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STERILISATIONSSCHUTZMITTEL UND VERFAHREN ZUR STERILISATION - Dokument DE69723243T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69723243T2 22.04.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000888779
Titel STERILISATIONSSCHUTZMITTEL UND VERFAHREN ZUR STERILISATION
Anmelder ASAHI MEDICAL Co. Ltd., Tokio, JP
Erfinder ONODERA, Hirokazu, Oita-shi, Oita 870-02, JP;
SUEMITSU, Junsuke, Oita-shi, Oita 870-02, JP
Vertreter Patentanwälte von Kreisler, Selting, Werner et col., 50667 Köln
DE-Aktenzeichen 69723243
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 04.02.1997
EP-Aktenzeichen 979018314
WO-Anmeldetag 04.02.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/JP97/00269
WO-Veröffentlichungsnummer 0097027878
WO-Veröffentlichungsdatum 07.08.1997
EP-Offenlegungsdatum 07.01.1999
EP date of grant 02.07.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.04.2004
IPC-Hauptklasse A61L 2/08
IPC-Nebenklasse A61L 2/00   A61L 31/00   C07K 1/14   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Sterilisationsverfahren unter Verwendung eines Sterilisationsschutzmittels.

Technischer Hintergrund

In den letzten Jahren wurden Versuche zur selektiven Abtrennung, Teilung, Entfernung usw. einer Substanz, die mit einem biologischen Wirkstoff (im folgenden einfach als Wirkstoff oder Ligand bezeichnet) wechselwirkt, unter Verwendung des Wirkstoffs unternommen; und Forschungen an aktiven Materialien, die man durch Immobilisieren eines Liganden, wie eines Peptids, Proteins, einer synthetischen Substanz oder dergleichen als biologischer Wirkstoff auf einem Träger erhält, wurden durchgeführt. Untersuchungen wurden insbesondere zu Techniken durchgeführt, um Blutzellen spezifisch zu entfernen, wobei man ein aktives Material verwendet, das durch Immobilisieren eines Proteins, wie eines Enzyms, eines Antikörpers oder dergleichen, auf einem Träger erhalten wird, oder um das aktive Material als Bioreaktor zu verwenden. Diese aktiven Materialien sind jedoch gegenüber Sterilisation sehr instabil, insbesondere im Falle eines aktiven Materials mit einem darauf immobilisierten Liganden, die Wechselwirkung des Liganden mit einer zu beeinflussenden Substanz wird in vielen Fällen durch die Sterilisation reduziert, und es ist schwierig, eine ausreichende Sterilisation des aktiven Materials durchzuführen, ohne die Aktivität des Liganden zu beeinträchtigen.

In U5-A-5,283,034 wird ein Sterilisationsverfahren offenbart, das das Durchführen der Sterilisation in Gegenwart einer Substanz (z. B. Humanserumalbumin), die als Oberflächenstabilisator verwendet wird, und eines Mono- oder Disaccharids (z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Trehalose oder Amylose) oder eines Glycoproteins (z. B. Immunglobulin), das als Sauerstoffradikalfänger verwendet wird, umfasst. Bei diesem Sterilisationsverfahren ist eine Sterilisation jedoch nur in einem trockenen Zustand von weniger als 1% Wassergehalt möglich; folglich hat das sterilisierte Material eine schlechtere Grundierungseigenschaft und ist schwierig zu handhaben.

In JP-A-4-285561 wird ein Sterilisationsverfahren offenbart, das das Sterilisieren eines medizinischen Geräts, welches ein physiologisch aktives Protein als Hauptbestandteil umfasst, in Gegenwart eines Mono- oder Disaccharids (z. B. Sorbit, Mannit, Xylit oder Trehalose) umfasst. Bei diesem Verfahren ist das zu sterilisierende Zielmaterial jedoch eine Substanz (z. B. Fibrin), die wasserunlöslich und gegenüber Sterilisation relativ stabil ist; wenn das zu sterilisierende Material eine Substanz (z. B. ein Antikörper) ist, dessen dreidimensionale Struktur eine große Wirkung auf die Expression der Aktivität hat, war daher nichts bekannt, um das zu sterilisierende Material zu schützen.

US-A-446 134 offenbart die Verwendung von Sacchariden als Stabilisatoren für humanen Blutfaktor gegenüber Wärmebehandlung. Das Dokument nimmt nicht speziell Bezug auf Trisaccharide oder höhere Saccharide oder auf die Verwendung von positiv geladenen Sacchariden. Eine Strahlungsbehandlung wird nicht ausdrücklich erwähnt.

WO-A-89/06547 offenbart die Verwendung von Sacchariden als Stabilisatoren für den humanen Blutgerinnungsfaktor VIII gegenüber Deaktivierung aufgrund von thermischer Pasteurisierung. Das Dokument nimmt nicht speziell Bezug auf Trisaccharide oder höhere Saccharide oder auf die Verwendung von positiv geladenen Sacchariden. Eine Strahlungsbehandlung wird nicht erwähnt.

U5-A-4,876,241 offenbart die Verwendung von Mono-, Di- oder Trisacchariden als Stabilisatoren für Proteine gegenüber einer durch thermische Pasteurisierung verursachten Deaktivierung. Das Dokument nimmt nicht Bezug auf positiv geladene Saccharide. Eine Strahlungsbehandlung wird nicht ausdrücklich erwähnt.

EP-A-0 267 015 bezieht sich auf den Schutz von epidermalem Wachstumsfaktor vor einem Verlust der biologischen Aktivität in Gegenwart von Feuchtigkeit durch ein Filtrationsverfahren.

Es ist also kein Strahlungssterilisationsverfahren für die Sterilisation eines Liganden (z. B. eines Proteins) mit Spezifität auch im feuchten Zustand bekannt, wobei die Aktivität des Liganden aufrechterhalten wird.

Offenbarung der Erfindung

Im Hinblick auf die obigen Probleme besteht das Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein solches Sterilisationsverfahren bereitzustellen, dass die Sterilisation eines biologischen Wirkstoffs auch im feuchten Zustand möglich ist, wobei die Aktivität des Wirkstoffs aufrechterhalten wird.

Die Erfinder führten intensive Untersuchungen durch, um die obigen Probleme zu lösen. Als Ergebnis fanden die Erfinder heraus, dass ein Sterilisationsschutzmittel mit einem Polysaccharid, insbesondere einem Trisaccharid oder höheren Saccharid, das eine oder mehrere positive Ladungen aufweist, bei der Sterilisation sehr effektiv ist. Die Erfinder haben weiterhin herausgefunden, dass ein biologischer Wirkstoff, selbst wenn es eine gegenüber Sterilisation sehr instabile Substanz (z. B. ein Antikörper) ist, bei Verwendung des obigen Sterilisationsschutzmittels in jedem Zustand, der von einem feuchten Zustand bis zu einem trockenen Zustand reicht, überraschend stabil gegenüber Sterilisation ist. Dieses Ergebnis hat zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung geführt.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Strahlungssterilisation eines biologischen Wirkstoffs, der aus der Gruppe von Proteinen und/oder Peptiden ausgewählt ist, in Gegenwart eines Sterilisationsschutzmittels mit einem Polysaccharid, das wenigstens drei Monosaccharide umfasst, die jeweils eine oder mehrere positive Ladungen aufweisen.

Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Sterilisationsschutzmittels mit einem Polysaccharid, das wenigstens drei Monosaccharide umfasst, die jeweils eine oder mehrere positive Ladungen aufweisen, zum Schutz eines biologischen Wirkstoffs, der aus der Gruppe von Proteinen und/oder Peptiden ausgewählt ist, während der Strahlungssterilisation.

Bevorzugte Ausführungsformen gehen aus den Unteransprüchen hervor.

Bester Modus zur Durchführung der Erfindung

In der vorliegenden Erfindung bezieht sich "Sterilisationsschutzmittel" auf ein Material, das ein zu sterilisierendes Material so schützen kann, dass das zu sterilisierende Material auch nach der Sterilisation seine Aktivität beibehalten und seine Funktion erfüllen kann. Das vorliegende Sterilisationsschutzmittel umfasst ein Trisaccharid oder höheres Saccharid, das eine oder mehrere positive Ladungen aufweist.

