PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69232535T4 11.09.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0605428
Titel IN LANGZEITKULTUR GEHALTENE HORMON-ABSONDERNDE PANKREATISCHE ZELLEN
Anmelder hCell Technology, Inc., Reno, NV, US
Erfinder BROTHERS, Janice, Ann, Incline Village, US
Vertreter v. Füner Ebbinghaus Finck Hano, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69232535
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, MC, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.06.1992
EP-Aktenzeichen 929141620
WO-Anmeldetag 23.06.1992
PCT-Aktenzeichen PCT/US92/05267
WO-Veröffentlichungsnummer 0009300441
WO-Veröffentlichungsdatum 07.01.1993
EP-Offenlegungsdatum 13.07.1994
EP date of grant 03.04.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.09.2003
IPC-Hauptklasse C12P 21/02
IPC-Nebenklasse C12N 5/08   C07K 14/605   C07K 14/62   G01N 33/50   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft zur Langzeitproliferation befähigte in vitro-Kulturen hormonsezernierender Pankreaszellen und Verfahren zur Etablierung, Aufrechterhaltung und Vermehrung hormonsezernierender Zellen in Kultur.

Stand der Technik

Hormonsezernierende Zellen sind hochdifferenziert und auf die Synthese und Sekretion gewöhnlich eines oder zweier spezifischer Hormone spezialisiert. Beispiele für hormonsezernierende Zellen sind bestimmte Zellen der Hypophyse, des Endometriums, des Ovars und des Pankreas. Die Hypophyse enthält Gellen, die auf die Synthese und Sekretion von Glycoproteinhormone, bekannt als Gonadotropine, follikelstimulierendes Hormon (FSH) und Luteinisierungshormone (LH), die auf die Gonaden einwirken, spezialisiert. Die von der Hypophyse sezernierten Gonadotropine gelangen über den Blutstrom in die Gonaden, wo sie dann ihre Wirkung ausüben. Innerhalb des Ovars differenzieren sich dann nach der Stimulierung durch die Gonadotropine die ein Ei umgebenden Granulosezellen innerhalb des präovulatorischen Follikels, um Östrogen und Progesteron zu synthetisieren und zu sezernieren. Spezialisierte Zellen des Endometriums synthetisieren und sezernieren ebenfalls Östrogen und Progesteron. In der Pankreas reagieren die β-Zellen der Langerhans'-Inseln auf erhöhte Blutglucosekonzentration mit einem Anstieg der Insulinsekretion.

Die übliche Zellkulturtechnik ist für die Vermehrung bestimmter Zelltypen in vitro wie Fibroblasten aus normalem Gewebe oder aus Tumoren durchaus ausreichend. Es ist andererseits schon lange das Ziel von Wissenschaftlern, hormonsezerniedernde Zelltypen aufrechtzuerhalten, allerdings fördern die Standardkulturbedingungen nicht deren Überleben bzw. die Proliferation hormonsezernierender Zellen über längere Zeit. Aus praktischen Erwägungen wäre es daher wünschenswert, Zellen in Kultur zu etablieren, die sowohl proliferieren als auch ihre spezialisierten Funktionen ausüben, d. h. die Synthese und Sekretion sperzifischer Hormone.

Für primäre Gewebekulturen werden normale Zellen oder Tumorzellen einem tierischen oder menschlichen Zellspender entnommen, in ein flüssiges chemisches Medium auf Petrischalen für die Laborkultur ausgebracht und in einem Inkubator unter physikalischen Bedingungen gehalten, welche die Umgebung der Zellen in vivo simulieren. Die Bedingungen des Mediums und des Inkubators gewährleisten eine genau eingestellte Temperatur, pH, Nährstoffe, Wachstumsfaktoren, Schutz vor Krankheitserregern und in manchen Fällen auch das erforderliche Substrat für die Anheftung der Zellen. Selbst unter optimalen Kulturbedingungen überleben die meisten Typen normaler Zellen in Kultur nur eine beschränkte Zeit. Werden andere Zellen als Fibroblasten in der primären Gewebekultur etabliert, vermehren sich diese gewöhnlich nicht. Sie üben ihre differenzierten Funktionen, wenn überhaupt, nur eine kürzere Zeitspanne aus. Erreichen die Zellen ihr natürliches Lebensende, sterben sie ab, weshalb die Kulturen selbstbegrenzend sind. Hormonsezernierende Zellen überleben in Kultur im allgemeinen nur höchstens 8 bis 12 Tage, während der sie nur wenige oder überhaupt keine Zellteilungszyklen durchmachen. Während der Lebenszeit der hormonsezernierenden Zellen in Kultur büßen diese bei Aufrechterhaltung mit den bekannten Techniken gewöhnlich an Funktion ein, was in einer Verminderung der Hormonproduktion zum Ausdruck kommt.

Zur Steigerung der Lebenszeit der hormonsezernierenden Zellen in Kultur bedienen sich die bisher veröffentlichten Techniken embryonaler Zellen. Die Strategie, mit embryonalen Zellen zu beginnen, beruht auf der Tatsache, dass diese im Vergleich mit adulten Zellen relativ wenig differenziert sind, weshalb angenommen werden kann, dass sie vor ihrer endgültigen Ausdifferenzierung, d. h. Spezialisierung auf Hormonsynthese, mehrere Zellteilungszyklen durchmachen. Es ist ein Axiom der Biologie, dass sich undifferenzierte Zellen rascher vermehren als differenzierte. Man nimmt im allgemeinen an, dass eine Zelle mit der Zeit den erforderlichen intrazellulären Mechanismus für die Hormonsynthese und -sekretion entwickelt und daher nicht länger zu einer raschen Teilung, wenn überhaupt, befähigt ist.

Eine weitere Strategie der Etablierung von Zellen in Kultur besteht darin, dass man mit Krebszellen beginnt, da man von ihnen ein höheres Vermehrungspotential erwartet. Einige aus Tumoren und anderen karzinomatösen Läsionen gewonnene Zellen können jedoch in Kultur etabliert werden und sich dort teilen. Es wurden aus einem malignen menschlichen Choriokarzinom durch Vermehrung von Tumorzellen über 304 Serientransplantationen auf Hamsterbackentaschen während eines Zeitraums von 8 Jahren vor der Etablierung in vitro (BeWo cell line; ATCC CCL 98; Mai 1990, Ergänzung zum Zelllinien-Katalog von 1988 der American Tissue Culture Collection [ATCC]) eine Zelllinie etabliert. Von der Zelllinie BeWo wurde beschrieben, dass sie menschliches Choriongonadotropin (hCG), Polypeptidhormone, menschliches Plazentalactogen (hPL), Östrogene und Progestine produzieren. Eine Zelllinie mit einem abnormen Karyotyp wurde aus den malignen Ascites einer Patientin mit Adenokarzinom des Ovars etabliert (NIH: OVCAR-3; ATCC HTB 161; ibid.). Von der Zelllinie OVCAR-3 wurde beschrieben, dass sie Androgen- und Östrogen-Rezeptoren besitzt, allerdings ist von einer Synthese von Hormonen durch diese Zellen nicht die Rede.

Eine klonale β-Zelllinie von Ratten (RIN) wurde in Kultur aus einem Ratten-Insulinom etabliert (Clark, S. A. et al., 1980, Endocrinology 127: 2779-2788) etabliert. Die RIN-Zellen sollen gemäß dieser Druckschrift Insulin in vitro in Reaktion auf niedrige Glucosekonzentrationen sezernieren, wobei die maximale Reaktion bei 0,6 mM Glucose eintritt. Diese Reaktion ist mit der von unreifen β-Zellen von Ratten vergleichbar, jedoch völlig unterschiedlich von der von normalen reifen Langerhans'- Inseln von Ratten, die in Reaktion auf Glucosekonzentrationen in einem Bereich von 5 bis 16 mM sezernieren.

Aus dem oben Gesagten geht hervor, dass Tumorzellen nur schwer in vitro zu etablieren sind. Außerdem besitzen Tumorzellen, die sich dennoch in Kultur etablieren lassen, häufig abnorme Eigenschaften, welche ihre Verwendbarkeit beeinträchtigen. Dazu zählen der Verlust an Veränderung der Hormonsynthese bzw. das Reaktionsvermögen auf Secretogogue.

Unter Einsatz der Strategie, ausgehend von der Beobachtung, dass abnorme Zellen eher in vitro wachsen, wurden normale Zellen in Kultur mit verschiedenen Mitteln, unter anderem mit UV-Licht, chemischen Karzinogenen und durch Zufuhr von Onkogenen umgewandelt. Granulosazellen von Ratten wurden durch Cotransfektion mit dem gesamten SV 40-Genom und dem aktivierten Ha-ras-Gen umgewandelt (Baum, G. et al., 1990, Develop Biol. 112, 115-128). Diese Zellen sollen wenigstens einige differenzierte Eigenschaften beibehalten, d. h. sie wären zur Synthese von Steroiden in Reaktion auf cAMP befähigt.

Andere in Kultur etablierte Zelllinien sind UMR-Zellen, die von normalen Langerhans'-Inseln von neonatalen Ratten abgeleitet sind (NG, K. W. et al., 1987, Endocrinol. 113: 8-10) sowie HIT- Zellen, die durch Infektion von Langerhäns'-Inseln von Hamstern mit Affen-Virus-40 abgeleitet sind (Santerre, R. F. et al., 1981, PNAS 78: 4339-4343). Die sekretorische Insulinproduktion dieser Zelllinien ist jedoch gering und eine Reaktion auf Glucose geht bei Passage in der Kultur verloren.

Zur Begünstigung der Selektion nichttransformierter hormonsezernierender Zellen als Ausgangsmaterial für die Züchtung wurde vor der Entfernung der Zellen aus der Spenderin eine Hormonbehandlung in vivo durchgeführt (Amsterdam, A., et al., 1989, Endocrinology 124, 1956-1964). Aus ovarialen Follikeln, die Frauen entnommen worden waren, welche eine Hormontherapie als Vorbereitung auf die in vitro-Fertilisation erfahren hatten, wurden Zellen gewonnen. Für die zusätzliche Begünstigung der differenzierten Funktion wurden die Zellen auf einer extrazellulären Matrix gehalten und dann weiter mit menschlichem Choriongonadotropin (hCG) behandelt. Obwohl die Zellen differenziert waren und Progesteron in Kultur sezernierten, sollen die Zellen in Kultur lediglich fünf Tage überlebt haben. Bei einer ähnlichen Untersuchung sollen Zellen nur acht Tage überlebt haben (Pellicer, A. et al., 1990, Fertility and Sterility 54, 590-596).

Eine weitere Strategie zur Begünstigung der Aufrechterhaltung der Differenzierung in Kultur beruht auf der Züchtung der Komponententeile ganzer Follikel einschließlich von Oocyten und des Cumuluskomplexes (Vanderhyden, B. C. et al., 1990, Develop. Biol. 140, 307-317). Bei dieser Art von "Kombinationskultur" wurden Granulosazellen von Mäusen in einem differenzierten Zustand 7 Tage lang gehalten.

Die obige Beschreibung des Standes der Technik lässt erkennen, dass hier ein Bedarf an Verfahren zur Aufrechterhaltung und Vermehrung von hormonsezernierenden Zellen in Langzeitkulturen besteht. Derartige Kulturen könnten als biologische "Fabriken" für die Erzeugung therapeutisch wertvoller Hormone verwendet werden. Gut etablierte Linien von hormonsezernierenden Zellen würden außerdem die Möglichkeit von in vitro-Biotests auf der Basis von Zellreaktionen auf Arzneimittel wie Gonadotropinpräparate bieten. Außerdem würden derartige Zelllinien die Möglichkeit von in vitro-Biotests auf die Toxizität von Arzneimitteln und anderen Chemikalien bieten. Etablierte Zelllinien würden außerdem für die Implantation zur Korrektur von Krankheiten aufgrund von Hormonmangel in Frage kommen. So z. B. könnten Diabetiker durch die Implantation von Zellen, welche die Funktion von insulinsezernierenden β-Zellen der Pankreas ersetzen, stabilisiert und gegebenenfalls auch geheilt werden.

Es besteht ein Bedarf an Verfahren zur Herstellung von entsprechend physiologisch einwandfreien Präparaten von Gonadotropinhormonen. Präparate von menschlichem Gonadotropin (hMG), das gewöhnlich sowohl FSH als auch LH enthält, werden Frauen verabreicht, die sich einer Vorbehandlung unterziehen, welche zur in vitro-Fertilisation führt. Das verabreichte hMG regt die Eierstöcke der Frau dazu an, eine große Zahl von präovulatorischen Follikeln zu entwickeln, die anschließend für die in vitro-Fertilisation verwendet werden.

hMG wird gegenwärtig aus dem Urin von Frauen nach der Menopause gewonnen. Jede Partie unterscheidet sich dabei, je nach Alter und endokrinem Zustand der Urinspenderinnen, wobei Unterschiede sowohl in Konzentration als auch im Typ der Isoformen im Endprodukt vorliegen. Man unterscheidet zumindest 11 Isoformen von menschlichem follikelstimulierendem Hormon (hFSH) und 7 Isoformen von menschlichem luteinisierendem Hormon (hLH) (Stone, B. A. eta l., 1990 Acta Endo Copenhagen, 123, 161-168). Die Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie (HPLC) verschiedener hMG-Präparate hat eine Variabilität zwischen den einzelnen Partien in Anwesenheit und Konzentration der Isoformen von FSH ergeben (Stone, B. A. et al., ibid.). Unterschiedliche Isoformen haben unterschiedliche Biopotenz (Gharib, S. D. et al., 1990, In: Endocrine Reviews, 11, 177- 199). Da bestimmte Isoformen des FSH biopotenter sind als andere, gibt es eine Variabilität in der Biopotenz zwischen den einzelnen Partien und unter den hMG-Präparaten. Außerdem beeinflusst die Anwesenheit von LH-Isoformen in einem Präparat die Biopotenz des FSH im Präparat.

Wissenschaftler versuchen gegenwärtig auf gentechnischem Wege FSH einer erwünschten und konstanten Biopotenz zu erzeugen. Es besteht daher ein deutlicher Bedarf an billigen Tests für die Entwicklung therapeutisch wertvoller Präparate gentechnisch hergestellter Gonadotropine.

Es gibt zwei Hauptformen chemischer Tests auf Gonadotropine: HPLC und Radioimmuntest (RIA). Die HPLC-Technik ist genau, aber damit lässt sich nicht feststellen, welche chemischen Eigenschaften der hMG-Präparate zur Biopotenz gehören. Außerdem erfordert die HPLC-Technik beträchtliche technische Erfahrung, umfangreiche Ausrüstung und die Einrichtung eines technischen Labors. Tests auf der Basis immunologischer Erkennung eines Gonadotropins (RIA) sind aufgrund des kreuzweisen Reaktivität der Antikörper mit unterschiedlichen Isoformen von Gonadotropinen nur beschränkt anwendbar. So z. B. könnte ein einzelner numerischer RIA-Wert für die FSH-Konzentration mehrere FSH-Isoformen unterschiedlicher Biopotenz umfassen. Die gegenwärtigen Techniken für chemische Tests stellen daher kein Mittel bereit, um die Biopotenz eines therapeutischen Präparat- Tests auf Gonadotropine nachzuweisen.

Ein Bedarf an Biopotenz-Tests auf Gonadotropine wurde von mehreren nationalen Behörden einschließlich der US-Behörde für Nahrungs- und Arzneimittel (FDA) festgestellt. Die gegenwärtig von dieser Behörde akzeptierten Tests sind an Nagern durchgeführte in vivo-Tests. Der in vivo-Test auf FSH ist der Steelman-Pohley-Test, der auf der Gewichtszunahme des Mäuseuterus beruht. Ein in vivo-Test auf LH ist der Leydig- Zelltest an Ratten; der Vermehrungsgrad der Samenblasen unreifer männlicher Ratten ist dabei der Index für den Nachweis der Biopotenz von LH. Ein weiterer in vivo-Biotest auf LH ist der Ascorbinsäure-Erschöpfungstest an Eierstöcken von Ratten. Diese in vivo-Tests sind von Nachteil, da sie die Tötung einer großen Zahl von Labortieren erfordern. So z. B. sind 2.000 Mäuse erforderlich, um den Stabilitätsfaktor für eine konkrete hMG- Partie zu messen. Diese 2.000 Mäuse umfassen jedoch nicht die Zahl der für die Feststellung der Biopotenz der Ausgangspartie erforderlichen Zahl von Tieren. Der Bedarf an billigeren Biotests ist daher offensichtlich. Außerdem sind die an Nagerzellen durchgeführten Tests nicht notwendigerweise auf die Biopotenz beim Menschen übertragbar.

Die gegenwärtige Quelle für therapeutische Gonadotropine ist, obwohl zweckmäßig, durch die biologische Variabilität unter den menschlichen Spendern begrenzt. Die Hauptquelle für menschliches Gonadotropin (menschliches Menopause-Gonadotropin, hMG) ist Urin, der von Nonnen irr der Schweiz gespendet wird. Die sich in der Postmenopause befindlichen Frauen, die in einem Kloster leben, sammeln ihren Urin, um ihn an eine Firma zu verkaufen, die daraus jeweils einen Teil ihres Produktes aus einer Partie des gesammelten Urins gewinnt. Da Alter und endokriner Zustand jeder Urinspenderin sich von Partie zu Partie ändert, weist jedes Gonadotropinpräparat unterschiedliche chemische Zusammensetzung und Biopotenz auf. Es besteht daher ein Bedarf an einer konstanten Quelle für menschliches Gonadotropin.

Es besteht weiterhin ein Bedarf an einer Quelle physiologisch einwandfreier Präparate von menschlichen Geschlechtssteroidhormonen. Gegenwärtig werden therapeutische Östrogen- und Progesteron-Verbindungen und deren Analoga durch standartisierte chemische Synthese hergestellt. Die Klasse der mit "Östrogene" bezeichneten Verbindungen, wie sie gewöhnlich von der Frau produziert werden, umfasst mehrere unterschiedliche Formeln und Isoformen. In ähnlicher Weise umfasst die mit "- Progestine" bezeichnete Klasse von Hormonen mehrere unterschiedliche Verbindungen und Isoformen. Die auf natürlichem Wege erzeugten Arten und Mengen von Östrogenen und Progestinen variieren je nach dem Alter der Frau und ihrem physiologischen Gesamtzustand, d. h. dem konkreten Zeitpunkt innerhalb ihres Menstruationszyklus, der Schwangerschaft oder der Menopause. Der optimale Steroidgehalt für eine bestimmte therapeutische Indikation wird dabei nicht ermittelt. Selbst wenn das optimale chemische Profil eines Geschlechtssteroidpräparats ermittelt wird, ist die chemische Synthese kein praktisch beschreitbarer Weg für die Erzeugung komplexer Steroidgemische. Es war daher wünschenswert, Verfahren zu entwickeln, die ein physiologisch genaues Gemisch aus menschlichen Östrogenen und Progesteronen bereitstellen.

