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Dokumentenidentifikation DE69528863T2 27.11.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0693523
Titel Matrix auf der Basis von Kollagen
Anmelder Col-bar R & D Ltd., Ramat-Gan, IL
Erfinder Pitaru, Sandu, Tel-Aviv 62300, IL;
Noff, Matityahu, Rehovot 76228, IL
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 69528863
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 18.07.1995
EP-Aktenzeichen 951112606
EP-Offenlegungsdatum 24.01.1996
EP date of grant 20.11.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.11.2003
IPC-Hauptklasse C08H 1/06
IPC-Nebenklasse A61L 27/00   A61L 31/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue, auf Kollagen basierende Matrix und Vorrichtungen, welche diese Matrix enthalten. Ein besonderes Beispiel für solch eine Vorrichtung ist ein auf Kollagen basierendes Blatt, welches für die gesteuerte Geweberegeneration (GTR) verwendbar ist und welches hier als "GTR- Membran" bezeichnet werden wird.

Eine besondere Anwendung der GTR-Membran dieser Erfindung besteht für die Zahntechnik zur gesteuerten Geweberegeneration von parodontalem Gewebe. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Herstellungsmethode für diese Matrix.

Gesteuerte Geweberegeneration ist ein chirurgisches Verfahren, das dazu dient, die Morphologie und Funktion von Geweben oder Organen, die durch eine Krankheit oder ein Trauma zerstört wurden, wieder herzustellen oder zu regenerieren. Bei der Geweberegeneration müssen regenerierte Gewebe die gleiche Stelle und den gleichen Raum neu besiedeln, der vorher von den gesunden Geweben eingenommen wurde, welche zerstört wurden. Überdies sollte die Neubesiedlung der betroffenen Stelle und die nachfolgende Differenzierung der Zellen für die Neubesiedlung ein geregelter und konzertierter Prozess sein, um die morphologischen und funktionalen Beziehungen zwischen den verschiedenen Regenerationsgeweben an der Regenerationsstelle wieder herzustellen.

Die Technik der GTR zielt darauf ab, eine geregelte und konzertierte Neubesiedlung einer betroffenen Stelle durch Geweberegeneration zu ermöglichen. Zu diesem Zweck wird eine Barriere zwischen dem regenerierenden Gewebe und dem Gewebe, welches in den Regenerationsprozess eingreifen könnte, errichtet. Diese Barriere wird solange an der Stelle beibehalten, bis die betroffene Stelle durch das richtige Gewebe neu besiedelt wurde und das Regenerationsgewebe seine Reife erreicht hat.

In der Zahntechnik werden bei der GTR von regenerierendem parodontalem Gewebe, welches durch eine parodontale Krankheit oder durch ein Trauma zerstört wurde, gegenwärtig hauptsächlich Membranbarrieren verwendet. Im allgemeinen finden zwei Arten von Membranen Anwendung, Membranen aus nicht abbaubarem Material und Membranen aus abbaubarem Material.

Kollagene sind eine Proteinfamilie mit einer wohlbekannten dreifachen Helix- Konfiguration. Von diesen Proteinen ist das Kollagen Typ I das am meisten vorherrschende und besteht zu etwa 25% aus Körperproteinen und zu 80% aus Bindegewebsproteinen. Kollagen Typ I polymerisiert und bildet Aggregate von Fasern und Bündeln. Kollagen wird im Körper ständig durch Abbau und Synthese neu modelliert. Kollagen Typ I wird nur durch ein spezifisches Enzym abgebaut - die Kollagenase, und ist gegenüber jedweder nichtspezifischer proteolytischer Abbau resistent.

Kollagen ist ein schwaches Antigen und die Antigenität liegt im wesentlichen in den nichthelikalen Molekülenden begründet. Diese Enden können von Enzymen wie Pepsin entfernt werden. Seine schwache Antigenität und seine relative Resistenz gegenüber einem Abbau machen Kollagen zu einem guten Kandidaten für ein Baumaterial für implantierbare Vorrichtungen.