Bei dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Sterilisationsschutzmittel wird vermutet, dass die eine oder mehreren positiven Ladungen ein während der Sterilisation erzeugtes Radikal schnell einfangen können, dass das Gerüst des Trisaccharids oder höheren Saccharids die Stabilität eines biologischen Wirkstoffs während der Sterilisation erhöhen und das oben genannte Radikal einfangen kann, obwohl die Wirkung gering ist, und dass als Ergebnis eine große Schutzwirkung während der Sterilisation erhalten werden kann. Es wird außerdem vermutet, dass die direkte Bindung einer oder mehrerer positiver Ladungen an das Saccharidgerüst eine noch größere Schutzwirkung während der Sterilisation ergibt.

In der vorliegenden Erfindung bezieht sich "Trisaccharid oder höheres Saccharid, das eine oder mehrere positive Ladungen aufweist" auf ein Homopolysaccharid, wobei wenigstens drei Monosaccharide derselben Art, die jeweils eine oder mehrere positive Ladungen aufweisen, in einer Reihe aneinander gebunden sind, oder ein Heteropolysaccharid, wobei wenigstens drei Saccharide, die jeweils eine oder mehrere positive Ladungen aufweisen, vorhanden sind und auch ein oder mehrere andere Saccharide vorhanden sind. Somit muss das vorliegende Polysaccharid aus wenigstens drei Monosacchariden bestehen, die jeweils eine oder mehrere positive Ladungen aufweisen.

Die Monosaccharid-Komponenten des Polysaccharids, das das Sterilisationsschutzmittel der vorliegenden. Erfindung bildet, umfassen zum Beispiel 3-Amino-3-desoxy-D-ribose, D-Galactosaminuronsäure, D-Galactosamin, D-Glucosaminuronsäure, D-Glucosamin, D-Gulosamin, D-Talosamin, Neosamin C, Pneumosamin, D-Fucosamin, D-Mannosamin, Mycaminose, Mycosamin und Rhodosamin. In der vorliegenden Erfindung besteht das Polysaccharid aus wenigstens drei Monosacchariden, bei denen es sich um wenigstens eines der obigen Monosaccharide handelt. Die obigen Monosaccharide (Monomere) haben jeweils eine oder mehrere positive Ladungen aufgrund der Aminogruppe. Die Monosaccharid-Komponenten des Polysaccharids können diejenigen sein, die man erhält, indem man die Aminogruppe des obigen Monosaccharids durch eine Iminogruppe ersetzt.

Das Polysaccharid besteht vorzugsweise aus wenigstens drei Monosacchariden, von denen wenigstens ein Monosaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus D-Galactosamin, D-Glucosamin, D-Gulosamin, D-Talosamin, D-Fucosamin, D-Mannosamin, Mycosamin und Rhodosamin besteht.

In der vorliegenden Erfindung ist das Polysaccharid besonders bevorzugt ein Chitosan, bei dem es sich um ein Polymer von D-Glucosamin handelt, und/oder ein Chitin, das partiell in Chitosan umgewandelt ist. Chitosan, das ein Poly-&bgr;-1-4-glucosamin ist, wird am meisten bevorzugt verwendet, weil es eine oder mehrere positive Ladungen aufgrund der Aminogruppe aufweist. Das Chitin, das partiell in Chitosan umgewandelt ist, ist ein Saccharid, das als Ergebnis einer Deacetylierung von Chitin durch Hydrolyse oder dergleichen partiell eine Poly-&bgr;-1-4-glucosamin-Struktur hat und wenigstens drei &bgr;-1-4-Glucosamin-Einheiten aufweisen muss. Das Chitin, das partiell in Chitosan umgewandelt ist, ist vorzugsweise wasserlöslich. Der Grad der Umwandlung von Chitin in eine &bgr;-1-4-Glucosamin-Struktur durch Hydrolyse oder dergleichen ist je nach dem Molekulargewicht des Chitins unterschiedlich, ist jedoch im Hinblick auf die Wasserlöslichkeit und die Menge der positiven Ladungen wünschenswerterweise so hoch wie möglich. Der Grad beträgt vorzugsweise 20% oder mehr, besonders bevorzugt 50% oder mehr, am meisten bevorzugt 80% oder mehr.

Das Polysaccharid in dem Sterilisationsschutzmittel, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat wünschenswerterweise ein Molekulargewicht, das die Funktion des Liganden, des biologischen Wirkstoffs, nicht beeinträchtigt und das in einem geeigneten Verhältnis zum Molekulargewicht des Liganden steht, so dass der Ligand während der Sterilisation nicht modifiziert wird. Ein Verhältnis des Molekulargewichts des Sterilisationsschutzmittels zu dem Molekulargewicht des Liganden von 1/2 oder mehr ist nicht zu bevorzugen, da bei einem solchen Verhältnis die Wechselwirkung zwischen Ligand und biologisch zu beeinflussender Substanz (im folgenden zuweilen einfach als zu beeinflussende Substanz bezeichnet) durch das Sterilisationsschutzmittel sterisch gehindert wird. Indessen ist ein Verhältnis des Molekulargewichts des Polysaccharids zu dem Molekulargewicht des Liganden von weniger als 1/500 nicht zu bevorzugen, da dann keine ausreichende Schutzwirkung während der Sterilisation erhalten wird. Daher beträgt das Molekulargewicht des Polysaccharids in der vorliegenden Erfindung vorzugsweise 1/500 oder mehr bis weniger als 1/2 des Molekulargewichts des Liganden, besonders bevorzugt 1/400 oder mehr bis weniger als 1/2 des Molekulargewichts des Liganden, am meisten bevorzugt 1/300 oder mehr bis weniger als 1/2 des Molekulargewichts des Liganden.

Insbesondere wenn ein Biomaterial (z.B. ein Antikörper) als Ligand verwendet wird, ist das Polysaccharid vorzugsweise ein Chitosan oder ein Chitin, das partiell in Chitosan umgewandelt ist, jeweils mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als 600 (Trimer) und nicht höher als 100 000 (467mer). Vom Standpunkt einer höheren Schutzwirkung während der Sterilisation liegt das Molekulargewicht des Polysaccharids vorzugsweise in der Nähe des Molekulargewichts des Liganden, solange die beiden Molekulargewichte die obigen Bedingungen erfüllen. Das Molekulargewicht des Sterilisationsschutzmittels ist besonders bevorzugt nicht kleiner als 600 und nicht größer als 90000, so dass das Sterilisationsschutzmittel die Wechselwirkung zwischen dem Liganden und der zu beeinflussenden Substanz nicht beeinträchtigt. Das Molekulargewicht des Sterilisationsschutzmittels ist am meisten bevorzugt nicht kleiner als 600 und nicht größer als 80000.

Das Polysaccharid, das das in der vorliegenden Erfindung verwendete Sterilisationsschutzmittel bildet, kann ein unmodifiziertes Polysaccharid sein, oder es kann ein terminal oder in der. Seitenkette modifiziertes Polysaccharid sein. Das Sterilisationsschutzmittel der vorliegenden Erfindung kann Additive zusammen mit einem Polysaccharid enthalten. Für die terminale Modifikation oder Modifikation in der Seitenkette kann eine geeignete Struktur verwendet werden, die gegenüber Sterilisation relativ beständig ist, wie eine Alkylkette, Polyethylenglycolkette oder dergleichen. Als Additive können je nach der Anwendung beliebige Verbindungen verwendet werden, und vorzugsweise werden solche verwendet, die Beständigkeit gegenüber der Sterilisation aufweisen.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Sterilisationsschutzmittel kann an den Liganden, der als zu sterilisierende Substanz verwendet wird, oder an die Oberfläche eines Trägers für den Liganden gebunden sein, oder es kann sich in der Nähe des Liganden befinden, um den Liganden während der Sterilisation stabil zu schützen. Die Anwesenheit des Sterilisationsschutzmittels in der Nähe des Liganden kann erreicht werden, indem sich das Mittel in einer Verdünnungsflüssigkeit befindet, in die eine zu sterilisierende Substanz gegeben wird, um die Sterilisation der Substanz durchzuführen. Um die Koexistenz des Sterilisationsschutzmittels der vorliegenden Erfindung und einer zu sterilisierenden Substanz zu erreichen, kann das Sterilisationsschutzmittel direkt auf die zu sterilisierende Substanz aufgetragen werden.

In der vorliegenden Erfindung bezieht sich "Oberfläche" auf eine Oberfläche, mit der eine biologisch zu beeinflussende Substanz in Kontakt kommen kann. Daher kann das Sterilisationsschutzmittel an die Oberfläche eines Trägers für einen biologischen Wirkstoff (Liganden) gebunden werden.

