdruck "Niederalkylthio" bedeutet einen Rest vorzugsweise stammend von einem geradkettigen Alkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen und gebunden an die Stammmolekulargruppe über ein Schwefelatom. Besonders bevorzugt ist Methylthio.

Der Ausdruck "Niederalkanoylthio" bedeutet einen Rest vorzugsweise stammend von einem geradkettigen Alkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen und gebunden an eine Carbonylgruppe, wobei diese Carbonylgruppe an die Stammmolekulargruppe gebunden ist über ein Schwefelatom. Besonders bevorzugt ist Acetylthio.

Die Ausdrücke "Niederalkenylthio" und "Niederalkenoylthio" werden auf die gleiche Weise definiert wie "Niederalkylthio" und "Niederalkanoylthio", außer, dass sie von einem geradkettigen Alkenyl stammen anstelle eines geradkettigen Alkyls. Vorzusweise ist das Schwefelatom irgendeiner Alkenylthiogruppe getrennt von irgendeinem ungesättigten Kohlenstoffatom durch mindestens eine Methylengruppe.

Die Ausdrücke "Niederalkinylthio" und "Niederalkinoylthio" werden auf die gleiche Weise definiert wie "Niederalkylthio" und "Niederalkanoylthio", außer, dass sie von einem geradkettigen Alkinyl stammen anstelle eines geradkettigen Alkyls. Vorzugsweise ist das Schwefelatom irgendeiner Alkinylthiogruppe getrennt von irgendeinem ungesättigten Kohlenstoff durch mindestens eine Methylengruppe.

Der Ausdruck "Carbamyl" bedeutet einen -NH&sub2; Rest, gebunden an die Stammmolekülgruppe über eine Carbonylgruppe. Die Carbamylgruppe kann monosubstituiert oder disubstituiert sein und die Substituenten können Alkyl-, Alkerlyl-, Alkinyl- und Arylreste umfassen.

Die vorstehend definierten Gruppen können nicht substituiert sein oder zusätzlich substituiert. Solche zusätzlichen Substituenten können umfassen Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxy wie Alkoxy, Carboxyalkyl, Acyl, Acyloxy, Halo wie Chlor oder Fluor, Haloalkoxy, Nitro, Amino, Amido und Keto. Die vorstehend definierten Gruppen als auch die zusätzlichen Substituenten können außerdem enthalten Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und/oder Stickstoff.

Im Vorliegenden bedeutet "Me" Methyl; "Et" bedeutet Ethyl und "Ac" bedeutet Acetyl.

In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist die Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen der folgenden Formeln:

worin R¹&sup0;&sup7;, R¹&sup0;&sup6;, R106a und R¹²&sup0; vorstehende Bedeutung haben. Vorzugsweise ist R¹&sup0;&sup7; Wasserstoff, Hydroxycarbonyl, Niederalkyl, Niederalkanoyl, Niederalkoxycarbonyl, Niederalkanoylthio, Niederalkylthio, Carbamyl oder bildet zusammen mit R106a und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropylring; R¹&sup0;&sup6; ist Wasserstoff, Hydroxy oder bildet zusammen mit R106a und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropylring; R106a ist Wasserstoff, Hydroxy oder bildet zusammen mit R¹&sup0;&sup6; und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropylring oder zusammen mit R¹&sup0;&sup7; und dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen Cyclopropylring und R¹²&sup0; ist Keto. Noch bevorzugter entspricht die Verbindung außerdem der Verbindung der Formel C-5.

In einer sogar noch bevorzugteren Ausführungsform ist die Verbindung der Formel C-3 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Verbindungen:

Ethyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl- 53,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carboxylat

Propyl 3',4',5',17-tetrahydro- 17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α- carboxylat

Butyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl- 3,5', dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carboxylat

1-Methylethyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α- carboxylat

2-Methylpropyl 3',4',5',17-tetrahydro- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carboxylat

1-Methylpropyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α- carboxylat

Cyclopentyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl- 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta- 1,4,8,14-tetraen-7α- carboxylat

Hexyl 3',4',5',17-tetrahydro- 17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α- carboxylat

Methyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- tetraen-7α-carboxylat

Propyl 3',4',5',17-tetrahydro- 17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-1,4,8,14-tetraen- 7α-carboxylat

Ethyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-1,4,8,14- tetraen-7α-carboxylat

1-Methylethyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18 norandrosta-1,4,8,14-tetraen- 7α-carboxylat

Butyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-1,4,8,14- tetraen-7α-carboxylat

1-Methylpropyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-1,4,8,14-tetraen- 7α-carboxylat

2-Methylpropyl 3',4',5',17-tetrahydro- 17β-methyl 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-1,4,8,14- tetraen-7α-carboxylat

Hexyl 3',4',5',17-tetrahydro- 17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- 7α-carboxylat

1,2,4bR(4bR*),5,5aS*,7, 7aR*,8,9,11,12bS*- Dodecahydro-7α,12b- dimethyl-10aR* -cyclopropal[/]pentaleno[1,6a- a]phenanthren-3,10-dion

4bR(4bR*),5,5aS*,7,7aR*,8,9, 11,12,12bS*-Decahydro-7A,12b- dimethyl-10R*- cyclopropal(/)pentaleno[1,6a- a]phenanthren-3,10-dion

1,2,4bS(4bR*),5,5aS*,8,9 11,12,12bR*-Dodecahydro- 7a,12b-dimethyl-10aS* -cyclopropal[/]pentaleno[1, 6a-a]phenanthren-3,10- dion

2',3',3'aα,4',6',11'aα,12',13'- Octahydro-3'aR,3'a,11'a- dimethyl-13'aR*- spiro[cyclopropan-1,7'(9'H)- [1H]pentaleno[1,6,a- a]phenanthren]-1',9'-dion

2',3',3'aα,4',6',10',11'- 11'aα,12',13'-Decahydro- 3'aR,3'a,11'a-dimethyl- 13'aR*- spiro[cyclopropan- 1,7'(9'H)- [1H]pentaleno[1,6a-a] phenanthren]-1',9'-dion

7α-(Acetylthio)-3',4'-dihydro- 17-methyl-cyclopenta[13,17]- 18-norandrosta-4,8,14-trien- 3,5'(2'H)-dion

3,4'-Dihydro-17-methyl- 7α-(methylthio)- cyclopenta[13,17]-18- norandrosta-4,8,14- trien-4,5'(2'H)-dion

3',4',5,5',6,17-Hexahydro-17β- methylcyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien- 3,5'(2'H)-dion

3',4',5',17-Tetrahydro- 6α-hydroxy-17β-methyl- 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carbonsäure

Methyl 3',4',5',17-tetrahydro- 6α-hydroxy-17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α carboxylat

Ethyl 3',4',5',17- tetrahydro-6α-hydroxy- 17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carbonsäure

Propyl 3',4',5',17-tetrahydro- 6α-hydroxy-17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α- carboxylat

1-Methylethyl 3',4',5',17-tetrahydro- 6α-hydroxy-17β-methyl- 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carboxylat

Butyl 3',4',5',17-tetrahydro- 6α-hydroxy-17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α- carboxylat

1-Methylpropyl 3',4',5',17-tetrahydro 6α-hydroxy-17β-methyl- 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carboxylat

3',4',5',17-Tetrahydro-17β- methylcyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien- 3,5'(2'H)-dion

3',4',5',17-Tetrahydro- 6β-hydroxy-17β-methyl- 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carbonsäure

Methyl 3',4',5',17-tetrahydro- 6β-hydroxy-17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α- carboxylat

Ethyl 3',4',5',17- tetrahydro-6β-hydroxy- 17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carboxylat

Propyl 3',4',5',17-tetrahydro- 6β-hydroxy-17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α- carboxylat

1-Methylethyl 3',4',5',17-tetrahydro- 6β-hydroxy-17β-methyl- 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17] 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carboxylat

Cyclopentyl 3',4',5',17- tetrahydro-17β-methyl 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α- carboxylat

1-Methylpropyl 3',4',5',17-tetrahydro- 6β-hydroxy-17β-methyl- 3,5'- dioxocyclopenta[13R,17] trien-7α-carboxylat

Methyl 2,2,3a,4,6,7,9, 10,11,11a,12,13-dodecahydro- 3αβ,11αβ-dimethyl-1,9-dioxo- 1H-pentaleno[1,6a- a]phenanthren-6α-carboxylat

Butyl 3',4',5',17- tetrahydro-6β-hydroxy- 17β-methyl-3,5'- dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14- trien-7α-carboxylat

7α-13R,17β)-3',4',5',17-Tetrahydro-14-hydroxy-17-methyl-3,5'- dioxo-γ-lacton, cyclopenta[13,17]-18-norandrosta-4,9(11)- dien-7-carbonsäure

[13S,17β]-3',4'-Dihydro-3-hydroxy-9,17- dimethylcyclopenta[13,17]gona-1,3,5(10)-trien-5'[2'H]-on

[13S,17β]-3',4',Dihydro-3-hydroxy-9,17- dimethylcyclopenta[13,17]gona-1,3,5(10),6-tetraen-5'[2'H]-an

[13S,17β]-3',4',Dihydro-17-methyl-cyclopenta[13,17]-18- norandrosta-4,6,8(14)-trien-3,5'[2'H]-dion

In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung Methyl 2,2,3a,4,6,7,9,10,11,11a,12,13-dodecahydro-3αβ,11αβ-dimethyl-1,9-dioxo-1H-pentaleno[1,6a- a]phenanthren-6α-carboxylat:

Diese Verbindung der Formel C-1 ist ein besonders wünschenswerter chromatographischer Marker bei der Herstellung von Epoxymexrenon.

Die hier diskutierten neuen Verbindungen können außerdem in Form ihrer Salze vorliegen.

Herstellung der neuen Verbindungen

Im Allgemeinen können die unmittelbar vorstehend beschriebenen neuen Verbindungen erhalten werden durch Umsetzung eines Steroids mit einem 20-Spiroxanring und dem vorstehend beschriebenen Steroidkern mit einer trihalogenierten Alkansäure. Vorteilhafterweise umfaßt das Reagenz für die Reaktion außerdem ein Alkalimetallsalz der verwendeten Alkansäure. Es wird besonders bevorzugt, dass das Reagenz für die Reaktion Trifluoressigsäure und ein Alkalimetallsalz dieser Säure umfaßt wie Kaliumtrifluoracetat. Außerdem wird vorzugsweise in der Reaktion ein Trockenmittel verwendet wie Trifluoressigsäureanhydrid, um in der Säure vorliegendes freies Wasser zu reduzieren.

Die als Ausgangsmaterialien verwendeten Steroidverbindungen haben vorzugsweise folgende Strukturformel:

worin -A-A-, -D-D-, -E-E-, -A-E-, -G-G-, -J-J-, -L-L-, -J-L-, -M-M-, -J-M-, -Q-Q- und -Q-T- vorstehende Bedeutung haben. Solche Ausgangsmaterialien können hergestellt werden und/oder isoliert werden durch Verfahren, die analog denjenigen sind, wie sie in Schema 1 beschrieben wurden und vorstehend diskutiert wurden für das Epoxymexrenon-Syntheseverfahren. Wahlweise sind die Ausgangsmaterialien im Handel erhältlich.

Die ursprüngliche Konzentration der Steroidverbindung der Formel C-3 ist vorzugsweise mindestens 0,1 Gewichtsprozent des Gesamtreaktionsgemischs, bevorzugtererweise etwa 2% bis etwa 20 Gewichtsprozent und noch bevorzugtererweise etwa 5% bis etwa 15 Gewichtsprozent. Ein Überschuss der Trihaloalkansäure liegt vorzugsweise vor. Wo Trifluoressigsäure verwendet wird, sollte es in einer Proportion von mindestens etwa 3 Gewichtsprozent des Gesamtreaktionsgemischs vorliegen, bevorzugtererweise zwischen etwa 5% bis etwa 25 Gewichtsprozent, am meisten bevorzugt zwischen etwa 10% und etwa 15 Gewichtsprozent.