Toxizitätstests sind ein weiteres Gebiet, auf dem Wissenschaftler versucht haben, in vitro-Systeme anzuwenden (siehe die Übersicht von Nau, H., 1990, in Methods in Developmental Toxicology: Use in Defining Mechanisms and Risk Parameters. Eds. G. L. Kimmel, D. M. Kochhar, CRC Press, SS. 29-43). Gegenwärtig sind in vitro-Systeme auf der Basis von hormonsezernierenden Zellen sehr begrenzt in Verwendung, insbesondere aufgrund der Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung von hormonsezernierenden Zellen in Kultur. Theoretisch könnte die reproduktive Toxizität einer Verbindung durch das Vermögen der Verbindung nachgewiesen werden, die Hormonsekretion aus Zellen, die gewöhnlich ein bestimmtes Hormon sezernieren, zu beeinträchtigen. Eine nicht-menschliche Zelllinie (Eierstöcke von chinesischen Hamstern, CHO) wurden bisher eingehend für toxikologische Analysen verwendet (Tsushimoto, G. et al., 1983, Arch Environ Contam Toxicol. 12, 721). Ferner wurden Oocyten von Amphibien als ein System zum Testen von die Tumorbildung begünstigenden Verbindungen vorgeschlagen (US-PS Nr. 4 983 527; erteilt am 8. Januar, 1991). Explantate von Xenopus-Hoden wurden zum Testen der Mutagenität und der Genotoxizität während der Spermatogenese vorgeschlagen (US-PS Nr. 4 929 542; erteilt am 29. Mai 1990). Aus Fibroblasten von Rattenembryonen etablierte Zelllinien wurden als Systeme für das Screening für Proteininhibitoren und -aktivatoren vorgeschlagen (US-PS Nr. 4 980 281; erteilt am 25. Dezember 1990). Da allgemein anerkannt ist, dass Menschen verglichen mit Amphibien und Nagern unterschiedliche toxische Empfindlichkeit aufweisen, sind die oben vorgeschlagenen in vitro-Testsysteme aufgrund des nicht-menschlichen Ursprungs der Zellen begrenzt.

Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf an menschlichen hormonsezernierenden Zelllinien, die in einer Langzeitkultur etabliert sind, und zwar für die:

1) Erzeugung menschlicher Hormone,

2) Biotests an therapeutischen Gonadotropinen,

3) Tests zur Feststellung der Wirksamkeit vor Arzneimitteln und für deren Konstruktion,

4) Tests zur Feststellung der Toxizität von Arzneimitteln und Chemikalien und

5) Implantation zum Ersatz unzureichender Hormonsekretion.

Offenbarung

Die Erfindung betrifft zum ersten ein Verfahren zur Etablierung einer Zellkultur aus hormonsezernierenden menschlichen Pankreaszellen in vitro, das folgende Stufen umfasst:

a) Auswahl von Zellen mit Insulinsekretionspotential aus einer Population menschlicher nichttumoraler Pankreaszellen, die ein Insulinsekretionspotential aufweisen,

b) Suspendierung dieser Zellen in einem Etablierungsmedium, das eines der Sera der Gruppe Humanserum, Rinderserumalbumin oder Serumersatzstoff umfasst, das tierische Proteine enthält, wobei das Etablierungsmedium die Lebensfähigkeit bzw. Proliferation der Zelle bzw. Zellen während eines Zeitraums von wenigstens 13 Tagen in vitro begünstigt und

c) Subkultivierung von bindungsunabhängigen Zellen aus Stufe b), so dass die Zellen proliferieren und die Lebensfähigkeit während eines Zeitraums von wenigstens 5,5 Monaten aufrechterhalten wird.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Etablierung einer Zellkultur aus hormonsezernierenden menschlichen Pankreaszellen in vitro, das folgende Stufen umfasst:

a) Auswahl mindestens einer Zelle mit Hormonsekretionspotential aus einer Population menschlicher nichttumoraler Pankreaszellen, die ein Insulinsekretionspotential aufweisen,

b) Suspendierung dieser Zelle bzw. Zellen in einem Etablierungsmedium, das eines der Sera der Gruppe Humanserum, Rinderserumalbumin oder Serumsupplement umfasst, das tierische Proteine enthält, wobei das Etablierungsmedium die Lebensfähigkeit bzw. Proliferation der Zelle bzw. Zellen während eines Zeitraums von wenigstens 13 Tagen in vitro begünstigt und

c) Subkultivierung der Zelle bzw. Zellen von Stufe b) in einem definierten Medium mit einer Osmolarität von ca. 248 bis ca. 275 mOsm, so dass die Zellen proliferieren und Nachkommen produzieren und die Lebensfähigkeit während eines Zeitraums von wenigstens 5,5 Monaten bis zu einem Jahr oder länger aufrechterhalten wird.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Langzeithaltung von menschlichen hormonsezernierenden, nichttumoralen Pankreaszellen in vitro bereit, das folgende Stufen umfasst:

a) Vermehrung der Zelle bzw. Zellen auf Stufe c), wobei das definierte Medium geeignet ist, die Lebensfähigkeit wenigstens eines Teils der Nachkommen zu begünstigen, so dass wenigstens ein Teil der Nachkommen in vitro nach wenigstens einem Jahr nach Ablauf der Stufe a) noch lebensfähig ist.

Die erfindungsgemäßen Verfahren gewährleisten in vorteilhafter Weise die in vitro-Langzeithaltung und -Vermehrung hormonsezernierender Zellen in definierten Medien.

In vitro sezernieren die Zellen Hormone, die für ihr Ausgangsgewebe in diesem Fall kennzeichnend sind. Die sezernierten Hormone umfassen Insulin und Glucagon. Die Zellen können auf die Stimulierung durch Secretogogue mit erhöhter Hormonsekretion reagieren.

Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen auch die Herstellung etablierter Hormon-sezernierender Pankreaszelllinien, die kryokonserviert und aus dem kryokonservierten Material vermehrt werden können, wobei sie das charakteristische Hormonsekretionsprofil über mehrere Generationen in vitro beibehalten.

Die sezernierten Hormone können dadurch therapeutisch von Bedeutung sein, dass man die Hormon-sezernierenden Zellen in Kultur vermehrt und die sezernierten Hormone aus dem die Zellen umgebenden Kulturmedium isoliert. Die Hormon-sezernierenden Zellen in Kultur können außerdem für einen in vitro-Biotest auf Biopotenz der therapeutischen Hormonpräparate geeignet sein.

Bereitgestellt wird auch ein in vitro-Toxikologie-Test auf der Basis der Veränderung in der Hormonsekretion durch menschliche Pankreaszellen in vitro in Reaktion auf den Kontakt mit einem zu testenden chemischen Mittel. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung ein Verfahren zur Ermittlung der Toxizität einer Testverbindung bereit, das folgende Stufen umfasst:

a) Bereitstellung einer etablierten menschlichen nichttumoralen Pankreaszelllinie, hergestellt nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Zelllinie Zellen umfasst, die eine kennzeichnende Reaktion auf ein bekanntes Toxin zeigen und diese eine bekannte Veränderung im Hormonsekretionsprofil der Zellen der Zelllinie darstellt,

b) Kontaktierung der Zellen mit der Testverbindung,

c) Ermittlung des Hormonsekretionsprofils der Zellen nach der Stufe b) und

d) Vergleich des Hormonsekretionsprofils der Zellen nach der Stufe b) mit der bekannten Änderung im Hormonsekretionsprofil zur Ermittlung der relativen Toxizität der Testverbindung.

Die gemäß den beschriebenen Verfahren erzielbaren Zellkulturen sind ebenfalls Teil der Erfindung und sind besonders geeignet für die Implantation bei Patienten zum Ersatz fehlender Hormone.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In Fig. 1 ist das gesamte Verfahren zur Etablierung und Vermehrung der Hormon-sezernierender Zellen in vitro schematisch dargestellt.

Fig. 2 zeigt ein Mikrophoto (Gesamtvergrößerung 4900X) einer typischen Kultur menschlicher Ovarialfollikelzellen nach Abschluss der Stufe 8 in Fig. 1.

Fig. 3 zeigt ein zweites Beispiel der in Fig. 2 beschriebenen Zellen.

Fig. 4 zeigt ein drittes Beispiel der in Fig. 2 beschriebenen Zellen.

Fig. 5 zeigt ein Mikrophoto (annähernde Endvergrößerung 560X) einer typischen Kultur von Follikelzellen nach einer Woche in Subkultur (s. Beispiel 2).

Fig. 6 zeigt ein Mikrophoto einer typischen Ausgangssubkultur von Follikelzellen (SC-1; s. Beispiel 2).

Fig. 7 zeigt ein Mikrophoto (annähernde Gesamtvergrößerung 2500X) einer typischen Subkultur von Follikelzellen nach mehr als 20 Zyklen einer Seriensubklultur (s. Beispiel 2). Mit den Zellen waren vier Tage vorher bei einer Dichte von 10&sup6; Zellen pro 15 ml Medium ein 25 cm²-Kolben beimpft worden.

Fig. 8 zeigt ein Mikrophoto (annähernde Endvergrößerung 1100X) eines "Blastem-ähnlichen" Auswuchses von Zellen an der Kante eines Schnittes durch ein Hypophysen-Makroadenom, das 9 Tage zuvor in Kultur gebracht worden war.

Fig. 9 zeigt ein Mikrophoto (2200X Gesamtvergrößerung) einer Gruppe von Zellen, die von einem auswachsenden "Blastem-ähnlichen" Fortsatz nach Einbringen des Originalstückes des Hypophysernadenoms in Kultur während 18 Tagen abgelöst wurde.

Fig. 10 stellt ein weiteres Mikrophoto dar, das zwei Tage später von derselben Gruppe von Zellen wie in Fig. 9 (20 Tage Gesamtzüchtungszeit für den ursprünglichen Tumorschnitt) aufgenommen worden war. Die Vergrößerung ist dieselbe wie in Fig. 9 und illustriert somit durch Vergleich die rasche Proliferation dieser Zellen.

Fig. 11 zeigt ein Histogramm, das die angestiegene Insulinsekretion durch menschliche Pankreaszellen in Reaktion auf die gestiegene Glucosekonzentration beschreibt.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Ein Schema des gesamten Verfahrens zur Etablierung von Zellkulturen zeigt Fig. 1. Die unten angegebenen Stufen beziehen sich auf Fig. 1.

Zellen mit hormonsezernierendem Potential werden sorgfältig aus einer Operationsgewebeprobe entsprechend den hier vorgesehenen Methoden isoliert. Vorzugsweise werden die in einer Kultur zu etablierenden Zellen einer Spenderin entnommen, die sich einer medizinischen Prozedur unterzieht, während der Gewebe als Teil der Prozedur entfernt wird (Stufe 2). Die Zellen werden dann sorgfältig aus den Geweben isoliert (Stufe 3) und anfänglich in der Kultur unter Bedingungen etabliert, welche in ausreichendem Maße die in vivo-Bedingungen simulieren, so dass die Lebensfähigkeit der Zellen begünstigt wird (Stufen 4-6). Nach ca. 30 Tagen unter den etablierenden Züchtungsbedingungen (Stufe 8) werden die Zellen auf ihr hormonsezernierendes Potential hin selektiert (Stufe 9). Die selektierten Zellen werden in Subkulturen gegeben und weiter gehalten und in einem definierten Medium vermehrt (Stufen 10 und 11). Das definierte Medium ist so formuliert, dass es die Zellproliferation und die fortgesetzte Lebensfähigkeit der Subkulturen begünstigt. Geeignete Hormone können dann aus dem Medium isoliert werden (Stufe 12). Nach ausreichender Zellvermehrung werden die Zellkulturen dann durch Vermehrungsrate, Hormonsekretion und Reaktionen auf Secretogogue und Toxine gekennzeichnet (Stufe 13). Aliquote Anteile können dann kryokonserviert (Stufe 14) und auf Beibehaltung der Zelllinienparameter getestet werden. Ist eine Zelllinie ausreichend gekennzeichnet, kann sie als etablierte Zelllinie bezeichnet und für die Produktion von Hormonen oder für Biopotenz- oder Toxizitätstests verwendet werden.

Aus Eierstockfollikeln gewonnene Zellen können einer Spenderin, die sich der in vitro-Fertilisation unterzieht, entnommen werden. Zum Zeitpunkt der Follikelentnahme wird die Spenderin gewöhnlich einer kombinierten Hormonbehandlung unterzogen, um die Entwicklung von vielfachen präovulatorischen Follikeln zu stimulieren (Stufe 1). Die Hormonbehandlung umfasst gewöhnlich Leuprolidacetat für eine mittlere Gelbkörpersuppression in Kombination mit menschlichem Menopausehormon (hMG) und follikelstimulierenden Hormon (FSH) für die kontrollierte Ovarialhyperstimulierung. Vierunddreißig Stunden vor der Wiederherstellung der Oozyten kann menschliches Choriongonadotrophin (hCG) verabreicht werden, um ein weiteres Wachstum und eine weitere Differenzierung des Follikels zu begünstigen. Die oben beschriebene Hormonbehandlung stimuliert die Proliferation der das E1 umgebenden Granulosazellen. Gegen Ende der Wachstumsphase der Follikel entwickeln sich zwei Populationen von Granulosazellen:

1) murale Granulosazellen, die den Kontakt mit der das Follikel einschließenden Basallamina aufrechterhalten und

2) die Cumulus-Granulosazellen, bekannt als Zona radiata-Zellen, die dem Ei am nächsten stehen und über einen Spalt sowohl mit den Oozyten als auch mit den übrigen umgebenden Cumuluszellen in Verbindung stehen. Die Stimulierung der Differenzierung der Granulosazellen durch Gonadotropin ist gekennzeichnet durch Änderungen in den Zell-Zell-Kontakten, in Zellform, Zytoskelettbau und in der Biosynthese der Östrogene, von Progesteron, der Progestine, der extrazellulären Matrixkomponenten und der Hormonrezeptoren. FSH wirkt durch einen cAMP-vermittelten Mechanismus auf die noch undifferenzierten Granulosazellen unter Stimulierung der enzymatischen Aktivität, die für den Umbau von Cholesterin in Progesteron und für die Umwandlung von Androgenen in Östrogene erforderlich ist. Mit zunehmender Reifung des Follikels stimulieren FSH und Östrogen die Produktion der mit der Plasmamembran der Granulosazellen in Verbindung stehenden LH-Rezeptoren. Nach der Stimulierung durch FSH und der Synthese der LH-Rezeptoren beginnen die Granulosazellen auf LH zu reagieren und synthetisieren dann in Reaktion auf das zugefügte LH das Progesteron.

Die oben beschriebene Hormonbehandlung begünstigt somit die Entwicklung von Granulosazellen, die einen hohen Gehalt an Basalsekretion an Progesteron und Östrogen zeigen. Derartige Zellen sind z. B. für die Produktion therapeutischer menschlicher Geschlechtssteroide und für einen in vitro-Toxizitätstest auf der Basis der Verminderung der Hormonsekretion durch ein toxisches Mittel wünschenswert. Bei optimaler Follikelentwicklung werden die Follikel zur Präparierung für die in vitro-Fertilisation der Eier abgesaugt. In diesem Kontext bedeutet der Ausdruck "Gewebe" (Stufe 2) das gesamte Follikel einschließlich der Basallamina, der Cumulus-Granulosazellen, der muralen Granulosazellen und des Eis. Im allgemeinen begleiten Nicht-Keimbahn-Follikelzellen die entnommenen Eier (Stufe 2) und diese Nicht-Keimbahn-Zellen würden gewöhnlich während des normalen Ablaufs der in vitro-Fertilisation verworfen. Die Zellen werden für die Kultur (Stufe 3) aus den Follikeln der Patientinnen, die ihre Nicht-Keimbahn- Zellen für medizinische Untersuchungen und für Zwecke der Gesundheitsfürsorge spenden, isoliert.

Im Gegensatz zu der oben beschriebenen Ausführungsform sind Follikelzellen, welche ein niedriges Basalniveau an Hormonsekretion zeigen, die jedoch andererseits auf Gonadotropin mit erhöhter Hormonsekretion reagieren, wünschenswert für in vitro- Biopotenztests für therapeutische Gonadotropinpräparate. Es können daher Follikelzellen aus einer Spenderin gewonnen werden, die sich lediglich dem ersten Teil der oben beschriebenen Vorbehandlung unterzogen hat. Die Spenderin hat in diesem Fall hMG und FSH, jedoch nicht hCG erhalten. Bei dieser Ausführungsform werden aus den wachsenden Primärfollikeln und weniger aus den reifen präovulatorischen Follikeln relativ undifferenzierte Follikelzellen gewonnen.

Follikelzellen können auch aus einer Spenderin gewonnen werden, die sich keiner Vorbehandlung unterzogen hat. Bei dieser Ausführungsform werden aus Primärfollikeln und weniger aus hormonstimulierten präovulatorischen Follikeln relativ undifferenzierte Follikelzellen erhalten. Analog zur oben beschriebenen Ausführungsform zeigen nach dieser Methode erhaltene Follikelzellen ein geringes Basalniveau an Hormonsekretion, wobei sie die Fähigkeit beibehalten, auf Gonadotropin mit erhöhter Hormonsekretion zu reagieren. Nach dieser Ausführungsform erhaltene Zellen sind daher in gleicher Weise für in vitro-Gonadotropin-Biopotenztests geeignet.

Zwei wichtige Merkmale, welche diese Methode von üblichen Methoden unterscheiden, sind folgende:

1. Das Gewebe wird nicht enzymatisch verdaut.

2. Die Zellen werden nicht zentrifugiert.

Dies steht im Gegensatz zu den veröffentlichten Methoden, welche die Verdauung der Gewebematrix durch Inkubieren mit Enzymen, wie Kollagenase, Hyaluronidase und Trypsin erforderlich machen, um die Zellen aus der Gewebematrix herauszulösen. Nach der Enzymbehandlung wird nach den üblichen Methoden gewöhnlich zentrifugiert, um aus den erhaltenen Gewebsresten Zellen zu isolieren. Der Ausdruck "praktisch enzymfrei" bedeutet hier ein Verfahren, bei dem dem Inkubationsmedium keine Enzyme zugesetzt werden. Es versteht sich von selbst, dass geringe Mengen an Enzymen wie Proteasen im Medium enthalten sein können und dass ihre Anwesenheit im Rahmen der Definition des Ausdrucks "praktisch enzymfrei" gestattet ist.