Eine molekulare Lösung von Typ I-Kollagen kann aus einem Bindegewebe, welches reich an diesem Protein ist, hergestellt werden, und das molekulare Kollagen kann dann zu Fibrillen neugeordnet werden, welche sich dann zur Bildung einer Kollagenmatrix verbinden. Kollagenmatrizes können in vitro in eine Vielzahl von implantierbaren Vorrichtungen geformt werden, wie z. B. Kollagenblätter oder Kollagenröhren.

Wenn sie zur Bildung von implantierbaren Vorrichtungen verwendet werden, sollten die Kollagenmatrizes ihre Integrität über einen langen Zeitraum aufrechterhalten. Diese Resistenz gegenüber einem Abbau der Kollagen-Fasern kann durch eine wachsende Zahl von intermolekularen Verknüpfungen erhöht werden. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Agenzien wie Aldehyd-Fixiermittel und Imide, und Behandlungen wie Bestrahlungen verwendet. Die wesentlichen Nachteile dieser Behandlungen liegen in der Toxizität und der Unvermögen, den Grad der Verknüpfung exakt zu kontrollieren.

US-A-4,971,954 betrifft die Bereitstellung von auf verzuckertem Kollagen basierenden Matrizes als nützliche Implantate filz klinische und tierärztliche Anwendungen, welche das Wachstum von Bindegewebszellen unterstützen und vor allem ein Einwachsen von Fibroblasten ermöglichen.

Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Kollagenmatrix bereitzustellen, welche für implantierbare Vorrichtungen wie Membranen oder Röhren für eine gesteuerte Geweberegeneration geeignet sind.

Es ist überdies das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Herstellung solch einer Matrix bereitzustellen.

Es ist weiterhin noch das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Kit bereitzustellen, welches Bestandteile enthält, die für gesteuerte Geweberegenerationsverfahren nützlich sind, wie z. B. Raumbewahrer für die Anwendung bei gesteuerten Geweberegenerationsverfahren (GTR).

Entsprechend des ersten Teils der vorliegenden Erfindung wird das besagte Objekt mittels eines Verfahrens zur Herstellung einer Kollagenmatrix aus Kollagen erhalten, welches umfasst:

(i) Lösen des besagten Kollagens in einem Lösungsmittel;

(ii) Überführung des besagten gelösten Kollagens in eine Form und Inkubation desselben, um eine Membran zu erhalten;

(iii) Komprimierung der besagten Membran bis eine erwünschte Membrandicke erreicht ist;

(iv) Reaktion der besagten komprimierten Membran mit einem reduzierenden Zucker oder reduzierenden Zuckerderivat, welches fähig ist, in einem Aldehyd- oder Ketonzustand in einer wässrigen Lösung zu existieren, um Fibrillen des Kollagens miteinander zu verknüpfen und so eine Matrix zu bilden; und

(v) Unterziehen der besagten Matrix einer Kritischen-Punkt-Trocknung.

Das Verfahren kann weiterhin nach Schritt (iv) den Schritt einer Dehydratation der besagten Matrix vor der Kritischen-Punkt-Trocknung enthalten.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Kollagenmatrix bereit, die mittels des besagten Verfahrens erhältlich ist, und eine implantierbare Vorrichtung, welche die besagte Kollagenmatrix enthält.

Die vorliegende Erfindung zielt ebenfalls auf die Verwendung der besagten implantierbaren Vorrichtung als eine Membranbarriere für die gesteuerte Geweberegeneration ab.

Überdies stellt die vorliegende Erfindung ein Kit zur Verwendung bei der gesteuerten Geweberegeneration bereit, welches besagte implantierbare Vorrichtung als eine Führungsmembran für Geweberegeneration und eine Verbindung zur Verwendung als Raumbewahrer enthält, wobei der besagte Raumbewahrer Hyaluronsäure ist.

Die Kollagenmatrix der vorliegenden Erfindung umfasst Kollagenfibrillen, deren Moleküle oder Mikrofibrillen miteinander durch ein Verknüpfungsmittel verknüpft sind, wobei das Verknüpfungsmittel einen reduzierenden Zucker oder ein reduzierendes Zuckerderivat enthält.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Kollagenmatrix umfasst die Reaktion von Kollagen mit einem Reduktionsmittel, wobei die Fibrillen des Kollagens miteinander verknüpft werden. Vorzugsweise wird die Kollagenmatrix nach der Herstellung dehydriert, z. B. in einer Alkohollösung, und dann einer Kritischen- Punkt-Trocknung unterzogen.

