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Dokumentenidentifikation DE69530993T2 19.05.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000789578
Titel MULTIKATALYTISCHE PROTEASE-INHIBITOREN
Anmelder Cephalon, Inc., West Chester, Pa., US
Erfinder IQBAL, Mohamed, Malvern, US;
DIEBOLD, James, Norristown, US;
SIMAN, Robert, Wilmington, US;
CHATTERJEE, Sankar, Wynnewood, US;
KAUER, C., James, Kennett Square, US
Vertreter Müller-Boré & Partner, Patentanwälte, European Patent Attorneys, 81671 München
DE-Aktenzeichen 69530993
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 14.11.1995
EP-Aktenzeichen 959391657
WO-Anmeldetag 14.11.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/US95/14921
WO-Veröffentlichungsnummer 0096014857
WO-Veröffentlichungsdatum 23.05.1996
EP-Offenlegungsdatum 20.08.1997
EP date of grant 04.06.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.05.2004
IPC-Hauptklasse A61K 38/05
IPC-Nebenklasse C07K 5/04  

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Inhibitoren von multikatalytischer Protease (MCP) und Zusammensetzungen, welche solche Inhibitoren umfassen, zur Verwendung als MCP-Inhibitoren, zum Beispiel, zur Verzögerung eines Verlusts an Muskelmasse, vorkommend bei verschiedenen physiologischen Zuständen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In eukaryotischen Zellen werden Zellproteine ständig abgebaut und ersetzt. Dies erlaubt der Zelle selektiv und schnell Proteine und Peptide mit abnormen Konformationen zu entfernen, Kontrolle über metabolische Wege auszuüben, indem die Mengen von regulatorischen Peptiden angepasst werden, und, wenn notwendig, Aminosäuren für Energie bereitzustellen, wie beim Hungern. Siehe Goldberg, A. L. & St. John, A. C. Annu. Rev. Biochem. 45: 747 bis 803 (1976). Die Zellmechanismen von Säugern verfügen über eine Vielzahl an Wegen zur Proteinaufspaltung. Einige dieser Wege scheinen Energieaufnahme in der Form von Adenosintriphosphat („ATP") zu benötigen. Siehe Goldberg, A. L. & St. John, vorstehend.

Multikatalytische Protease (MCP, auch typischerweise als „multikatalytische Proteinase", „Proteasom", „multikatalytischer Proteinasekomplex", „multikatalytischer Endopeptidasekomplex", „ 20S Proteasom" und „Ingensin" bezeichnet) ist ein eukaryotischer nicht-lysosomaler Proteinasekomplex mit großem Molekulargewicht (700 kD), der bei mindestens zwei zellulären Wegen bei der Aufspaltung von Protein in Peptide und Aminosäuren eine Rolle spielt. Siehe Orlowski, M. Biochemistry 29(45) 10289 bis 10297 (1990). Der Komplex verfügt über mindestens drei verschiedene Arten von hydrolytischen Aktivitäten:

(1) eine Trypsin-ähnliche Aktivität, wobei Peptidbindungen auf der Carboxylseite von basischen Aminosäuren gespalten werden; (2) eine Chymotrypsin-ähnliche Aktivität, wobei Peptidbindungen auf der Carboxylseite von hydrophoben Aminosäuren gespalten werden; und (3) eine Aktivität, wobei Peptidbindungen auf der Carboxylseite von Glutaminsäure gespalten werden. Siehe Rivett, A. J. J. Biol. Chem. 264: 21 12215 bis 12219 (1989) und Orlowski, vorstehend.

Bei einem Pfad der Proteinhydrolyse, bei dem MCP eine Rolle spielt, spielt auch das Polypeptid „Ubiquitin" eine Rolle. Hershko, A. & Crechanovh, A. Annu. Rev. Biochem. 51: 335 bis 364 (1982). Dieser Pfad, der MCP, ATP und Ubiquitin erfordert, scheint für den Abbau von stark abnormen Proteinen, bestimmten kurzlebigen normalen Proteinen und der Proteinmasseansammlung beim Wachstum von Fibroblasten und Reifen von Retikuloiden verantwortlich zu sein. Siehe Driscoll, J. und Goldberg, A. L. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86: 787 bis 791 (1989). Über diesen Weg abzubauende Proteine sind kovalent in einer ATP-abhängigen Weise an Ubiquitin über ihre Lysinaminogruppen gebunden. Die mit Ubiquitin konjugierten Proteine werden dann über einen ATP-abhängigen Proteasekomplex durch das 26S Proteasom, welches MCP als seinen proteolytischen Kern enthält, zu kleinen Peptiden abgebaut. Goldberg, A. L. & Rock, K. L. Nature 357: 375 bis 379 (1992).