Außerdem sollte die Reaktionstemperatur Raumtemperatur übersteigen (22ºC). Vorzugsweise liegt die Temperatur zwischen etwa 40ºC und 100ºC, bevorzugtererweise zwischen etwa 50ºC und 80ºC, noch bevorzugterer zwischen etwa 60ºC und 70ºC und am meisten bevorzugt zwischen etwa 60ºC und 65ºC. Erhöhung der Reaktionstemperatur auf etwa 70ºC oder höher steigert die Menge an Nebenprodukt C14 Lacton, das in der Reaktion erzeugt wird. Die Reaktionszeit sollte vorzugsweise mindestens 30 Minuten betragen, bevorzugtererweise zwischen etwa 30 Minuten und etwa 6 Stunden, noch bevorzugterer zwischen etwa 45 Minuten und etwa 4 Stunden und am meisten bevorzugt zwischen etwa einer Stunde und zwei Stunden. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Reaktionszeit zwischen etwa einer Stunde und zwei Stunden und die Reaktionstemperatur wird auf etwa 60ºC gehalten.

Nachstehendes Schema S-1 erläutert eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens:

Schema S-1

Kondensierte Ringsteroide mit unterschiedlichen Substituenten an verschiedenen Positionen innerhalb des Steroids können hergestellt werden wie in nachstehenden Reaktionsschemen dargelegt. Dem Fachmann sind zusätzliche Verfahren und Methoden bekannt, die nicht speziell hier beschrieben wurden, um unterschiedliche Substituenten an unterschiedlichen Positionen des Steroids einzufügen. Das Ausgangsmaterial kann entweder ein kondensiertes Ringsteroid sein oder ein 20-Spiroxan-Ringsteroid. Um die Beschreibung zu erleichtern, wo das Ausgangsmaterial ein kondensiertes Ringsteroid ist, verwenden die nachstehenden Reaktionsschemen spezifische Steroide oder Gruppen von Steroiden als erläuternde Ausgangsmaterialien. Es sollte jedoch verstanden werden, dass andere kondensierte Ringsteroidderivate oder Analoge hergestellt werden können in den gleichen Reaktionsreihen durch Verwendung eines anderen kondensierten Ringsteroids als Ausgangsmaterial. Auf ähnliche Weise, um die Beschreibung zu vereinfachen, worin das Ausgangsmaterial ein 20-Spiroxan-Ringsteroid ist, werden gewisse spezifische 20-Spiroxanringe als Ausgangsmaterialien verwendet. Es sollte jedoch verstanden werden, dass andere 20-Spiroxan-Ringsteroidderivate oder Analoge hergestellt werden können in den gleichen Reaktionsreihen durch Verwendung eines unterschiedlichen 20-Spiroxan-Ringsteroids als Ausgangsmaterial.

Steroide mit einem C7 Carbonsäuresubstituenten können hergestellt werden durch Verseifung eines Steroids mit einem C7 Alkoxycarbonylsubstituenten wie die Verbindung der Formel C-1. Die Verseifungsreaktion kann erfolgen durch Behandlung des Ausgangssteroids mit einem basischen Reagenz wie Natrium- oder Kaliumhydroxid in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Isopropanol und dergleichen bei Temperaturen bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels in Gegenwart oder Abwesenheit von Wasser. Wie in Schema S-2 erläutert, ergibt die Verseifung der Verbindung der Formel C-1 die Carbonsäure der Formel C-101.

Steroide mit C7 Carbonsäureestersubstituenten, die kein Methanoat sind, können hergestellt werden unter Verwendung von Carbonsäuren wie C-101 als Ausgangsmaterial. Behandlung solcher Carbonsäuren mit einem Alkylierungsmittel wie einem Alkylhalogenid in Gegenwart einer Base (wie Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumbicarbonat oder Triethylamin) in einem Lösungsmittel wie Dimethylformamid ergibt die gewünschten Ester. Beispiele für geeignete Alkylierungsmittel sind Ethyliodid, Ethylbromid, Isopropyliodid, Hexyliodid, Benzylbromid, Allyliodid und dergleichen.

Carbonsäure C-101 ist außerdem ein geeignetes Ausgangsmaterial für die Synthese von Carbamylen. Behandlung der Säure mit einem Chlorformiat wie Isobutylchlorformiat oder Ethylchlorformiat in Gegenwart einer Base ergibt ein gemischtes Anhydrid. Behandlung des gemischten Anhydrids mit einem Amin (wie Dimethylamin, Methylamin oder Benzylamin) ergibt das Carbamyl, worin R&sub1; und R&sub2; die Substituenten an den verschiedenen Aminen sind.

Schema S-2

Verschiedene Modifikationen an der C7 Position werden gemacht unter Verwendung von ungesättigten Ketonen wie die Verbindung der Formel C-105 (nachstehend gezeigt in Schema S-3) als Ausgangsmaterial. Sulfide werden synthetisiert durch die Zugabe von geeigneten Thiolen unter basischen Bedingungen. Beispiele für geeignete Thiole sind Methylmercaptan, Ethylmercaptan und dergleichen. Geeignete Basen umfassen Piperidin, Triethylamin und dergleichen.

Behandlung der ungesättigten Ketone (wie die Verbindung der Formel C-105) mit Thioalkansäuren wie Thioessigsäure liefert C7 Thioacylverbindungen wie Acetylthio.

Ein kondensierter C6, C7 Cyclopropyl-Substituent kann zugesetzt werden durch Behandlung von ungesättigten Ketonen (wie die Verbindung der Formel C-105) mit Dimethylsulfoxoniummethylid, das erzeugt wird durch Behandlung von Trimethylsulfoxoniumhalogenid mit einer geeigneten Base (wie Natriumhydrid) in einem geeigneten Lösungsmittel.

Die verschiedenen Syntheseschemen werden in Schema S-3 nachstehend erläutert:

Schema S-3

Steroide, die einen C6 Spirocyclopropylring tragen werden synthetisiert gemäß den Verfahren, nachstehend beschrieben in Schema S-4. Enone, wie die Verbindung der Formel C-110 werden zuerst geschützt als ein C3 Enolether durch Behandlung mit einem Orthoester wie Triethylorthoformiat oder Trimethylorthoformiat in Gegenwart einer Säure wie p-Toluolsulfonsäure. Der dabei entstehende Enolether wird behandelt mit Vilsmeier Reagenz, das in situ erzeugt wird durch Zugabe von Phosphoroxychlorid zum Dimethylformamid unter Bildung einer Formylverbindung wie die Verbindung der Formel C-112. Reduktion der Formylgruppe wird erzielt unter Verwendung eines Hydridreduktionsmittels wie Lithium tri-tert-Butoxyaluminiumhydrid in einem Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran. Dieses erzeugt einen Zwischenproduktalkohol, der bei der Behandlung mit Säure Wasser verliert unter Bildung einer 6-Methylenverbindung wie die Verbindung der Formel C-113. Geeignete Säuren umfassen Salzsäure in einem wässrigen Medium. Behandlung der 6-Methylenverbindung mit Diazomethan ergibt ein Zwischenproduktpyrazolin, das sich beim Erhitzen zersetzt unter Bildung einer Produkt-Spirocyclopropylverbindung wie die Verbindung der Formel C-114. Der geschützte Enolether (wie die Verbindung der Formel C-111) ist ein vielseitiges Zwischenprodukt und die Behandlung mit einem Hydridreduktionsmittel wie Natriumborhydrid, gefolgt durch Säurehydrolyse liefert Hydroxyverbindungen wie die Verbindungen der Formeln C-115 und C-116.

Diese verschiedenen Synthesestufen werden in nachstehendem Schema S-4 erläutert:

Schema S-4

Steroide mit einem C6 Hydroxysubstituenten und einem C7 Estersubstituenten können synthetisiert werden gemäß den Verfahren, wie sie nachstehend in Schema S-5 erläutert werden. Ein Ester (wie die Verbindung der Formel C-1) wird geschützt am C3 Carbonyl durch Bildung des 3,5-Dienolethers (wie die Verbindung der Formel C-117) unter Verwendung eines Orthoesters wie Triethylorthoformiat oder Trimethylorthoformiat in Gegenwart einer Säure. Eine geeignete Säure ist p-Toluolsulfonsäure. Behandlung des Enolethers mit einem Oxidationsmittel wie meta- Chlorperoxybenzoesäure resultiert in der Bildung einer Hydroxyverbindung wie die Verbindung der Formel C-118.

Schema S-5

Schema S-6 erläutert die Einführung einer Doppelbindung an der C1-C2 Position des Steroids. Diese erfolgt durch Behandlung des gewünschten Steroids (wie Verbindungen der Formeln C-1, C-108 und C-114) mit einem geeigneten Oxidationsmittel wie Dichlordicyanobenzochinon in einem geeigneten Lösungsmittel (wie Dioxan) bei Temperaturen im Bereich bis zum Siedepunkt C1-C2 ungesättigte Verbindungen wie die Verbindungen der Formeln C-127, C-128 und C-129 können gemäß diesem Verfahren hergestellt werden.

Schema S-6

Schema S-7 erläutert die Einführung einer Doppelbindung in den kondensierten Ring. Ein Steroid (wie die Verbindung der Formel C-114) wird behandelt mit einem Orthoester (wie Triethylorthoformiat oder Trimethylorthoformiat) in Gegenwart eines Säurekatalysators (wie p- Toluolsulfonsäure) unter Bildung des Enolethers, worin das C3 Carbonyl geschützt ist. Im Falle der Verbindung der Formel C-114 ist der sich bildende Enolether der C2-C3 Enolether (wie die Verbindung der Formel C-131), weil die C6 Position voll substituiert ist. Behandlung des Enolethers mit einer starken Base wie Lithiumdiisopropylamid bei niedriger Temperatur (-78ºC bis -30ºC), gefolgt durch Behandlung mit einem Selenierungsmittel wie Phenylselenenylchlorid ergibt das Selenoderivat wie die Verbindung der Formel C-132. Oxidation des Selenoderivates mit einem Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid bei beispielsweise Raumtemperatur in Gegenwart einer Base wie Pyridin in einem Lösungsmittel wie Methylenchlorid verursacht die Eliminierung der Selenogruppe und Einführung der Doppelbindung. Hydrolyse des Enolethers ergibt ein Keton wie die Verbindung der Formel C-134.

Schema S-7

Schema S-8 erläutert die Synthese von Doppelbindungsisomeren der Verbindung der Formel C-1. Behandlung mit verschiedenen Spiroxanverbindungen wie diejenigen, die in Schema S- 8 erläutert werden, mit Kaliumacetat, Trifluoressiganhydrid und Trifluoressigsäure unter Bedingungen ähnlich denjenigen wie für die Synthese der Verbindung der Formel C-1, ergeben die Vebindungen der Formeln C-121 und C-123.

Schema S-8

Schema S-9 erläutert eine alternative Methode zur Synthese von Doppelbindungsisomeren in dieser Familie von Steroiden. Ausgehend von einem vorgefertigten Enon (wie die Verbindung von Formel C-24, dessen Synthese vorstehend beschrieben wurde), das bereits den kondensierten Ring trägt, wird das C6-C7 kondensierte Cyclopropan eingeführt unter Anwendung der vorstehend in Schema S-3 beschriebenen Chemie für die Synthese der Verbindungen wie diejenigen der Formel C-108 und C-109.

Schema S-9

worin X Halogen ist.