Die Bindung des Sterilisationsschutzmittels an einen Liganden oder an ein Substrat (z. B. poröses Material) als Träger kann in Form einer direkten kovalenten Bindung oder einer kovalenten Bindung über eine aktive Gruppe erfolgen. Bei der Bindung des Sterilisationsschutzmittels an einen Liganden oder Träger dafür, wie ein Substrat (z. B. poröses Material), kann eine Substitutionsreaktion, eine Kondensationsreaktion, eine Ringöffnungsreaktion oder dergleichen verwendet werden. Als aktive Gruppe an der Oberfläche des Trägers oder an dem Liganden, um das Sterilisationsschutzmittel daran zu binden, seien erwähnt eine aktive Gruppe, die durch Aktivierung unter Verwendung eines Halogenacetaminoalkylierungsmittels gebildet wird, eine Epoxygruppe, die durch Aktivierung unter Verwendung von Epichlorhydrin oder dergleichen gebildet wird, eine aktive Gruppe, die durch Aktivierung unter Verwendung einer Isocyanatgruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Aminogruppe, einer Carboxygruppe, einer Hydroxygruppe, einer Vinylgruppe oder Bromcyan gebildet wird, und so weiter. Als aktive Gruppe, die durch Aktivierung unter Verwendung eines Halogenacetaminoalkylierungsmittels gebildet wird, seien erwähnt eine &agr;-Acetaminohalogengruppe, die durch Aktivierung unter Verwendung eines N-Hydroxymethylhalogenacetamids oder dergleichen gebildet wird, eine &agr;,&bgr;-Propionaminohalogengruppe, die durch Aktivierung unter Verwendung eines N-Hydroxymethyldihalogenpropionamids oder dergleichen gebildet wird, eine &agr;,&agr;-Acetaminodihalogengruppe, die durch Aktivierung unter Verwendung eines N-Hydroxymethyldihalogenacetamids oder dergleichen gebildet wird, eine &agr;,&agr;,&agr;-Acetaminotrihalogengruppe, die durch Aktivierung unter Verwendung eines N-Hydroxymethyltrihalogenacetamids oder dergleichen gebildet wird, und so weiter.

In der vorliegenden Erfindung umfasst das Polysaccharid keine Substanz, bei der die Saccharidkette und die eine oder mehreren Ladungen voneinander getrennt sind, wie Glycoprotein.

In der vorliegenden Erfindung ist das zu sterilisierende Material ein biologisch aktives Material, wie es in Anspruch 1 definiert ist, das einen biologischen Wirkstoff, der eine Wechselwirkung mit einer biologisch zu beeinflussenden Substanz zeigt, und einen Träger für den biologischen Wirkstoff umfasst.

In der vorliegenden Erfindung ist der biologische Wirkstoff (Ligand) eine Substanz, der eine spezifische oder selektive Wechselwirkung mit einer zu beeinflussenden Substanz zeigt, und es handelt sich um eine Substanz mit einer Affinität zu der zu beeinflussenden Substanz oder einer Substanz, die eine Wirkung wie Katalyse, Aktivierung, Stimulation, Reaktion oder dergleichen auf die zu beeinflussende Substanz zeigt. Die Art des verwendeten Liganden ist je nach der zu beeinflussenden Substanz unterschiedlich, aber es handelt sich um ein Protein und/oder ein Peptid.

Als Beispiele für den Liganden, der eine Affinität zu denjenigen Zellen, die Hämocytenkomponenten des Blutes darstellen, insbesondere immunitätsassoziierte Zellen, aufweist, wird im Hinblick auf die geringe Immunogenität, wenn es innerhalb eines lebenden Körpers aufgelöst wird, ein Peptid mit etwa 3 bis 50 Aminosäure-Struktureinheiten bevorzugt, und im Hinblick auf die hohe Affinität zu einer zu beeinflussenden Substanz ist ein Antikörper oder dergleichen bevorzugt. Im Hinblick auf die hohe Affinität zu Zellen ist ein monoklonaler Antikörper besonders bevorzugt. Als Beispiele für den Antikörper, wenn er im Hinblick auf seine Funktion betrachtet wird, können genannt werden: Anti-CD4, Anti-CD8, Anti-CD3, Anti-CD2, Anti-CD1a, Anti-CD1b, Anti-CDS, Anti-CD3R, Anti-CD6, Anti-CD7, Anti-CD9, Anti-CD10, Anti-CD11a, Anti-CD18, Anti-CD19, Anti-CD20, Anti-CD21, Anti-CD22, Anti-CD23, Anti-CD24, Anti-CD37, Anti-CD40, Anti-CD72, Anti-CD77, Anti-CD16, Anti-CD32, Anti-CD33, Anti-CD34, Anti-CD35, Anti-CD64, Anti-CD65, Anti-CDw65, Anti-CD66b, Anti-CD66e, Anti-CD89, Anti-CDw90, Anti-CD56, Anti-CD57, Anti-CD94, Anti-CD105, Anti-CD106, Anti-CD46, Anti-CD31, Anti-CD36, Anti-CD41, Anti-CD42a, Anti-CD42b, Anti-CD63, Anti-CD11a, Anti-CD11b, Anti-CD11c, Anti-CD18, Anti-CD29, Anti-CD44, Anti-CD48, Anti-CD49a, Anti-CD49b, Anti-CD49c, Anti-CD49d, Anti-CD49e, Anti-CD49f, Anti-CD50, Anti-CD51, Anti-CD54, Anti-CD58, Anti-CD61, Anti-CD62E, Anti-CD62L, Anti-CD62P, Anti-CD103, Anti-CD26, Anti-CD30, Anti-CD69, Anti-CD70, Anti-CD71, Anti-CD95, Anti-CD25, Anti-CD117, Anti-CD122, Anti-CDw124, Anti-CD126 und Anti-CD127. Diese Antikörper können allein oder in Kombinationen von zwei oder mehr verwendet werden. Weiterhin kann sogar ein Peptid, das nur aus einem Teil eines solchen Antikörpers besteht, in befriedigender Weise als Ligand verwendet werden.

Wenn die zu beeinflussende Substanz eine Plasmakomponente ist, umfasst der Ligand, der eine Wechselwirkung mit der Substanz zeigt, alle Verbindungen oder Naturprodukte, die jeweils eine Affinität zu der Plasmakomponente aufweisen. Als Beispiele für einen solchen Liganden seien Antikörper gegen Plasmakomponenten, wie ein Anti-LDL-Antikörper und dergleichen, synthetische Verbindungen mit Ladungen, Polypeptide (Oligopeptide) mit nicht weniger als 3 und nicht mehr als 50 Aminosäure-Struktureinheiten, hochmolekulare Polymere erwähnt.

Der Ligand, der eine Katalyse gegenüber einer zu beeinflussenden Substanz zeigt und eine Wirkung im Sinne einer selektiven Reaktion, selektiven Modifikation oder dergleichen auf die Substanz aufweist, ist unter Verbindungen, Naturprodukten, im Blut enthaltenen Substanzen usw. zu finden, ist jedoch nicht auf solche beschränkt. Bevorzugt als ein solcher Ligand sind im Hinblick auf die Anforderung einer hohen Stabilität nach der Sterilisation Proteine, die von einem Organismus abgeleitet sind, wie ein Mitogen, Cytokin, Enzym und dergleichen. Wenn die zu beeinflussende Substanz eine Zelle ist, umfasst der Ligand auch einen zellstimulierenden Faktor, der die Zelle aktivieren, inaktivieren, differenzieren oder vermehren kann oder gegenüber der Zelle eine Immunantwortsteuernde Wirkung, eine Antitumorwirkung, eine antivirale Wirkung oder eine die Zellvermehrung oder -Differenzierung steuernde Wirkung zeigen kann.

Ein Mitogen wird auch eine zellteilungsinduzierende Substanz genannt und kann nicht nur die Zellteilung induzieren, sondern auch die Zelldifferenzierung fördern und Zellen eine besondere Funktion verleihen. Beispiele für ein Mitogen sind Phytohämagglutinin (PHA), Concanavalin A, Kidneybohnen-Lectin (PH), Kermes-Beeren-Mitogen (PWM), Lipopolysaccharid (LPS), Streptolysin 5, Tuberculin-Protein (PPD), Protein A und pneumococcales Polysaccharid (SIII). Insbesondere wird Kermesbeeren-Mitogen (PWM), das eine starke Wirkung auf Lymphocyten, Lipopolysaccharid (LPS) usw. zeigt, in befriedigender Weise verwendet.