Auch ein zweiter Pfad des Proteinabbaus, der MCP und ATP erfordert, der aber kein Ubiquitin erfordert, wurde beschrieben. Siehe Driscoll, J. & Goldberg, A. L., vorstehend. Bei diesem Verfahren hydrolisiert MCP Proteine in einer ATP-abhängigen Weise. Siehe Goldberg, A. L. & Rock, K. L., vorstehend. Dieses Verfahren wurde im Skelettmuskel beobachtet. Siehe Driscoll & Goldberg, vorstehend. Jedoch wurde vorgeschlagen, dass im Muskel MCP synergistisch mit einer anderen Protease, Multipain, zusammenwirkt, wodurch es so zu einer beschleunigten Aufspaltung von Muskelprotein kommt. Siehe Goldberg & Rock, vorstehend.

Es wurde berichtet, dass MCP über einen proteolytischen Mechanismus wirkt, wobei das Nucleophil der Wirkstelle die Hydroxylgruppe des N-terminalen Threoninrests ist. So ist MCP das erste bekannte Beispiel einer Threoninprotease. Siehe Seemuller et al., Science (1995) 268 579 bis 582; Goldberg, A. L., Science (1995) 268 522 bis 523.

Die relativen Aktivitäten der Zellprotein-synthetisierenden und -abbauenden Wege bestimmen, ob Protein angesammelt wird oder verloren geht. Der abnorme Verlust von Proteinmasse ist mit mehreren Krankheitszuständen, wie Muskeldystrophie, Herzkachexie, Emphysem, Lepra, Fehlernährung, Knochenerweichung, akuter Kinderleukämie und Krebskachexie, verbunden. Ein Verlust an Muskelmasse wird auch beim Älterwerden, bei langen Krankenhausaufenthalten oder langer Bettlägerigkeit und bei chronischem Schmerz im unteren Rücken beobachtet.

Bei Denervierung oder Inaktivität kommt es bei Skelettmuskeln zu einer schnellen Atrophie, was zu einer starken Abnahme der Größe, des Proteingehalts und der Kontraktionsstärke führt. Diese Atrophie ist ein wichtiger Bestandteil von vielen neuromuskulären Krankheiten bei Menschen. Eine Erhöhung der Proteinaufspaltung zeigte sich als die primäre Ursache von Muskelschwund bei Denervierungsatrophie. Furono, K. et al. J. Biochem. 265/15: 8550 bis 8557 (1990). Obwohl der/die spezielle/speziellen Vorgang oder Vorgänge, der/die mit Proteinhydrolyse im Muskel zu tun hat/haben nicht erkannt wurde/wurden, gibt es einen Beweis, der bei der beschleunigten Aufspaltung von Muskelproteinen eine Verbindung mit MCP herstellt. Siehe zum Beispiel Furono, vorstehend und die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 92/20804 (Veröffentlichungsdatum: 26. November 1992).

Es wurde erkannt, dass MCP-Aktivität in mehreren Krankheitszuständen eine Rolle spielt. Zum Beispiel wurde von einer abnorm hohen Exprimierung von MCP in menschlichen Leukämiezelllinien berichtet. Kumatori, A. et al. PNAS 87: 7071 (1990). Auch wurde von Autoantikörpern gegen MCP bei Patienten mit systemischem Lupus erythematosus („SLE") berichtet. Arribas, J. et al. J. Exp. Med. 173: 423 bis 427 (1990).

Es werden Mittel benötigt, die in der Lage sind, den MCP-Komplex zu inhibieren; solche Mittel würden ein wertvolles Werkzeug bereitstellen, sowohl für jene, die Forschung auf dem Gebiet, zum Beispiel der MCP-Aktivität, betreiben, als auch für jene in den medizinischen Bereichen, um zum Beispiel die schädlichen Auswirkungen von abnormer oder aberranter MCP-Aktivität zu kontrollieren. Die vorliegende Erfindung ist auf diese wichtigen Ziele hin ausgerichtet,

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist auf multikatalytische Protease-Inhibitoren („MCP") gerichtet. Der Gegenstand der Erfindung kann in Verfahren zur Inhibierung von MCP, verbunden mit bestimmten Störungen, einschließlich der Behandlung von Muskelschwundstörungen, angewendet werden.