Kondensierte Ringsteroide mit einem aromatischen A Ring können hergestellt werden durch Behandlung von Steroiden wie dienigen beschrieben in P. Compain, et al., Tetrahedron, 52(31), 10405-10416 (1996) (was durch Bezugnahme hierin enthalten ist) mit Trifluoressigsäure, Kaliumacetat und Trifluoressigsäureanhydrid im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie vorstehend mit Bezug auf Schema S-1 diskutiert wurde.

Diese neuen kondensierten Ringsteroide besitzen einen aromatischen A Ring und einen 3- Hydroxysubstituenten und man erwartet von ihnen, dass sie allen chemischen Reaktionen unterliegen, die typisch sind für Phenole. Schema S-10 erläutert die Synthese eines 3-phenolischen Ethers aus einem solchen kondensierten Ringsteroid. Insbesondere erwartet man von der Behandlung dieser phenolischen Verbindungen mit einer Base und einem Alkalihalogenid oder Alkylsulfonat, dass sie den entsprechenden phenolischen Ester produzieren. Siehe beispielsweise Feuer und Hooz, In The Chemistry of the Ether Linkage, Patai (Ed.), Interscience: New York, Seiten 446-450, 460-468 (1967) und Olson, W. T., J. Am. Chem. Soc., 69, 2451 (1947), die durch Bezugnahme hier enthalten sind.

Schema S-10

Auf ähnliche Weise erläutert Schema S-11 die Synthese eines 3-phenolischen Esters aus einem kondensierten Ringsteroid, das einen aromatischen A Ring besitzt und einen 3- Hydroxysubstituenten. Insbesondere wird von der Behandlung dieser phenolischen Verbindungen mit einem Carbonsäureanhydrid oder mit einem Carbonsäurehalogenid erwartet, dass sich der entsprechende phenolische Ester bildet. Siehe beispielsweise March, J., Advanced Organic Chemistry, Wiley: New York, Seiten 346-347 (1985), welches durch Bezugnahme hierin enthalten ist.

Schema S-11

Schema S-12 erläutert die Synthese eines 3-phenolischen Carbonats aus einem kondensierten Ringsteroid, das einen aromatischen A Ring und einen 3-Hydroxysubstituenten besitzt. Insbesondere wird von der Behandlung dieser phenolischen Verbindungen mit einem Alkylhaloformiat erwartet, dass sie das entsprechende phenolische Carbonat liefern. Siehe beispielsweise March, J., Advanced Organic Chemistry, Wiley: New York, Seiten 346-347 (1985), welches durch Bezugnahme hierin enthalten ist.

Schema S-12

Schema S-13 erläutert die Synthese von Orthoallyl-substituierten Phenylderivaten aus einem kondensierten Ringsteroid, das einen aromatischen A Ring und einen 3-Hydroxysubstituenten besitzt. Insbesondere erwartet man von der Behandlung dieser Verbindungen mit einer Base und einem Allylhalogenid, dass sie den entsprechenden Allylphenylether liefern. Der Allylphenylether sollte ein Gemisch aus Orthoallyl-substituierten Phenylderivaten bei der thermischen Umordnung liefern. Siehe beispielsweise Shine, H., J. Aromatic Rearrangements; Reaction Mechanism in Organic Chemistry, Monograph 6, American Elsevier: New York, Seiten 89-120 (1967), welches durch Bezugnahme hier enthalten ist.

Schema S-13

Schema S-14 erläutert die Synthese von orthodialkylierten substituierten Phenylderivaten aus einem kondensierten Ringsteroid, das einen A Ring und einen. 3-Hydroxysubstituenten besitzt. Insbesondere erwartet man von der Behandlung dieser Verbindungen mit einem Alkohol und einer Säure, dass sie die entsprechenden orthodialkylierten Phenylderivate liefern. Siehe beispielsweise Calcott, W. S., J. Am. Chem. Soc., 61, 1010 (1939), welches durch Bezugnahme hier enthalten ist.

Schema S-14

Schema S-15 erläutert die allylische Oxidation eines kondensierten Ringsteroids, das einen aromatischen A Ring und einen 3-Hydroxysubstituenten besitzt. Insbesondere können diese Verbindungen oxidiert werden an einer allylischen Position durch Umsetzung mit Seleniumdioxid und t-Butylhydroxyperoxid unter Bildung des entsprechenden Alkohols. Dehydratisierung dieses Alkohols liefert das entsprechende Olefin. Siehe beispielsweise Schmuff, N. R., J. Oro. Chem., 48, 1404 (1983), welches durch Bezugnahme hierin enthalten ist.

Schema S-15

Schema S-16 erläutert das Schützen der 3-Carbonylgruppe und die Reduktion der 20- Carbonylgruppe der neuen kondensierten Ringsteroide der vorliegenden Erfindung. Insbesondere können diese Verbindungen umgesetzt werden mit Trialkylorthoformiat und einer Säure unter Bildung des 3-Enolethers. Der 3-Enolether kann umgesetzt werden mit Natriumborhydrid, um die C- 20 Carbonylgruppe zum entsprechenden C-20 Alkohol zu reduzieren. Die Behandlung des C-20 Alkohols mit einer Säure und Wasser entfernt die Schutzgruppe des 3-Enolethers unter Bildung des 3-Ketoderivates.

Schema S-16

Schema S-17 erläutert die Hydrierung von olefinischen Bindungen in den neuen kondensierten Ringsteroiden der vorliegenden Erfindung. Insbesondere wird erwartet, dass die Hydrierung in zwei Stufen verläuft. Die C-6, C-7 Doppelbindung wird zuerst gesättigt, gefolgt durch Sättigung der C-8, C-14 Doppelbindung.

Schema S-17

Schema S-18 erläutert die Umordnung der geschützten 11α-Hydroxy-kondensierten Ringsteroide der vorliegenden Erfindung. Insbesondere wird die 11α-Hydroxygruppe der Verbindung zuerst geschützt mit einer geeigneten Schutzgruppe wie 2-Methoxyethoxymethylether (MEM Ether). Von der Behandlung des geschützten 11α-Hydroxysteroids mit einem Alkalimetallsalz und einer Trihaloalkansäure in Gegenwart eines Säureanhydrids wird erwartet, dass sie zur Umordnung der Lactongruppe führt in diesen Molekülen wie nachstehend erläutert. Entfernung des MEM Ethers mit Zinkbromid wird die nachstehend gezeigten umgeordneten Alkohole liefern.

Schema S-18

Schema S-19 erläutert das Schützen der 3-Carbonylgruppe und die Alkylierung der 19- Position der neuen kondensierten Ringsteroide der vorliegenden Erfindung. Insbesondere wird die Verbindung zuerst umgewandelt in den 3-Alkylenolether wie in Schema S-16 erläutert. Behandlung des 3-Alkylenolethers mit Lithiumdiisopropylamid (LDA), gefolgt durch Behandlung mit einem Alkylhalogenid führt zur Bildung des 19-Alkylderivates. Hydrolyse der 3-Alkylenoletherschutzgruppe ergibt das 3-Ketoderivat.

Schema S-19

Schema S-20 erläutert die Umwandlung von Estronmethylether zum entsprechenden Spirolacton. Umordnung des Lactons zum entsprechenden kondensierten Ringsteroid sollte erfolgen durch Behandlung des Lactons mit einer Trihalogenierten Alkansäure, vorzugsweise in Gegenwart eines Alkalimetallsalzes der verwendeten Alkansäure unter den vorstehend beschriebenen Reaktionsbedingungen. Siehe beispielsweise Otsubo, K., Tetrahedron Letters, 27(47), 5763 (1986).

Schema S-20

Die hier beschriebenen neuen Verbindungen können außerdem den Bioumwandlungsverfahren unterworfen werden ähnlich denjenigen wie sie vorstehend beschrieben wurden unter Bildung noch anderer neuer kondensierter Ringsteroide wie Steroide mit 9α, 9β, 11α oder 11β- Hydroxysubstituenten als auch andere hydroxylierte kondensierte Ringsteroide. Gegebenenfalls können solche hydroxylierten Steroide dann oxidiert werden durch Eliminierung des Hydroxysubstituenten zur Einführung einer olefinischen Doppelbindung wie eine Δ9,11-olefinische Doppelbindung.

Im Hinblick auf das Vorstehende ist ersichtlich, dass die verschiedenen Gegenstände der Erfindung erreicht werden und andere vorteilhafte. Ergebnisse erzielt werden.

Da verschiedene Veränderungen bei den vorstehenden Zusammensetzungen und Verfahren gemacht werden könnten, ohne vom Rahmen der Erfindung abzuweichen, ist beabsichtigt, dass alle in der vorstehenden Beschreibung enthaltenden Gegenstände als erläuternd ausgelegt werden sollen und nicht in einem begrenzenden Sinne.

Die nachstehenden nicht begrenzenden Beispiele dienen der Erläuterung verschiedener Aspekte der vorliegenden Erfindung:

Beispiel X-1A Herstellung von Methyl 2,3,3a,4,6,7,9,10,11,1a,12,13-dodecahydro-3aβ-dimethyl-1,9-dioxo-1H- pentaleno[1,6a-a]phenanthren-6α-carboxylat (Verbindung C1):

Kaliumacetat (6,7 g, 7,1 mMol; Sigma-Aldrich 5128LG)- wurde einem sauberen, trockenen Reaktor zugesetzt, der ausgestattet war mit einem mechanischen Rührer, Kühler, Thermoverbindung und Heizmantel. Trifluoressigsäure (25,0 ml, 8,1 Mol; Sigma-Aldrich 7125MG) und Trifluoressigsäureanhydrid (4,5 ml, 31,0 mMol; Sigma-Aldrich 11828PN) wurden nacheinander dem Reaktor zugesetzt. Die Lösung wurde dann bei einer Temperatur zwischen 25º und 30ºC 30 Minuten lang gehalten.

Das vorgefertigte TFA/TFA Anhydridreagenz wurde 5,0 g (9,6 mMol) 7-Methyl hydrogen 17- hydroxy-11α-(methylsulfonyl)oxy-3-oxo-17α-pregna-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-lacton:

zugesetzt, das auf die in Beispiel 36 beschriebene Weise hergestellt worden war. Das dabei entstehende Gemisch wurde auf 60ºC 60 Minuten lang erhitzt, wobei der Umsetzungsgrad periodisch überprüft wurde durch TLC und/oder HPLC. Als die Reaktion beendet war (etwa 60 Minuten) wurde das Gemisch in einen 1-Hals-Kolben getan und unter vermindertem Druck eingeengt bei 50ºC bis es eine dicke Schlemme wurde.

Die dabei entstehende Schlemme wurde verdünnt mit 150 ml Ethylacetat und 80 ml einer Wasser/Kochsalzmischung. Die Phasen konnten sich dann absetzen und die wässrige Schicht wurde nochmals extrahiert mit 80 ml Ethylacetat. Die Stärke der Kochsalzlösung betrug 12 Gewichtsprozent. Die vereinigte Ethylacetatlösung wurde einmal gewaschen mit 12 Gewichtsprozent Kochsalzlösung (80 ml), dann einmal mit 1 N NaOH Lösung (80 ml) und schließlich mit 12 Gewichtsprozent Kochsalzlösung (80 ml). Das Gemisch wurde stehengelassen, um sich abzutrennen und die abgetrennte Ethylacetatschicht wurde zur Trockne eingeengt unter vermindertem Druck bei 45ºC unter Verwendung eines Wasseraspirators unter Bildung von etwa 3,8 g eines rohen Feststoffproduktes. HPLC Analyse des Rohproduktes ergab, dass das Produkt etwa 40 Bereichs-% der Verbindung C-1 enthielt.