Die erste Stufe nach Gewinnung der Follikelzellen besteht darin, dass man diese mit oder ohne das Ei in ein Etablierungsmedium gibt (EM; Stufe 4). Der Ausdruck "etablierendes Medium" bedeutet eine Lösung, die im wesentlichen die kritischen Parameter des in vivo-Mediums, aus der die Zellen stammen, simuliert. Geoffenbart werden hier fünf spezifische Formulierungen für etablierende Medien. Die kritischen Parameter des in vivo-Mediums der Follikelzellen umfassen eine Osmolarität, die im Vergleich zu der, wie sie gewöhnlich in früheren Versuchen zur Züchtung hormonsezernierender Zellen verwendet werden, vermindert ist. Die Osmolarität der Follikelflüssigkeit liegt im allgemeinen in einem Bereich von 270 bis 275 mOsm. Die Endosmolarität eines etablierenden Züchtungsmediums gemäß der vorliegenden Erfindung liegt vorzugsweise in einem Bereich von ca. 248 mOsm bis ca. 275 mOsm und insbesondere von ca. 269 mOsm bis 275 mOsm.

Vorzugsweise überzieht man die Zellen im etablierenden Medium mit einem medizinischen Blut-Gas-Gemisch aus 5% Co&sub2;/5% O&sub2;/90% N&sub2;, welches das in vivo-Gasgemisch simuliert. Vorzugsweise supplementiert man das etablierende Medium mit zusätzlichem Glutamin bis auf einen Wert von ca. 6,35 mM bis ca. 8,35 mM und insbesondere bis auf 7,35 mM Glutamin. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das etablierende Medium mit Serum supplementiert, erhalten von einem konkreten Zellspender (etablierendes Medium, homologes Serum; EMHS). Vorzugsweise enthält das EMHS 0,5 bis 15%, insbesondere 5% bis 10% und ganz besonders bevorzugt 7 % bis 8% homologes Serum. Dieses stellt ein Medium bereit, das keine anderen Proteine als jene enthält, die für das Individuum spezifisch sind, aus denen die Zellen stammen, und daher die Lebensfähigkeit der gespendeten Zellen aufgrund der Minimierung der immunologischen Reaktion begünstigt. Außerdem kann das Spenderserum wegen seines spezifischen Gehalts und wegen seiner spezifischen Konzentration an Hormonen wie Progesteronen, Östrogenen und Gonadotropinen von Vorteil sein.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das etablierende Medium mit einem Serum supplementiert, das aus einem anderen Individuum als dem konkreten Zellspender erhalten wurde (etablierendes Medium, nichthomologes Serum; EMNS). Vorzugsweise enthält das EMNS 0,5% bis 15%, vorzugsweise 5% bis 10% und ganz besonders bevorzugt 7% bis 8% nichthomologes Serum. Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist klar, dass das Medium auch noch mit Hormonen und Wachstumsfaktoren zur Begünstigung des Überlebens der Zellen mit den erwünschten Eigenschaften, wie z. B. mit erhöhter Progesteronproduktion, unterschiedlich supplementiert werden kann.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Zeilen mit Erfolg in einem definierten Medium etabliert, das kein Serum enthält, aber mit Rinderserumalbumin (BSA) oder einem Gemisch aus BSA und einem im Handel erhältlichen Serumersatz supplementiert ist. Der Ausdruck "definiertes Medium" bedeutet ein Züchtungsmedium, das kein menschliches Serum und damit weniger unbekannte, ungeprüfte Komponenten enthält als ein menschliches Serum enthaltendes Medium. Es versteht sich von selbst, dass ein Medium, das ein tierisches Produkt wie BSA enthält, nicht so vollständig definiert ist wie ein Medium, das zur Gänze aus chemisch synthetisierten Komponenten besteht. Erfindungsgemäß werden jedoch BSA enthaltende Medien und Serumersatz enthaltende Medien üblicherweise als "definierte Medien" bezeichnet. In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Gattungsbegriff "definiertes Medium" jedes Medium ohne menschliches Serum. In den nachfolgenden Versuchsbeispielen sind die Formeln für drei unterschiedliche definierte Medien angegeben:

1) Etablierungsmedium-01 (EM-01);

2) definiertes Medium-1 (DM-1);

3) definiertes Medium, Serumersatz (DMSS).

Diese drei definierten Medien haben gemeinsam, dass sie anstelle von menschlichem Serum BSA und/oder einen Serumersatz mit tierischen Proteinen enthalten.

Der Ausdruck "Serumersatz" bedeutet hier ein Gemisch aus Proteinen und Wachstumsfaktoren, das vorzugsweise in einer Menge von ca. 5% bis 15%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums zugegeben wird. Ursprünglich war EM-01 entwikelt worden, um die Lebensfähigkeit fertilisierter Eizellen aus einer Spenderin zu begünstigen, deren Serum anti-Sperma- Antikörper enthielt. Zufällig wurde festgestellt, dass der Ersatz von Spenderserum durch BSA ebenfalls die Lebensfähigkeit von Nicht-Keimbahn-Follikelzellen, die zur selben Zeit wie die Eizellen gezüchtet wurden, begünstigt. EM-01 ist daher ein bevorzugtes Etablierungsmedium für Follikelzellen. Die mit DM-1 und DMSS bezeichneten Medien waren ursprünglich für den Gebrauch nach 30 Tagen in EM enthaltendem menschlichem Serum (EMHS und DMSS) formuliert. Es wurde jedoch gefunden, dass Zellen mit Erfolg in DM-1 oder in DMSS etabliert werden können, auch wenn sie vorher nicht in EM enthaltendes menschliches Serum gegeben wurden. EM-01, DM-1 und DMSS haben alle die Unterscheidungsmerkmale von EM enthaltendem menschlichem Serum gemeinsam, dass sie nämlich eine geringere Osmolarität aufweisen als die traditionellen Züchtungsmedien. Die Osmolarität von EM-01, DM-1 und DMSS liegt vorzugsweise in einem Bereich von ca. 248 mOsm bis ca. 300 mOsm, insbesondere im Bereich von ca. 260 mOsm bis ca. 280 mOsm und ganz besonders bevorzugt ca. 270 mOsm bis ca. 275 mOsm.

Die hier verwendeten Medienformulierungen können zweckmäßigerweise zusätzlich zu Glucose auch noch weitere Energiequellen wie Lactat und Pyruvat enthalten. Der Ausdruck "Energiequelle" bedeutet einen chemischen Stoff, der von den Zellen über Glycolyse oder den Tricarbonsäurezyklus zur Erzeugung von ATP verwertet werden kann.

Was das Etablierungsmedium betrifft, so supplementiert man die definierten Medienformulierungen bevorzugt mit Glutamin bis zu einer Menge von ca. 6,35 mM bis ca. 8,35 mM und ganz besonders bevorzugt mit ca. 7,35 mM Glutamin.

Das Ei und die umgebenden Nicht-Keimbahn-Follikelzellen werden zweckmäßigerweise zusammen in EM (EMHS, EMNS, EM-01, DM-1, DMSS; Stufe 2a) gegeben. Nach ca. 24 Stunden kann dem EM Sperma zugesetzt werden, wonach die Zellen für weitere 20-24 Stunden inkubiert werden (Stufe 2b). Im allgemeinen wird angenommen, dass Spermatozoen ein als acrosomales Enzym bekanntes Enzym bereitstellen, das die Nicht-Keimbahn-Zellen vorsichtig aus das Ei bildenden Matrix herauslöst. Es versteht sich von selbst, dass die Menge an acrosomalen Enzymen in den Spermatozoen gering ist und nicht mit den großen Mengen an Enzymen wie Collagenase verglichen werden kann, die nach den traditionellen Methoden zur Verdauung von Gewebematrices zur Freisetzung von Zellen verwendet werden. Nach der Inkubation im Sperma können die Corona radiata-Zellen manuell mit Hilfe einer Hohlnadel, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus dem Ei entfernt werden (Stufe 2c). Die Follikelzellen, die dem Ei nicht anhaften können aus dem umgebenden Medium leicht isoliert werden (Stufe 3).

Die lebensfähigen Zellen werden mit Hilfe eines Präpariermikroskops (90fache Vergrößerung; Stufe 5) ausgewählt. Der Ausdruck "lebensfähig" bedeutet Zellen, die gewöhnlich eine auf dem Boden einer Petrischale sich ausbreitende Monoschicht zeigt. Die Lebensfähigkeit kann anhand einer entbehrlichen Zellprobe mit Hilfe der Methode des Trypanblau-Ausschlusses, wie allgemein bekannt, nachgewiesen werden. Die Methode in Fig. 1 unterscheidet sich wiederum in Stufe 5, genauso wie oben in Stufe 3, von den Methoden von Amsterdam et al. (ibid.) und Pellicer et al. (ibid.) dadurch, dass bei der vorliegenden Technik ein Zentrifugieren bzw. eine Gradientenauftrennung nicht erforderlich sind. Stattdessen werden die Zellen manuell und sorgfältig ausgewählt und für die Züchtung isoliert, wobei die Integrität der Membran einer großen Zahl von Zellen erhalten bleibt, im Gegensatz zu Zellpopulationen, die zentrifugiert werden. Die Methode unterscheidet sich andererseits wiederum von Techniken, die zur Isolierung von Zellen eine enzymatische Verdauung des Gewebes erforderlich machen. Diese allgemein bekannten Techniken umfassen gewöhnlich die Inkubierung in Trypsin oder Collagenase, was zu Verletzungen der Zellen führen kann, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung erwünscht sind.

Die ausgewählten Zeilen werden dann mit Hilfe einer dünnen Glasmikropipette in frisches EM gegeben und für weitere 24 bis 96 Stunden inkubiert (Stufe 6). Vorzugsweise werden die Zellen mit einem Blut-Gas-Gemisch behandelt, wie es oben beschrieben wurde, um die in vivo-Gasbedingungen optimal zu simulieren. Zu diesem Zeitpunkt können dann die Zellen auf Kulturen mit jeweils 50 bis 100 Zellen in frischem EM verteilt werden (Stufe 7).

Die ausgewählten Zellen werden dann im etablierenden Medium weiter ca. 30 Tage gehalten (Stufe 8). Während der ersten 14 Tage wird das Züchtungsmedium nur alle 6 bis 7 Tage wieder aufgefrischt. Dies führt zu einer leichten Hypoxie der Kulturen und es kommt zu einer physiologischen Selektion gegenüber Fibroblasten, da sich rasch teilende Zellen wie Fibroblasten in einer reduzierten O&sub2;-Atmosphäre nicht überleben (Aladjem, S. et al., 1981, Placenta Suppl. 3, 175). Die reduzierte O&sub2;- Atmosphäre führt gleichzeitig zu einer positiven Selektion im Hinblick auf Zellen von Granulosa-Herkunft, da ihr normales in vivo-Milieu eine ähnliche Bedingung aufweist.

Bei einigen Ausgangskulturen ist gewöhnlich ein hoher Anteil der Zellen zum Überleben und zur Proliferation ohne Anheftung an ein Substrat in der Lage. Demgegenüber breitet sich eine Reihe von Zellen auf dem Boden der Petrischale aus und haftet sich an den Kunststoff an. Eine derartige Zellkultur kann somit sowohl in der Suspension schwebende Zellklumpen, an der Kunststoffschale anhaftende Zellklumpen als auch in Form einer Monoschicht auf dem Boden der Schale sich ausbreitende Zellen umfassen.

Nach ca. 20 bis 30 Tagen für die Etablierung im in vitro-Medium (Stufe 8) werden Zellen auf ihr hormonsezernierendes Potential hin ausgewählt (Stufe 9), und zwar entsprechend den morphologischen Kriterien, wie sie in Fig. 2, 3 und 4 dargestellt sind. Die kreisförmiger Zellklumpen sind typisch für die ausgewählten Zellklumpen. Vorzugsweise werden kleine Klumpen aus 2 bis 12 und insbesondere aus 4 bis 5 Zellen ausgewählt. Die ausgewählten Klumpen werden zu Gruppen aus 50- 150 Zellen (Stufe 9a) oder aus 10-15 Zellen (Stufe 10) vereint. Diese Gruppen werden als erste Subkulturen bezeichnet (SC-1). Aufgrund der räumlichen Anordnung der Zellen innerhalb eines ausgewählten Klumpens, d. h. aufgrund ihrer perlenkettenartigen Art der Berührung wird davon ausgegangen, dass diese Klumpen mit hoher Wahrscheinlichkeit Tochterzellen aufweisen, die aus der Teilung von 1 oder 2 Vorläuferzellen abstammen. Häufig ist es wünschenswert, eine klonal selektierte Kultur zu erhalten, die von einer einzigen Vorläuferzelle abstammt, weshalb mit hoher Wahrscheinlichkeit angenommen werden kann, dass diese Klumpen eine derartige Kultur bereitstellen, wenn ein einziger Klumpen für SC-1 verwendet wird (z. B. Stufe 10, auf der ein einziger Klumpen aus 10-12 Zellen die Ausgangskultur bildet). Fig. 6 zeigt eine typische Ausgangssubkultur von Follikelzellen in SC-1. Die dunklen Flecken sind besonders dichte Zellklumpen, bei denen die einzelnen Zellen photographisch nicht aufgelöst werden können. Die heller gefärbten Zellschichten zwischen den dunklen Flecken sind Zellen, die sich auf dem Boden der Petrischale ausgebreitet haben und auf die die Kamera fokussiert war. (Die weiß erscheinende Nummer auf dem Photo ist lediglich eine Regstriernummer und enthält keine Informationen, die für die vorliegende Patentanmeldung von Bedeutung wären.)

Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist es klar, dass zu jedem Zeitpunkt in den darauffolgenden Subkultivierungsvorgängen die Möglichkeit einer Klon-Selektion besteht (Stufe 11).

Die Kriterien für Zellen mit hormonsezernierendem Potential sind annähernde Kugel- oder Eiform und Homogenität in Größe und Form innerhalb eines Klumpens, wie dies die kreisförmigen Klumpen in Fig. 2, 3 und 4 zeigen. Diese Selektionskriterien beruhen auf den Beobachtungen des Anmelders an Follikelzellen und insbesondere an Granulosazellen mit Hilfe der Phasenkontrastoptik und mikrochirurgischen Manipulationen sowie auf dem Studium histologischer Präparate und rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen von Follikelrzellen. Für den Fachmann ist es klar, dass die oben beschriebenen Selektionskriterien für den Vergleich mit anderen nicht ausgewählten Zellen im Gesichtsfeld gelten (Fig. 2, 3 und 4). Die ausgewählten Zellklumpen enthalten weniger Zellen als die nichtausgewählten Klumpen und die einzelnen Zellen sind homogener als die Zellen der nichtausgewählten Klumpen. Die ausgewählten Zellen haben eine glatter erscheinende Plasmamembran als die nichtausgewählten Zellen, die gewöhnlich Plasmamembranen mit gerippten Führungskanten besitzen. Außerdem ist im Falle von Follikelzellen das Cytoplasma der ausgewählten Zellen gewöhnlich eher glatt als granulär.

Methoden zur Entfernung von Zellen für Subkulturen (Stufen 10 und 11);

Im Falle von wachsenden Zellen, die am Boden der Kulturschale festhaften, werden die Zellen für die Subkultur durch vorsichtiges Abkratzen mit Hilfe einer dünnen Glasmikropipette geerntet. Diese Methode unterscheidet sich von den Methoden unter Einsatz enzymatischer oder anderer aggressiver Methoden, wie der Ca-Chelatbildung zum Ablösen der Zellen vom Substrat. Natürlich ist im Falle von Zellen, die in Suspension wachsen, eine Ablösungsstufe nicht erforderlich.

Die ausgewählten Zellen werden dann auf ein definiertes Medium transferiert (Stufe 10 und 11, z. B. D -1, DMSS, siehe oben). Die hier beschriebenen Formulierungen des definierten Mediums ermöglichen die Proliferation der Zellen und die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der Hormonsekretion. Die Zellen enthalten Züchtungskolben oder -schalen und das Medium werden mit dem medizinischen Blut-Gasgemisch beschickt (s. oben) und bei 37EC in einem hermetisch verschlossenen Inkubator gehalten. Vorzugsweise proliferierten die Zellen in der Kultur über lange Zeit, und zwar wenigstens über einen Zeitraum von mindestens ca. 2 Monaten, vorzugsweise von mindestens ca. 5,5 Monaten und insbesondere länger als 15 Monate. Die Zellkulturen werden gewöhnlich mit medizinischem Blut-Gasgemisch jeden zweiten Tag beschickt und je nach Bedarf entsprechend der Dichte der proliferierenden Zellpopulation unterteilt.

Das definierte Medium kann einen höheren Ausgangs-pH haben als das bei früheren Versuchen zur Züchtung von Follikelzellen verwendete Medium. Die pH-Werte der Medien DM-1 und DMSS werden anfänglich auf 7,65 eingestellt, im Gegensatz zum üblichen pH des Kulturmediums. Der Grund für den Einsatz eines höheren Ausgangs-pH's beruht auf der Tatsache, dass die Follikelflüssigkeit und die Granulsaozellen in vivo in einem leicht erhöhten CO&sub2;-Milieu vorliegen und Säugerembryonen verglichen mit dem mütterlichen Serum einen höheren pH aufweisen (Nau, H. et al., 1986, Nature 323, 276-279; Nau, H. 1990, ibid.). Der höhere Anfangs-pH des Etablierungsmediums kann die Zellen vor Schädigung durch schwache Säuren schützen, indem deren Produktion auf ein Minimum reduziert wird. Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist es einsichtig, dass zur Steuerung der Wirkung der schwachen Säuren unterschiedliche Techniken verwendet werden können. Daher ist der Anfangs-pH von 7,65 lediglich ein Vorschlag. Außerdem weisen die Etablierungsmedien EMHS, EMNS und EM-01 pH-Werte im Bereich von 7,2 bis 7,45 auf, so dass ein üblicherweise verwendeter pH ausreicht, um hormonsezernierende Zellen in Kultur zu etablieren und auch ausreichend sein kann, um diese Zellen in Kultur zu vermehren.

Während der ersten sechs Tage in der ersten Subkultur (Stufe 10) steigt die Zellzahl um etwa das Doppelte, vorzugsweise auf etwa das Dreifache oder noch mehr an. Während des letzten Teils der ersten Subkultur und während der nachfolgenden Subkulturen steigt die Zellproliferationsrate bis zu einer Verdoppelung der Zeitdauer von vorzugsweise ca. 72 Stunden und insbesondere von ca. 48 bis 36 Stunden oder darunter an.

Fig. 6 zeigt das typische Erscheinungsbild einer Ausgangssubkultur nach 14 Tagen in Kultur (Stufe 10). In Fig. 6 stellen die dunklen Flecken große Zellklumpen aus 200 Zellen oder mehr dar. Die heller gefärbten Zellbereiche zwischen den Klumpen sind Schichten, die aus Einzelzellen oder wenigen Zellen über den Boden der Petrischale verteilt zusammengesetzt waren.