In einer Ausführungsform werden Verbindungen mit der Formel

bereitgestellt. Die Bestandteile werden eigens definiert, genauso wie die bevorzugten Bestandteile.

Die Verbindungen der Erfindung sind bei einer Vielfalt von Anwendungen nützlich. Zum Beispiel können die Verbindungen bei Forschunganwendungen angewendet werden, um ferner in vitro- und in vivo-Modelle für das mechanistische Verständnis des MCP-Weges und für die Darstellung von Peptidantigenen über den Weg des Haupthistokompatibilitätskomplexes-Klasse I (MHC I) zu verfeinern und zu entwickeln.

In einem klinischen Gesamtbild können die Zusammensetzungen, welche die beanspruchten Verbindungen enthalten, zur Inhibierung von MCP-Aktivität, zur Verringerung des Verlusts an Muskelmasse, zur Behandlung von Muskelschwundstörungen, zur Reduktion des Superoxiddismutaseabbaus und zur Behandlung von Störungen, die durch eine Reduktion der Superoxiddismutaseaktivität gekennzeichnet sind, verwendet werden.

Auch werden Verfahrensmethoden zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung dargestellt.

Diese und andere Merkmale der Verbindungen werden im Laufe der Offenbarung in einer erweiterten Form dargelegt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNTUNGEN

1 zeigt die Wirkung von Ausführungsformen der offenbarten MCP-Inhibitoren auf die Verarbeitung von mit Elektroporation behandeltem OVA durch M12.B6-Zellen.

2 zeigt die Wirkung der OVA-Konzentration auf die Inhibierung der Verarbeitung durch eine Ausführungsform der Erfindung.

3 zeigt die Wirkung der OVA-Konzentration auf die Inhibierung der Verarbeitung durch eine Ausführungsform der Erfindung.

4 zeigt eine physikalische Karte, die das SOD-1-Gen und die Lage der FALS-Mutationen, Restriktionsstellen und der PCR-Primer definiert.

5 zeigt die Quantifizierung von SOD-1-Mengen in transient transfizierten 293-Zellen nach der Inkubation mit 5 &mgr;M an Ausführungsformen der MCP-Inhibitoren.

6 zeigt die Dosis-Wirkung von verschiedenen SOD-1-Isoformen auf eine Ausführungsform der Erfindung.

7 zeigt, dass der SOD-1-Turnover eine Funktion der MCP-Aktivität ist. GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN Diese Erfindung stellt MCP-Inhibitoren und Zusammensetzungen, die diese Inhibitoren einschließen, bereit. Die MCP-Inhibitoren der Erfindung werden zum Beispiel durch die Formel

dargestellt, worin

R1 aus der Gruppe, bestehend aus -C ≡N, -C(=O)OR9, Phthalimido, -NH-SO2R9 und -NH-J, ausgewählt ist,

R2 aus der Gruppe, bestehend aus H, Hydroxyl, Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen und Cycloalkyl mit drei bis sieben Kohlenstoffatomen, ausgewählt ist,

R3 aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)m NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J und -R6-CN, ausgewählt ist,

R4 -CH(CH2-R7)-Q ist,

Q aus der Gruppe, bestehend aus -CH-R8, -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NH-R7 -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
ausgewählt ist, wobei p und q unabhängig voneinander zwei oder drei sind,

W ein Cycloakylrest ist,

R5 aus der Gruppe, bestehend aus -NO2, -CN und -J, ausgewählt ist,

R6 -(CH2)m- NH-C(=NH)-NH- ist,

R7 aus der Gruppe, bestehend aus Phenyl und Alkyl mit einem bis acht Kohlenstoffatomen, ausgewählt ist, wobei der Alkylrest gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Aryl- oder Heteröarylgruppen substituiert sein kann,

R8 aus der Gruppe, bestehend aus =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2 und =N-NH-J, ausgewählt ist,

R9 aus 4der Gruppe, bestehend aus einem Wasserstoffatom und Alkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, ausgewählt ist, wobei der Alkylrest gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Aryl- oder Heteroarylgruppen substituiert sein kann,

J eine Schutzgruppe ist, n eine ganze Zahl von 3 bis 10 ist und m eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist.

In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist R1 -C ≡N, -C(=O)OCH3, Phthalimido oder -NH-SO2CF3, und in anderen bevorzugten Ausführungsformen ist R2H oder Cyclopentyl.