Das Feststoffprodukt wurde dann einer chromatographischen Reinigung unterworfen. Die chromatographische Reinigung erzeugte 210 mg Methyl 2,3,3a,4,6,7,9,10,11,1a,12,13-dodecahydro-3aβ-dimethyl-1,9-dioxo-1H-pentaleno[1,6a-a]phenanthren-6α-carboxylat (Verbindung C-1).

Die massenspektrometrischen Daten zeigten ein Molekulargewicht von 380 an und eine Formel von C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub8;O&sub4; von hohen Auflösungsdaten. Das EI Massenspektrum hatte ein M+ Peak bei m/z 380. Das APCI Massenspektrum hatte Peaks bei m/z 381 (MH)+ und m/z 398 (MNH&sub4;)+. Kohlenstoff und Wasserstoffanalysen stimmten überein mit der vorgeschlagenen molekularen Formel.

Das IR Spektrum hatte zwei Peaks in der Carbonylabsorptionsregion: 1722 cm&supmin;¹ und 1667 cm&supmin;¹. Das 1722 cm&supmin;¹ Peak wurde den beiden Carbonylen zugeordnet, da das ¹³C NMR Spektrum Signale bei δ 217,7 hat aufgrund eines gesättigten Ketons und bei δ 172,7 aufgrund von Carbomethoxycarbonyl. Abwesenheit des 1773 cm&supmin;¹ Peaks im IR Spektrum zeigte den Verlust der Lactongruppe an.

Die ¹³C APT und HETCOR NMR Daten zeigten die Gegenwart der folgenden Typen an Kohlenstoffen an: 3 Carbonyle (δ 217,7,198,4, 172,2); 4 voll substituierte olefinische Kohlenstoffe (δ 166,3, 141,8, 139,3, 121,8); 2 Methin-olefinische Kohlenstoffe (δ 124,9, 122,0); 3 quaternäre aliphatische Kohlenstoffe (δ 61,1, 50.7, 39,7); 1 Methin aliphatischer Kohlenstoff (δ 43,3);

8 Methylenkohlenstoffe (δ 46,0, 37,5, 34,1, 33,3, 32,9, 31,9, 23,7, 22,2) und 3 Methylkohlensfoffe (δ 51,9, 23,6, 23,1).

Beispiel X-1B Herstellung von (7α,13R,17β)-3',4',5',17-Tetrahydro-14-hydroxy-17-methyl-3,5',dioxo-γ-lacton, cyclopenta [13,17]-18-norandrosta-4,9(11)-dien-7-carbonsäure (Verbindung (C-201):

Kaliumacetat (8,9 g, 90 mMol), Trifluoressigsäure (150 ml, 1,480 g/ml) und Trifluoressigsäureanhydrid (33 ml, 1,487 g/ml) wurden einem 250 ml Rundkolben zugesetzt, der ausgestattet war mit mechanischem Rührer, Kühler und Heizmantel. Die dabei entstehende Lösung wurde gerührt zwischen etwa 25ºC und 30ºC etwa 10 Minuten lang.

Das zuvor hergestellte TFA/TFA Anhydridreagenz wurde 15 g (30,0 mMol) 7-Methyl hydrogen 17-hydroxy-11α-(methylsulfonyl)oxy-3-oxo-17α-pregna-4-en-7α,21-dicarboxylat, γ-lacton

zugesetzt, welches auf die in Beispiel 36 beschriebene Weise hergestellt worden war. Das dabei entstehende Gemisch wurde auf zwischen etwa 60 bis 70ºC etwa 1 bis 1,5 Stunden lang erhitzt. Dieses Gemisch wurde unter vermindertem Druck bei 50ºC eingeengt unter Bildung einer dicken Schlemme. Die Schlemme wurde gelöst in 100 ml Ethylacetat und wurde zweimal gewaschen mit etwa 20% Wasser/Kochsalzlösung (jeweils 80 ml), einmal mit 1 N Natriumhydroxid (80 ml) Lösung, gefolgt durch einmal mit etwa 20% Wasser/Kochsalzlösung (80 ml). Das Rohprodukt wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt unter Bildung von 18 g eines rohen nassen Materials.

Dieses Material wurde gereinigt durch Säulenchromatographie zweimal unter Bildung von etwa 3 g reinem (7α,13R,17β)-3',4',5',17-Tetrahydro-14-hydroxy-17-methyl-3,5',dioxo-γ-lacton, cyclopenta [13,17]-18-norandrosta-4,9(11)-dien-7-carbonsäure (Verbindung (C-201).

Beispiel X-1C Herstellung von [13S,17β]-3',4',Dihydro-3-hydroxy-9,17-dimethylcyclopenta[13,17]gona-1,3,5(10)- trien-5'[2'H]-on (Verbindung C-202):

Kaliumacetat (6 g, 61,1 mMol), Trifluoressigsäure (150 ml, 1,480 g/ml) und Trifluoressigsäureanhydrid (26 ml, 1,487 g/ml) wurden einem 250 ml Rundkolben zugesetzt, der ausgestattet war mit mechanischem Rührer, Kühler und Heizmantel. Die dabei entstehende Lösung wurde zwischen etwa 25ºC und 30ºC etwa 10 Minuten lang gerührt.

Das zuvor hergestellte TFA/TFA Anhydridreagenz wurde 15 g(43,7 mMol) 17-Hydroxy-3- oxo-17α-pregn-4-en-21-carbonsäure, γ-lacton (auch bekannt als Aldona; G. D. Searle & Co.) zugesetzt:

Das dabei entstehende Gemisch wurde erhitzt auf zwischen 60ºC und 70ºC etwa 1 bis etwa 1,5 Stunden lang. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck bei 50ºC eingeengt unter Bildung einer dicken Schlemme. Die Schlemme wurde gelöst in 100 ml Ethylacetat und wurde zweimal gewaschen mit etwa 20% Wasser/Kochsalzlösung (80 ml jeweils), einmal mit 1 N Natriumhydroxidlösung (80 ml), gefolgt durch einmal mit etwa 20% Wasser/Kochsalzlösung (80 ml). Das Rohprodukt wurde getrocknet über Magnesiumsulfat, filtriert und zur Trockne unter vermindertem Druck bei 50ºC eingeengt unter Bildung von etwa 20 g des rohen nassen Materials.

Dieses Material wurde durch Säulenchromatographie zweimal gereinigt unter Bildung von etwa 125 g reinem [13S,17β]-3',4',Dihydro-3-hydroxy-9,17-dimethylcyclopenta[13,17]gona-1,3,5(10)- trien-5'[2'H]-on (Verbindung -202).

Beispiel X-1D Herstellung von [13S,17β]-3',4'-Dihydro-3-hydroxy-9,17-dimethylcyclopenta[1,3,17]gona-1,3,5(10),6- tetraen-5'[2'H]-on (Verbindung -203):

Kaliumacetat (6 g, 61,1 mMol), Trifluoressigsäure (150 ml, 1,480 g/ml) und Trifluoressigsäureanhydrid (26 ml, 1,487 g/ml) wurde einem 250 ml Rundkolben zugesetzt, der ausgestattet war mit mechanischem Rührer, Kühler und Heizmantel. Die dabei entstehende Lösung wurde zwischen etwa 25ºC und 30ºC etwa 10 Minuten lang gerührt.

Das zuvor hergestellte TFA/TFA Anhydridreagenz wurde 15 g (45,9 mMol) 17-Hydroxy-3- oxo-17α-pregn-4,9(11)-dien-21-carbonsäure, γ-lacton (auch bekannt als Δ9,11-Aldona):

zugesetzt, welches hergestellt worden war aus 3-Methoxy-3,5,9(11)-androstatrien-17-on (Upjohn). Das dabei entstehende Gemisch wurde erhitzt auf zwischen etwa 60ºC und 70ºC etwa 1 bis 1,5 Stunden lang. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck bei 50ºC eingeengt unter Bildung einer dicken Schlemme. Die Schlemme wurde gelöst in 100 ml Ethylacetat und wurde zweimal gewaschen mit etwa 20% Wasser/Kochsalzlösung (80 ml jeweils), einmal mit 1 N Natriumhydroxidlösung (80 ml), gefolgt durch einmal mit etwa 20% Wasser/Kochsalzlösung (80 ml). Das Rohprodukt wurde getrocknet über Magnesiumsulfat, filtriert und zur Trockne eingeengt unter vermindertem Druck bei 50ºC unter Bildung von etwa 18 g rohem nassem Material.

Dieses Material wurde durch Säulenchromatographie zweimal gereinigt unter Bildung von etwa 340 g reinem [13S,17β]-3',4'-Dihydro-3-hydroxy-9,17-dimethylcyclopenta[13,17]gona- 1,3,5(10),6-tetraen-5'[2'H]-on (Verbindung -203).

Beispiel X-1E Herstellung von [13S,17β]-3',4'-dihydro-17-methyl-cyclopenta[13,17]-18-norandcosta-4,6,8(14)-trien- 3,5'[2'H]-dion (Verbindung -204):

Kaliumacetat (8 g, 81,5 mMol), Trifluoressigsäure (150 ml, 1,480 g/ml) und Trifluoressigsäureanhydrid (33 ml, 1,487 g/ml) wurden einem 250 ml Rundkolbenreaktor zugesetzt, der ausgestattet war mit mechanischem Rührer, Kühler und Heizmantel. Die dabei entstehende Lösung wurde gerührt zwischen etwa 25ºC und 30ºC etwa 10 Minuten lang.

Das zuvor hergestellte TFA/TFA Anhydridreagenz wurde 15 g (44,0 mMol) 17-Hydroxy-3- oxo-17α-pregn-4,6-dien-21-carbonsäure, γ-lacton zugesetzt (auch bekannt als Canrenon; G. D. Searle & Co.):

Das dabei entstehende Gemisch wurde erhitzt auf zwischen etwa 60 bis 70ºC etwa 1 bis 1,5 Stunden lang. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck bei 50ºC eingeengt unter Bildung einer dicken Schlemme. Die Schlemme wurde gelöst in 100 ml Ethylacetat und zweimal gewaschen mit etwa 20% Wasser/Kochsalzlösung (80 ml jeweils), einmal mit 1 N Natriumhydroxidlösung (80 ml), gefolgt durch einmal mit etwa 20% Wasser/Kochsalzlösung (80 ml).

Das Rohprodukt wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne unter vermindertem Druck bei 50ºC eingeengt unter Bildung von etwa 18 g des rohen nassen Materials.

Dieses Material wurde gereinigt durch zweimalige Säulenchromatographie unter Bildung von etwa 2,2 g reinem [13S,17β]-3',4'-Dihydro-17-methyl-cyclopenta[13,17]-18-norandrosta- 4,6,8(14)-trien-3,5'[2'H]-dion (Verbindung -204).

Beispiel X-2

Herstellung von:

Einer gerührten, kalten (0ºC) Lösung von 11α-Hydroxycanrenon (3,6 g, 10 mMol) und Triethylamin (1,2 g, 12 mMol) in Methylenchlorid (20 ml) wurde Methansulfonylchlorid (1,1 g, 10 mMol) zugesetzt. Dieses Gemisch wurde in der Kälte 3 Stunden lang gerührt und durfte sich auf Raumtemperatur erwärmen. Das Rühren wurde fortgesetzt bis Dünnschichtchromatographie anzeigte, dass die Reaktion beendet ist. Das Gemisch wurde dann verdünnt mit Ethylacetat und extrahiert mit Wasser, wässriger 5% Natriumbicarbonatlösung und Wasser und über Natriumsulfat getrocknet. Das Trockenmittel wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt unter Bildung des folgenden rohen Mesylats C-136, das für die Verwendung in der nächsten Stufe geeignet ist:

Eine Lösung von Mesylat C-136 (4,3 g, 10 mMol) wurde umgesetzt mit Trifluoressigsäure (25 ml), Trifluoressigsäureanhydrid (4,5 ml) und Kaliumacetat (6,7 g, 7,1 mMol) gemäß der für die Synthese von Verbindung C-1 in Beispiel X-1 beschriebenen Arbeitsweise. Das Rohprodukt wurde isoliert gemäß der gleichen Arbeitsweise wie für Verbindung C-1 in Beispiel X-1 und wurde gereinigt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Gemischen aus Ethylacetat und Toluol oder Ethylacetat und Hexan als Eluierunsmittel. Das so erhaltene Produkt wurde weiter gereinigt durch Umkristallisation aus Alkohol, Alkohol und Wasser oder Ethylacetat und Hexan unter Bildung von Tetraen C-105.