Fig. 7 zeigt ein Mikrophoto von Follikelzellen nach mehr als 20 Subkulturen (Stufe 11), die bei einer Dichte von 10&sup6; Zellen/15 ml/25 cm? vier Tage vor der Aufnahme ausplattiert ausplattiert wurden. In Fig. 7 ist die Kameralinse lediglich auf die untere, dem Boden der Petrischale am nächsten kommende Zellschicht fokussiert und zwischen der mittleren Fläche und der untersten Zellschicht liegen viele Schichten schwebender Zellklumpen. Die typische Zelldichte einer Kultur ähnlich der in Fig. 7 beträgt vorzugsweise ca. 3 · 10&sup6; bis ca. 4 · 10&sup6; Zellen/15 ml/25 cm?.

Nach einer gewissen Proliferationsdauer und nach Erreichung einer sättigenden Zelldichte kann eine einzelne Kultur verlangsamte bzw. gestoppte Proliferation zeigen. Eine derartige "schlafende" Kultur kann zweckmäßig sein, wenn differenzierte Eigenschaften wie Reaktionen auf Secretogogues konserviert werden. Eine schlafende Kultur kann für den Biotest auf Gonadotropinpotenz, wie unten beschrieben, verwendet werden. Eine proliferierende Kultur kann aber auch in einem Gonadotropintest verwendet werden.

Durch wiederholte Seriensubkultur wird eine große Population ähnlicher Zellen erhalten (Stufe 11). Zweckmäßigerweise werden Anteile der Population in einem Kryokonservierungsmedium tiefgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert (Stufe 14) Die Vorgehensweise für das Tieffrieren von Zellen, wie in Beispiel 15 beschrieben, entspricht traditionellen Techniken sowie komplexeren Techniken, die gegenwärtig zum Tieffrieren von Embryonen verwendet werden. Aufgrund der erheblichen Größe bestimmter hormonsezernierender Zellen in Kultur, insbesondere von Hypophysenzellen (Fig. 8-10; Beispiel 13) ist es zweckmäßig, sich Gefriertechniken zu bedienen, die für die Verwendung im Zusammenhang mit Embryonen, die vergleichbar große Abmessungen besitzen, gedacht sind. Einfache und traditionelle Techniken können jedoch verwendet werden, wenn ein geringerer Prozentsatz an Lebensfähigkeit akzeptabel ist. Nach dem Auftauen können die Zellen die charakteristischen Proliferations- und Hormonsekretionsmuster der Population zeigen, aus denen sie gewonnen wurden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Zellpopulation vermehrt und kryokonserviert, um eine praktisch unbegrenzte Versorgung mit Zellen mit definierten Eigenschaften zu gewährleisten. Eine derartige gekennzeichnete und gelagerte Population wird bekanntlich als "etablierte Zelllinie" bezeichnet.

Während des Aufenthalts im Etablierungsmedium (Stufe 8) und in der Subkultur (Stufen 10 und 11) sind die Zellen zur Sekretion wenigstens eines menschlichen Hormons befähigt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sezernieren die Zellen bei Geschwindigkeiten, die für die Isolierung des Hormons (der Hormone) ausreichend ist.

Die Zellen einer konkreten Population brauchen kein hohes Ausgangsniveau an Steroidhormon zu sezernieren. Die Zellen reagieren jedoch auf die Stimulierung durch Gonadotropine mit nachweisbar erhöhter Sekretion an Steroidhormon. So z. B. stimuliert eine maximale Dosis an FSH einen 2- bis 20fachen Anstieg, vorzugsweise einen 4- bis 10fachen Anstieg und ganz besonders einen 5- bis 8fachen Anstieg der Menge an Steroidhormon, das in das Medium über einen Zeitraum von 24 bis 48 Stunden sezerniert wird. Vorzugsweise kann der Anstieg an Steroidsekretion mit der Dosis und der Art des den Zellen verabreichten Gonadotropins korrelieren und dadurch das Hormonsekretionsprofil der Population bestimmen. Der Ausdruck "Hormonsekretionsprofil" bedeutet (1) die konkreten Secretogogues, auf die die Zellen reagieren, (2) den Typ (die Typen) des Hormons (der Hormone) und (3) die Mengen an Hormonen, die in Reaktion auf ein konkretes Secretogogue sezerniert werden. Etablierte Zelllinien können als Biotests für die Biopotenz des Gonadotropins verwendet werden.

Außerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung können Zellen aus menschlichem Trophoblastgewebe und ganz besonders aus Gewebe nichttumoraler Provenienz gewonnen werden. Die Zellen werden in Kultur etabliert und dann, wie oben beschrieben und in Beispiel 12 illustriert, der Subkultivierung unterworfen. Trophoblastzellen sezernieren vorzugsweise hCG und andere Hormone. Populationen von Zellen nichttumoraler trophoblastischer Provenienz werden zweckmäßiigerweise in Biotests auf potentielle Vermehrungstoxine hin verwendet. Die Biotests beruhen auf der Verminderung bzw. Abänderung der Basissekretion an Geschlechtshormonen nach der Kontaktierung der Zellen mit einem potentiellen Toxin.

Außerhalb des Umfangs der Erfindung können aus menschlichem Endometrium Zellen gewonnen werden. Die Endometriumzellen werden in Kultur und Subkultur nach einem der oben beschriebenen Verfahren etabliert. Die Populationen der Endometriumzellen sezernieren vorzugsweise hohe Gehalte an Progestinen und/oder Östrogenen, so dass sie als Quellen für therapeutisch wertvolle Hormonpräparate in Frage kommen. Die Populationen der Endometriumzellen werden ebenfalls zweckmäßigerweise bei Biotests auf reproduktive Toxizität verwendet.

Außerhalb des Umfangs der Erfindung können Zellen aus einem menschlichen Hypophysentumor gewonnen werden. Die Zellen können in Kultur nach einem der oben beschriebenen Verfahren und wie in Beispiel 13 illustriert etabliert und vermehrt werden. Zweckmäßigerweise wird das Tumorgewebe zuerst in Stücke von ca. 1 bis 3 mm Durchmesser zerschnitten, wonach die einzelnen Stücke für 15 bis 20 Tage in das Etablierungsmedium gegeben werden. In dieser Zeit entwickeln die Zellen Auswüchse und trennen sich vom ursprünglichen Tumorstück ab (Fig. 8-10). Die Zellauswüchse werden als "blastemähnlich" bezeichnet, ein embryologischer Ausdruck für eine Zellgruppe, die Ausgangspunkt ist für die Entwicklung eines Organs. Die abgetrennten "blastemischen" Zeligruppen werden dann in einzelne Kulturen zur weiteren Vermehrung im definierten Medium verfrachtet. Die Hypophysenzellen sezernieren vorzugsweise wenigstens ein menschliches Gonadotropin wie FSH oder LH. Das menschliche FSH oder LH wird zweckmäßigerweise aus dem die Zellkulturen umgebenden Medium isoliert, um ein therapeutisch wertvolles Gonadotropinpräparat zu bilden.

Erfindungsgemäß werden Zellen aus normalem Pankreasgewebe gewonnen und in vitro entsprechend den oben beschriebenen Verfahren vermehrt. Zur Etablierung von Pankreaszellen in Kultur bedient man sich zweckmäßigerweise einer Variante des Etablierungsverfahrens. Das Gewebe kann unmittelbar in das Etablierungsmedium gegeben werden, wonach es mit Hilfe eines sterilen Skalpells in kleine Stücke zerteilt wird. Diese enthalten vorzugsweise ca. 50 bis 300 Zellen. Die Stücke werden dann in aliquoten Anteilen auf mehrere Petrischalen verteilt und mit dem oben beschriebenen medizinischen Blut-Gas-Gemisch beschickt. Sie werden in luftdicht verschlossenen Behältern ca. zwei Wochen gelagert, wobei das Gas alle zwei Tage erneuert wird. Die Zellen proliferieren während dieser Zeit. Nach zwei Wochen können die Zellkulturen unterteilt und für ca. 8 weitere Wochen in dem Etablierungsmedium gehalten werden. Die Kulturen können je nach Bedarf in Abhängigkeit von der Proliferationsgeschwindigkeit der Kulturen aufgeteilt werden. Das Medium jeder Kultur wird auf den Hormongehalt hin getestet. Zweckmäßigerweise sezernieren aus der Pankreas gewonnene Zellen Insulin. Den erwünschten Hormongehalt aufweisende Kulturen werden für die weitere Züchtung im definierten Medium ausgewählt (Fig. 1, Stufe 10). Ist eine Suspensionskultur erwünscht, können zweckmäßigerweise Zellen ausgewählt werden, die nicht auf den Oberflächen der Kulturgefäße haften, sondern im Medium suspendiert sind.

Pankreaszellen werden in einer Langzeitkultur während mindestens 5,5 Monate bis zu einem Jahr oder länger gehalten. Anteile der Pankreaszellkulturen werden in Intervallen entsprechend dem in Beispiel 17 beschriebenen Verfahren eingefroren. Werden diese dann aufgetaut und in ein definiertes Medium gegeben, behalten die Zellen ihre Fähigkeit bei, Insulin zu synthetisieren und zu sezernieren.

Der Ausdruck "Spiegel der Aufrechterhaltung der Insulinsekretion" bedeutet die Menge an in das definierte Kulturmedium sezerniertem Insulin. Bei der Züchtung von Pankreaszellen wird die Verwendung des Mediums DMSS bevorzugt, es kommt jedoch auch jedes andere oben beschriebene definierte Medium in Frage.

Vorzugsweise sezernieren die erfindungsgemäßen Pankreaszellen einen "Aufrechterhaltungsspiegel" von ca. 2 ìIU bis ca. 1000 ìIU nsulin/Stunde/10&sup5; Zellen/ml Kulturmedium. Insbesondere sezernieren die Zellen einen Aufrechterhaltungsspiegel von ca. 20 ìIU bis ca. 400 ìIU Insulin/Stunde/10&sup5; Zellen/ml Kulturmedium.

Wichtig ist, darauf hinzuweisen, dass die in einer Langzeitkultur gehaltenen erfindungsgemäßen Pankreaszellen die Fähigkeit besitzen, auf erhöhte Glucose- und Aminosäurekonzentrationen mit erhöhter Insulinsekretion zu reagieren. Die Pankreaszellen behalten diese Funktion in Dauerkultur ein Jahr lang oder länger bei.

Bei einem Nichtdiabetiker sind die β-Zellen in den Langerhans'schen Inseln gewöhnlich Blutglucosekonzentrationen in einem Bereich von ca. 3 mM bis ca. 8,8 mM ausgesetzt. Steigt die Blutglucosekonzentration auf über ca. 5 mM an, sezernieren die normalen β-Zellen die entsprechende Insulinmenge, um eine Normalisierung der Blutglucosekonzentration zurück auf einen Wert von 4,4-5,3 mM zu bewirken. Ein weiterer Faktor, welcher die Insulinsekretion beim gesunden Menschen beeinflusst, ist der Blutspiegel an Aminosäuren wie Alanin, Arginin und Leucin. Erhöhter Aminosäurespiegel kann die Insulinsekretion verstärken, so dass die Sekretion bei geringerem Glucosegehaltstimuliert wird. Somit reagieren normale β-Zellen äußerst empfindlich auf den Glucose- und Aminosäurespiegel, der nach einer Mahlzeit ansteigt und ihre Insulinsekretion ist genau darauf abgestimmt, dass die entsprechenden Spiegel wieder auf den Normalwert zurückkehren.

Demgegenüber sind Pankreaszellen von Diabetikern mit juvenilem Typ I-Diabetes nicht in der Lage, auf erhöhte Glucosespiegel mit Insulinsekretion zu reagieren. Wird nicht durch Zufuhr von außen entgegengesteuert, können die Blutglucosewerte eine Diabetikers Werte von 10 mM oder mehr erreichen, wobei bei diesen Werten Glucose über die Nieren verlorengeht, was zu einer Dehydratisierung und zu schweren Stoffwechselstörungen führt. Bei der klinischen Behandlung eines Erwachsenen mit Typ I-Diabetes wird Insulin in entsprechenden Zeitabständen und entsprechenden Mengen verabreicht, um die Blutglucosewerte zwischen 3,88 mM und 6,66 mM zu halten. Bei einem Kind mit Typ I-Diabetes gilt es im allgemeinen als sicherer, höhere Blutglucosewerte, d. h. 6,1 mM bis 9,43 mM aufrechtzuerhalten, da ein Kind unter Umständen zuviel Insulin erhält und nicht in der Lage ist, die Symptome zu bekommen, die mit gefährlich niedrigen Blutglucosewerten verbunden sind. Die Insulinzufuhr von außen ist natürlich ein unvollkommener Ersatz für die Funktion normaler Pankreas-β-Zellen, die ständig auf schwankende Glucosewerte mit entsprechender Insulinsekretion reagieren.

Die erfindungsgemäßen Kulturen menschlicher Pankreaszellen besitzen die Fähigkeit, dosisabhängig auf erhöhte Glucosewerte im Kulturmedium zu reagieren, wie dies in Fig. 11 dargestellt ist. Außerdem ist die in vitro-Reaktion dieser Zellen in einer Langzeitkultur mit der vergleichbar, die von normalen reifen menschlichen β-Zellen in Primärkulturen erwartet wird. Das Reaktionsvermögen dieser Zellen kann auf verschiedene Weise getestet werden.

Zu Beginn des Tests werden die Zellen in ein frisch definiertes Kulturmedium desselben Typs gegeben, in dem sie dann über längere Zeit gehalten werden. Das Langzeitkultur-Medium enthält vorzugsweise ca. 6,5 mM bis ca. 8,0 mM und insbesondere 7,4 +/- 0,3 mM Glucose. Der bevorzugte Glucosewert im Langzeitkultur- Medium ist vergleichbar mit dem oberen Ende des normalen Bereichs der Konzentration an menschlicher Blutglucose, so dass die Zellen weiterhin Insulin produzieren. Die in das definierte Medium sezernierte Insulinmenge wird wie oben beschrieben als "Aufrechterhaltungsspiegel" bezeichnet.

Die Zellen können aber auch zum Aufbau von Insulinspeichern in ihrem Inneren und zur Erhöhung ihres Reaktionsvermögens auf Glucose durch Inkubierung in einem "glucosearmen Medium" gewissermaßen im Hinblick auf die Glucose ausgehungert werden. Der Ausdruck "glucosearmes Medium" bedeutet ein Kulturmedium, das weniger an Glucose enthält als der normalen physiologischen Glucosekonzentration entspricht, d. h. gewöhnlich 0 bis ca. 2 mM Glucose. Die Zellen werden dabei ca. 0 bis ca. 16 Stunden, vorzugsweise ca. 2 Stunden in glucosearmem Medium vor dem Versuchstest auf Reaktion auf Glucose inkubiert.

Die Zellen werden dann in einen Bereich von Glucosekonzentrationen (gewöhnlich von ca. 0,5 mM bis ca. 33 mM Glucose) gebracht. Als Kontrolle werden mehrere Kulturen nicht der erhöhten Glucosekonzentration ausgesetzt, sondern in frisches "glucosearmes Medium" oder in das reguläre definierte Medium mit hoher normaler physiologischer Konzentration an Glucose (ca. 7,4 mM) gegeben. Danach werden zu verschiedenen Zeitpunkten Mediumproben entnommen, um sie auf den Insulingehalt zu testen. Die in das Kontrollmedium ohne zugesetzte Glucose, d. h. in das glucosearme oder definierte Medium sezernierte Insulinmenge wird als "Ausgangsniveau" der Insulinsekretion für den jeweiligen Test bezeichnet.

Bei Einwirken von ca. 1 mM bis ca. 6 mM Glucose sezernieren die Zellen ca. 1,2 bis ca. 2,5 mehr Insulin als dem Ausgangsniveau" entspricht. Bei Einwirken von ca. 6,1 mM bis ca. 17 mM Glucose sezernieren die Zellen ebenso vorzugsweise ca. 3 bis ca. 10 mal mehr Insulin als dem Ausgangsniveau entspricht. Im allgemeinen reagieren die erfindungsgemäßen Pankreaszellen maximal auf 11 bis 16,5 mM Glucose.

Dieses Glucosereaktionsmuster ist vergleichbar mit dem frisch entfernter menschlicher Insulinome, die in permselektive Makrokapseln eingeschlossen und in vitro perfundiert sind (Altman, J. J. et al., 1984, Trans. Am. Soc, Art. Organs 30: 382-386). Die verkapselten Insulinome sollen auf 5,5 mM Glucose (220 ìIU Insulin/sezernierter ml) und bis auf 16,5 mM Glucose (350 ìiU Insulin/szernierter ml) maximal reagieren.

Die Reaktion der Pankreaszellen auf Aminosäuren wird auf ähnliche Weise getestet. Die Zellen werden dabei in ein unterschiedliche Glucosekonzentrationen enthaltendes Medium gegeben. Einzelne Portionen der Kulturen werden einer Aminosäure wie Alanin oder Arginin in Konzentrationen von ca. 0,5 bis ca. 40 mM ausgesetzt. Nach einer Inkubationsdauer von ca. 0,5 bis ca. 24 Stunden und vorzugsweise nach 1,5 Stunden werden die Mediumproben auf ihren Insulingehalt hin getestet.

Die Pankreaszellen sezernieren bei einer Inkubierung in ca. 1 mM Glucose während 1,5 Stunden, vorzugsweise eine mittlere Insulinmenge. Werden 10 mM Alanin zusammen mit 1 mM Glucose zugesetzt, wird die Insulinsekretion ca. 1,13 mal stärker stimuliert als dem mittleren Sekretionsgrad entspricht. Werden 20 mM Arginin zusammen mit 1 mM Glucose zugesetzt, wird die Insulinsekretion ca. 1,4 mal stärker stimuliert als dem mittleren Sekretionsgrad entspricht. Ähnliche Wirkungen der Aminosäuren werden vorzugsweise auch bei 2 mM Glucose beobachtet. Diese Aminosäurereaktion ist vergleichbar mit der, die von normalen Pankreaszellen erwartet wird, bei der die Insulinsekretion durch Aminosäuren so verstärkt wird, dass bei niedrigeren Glucosekonzentrationen mehr Insulin sezerniert wird.

Diese Tests an menschlichen Pankreaszellen in einer Langzeitkultur zeigen, dass die erfindungsgemäßen Zellen bestimmte Eigenschaften normaler β-Zellen beibehalten und daher für die Diabetestherapie in Frage kommen.

Menschliches Insulin wird heute industriell unter Einsatz gentechnisch veränderter Bakterien produziert. Die erfindungsgemäßen Pankreaszellen können sich jedoch als wertvolle "Biofabriken" für die Erzeugung von menschlichem Insulin erweisen.