R3 ist bevorzugt -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2.

Q ist bevorzugt -CH-R8, -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7, oder hat die Struktur:

R5 ist bevorzugt -NO2, -CN, -PMC, -MTR, -MTS oder Tos.

R7 ist bevorzugt -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3 oder -C6H5.

R8 ist bevorzugt =0, =N-OH, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=O)-NH2 oder =NNH-C(=S)-NH2.

In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist R1 -C(=O)OCH3, Phthalimido oder -NH-SO2CF3; R2 ist Cyclopentyl; R3 ist -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2; R7 ist -CH(CH3)2 und R8 ist =O.

In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist R1 -C ≡N; R2 ist Cyclopentyl; R3 ist -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2 oder -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2 ; R7 ist -CH(CH3)2 und R8 ist =O.

In mehr bevorzugten Ausführungsformen ist R1 -C ≡N; R2 ist Cyclopentyl; R3 ist -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2 oder -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2 ; R7 ist -CH(CH3)2; Q ist -CH-R8 und R8 ist =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3 oder =N-O-CH2-C6H5.

Wie hier verwendet bedeutet der Ausdruck „Alkyl", dass er geradkettige, verzweigte und cyclische Kohlenwasserstoffe einschließt, wie Ethyl-, Isopropyl- und Cyclopentylgruppen. Substituierte Alkylgruppen sind Alkylgruppen, bei denen ein oder mehrere Wasserstoffatome durch Halogen, andere Kohlenwasserstoffgruppen (zum Beispiel eine Phenylgruppe), eine Heteroarylgruppe oder eine Gruppe, in der ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Sauerstoffatome unterbrochen werden, ersetzt wurden. Bevorzugte Alkylgruppen weisen 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatome auf. Wie hier verwendet hat der Ausdruck „Halogen" seine übliche Bedeutung und schließt Fluor, Chlor, Brom und Iod ein, wobei Fluor ein bevorzugtes Halogen ist. Der Ausdruck „Arg", so wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat seine normale Bedeutung als Abkürzung für die Aminosäure „Arginin".

In einigen Ausführungsformen enthalten die Verbindungen der Erfindung Schutzgruppen. Wie hier verwendet sollte der Bezeichnung „Schutzgruppen" sehr breite Auslegung eingeräumt werden. Schutzgruppen an sich sind als chemische funktionelle Gruppen bekannt, die selektiv an Funktionen, wie Hydroxylgruppen, Aminogruppen und Carboxylgruppen, angebracht und davon abgespalten werden können. Diese Gruppen sind in einer chemischen Verbindung vorhanden, um eine solche Funktion gegenüber chemischen Reaktionsbedingungen, welchen die Verbindung ausgesetzt wird, inert zu machen. Jede aus einer Vielfalt von Schutzgruppen kann in der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Eine solche Schutzgruppe ist die Phthalimidogruppe. Andere bevorzugte Schutzgruppen gemäß der Erfindung haben die folgenden Formeln:

Weitere repräsentative Schutzgruppen, die für einen Einsatz in der Erfindung geeignet sind, können in Greene, T. W. und Wuts, P. G. M., „Protective Groups in Organic Synthesis", 2. Ausgabe, Wiley & Sons, 1991 gefunden werden.

Wie sich vor kurzem zeigte, steht die MCP-Aktivität mit einer Vielfalt von Störungen und Krankheiten in Verbindung. Da Verbindungen, wie sie hier offenbart werden, nützlich bei der Inhibierung der Aktivität von MCP sind, und da die Nützlichkeit von solchen Verbindungen sowohl in der Forschung als auch bei therapeutischen Ansätzen angewendet werden kann, schließen Verfahrensmethoden zur Inhibierung der Aktivität von MCP durch in Kontakt bringen von MCP mit einer Verbindung der Erfindung die Bereitstellung der Verbindung für einen Säuger, einschließlich einen Menschen, als ein Medikament oder pharmazeutisches Mittel ein.

Wie hier verwendet bedeutet der Ausdruck „in Kontakt bringen", dass man direkt oder indirekt dafür sorgt, dass die in Kontakt zu bringenden Einheiten zusammen platziert werden, so dass die Einheiten miteinander physikalisch in Kontakt kommen. Auf diese Weise in Kontakt bringen schließt physische Handlungen ein, wie Platzieren der Einheiten zusammen in einem Behälter, oder Verabreichen von Einheiten an einen Patienten. Deshalb zum Beispiel fällt Verabreichen einer Verbindung der Erfindung an einen menschlichen Patienten, der erwiesenermaßen an einer Krankheit oder Störung leidet, die mit abnormen und/oder aberranten Aktivitäten von MCP in Verbindung steht, welche mit einer solchen Krankheit oder Störung in Verbindung stehen, in den Bereich der Definition von „in Kontakt bringen".