Besagtes Verknüpfungsmittel kann ein aldehydischer Monozucker oder eine Monozuckerderivat sein, in welchem das a-Kohlenstoffatom in wässriger Lösung in einem aldehydischen oder ketonischen Zustand vorliegt.

Besagtes Verknüpfungsmittel kann eine Verbindung sein, welche durch eine der beiden folgenden Formeln I und II wiedergegeben wird:

wobei:

R1 H- oder eine niedere Alkyl- oder Alkylengruppe, eine Aminosäure, ein Peptid, ein Saccharid, eine Purin- oder Pyrimidinbase, eine phosphorylierte Purin- oder Pyrimidinbase ist;

n eine ganze Zahl zwischen 2 und 9 ist, und

p und q jeweils unabhängig voneinander eine ganze Zahl zwischen 0 und 8 sind, unter der Voraussetzung, das p und q zusammen wenigstens 2 und nicht mehr als 8 ergeben.

Ein reduzierender Zucker kann mit einer α- oder ε-Aminogruppe der Aminosäuren des Kollagenmoleküls eine Schiffsche Base bilden. Die Schiffsche Base erfährt eine Amadori-Umlagerung und bildet über das folgende Reaktionsschema ein Ketamin- Produkt:

a. Aldehydzucker
b. Keton-Zucker

Zwei benachbarte Ketamingruppen können dann kondensieren und so eine stabile intermolekulare oder intramolekulare Verknüpfung bilden.

Wenn das Verknüpfungsmittel Ribose ist, kann eine stabiles, verknüpftes Produkt mittels Pentosidingruppen über das folgende Reaktionsschema gebildet werden (im folgenden Schema bezeichnet "A" ein erstes Kollagenmolekül und "B" ein zweites Kollagenmolekül):

Beispiele für besagtes Verknüpfungsmittel sind Glycerose, Threose, Erythrose, Lyxose, Xylose, Arabinose, Ribose, Allose, Altrose, Glukose, Mannose, Gulose, Idose, Galaktose, Talose oder jede andere Diose, Triose, Pentose, Hexose, Septose, Octose, Nanose oder Decose.

Die Abbaurate der Kollagenmatrix in situ kann über das Ausmaß der Verknüpfung zwischen den Kollagenmolekülen in der Matrix kontrolliert werden. Diese wiederum kann über die Konzentration des Zuckers während der Herstellung der Matrix, über die Temperatur und über den Zeitraum, über den das Kollagen dem Zucker ausgesetzt ist, kontrolliert werden.

Die Matrix kann auch verschiedene Wirkstoffe enthalten, die einen bestimmten therapeutischen Effekt aufweisen, und welche durch besagte Zucker innerhalb der Matrix immobilisiert sind. Wenn die Matrix in situ vorliegt, werden diese Wirkstoffe während des allmählichen Abbaus der Matrix schrittweise freigesetzt. Diese Wirkstoffe schließen antimikrobielle Wirkstoffe, entzündungshemmende Wirkstoffe oder Faktoren, welche Geweberegeneration induzieren können, ein.

Beispiele für antimikrobielle Mittel sind Antibiotika wie Penicillin, Cephalosporine, Tetracycline, Streptomycin, Gentamicin, Sulfonamide, und antimykotische Wirkstoffe wie Miconazol.

Beispiele für entzündungshemmende Mittel sind Cortison, ein synthetisches Derivat davon, oder jeder beliebige synthetische entzündungshemmende Wirkstoff.

Beispiele für Faktoren, welche Geweberegeneration induzieren können, sind Wachstumsfaktoren wie der Fibroblastenwachstumsfaktor, PDGF (platelet derived growih factor), TGR (transforming growth factor), Wachstumsfaktoren für Zahnzement oder insulinähnliche Wachstumsfaktoren, differenzierende Faktoren wie die BMP (bone morphogenetic proteins oder Knochenwachstumsfaktoren); oder Adhäsionsfaktoren (diese können auch mittels Verknüpfung durch Zucker oder unter Ausnutzung ihrer natürlichen Fähigkeit, sich an Kollagen zu binden, mit der Matrix verknüpft sein).