Beispiel X-3

Herstellung von

Mesylat C-138:

wurde synthetisiert und isoliert (gemäß der in Beispiel X-2 für die Synthese von Mesylat C-136 beschriebenen Arbeitsweise) unter Verwendung von 11α,17-Dihydroxy-3-oxo-17-oxo-pregn-4-en- 21-carbonsäure, γ-lacton (3,6 g, 10 mMol), Triethylamin (1,2 g, 12 Mol) und Methansulfonylchlorid (1,1 g, 10 mMol) in Methylenchlorid (20 ml). Das so isolierte Mesylat C-138 ist geeignet zur Verwendung in der folgenden Stufe.

Eine Lösung des Mesylats C-138 (4,4 g, 10 mMol) wurde umgesetzt mit Trifluoressigsäure (25 ml), Trifluoressigsäureanhydrid (4,5 ml) und Kaliumacetat (6,7 g, 7,1 mMol) gemäß der für die Synthese von Verbindung C-1 in Beispiel X-1 beschriebenen Arbeitsweise. Das Rohprodukt C-110 wurde isoliert gemäß dergleichen Arbeitsweise wie für Verbindung C-1 in Beispiel X-1 und gereinigt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Gemischen aus Ethylacetat und Toluol oder Ethylacetat und Hexan als Eluierungsmittel. Das so erhaltene Produkt wurde weiter gereinigt durch Umkristallisation aus Alkohol, Alkohol und Wasser oder Ethylacetat und Hexan.

Beispiel X-4 Herstellung von 3',4',5', 17-Tetrahydro-17β-methyl-3,5'-dioxocyclopenta[13R,17]-18-norandrosta- 4,8,14-trien-7α-carbonsäure (Verbindung C-101):

Eine Lösung von Verbindung C-1 (3,8 g, 10 mMol) und wässrige 1 N Natriumhydroxidlösung (35 ml) in Ethanol (60 ml) wurde 8 Stunden lang unter Rückfluß gehalten. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur gekühlt, auf dem Rotationsverdampfer im Vakuum eingeengt und die restliche wässrige Schicht wurde dreimal extrahiert mit Ethylacetat. Die wässrige Schicht wurde dann angesäuert mit 1 N Salzsäurelösung und dreimal extrahiert mit Ethylacetat. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Trockenmittel wurde abfiltriert und das Filtrat auf dem Rotationsverdampfer eingeengt. Die rückständige rohe Carbonsäure C-101 wurde kristallisiert durch Behandlung mit Ethylacetat und umkristallisiert aus Ethylacetat und Hexan oder Methanol oder Ethanol und Wasser.

Beispiel X-5 Herstellung von 1-Methylethyl 3',4',5',17-tetrahydro-17β-methyl-3,5'-dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α-carboxylat (Verbindung C-102):

Ein Gemisch aus Natriumbicarbonat (3,5 g) und einer Lösung der Carbonsäure C-101 (3,7 g, 10 mMol) und Isopropyliodid (3 ml) in Dimethylformamid (35 ml) wurde bei Raumtemperatur übernacht gerührt. Die Reaktion wurde auf Wasser gegosssen und die wässrige Lösung dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden gewaschen mit Wasser und über Natriumsulfat getrocknet. Das Trockenmittel wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der rückständige rohe Isopropylester C-102 wurde kristallisiert durch Behandlung mit Ethylacetat oder Alkohol und gereinigt durch Chromatographie an Silicagel und Umkristallisation aus Ethylacetat und Hexan oder Alkohol oder Alkohol und Wasser.

Beispiel X-6 Herstellung von Ethyl 3',4',5', 17-tetrahydro-17β-methyl-3,5'-dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α-carboxylat:

Ein Gemisch aus Natriumbicarbonat (3,5 g) und einer Lösung aus der Carbonsäure C-101 (3,7 g, 10 mMol) und Ethyliodid (3 ml) in Dimethylformamid (35 ml) wurde bei Raumtemperatur übernacht gerührt. Die Reaktion wurde auf Wasser gegossen und die wässrige Lösung dreimal extrahiert mit Ethylacetat. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Trockenmittel wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der rückständige Ethylester C-103 wurde kristallisiert durch Behandlung mit Ethylacetat oder Alkohol und gereinigt durch Chromatographie an Silicagel und Umkristallisation aus Ethylacetat und Hexan oder Alkohol oder Akohol und Wasser.

Beispiel X-7 Herstellung von Hexyl 3',4',5', 17-tetrahydro-17β-methyl-3,5'-dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-4,8,14-trien-7α-carboxylat (Verbindung C-104):

Ein Gemisch aus Natriumbicarbonat (3,5 g) und einer Lösung der Carbonsäure C-101 (3,7 g, 10 mMol) und n-Hexyliodid (3 ml) in Dimethylformamid (35 ml) wurde bei Raumtemperatur übernacht gerührt. Die Reaktion wurde auf Wasser gegossen und die wässrige Lösung dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Trockenmittel wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der rückständige rohe n-Hexylester C-104 wurde kristallisiert durch Behandlung mit Ethylacetat oder Alkohol und gereinigt durch Chromatographie an Silicagel und Umkristallisation aus Ethylacetat und Hexan oder Alkohol oder Alkohol und Wasser.

Beispiel X-8 Herstellung von 3',4'-Dihydro-17-methyl-7α(methylthio)-cyclopenta[13,17]-18-norandrosta-4,8,14- trien-3,5'(2'H)-dion (Verbindung C-106):

Eine Lösung aus Tetraen C-105 (3,2 g, 10 mMol) in Methanol (40 ml) und Piperidin (4 ml) wurde auf 5ºC gekühlt. Gasförmiges Methylmercaptan wurde hindurchgeführt, bis eine Gewichtszunahme von 7 g beobachtet wurde. Der Druckbehälter wurde versiegelt und 20 Stunden lang auf Raumtemperatur gehalten. Die Lösung wurde auf Eiswasser gegossen und der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Das Methylthioprodukt C-106 wurde gereinigt durch Umkristallisation aus Methanol oder Ethylacetat und Hexan. Siehe z. B. das Verfahren dargelegt in A. Karim und E. A. Brown, Steroids, 20, 41 (1972), welches hier durch Bezugnahme enthalten ist.

Beispiel X-9 Herstellung von 7α-(Acetylthio)-3,4'-dihydro-17-methyl-cyclopenta[13,17]-18-norandrosta-4,8,14- trien-3,5'(2'H)-dion (Verbindung C-107):

Eine Lösung von Tetraen C-105 (3,2 g, 10 mMol) in Thioessigsaüre (10 ml) wurde auf 85- 95ºC eine Stunde lang erhitzt. Überschüssige Thioessigsäure wurde im Vakuum entfernt und das dabei entstehende rohe 7α-Thioacetat C-107 gereinigt durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel wie Methanol oder Ethylacetat oder Ethylacetat und Hexan. Siehe z. B. das Verfähren dargelegt in U.S. Patent 3,013,012, J. A. Cella und R. C. Tweit, 12. Dezember 1961, welches hier durch Bezugnahme enthalten ist.

Beispiel X-10 Herstellung von 1,2,4bR(4bR*),5,5aS*,7,7aR*,8,9,11,12bs*-Dodecahydro-7a,12b-dimethyl-10aR*- cyclopropal[/]pentaleno[1,6a-a]phenanthren-3,10-dion und 1,2,4bS(4bR*),5,5aS*,8,9,11,12,12bR*-Dodecahydro-7a,12b-dimethyl-10aS*- cyclopropal[I]pentaleno[1,6a-a]phenanthren-3,10-dion (Verbindung C-109):

Einer Lösung von Trimethylsulfonoxoniumiodid (1 g, 4,6 mMol) in trockenem Dimethylsulfoxid (20 ml) wurde Natriumhydrid zugesetzt (220 mg einer 50% Dispersion in Mineralöl, 4,6 mMol). Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt bis die Wasserstoffentwicklung aufhörte. Eine Lösung von Tetraen C-105 (1,12 g, 3,5 mMol) in Dimethylsulfoxid (4 ml) wurde dann zugesetzt und das Rühren 4 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser verdünnt und der dabei entstehende Niederschlag abfiltriert und luftgetrocknet. Das Produkt war ein Gemisch aus 6β,7β (Verbindung C-108) und 6α,7α (Verbindung C-109) Isomeren. Trennung dieser Isomeren erfolgte durch Chromatographie an Silicagel und die einzelnen Isomeren wurden weiter gereinigt durch Umkristallisation aus Lösungsmitteln wie Ethylacetat und Hexan, Alkohol oder Alkohol und Wasser.

Beispiel X-11

Herstellung von:

Einer Suspension von Enon C-110 (3,2 g, 10 mMol) in Ethylorthoformiat (10 ml) und wasserfreiem Ethanol (10 ml) wurde p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,05 g) zugesetzt. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und abgeschreckt durch Zugabe einiger Tropfen Pyridin. Nach weiterem 5 minütigem Rühren bei 0ºC wurde der dabei entstehende Niederschlag abfiltriert, gewaschen mit einer geringen Menge Methanol und umkristallisiert aus Alkohol oder Ethylacetat und Hexan, enthaltend Spuren von Pyridin unter Bildung des reinen Enolethers C-111.

Wahlweise kann die Reaktion aufgearbeitet werden nach Zugabe von Pyridin durch Entfernung sämtlicher Lösungsmittel im Vakuum und Kristallisieren des Rückstandes durch Zugabe von Lösungsmitteln wie Eher, Ethylacetat oder Hexan. Das rohe C-111 wird wie oben umkristallisiert. Siehe z. B. das Verfahren dargelegt in R. M. Weier und L. M. Hofmann, J. Med. Chem., 20, 1304-1308 (1977), welches durch Bezugnahme hier enthalten ist.

Beispiel X-12

Herstellung von:

Siehe z. B. Verfahren von R. M. Weier und L. M. Hofmann, J. Med. Chem., 20, 1304-1308 (1977), welches durch Bezugnahme hier enthalten ist.

Ein Vilsmeyer Reagenz wurde hergestellt durch Zugabe von Phosphoroxychlorid (4,59 g, 30 mMol) zu Dimethylformamid (30 ml) bei ºC. Nach 5 Minuten wurde eine Lösung von Enolether C-11-1 (3,5 g, 10 mMol) in Dimethylformamid (5 ml) zugesetzt und die Reaktion bei 0ºC 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur übernacht gerührt. Die Reaktion wurde auf wässrige Natriumacetatlösung gegossen und 2 Stunden lang gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet unter Bildung von rohem Aldehyd C-112. Reinigung erfolgte durch Umkristallisation aus Lösungsmitteln wie Alkohol, Alkohol und Wasser oder Ethylacetat und Hexan. Wahlweise wird der rohe Aldehyd C-112 isoliert aus der wässrigen Natriumacetatlösung durch Extraktion mit einem Lösungmittel wie Ethylacetat. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Entfernung des Lösungsmittels wird der Rückstand gereinigt durch Umkristallisation oder durch Chromatographie über Silicagel, gefolgt durch Umkristallisation.