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Inhibierung multikatalytischer Protease bereitgestellt, welche eine Verbindung der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

In bevorzugten Ausführungsformen werden Arzneimittel gemäß der Erfindung an Patienten verabreicht, die an einer Störung leiden, d. h. einem abnormen physischen Zustand, einer Krankheit oder einem pathophysiologischen Zustand, welche mit abnormen und/oder aberranten Aktivitäten von MCP in Verbindung stehen. Die Störungen, gegen die die Zusammensetzungen der Erfindung verabreicht werden, sind bevorzugt jene, die direkt oder indirekt einen Schwund (d. h. Verlust) an Muskelmasse, das heißt, eine Muskelschwundstörung hervorrufen. Diese schließen Muskeldystrophien, Herzkachexie, Emphysem, Lepra, Fehlernährung, Knochenerweichung, akute Kinderleukämie, AIDS-Kachexie und Krebskachexie ein.

Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet „Verabreichen" das Einbringen des Arzneimittels in einen Patienten. Bevorzugte Verfahren der Verabreichung schließen intravenöse, subkutane und intramuskuläre Verabreichung ein. Bevorzugt wird die Verbindung als ein Arzneimittel verabreicht, welches die Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie physiologischer Salzlösung, umfasst. Andere geeignete Träger können in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) gefunden werden.

Die Konzentrationen der hier beschriebenen Verbindungen in einem Arzneimittel werden abhängig von einer Anzahl an Faktoren variieren, einschließlich der Dosis des zu verabreichenden Arzneistoffs, den chemischen Eigenschaften (z. B. Hydrophobizität) der angewendeten Verbindungen und dem Verabreichungsweg. Im Allgemeinen können die Verbindungen dieser Erfindung in einer wässrigen physiologischen Pufferlösung für parenterale Verabreichung, die etwa 0,1 bis 10% (w/v) Verbindung enthält, bereitgestellt werden. Typische Dosisbereiche sind etwa 1 &mgr;g/kg bis etwa 1 g/kg Körpergewicht pro Tag; ein. bevorzugter Dosisbereich ist etwa 0,01 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die bevorzugte Dosierung des zu verabreichenden Arzneistoffs ist wahrscheinlich abhängig von so veränderlichen Größen, wie der Art und dem Umfang des Fortschreitens der Krankheit oder der Störung, dem Gesamtgesundheitszustand des speziellen Patienten, der relativen biologischen Wirksamkeit der ausgewählten Verbindung und der Formulierung des Verbindungsexzipienten und seinem Verabreichungsweg. Wie hier verwendet bezeichnet der Ausdruck „Patient" jede Art von Vertebrat. Bevorzugt ist der Patient ein Mensch.

Die Muskeldystrophien sind genetische Krankheiten, die durch fortschreitende Schwäche und Degeneration von Muskelfasern, ohne den Beweis einer Neuraldegeneration, gekennzeichnet sind. Bei Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) zeigt sich im Durchschnitt eine 67%-Reduktion an Muskelmasse, und bei myotonischer Dystrophie zeigte sich eine minimale Synthese von Muskelprotein, die im Durchschnitt um 28% verringert war, ohne jede entsprechende Verringerung der Synthese von Nichtmuskelproteinen (möglicherweise gemäß einer beeinträchtigten Antwort des sensiblen Endorgans auf anabole Hormone oder Substrate). Ein beschleunigter Proteinabbau zeigte sich in den Muskeln von DMD-Patienten.

Eine ernsthafte dekompensierte Herzinsuffizienz (CHF) ist durch eine „Herzkachexie", d. h. einen Muskelproteinschwund, sowohl bei den Herz- als auch bei den Skelettmuskeln, mit einer durchschnittlichen Körpergewichtabnahme von 19%, gekennzeichnet. Die Herzkachexie wird durch eine erhöhte Geschwindigkeit der Aufspaltung von myofibrillärem Protein verursacht.