Die Kollagenmatrix dieser Erfindung ist nützlich für die Herstellung einer Anzahl von implantierbaren Vorrichtungen einschließlich Blättern, die als Membranbarriere bei der GTR dienen, und Röhren auf Kollagenbasis für die Nerven- oder Gefäßregeneration.

Die Barrieremembranen dieser Erfindung weisen typischerweise eine Dicke von 0,05 mm bis 2 mm auf. Die Größe der Membranen liegt zwischen 0,5 cm² bis 400 cm² oder sogar darüber hinaus.

Die Kollagenmembranen dieser Erfindung sind resistent gegenüber jeglichem nichtspezifischem proteolytischem Abbau. Sie werden durch Kollagenase mit einer Rate abgebaut, die über den Grad der Verknüpfung kontrolliert werden kann, wie oben bereits angemerkt wurde.

In Übereinstimmung mit einer Anwendungsform dieser Erfindung kann die Kollagenmatrix in Verbindung mit einem raumbewahrenden Material ("Raumbewahrer") verwendet werden. Ein Raumbewahrer wird bei einigen Verfahren verwendet, um einen Raum aufrechtzuerhalten, in welchen die regenerierenden Zellen wandern und ihn neu besiedeln können. In einigen Fällen entsteht dieser Raum auf natürliche Weise, wie z. B. wenn ein Tumor von einem Knochen entfernt wird. In anderen Fällen ist solch ein Raum nicht erhältlich, wie zum Beispiel bei verschiedenen Arten von parodontalen oder Knochenverletzungen. In solchen Fällen ist es notwendig, Füllmaterial zwischen die Barriere und das regenerierende Gewebe einzufügen. Beispiele für Raumbewahrer sind (i) Hyaluronan (Hyaluronsäure), (ii) mineralisierte, gefriergetrocknete Knochen, (iii) deproteinierte Knochen, (iv) synthetisches Hydroxylapatit, (v) andere als unter (i) bis (iv) genannte kristalline Materialien, die mit Osteokalzin oder Vitronektin angereichert sind, und (vi) wärmebehandelte, demineralisierte Knochen (die von Knochen stammenden Verbindungen unter (ii), (iii) und (vi) kommen vorzugsweise vom Menschen). Auch Kombinationen all dieser oben erwähnten Raumbewahrer sind möglich, vor allem Hyaluronan mit einem oder mehreren der anderen Raumbewahrer.

Hyaluronan, welches vorzugsweise a priori in einer lyophilisierten Form verwendet wird, ist ein Polysaccharid, das aus sich wiederholenden Einheiten von Glukuronsäure und N-Acetylglucosamin besteht. Es besitzt ein Molekulargewicht zwischen wenigen Tausend bis zu einigen Millionen Dalton, abhängig von der Quelle, aus der es extrahiert wurde. Hyaluronan wird in sich entwickelndem und heilendem Gewebe natürlich ausgeschieden und besitzt die Fähigkeit, große Mengen an Wasser zu binden. Diese Eigenschaften ermöglichen es dem Hyaluronan, bei der GTR in Verbindung mit den Membranen dieser Erfindung als Raumbewahrer eingesetzt zu werden.

Die Verwendung von mineralisierten Knochen, deproteinierten Knochen (was natürliches Hydroxylapatit ist, welches durch Knochenveraschung bei 700ºC hergestellt wird) oder synthetischem Hydroxylapatit in Verbindung mit Osteokalzin und Vitronektin [Osteokalzin ist ein Knochenprotein, welches an Hydroxylapatit gebunden ist (der mineralischen Komponente des Knochens) und von welchem man annimmt, das es Osteoklasten (knochenresorbierende Zellen) auf mineralisierte Oberflächen anzieht; Vitronektin ist ein Adhäsionsprotein und erleichtert die Bindung von Osteoklasten auf mineralisierten Knochenoberflächen] ist neu und man nimmt an, dass sie die Aktivierung von Osteoklasten an der Heilungsstelle erhöht. Dies wiederum erhöht die Resorption dieser Raumbewahrer und erleichtert ihren Austausch durch regenerierendes Gewebe.