Ein Cytokin ist ein proteinartiger Faktor, der aus Zellen freigesetzt wird und der eine zelluläre Wechselwirkung vermittelt, und ist eine Substanz, die eine Immunantwort-steuernde Wirkung, eine Antitumorwirkung, eine antivirale Wirkung oder eine die Zellvermehrung oder -Differenzierung steuernde Wirkung zeigt. Beispiele dafür sind die Interleukine 1 bis 13, die Interferone &agr;, &bgr; und &ggr;, Tumornekrosefaktor, Lymphotoxin, koloniestimulierende Faktoren, wie Granulocyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF), Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) und dergleichen, Erythropoietin, epidermaler Wachstumsfaktor und Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Insbesondere ist ein Cytokin, das auf Kontakt hin wirkt, befriedigend.

Ein Enzym ist ein Katalysator, der von einem Organismus produziert wird und eine Katalyse einer Reaktion unter milden Bedingungen zeigen kann. Das Enzym kann hauptsächlich in ein Oxidations-Reduktions-Enzym, eine Transferase, eine Hydrolase, ein Excisions- und Additionsenzym, eine Isomerase und eine Synthase klassifiziert werden. Jedes Enzym kann in befriedigender Weise verwendet werden.

In der vorliegenden Erfindung kann der Ligand an ein Substrat (z. B. ein poröses Material), das ein Träger für den Liganden ist, oder an ein Sterilisationsschutzmittel in Form einer direkten kovalenten Bindung oder einer kovalenten Bindung über eine aktive Gruppe gebunden sein. Bei der Bindung des Liganden an einen Träger oder ein Sterilisationsschutzmittel kann jede beliebige Reaktion verwendet werden, solange die Aktivität des Liganden aufrechterhalten wird, aber eine Substitutionsreaktion, eine Kondensationsreaktion, eine Ringöffnungsreaktion oder dergleichen werden vorzugsweise verwendet. Als aktive Gruppe kann dieselbe aktive Gruppe verwendet werden, wie sie auch für die Bindung des Sterilisationsschutzmittels der vorliegenden Erfindung an einen Liganden, einen Träger oder dergleichen verwendet wird, doch wird vorzugsweise eine aktive Gruppe verwendet, die unter Verwendung eines Halogenacetaminoalkylierungsmittels, einer Epoxygruppe oder dergleichen gebildet wird, insbesondere deshalb, weil der Ligand unter milden Bedingungen damit umgesetzt werden kann, wobei die Aktivität des Liganden aufrechterhalten wird. Insbesondere wenn der Ligand ein Biomaterial wie ein Antikörper oder dergleichen ist, ist eine aktive Gruppe, die unter Verwendung eines Halogenacetaminoalkylierungsmittels gebildet wird, am meisten bevorzugt.

In der vorliegenden Erfindung können als Beispiele für den Träger für den Liganden ein poröses Material, ein Filmmaterial, ein plattenartiges Material, ein granuläres Material und ein tubuläres Material genannt werden. Ein poröses Material wird besonders bevorzugt. Das poröse Material kann eine beliebige Form haben, solange das poröse Material in Kontakt mit einer zu beeinflussenden Substanz treten kann. Die Form hat vorzugsweise eine große spezifische Oberfläche, damit der Ligand in einer flüssigen Phase mit einer hohen Kontaktfrequenz mit einer zu beeinflussenden Substanz in Kontakt treten kann. Eine bevorzugte Form des porösen Materials umfasst faserige Strukturen, wie faserige, baumwollartige, garnartige, bündelartige, bambusjalousieartige, gewebeartige, vliesartige und dergleichen, polymere poröse Materialien, wie Schwamm und dergleichen, eine Perlform, eine Gelform, eine Hohlgarnform und so weiter. Insbesondere wenn eine Zellkomponente aus Blut abgetrennt, geteilt oder entfernt wird, wird ein Gewebe oder Vlies wegen der Effizienz bevorzugt, und wegen der leichten Steuerung ist ein Vlies am meisten bevorzugt.

Wenn das poröse Material die Form eines Vlieses hat, kann der mittlere Faserdurchmesser desselben in geeigneter Weise gewählt werden. Wenn es sich bei der zu beeinflussenden Substanz zum Beispiel um Zellen handelt und die Zellen spezifisch entfernt werden, wird vorzugsweise ein Vlies mit einem mittleren Faserdurchmesser von nicht weniger als 3 &mgr;m, aber weniger als 30 &mgr;m verwendet. Ein mittlerer Faserdurchmesser von weniger als 3 &mgr;m ist nicht bevorzugt, da dann die spezifische Adsorption von anderen Komponenten als der zu beeinflussenden Substanz zunimmt. Indessen ist ein mittlerer Faserdurchmesser von 30 &mgr;m oder mehr nicht bevorzugt, da dann die Kontaktfrequenz mit der zu beeinflussenden Substanz erheblich gering ist und die Effizienz gering ist. Wenn es sich bei der zu beeinflussenden Substanz um Zellen handelt und die Zellen spezifisch entfernt werden, ist der mittlere Faserdurchmesser daher vorzugsweise nicht kleiner als 3 &mgr;m, aber kleiner als 25 &mgr;m, am meisten bevorzugt nicht kleiner als 3 &mgr;m, aber kleiner als 20 &mgr;m.

Als Basismaterial für das poröse Material kann jedes beliebige Material in befriedigender Weise verwendet werden, solange ein Sterilisationsschutzmittel oder ein Ligand in Form einer kovalenten Bindung daran gebunden werden kann oder eine funktionelle Gruppe eingeführt werden kann. Als Beispiele für das Material, das im Hinblick auf die Festigkeit und praktische Anwendbarkeit zu bevorzugen ist, seien erwähnt Polyolefine, wie Polyethylen, Polypropylen, Polybutylen und dergleichen, Polystyrol-Derivate, wie Polystyrol, Polyalkylstyrole, Polyalkoxystyrole, Polyvinylnaphthalin und dergleichen, polyaromatensubstituierte Ethylene, Polyester, wie Polyethylenterephthalat und dergleichen, Polymere des Polyvinylalkoholtyps, Polymethacrylsäureester, wie Polymethylmethacrylat, Polybenzylmethacrylat und dergleichen, und ähnliche Acrylsäureester, Polyamide, wie Nylon 66, Nylon 6 und dergleichen, Copolymere oder Gemische aus einer Vielzahl von Materialien, wie Polyethylen-Polypropylen-Copolymer, Styrol-Butadien-Copolymer, Polypropylen-Polystyrol-Gemisch und dergleichen, sowie amorphe Materialien daraus. Aufgrund der Stabilität des Materials und der Leichtigkeit der Einführung funktioneller Gruppen sind Polypropylen, Polyethylen, Polyethylen-Polypropylen-Copolymer usw. als Material bevorzugt, und besonders bevorzugt sind Polypropylen, Polyethylen-Polypropylen-Copolymer.

Die biologisch zu beeinflussende Substanz umfasst alle Substanzen, die durch den oben genannten Liganden beeinflusst werden, doch müssen diese eine einzigartige Eigenschaft haben, wie sie durch den Ligand spezifisch beeinflusst wird. Beispiele für die zu beeinflussende Substanz sind Substanzen, die von einem Organismus abgeleitet sind, insbesondere Blutkomponenten oder Zellen. Beispiele für die zu beeinflussende Substanz unter dem Gesichtspunkt der Art des darauf angewendeten Liganden sind wie folgt. Wenn der Ligand ein Antikörper ist, seien ein Antigen für den Antikörper, eine das Antigen tragende Zelle oder eine als Antigen wirkende Plasmakomponente erwähnt. Wenn der Ligand ein Peptid mit einer Affinität für ein Antigen ist, seien das Antigen, eine das Antigen tragende Zelle oder eine als Antigen wirkende Plasmakomponente erwähnt. Wenn der Ligand ein Enzym, ein Cytokin oder ein zellstimulierender Faktor ist, seien ein durch das Enzym zu beeinflussendes Substrat oder eine Zelle erwähnt, die so beeinflusst werden soll, dass sie eine Aktivierung, Inaktivierung, Differenzierung, Immunantwort oder dergleichen durch den zellstimulierenden Faktor oder das Cytokin erfährt.