Ein Emphysem ist eine chronisch-obstruktive Atemwegserkrankung, definiert durch eine Vergrößerung der Luftzwischenräume, die distal zu den terminalen nicht-respiratorischen Bronchiolen liegen, begleitet durch destruierende Veränderungen der Alveolarwände. Klinische Symptome von verringerter Lungenfunktion schließen Husten, Keuchen, rezidivierende Atemwegsinfektionen, Ödem und funktionelle Beeinträchtigung und verkürzte Lebenszeit ein. Die Ausschüttung von Tyrosin ist in Patienten die an Emphysemen leiden um 47% erhöht. Auch bleibt die Ganzkörperleucinausschüttung normal, die Ganzkörperleucinoxidation ist erhöht und die Ganzkörperproteinsynthese ist erniedrigt. Das Ergebnis ist eine Abnahme der Muskelproteinsynthese, begleitet durch eine Abnahme des Ganzkörperproteinturnovers und der Skelettmuskelmasse. Diese Abnahme wird in steigendem Maße durch ein Fortschreiten der Krankheit und durch eine Verschlechterung über einen langen Zeitraum offensichtlich.

Bei Diabetes mellitus kommt es zu einem generalisierten Schwund von Kleinmuskeln der Hände, gemäß einer chronischen partiellen Denervierung (Neuropathie). Dies ist am stärksten offensichtlich und verschlechtert sich beim Fortschreiten der Krankheit über einen langen Zeitraum und mit deren Ernsthaftigkeit.

Lepra ist mit einem muskulären Schwund verbunden, der zwischen den Mittelhandknochen des Daumens und des Zeigefingers stattfindet. Ernsthafte Fehlernährung ist unter anderem gekennzeichnet durch ernsthaften Muskelschwund.

Knochenerweichung ist eine Ernährungsstörung, verursacht durch einen Mangel an Vitamin D und Calcium. Diese – wird bei Kindern als „Rachitis", und bei Erwachsenen als „Knochenerweichung" bezeichnet. Sie ist gekennzeichnet durch eine Erweichung der Knochen (gemäß einer beeinträchtigten Mineralisation, mit einer übermäßigen Ansammlung an Osteoid), Schmerz, Empfindlichkeit, Muskelschwund und -schwäche, Appetitlosigkeit und Gesamtgewichtsverlust. Sie kann eine Folge von Fehlernährung, wiederholten Schwangerschaften und Laktation (aufbrauchen oder entleeren der Vitamin D- und Calciumvorräte) und Vitamin D-Resistenz sein.

Bei akuter Kindheitsleukämie kommt es zu Proteinenergiefehlernährung, was zu Skelettmuskelschwund führt. Studien haben gezeigt, dass sich bei einigen Kindern sogar schon vor der Diagnose von Leukämie Muskelschwund zeigt, mit einer durchschnittlichen Abnahme der Muskelmasse von 27%. Auch findet eine gleichzeitige Zunahme des Fettgewebes von 33% bis 37% statt, was zu keiner Netto-Veränderung des relativen Körpergewichts und der Gliedmaßenausdehnung führt.

Krebskachexie ist ein komplexes Syndrom, das in variierender Häufigkeit in Patienten mit soliden Tumoren und hämatologischen Malignomen auftritt. Klinisch zeigt sich Krebskachexie als Gewichtsverlust mit einem umfangreichen Abbau von sowohl Fettgewebe, als auch fettfreier Muskelmasse und ist eine Todesursache als Folge von Krebs. Patienten mit Krebskachexie haben kürzere Überlebenszeiten und sprechen weniger auf eine Chemotherapie an. Zusätzlich zu Störungen die Muskelschwund verursachen, scheinen andere Umstände und Zustände in gewisser Weise mit einer Abnahme der Muskelmasse in Verbindung zu stehen. Solche Beschwerden schließen Muskelschwund gemäß chronischen Rückenschmerzen, fortgeschrittenem Alter, langen Krankenhausaufenthalten wegen Erkrankung oder Verletzung, Alkoholismus und Corticosteroid-Therapie ein.

Studien haben gezeigt, dass bei ernsthaften Fällen von chronischem Schmerz im unteren Rücken paraspinaler Muskelschwund auftritt. Eine Verringerung des paraspinalen Muskelschwundes lindert den Schmerz und verbessert die Funktion.

Es wird auch angenommen, dass die allgemeine Schwäche im Alter von Muskelschwund herrührt. Wenn der Körper altert wird ein wachsender Anteil der Skelettmuskeln durch fibröses Bindegewebe ersetzt. Das Ergebnis ist eine bedeutende Reduktion der Muskelkraft, aber nur eine sehr geringe Reduktion der fettfreien Masse.