Wärmebehandlung von demineralisierten Knochen (z. B. Gefriertrocknung) wird die kollagene Komponente der Knochenmatrix denaturieren und ermöglicht nichtspezifischen Proteinasen, die Knochenmatrix abzubauen. Dies wiederum verstärkt den Abbau des Raumbewahrers und erleichtert seinen Austausch durch regenerierendes Gewebe. Solche eine Herstellung mittels Wärmebehandlung ist besonders für diese Anwendung eine Neuheit.

Für verschiedene Anwendungen können die Raumbewahrer in Abhängigkeit von der Größe, Form und Lage der Regenerationsstelle mit einem oder mehreren der oben erwähnten antibakteriellen, entzündungshemmenden oder gewebeinduzierenden Faktoren angereichert werden, und/oder mit einer Substanz angereichert werden, welche die Aufrechterhaltung der Form der Matrix des Raumbewahrers unterstützen soll, wie z. B. ein oder mehrere Matrixproteine, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kollagen, Fibrin, Fibronektin, Osteonektin, Osteopontin, Tenascin, Thrombospondin und/oder Glucoaminoglycane einschließlich Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfate und Keratansulfat.

Diese, von der vorliegende Erfindung vorgestellt, stellen die oben genannten neuen Raumbewahrer dar.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Kit zur Verwendung bei der GTR zur Verfügung, welches die Kollagenmembran dieser Erfindung enthält. In Übereinstimmung mit einer Anwendungsform dieser Erfindung enthält das Kit auch einen Raumbewahrer. Die Kollagenmatrix wie auch das Hyaluronan kann auch einen oder mehrere der oben genannten Additive enthalten. Vorzugsweise enthält der Raumbewahrer auch ein Additiv, ausgewählt aus einem oder mehreren der Gruppe bestehend aus antimikrobiellen Wirkstoffen, entzündungshemmenden Wirkstoffen und Faktoren mit Geweberegeneration induzierenden Eigenschaften, oder eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kollagen, Fibrin, Adhäsionsfaktoren, Heparansulfat, Dermatansulfat oder Keratansulfat.

Im Folgenden wird die Erfindung durch eine Beschreibung der spezifischen Anwendungsformen und durch Beispiele, welche einige im Rahmen dieser Erfindung ausgeführten Experimente beschreiben, weiter erläutert werden, auch in Bezugnahme auf die beigefügte Abbildung.

Abb. 1 zeigt die Ergebnisse eines Experimentes, in welchem die verbliebene Radioaktivität einer mit Tritium markierten Kollagenmatrix nach dem Abbau durch Kollagenase gemessen wurde. Mit Tritium markierte Kollagenfibrillen wurden in einer Lösung mit Ribose in PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung) (a) oder in einer PBS- Lösung ohne Ribose (b) über Zeiträume zwischen 1 und 16 Tagen inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die gebildete Kollagenmatrix für 1, 2 bzw. 4 Stunden mit Kollagenase behandelt. Die Menge der in der Matrix verbliebenen Radioaktivität in Prozent der Gesamtradioaktivität nach der Behandlung mit Kollagenase ist auf der vertikalen Achse in Abb. 1 abgebildet. Die Matrizes, welche für 9 Tage und länger in Ribose inkubiert wurden, waren im Wesentlichen resistent gegenüber einem Kollagenabbau.

Im Folgenden werden spezifischen Anwendungsformen der vorliegenden Erfindung detailliert beschrieben.

Herstellung von Kollagenmembranen

Kollagen Typ I kann durch bereits bekannte Behandlung mit Pepsin aus der Haut, den Sehnen oder der Plazenta von Rindern oder aus menschlicher Plazenta gewonnen werden. Eine molekulare Lösung von gereinigtem, mit Pepsin behandeltem Kollagen Typ I (1-10 mg/ml) wird in 0,05 M Essigsäure gelöst und bei einer Temperatur von 4ºC mit 0,1 M NaOH vermischt und dann in eine passende Form gegossen und für 24 bei einer Temperatur zwischen 20-37ºC inkubiert. Die hergestellte Matrix wird dann mittels eines Stempels komprimiert, welcher das Wasser auspresst bis die geforderte Dicke der Membran erreicht ist. Die Membran wird dann in einer Ribose-Lösung (mit einer Konzentration zwischen 0,05 M und 1 M) über einen Zeitraum zwischen 6 Stunden und 24 Tagen, oder manchmal sogar länger, in Abhängigkeit vom benötigten Widerstand der Membran gegen enzymatischen Abbau, inkubiert.