Beispiel X-13

Herstellung von:

Einer gerührten kalten Lösung von Lithium tri-tert-Butoxyaluminiumhydrid (3,05 g, 12 mMol) in Tetrahydrofuran wurde Aldehyd C-112 (3,78 g, 10 mMol) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt und abgeschreckt durch Zugabe von Wasser und Essigsäure, wobei man aufpassen mußte, das Gemisch schwach basisch zu halten. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt und der dabei entstehende Feststoff in Ethylacetat aufgeschlemmt. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde gelöst in einem minimalen Volumen einer Lösung aus Aceton und Wasser (3 : 1) und dem angesäuerten wässrigen Aceton (pH 1,5-2,0) zugesetzt. Das saure Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt und im Vakuum eingeengt. Das dabei entstehende rohe Dienon C-113 wurde gereinigt durch Umkristallisation aus Lösungsmitteln wie Alkohol, Alkohol und Wasser oder Ethylacetat und Hexan. Wahlweise wird das rohe Dienon C-113 gereinigt durch Chromatographie an Silicagel und dann umkristallisiert. Siehe z. B. das Verfahren dargelegt in R. M. Weier und L. M. Hofmann, J. Med. Chem., 20, 1304-1308 (1977), welches durch Bezugnahme hier enthalten ist.

Beispiel X-14 Herstellung von 2',3',3'aα,4',6',10',11',11'aα,12',13'-Decahydro-3'aR,3'a,11'a-dimethyl-13'aR*- spiro[cyclopropan-1,7'(9'H)-[1H]pentaleno[1,6a-a]phenanthren]-1'9'-dion:

Einer Lösung des Dienons C-113 (1,17 g, 0,05 mMol) in Tetrahydrofuran (30 ml) wurde eine Lösung von Diazomethan (0,2 g, 0,07 mMol) in Ether (7 ml) zugesetzt. Die dabei entstehende Reaktionslösung wurde mehrere Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt. Essigsäure wurde dann zugesetzt, um überschüssiges Diazomethan zu zerstören und die Lösung wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand, welcher das Zwischenprodukt Pyrazolin ist, wurde kristallisiert unter einem Lösungsmittel wie Aceton, Hexan, Ethylacetat oder Ethanol und wurde dann umkristallisiert. Dieses Material wurde umgewandelt zum Spirocyclopropan C-114. Somit wurde das feste C-114 bei 190ºC im Vakuum erhitzt und der dabei entstehende Feststoff wurde umkristallisiert aus Alkohol, Alkohol und Wasser, Aceton und Wasser oder Ethylacetat und Hexan. Wahlweise wird eine Lösung des Pyrazolins in Aceton behandelt mit Bortrifluoridetherat bei Raumtemperatur etwa eine Stunde lang. Wasser wird zugesetzt und der dabei entstehende Niederschlag wird filtriert und luftgetrocknet. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisation. Siehe z. B. das Verfahren dargelegt in F. B. Colton und R. T. Nicholson, U.S. Patent 3,499,891, 10. März 1970, welches durch Bezugnahme hier enthalten ist.

Beispiel X-15

Herstellung von:

Einer Lösung von Enolether C-111 (3,2 g, 10 mMol) in Methanol (20 ml) wurde Natriumborhydrid (38 mg) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt und mit 1 N Salzsäure 30 Minuten lang behandelt. Die Reaktion wurde weiter verdünnt mit Wasser und der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt, bestehend aus einem Gemisch aus zwei epimeren Alkoholen (Verbindung C-115 und Verbindung C-116), wurde an Silicagel chromatographiert, um eine Trennung zu bewirken. Die gereinigten Alkohole C-115 und C-116 wurden jeweils umkristallisiert aus Lösungsmitteln wie Alkohol, Alkohol und Wasser, Ethylacetat und Hexan und Acton und Hexan. Wahlweise kann das verdünnte Reaktionsgemisch extrahiert werden mit Ethylacetat, die vereinigten organischen Schichten über Natriumsulfat getrocknet und das Rohprodukt so isoliert wird chromatographiert wie vorstehend, um die getrennten Alkohole C-115 und C-116 zu erhalten.

Beispiel X-16

Herstellung von:

Verbindung C-1 (3,8 g, 10 mMol) wird umgewandelt zu Enolether C-117 unter Verwendung von Ethylorthoformiat (3,2 g, 10 mMol), Ethanol (10 ml) und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,05 g) gemäß dem Verfahren beschrieben für die Synthese von Verbindung C-111, dargelegt in Beispiel X- 11.

Beispiel X-17 Herstellung von Methyl 3',4',5',17-tetrahydro-6α-hydroxy-17β-methyl-3,5'-dioxocyclopenta[13R,17]- 18-norandrosta-4,8,14-trien-7α-carboxylat (Verbindung C-118):

Eine Lösung von 57% m-Chlorperoxybenzoesäure (3,64 g) in 10% wässrigem Dioxan (20 ml) wurde halb-neutralisiert mit 1 N Natriumhydroxidlösung. Diese Lösung wird auf 0ºC gekühlt und portionsweise einer gerührten kalten (0ºC) Lösung von Enolether C-117 (4,1 g, 10 mMol) in 10% wässrigem Dioxan (20 ml) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur übernacht gerührt, auf Eiswasser gegossen und mit Methylenchlorid oder Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet über Natriumsulfat. Verdampfen des Lösungsmittels lieferte den rohen Hydroxester C-118, der durch Chromatographie an Silicagel gereinigt wurde. Siehe beispielsweise das Verfahren dargelegt in R. M. Weier und L. M. Hofmann, J. Med. Chem., 20, 1304-1308 (1977), welches durch Bezugnahme hier enthalten ist.

Beispiel X-18

Herstellung von:

Lithiumdimethylcuprat wurde hergestellt durch Zugabe von Methyllithium (19 ml einer 1,6 M Lösung in Ether, 30 mMol) einer gerührten Suspension von Cuproiodid (2,86 g, 15 mMol) in Ether (30 ml) bei 0ºC unter einer inerten Argonatmosphäre. Nach Rühren in der Kälte 15 Minuten lang wurde eine Lösung von Tetraen C-105 (1,6 g, 15 mMol) in Tetrahydrofuran (25 ml) tropfenweise binnen 25 Minuten zugesetzt. Die Reaktion wurde weitere 30 Minuten lang fortgesetzt und auf gesättigte Ammoniumchloridlösung gegossen unter heftigem Rühren. Das wässrige Gemisch wurde extrahiert mit Ethylacetat oder Methylenchlorid. Die vereinigten organischen Schichten wurden gewaschen mit wässriger Ammoniumchloridlösung, Wasser und getrocknet über Natriumsulfat. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in Ethylacetat oder Methylenchlorid gelöst und mit p-Toluolsulfonsäure (100 mg) auf dem Dampfbad 30 Minuten bis 1 Stunde lang behandelt. Die organische Lösung wurde gewaschen mit Wasser und getrocknet über Natriumsulfat. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt unter Bildung des rohen Enons C-119. Reinigung erfolgte durch Umkristallisation aus Alkohol, Alkohol und Wasser oder Ethylacetat und Hexan. Wahlweise wird das rohe Enon C-119 chromatographiert an Silicagel und das Produkt dann umkristallisiert. Siehe z. B. das Verfahren dargelegt in J. K. Grunwell et al., Steroids, 27, 759-771 (1976), welches durch Bezugnahme hier enthalten ist.

Beispiel X-19

Herstellung von:

Ester C-120 (4,00 g, 10 mMol):

(hergestellt gemäß dem Verfahren dargelegt in R. M. Weier und L. M. Hofmann, J. Med. Chem., 18, 817 (1975), welches hier durch Bezugnahme enthalten ist wird umgesetzt mit Trifluoressigsäure (25 ml), Trifluoressigsäureanhydrid (4,5 ml) und Kaliumacetat (6,7 g, 7,1 mMol) gemäß dem für die Synthese von Verbindung C-1 in Beispiel X-1 beschriebenen Verfahren. Das Rohprodukt C-121 wird isoliert gemäß dem gleichen Verfahren wie für Verbindung C-1 in Beispiel X-1 und gereinigt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Gemischen von Ethylacetat und Toluol oder Ethylacetat und Hexan als Eluierungsmittel und das so erhaltene Produkt wird weiter gereinigt durch Umkristallisation aus Alkohol, Alkohol und Wasser oder Ethylacetat und Hexan.

Beispiel X-20

Herstellung von:

Enon C-122 (3,68 g, 10 mMol):

(hergestellt gemäß dem Verfahren dargelegt in F. B Colton und R. T. Nicholson, U.S. Patent 3,499,891, 10. März 1970, welches durch Bezugnahme hier enthalten ist) wird umgesetzt mit Kaliumacetat (6,7 g, 7,1 mMol), Trifluoressigsäure (25 ml) und Trifluoressigsäureanhydrid (4,5 ml) gemäß dem Verfahren beschrieben für die Synthese von Verbindung C-1 in Beispiel X-1. Das Rohprodukt wird isoliert wie beschrieben in der vorstehenden Druckschrift und wird gereinigt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Gemischen aus Ethylacetat und Hexan oder Ethylacetat und Toluol als Eluierungsmittel. Das gereinigte C-123 wird weiter gereinigt durch Umkristallisation aus Alkohol, Alkohol und Wasser oder Ethylacetat und Hexan.

Beispiel X-21

Herstellung von:

Verbindungen C-125 und C-126 werden synthetisiert gemäß dem vorstehenden Verfahren für die Synthese der Vebindungen C-108 und C-1. Somit wird eine Lösung von Trimethylsulfoxoniumiodid (1 g, 4,6 mMol) in trockenem Dimethylsulfoxid (20 ml) Natriumhydrid (220 mg einer 50% Dispersion in Mineralöl, 4,6 mMol) zugesetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt, bis die Wasserstoffentwicklung aufhört.

Eine Lösung von Trienon C-124 (1,1-4 g, 3,5 mMol):

in Dimethylsulfoxid (4 ml) wird dann zugesetzt und das Rühren 4 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre fortgesetzt. Trienon C-124 wird hergestellt gemäß dem Verfahren dargelegt im Beispiel X-2 für die Herstellung von Tetraen C-105 durch Verwendung von Canrenon als Ausgangsmaterial anstelle von 11α-Hydroxycanrenon. Das Reaktionsgemisch wird verdünnt mit Wasser und der dabei entstehende Niederschlag wird abfiltriert und luftgetrocknet. Das Produkt ist ein Gemisch aus dem 6β,7β (Verbindung C-125) und 6α,7α (Verbindung C-126) Isomeren. Trennung dieser Isomeren erfolgt durch Chromatographie an Silicagel und die einzelnen Isomeren werden weiter gereinigt durch Umkristallisation aus Lösungsmitteln wie Ethylacetat und Hexan, Alkohol oder Alkohol und Wasser.

Beispiel X-22 Herstellung von Methyl 3',4',5',17-tetrahydro-17β-methyl-3,5',dioxocyclopenta[13R,17]-18- norandrosta-1,4,8,14-tetraen-7α-carboxylat (Verbindung C-127):

Dienon C-127 wird synthetisiert gemäß dem Verfahren beschrieben in R. M. Weier und L. M. Hofmann, J. Med. Chem., 18, 817 (1975), welches durch Bezugnahme hier enthalten ist. Somit wird eine Lösung der Verbindung C-1 (3,8 g, 10 mMol) und Dichlordicyanobenzochinon (2,72 g, 12 mMol) in Dioxan (80 ml) unter Rückfluß gehalten unter Rühren 24 Stunden lang. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand digestiert mit Methylenchlorid, filtriert und das Filtrat gewaschen mit einer 2% Natriumsulfitlösung, 5% Natriumhydroxidlösung und gesättigter Natriumchloridlösung und getrocknet über Natriumsulfat. Das Trockenmittel wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt Dienon C-127 wird gereinigt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Gemischen aus Ethylacetat und Toluol als Eluierungsmittel und das so isolierte Produkt 27 wird weiter gereinigt durch Umkristallisation aus Alkohol.