Wichtig ist, darauf hinzuweisen, dass die Zellen, da sie auf physiologisch relevante Änderungen in der Glucose- und Aminosäurekonzentration reagieren, für die Transplantation in Diabetiker in Frage kommen, um die Funktionen der geschädigten oder zerstörten β-Zellen zu übernehmen.

Die Zellen können verkapselt werden und die erhaltenen Kapseln können in den Patienten implantiert werden. Die Kapseln sind porös und ermöglichen auf diese Weise, dass die Glucose aus dem Blutstrom die Zellen erreicht und diese Insulin dezernieren, das dann aus der Kapsel herausdiffundiert und sich über den Blutstrom verbreitet. Es wird erwartet, dass die Zellen auf Änderungen in der Glucosekonzentration des Patientenblutes auf ähnliche Weise reagieren, wie sie dies bei Änderungen der Glucosekonzentration in vitro tun. Es ist damit zu rechnen, dass die Insulinsekretion der Zellen den Glucosegehalt des Patientenblutes normalisiert, wonach die Zellen dann ihre Insulinsekretion entsprechend herabsetzen.

Für einen Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet der Zellzüchtung ist es einsichtig, dass Einzelzell-Subklonkulturen aus den erfindungsgemäßen Zellkulturen etabliert werden können. Der Vorteil von Einzelzell-Subklonkulturen kann darin bestehen, dass von den Zellen einer konkreten Kultur, die von einer einzigen Zelle abstammen, erwartet werden kann, dass sie in ihren Eigenschaften homogen sind. Es können dann zahlreiche Subklonkulturen auf verschiedene erwünschte Eigenschaften wie die Proliferationsrate und das Reaktionsvermögen auf Glucose einem Screening unterworfen werden. Für jeden geplanten Zweck, wie z. B. die Implantation in Form von Kapseln, kann dann eine optimale Kultur ausgewählt werden.

Für einen Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet ist selbstverständlich, dass die hier bereitgestellten Verfahren auf viele weitere Zelltypen wie Brustdrüsenzellen, die gewöhnlich in Kulturen schwierig zu etablieren und zu vermehren sind, angewandt werden können.

Die nachfolgenden Versuchsbeispiele illustrieren die Ausführung der Erfindung, wobei die Beispiele 1 bis 15 und der Teil in Beispiel 16, der das Schilddrüsengewebe betrifft, außerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung liegen.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel betrifft ein Verfahren zur Etablierung menschlicher Granulosazellen in Kultur unter Verwendung eines Spenderserums im Etablierungsmedium.

Zellquelle: Die Zellen in diesem Beispiel wurden aus Follikelzellen gewonnen, welche mit Eizellen verbunden waren, die Patientinnen entnommen worden waren, die sich einer in vitro- Fertilisation unterzogen hatten.

Spenderserum: Jeder Zellspenderin wurde 24 Stunden vor der Eizellenentnahme Blut entnommen und sorgfältig zur Gerinnung gebracht. Das geronnene Blut wurde dann bei 2700 U/min 10 min lang zentrifugiert. Das klare Serum wurde dann sorgfältig entfernt und in ein steriles Falcon-Röhrchen gegeben und zur Entfernung der restlichen Erythrozyten erneut zentrifugiert. Das Serum wurde lediglich dann verwendet, wenn keine Anzeichen von Hämolyse mehr festzustellen waren. Anschließend wurde das Serum entfernt, in ein anderes steriles Falcon-Röhrchen gegeben und bei 57EC 30 min hitzeinaktiviert. Das hitzeinaktivierte Serum wurde mit Hilfe eines 0,20 ìm-Nalgene-Filters filtriert und in einem sterilen Falcon-Teströhrchen gesammelt, wonach es zur Herstellung von BDM und EM verwendet wurde.

Die Formulierungen für BDM und EM beruhten auf der Ausgangsformulierung des Basalmediums "IVF Ham's F-10", das wie folgt synthetisiert wurde:

IVF Ham's F-10 : 1000 ml Ham's F-10 mit L-Glutamin (GIBCO) wurden mit 0,9 g NaHCO&sub3;, 0,075 g Penicillin, 0,075 g Streptomycin und 0,245 g Ca-Lactat versetzt. Die Osmolarität wurde auf einen Bereich von 280 bis 285 mOsm mit Zellkulturwasser (Typ 1- Wasser, 18 Megaohm-Wasser, GIBCO oder M. A. Bio) eingestellt. Das Medium wurde dann mit zwei 500 ml, 0,20 im Nalgene Filtereinheiten steril filtriert. Der pH betrug 7,7.

IVF Ham's F-10 wurde als Basis für die unten beschriebenen Medien, und zwar für das sogenannte Blastocyten-Entwicklungsmedium (BDM) und das Etablierungsmedium (EM) sowie für die Mediumformulierungen in Beispiel 2 (DM-1) und in Beispiel 5 (EM-01) verwendet.

Blastocyten-Entwicklungsmedium (BDM): 1,5 ml hitzeinaktiviertes (37EC, 30 min) Spenderserum wurden 8,5 ml IVF Ham's F-10 zugesetzt. Der pH betrug 7,35 +/- 0,6. Das Medium wurde dann mit zwei 0,20 im Nalgene Filter-Einheiten steril filtriert.

Etablierungsmedium (EM): 1,5 ml des Spenderserums wurden 18,5 ml IVF Ham's F-10 zugesetzt. Der pH betrug 7,2 bis 7,45. Das Medium wurde dann mit zwei 0,20 im Nalgene Filter-Einheiten steril filtriert.

Ölschalen: Jede Ölschale wurde dadurch hergestellt, dass man 12 ml gegen IVF Ham's F-10 äquilibriertes Mineralöl ca. 16 Stunden auf dem Boden einer Nunculon-Züchtungschale (ohne Nunculon- Deckel) gab. Unter die Ölschicht wurde dann sorgfältig eine Blase aus EM oder BDM in einer Menge von ca. 0,4 bis 0,5 cm³ gegeben, die über Nacht mit 5% CO&sub2;/5% N&sub2;/90% O&sub2; bei 37EC äquilibriert worden war. Jede Ölschale hatte 6 Blasen EM oder BDM. Die Schicht aus äquilibriertem Öl schützte vor rascher pH- Änderung in den Blasen.

Zellspenderinnen: Alle Spenderinnen waren Patientinnen, die sich für in vitro-Fertilisation entschieden hatten und freiwillig Follikelzellen spendeten, die zusammen mit den Eizellen abgesaugt wurden, welche sonst nach der in vitro-Fertilisation verworfen worden wären. Vor der Entnahme der Eizelle wurden die Patientinnen im Alter zwischen 22 und 43 Jahren einer kombinierten Hormonbehandlung unterzogen, um die Entwicklung von vielfachen Follikeln zu stimulieren. Die Behandlung umfasste gewöhnlich Leuprolidacetat für die mittlere Lutealsuppression (in Kombination mit menschlichem Menopausehormon (hMG) und follikelstimulierendem Hormon (FSH) für die gesteuerte Hyperstimulierung von Eizellen. Zur Überwachung des Gehalts an Östradiol und Progesteron des Serums bediente man sich Radioimmuntests (RIA). Zur Feststellung der Zahl der wachsenden Follikel und ihrer Größe bediente man sich des Ultraschallscannings. Vierunddreißig Stunden (+/- 1 Stunde) vor der Extraktion der Oocyten wurden 10.000 IU menschliches Choriongonadotropin (hCG) verabreicht. Während der transvaginalen Oocytenextraktion wurde der Follikelinhalt abgesaugt, wonach die Follikel bei 37EC mit Dulbecco-Lösung benetzt wurden. Die in Lösung befindlichen Follikel wurden dann in sterilen 15 cm³ Einweg-Falcon-Teströhrchen gesammelt und unmittelbar danach in ein embryologisches Labor gebracht. Es muss darauf hingewiesen werden, dass in embryologischen Labors keine Parfums zugelassen sind, da festgestellt wurde, dass die Dämpfe bestimmter Parfums die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen.

Die Oocytenkomplexe wurden identifiziert und dann in 5 cm³ warmes etablierendes Medium (EM) enthaltende, Vertiefungen aufweisende Falcon-Kulturschalen (Nr. 3007) transferiert. Ein bis 3 Oocytenkomplexe wurden dann in jede Sammelschale gegeben. Ein Oocytenkomplex umfasst die Oocyte, die umgebende Zona pellucida, die Zona radiatas, die Cumuluszellen und die anhaftenden Follikelkomponenten. Die zeitliche Begrenzung für den Transfer betrug 90 Sekunden, um Änderungen des pH und Temperaturschwankungen auf ein Minimum zu reduzieren. Die Sammelschale wurde dann unmittelbar mit dem gespaltenen Deckel in einen 37EC-Inkubator, der 5% CO&sub2; (für medizinische Zwecke) enthielt, gegeben.

Nach ca. 5 bis ca. 30 Minuten wurden die Oocytenkomplexe in EM- Blasen auf eine Ölschale transferiert. Im allgemeinen wurden 1 bis 3 Oocytenkomplexe in eine einzige EM-Blase gegeben. Während dieser Prozedur blieb die EM-Schale nicht länger als 7 Minuten außerhalb des Inkubators. Die Ölschale wurde dann in einen betriebssicheren Behälter gegeben, der mit einem filtrierten medizinischen Gemisch aus 5% CO&sub2;/5% O&sub2;/90 N&sub2; begast worden war, dann luftdicht verschlossen und schließlich in einen Inkubator (5% CO&sub2;) bei 37EC für 4 bis 5,5 Stunden gegeben.

Die Eizelle wurde dann durch Zugabe eines Tropfens einer Endspermiensuspension zu jeder EM-Blase inseminiert. Die Menge an zugesetztem Sperma war so eingestellt, dass sich eine Endkonzentration von ca. 50 bis 60 Millionen Spermatozon pro ml in jeder EM-Blase ergab. Die Ölschale wurde dann über Nacht wie oben beschrieben inkubiert. Am folgenden Morgen ergab dann die Prüfung der EM-Blasen die Anwesenheit von zwei Klassen von Zellen:

1) einzelne Zellen im EM und

2) Zellen der Zona radiata, die eng mit der Eizelle verbunden waren.

Zu diesem Zeitpunkt wurden ca. 50 bis 52 Stunden nach der Eizellenextraktion Nicht-Keimbahn-Zellen für die weitere Züchtung selektiert.

(a) Selektion aus Einzelzellen nach 50 Stunden in EM:

Die Eizelle wurde aus dem EM abgesaugt und entsprechend den üblichen IVF-Methoden inkubiert. Nicht-Keimbahn-Zellen wurden für die Züchtungszwecke aus Zellen ausgewählt, die eine Monoschichtausbreitung auf dem Boden der Schale zeigten. Zellen mit anhaftenden Blutkoagulat wurden vermieden. Die ausgewählten Zellen wurden dann in frische EM-Blasen in einer frisch äquilibrierten Ölschale gegeben. Der Transfer erfolgte unter vorsichtigem Abkratzen, um die Follikelzellen von der Kulturschale zu lösen. Die sterile Borsilikatpipette für den Transfer war mit Ham's F-10 vorbeschichtet worden. Für diese Kulturen wurden Nunculon-Kulturschalen (SECO, Rolling Hills, PA) verwendet, und zwar lediglich deren Böden. Zwanzig bis 50 ausgewählte Zellen wurden dann in jede EM-Blase gegeben. (i) Diese Kulturen wurden dann in betriebssichere Behälter gegeben und mit einem Gemisch aus 5% CO&sub2;/5% O&sub2;/90% N&sub2; beschickt. Danach wurden die Behälter verschlossen und für 3 Tage in einen Inkubator mit 5% CO&sub2; gegeben. (ii) Die Zellen wurden dann in Falcon-Schalen (Vertiefungen Nr. 3007) mit 6 ml EM gegeben und mit Mineralöl überschichtet, das mit IVF Ham's F-10 äquilibriert worden war. Jede Vertiefung der Kulturschale wurde mit 50 bis 100 Zellen beimpft und dann unter den obigen Bedingungen 30 Tage lang gehalten. Während der 30-tägigen Etablierung wurden die Kulturen alle 5 bis 6 Tage mit 1 ml frisches EM gespeist, d. h. in einer 6 ml enthaltenden Vertiefung wurde 1 ml entfernt und ersetzt. Nach zwei Wochen zeigte sich bei bestimmten Kulturen, dass sich die Zellen bis zu dem Punkt, bei dem eine Subkultur erforderlich war, vermehrt hatten, d. h. die Zahl der Zellen war auf das 3- bis 4fache angestiegen. Die Zellen wurden dann vorsichtig vom Boden der Schale abgekratzt und kleine Gruppen von Zellen wurden dann in EM enthaltende neue Kulturschalen wie oben beschrieben verfrachtet.

(b) Auswahl aus Zellen, die nach 50 bis 52 Stunden in EM der Eizelle anhafteten:

Die Eizelle wurde zusammen mit den einen Komplex bildenden Zona radiata-Zellen sorgfältig auf die BDM-Blasen in einer BDM- Ölschale transferiert. Anschließend wurden die anhaftenden Zona radiate-Zellen manuell von der Eizelle dadurch entfernt, dass man diese und die anhaftenden Zellen in die Öffnung einer 27? Gauge-Injektionsnadel vorsichtig ansaugte und dann ebenso vorsichtig die Eizelle nach außen drückte. Dadurch wurden die anhaftenden Zona radiata-Zellen von der die Eizelle umgebenden glatteren Membran, der Zona pellucida, entfernt. (Die entfernte Eizelle wurde dann inkubiert und für die Implantation bzw. Kryokonservierung nach den üblichen in vitro- Fertilisationsmethoden vorbereitet). Unter den entfernten Zona radiata-Zellen in BDM wurden Zellen entsprechend den obigen Kriterien ausgewählt und in Kultur, wie in 1 (a) (i, ii) beschrieben, etabliert.

Nach einer Gesamtdauer von 30 Tagen in EM-Kultur wurden, wie unten in Beispiel 2 beschrieben, die Zellen einer Subkultivierung unterworfen.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Aufrechterhaltung und Vermehrung von hormonsezernierdenden Zellen in einer Langzeitkultur.

Nach Abschluss der anfänglichen 30 Tage für die Etablierungskultur (Beispiel 1) wurde mit der Subkulturselektion begonnen. Die anfänglichen Subkulturen (SC-1) aus kleinen Zellgruppen wurden manuell ausgewählt. Die Zellselektion erfolgte unter Phasenoptik entsprechend den in Fig. 2, 3 und 4 illustrierten Auswahlkriterien. Die kreisförmigen Zellklumpen sind repräsentativ für den Typ von Zellklumpen, die ausgewählt wurden, weil von ihnen besonders angenommen werden kann, dass sie über hormonsezernierendes Potential verfügen. Es wurden kleine Klumpen von 2 bis 12 Zellen und insbesondere von 4 bis 5 Zellen ausgewählt. Gewöhnlich waren die Zellen in den ausgewählten Klumpen halblinear angeordnet, d. h. sie berührten einander nach Art einer "Perlenkette" Die ausgewählten Zellen waren annähernd kugel- oder eiförmig und annähernd homogen in Größe und Form. Die ausgewählten Zellen hatten gewöhnlich eine glatt erscheinende Membran und ein glatt erscheinendes und nicht so sehr granuläres Plasma.

War es erwünscht, den Hormongehalt innerhalb kurzer Zeit festzustellen, wurden die ausgewählten Klumpen zu Kulturen aus jeweils 50 bis 150 Zellen gruppiert, die als SC-1 bezeichnet wurden, wobei ein Medium, zusammengesetzt aus 40 cm³ IVF Ham's F-10 + 0,25 gm BSA in Gewebekultur-Vertiefungen vom Typ Falcon Nr. 3037 ohne Ölüberschichtung verwendet wurde. Jede Kultur wurde dann in eine einzelne 5 ml Medium enthaltende Vertiefungen gegeben, wonach die Kulturen mit einem medizinischen Blut-Gas-Gemisch (s.o.) beschickt und dann in einen hermetisch verschlossenen Behälter in einem Inkubator bei 37EC gegeben wurden. Die Kulturen wurden in diesem Medium 3 Tage gehalten, wonach der Hormongehalt des Mediums festgestellt wurde.

Ausgewählte Klumpen konnten aber auch zu kleineren Ausgangssubkulturen von jeweils 10 bis 15 Zellen, ebenfalls als SC-1 bezeichnet, gruppiert werden. Diese Gruppen wurden dann in ein definiertes Medium (DM-1) gegeben, das wie folgt formuliert wurde.

Definiertes Medium-1 (DM-1): 100 ml IVF Ham's F-10 (siehe Beispiel 1) wurden mit 100 ml Nährstoff Ham's F-12, Hepes und mit Natriumbicarbonat abgepuffert und mit Glutamin supplementiert (7,35 mM Glutamin, Sigma) + 30 ml Gewebekulturwasser (Sigma), 7,2 g Zellkultur getestetes BSA (Fraktion V, Sigma), 1500 IU Penicillin-G und 1,5 mg Streptomycin gemischt. Das Medium wurde über Nacht bei 37EC vor Gebrauch in 5%iger CO&sub2;- Atmosphäre äquilibriert. Die Endosmolarität betrug 272 +/- 1 mOsm. Der pH wurde auf 7,65 eingestellt. Das Medium wurde mit einer 0,45 im und einer 0,20 im Nalgene-Filtereinheit steril filtriert.

Diese Subkulturen wurden 14 bis 15 Tage lang in DM-1 gezüchtet, wobei das Medium alle 5 bis 6 Tage aufgefrischt wurde. Innerhalb dieses Zeitraums stieg die Zellzahl gewöhnlich auf das ca. 10- bis 30fache an. Es wurde gefunden, dass SC-1-Kulturen, die aus lediglich 10 bis 15 Ausgangszellen etabliert worden waren, ebenfalls Hormone sezernierten, die schon innerhalb von wenigen Tagen durch Radioimmuntest nachweisbar waren.

Nach ca. 15 Tagen wurde jede SC-1-Kultur in ca. 4 bis 6 Zweitsubkulturen (SC-2) aufgeteilt.

Die Zellen in SC-2- wurden vermehrt und wie oben angegeben mehr als 20 mal einer Subkultivierung unterworfen. In regelmäßigen Abständen wurde von jeder Subkultur das Medium gesammelt und auf die Anwesenheit von sezerniertem Östradiol (E&sub2;), Progesteron, luteinisierendem Hormon (LH), Follikelstimulierungshormon (FSH), thyreotropes Hormon (TSH), Prolactin, Testosteron und die β-Kette des humanen Choriongonadotropins (B-hCG) getestet. Man bediente sich dabei quantitativer Radioimmuntests (RIA) wie in Radioassay Systems in Clinical Endocrinology, 1981, Ed. G. E. Abraham, {Basel: Marcel Dekker}, SS. 475-529 beschrieben. Progesteron, Testosteron, Östradiol, Prolactin, TSH und LH wurden nach dem Coat-a-Count-Verfahren getestet (Diagnostic Products Corp., Los Angeles). FSH und BhCG wurden durch das SERONO MATAclone-Verfahren (Serone, Italien) getestet.