In der vorliegenden Erfindung seien als Blutkomponenten erwähnt: in Blut vorhandene Hämocytenkomponenten, wie Lymphocyten, Granulocyten, Monocyten, Blutplättchen, hämatopoetische Stammzellen und dergleichen, Plasmaproteine, wie Albumin, &ggr;-Globulin, basisches Protein, Immunglobulin, Lipoprotein geringer Dichte, &bgr;2-Mikroglobulin, retinolgebundenes Protein, Ceruloplasmin, Transthyretin und dergleichen, in Plasma enthaltene Substanzen, wie Bilirubin und dergleichen, Glycoproteine, die ein Saccharid in der Struktur enthalten, und so weiter. Die Blutkomponenten sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Biomaterialien wie DNA, RNA und dergleichen sowie andere sind ebenfalls von den Blutkomponenten mit umfasst. Als besonders zu bevorzugende Beispiele für die Blutkomponenten seien T-Zellen, wie Helfer-T-Zelle, Suppressor-T-Zelle und dergleichen, B-Zellen oder hämatopoetische Stammzellen erwähnt.

In der vorliegenden Erfindung umfasst das Blut neben gewöhnlichem Blut auch eine Lymphocytensuspension, eine Monocytensuspension, Knochenmarksflüssigkeit, Nabelschnurblut, Leukocytenstratum, Blutplättchenkonzentrat, Erythrocytenkonzentrat, peripheres Blut, an das ein hämatopoetischer Faktor, wie G-CSF oder dergleichen verabreicht wird, usw. Weiterhin ist es möglich, ein Antikoagulans, einen Blutkonservierungsstoff usw. zu diesen Bluttypen zu geben, falls dies notwendig sein sollte.

In der vorliegenden Erfindung ist das biologisch wirksame Material (im folgenden einfach als das aktive Material bezeichnet) ein zu sterilisierendes Material, das einen biologischen Wirkstoff und einen Träger umfasst. Um das wirksame Material zu sterilisieren, wird ein bekanntes Sterilisationsverfahren, wie Strahlungssterilisation, feuchte heiße Sterilisation, chemische Sterilisation oder dergleichen, verwendet. Vorzugsweise wird eine Bestrahlungssterilisation verwendet, die eine Strahlung, wie Gammastrahlen, Elektronenstrahlen oder dergleichen, verwendet. Die Einwirkung der Strahlung ist je nach der Dichte des wirksamen Materials und der Zahl der lebensfähigen Keime vor der Sterilisation unterschiedlich, beträgt jedoch vorzugsweise wenigstens 1 kGy. Eine Bestrahlung mit 80 kGy oder mehr ist nicht bevorzugt, da ein anderes Material als der Ligand beeinträchtigt werden kann. Unter dem Gesichtspunkt der Stabilität der Sterilisationswirkung ist eine besonders bevorzugte Dosis nicht kleiner als 2 kGy und nicht größer als 65 kGy, und die am meisten bevorzugte Dosis ist nicht kleiner als 2 kGy und nicht größer als 50 kGy.

In der vorliegenden Erfindung wird das aktive Material im Hinblick auf die Handhabung während der Verwendung und die Stabilität des Liganden während der Sterilisation vorzugsweise in einem feuchten Zustand zusammen mit einer Verdünnungsflüssigkeit sterilisiert. Die Verdünnungsflüssigkeit kann eine beliebige Flüssigkeit sein, solange es sich um eine Flüssigkeit handelt, die keine Verschlechterung des Liganden verursacht; die Verdünnungsflüssigkeit ist jedoch vorzugsweise eine wässrige Lösung, die die zu beeinflussende Substanz oder dergleichen nicht beeinträchtigt, auch wenn die Verdünnungsflüssigkeit während der Verwendung bleibt. Wenn die zu beeinflussende Substanz eine Blutkomponente oder dergleichen ist, wird vorzugsweise eine Flüssigkeit verwendet, die durch Hinzufügen eines Sterilisationsschutzmittels zu einer salzhaltigen wässrigen Lösung erhalten wird. Der pH-Wert der Verdünnungsflüssigkeit ist vorzugsweise nicht kleiner als 4, aber kleiner als 12. Ein pH-Wert von weniger als 4 oder 12 oder mehr ist nicht bevorzugt, da er leicht eine Verschlechterung des Liganden usw. bewirkt. Der pH-Wert der Verdünnungsflüssigkeit ist besonders bevorzugt nicht kleiner als 4, aber kleiner als 11, am meisten bevorzugt nicht kleiner als 5, aber kleiner als 11.

Wenn ein Sterilisationsschutzmittel zu der Verdünnungsflüssigkeit gegeben wird, wird die Konzentration des Sterilisationsschutzmittels in geeigneter Weise ausgewählt. Wenn ein Antikörper als Ligand verwendet wird, ist die bevorzugte Konzentration des Sterilisationsschutzmittels nicht kleiner als 0,1 Gew.-% und nicht mehr als 15 Gew.-%. Eine Konzentration des Sterilisationsschutzmittels von weniger als 0,1 Gew.-% ist nicht bevorzugt, da es dann schwierig ist, eine ausreichende Schutzwirkung während der Sterilisation zu erhalten. Indessen ist eine Konzentration des Sterilisationsschutzmittels von mehr als 15 Gew.-% nicht bevorzugt, da dies eine hohe Viskosität ergibt. Die Konzentration des Sterilisationsschutzmittels ist besonders bevorzugt nicht kleiner als 0,1% und nicht größer als 10%, am meisten bevorzugt nicht kleiner als 1% und nicht größer als 10%.

Das wirksame Material gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch dann geeignet, wenn es in einem nicht-aseptischen Zustand verwendet wird, aber es ist besonders effektiv, wenn es in einer aseptischen Umgebung verwendet wird. In der vorliegenden Erfindung kann das wirksame Material verwendet werden, indem man es in einen Behälter einfüllt, der wenigstens einen Einlass und einen Auslass hat, und es kann für die spezifische Entfernung oder Gewinnung von Zellen oder für den externen Kreislauf zur spezifischen Entfernung von Zellen verwendet werden. Das wirksame Material kann weiterhin für die spezifische Abtrennung, Adsorption, Entfernung usw. von Zellfraktionen, wie Leukocyten, Lymphocyten, Monocyten, Granulocyten und dergleichen, verwendet werden. Das wirksame Material kann weiterhin für die spezifische Entfernung und Gewinnung von Plasmakomponenten verwendet werden. Wenn ein Enzym oder dergleichen als Ligand verwendet wird, kann das wirksame Material für einen Bioreaktor verwendet werden. Wenn als Ligand ein Material verwendet wird, das eine selektive Reaktivität gegenüber und/oder eine selektive Modifizierbarkeit für eine zu beeinflussende Substanz aufweist, kann das wirksame Material für die Zellaktivierung usw. verwendet werden.

Bevorzugte Beispiele für die Anwendung des wirksamen Materials auf die vorliegende Erfindung sind unten aufgeführt.

  • 1. Ein spezifischer Entfernen für CD4-positive Zellen, um nur eine bestimmte Hämocytenkomponente im Blut zu entfernen, wobei ein poröses Material mit einem monoklonalen Anti-CD4-Antikörper als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 2. Ein spezifischer CD34-Separator, um nur eine bestimmte Hämocytenkomponente im Blut abzufangen und zu gewinnen, wobei ein poröses Material mit einem monoklonalen Anti-CD34-Antikörper als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 3. Ein spezifischer Entfernen für CD3-Zellen, um nur eine bestimmte Hämocytenkomponente im Blut abzufangen und zu gewinnen, wobei ein poröses Material mit einem monoklonalen Anti-CD3-Antikörper als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 4. Ein spezifischer LDL-Entferner, um nur eine bestimmte Plasmakomponente im Blut abzufangen, wobei ein poröses Material mit einem monoklonalen Anti-LDL-Antikörper als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 5. Ein spezifischer Entfernen für CD4-positive Zellen, um nur eine bestimmte Hämocytenkomponente im Blut zu entfernen, wobei ein poröses Material mit einem Peptid, das eine Affinität zu CD4-Zellen aufweist, als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 6. Ein spezifischer LDL-Entferner, um nur eine bestimmte Plasmakomponente im Blut abzufangen, wobei ein poröses Material mit einem Peptid, das eine Affinität zu LDL aufweist, als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 7. Eine zellstimulierende Vorrichtung, um nur eine bestimmte Zellkomponente im Blut zu stimulieren, wobei ein poröses Material mit einem Mitogen als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 8. Eine zellaktivierende Vorrichtung, um nur eine bestimmte Zellkomponente im Blut zu aktivieren, wobei ein poröses Material mit einem Mitogen als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 9. Ein Bioreaktor, um nur eine bestimmte Substanz in einer Lösung zu modifizieren, wobei ein poröses Material mit einem Enzym als Ligand in einen Behälter. gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 10. Eine zellvermehrende Vorrichtung, wobei ein poröses Material mit einem Cytokin als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 11. Einen Zellinkubator, wobei ein poröses Material mit einem zellstimulierenden Faktor oder einem zellvermehrenden Faktor als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.
  • 12. Ein leukocytenentfernendes System, um nur eine bestimmte Leukocytenkomponente im Blut zu entfernen, das einen spezifischen Entfernen für CD4-positive Zellen, um nur eine bestimmte Blutkörperchenkomponente im Blut zu entfernen, in einem Blutkreislauf enthält, wobei in diesem Entfernen ein poröses Material mit einem monoklonalen Anti-CD4-Antikörper als Ligand in einen Behälter gefüllt wird, der einen Einlass und einen Auslass hat.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen ausführlicher beschrieben, ist jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