Wenn gewünscht, kann die Ribose-Lösung mit Additiven wie antibakteriellen oder antimykotischen Wirkstoffen, entzündungshemmenden Wirkstoffen oder mitogenetischen und differenzierenden Wirkstoffen angereichert werden.

Auf ähnliche Weise, mutatis mutandis, können andere Vorrichtungen als Membranen, wie z. B. Schläuche, aus der Kollagenmatrix hergestellt werden.

Die Kollagenvorrichtungen können dann getrocknet und sterilisiert werden. Zu diesem Zweck können die Kollagenvorrichtungen entweder an Luft oder durch Eintauchen in eine Alkohollösung (30% - 100%) dehydriert werden. Die dehydrierten Vorrichtungen können dann einer Kritischen-Punkt-Trocknung unterzogen werden, z. B. in Kohlendioxid (CO&sub2;) oder in einem anderen Gas wie Freon in einem Kritischen-Punkt- Trockner, bei z. B. etwa 41ºC und einem Druck von ungefähr 80-90 bar. Wir haben festgestellt, dass dieses Verfahren die Vorrichtungen sterilisiert und sie vollständig trocknet, was ihre Haltbarkeitsdauer wirkungsvoll verlängert. Dieses Verfahren beeinflusst die Fähigkeit dieser Kollagenvorrichtungen einem kollagenolytischen Abbau zu widerstehen. Weiterhin bewahrt ein derartiges Verfahren die 3-dimensionale Form der Vorrichtung.

Um eine Membran herzustellen, deren Teile in verschiedenen Zeiträumen abgebaut werden, werden die Teile, die einem Abbau länger widerstehen sollen, mit der Ribose- Lösung in Kontakt gebracht. Nach dem benötigten Zeitraum ist die ganze Membran mit der Ribose-Lösung inkubiert.

Um zum Beispiel eine rechteckige Membran mit einem Gradienten der Abbauraten von einer kurzen Seite des Rechtecks zur anderen herzustellen (die eine kurze Basis hat eine hohe Abbaurate, die andere eine niedrige Abbaurate) kann das folgende Verfahren angewandt werden:

Während die Membran in einer Atmosphäre mit 100% Luftfeuchtigkeit gehalten wird, wird ein Teil der rechteckigen Membran, welcher zu einer der beiden kurzen Seiten benachbart ist für einen vorbestimmten Zeitraum in die Ribose-Lösung getaucht. Danach werden benachbarte Teile allmählich für vorbestimmte Zeiträume in die Ribose-Lösung eingetaucht. So wird das entfernte Ende am kürzesten in der Ribose- Lösung verweilen und wird so der für den Abbau empfindlichste Teil sein.

Raumbewahrer (a) Lyophilisiertes Hyaluronan

Aus humanen, bovinen oder aviären Quellen erhaltenes Hyaluronan wird in einer wässrigen Lösung gelöst, die mit einem der oben erwähnten Faktoren angereichert ist oder nicht damit angereichert ist, und dann lyophilisiert. Es wurde in Übereinstimmung mit der Erfindung gefunden, dass angereichertes, lyophilisiertes Hyaluronan, das in die Haut implantiert wurde, Wasser absorbiert, anschwillt und eine gelatinöse Konsistenz annimmt und so geeignet ist, als Raumbewahrer zu fungieren.

(b) Knochenprodukte und Hydroxylapatit-Produkte

1 g eines mineralisierten, gefriergetrockneten Knochens, eines deproteinierten Knochens oder synthetisches Hydroxylapatit werden in eine Lösung gemischt, welche bis zu 15 mg Osteokalzin und/oder 10 mg Vitronektin enthält, und die Mischung wird dann lyophilisiert.

Teilchen des demineralisierten, gefriergetrockneten Knochens werden für 5 min bis 240 min in einer trockenen Atmosphäre oder in einer kaustischen Lösung auf eine Temperatur zwischen 50ºC-100ºC erhitzt. Wenn die Wärmebehandlung in einer wässrigen Lösung erfolgt, wird der demineralisierte Knochen nach der Wärmebehandlung erneut gefriergetrocknet. Es wurde in Übereinstimmung mit der Erfindung gefunden, dass zwischen der Abbaurate des demineralisierten Knochens durch Trypsin in vitro und der Heiztemperatur eine lineare Korrelation besteht.