Die Ergebnisse der Sektretionstests an den verschiedenen Kulturen nach aber 4 Monaten in kontinuierlicher Seriensubkultur sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

TABELLE 1

Schlussfolgerungen:

Nach diesem Verfahren wurden menschliche Follikelzellen in Kultur vermehrt und auf Seriensubkulturen transferiert, die sich dann weiter vermehrten und Hormone sezernierten. Gewöhnlich sezernierten nach über 4 Monaten in kontinuierlicher Subkultur mehrere Zellkulturen mäßige bis hohe Mengen an Östrogen, Progesteron und FSH. Wurden 100 mg/ml Testosteron (Sigma T-5641) zugesetzt, um ein erforderliches Substrat für die Steroidproduktion bereitzustellen, sezernierten diese Subkulturen weiterhin 16 Monate nach dem ersten Einbringen derselben in die Kultur Hormone.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel illustriert den Grad der Zellvermehrung in Kulturen hormonsezernierender Zellen.

Zellzählmethoden: Für die Beimpfung mit den primären Ausgangskulturen wie in Beispiel 1 und den ersten Subkulturen wie in Beispiel 2 wurde die Zellzahl durch unmittelbares Zählen mit Hilfe eines Umkehrphasenmikroskops bei der Auswahl der Zellen festgestellt. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beimpfung wurde die Zellzahl durch Zählen und Mittlung der in einer Vielzahl von Tropfen enthaltenen Zellen in einer Zählkammer nach Makler (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel) festgestellt. Diese hat einen Raster von 0,01 mm? · 0,01 mm Tiefe.

Repräsentative Proben von Zellkonzentrationen wurden entweder unmittelbar aus Suspensionskulturen oder aus Zellpopulationen gewonnen, die vom Substrat gelöst worden waren.

Ergebnisse: Während der ersten sechs Tage in der ersten Subkultur (SC-1) stieg die Zellzahl gewöhnlich auf das ca. 3fache an. Typische SC-1-Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

TABELLE 2

während des letzten Teils der SC-1 und während der darauffolgenden Subkulturen stieg die Zellproliferationsrate gewöhnlich an, bis es nach ca. drei Tagen zu einer Verdoppelung kam.

Wie aus Tabelle 1, Beispiel 2, hervorgeht, produzierten die Zellen auch während der Tage, an denen sie sich vermehrten, Hormone.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel beschreibt die Etablierung von Follikelzelllen in Kultur unter Einsatz von nichthomologem menschlichem Serum.

Follikelzellen von drei verschiedenen Zellspenderinnen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, in Kultur etabliert, nur dass die Zellen unmittelbar in DEM und nicht in EM gegeben wurden, wonach sie in diesem Medium 7 Tage gehalten wurden. Anschließend wurden die Zellen in ein zweites Medium (DM oder EM) transferiert, das anstelle von Zellspenderserum Serum einer anderen Person enthielt. Die Serumspenderinnen waren Frauen, die an dem IVF-Programm teilnahmen und der oben beschriebenen Hormonvorbehandlung unterzogen worden waren. Das Hormonprofil für das Spenderserum "A" lag innerhalb des normalen Bereichs für Frauen, die sich einer solchen Hormonvorbehandlung unterziehen. Das Hormonprofil für das Spenderserum "B" lag innerhalb des "hyperstimulierten" Bereichs. Die Hyperstimulierung, zu der es aus unbekannten Gründen bei bestimmten Patientinnen, die sich der regulären IVF-Hormonvorbehandlung unterziehen, kommt, ist gekennzeichnet durch hohe Östrogenspiegel und einen Anstieg des Progesteronspiegels auf ca. 1,0 ng/ml im Serum. Die Zellen wurden in DM oder EM (nichthomologes Serum) 2 bis 3 Wochen gehalten, wonach aus ihnen, wie in Beispiel 2 beschrieben, Subkulturen hergestellt wurden.

Ergebnisse: Die Follikelzellen wurden erfolgreich in Kultur etabliert und sezernierten Hormone, wie Tabelle 3 zeigt.

TABELLE 3

Schlussfolgerungen: In EM enthaltendem nichthomologem Serum können Zellen etabliert werden, nur wird der Spiegel der Hormonsekretion durch den Östrogenspiegel sowie durch den Progesteronspiegel im Serum beeinflusst.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Etablierung, Aufrechterhaltung und Vermehrung von hormonsezernierenden Zellen in einem Kulturmedium, das kein Serum enthält.

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden Follikelzellen gewonnen. Das Serum der Patientin enthielt eine signifikante Menge an Antisperma-Antikörper (über 20% des Gesamt-IgG war Antisperma). Zur Optimierung der Insemination der Eizellen dieser Patientin wurde in keines der während der IVF-Behandlung verwendeten Medien Spenderserum aufgenommen.

Die Follikelzellen wurden gewonnen, ausgewählt und in Kultur wie in Beispiel 1 etabliert, nur dass anstelle von Spenderserum enthaltendem Medium (GM und EM) BSA supplementiertes Medium (EM-1) verwendet wurde. EM-1 bestand dabei aus IVF Ham's F-10 (s. Beispiel 1) + BSA (Fraktion V, Sigma), zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von 0,5% bis 1,0%. Die Osmolarität des EM-1 betrug 273 mOsm und der pH 7,41.

Die etablierten Follikelzellen wurden gehalten, zur Gewinnung von Subkulturen verwendet und in Kultur, wie in Beispiel 2 beschrieben, vermehrt.

Ergebnisse: Unter diesen Bedingungen proliferierten die Zellen und sezernierten erfolgreich Hormone, wie in Tabelle 4 gezeigt. Die Ergebnisse in Tabelle 4 wurden während der siebenten bzw. achten Subkultur (SC-7 und SC-8) erzielt. Eine Kontrollkultur 100B-5-OR-04 wurde im Medium mit Spenderserum (EM) etabliert. Auch wurden 100B-5-OR-01 und 100B-5-OR-02 im Medium ohne Serum (DM) etabliert.

TABELLE 4

Keine Kultur sezernierte eine nachweisbare Menge an Gonadotropinen, FSH, LH bzw. β-hCG.

Schlussfolgerungen: Die Zellen die zuerst in DM etabliert werden, zeigen eine Proliferationsrate, die mit der von Zellen vergleichbar ist, die zuerst in EM etabliert wurden. Die in DM etablierten Zellen zeigen jedoch verminderte Basissteroidhormonproduktion selbst nach 7 oder 8 Zyklen der Seriensubkultur. In DM etablierte Zellen sind daher von Vorteil für Tests wie Gonadotropin-Biotests, die durch niedrige Basissteroidsekretion begünstigt werden.

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel beschreibt die Aufrechterhaltung und Vermehrung eines einen Serumersatz (DMSS) enthaltenden definierten Mediums.

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden Follikelzellen in Kultur etabliert. Danach wurden wie in Beispiel 2 beschrieben, daraus Subkulturen hergestellt, nur dass die Menge an BSA, verglichen mit dem definierten Kulturmedium (DM-1) vermindert war und ein Serumersatz [Seru-Max, Lot Nr. 107-F-4607, Sigma] zugesetzt wurde. Seru-Max enthält unter anderen Komponenten Wachstumsfaktoren wie Rinderfibroblast-Wachstumsfaktor, Mäuseepidermis-Wachstumsfaktor und Rinderinsulin sowie Ethanolamin, Selen, Transferrin und Hydrocortison. Von der Firma Sigma ist eine Analyse der obigen Partie-Nummer von Seru-Max erhältlich. Diese Mediumformulierung (DMSS) stellt ein definierteres Medium als DM dar, da ein Teil des BSA durch ein definierteres Supplement (Seru-Max) ersetzt ist. Die Formulierung von DMSS ist nachfolgend angegeben:

Definiertes Medium-Serum-Ersatz (DMSS):

100 ml Ham's Nährmedium F-12, HEPES und mit Natriumbicarbonat abgepuffert wurden mit 5 ml L-Glutamin-Supplement versetzt, um den Glutaminspiegel auf insgesamt 7,35 mM ansteigen zu lassen (Sigma), dazu 17 ml Zellkultur getestetes destilliertes Wasser (Sigma) sowie 0,25 g Zellkultur getestetes BSA (Fraktion V, Sigma), 2,5 mM Na-Pyruvat. 1500 IU Penicillin-G, 1,5 mg Streptomycin und 10% Seru-Max (Sigma). Die Analyse der Partie-Nr. 107F-4607 von Seru-Max ist von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, MO erhältlich. Die Endosomolarität betrug 272 +/- 1 mOsm. Der pH wurde auf 7,65 eingestellt. Das Endvolumen (136 ml) wurde mit zwei 0,20 im Nalgen-Filtereinheiten sterilfiltriert.

Ergebnisse: Die Zellproliferation in DMSS verlief vergleichsweise wie die der Kontrollzellkulturen, die mit DM-1 gewachsen waren. Die Prolactinsynthese war leicht, aber nicht signifikant angestiegen (0,4% in Reaktion auf das Seru-Max). Der Synthesespiegel für Progesteron und Östradiol hatte sich, verglichen mit den DM-1-Kontrollen nicht geändert. Wurden im Gegensatz dazu 10% bzw. 15% fötales Kalbsserum (FCS) anstelle von Seru- Max verwendet, war der Hormongehalt der Kulturen fast null und die Zellproliferation verlief erheblich langsamer (keine Ergeb- nisse angeführt).

Schlussfolgerungen: Die Verwendung von definiertem Medium mit Serumsupplement ist vorteilhaft gegenüber der Verwendung von mit FCS supplementiertem Serum für die Vermehrung von humanen hormonsezernierenden Zellen und für die Aufrechterhaltung des Hormonsekretionspotentials.

BEISPIEL 7

Dieses Beispiel beschreibt die Etablierung, Aufrechterhaltung und Vermehrung von Follikelzellen in Kultur, die nicht dem Sperma ausgesetzt waren.

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden von Patientinnen, die vor der Oocytenentnahme ausgewählt worden waren, weil sie nur eine konkrete Zahl von gewonnenen Oocyten befruchtet hatten, Follikelzellen entnommen. Diese Situation ermöglichte die Auswahl von Follikelzellen, die wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt wurden, nur dass sie nicht dem Sperma ausgesetzt waren.

Wie in Beispiel 1(a) beschrieben, wurden unter einzelnen Zellen in EM-Blasen Zellen ausgewählt (es erwies sich als unpraktisch, die die Eizelle umgebenden Zellen wie in Beispiel 1(b) angegeben, zu gewinnen, und zwar möglicherweise deshalb, weil die Einwirkung des Spermas erforderlich ist, um die Zellen aus der Zona radiata zu lösen). Nach diesem Verfahren wurden weniger Zellen gewonnen als in Beispiel 1, doch waren die Kulturen erfolgreich. Die anfängliche Zellzählung ergab eine Gewinnung von lediglich 12 bis 27 Zellen pro EM-Blase mit 3 Komplexen pro Blase. Dies stand im Gegensatz zu den Komplexen, denen eine Spermasuspension zugefügt worden war (bei derselben Zellspenderin), wobei die anfängliche Gewinnung von Zellen aus jeder EM- Blase für eine Primärkultur 131 bis 198 Zellen betrug. Die nicht mit Sperma behandelten Kulturen ließen sich gegebenenfalls etablieren, allerdings waren für eine zufriedenstellende Etablierung der Zellkultur zusätzliche 1,5 bis 2 Wochen erforderlich. Die nicht mit Sperma behandelten Kulturen wurden ca. 5 Wochen gehalten. Während dieser Zeit war ihr Hormonsekretionsprofil vergleichbar mit dem in Tabelle 1 für die dem Sperma ausgesetzten Kulturen.

BEISPIEL 8

Dieses Beispiel beschreibt Zellen, die in Kultur gehalten wurden, welche auf die Stimulierung durch Gonadotropin und cAMP mit erhöhter Hormonsekretion reagierten.

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden die Linien 100B-OR-5A, 100B5-OR-B und 100B5-OR-D von Eifollikelzellen in Kultur etabliert, gehalten und dann Wie in Beispiel 2 beschrieben, zur Bildung von Subkulturen gezüchtet. Aus diesen Linien wurden die mit 1, 2 bzw. 3 bezeichneten Subkulturen gewonnen, die nach dem unten beschriebenen Stimulierungsprogramm eingesetzt wurden.

(a) Gonadotropinstimulierung: Humanes Choriongonadotropin (hCG; Sigma) wurde dem Kulturmedium (DM-1) in einer Menge von 750 ng/ml zugesetzt. Nach 70 bis 76 Stunden war der Progesterongehalt des Mediums auf ca. das Doppelte gegenüber der Kontrolle angestiegen. Die Östradiolsynthese wurde durch hCG ebenfalls stimuliert, was zu einem erhöhten Östradiolgehalt führte, der innerhalb von 30 Stunden den Kontrollgehalt um das 0,4- bis 0,5fache überstieg. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst:

TABELLE 5

(b) cAMP-Stimulierung: Man ließ auf Kulturen 1 mM 8-Br-cAMP (Sigma) oder FSH (1 IU/min. Metrodin [Urofollitropin], Partie- Nr.: 07321070, Serono, Italien) einwirken. Wie Tabelle 6 zeigt, stieg der Progesterongehalt in den Kulturen in Reaktion auf eine 24-stündige cAMP-Stimulierung auf das 5- bis 11fache an. Die FSH-Stimulierung führte im Verlauf von 48 Stunden zu einem Anstieg des Progesterongehalts um das 6,5- bis 7,7fache.

TABELLE 6

Schlussfolgerungen: Die Follikelzellen in Kultur reagierten auf die Stimulierung durch Gonadotropin auf ähnliche Weise wie ihre in vivo-Entsprechungen, d. h. die Granulosazellen. Dies zeigt, dass die in vitro vermehrten Follikelzellen eine differenzierte Eigenschaft der Granulosazellen exprimieren und daher für Biotests auf Gonadotropinpotenz sowie auf chemische Toxizität verwendet werden können.

BEISPIEL 9

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Testen der Potenz eines Präparats aus Gonadotropin.

Einer Spenderin wurden Follikelzellen entnommen, die einer den Eierstock stimulierenden Hormonbehandlung ohne hCG unterzogen worden waren. Die Follikelzellen waren daher vor der Auswahl für die Kultur keinem hohen Gonadotropinspiegel ausgesetzt und sezernierten einen hohen Basisspiegel an Progesteron.

Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 in Kultur etabliert und wie in Beispiel 2 und 6 in Kultur vermehrt. Die Menge an von diesen Zellen in ein Kulturmedium ohne Gonadotropin sezerniertem Progesteron war typischerweise nicht nachweisbar, es wurde jedoch eine erhebliche Menge an Östradiol synthetisiert.

Das für den Biotest zu verwendende Gonadotropin (z. B. handelsübliche FSH-Präparate) wird der Zellkultur zugesetzt. Nach einer Einwirkdauer von ca. 24, 48 und 72 Stunden wurde der Hormongehalt im Kulturmedium gemessen und mit der Kontrolle verglichen. Die Potenz des Gonadotropins bei diesem in vitro-Biotest wird zuerst mit den durch Hochgeschwindigkeit-Flüssigkeitschromatographie (HPLC; Stone, B. A., et al., 1990, siehe oben) ermittelten FSH-Werten in Beziehung gesetzt. Bei der nachfolgeden Verwendung beim Biotest wurde die relative Potenz eines Gonadotropinpräparats durch Anpassen der numerischen Biotestwerte an die Standardkuven ermittelt, die durch Vergleich der Biotestwerte mit den HPLC-Werten erhalten wurden.

BEISPIEL 10

Dieses Beispiel beschreibt einen in vitro-Biotest auf die potentielle Toxizität von Arzneimitteln und anderen chemischen Verbindungen.

Eifollikelzellen wurden wie in Beispiel 1 in Kultur etabliert, gehalten und wie in Beispiel 2 beschrieben zur Gewinnung von Subkulturen verwendet. Die Subkulturen sezernierten Progesteron und Östrogen in einer Menge, die mit der in Tabelle 1 vergleichbar ist.

Zum Nachweis der potentiellen Toxizität eines Arzneimittels wurden die Zellen mit diesem sowie mit einer als nichttoxisch bekannten Kontrollverbindung in Berührung gebracht. Die mit einer nichttoxischen Verbindung in Berührung gebrachten Zellen sezernierten weiterhin den Basisspiegel von Steroidhormonen. Ist das getestete Arzneimittel toxisch, vermindert sich verglichen mit der Kontrolle der Spiegel der Hormonsekretion.

BEISPIEL 11

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Etablierung und Vermehrung von Zellen in Kultur aus Primärfollikeln.

Primäre Ovarfollikel wurden aus zwei Spenderinnen gewonnen, die sich einer Ovarectomie unterzogen hatten und nicht einer Ovarstimulierungshormonbehandlung unterzogen worden waren.

Die Primärfollikel wurden manuell aus kleinen Stücken von Ovargewebe isoliert. Der Primärfollikelkomplex wurde in Kultur gegeben und 6 Wochen in Kultur im Medium DMSS (s. Beispiel 6) gehalten. Nach 5 Wochen in Kultur sezernierten die Zellen Östradiol sowie eine nachweisbare Menge Progesteron.

TABELLE 7

BEISPIEL 12

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Etablierung und Vermehrung in Kultur von hormonsezernierenden Zellen trophoblastischen Ursprungs.

Trophoblastische Zellen gewann man aus einer Zellspenderin, die sich einem chirurgischen Eingriff bei ectopischer Schwangerschaft unterzogen hatte. Eine Reihe trophoblatischer Zellen wurde unmittelbar in EM, wie in Beispiel 1 beschrieben, gegeben und in DM wie in Beispiel 2 weiter gezüchtet. Eine zweite Gruppe trophoblastischer Zellen wurde unmittelbar in eine andere Art von definiertem Medium mit Serumersatz (DMSS, Formel in Beispiel 6, s.o.) gegeben und wie in Beispiel 2 weiter gezüchtet, nur dass das Wachstumsmedium DMSS war.

Ergebnisse: Die Trophoblastzellen proliferierten gewöhnlich erfolgreich in Kultur unter beiden oben beschriebenen Bedingungen. Nach 6 Tagen in SC-3-Subkulturen wurde das Medium auf die in Tabelle 8 aufgeführten Hormone getestet.