2,15 g N-Hydroxymethylbromacetamid und 100 ml Sulfolan wurden in einen Glaskolben gegeben und gerührt. Dazu wurden 25 9 Trifluormethansulfonsäure gegeben, und anschließend wurde gerührt. Dort hinein gab man 0,1 g eines aus Polystyrol bestehenden Vliesstoffes (mittlerer Faserdurchmesser: 4,5 &mgr;m), und man ließ eine Reaktion 4 Stunden lang bei 25°C stattfinden. Nach der Reaktion wurde der Vliesstoff herausgenommen, mit reinem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man einen aktivierten Vliesstoff erhielt.

Der Vliesstoff wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,6 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l einer Lösung eines monoklonalen Anti-Human-CD4-Antikörpers (im folgenden abgekürzt als "Anti-Human-CD4-Lösung") eingetaucht, die man erhielt, indem man 72 &mgr;g eines monoklonalen Anti-Human-CD4-Antikörpers ("Anti-CD4 Monoclonal Purified Antibody" von Immunotec Co.; Molekulargewicht = 55 000) in 500 &mgr;l einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (im folgenden abgekürzt als "PBS-(-)-Lösung"), die weder Calcium noch Magnesium enthielt, löste, um den monoklonalen Antikörper (im folgenden abgekürzt als "Antikörper") auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen. Dann wurde der Vliesstoff in eine PBS-(-)-Lösung eingetaucht, die 5% Chitosan (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 3000 bis 30 000, das sind 1/50 bis 1/5 des Molekulargewichts des Liganden) enthielt, um das Chitosan 2,5 Stunden lang bei 4°C zu immobilisieren. Danach wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen, wobei man das gewünschte wirksame Material (Filter) erhielt.

Danach wurden fünf Platten des obigen Filters zusammen mit dem PBS-(-) als Füllflüssigkeit mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter (ein Produkt von Movitech) mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule für die Abtrennung CD4-positiver Zellen herzustellen. Die Säule wurde unter Verwendung eines Cobalt-60-Bestrahlungsgeräts mit 25 kGy (Dosisleistung: 1,5 kGy/h) einer Gammastrahlung bestrahlt.

Die resultierende Säule wurde vom Einlass der Säule her unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit 3 ml humanem Frischblut mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) versorgt, und das behandelte Blut wurde aus dem Auslass der Säule gewonnen.

Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen wurde mit Durchflusscytometrie berechnet, indem man die Zahl der CD4-positiven Zellen in unbehandeltem Blut und in behandeltem Blut maß. Die Zahl der CD4-positiven Zellen in unbehandeltem Blut betrug 4,0 × 105, und die Zahl in behandeltem Blut betrug 4,0 × 104; daher betrug der Entfernungsgrad 90%. In diesem Fall wurden der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen, der Entfernungsgrad von B-Lymphocyten und der Entfernungsgrad von Blutplättchen in derselben Weise bestimmt; als Ergebnis betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 5%, der Entfernungsgrad von B-Lymphocyten betrug 8%, und der Entfernungsgrad von Blutplättchen betrug 20%. Es wurde bestätigt, dass CD4-positive Zellen spezifisch entfernt werden können und dass die Aktivität von Anti-CD4-Antikörper aufrechterhalten wurde.

Um zu bestätigen, ob die Säule durch die obige Sterilisationsbehandlung ausreichend sterilisiert wurde oder nicht, wurde die Zahl der lebensfähigen Keime in der Füllflüssigkeit nach der Sterilisation gemäß dem Verfahren der Pharmacopoeia of Japan untersucht. In der Verdünnungsflüssigkeit wurden nach der Sterilisation keine Mikroben nachgewiesen.

Vergleichsbeispiel 1

Dasselbe experimentelle Verfahren wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt, außer dass das 5%ige Chitosan durch eine PBS-(-)-Lösung ersetzt wurde, die 5% Fructose enthielt, die ein Monosaccharid ist und keine positive Ladung aufweist (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., mit einem Molekulargewicht von 180, das sind 1/833 des Molekulargewichts des Liganden). In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen 30%; was die anderen Zellen betrifft, so betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 29%, und der Entfernungsgrad von B-Zellen betrug 40%; die spezifische Entfernungsfähigkeit für CD4-positive Zellen des Vliesstoffs mit den immobilisierten monoklonalen Anti-CD4-Antikörpern verschwand als Ergebnis der Gammabestrahlung.

Beispiel 2

2,15 g N-Hydroxymethyliodacetamid, 50 ml konzentrierte Schwefelsäure und 40 ml Nitrobenzol wurden in einen Glaskolben gegeben und durch Rühren zu einer Lösung verarbeitet. Dazu wurden 0,3 g Paraformaldehyd in einem Eisbad gegeben, und anschließend wurde gerührt. Dort hinein gab man 0,1 g eines aus Polypropylen bestehenden Vliesstoffes (mittlerer Faserdurchmesser: 3,3 &mgr;m), und man ließ eine Reaktion 3 Stunden lang bei 25 °C stattfinden. Nach der Reaktion wurde der Vliesstoff herausgenommen, mit Ethanol und reinem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man einen aktivierten Vliesstoff erhielt.

Der Vliesstoff wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen. Dann wurde der Vliesstoff in dieselbe 5%ige Chitosan-PBS-(-)-Lösung eingetaucht, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, um das Chitosan 2,5 Stunden lang bei 4°C zu immobilisieren. Danach wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen, wobei man die gewünschten wirksamen Materialien (Filter) erhielt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden zehn der obigen Filter zusammen mit der 5%igen Chitosan-PBS-(-)-Lösung als Füllflüssigkeit mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 35 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 81%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 13%, der Entfernungsgrad von B-Lymphocyten betrug 13%, und der Entfernungsgrad von Blutplättchen betrug 25%. Es wurde bestätigt, dass CD4-positive Zellen spezifisch entfernt werden können und dass die Aktivität von Anti-CD4-Antikörper aufrechterhalten wurde.

Vergleichsbeispiel 2

Dasselbe experimentelle Verfahren wie in Beispiel 2 wurde durchgeführt, außer dass das 5%ige Chitosan durch eine PBS-(-)-Lösung ersetzt wurde, die 5% Humanalbumin (Glycoprotein) (ein Produkt von Boehringer Mannheim) enthielt und die als Immobilisierungslösung und Füllflüssigkeit verwendet wurde. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen 33%; der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen betrug immerhin 40%; der Entfernungsgrad von B-Zellen betrug immerhin 29%; und eine spezifische Entfernungsfähigkeit von Zellen war nicht zu erkennen.

Beispiel 3

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4 °C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden fünf der obigen Filter und eine PBS(-)-Lösung, die 3% Glucosamin-Trimer (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 611, das sind 1/241 des Molekulargewichts des Liganden) enthielt, als Füllflüssigkeit mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 83%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 31%. Es wurde bestätigt, dass CD4-positive Zellen spezifisch entfernt werden können und dass die Aktivität von Anti-CD4-Antikörper aufrechterhalten wurde.

Beispiel 4

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden fünf der obigen Filter und eine PBS(-)-Lösung, die 7% Glucosamin-Pentamer (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 1006, das sind 1/149 des Molekulargewichts des Liganden) enthielt, als Füllflüssigkeit mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 79%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 27%. Es wurde bestätigt, dass CD4-positive Zellen spezifisch entfernt werden können und dass die Aktivität von Anti-CD4-Antikörper aufrechterhalten wurde.

Beispiel 5

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden fünf der obigen Filter und eine PBS(-)-Lösung, die 5% Glucosamin-Heptamer (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 1401, das sind 1/107 des Molekulargewichts des Liganden) enthielt, als Füllflüssigkeit mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 83%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 27%. Es wurde bestätigt, dass CD4-positive Zellen spezifisch entfernt werden können und dass die Aktivität von Anti-CD4-Antikörper aufrechterhalten wurde.