(c) Verwendung von Raumbewahrern zusammen mit Kollagen

Die Raumbewahrer, welche in Verbindung mit der Kollagenbarriere verwendet werden sollen, werden jeder aus den oben erwähnten Materialien oder aus Kombinationen von ihnen bestehen. Zum Beispiel kann der Raumbewahrer aus einer lyophilisierten Hyaluronan-Matrix bestehen, welche Teilchen von wärmebehandeltem, demineralisiertem, gefriergetrocknetem Knochen und/oder mit Osteokalzin und Vitronektin behandeltem, deproteiniertem Knochen enthält. Um solch ein Material herzustellen, wird wärmebehandelter, demineralisierte, gefriergetrockneter Knochen und angereicherter deproteinierter Knochen mit einer Lösung aus Hyaluronan vermischt und die Lösung wird dann lyophilisiert.

Beispiel I: In vitro Abbau

Mit Tritium radioaktiv markierte Kollagenfibrillen wurden in einer PBS-Lösung mit oder ohne Ribose inkubiert. Die Menge an Kollagenfibrillen in der Lösung betrug 3 ug/ml und die Konzentration der Ribose betrug 0,2 M. Die Inkubation der Kollagenfibrillen in der Lösung erfolgte bei einer Temperatur von 37ºC und dauerte zwischen 1 und 16 Tagen.

Anschließend an die Inkubation wurden die so gebildeten Kollagen-Matrices mit Kollagenase (1 : 10 Kollagen: Kollagenase-Verhältnis, nach Gewicht) für 1, 2 oder 4 Stunden inkubiert. Anschließend an diese Inkubation wurden die Lösungen zentrifugiert und die Menge an verbliebener Radioaktivität, welche aus der folgenden Kollagenmatrix bestand, wurde ermittelt. Die Ergebnisse der radioaktiven Zählraten sind in Abb. 1 aufgeführt. Wie man sehen kann, beträgt die Radioaktivität, welche in der Matrix nach Inkubation der Kollagenfibrillen in PBS ((b) in Abb. 1) und nach der Behandlung mit Kollagenase verblieb, weniger als 40%. Dagegen betrug die Radioaktivität in Matrices, die durch Inkubation in einer Ribose-Lösung nach mehr als 6 Tagen gebildet wurden (Abb. 1) ungefähr 85-90%.

Das zeigt deutlich, dass die Kollagen-Matrix, die mittels Inkubation in Ribose-Lösung gebildet wurde, welche zu einer Verknüpfung der Kollagenmoleküle miteinander führte, deutlich resistenter gegen Abbau durch Kollagenase war als die andere Matrix.

Beispiel II: In vivo Abbau

(a) Kollagen-Matrices, jede mit 100 ug, mit radiomarkiertem Kollagen wurden 1, 3 oder 9 Tage lang mit Ribose auf eine ähnliche Weise, wie in Beispiel I beschrieben, behandelt. Die Matrices wurden dann in eine Ratte durch ein Standardloch (ungefähr 1 · 3 mm) in den Femur der Ratte implantiert. Die Tiere wurden 0, 7, 14 und 21 Tage nach der Implantation geopfert und die verbliebene Menge an Radioaktivität in jedem Loch wurde bestimmt. Es wurden jedesmal 5 Ratten geopfert.

Durch Messen der Radioaktivität und Vergleich mit der Radioaktivität der hergestellten Kollagenmatrix, konnte eine Abbausrate bestimmt werden. Es zeigte sich, dass die Präparate mit einer Geschwindigkeit von 3%, 2% bzw. 0,5% jeweils für die Präparate, die für 1, 3 bzw. 9 Tage mit Ribose behandelt wurden, abgebaut wurden.