TABELLE 8

Nach 5 Wochen in Kultur sezernierten die trophoblatischen Zellen noch erhebliche Spiegel an β-hCG (43,9 mIU/10&sup6; Zellen/ 10 ml/6 Tage).

BEISPIEL 13

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Etablierung, zum Halten und zur Vermehrung von Gonadotropin sezernierenden Hypophysenzellen in Kultur.

Segmente von Hypophsenmakroadenom wurden einem männlichen Spender entnommen, der sich einem trans-sphenoidalen chirurgischen Eingriff an der Hypophyse unterzogen hatte. Kleine Zellklumpen wurden dem umgebenden Gewebe entnommen und manuell durch Zerschneiden unter Verwendung steriler dünner Glasnadeln isoliert. Diese kleinen Segmente (Durchmesser ca. 0,5 bis 1,0 mm) wurden in einzelne DMSS enthaltende Vertiefungen (siehe Beispiel 6) gegeben. Auf diese Weise wurden mehrere Einzelkulturen mit Zellen gebildet, die aus unterschiedlichen Tumorbereichen ausgewählt wurden. Nach 6 Stunden in Primärkultur wurde das Medium gewechselt und nach weiteren 42 Stunden wurden Mediumproben entnommen (48 Stunden Gesamtdauer der Primärkultur; 42 Stunden Synthesezeit). Wie Tabelle 9 zeigt, sezernierten alle Ausgangskulturen hohe Spiegel an LH und nachweisbare Spiegel an FSH und Progesteron. Drei der Kulturen sezernierten auch nachweisbare Spiegel von β-hCG. Bemerkenswert ist, dass keine nachweisbare Menge an Prolactinsekretion festzustellen war, was zeigte, dass die Zellen keine lactotrophe Komponente aufwiesen, weshalb anzunehmen war, dass sie rein gonadotrop ausgerichtet waren.

TABELLE 9

Nach 15 Tagen in Kultur (Synthesedauer 10 Tage) sezernierten die Zellen weiterhin Hormone. Die Werte für D/A Macro-05 waren z. B. LH, 11,3; FSH 4,04; B-hCG, 5,9 (mIU ml). Nach 28 Tagen in Kultur (8 Tage Synthesedauer) enthielt die -05-Kultur noch 3,0 mIU/ml LH, während die übrigen Hormone nicht mehr nachweisbar waren. Im Gegensatz dazu wurden die "blastemähnlichen" Zellcluster, wie dies Fig. 9 und 10 zeigten, am 20. Züchtungstag auf getrennte Kulturen übertragen und sezernierten relativ hohe Mengen an Hormon. So z. B. sezernierten zwei solcher "Blastem"-Gruppen, in einer Petrischale kombiniert, während einer Zeitdauer von 8 Tagen 3,0 mIU/ml LH. Bei der relativ geringen Zellzahl in der Kultur stellt dies eine hohe Menge an Hormonsekretion dar und lässt den Schluss zu, dass die "Blastem"-Zellen die produktivsten Komponenten der Primärkulturen darstellten.

Etabliert wird eine Zelllinie, welche eine therapeutisch wertvolle Form von humanem Gonadotropin sezerniert. Dieses wird aus dem die Zellkulturen umgebenden Medium isoliert und zur Herstellung eines medizinischen Gemisches für die Vorbehandlung von Frauen für die in vitro-Fertilisation verwendet

BEISPIEL 14

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Etablierung, zum Halten sowie zur Vermehrung von humanen Endometriumzellen in vitro.

Aus einer Spenderin, die sich einer Endometriumbiopsie unterzogen hatte, wurden Endometriumzellen gewonnen.

Die Zellen wurden, wie in Beispiel 12 beschrieben, manuell isoliert. Gruppen von Zellen wurden dann in einzelne Vertiefungen gegeben und nacheinander, ausgehend von ihrer hormonsekretorischen Aktivität, ermittelt durch RIA der Medien, für die weitere Züchtung ausgewählt. Die ausgewählten Zellgruppen wurden wie in Beispiel 1 in Kultur etabliert und wie in Beispiel 2 in Kultur vermehrt. Wie Tabelle 10 zeigt, sezernierten nach über 4 Monaten in Kultur zwei der Zelllinien weiterhin sehr erhebliche Mengen an Östrogen und Progesteron. Diese Zelllinien waren somit für die Produktion von humanem Geschlechtssteroidhormon für therapeutische Zwecke geeignet.

TABELLE 10

BEISPIEL 15

Dieses Beispiel beschreibt Verfahren zur Kryokonservierung hormonsezernierender Zellen.

Follikelzellen wurden in 3 unterschiedliche Kryokonservierungsmedien gegeben:

A) 80% DMSS, 10% Dimethylsulfoxid (DMSO; getestete Zellkultur, Sigma), 10% Glycerin (Sigma Grade, Sigma)

B) Testeidotter-Puffer (Irvine Scientific, CA) plus 15% Glycerin

C) 87,5% DMSS (mit 2% BSA und 3,4% Saccharose) plus 12,4% 1,2-Propandiol.

Alle Lösungen wurden langsam mit einem sterilen 0,20 ìm- Nalgen-Filter filtriert und mit 5% CO&sub2;/5% O&sub2;/90% N&sub2; (medizinisches Gasgemisch) während 16 bis 24 Stunden äquilibriert. Die Zellen in den Kryokonservierungsmitteln A bzw. B wurden bei einer Geschwindigkeit von ca. -1EC pro Minute auf eine Temperatur von -34EC tiefgefroren und unter flüssigem Stickstoff gelagert.

Für das Kryokonservierungsmittel C wurden die Zellen wie folgt behandelt:

1. 10 ml DMSS + 2% BSA, Fraktion V (getestete Zellkultur, Sigma); 12-minütige Inkubation 3 · 10&sup6; Zellen. 37EC (36 bis 37EC).

2. 10 ml [8,75 ml DMSS + 2 BSA + 1,24 ml 1,2-Propandiol (Sigma)], 12 min Inkubation, leichte 1-minütige Verwirbelung; 3 · 10&sup6; Zellen; Raumtemperatur (= 35EC +/- 1E

3. 10 ml [obige Lösung B + 0,34 g Saccharose (getestete Zellkultur, Sigma), 12 min. Inkubation, leichte 1-minütige Verwirbelung; 3 · 10&sup6; Zellen, Raumtemperatur (= 35E +/-1EC).

4. Beschickung von 3 Kryoampullen bei ca. 10&sup6; Zellen pro 1,5 ml Lösung C.

5. Kühlung bei 4EC 10 min lang.

Einfrierprogramm für Planer Cell Freezer R 204; Flüssiger N&sub2;- Dampf (PLANER Products Ltd.).

Temp.-Bed. 1: -2EC/min auf -7EC +/- 0,5EC

Temp.-Bed. 2: Halten bei -7EC, 15 min. N&sub2;-Dampf.

Beimpfung (Kristallisationsbeginn) an der Oberseite des Miniskus in der Einfrierampulle zu Beginn der Bedingung 2 durch Berühren der Oberseite des Miniskus mit einer in flüssigem N&sub2;- Dampf vorgekühlten Zange.

Temp.-Bed. 3: -0,3EC/min auf -34EC.

Temp.-Bed. 4: Halten bei -34EC für 30 Minuten, dann rasches Einbringen der Kryoampullen in den N&sub2;-Dampf-Kryolagerungstank.

Auftauen für das Tiefgefrieren unter Verwendung des Kryokonservierungsmittels C:

Auftaulösungen:

Lösung a: DMSS + 2% BSA

Lösung b: 1,0 ml Lösung A + 0,68 g Saccharose

Lösung c: 8,8 ml Lösung B + 1,2 ml 1,2-Propandiol.

Alle Lösungen wurden mit einem 0,20 ìm-Nalgen-Filter sterilfiltriert. Die nachfolgenden Auftaulösungen wurden in 15 ml- Falcon-Proberöhrchen hergestellt.

Die Auftaulösungen wurden in unverschlossenen Proberöhrchen mit dem medizinischen Gasgemisch äquilibriert. Die tiefgefrorene Kryoampulle wurde in einem Wasserbad von 30EC rasch aufgetaut. Die Ampulle wurde dann geöffnet und die Zellen wurden sofort in 6 ml Medium "T1" in eine Nunculon-Petrischale transferiert und dann in einen mit medizinischem Gasgemisch begasten verschlossenen Glasbehälter 8 Minuten lang bei Raumtemperatur gegeben.

Die Zellen wurden dann in eine zweite Nunculon (Boden) Petrischale mit 6 ml T1-Lösung transferiert, erneut begast und während weiterer 8 Minuten inkubiert. Diese Stufe wurde für jede Auftaulösung (T2-T6) wiederholt. Die aufgetauten rehydratisierten Zellen wurden in 25 cm?-Falcon-Gewebekulturkolben mit 10 bis 15 ml DMSS plus 10% Hybridoma Enhancing Supplement (H6020 oder H8142 Sigma) transferiert.

Die in den Kryokonservierungsmitteln A bzw. B konservierten Zellen wurden nach einem Monat durch Verfrachten der tiefgefrorenen Kryoampulle in ein 36EC-Wasserbad aufgetaut. Die aufgetauten Zellen wurden unmittelbar in 25 cm? -Falcon-Gewebekulturkolben mit 15 ml DMSS transferiert.

80% der aufgetauten Zellen erwiesen sich aufgrund des Trypanblau-Ausschlusstests als lebensfähig. Nach einer Woche in der Kultur vermehrten sich die aufgetauten Zellen gewöhnlich mit einer Rate, die mit der von Kulturen vergleichbar war, aus denen sie ursprünglich stammten und hatten die Hormonsekretionsprofile ihrer jeweiligen Elternkulturen beibehalten.

BEISPIEL 16

Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zur Etablierung von hormonsezernierenden Zellen in Kultur aus einem Schilddrüsentumor und ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Etablierung von Zellkulturen aus Pankreasgewebe.

Die Schnitte des Schilddrüsentumors stammten von einer 30 Jahre alten Spenderin. Die Schnitte des Pankreasgewebes stammten vom Hinterlappen der Pankreas einer älteren Spenderin, die aufgrund einer Verletzung der Pankreas sich einem chirurgischen Eingriff unterziehen musste. Kleine ca. 50 bis 300 Zellen enthaltende Stücke wurden aus dem Gewebe entfernt und wie in Beispiel 13 beschrieben, in ein Etablierungskulturmedium gegeben. Die Kulturen wurden dann jeden zweiten Tag mit dem oben beschriebenen medizinischen Gasgemisch begast. 2 Wochen danach wurden die Kulturen unterteilt und in ein frisches Etablierungsmedium gegeben. Nach weiteren 8 Wochen in Kultur wurden die Zellkulturen gegebenenfalls, je nach der Zellproliferationsrate, weiter unterteilt.

Nach einer Gesamtdauer in der Primärkultur von 8 Wochen (Synthesedauer 10 Tage) hatten die Schilddrüsenzellen im Medium bei einer Konzentration von 7,3 ìg/D1 (getestet von einem industriellen klinischen Labor) Thyroxin (T&sub4;) akkumuliert. Dies stellt eine beträchtliche Menge an Thyroxinsekretion, verglichen mit dem normalen Bereich für adultes Serum von 4 bis 12 ìg/D1 dar und zeigt, dass die Schilddrüsenzellen nach 8 Wochen in Kultur noch wenigstens eine differenzierte Schilddrüsenfunktion ausübten. Die Zeilen sezernierten keine nachweisbaren Mengen an Progesteron oder LH, akkumulierten jedoch über 4 Wochen der Synthese Östrogen in einer Menge von 255 pg/ml. Die Zellen verblieben über die gesamte Züchtungsdauer in follikelähnlichen Clustern.

Die Pankreaszellen vermehrten sich in Suspension in 15 ml DMSS (25 cm? Falcon-Kolben) während der 8 Wochen der Primärkultur. Das Medium wurde für Testzwecke während einer Zeitspanne von 6 bis 8 Wochen Züchtung (Synthesedauer 2 Wochen) gesammelt. Wie von den ursprünglichen Pankreaszellen zu erwarten war, sezernierten sie keine nachweisbaren Mengen an Progesteron, Östrogen oder LH. Die Amylase- und Insulinkonzentrationen wurden nach Sierra Nevada Labs, Reno, Nevada, getestet. Die Amylasekonzentration im Medium war bei 5 E/l sehr gering (der normale Bereich für humanes Serum liegt bei 34-122 E/l). Dies zeigte, dass nur sehr wenige Zellen in den Kulturen von der exokrinen Pankreas stammten. Im Gegensatz dazu enthielt das Medium der meisten Kulturen mehr als 400 IE/ml Insulin (normaler Bereich beim hungernden Individuum 9,1-21,7 IE/ml). Dies zeigte, dass die Kulturen β-Zellen enthielten, die von den endokrinen Pankreasinseln abstammten und dass die Zellen aktiv Insulin in das Medium sezernierten. Es wurden einzelne Kulturen für die weitere Vermehrung entsprechend der Proliferationsrate und je nach der sezernierten Insulinmenge ausgewählt.

Die Pankreaszellen können zur Erzeugung von Kulturen subkloniert werden, die humanes Insulin produzieren und frei sind von exokrinen Pankreaszellen.

Schlussfolgerung: Die erfindungsgemäßen Verfahren sind wirkungsvoll bei der Etablierung von Zellkulturen von Insulin produzierenden Pankreaszellen für unterschiedliche Verwendungszwecke.

BEISPIEL 17

Dieses Beispiel zeigt die Aufrechterhaltung von Insulin sezernierenden Zellen in einer Langzeitkultur sowie die Aufrechterhaltung des Insulin sezernierenden Vermögens der Zellen nach Tieffrieren und Auftauen.

Die in Beispiel 16 beschriebenen Pankreaszellkulturen wurden etwa alle 3 bis 5 Tage bis zur 47. Generation einer Passage unterzogen. Die Passage erfolgte durch Transferieren von 0,5 -1,0 ml Zellsuspension in 10 ml frisches Medium in einen Kolben. Jeder Kolben wurde mit medizinischem Blut-Gas-Gemisch begast (s.o.), luftdicht verschlossen und in einem Inkubator bei 37EC gehalten. Gewöhnlich wurde jeder Kolben jeden zweiten Tag mit frischem Gas begast. Nach der 47. Passage wurden die Zellen 9,5 Monate lang in einer Dauerkultur gehalten.

Ein Teil der Pankreaszellen der 47. Generation wurde entsprechend dem in Beispiel 15 beschriebenen Verfahren unter Verwendung des Kryokonservierungsmittels A tiefgefroren. Die Zellen wurden tiefgefroren, einen Tag gelagert, wonach sie entsprechend dem in Beispiel 15 beschriebenen Verfahren aufgetaut wurden.

Die aufgetauten Zellen und die Zellen der 47. Generation, die nicht tiefgefroren worden waren, wurden in DMSS-Medium gegeben und bei 1070 U/min lang zentrifugiert. Die Zellpellets wurden dann gewaschen und erneut in 30 ml Medium PDM (Dulbecco's Salzlösung, phosphatgepuffert, mit MgSO&sub4; (nicht MgCl&sub2;), plus 2 BSA Fraktion V), bis zu einer Endosmolalität, eingestellt auf 272 mOsm, bei 37EC suspendiert.

Die Zellen wurden dann 30 Minuten bei 37EC inkubiert, zentrifugiert und erneut, wie oben angegeben, suspendiert. Die Zellzählung und die Überlebensfähigkeit wurde durch Trypanblau- Ausschluss ermittelt.

Die Zellen wurden dann zentrifugiert und erneut in einem basischen Medium, das aus 3 Teilen Medium PDM (s. o.) und 1 Teil DMSS bestand, wie oben in Beispiel 6 definiert, suspendiert. Die Zellen wurden dann für 1,5 oder 3 Stunden in D(+)Glucose bei Konzentrationen von 1 bis 21 mM, wie unten in Tabelle 11 gezeigt, inkubiert. Die RIA-Analyse ergab, dass die Zellen, wie Tabelle 11 zeigt, auf Glucose durch Insulinsekretion reagierten.

TABELLE 11

Schlussfolgerungen: Die Pankreaszellen wurden in Langzeitkultur gehalten. Während dieses Zeitraums behielten die Zellen ihre Fähigkeit, auf erhöhte Glucosekonzentrationen mit Insulinsektretion zu reagieren. Außerdem behielten die tiefgefrorenen und wieder aufgetauten Zellen ihre Fähigkeit, auf Glucose zu reagieren, was mit dem entsprechenden Vermögen der nicht eingefrorenen Zellen vergleichbar war.

BEISPIEL 18

Dieses Beispiel zeigt den zeitlichen Verlauf der Reaktion der humanen Pankreaszellen auf Glucose.

Die Kulturen humaner Pankreaszellen aus Beispiel 16 wurden über 55 Generationen in Dauerkultur gehalten, wobei die Züchtungsdauer 12 Monate betrug.

Zwei Stunden vor dem Versuch wurden die Zellen bei 1070 U/min

5 Minuten lang zentrifugiert und dann im glucosearmen Medium, das aus 1 Teil DMSS und 6 Teilen PDM bestand, erneut suspendiert. Die Zellen wurden in glucosearmem Medium (Glucose-unterdosiert) bei einer Konzentration von ca. 1,5 · 10&sup6; Zellen/ml in 10 ml-Züchtungsflaschen zwei Stunden lang bei 37E inkubiert.

Die Zellen wurden dann zentrifugiert und im Versuchsmedium, das aus einem Teil DMSS und sechs Teilen PDM bestand, erneut suspendiert. Die Glucosekonzentration im bloßen Versuchsmedium betrug 1,1 mM. Diesem Medium wurde Glucose in den in Tabelle 12 angegebenen Konzentrationen zugesetzt, wonach die Zellen verschieden lang inkubiert wurden. Es wurden dann Proben gesammelt und, wie in Tabelle 12 angegeben, auf den Insulingehalt getestet.

TABELLE 12

Schlussfolgerungen: Die Zellen reagierten stufenweise auf die zunehmende Glucosekonzentration bei maximaler Reaktion bei 16,5 mM, was vergleichbar ist mit der Reaktion, die bei normalen humanen β-Zellen in der Primärkultur zu erwarten ist. Die maximale Reaktion übertraf um ca. das 20- bis 128fache den Basisspiegel der Insulinsekretion.

BEISPIEL 19

Dieses Beispiel zeigt, dass Pankreaszellen in kontinuierlicher Kultur ihr Vermögen, in Reaktion auf Glucose Insulin zu sezernieren, beibehalten.