Beispiel X-25 Herstellung von 2',3',3'aα,4',6'11'aα,12',13'-Octahydro-3'aR,3'a,11'a-dimethyl-13'aR* -spiro[cyclopropan-1,7'(9'H)-[1H]pentaleno,[1,6a-a]phenanthren]1'9'-dion (Verbindung C-128):

Unter Anwendung des Verfahrens und der Aufarbeitung wie vorstehend beschrieben in Beispiel X-22 für die Synthese von Dienon C-127, wird Enon C-114 (3,48 g, 10 mMol) umgewandelt in das Dienon C-128 unter Verwendung von Dichlordicyanobenzochinon (2,72 g, 12 mMol) in Dioxan (80 ml).

Beispiel X-24 Herstellung von 4bR(4bR*),5,5aS*,7,7aR*,8,9,11,12,12bS*-Decahydro-7A,12b-dimethyl-10R* -cyclopropa(/)pentaleno [1,6a-a]phenanthren-3,10-dion (Verbindung C-129):

Unter Anwendung des Verfahrens und der Aufarbeitung vorstehend beschrieben in Beispiel X-22 für die Synthese von Dienon C-127 wird Enon C-108 (3,34 g, 10 mMol) umgewandelt in das Dienon C-129 unter Verwendung von Dichlordicyanobenzochinon (2,72 g, 12 mMol) in Dioxan (80 ml).

Beispiel X-25

Herstellung von:

Einer kalten (0ºC) gerührten Lösung von Carbonsäure C-101 (3,66 g, 10 mMol) und N- Methylmorpholin (1,01 g, 10 mMol) in Tetrahydrofuran (35 ml) wird Isobutylchlorformiat (1,36 g, 10 mMol) zugesetzt. Die Reaktion wird bei 0ºC 20 Minuten lang gerührt, filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand ist ein gemischtes Anhydrid und eignet sich zur Verwendung in der nächsten Stufe.

Gasförmiges Dimethylamin wird durch eine kalte (0ºC) Lösung des gemischten Anhydrids (4,6 g, 10 mMol) in Tetrahydrofuran (40 ml) in einem Druckgefäß geblasen. Nach 15 Minuten wird das Druckgefäß versiegelt und die Reaktion kann 24 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen. Die Reaktion wird auf 40ºC 30 Minuten lang erwärmt und wieder auf 0ºC gekühlt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wird der Kessel abgelassen in die Atmosphäre und überschüssiges Dimethylamin darf verdampfen. Die Reaktion wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand gelöst in Ethylacetat und extrahiert mit 1 N Natriumhydroxidlösung und Wasser. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird die organische Schicht abgestreift und der Rückstand gereinigt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Gemischen aus Ethylacetat und Toluol als Eluierungsmittel. Das so isolierte Amid C-130 wird weiter gereinigt durch Umkristallisation aus Alkohol, Alkohol und Wasser oder Ethylacetat und Hexan.

Beispiel X-26

Herstellung von:

Einer Suspension von Enon C-114 (3,5 g, 10 mMol) in Ethylorthoformiat (10 ml) und wasserfreiem Ethanol (10 ml) wird p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,05 g) zugesetzt. Die Reaktion wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und wird durch Zugabe einiger Tropfen Pyridin abgeschreckt. Nach weiterem 5 minütigem Rühren bei 0ºC wird der dabei entstehende Niederschlag filtriert, gewaschen mit einer geringen Menge Methanol und umkristallisiert aus Alkohol oder Ethylacetat und Hexan, enthaltend Spuren von Pyridin, um reinen Enolether C-131 zu liefern.

Wahlweise kann die Reaktion aufgearbeitet werden nach Zugabe des Pyridins durch Entfernung aller Lösungsmittel im Vakuum und Auskristallisieren des Rückstandes durch Zugabe von Lösungsmitteln wie Hexan, Ether, Ethylacetat oder Hexan. Der rohe Enolether C-131 wird wie vorstehend umkristallisiert.

Beispiel X-27

Herstellung von:

Einer kalten (-78ºC) Lösung von Lithium bis (trimethylsilyl)amid (10 ml einer 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran) wird eine Lösung von Enolether C-131 (3,8 g, 10 mMol) in Tetrahydrofuran (20 ml) tropfenweise binnen 20 Minuten zugesetzt. Die Reaktion wird bei -78ºC 10 Minuten lang gerührt und eine Lösung von Phenylselenenylchlorid (1,9 g, 10 mMol) in Tetrahydrofuran (5 ml) wird zugesetzt. Die Reaktion wird 5 Minuten lang gerührt und abgeschreckt durch die Zugabe von 1% Natriumbisulfatlösung. Die Reaktion wird weiter verdünnt mit Wasser und extrahiert mit Ethylacetat. Die vereinigten organischen Schichten werden gewaschen mit 5% wässriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser und über Natriumsulfat getrocknet. Das Trockenmittel wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird gereinigt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Gemischen aus Ethylacetat und Toluol oder Ethylacetat und Hexan als Eluierungsmittel unter Bildung von reinem Selenid C-132.

Beispiel X-28

Herstellung von:

Einer kalten (0ºC) Lösung des Selenids C-132 (g, 10 mMol) und Pyridin (1,61 ml, 20 mMol) in Methylenchlorid (40 ml) wird nach und nach eine Lösung aus Wasserstoffperoxid (3,1 g einer 30% Lösung, 27 mMol) in Wasser (3 ml) zugesetzt. Die Temperatur wird auf unter 30-35ºC gehalten. Nachdem jegliche Exothermizitäten abklangen, wurde das Eisbad entfernt und die Reaktion kräftig bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt. Die Reaktion wurde verdünnt mit Methylenchlorid und gewaschen mit 5% Natriumbicarbonatlösung und Wasser und getrocknet über Natriumsulfat. Das Trockenmittel wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde gereinigt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Gemischen aus Ethylacetat und Toluol oder Ethylacetat und Hexan als Eluierungsmittel unter Bildung des reinen ungesättigten Ketons C-133, das weiter gereinigt wird durch Umkristallisation aus Ethylacetat und Hexan oder Alkohol.

Beispiel X-29

Herstellung von

Eine Lösung von Keton C-133 (2 g) in Aceton (15 ml) wird behandelt mit 1 N Salzsäure (4 ml) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Die Reaktion wird eingeengt im Vakuum. Der Rückstand wird verdünnt mit Wasser und extrahiert mit Ethylacetat. Die vereinigten organischen Schichten werden gewaschen mit 5% Natriumbicarbonatlösung und Wasser und getrocknet über Natriumsulfat. Das Trockenmittel wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt unter Bildung von rohem Keton C-134. Das Rohprodukt wird gereinigt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Gemischen aus Ethylacetat und Toluol als Eluierungsmittel unter Bildung von reinem Keton C-134, das weiter gereinigt wird durch Umkristallisation aus Ethylacetat und Hexan oder Alkohol.


Anspruch[de]

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines 3-Keto-7α-alkoxycarbonyl substituierten Δ-4,5- Steroids, umfassend die Umsetzung eines Alkylierungsmittels mit einem 4,5-Dihydro-5,7- lactonsteroidsubstrat in Gegenwart einer Base, wobei dieses Lactonsubstrat substituiert ist mit Keto oder Dialkoxy am 3-Kohlenstoff und weiterhin umfassend die Gruppe:

worin C(5) das 5-Kohlenstoff und C(7) das 7-Kohlenstoff der Steroidstruktur des Substrats bedeutet.

2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin dieses Steroidsubstrat eine gesättigte oder ungesättigte Nuclearstruktur enthält, weiterhin umfassend:

Eine 9,11-Epoxidgruppe oder Vorläufer davon und einen Substituenten am 17-Kohlenstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Spirolacton, Keto oder anderem Vorläufer des Spirolactons.

3. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, worin dieses Steroidsubstrat und dieses Steroidprodukt substituiert sind an der 17-Position mit einem Spirolactonsubstituenten entsprechend der Formel XXXIII

4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin dieses Steroidsubstrat und Steroidprodukt substituiert sind an der 17-Position mit einem Ketosubstituenten.

5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin dieses Lactonsubstrat 3-Dialkoxysubstituenten umfaßt.

6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin dieses 5,7-Lacton umgesetzt wird mit einem Alkylhalogenid in Gegenwart einer Base.

7. Ein Verfahren zur Herstellung einer 4,5-Dihydro-5,7-lactonsteroidverbindung, wobei dieses Lactonsteroid substituiert ist mit Keto oder Dialkoxy am 3-Kohlenstoff und umfaßt die Gruppe

worin C(5) das 5-Kohlenstoff bedeutet und C(7) das 7-Kohlenstoff der Steroidstruktur der Lactonverbindung bedeutet,

wobei das Verfahren umfaßt:

Umwandlung eines 7-Cyano substituierten Steroids zur 7-Carbonsäure und danach Umwandlung der 7-Carbonsäure in das 5,7-Lacton.

8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das Substrat ein 3-Keto-Δ-4,5-7- carboxysteroid umfaßt und sich ein Ketalzwischenprodukt bildet, umfassend ein 3-Dialkoxy-5,7- lacton, wobei dieses 3-Dialkoxy-5,7-lacton hydrolysiert wird unter sauren Bedingungen unter Bildung des 3-Keto-5,7-lactons.

9. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 11:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R¹ einen alpha-orientierten Niederalkoxycarbonyl oder Hydroxycarbonylrest bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet und

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden, die an den pentacyclischen D-Ring kondensiert sind;

wobei das Verfahren umfaßt:

Alkylieren einer Verbindung der Formel EI durch Hydrolyse, gefolgt durch Reaktion mit einem Alkylierungsmittel in Gegenwart einer Base, wobei die Verbindung der Formel EI die Struktur hat:

worin -A-A-, R³, R&sup8;, R&sup9; und -B-B- vorstehende bedeutung haben und R¹&sup7; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist.

10. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel IIC:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R¹ einen alpha-orientierten Niederalkoxycarbonyl- oder Hydroxycarbonylrest bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

wobei das Verfahren umfaßt:

Alkylieren einer Verbindung der Formel E durch Hydrolyse, gefolgt durch Umsetzung mit einem Alkylierungsmittel in Gegenwart einer Base, wobei die Verbindung der Formel E die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben und R¹&sup7; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl bedeutet.

11. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel E

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

R¹&sup7; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl und Cyano und Aryloxy;

wobei das Verfahren umfaßt:

Thermische Zersetzung einer Verbindung entsprechend der Formel DE2 in Gegenwart eines Alkalimetallhalogenids, wobei die Verbindung der Formel DE2 die Struktur hat:

worin R¹² C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und -A-A-, -B-B-, R³ und R¹&sup7; vorstehende Bedeutung haben.

12. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel DE2:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

R¹² und R¹&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus C&sub1; bis C&sub4; Alkyl und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

wobei das Verfahren umfaßt:

Kondensieren einer Verbindung der Formel DE1 mit einem Dialkylmalonat in Gegenwart einer Base, wobei diese Verbindung der Formel DE1 die Struktur hat:

worin -A-A-, -B-B-, R³ und R¹&sup7; vorstehende Bedeutung haben.

13. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel DE1:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

R¹&sup7; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

wobei das Verfahren umfaßt:

Umsetzung einer Verbindung der Formel D mit einem Sulfoniumylid in Gegenwart einer Base, wobei diese Verbindung der Formel D die Struktur hat:

worin -A-A-, -B-B-, R³ und R¹&sup7; vorstehende Bedeutung haben.

14. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel D:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

R¹&sup7; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe bedeutet:

bedeutet

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

wobei das Verfahren umfaßt:

Hydrolyse einer Verbindung der Formel C zur 7α-Carbonsäure und Reaktion unter sauren Bedingungen mit einem Trialkylorthoformiat, wobei die Verbindung der Formel C die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben.

15. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel I

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

R²&sup6; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus R&sup8; bzw. R&sup9; oder R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen ein Keto bilden;

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; umfassenzusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; umfassen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur, kondensiert an den pentacyclischen D-Ring;

wobei das Verfahren umfaßt:

Alkylieren einer Verbindung der Formel A211 durch Umsetzung mit einem Alkylierungsmittel in Gegenwart einer Base, wobei die Verbindung der Formel A211 die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; vorstehende Bedeutung haben.

16. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel IE:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy und

R²&sup6; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

wobei das Verfahren umfaßt:

Alkylieren einer Verbindung der Formel 211 durch Umsetzung mit einem Alkylierungsmittel in Gegenwart einer Base, wobei die Verbindung der Formel 211 die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B- und R³ vorstehende Bedeutung haben.

17. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 211:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus R&sup8; bzw. R&sup9; oder R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen ein Keto bilden;

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden, die an den pentacyclischen D-Ring kondensiert sind;

wobei das Verfahren umfaßt:

Oxidation einer Verbindung der Formel A210, wobei diese Verbindung der Formel A210 die Struktur aufweist

worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; vorstehende Bedeutung haben.

18. Ein Verfahren gemäß Anspruch 17, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen mit C(17) umfassen

worin X zwei Wasserstoffatome, Oxo oder =S bedeutet;

Y&sup4; und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeuten oder

Y¹ Hydroxy bedeutet und

Y² Hydroxy, Niederalkoxy bedeutet oder wenn X H&sub2; ist auch Niederalkanoyloxy.

19. Ein Verfahren gemäß Anspruch 18, worin R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen mit (C17) umfassen

20. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel A211:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden, die an den pentacyclischen D-Ring kondensiert sind;

wobei das Verfahren umfaßt:

Umsetzung eines 3-Keto-5,7-hemiacetalzwischenproduktes der Formel A209C mit einem Peroxidoxidationsmittel, wobei diese Verbindung der Formel A209C der Formel

entspricht, worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; vorstehende Bedeutung haben.

21. Ein Verfahren gemäß Anspruch 20, worin R&sup8; und R&sup9; zusammen mit C(17) umfassen

worin X zwei Wasserstoffatome, Oxo oder =S bedeutet;

Y¹ und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeuten oder

Y¹ Hydroxy bedeutet und

Y² Hydroxy, Niederalkoxy bedeutet oder wenn X H&sub2; bedeutet auch Niederalkanoyloxy.

22. Ein Verfahren gemäß Anspruch 21, worin R&sup8; und R&sup9; zusammen mit C(17)

umfassen.

23. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hab, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus R&sup8; bzw. R&sup9; oder R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen Keto bilden;

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden, die an den pentacyclischen D-Ring kondensiert sind;

wobei das Verfahren umfaßt:

Umsetzung eines 3-Keto-5,7-hemiacetalzwischenproduktes der Formel A209C mit einem Peroxidoxidationsmittel, wobei diese Verbindung der Formel A209C der Formel

entspricht, worin -A-A-, -B-B-, R³, R&sup8; und R&sup9; vorstehende Bedeutung haben.

24. Ein Verfahren gemäß Anspruch 23, worin R&sup8; und R&sup9; zusammen mit C(17)

umfassen,

worin X zwei Wasserstoffatome, Oxo oder =S bedeutet;

Y¹ und Y² zusammen die Sauerstoffbrücke -O- bedeuten oder

Y¹ Hydroxy bedeutet und

Y² Hydroxy, Niederalkoxy bedeutet oder wenn X H&sub2; bedeutet auch Niederalkanoyloxy bedeutet.

25. Ein Verfahren gemäß Anspruch 24, worin R&sup8; und R&sup9; zusammen mit C(17)

umfassen.

26. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel A209:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet;

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus R&sup8; bzw. R&sup9; oder R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen ein Keto bilden;

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy; Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden, die an den pentacyclischen D-Ring kondensiert sind;

und -E-E- ausgewählt ist aus

worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl;

wobei das Verfahren umfaßt:

Hydrolysieren einer Verbindung entsprechend der Formel A208

worin -A-A-, -B-B-, -E-E-, R³, R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; vorstehende Bedeutung haben, R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist oder die R&sub1;&sub9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden und R²&sup0; C&sub1;-C&sub4;-Alkyl ist.

27. Ein Verfahren zur Herstelllung einer Verbindung entsprechend der Formel A205:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy

R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden und

R²&sup0; C&sub1;-C&sub4; Alkyl ist und

worin -E-E- ausgewählt ist aus

worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano; R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl;

wobei das Verfahren umfaßt:

Umsetzung einer Verbindung entsprechend der Formel A204 mit einem niederen Alkohol und einer Säure, wobei die Verbindung der Formel A204 die Struktur aufweist

worin -A-A-, -B-B-, -E-E-, R³ und R¹&sup9; vorstehende Bedeutung haben.

28. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel A204

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden;

worin -E-E- ausgewählt ist aus

worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl;

wobei das Verfahren umfaßt:

Hydrolysieren einer Verbindung der Formel A203 in Gegenwart eines Alkohols der Formel R²&sup0;OH, wobei die Verbindung der Formel A203 die Struktur aufweist

worin -A-A-, -B-B-, -E-E-, und R³ vorstehende Bedeutung haben und R¹&sup8; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist oder die R¹&sup8;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden.

29. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel A204

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden und

worin -E-E- ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl;

wobei das Verfahren umfaßt:

Schützen der Ketosubstituenten einer Verbindung entsprechend der Formel A201 durch Umsetzung mit Alkanol unter sauren Bedingungen in Gegenwart von Orthoformiat, wobei die Verbindung der Formel A201 die Struktur aufweist:

worin -A-A-, -B-B-, -E-E- und R³ vorstehende Bedeutung haben, wobei ein 3-Enoletherzwischenprodukt erzeugt wird entsprechend der Formel A202

worin -A-A-, -B-B-, -E-E- und R³ vorstehende Bedeutung haben und R¹&sup8; ein C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup8;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden und Reduzieren dieser Verbindung der Formel A202 unter Bildung einer Verbindung entsprechend der Formel A203

worin -A-A-, -B-B-, -E-E-, R³ und R¹&sup8; vorstehende Bedeutung haben und Hydrolysieren dieser Verbindung entsprechend der Formel A203 in Gegenwart eines Alkohols mit der Formel R²&sup0;OH wodurch diese Verbindung der Formel A204 erzeugt wird.

30. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung entsprechend der Formel

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

worin -E-E- ausgewählt ist aus

worin R¹&sup8; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist oder die R¹&sup8;O- Gruppen am C-17 zusammen eine O,O- Oxyalkylenbrücke bilden; R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl;

wobei das Verfahren umfaßt:

Reduzieren einer Verbindung entsprechend der Formel A202:

worin -A-A-, -B-B-, -E-E-, R³ und R¹&sup8; vorstehende Bedeutung haben.

31. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 30, worin R³ Wasserstoff ist, -A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5; und -B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- bedeutet.

32. Ein Verfahren gemäß Anspruch 31, worin R&sup4;, R&sup5;, R&sup5; und R&sup7; jeweils Wasserstoff sind.

33. Eine Verbindung gemäß der Formel D:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

R¹&sup7; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy.

34. Eine Verbindung entsprechend der Formel E:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

R¹&sup7; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy.

35. Eine Verbindung entsprechend der Formel F:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5; oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus. Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy.

36. Eine Verbindung entsprechend der Formel A211:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy.

R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus R&sup8; bzw. R&sup9; oder R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen ein Keto bilden und

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden, die an den pentacyclischen D-Ring kondensiert sind.

37. Eine Verbindung entsprechend der Formel A210:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy und

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus R&sup8; bzw. R&sup9; oder R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen ein Keto bilden und

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden, die an den pentacyclischen D-Ring kondensiert sind.

38. Eine Verbindung gemäß der Formel A209:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und aus der Gruppe bestehend aus

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus R&sup8; bzw. R&sup9; oder R&sup8;&sup0; und R&sup9;&sup0; zusammen ein Keto bilden;

R&sup8; und R&sup9; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxycarbonylalkyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy oder R&sup8; und R&sup9; zusammen eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden oder R&sup8; oder R&sup9; zusammen mit R&sup6; oder R&sup7; eine carbocyclische oder heterocyclische Ringstruktur bilden, die an den pentacyclischen D-Ring kondensiert sind und

-E-E- ausgewählt ist aus

worin R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl.

39. Eine Verbindung entsprechend der Formel A208:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R²&sup0; C&sub1;-C&sub4;-Alkyl ist und

-E-E- ausgewählt ist aus:

worin R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden;

R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl.

40. Eine Verbindung gemäß Formel A207:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R²&sup0; C&sub1;-C&sub4;-Alkyl ist und

-E-E- ausgewählt ist aus:

worin R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden;

R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl und

R²&sup5; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist.

41. Eine Verbindung gemäß der Formel A206:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy;

R²&sup0; C&sub1;-C&sub4;-Alkyl ist und

-E-E- ausgewählt ist aus:

worin R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden;

R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl.

42. Eine Verbindung gemäß der Formel A205:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

R²&sup0; ausgewählt ist aus C&sub1;-C&sub4; Alkyl und

-E-E- ausgewählt ist aus:

worin R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup9;O- Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden;

R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl.

43. Eine Verbindung gemäß der Formel A204:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

-E-E- ausgewählt ist aus:

worin R¹&sup9; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl oder die R¹&sup9;O-Gruppen zusammen eine O,O-Oxyalkylenbrücke bilden;

R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl.

44. Eine Verbindung gemäß der Formel A203:

worin

-A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;- oder -CR&sup4;=CR&sup5;- bedeutet;

R³, R&sup4;, R&sup5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Cyano und Aryloxy;

-B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- oder eine alpha- oder beta-orientierte Gruppe:

bedeutet,

worin R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halo, Niederalkoxy, Acyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Alkyl, Alkoxycarbonyl, Acyloxyalkyl, Cyano und Aryloxy und

-E-E- ausgewählt ist aus:

worin R¹&sup8; C&sub1; bis C&sub4; Alkyl ist oder die R¹&sup8;O- Gruppen am C-17 zusammen eine O,O- Oxyalkylenbrücke bilden;

R²¹, R²² und R²³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Halo, Nitro und Cyano und R²&sup4; ausgewählt ist aus Wasserstoff und Niederalkyl.

45. Eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 44, worin R³ Wasserstoff ist, - A-A- die Gruppe -CHR&sup4;-CHR&sup5;-, -B-B- die Gruppe -CHR&sup6;-CHR&sup7;- bedeutet und R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; jeweils Wasserstoff sind;

46. Eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 38 bis 44, worin R³ Wasserstoff ist, - A-A- die Gruppe -CH&sub2;-CH&sub2;- bedeutet, -B-B- die Gruppe -CH&sub2;-CH&sub2;- bedeutet und -E-E- ausgewählt ist aus

worin R²¹ Wasserstoff ist.

47. Eine Verbindung gemäß einer der Ansprüche 38 bis 44, worin R³ Wasserstoff ist, -A-A die Gruppe -CH&sub2;-CH&sub2; bedeutet, -B-B- die Gruppe -CH&sub2;-CH&sub2;- bedeutet und -E-E-

bedeutet, worin R²¹ Wasserstoff ist.







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