Vergleichsbeispiel 3

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden fünf der obigen Filter und eine PBS-(-)-Lösung, die 5% Dextransulfat, ein Polysaccharid, das negative Ladungen aufweist (ein Produkt von Sigma Co.; Molekulargewicht = 50 000, das sind 1/3 des Molekulargewichts des Liganden), enthielt, als Füllflüssigkeit mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 19%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 22%. Die spezifische Entfernungsfähigkeit für CD4-positive Zellen des Vliesstoffs mit den immobilisierten monoklonalen Anti-CD4-Antikörpern verschwand als Ergebnis der Gammabestrahlung.

Vergleichsbeispiel 4

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l einer Lösung von Anti-Human-CD4 in PBS-(-) (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden fünf der obigen Filter und eine PBS-(-)-Lösung, die 3% Dextransulfat, ein Polysaccharid, das negative Ladungen aufweist (ein Produkt von Sigma Co.; Molekulargewicht = 500 000, das sind 1/0,3 des Molekulargewichts des Liganden), enthielt, als Füllflüssigkeit mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 26%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 22%. Die spezifische Entfernungsfähigkeit für CD4-positive Zellen des Vliesstoffs mit den immobilisierten monoklonalen Anti-CD4-Antikörpern verschwand als Ergebnis der Gammabestrahlung.

Vergleichsbeispiel 5

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden fünf der obigen Filter und eine PBS(-)-Lösung, die 7% Heparin, ein Polysaccharid, das negative Ladungen aufweist (ein Produkt von The Green Cross Corporation; Molekulargewicht = 17 000 bis 20 000, das sind 1/8 bis 1/7,5 des Molekulargewichts des Liganden), enthielt, als Füllflüssigkeit mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 16%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 26%. Die spezifische Entfernungsfähigkeit für CD4-positive Zellen des Vliesstoffs mit den immobilisierten monoklonalen Anti-CD4-Antikörpern verschwand als Ergebnis der Gammabestrahlung.

Vergleichsbeispiel 6

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden fünf der obigen Filter und eine PBS(-)-Lösung, die 5% Globulin (ein Glycoprotein) (ein Produkt von Boehringer Mannheim) enthielt, als Füllflüssigkeit mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 30%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 26%. Die spezifische Entfernungsfähigkeit für CD4-positive Zellen des Vliesstoffs mit den immobilisierten monoklonalen Anti-CD4-Antikörpern verschwand als Ergebnis der Gammabestrahlung.

Vergleichsbeispiel 7

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

Fünf der obigen Filter und eine Füllflüssigkeit, d. h. eine PBS-(-)-Lösung, die 5% Humanalbumin, ein Protein (ein Produkt von Sigma Co.), und 5% Dextran, ein Polysaccharid, das keine positive Ladung aufweist (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 10 000, das sind 1/15 des Molekulargewichts des Liganden), enthielt, wurden mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 28%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 26%. Die spezifische Entfernungsfähigkeit für CD4-positive Zellen des Vliesstoffs mit den immobilisierten monoklonalen Anti-CD4-Antikörpern verschwand als Ergebnis der Gammabestrahlung.

Vergleichsbeispiel 8

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

Fünf der obigen Filter und eine Füllflüssigkeit, d. h. eine PBS-(-)-Lösung eines monoklonalen Maus-Antikörpers, eines Proteins (ein Produkt von Immunotec Co.) (72 &mgr;g/500 &mgr;l), wurden mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 29%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 29%. Die spezifische Entfernungsfähigkeit für CD4-positive Zellen des Vliesstoffs mit den immobilisierten monoklonalen Anti-CD4-Antikörpern verschwand als Ergebnis der Gammabestrahlung.

Vergleichsbeispiel 9

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

Fünf der obigen Filter und eine Füllflüssigkeit, d. h. eine PBS-(-)-Lösung, die 5% eines Glucosamin-Hydrochlorids, ein Monosaccharid, das eine positive Ladung aufweist (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 216, das sind 1/694 des Molekulargewichts des Liganden), enthielt, wurden mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde zur Sterilisation mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 35%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 24%. Die spezifische Entfernungsfähigkeit für CD4-positive Zellen des Vliesstoffs mit den immobilisierten monoklonalen Anti-CD4-Antikörpern verschwand als Ergebnis der Gammabestrahlung.

Beispiel 6

Derselbe aktivierte Vliesstoff, wie er in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Lösung von Anti-Human-CD4 in PBS-(-) (72 &mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper auf dem Vliesstoff zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen.

Fünf der obigen Filter und eine Füllflüssigkeit, d. h. eine PBS-(-)-Lösung, die 0,5% Galactosamin-Decamer (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 1621, das sind 1/92 des Molekulargewichts des Liganden) enthielt, mit einer Fülldichte von 0,1 g/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde zur Sterilisation mit 25 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 81%. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 23%. Es wurde bestätigt, dass CD4-positive Zellen spezifisch entfernt werden können und dass die Aktivität von Anti-CD4-Antikörper aufrechterhalten wurde.

Beispiel 7

2,15 g N-Hydroxymethyliodacetamid, 50 ml konzentrierte Schwefelsäure und 40 ml Nitrobenzol wurden in einen Glaskolben gegeben und durch Rühren zu einer Lösung verarbeitet. Dazu wurden 0,3 g Paraformaldehyd in einem Eisbad gegeben, und anschließend wurde gerührt. Dort hinein gab man 0,1 g eines aus Polypropylen bestehenden Vliesstoffes (mittlerer Faserdurchmesser: 3,3 &mgr;m), und man ließ eine Reaktion 2 Stunden lang bei 25 °C stattfinden. Nach der Reaktion wurde der Vliesstoff herausgenommen, mit Ethanol und reinem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man einen aktivierten Vliesstoff erhielt.

Der Vliesstoff wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,55 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 100 &mgr;l einer Lösung einer Alkalischen Phosphatase in PBS-(-) (0,0125 &mgr;g/&mgr;l) eingetaucht, um das Enzym zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen. Der Vliesstoff wurde in eine PBS-(-)-Lösung eingetaucht, die 1% Chitosan (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 3000 bis 30 000) enthielt, um das Chitosan 2,5 Stunden lang bei 4°C zu immobilisieren. Dann wurde der Vliesstoff mit dem PBS-(-) gewaschen, wobei man das gewünschte wirksame Material (einen Bioreaktor) erhielt.

Der Bioreaktor wurde in eine 96-Napf-Mikroplatte eingesetzt. Die Mikroplatte wurde mit einer 1%igen Chitosanlösung als Füllflüssigkeit gefüllt und dann mit 5 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

Nach der Sterilisation wurde die Füllflüssigkeit durch die PBS-(-)-Lösung ersetzt. Dort hinein gab man 100 &mgr;l einer p-Nitrophenylphosphorsäure-Diethanolamin-Pufferlösung (Konzentration = 2 mg/ml). Man ließ die resultierende Lösung 5 Minuten lang bei 25°C stehen, und der Vliesstoff wurde daraus entfernt. Dann wurde ihre Extinktion bei 405 nm gemessen. Die Extinktion betrug 1,5, und es wurde bestätigt, dass die Aktivität des Enzyms aufrechterhalten wurde. In diesem Fall betrug die Extinktion des Kontrollsystems, in dem nur Chitosan immobilisiert war, 0,1.

Vergleichsbeispiel 10

Dasselbe experimentelle Verfahren wie in Beispiel 8 wurde durchgeführt, außer dass das 1%ige Chitosan durch eine PBS-(-)-Lösung ersetzt wurde, die 1% Fructose enthielt, die ein Monosaccharid ist, das keine positive Ladung aufweist (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 180, das sind 1/833 des Molekulargewichts des Liganden). Die Extinktion nach 5 Minuten bei 25°C betrug 0,2, und die Aktivität des Enzyms nahm merklich ab.

Beispiel 8

1 g eines Chitins (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Molekulargewicht = 3000 bis 30 000, das sind 1/50 bis 1/5 des Molekulargewichts des Liganden) wurde zu 100 ml 5%iger Natronlauge gegeben und 5 Stunden lang bei 50°C hydrolysiert, wobei man Chitin erhielt, das partiell in Chitosan umgewandelt wurde. Dieses partiell in Chitosan umgewandelte Chitin wurde mit 1 N Salzsäure titriert, um seinen Umwandlungsgrad in Chitosan zu messen, der 70% betrug.