Ein Teil der humanen Pankreaszellen aus Beispiel 16 wurde bei der Passagegeneration 21 entsprechend dem in Beispiel 17 beschriebenen Verfahren tiefgefroren und dann 9,5 Monate später vor dem Versuch wieder aufgetaut. Bei Passagegeneration 60 wurden die Zellen 1 Jahr lang in Dauerkultur gehalten. Beide Gruppen von Zellen wurden dann, wie in Beispiel 18 beschrieben, vor dem Versuch einer Unterdosierung von Glucose ausgesetzt. Danach wurden die Kulturen in 24 Vertiefungen aufweisende Schalen bei einer Konzentration von 10&sup5; Zellen/ml/Vertiefung in einem Inkubationsmedium aus RPMI-1640-Y [100 ml Glucose-unterdosiertes RPMI 1640 (R 1383, Sigma), 1 gm BSA-Fraktion V, 1,5 ml HEPES-Lösung, 5,5 ml Gewebezüchtungswasser, 1500 IU Penicillin-G, 1,5 mg Streptomycin, pH 7,4-7,6, Endosmolarität eingestellt auf 272 mOsm] gegeben.

Die Zellen wurden dann 90 Minuten bzw. 5 Stunden in unterschiedlichen Glucosekonzentrationen, wie dies Fig. 11 zeigt, inkubiert.

Ergebnisse: Die Zellen, die bei Passagegeneration 21 tiefgefroren worden waren, reagierten maximal auf 11 mM und 16,5 mM Glucose mit einem 8- bis 9,5fachen Anstieg der Insulinsekre tion, verglichen mit der Kontrolle nach 5 Stunden. Die Zellen, die 1 Jahr lang (Passagegeneration 60) in Dauerkultur gehalten worden waren, reagierten auf 5,6, 11 und 16,5 mH Glucose mit einem Anstieg der Insulinkonzentration in einem Bereich des 3- bis 4,5fachen, verglichen mit der Kontrolle (Fig. 11).

BEISPIEL 20

Dieses Beispiel zeigt die Reaktion der Pankreaszellen in Langzeitkultur auf Aminosäuren.

Humane Pankreaszellen wurden bei Passagegeneration 47 für den Versuch, wie in Beispiel 17 beschrieben, gewonnen. Die Zellen wurden in 6 Teilen PDM und 1 Teil DMSS-Medium bei einer Konzentration von 10&sup5; Zellen/ml bei unterschiedlichen Glucosekonzentrationen inkubiert. Danach wurden Alanin (10 mM) bzw. Arginin (20 mM) zugesetzt, wonach die Zellen 90 Minuten lang inkubiert wurden. Anschließend wurden die Proben zum Test auf Insulingehalt gesammelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengefasst.

TABELLE 13 Wirkung von Aminosäuren auf die durch Glucose stimulierte Insulinsekretion

Ergebnisse: Bei geringen Glucosekonzentrationen (1, 2 und 6 mM) bewirkte Alanin eine stärkere Insulinsekretion als bei aussschließlicher Glucosestimulierung. Die Wirkung des Alanins war bei 2 mM Glucose besonders ausgeprägt. Das Alanin bewirkte hier eine Steigerung der Insulinsekretion, die um das 1,25fache höher war als bei ausschließlicher Glucosestimulierung. Arginin zeigte eine ausgeprägte Wirkung bei 1 mM Glucose. Das Arginin bewirkte hier eine Steigerung der Insulinsektretion, die um das 1,4fache höher war als bei ausschließlicher Glucosestimulierung.

BEISPIEL 21

Dieses Beispiel zeigt, dass in Langzeitkultur gehaltene humane Pankreaszellen immunreaktives Insulin enthalten.

Humane Pankreaszellen aus Beispiel 16 der Passagegeneration 47 wurden fixiert und durch Methanol (-20EC) permeabel gemacht, auf eine Unterlage aufgebracht und mit Hilfe einer üblichen immunchemischen Technik (Harlow, E. et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories) angefärbt, wobei man sich eines anti-humanen Insulinantikörpers, der aus Meerschweinchen von der Firma Peninsula Laboratories, Belmont, Kalifornien, stammte, als primären Antikörper bediente. Der sekundäre Antikörper war ein anti-Meerschweinchen-IgG (vollständiges Molekül) - TRITC-Konjugat (Rb) von Sigma (T- 7153). Als Negativkontrolle wurden anstelle des primären Antikörpers Zellen mit demselben primären anti-Insulin-Antiserum, das mit synthetischem humanem Insulin vorinkubiert worden war, um die anti-Insulin-Antikörper zu adsorbieren, inkubiert. Die Zellen wurden mit Hoechst-Farbstoff 33258 gegengefärbt. Die immungefärbten Zellen wurden beobachtet und mit einem Zeiss 7135-Mikroskop unter Verwendung eines Zeiss-Filters Nr. 15 zur Beleuchtung der Insulinmarkierung durch Rhodaminfarbstoff photographiert. Es wurden die identischen Zellbereiche beobach tet und unter Verwendung eines Zeiss-Filters Nr. 2 zur Beleuchtung der Hoechst-Markierung der DNA in den Kernen sämtlicher Zellen in diesem Bereich photographiert. Die Photos der Zellkerne wurden mit den photographischen Gegenstücken der mit Rhodamin markierten Zellcytoplasmen verglichen, um festzustellen, wieviele Zellen in diesem Bereich immunreaktives Insulin enthalten.

Ergebnisse: Die Kontrollen ergaben keine Hintergrundfärbung. Der Vergleich der Zahlen der markierten Kerne mit den Zahlen der auf Insulin immunreaktiven Zellen ergab, dass über 60% der Zellen in der Kultur bei unterschiedlichen Intensitäten der Fluoreszenzfärbung immunreaktives Insulin enthielten.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Etablierung einer Zellkultur aus hormonsezernierenden menschlichen Pankreaszellen in vitro, das folgende Stufen umfaßt:

a) Auswahl von Zellen mit Insulinsekretionspotential aus einer Population menschlicher nichttumoraler Pankreaszellen, die ein Insulinsekretionspotential aufweisen,

b) Suspendierung dieser Zellen in einem Etablierungsmedium, das eines der Sera der Gruppe Humanserum, Rinderserumalbumin oder Serumersatzstoff umfaßt, das tierische Proteine enthält, wobei das Etablierungsmedium die Lebensfähigkeit bzw. Proliferation der Zelle bzw. Zellen während eines Zeitraums von wenigstens 13 Tagen in vitro begünstigt und

c) Subkultivierung von bindungsunabhängigen Zellen aus Stufe

b) , so daß die Zellen proliferieren und die Lebensfähigkeit während eines Zeitraums von wenigstens 5,5 Monaten aufrechterhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zellen so ausgewählt werden, daß sie wenigstens zwei Merkmale aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

a) glatte Außenmembran,

b) eine der beiden Formen, ausgewählt unter annähernd sphärischer Form und praktisch ovoider Form,

c) nichtgranuläres Cytoplasma und

d) Teil einer Zellmasse mit ca. 2 bis 12 Zellen und annähernd gleicher Größe und Form.

3. Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Stufe der weiteren Unterteilung der Nachkommen aus Stufe c) in eine Vielzahl von Zellkulturen umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Auswahl durch visuelle, mikroskopische Untersuchung erfolgt und das außerdem noch die Stufe des Aufsaugens wenigstens eines Vertreters der Gruppe individuelle Zelle und Zellmassen umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem dieses zentrifugenfrei ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Verfahren praktisch enzymfrei ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man vor der Stufe a) eine Gruppe von Zellen zugibt, welche die Population ähnlicher Zellen in einer Lösung mit praktisch derselben chemischen Zusammensetzung als die biologische Flüssigkeit, welche diese Gruppe von Zellen unter natürlichen Bedingungen in vivo umgibt, umfaßt, wobei die Konzentration dieser Zellgruppe in der Lösung kleiner ist als die Konzentration der in der biologischen Flüssigkeit enthaltenen Zellen, oder dieser Konzentration entspricht und vor der Stufe a) die Zellpopulation aus der Zellgruppe in der Lösung durch Selektion von Zellen mit Merkmalen wachstumsfähiger Zellen abtrennt und diese Zellen aus der Lösung entfernt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem Stufe der Selektion der Zellen mit Merkmalen von lebensfähigen Zellen durch Selektion von Zellen mit Merkmalen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

a) Zellen mit glatter Plasmamembran,

b) Zellen, die in einer Monoschicht auf dem Boden der Kulturschale angeordnet sind und

c) blutkoagulatfreie Zellen,

durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 und 8, bei dem das Etablierungsmedium der Stufe b) eine Osmolarität von ca. 248 mOsm bis ca. 275 mOsm aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Einstellungsmedium außerdem noch folgendes umfaßt:

i) ein Basismedium, das essentielle Mineralstoffe, Salze, Vitamine, Aminosäure und Lipide,

ii) ein Puffersystem,

iii) Glutamin in einer Menge von ca. 6,35 mM bis ca. 8,35 mM und

iv) wenigstens eine Energiequelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lactat und Pyruvat, umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Etablierungsmedium außerdem noch ein Serum in einer Menge von ca. 0,5 bis ca. 15%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums, umfaßt.

12. Medium nach Anspruch 9, bei dem das Etablierungsmedium außerdem noch einen Serumersatzstoff in einer Menge von ca. 5 bis ca. 15%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums, umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Serum Humanserum ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Serum aus dem Blut eines Spenders der Zellpopulation erhalten wird.

15. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Etablierungsmedim außerdem noch Säugerserumprotein in einer Menge von ca. 0,5 bis ca. 3,0% (G/V) umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Etablierungsmedium Rinderserumalbumin umfaßt.

17. Verfahren zur Etablierung einer Zellkultur aus hormonsezernierenden menschlichen Pankreaszellen in vitro, das folgende Stufen umfaßt:

a) Auswahl von Zellen mit Insulinsekretionspotential aus einer Population menschlicher nichttumoraler Pankreaszellen, die ein Insulinsekretionspotential aufweisen,

b) Suspendierung dieser Zellen in einem Etablierungsmedium, das eines der Sera der Gruppe Humanserum, Rinderserumalbumin oder Serumersatzstoff umfaßt, das tierische Proteine enthält, wobei das Etablierungsmedium die Lebensfähigkeit bzw. Proliferation der Zelle bzw. Zellen während eines Zeitraums von wenigstens 13 Tagen in vitro begünstigt und

c) Subkultivierung von bindungsunabhängigen Zellen aus Stufe b) , so daß die Zellen proliferieren und die Lebensfähigkeit während eines Zeitraums von wenigstens 5,5 Monaten aufrechterhalten wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Stufe c) so durchgeführt wird, daß die Zellen in das definierte Medium gegeben werden, das Nachkommen mit einem Potential für die Sekretion wenigstens eines Hormons der Gruppe, bestehend aus Glucagon und Insulin, produziert.

19. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Stufe c) so durchgeführt wird, daß die Zellen in das definierte Medium außerdem folgendes umfaßt:

i) ein Basismedium, das essentielle Mineralstoffe, Salze, Vitamine, Aminosäuren und Lipide,

ii) ein Puffersystem,

iii) Protein,

iv) wenigstens eine Energiequelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lactat und Pyruvat, und

v) Glutamin in einer Menge von ca. 6,35 bis ca. 8,35 mM

umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das definierte Medium außerdem noch einen Serumersatzstoff in einer Menge von ca. 5 bis ca. 15%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums, umfaßt.

21. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Stufe c) durch Subkultivierung der Zellen in einem definierten Medium mit einer Osmolarität im Bereich von ca. 269 mOsm bis ca. 275 mOsm erfolgt.

22. Verfahren nach Anspruch 17, das außerdem noch die Stufe der Übertragung der Nachkommen aus Stufe c) in ein glucosearmes definiertes Medium umfaßt, wodurch die Zellen dazu gebracht werden, einen Basalspiegel an Insulin zu sezernieren, umfaßt.

23. Verfahren nach Anspruch 17, das außerdem noch die Stufe der Kontaktierung der Nachkommenzellen von Stufe c) mit ca. 0,5 bis ca. 22 mM Glucose umfaßt.

24. Verfahren nach Anspruch 17, das außerdem noch die Stufe der Kontaktierung der Nachkommenzellen von Stufe c) mit ca. 2 bis ca. 9 mM Glucose umfaßt.

25. Verfahren nach Anspruch 17, das außerdem noch die Stufe der Kontaktierung der Nachkommenzellen von Stufe c) mit 1 bis 6 mM Glucose umfaßt, wodurch die Zellen dazu gebracht werden, einen mittleren Insulinspiegel zu sezernieren, sowie der Kontaktierung der Zellen mit einer Aminosäure umfaßt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die Aminosäure wenigstens eine Aminosäure, ausgewählt unter Alanin und Arginin ist.

27. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem die Aminosäure Alanin in einer Konzentration von ca. 10 mM umfaßt.

28. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem die Aminosäure Arginin in einer Konzentration von ca. 20 mM umfaßt.

29. Verfahren nach Anspruch 17, das außerdem eine Stufe der Kontaktierung der Nachkommenzellen mit einem Sekretogog, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucagon-ähnlichem Peptid-1 und Glucose, umfaßt.

30. Menschliche Pankreaszellkultur die nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 21 erhalten werden kann.

31. Menschliche Pankreaszellkultur nach Anspruch 30, die zur Proliferation in vitro befähigt ist und zur Sekretion von ca. 2 bis ca. 1000 uIU Insulin/h pro 10&sup5; Zellen pro ml Kulturmedium, befähigt ist.

32. Zellkultur nach Anspruch 31, bei der die Sekretion von Insulin ca. 20 bis ca. 400 uIU Insulin/h/105 Zellen pro ml definiertes Kulturmedium beträgt.

33. Zellkultur, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Basalspiegel an Insulin ca. 20 bis ca. 250 uIU Insulin/h pro 1,5 Millionen Zellen pro glucosearmes Medium beträgt.

34. Zellkultur, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 23, bei dem die Nachkommenzellen auf den Kontakt mit Glucose reagieren, indem sie zu einer erhöhten Insulinsekretion in einer Menge führen, die ca. das 1,2- bis ca. das 130fache des Basalspiegels der Insulinsekretion ausmacht, wobei der Basalspiegel in einem Bereich von ca. 20 bis a. 250 uIU Insulin pro 1,5 Millionen Zellen pro ml des Mediums liegt.

35. Zellkultur nach Anspurch 34, bei der die Reaktion über eine Zeitdauer von ca. 30 Minuten bis ca. 24 Stunden erfolgt.

36. Zellkultur, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die Nachkommenzellen auf den Kontakt mit. Glucose reagieren, indem sie zu einer erhöhten Insulinsekretion in einer Menge führen, die ca. das 1,5- bis ca. das 10fache des Basalspiegels der Insulinsekretion ausmacht.

37. Zellkultur, herstellbar nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, bei dem die Nachkommenzellen auf den Kontakt mit Aminosäure reagieren, indem sie zu einem Spiegel der Insulinsekretion in einer Menge führen, die das 1,3- bis 2,0fache der mittleren Insulinsekretion ausmacht.

38. Verfahren zur Ermittlung der Toxizität einer Testverbindung, das folgende Stufen umfaßt:

a) Bereitstellung einer etablierten menschlichen nichttumoralen Pankreaszellinie, hergestellt nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 17, wobei die Zellinie Zellen umfaßt, die eine kennzeichnende Reaktion auf ein bekanntes Toxin zeigen, und diese eine bekannte Veränderung im Hormonsekretionsprofil der Zellen der Zelllinie darstellt,

b) Kontaktierung der Zellen mit der Testverbindung,

c) Ermittlung des Hormonsekretionsprofils der Zellen nach der Stufe b) und

d) Vergleich des Hormonsekretionsprofils der Zellen nach der Stufe b) mit der bekannten Änderung im Hormonsekretionsprofil zur Ermittlung der relativen Toxizität der Testverbindung.

39. Zellkultur, die menschliche hormonsezernierende nichttumorale Pankreaszellen nach Anspruch 30 in Suspension in einem definierten Medium umfaßt, das seinerseits folgendes umfaßt:

a) Ein Basismedium mit essentiellen Mineralstoffen, Salzen, Vitaminen, Aminosäuren und Lipiden,

b) ein Puffersystem,

c) eine Osmolarität von ca. 248 bis ca. 275 mOsm, wobei die Kultur mit einem medizinischen Gasgemisch aus 5% CO&sub2;, 5% O² und 90% N&sub2; begast wurde, und

d) Glutamin in einer Menge von ca. 6,35 bis ca. 8,35 mM.

40. Zellkultur nach Anspruch 39, bei der das Medium außerdem noch wenigstens eine Energiequelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lactat und Pyruvat, umfaßt.

41. Zellkultur nach Anspruch 39 oder 40, bei der das Medium außerdem noch ein Serum in einer Menge von ca. 0,5 bis ca. 15%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums, umfaßt.

42. Zellkultur nach Anspruch 41, bei dem das Serum wenigstens ein Serum, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Humanserum und definiertem Serumsupplement, umfaßt.

43. Zellkultur nach Anspruch 39, bei der das definierte Medium ein Protein umfaßt.

44. Zellkultur nach Anspruch 43, bei der das Medium außerdem noch wenigstens eine Energiequelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lactat und Pyruvat, umfaßt.

45. Zellkultur nach Anspruch 43, bei der die Osmolarität ca. 269 bis ca. 275 mOsm beträgt.

46. Zellkultur nach Anspruch 43, bei der das sezernierte Hormon ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Glucagon und Insulin.

47. Verfahren zur Langzeithaltung von menschlichen hormonsezernierenden, nichttumoralen Pankreaszellen in vitro, die nach dem Verfahren nach Anspruch 17 erhalten werden können, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:

a) Vermehrung der Zelle bzw. Zellen auf Stufe c), wobei das definierte Medium geeignet ist, die Lebensfähigkeit wenigstens eines Teils der Nachkommen zu begünstigen, so daß wenigstens ein Teil der Nachkommen in vitro nach wenigstens einem Jahr nach Ablauf der Stufe a) noch lebensfähig ist.

48. Verfahren zur Ermittlung der Toxizität einer Testverbindung, das folgende Stufen umfaßt:

a) Bereitstellung einer etablierten menschlichen nichttumoralen Pankreaszelllinie gemäß Anspruch 30, wobei die Zellinie in länger als ein Jahr in vitro vermehrt wird und die Zellen eine kennzeichnende Reaktion auf ein bekanntes Toxin zeigen und diese eine bekannte Veränderung im Hormonsekretionsprofil der Zellen der Zellinie darstellt,

b) Kontaktierung der Zellen mit der Testverbindung,

c) Ermittlung des Hormonsekretionsprofils der Zellen nach der Stufe b) und

d) Vergleich des Hormonsekretionsprofils der Zellen nach der Stufe b) mit der bekannten Änderung im Hormonsekretionsprofil zur Ermittlung der relativen Toxizität der Testverbindung.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com