Studien haben gezeigt, dass bei Patienten, die an Verletzungen oder chronischen Erkrankungen leiden und eine lange Zeit im Krankenhaus verbringen, ein langanhaltender unilateraler Muskelschwund, mit einer durchschnittlichen Abnahme der Muskelmasse von 31%, auftritt. Studien haben auch gezeigt, dass dies mit intensiver Physiotherapie korrigiert werden kann. Jedoch kann es für viele Patienten wirkungsvoller sein, eine Verbesserung mit einer Arzneistofftherapie zu verwirklichen.

Bei Alkoholikern findet ein Schwund der Tibialis-anterior-Muskeln statt. Dieser Schaden der proximalen Muskeln wird durch einen neurogenen Schaden, nämlich durch eine beeinträchtigte glycolytische und Phosphorylase-Enzymaktivität, verursacht. Der Schaden wird offensichtlich und verschlechtert sich, je länger die Dauer des Alkoholmissbrauchs ist. Patienten, die mit Corticosteroiden behandelt wurden, erfuhren einen Verlust an Muskelmasse.

Es hat sich gezeigt, dass MCP den intrazellulären Mediator von Inflammation aktiviert, der als NFkappaB bezeichnet wird. Siehe Baeuerle, P. A. und Henkel, T. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12, 141 bis 179. Inhibitoren von MCP werden deshalb möglicherweise bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und inflammatorischen Krankheiten verwendet.

Die Verbindungen der Erfindung können zur Linderung des Verlusts an Muskelmasse, als Folge von sowohl der vorstehenden Zustände, als auch anderer, verwendet werden. Zusätzlich sind die MCP-Inhibitoren der Erfindung bei veterinärmedizinischen und landwirtschaftlichen Anwendungen bei Tieren nützlich, um einem Gewichtsverlust bei Tieren entgegenzuwirken oder um das Wachstum zu fördern.

MCP hat mit der Darstellung von Peptidantigenen über den Weg des Haupthistokompatibilitätskomplexes-Klasse I (MHC I) zu tun. Siehe Goldberg und Rock, vorstehend; siehe auch Rock et al., Cell, 78: 761 bis 771 (1994), nachstehend „Rock et al.". Inhibitoren von MCP haben deshalb einen Nutzen als Mittel in der Forschung bei Studien, bei denen eine Inhibierung des MCH I-Weges gewünscht wird, genauso wie bei der Linderung von Krankheiten und Störungen, die mit der Verarbeitung von Antigenen mit aberrantem und/oder abnormem MHC-I in Verbindung stehen. Da der genaue Ursprung der meisten Peptide, die auf MHC-I-Molekülen dargestellt werden, noch nicht klar ist, und da sich kürzlich ein Beweis herauskristallisierte, dass MCP eine Rolle bei der MHC-I-Darstellung spielen könnte (siehe Rock et al., vorstehend), würden Stoffe, wie die offenbarten MCP-Inhibitoren, welche die proteolytische Verarbeitung von Antigenen für MHC-I-Darstellung blockieren, bei der Auflclärung der Wichtigkeit dieses Weges nützlich sein.

Überraschenderweise wurde auch gefunden, dass die MCP-Inhibitoren der Erfindung auch bei der Erhöhung der Aktivität des Cu/Zn-Superoxiddismutase-1-Enzyms („SOD-1") nützlich sind. Dementsprechend sind diese Verbindungen sowohl bei Forschungsarbeiten für die Untersuchung von SOD-1-defizienten Systemen, als auch bei der Behandlung von neurodegenerativen oder anderen Störungen nützlich, die durch eine Reduktion der SOD-1-Enzymaktivität (d. h. wobei sich eine solche Reduktion in der Pathogenese der Störung zeigte) gekennzeichnet sind. Solche Zustände schließen Krankheiten, die mit oxidativem Stress in Verbindung stehen, ein, wie Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Huntingdon-Krankheit, Schlaganfall, Trauma und Ischämie.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Reduktion des Cu/Zn-Superoxiddismutase-l-Enzymabbaus bereitgestellt, welche einen Inhibitor der multikatalytischen Protease und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, wobei der Inhibitor eine Verbindung der vorliegenden Erfindung ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Behandlung einer durch eine Reduktion der Cu/Zn-Superoxiddismutase-1-Enzymaktivität gekennzeichneten Störung bereitgestellt, welche einen Inhibitor der multikatalytischen Protease und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, wobei der Inhibitor eine Verbindung der vorliegenden Erfindung ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung, welche einen Inhibitor der multikatalytischen Protease umfasst, wobei der Inhibitor eine Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Reduktion des Abbaus des Cu/Zn-Superoxiddismutase-l-Enzyms in einem Säuger bereitgestellt, wobei der Abbau mit einer durch den Abbau verursachten Krankheit oder Störung verbunden ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung, welche einen Inhibitor der multikatalytischen Protease umfasst, wobei der Inhibitor eine Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen, welche durch eine Reduktion der Cu/Zn-Superoxiddismutase-1-Enzymaktivität gekennzeichnet sind, bereitgestellt.