Dasselbe experimentelle Verfahren wie in Beispiel 7 wurde durchgeführt, außer dass eine PBS-(-)-Lösung, die 1% des obigen partiell in Chitosan umgewandelten Chitins enthielt, als Sterilisationsschutzmittel anstelle der 1%igen Chitosan-PBS-(-)-Lösung verwendet wurde und dass die Dosis der Gammastrahlung auf 25 kGy geändert wurde. Die Extinktion nach 5 Minuten bei 25°C betrug 0,9, und es wurde bestätigt, dass die Aktivität des Enzyms aufrechterhalten wurde.

Vergleichsbeispiel 11

Dasselbe experimentelle Verfahren wie in Beispiel 9 wurde durchgeführt, außer dass die obige PBS-(-)-Lösung, die 1% eines partiell in Chitosan umgewandelten Chitins enthielt, durch eine PBS-(-)-Lösung, die 1% Dextran, ein Polysaccharid, das keine positive Ladung aufweist, enthielt, ersetzt wurde. Die Extinktion nach 5 Minuten bei 25°C betrug 0,05, und die Aktivität des Enzyms nahm ab.

Beispiel 9

2,15 g N-Hydroxymethyliodacetamid, 50 ml konzentrierte Schwefelsäure und 40 ml Nitrobenzol wurden in einen Glaskolben gegeben und durch Rühren zu einer Lösung verarbeitet. Dazu wurden 0,3 g Paraformaldehyd in einem Eisbad gegeben, und anschließend wurde gerührt. Dort hinein gab man 0,1 g eines aus Polypropylen bestehenden Vliesstoffes (mittlerer Faserdurchmesser: 3,3 &mgr;m), und man ließ eine Reaktion 3 Stunden lang bei 25°C stattfinden. Nach der Reaktion wurde der Vliesstoff herausgenommen, mit Ethanol und reinem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man einen aktivierten Vliesstoff erhielt.

Der Vliesstoff wurde zu Kreisen mit einem Durchmesser von 0,68 cm geschnitten und 2,5 Stunden lang bei 4°C in 200 &mgr;l der Anti-Human-CD4-Lösung (72&mgr;g/500 &mgr;l) eingetaucht, um den Antikörper zu immobilisieren. Nach der Immobilisierung wurde der Vliesstoff mit der PBS-(-)-Lösung gewaschen. Dann wurde der Vliesstoff zur Beschichtung 2,5 Stunden lang bei 4°C in dieselbe 5%ige Chitosan-PB5-(-)-Lösung eingetaucht, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde. Danach wurde das resultierende Filter 3 Stunden lang auf –80 °C gekühlt und anschließend gefriergetrocknet, wobei man die gewünschten wirksamen Materialien (Trockenfilter) erhielt.

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden zehn der obigen Trockenfilter mit einer Fülldichte von 0,19/cm3 in einen 1-ml-Behälter mit einem Einlass und einem Auslass gefüllt, um eine Säule herzustellen. Die Säule wurde mit 15 kGy einer Gammastrahlung bestrahlt.

Die Säule wurde mit 5 ml der PBS-(-)-Lösung vorbehandelt. In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden dann 3 ml eines humanen Frischbluts mit ACD-A-Zusatz (Blut : ACD-A = 8 : 1) unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeführt. Der Entfernungsgrad CD4-positiver Zellen betrug 80. In diesem Fall betrug der Entfernungsgrad von CD8-positiven Zellen 13. Es wurde bestätigt, dass CD4-positive Zellen spezifisch entfernt werden können und dass die Aktivität von Anti-CD4-Antikörper aufrechterhalten wurde.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Sterilisationsverfahren bereitgestellt, das die Sterilisation eines biologischen Wirkstoffs auch im feuchten Zustand ermöglicht, wobei die Aktivität des biologischen Wirkstoffs aufrechterhalten wurde. Da gemäß diesem Verfahren ein Reaktor, in den ein Material mit einem biochemischen Wirkstoff gefüllt wird, in feuchtem Zustand sterilisiert werden kann, können Operationen wie Vorbehandlung und dergleichen einfach durchgeführt werden, indem man den Reaktor verwendet.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Strahlungssterilisation eines biologischen Wirkstoffs, der aus der Gruppe von Proteinen und/oder Peptiden ausgewählt ist, in Gegenwart eines Sterilisationsschutzmittels mit einem Polysaccharid, das wenigstens drei Monosaccharide umfasst, die jeweils positive Ladungen aufweisen.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die positiven Ladungen des Monosaccharids auf eine Amino- oder eine Iminogruppe zurückzuführen sind.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Wirkstoff aus einem Antikörper gegen Zelloberflächenantigen, einem Peptid mit Affinität für ein Zelloberflächenantigen, einem Enzym, einem Cytokin und einem zellstimulierenden Faktor ausgewählt ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper und/oder ein Teil davon ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Zelle eine Blutzelle ist.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Polysaccharid um Chitosan und/oder Chitin, das partiell in Chitosan umgewandelt ist, handelt.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Sterilisationsschutzmittel durch eine direkte kovalente Bindung oder eine kovalente Bindung über eine aktive Gruppe an einen Träger gebunden ist.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der biologische Wirkstoff durch eine direkte kovalente Bindung oder eine kovalente Bindung über eine aktive Gruppe an einen Träger gebunden ist.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 7 und 8, wobei der Träger aus einem porösen Material, einem Filmmaterial, einem plattenartigen Material, einem granulären Material und einem tubulären Material ausgewählt ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das poröse Material ein Vliesstoff ist.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Polysaccharid ein Molekulargewicht hat, das wenigstens 1/500, aber weniger als 1/2 des Molekulargewichts des biologischen Wirkstoffs beträgt.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der Strahlungssterilisation um eine Gammastrahlensterilisation handelt.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der biologische Wirkstoff im nassen Zustand sterilisiert wird.
  14. Verwendung eines Sterilisationsschutzmittels mit einem Polysaccharid, das wenigstens drei Monosaccharide umfasst, die jeweils positive Ladungen aufweisen, zum Schutz eines biologischen Wirkstoffs, der aus der Gruppe von Proteinen und/oder Peptiden ausgewählt ist, während der Strahlungssterilisation.
  15. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die positiven Ladungen des Monosaccharids auf eine Amino- oder eine Iminogruppe zurückzuführen sind.
  16. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei der Wirkstoff aus einem Antikörper gegen Zelloberflächenantigen, einem Peptid mit Affinität für ein Zelloberflächenantigen, einem Enzym, einem Cytokin und einem zellstimulierenden Faktor ausgewählt ist.
  17. Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper und/oder ein Teil davon ist.
  18. Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Zelle eine Blutzelle ist.
  19. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem Polysaccharid um Chitosan und/oder Chitin, das partiell in Chitosan umgewandelt ist, handelt.
  20. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei das Sterilisationsschutzmittel durch eine direkte kovalente Bindung oder eine kovalente Bindung über eine aktive Gruppe an einen Träger gebunden ist.
  21. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei der biologische Wirkstoff durch eine direkte kovalente Bindung oder eine kovalente Bindung über eine aktive Gruppe an einen Träger gebunden ist.
  22. Verwendung gemäß Anspruch 20 und 21, wobei der Träger aus einem porösen Material, einem Filmmaterial, einem plattenartigen Material, einem granulären Material und einem tubulären Material ausgewählt ist.
  23. Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei das poröse Material ein Vliesstoff ist.
  24. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei das Polysaccharid ein Molekulargewicht hat, das wenigstens 1/500, aber weniger als 1/2 des Molekulargewichts des biologischen Wirkstoffs beträgt.
  25. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei der Strahlungssterilisation um eine Gammastrahlensterilisation handelt.
  26. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei der biologische Wirkstoff im nassen Zustand sterilisiert wird.
  27. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei das Polysaccharid ein Trisaccharid oder höheres Saccharid von Glucosamin und/oder eines Derivats davon umfasst.
  28. Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei der biologische Wirkstoff ein beliebiger Vertreter ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Enzym, einem Cytokin und einem zellstimulierenden Faktor besteht.
  29. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Sterilisation in einem Zustand durchgeführt wird, bei dem das Sterilisationsschutzmittel an den biologischen Wirkstoff gebunden ist.
  30. Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei die Sterilisation in einem Zustand durchgeführt wird, bei dem das Sterilisationsschutzmittel in einer Lösung vorliegen kann, in die der biologische Wirkstoff gefüllt wird.
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