(b) Membranen, die wie in Beispiel I hergestellt wurden, mit einer Größe von ungefähr 0,5 · 1 cm wurden nach einer 9-tägigen Behandlung mit Ribose, wie oben, unter die Gingiva von Hunden wie auch von Menschen implantiert. Unter Verwendung von histologischen Methoden wurde gefunden, dass der vollständige Abbau der Membranen bei Hunden etwa 4 Monate in Anspruch nahm. Durch einen erneuten Eingriff beim Mensch wurde ermittelt, das der vollständige Abbau und das Verschwinden der Membranen 6 Monate dauerte. Die Tatsache, dass die Membranen über so lange Zeiträume in situ verbleiben, erleichtert ihre Verwendung bei der gesteuerten Geweberegeneration.

Beispiel III: Tierexperimente

Wie oben hergestellte Kollagenmembranen wurden verwendet, um experimentelle parodontale Defekte an der buccalen Seite des Prämolaren von Hunden zu behandeln. Histologische Untersuchungen der behandelten Stellen 4 Monate nach der Behandlung mit Kollagenmembranen ergaben eine 90% Regenerierung der Defektgröße.


Anspruch[de]

1. Verfahren für die Herstellung einer Kollagenmatrix aus Kollagen, umfassend:

(i) das Lösen von Kollagen in einem Lösungsmittel;

(ii) das Übertragen des gelösten Kollagens in eine Form und Inkubieren des Kollagens, um eine Membran zu erzielen;

(iii) das Komprimieren der Membran, bis eine gewünschte Membrandicke erreicht ist;

(iv) das Reagieren der komprimierten Membran mit einem heduzierenden Zucker oder einem reduzierenden Zuckerderivat, welches fähig ist, in einem Aldehyd- oder Ketonzustand in einer wässrigen Lösung zu existieren, um die Fibrillen des Kollagens miteinander zu vernetzen und so eine Matrix zu bilden; und

(v) das Unterziehen der Matrix unter eine Kritische-Punkt-Trocknung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner einen Schritt der Dehydratisierung der Matrix nach Schritt (iv) vor der Kritischen-Punkt-Trocknung umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kollagen in Essigsäure gelöst wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der reduzierende Zucker oder das reduzierende Zuckerderivat eine Verbindung ist, die durch eine der folgenden Formeln I oder II dargestellt ist:

worin

R¹ H, ein niederes Alkyl oder Alkylen, eine Aminosäure, ein Peptid, ein Saccharid, eine Purin- oder Pyrimidinbase, eine phosphorylierte Purin- oder Pyrimidinbase ist;

n eine ganze Zahl von 2 bis 9 ist und

p und q jeweils unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 0 bis 8 sind, vorausgesetzt, dass p und q zusammen wenigstens 2 und nicht mehr als 8 sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der reduzierende Zucker eine Diose, Triose, Tetrose, Pentose, Hexose, Septose, Octose, Nanose oder Decose ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der reduzierende Zucker aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Glycerose, Threose, Erythrose, Lyxose, Xylose, Arabinose, Ribose, Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Idose, Galactose und Taiose besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der reduzierende Zucker oder das reduzierende Zuckerderivat mit einem oder mehreren Additiven angereichert wird, die ein antimikrobielles Mittel, ein entzündungshemmendes Mittel oder einen Faktor, der gewebeinduzierende Eigenschaften hat, umfassen, wobei das Mittel oder der Faktor in der Matrix immobilisiert wird.

8. Kollagenmatrix, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2.

9. Implantierbare Vorrichtung, umfassend die Matrix nach Anspruch 8.

10. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 9 als eine Membranbarriere für eine gesteuerte Geweberegeneration.

11. Kit zur Verwendung bei der gesteuerten Geweberegeneration, umfassend die Vorrichtung nach Anspruch 9 als eine Führungsmembran für die Geweberegeneration und eine Substanz zur Verwendung als Raumbewahrer, wobei der Raumbewahrer Hyaluronsäure ist.

12. Kit nach Anspruch 11, wobei der Raumbewahrer auch ein oder mehrere Additive umfasst, weiche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem antimikrobiellen Mittel, einem entzündungshemmenden Mittel oder Faktoren, die gewebeinduzierende Eigenschaften haben, besteht.

13. Kit nach Anspruch 11, wobei der Raumbewahrer auch eine Substanz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kollagen, Fibrin, Adhäsionsfaktoren, Heparansulfat, Dermatansulfat und Keratansulfat besteht.







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