SOD-1 ist ein homodimeres Metalloenzym, welches die Dismutation des toxischen Superoxidanions O2 zu O2 und H2O2 katalysiert. SOD-1 ist ein Abfangmittel für freie Radikale und wirkt deshalb als eine erste Verteidigung bei der Detoxikation von Superoxidradikalen, die normale Nebenprodukte des aeroben Metabolismus darstellen. SOD-1 kommt hauptsächlich in Eukaryoten vor und wird im Cytoplasma von so gut wie allen Zellentypen gefunden. SOD-1 ist ein essentielles Enzym bei der physiologischen Antwort auf Sauerstofftoxizität und es wurde ausgiebig als ein therapeutisches Mittel bei pathologischen Zuständen, die mit oxidativem Stress verbunden sind, untersucht. Siehe Bannister et al., CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 111 bis 180 (1987); Halliwell et al., Methods in Enzymol., 186: 1 bis 75 (1990); Greenwald, Free Rad. Biol. Med. 8: 201 bis 209 (1990).

Merkmale, die die Verwendung von SOD-1 als ein therapeutisches Mittel verhinderten, sind sein schlechter intrazellulärer Zugang bei exogener Bereitstellung, und seine äußerst kurze Halbwertszeit im Serum. Deshalb würden Verbindungen, die die Aktivität von intrazellulärem SOD-1 erhöhen, einen wesentlichen Vorteil in der SOD-1-Therapie bereitstellen.

ALS ist eine fortschreitende paralytische Störung, die durch Degeneration von großen motorischen Nervenzellen des Rückenmarks und des Gehirns verursacht wird. Ungefähr 5 bis 10% der ALS-Fälle sind familiär bedingt (FALS) und werden als autosomale dominante Eigenschaft weitervererbt. Vor kurzem wurden sechzehn verschiedene Falsch-Sinn-Mutationen in einer Untergruppe von Familien mit FALS identifiziert und sie waren in dem Gen vorhanden, welches SOD-1 kodiert. Siehe Rosen, D. R., et al., Science 261: 1047 bis 1051 (1993); Deng, H. -X., et al., Nature 362: 59 bis 62 (1993). Diese Mutationen führen zu einer Abnahme der SOD-1-Aktivität in roten Blutkörperchen und im Hirngewebe und zeigten eine Destabilisierung des SOD-1-Proteins, als Folge eines erhöhten Turnovers des Enzyms. Siehe Bowling, A. C., et al., J. Neurochem. 61: 2322 bis 2325 (1993); Borchelt, D. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8292 bis 8296 (1994). Zusätzlich wurde ein Modell einer transgenen Maus von ALS beschrieben, basierend auf dem Befund einer Verbindung zwischen SOD-1 und ALS. Brown, R. H. 331/16 NEJM 1901 (1994).

Wir haben entdeckt, dass unsere MCP-Inhibitoren potente positive Effektoren von SOD-1 sind. Ein bevorzugter MCP-Inhibitor, hier als „Verbindung 14" bezeichnet, reduziert spezifisch in einer dosisabhängigen Weise den Abbau von Wildtyp- und durch Mutation entstandenes SOD-1 (die Bezeichnungen der Verbindungsnummer basieren auf der Nummer des Beispiels, welches die Synthese der Verbindung offenbart, z. B. die Synthese der Verbindung 14 wird nachstehend in Beispiel 14 dargelegt). Wie hier verwendet bedeutet die Reduktion des SOD-1-Abbaus eine Verzögerung der Geschwindigkeit, mit der das SOD-1-Protein katabolisiert wird.

Die Erfindung wird ferner über die folgenden Beispiele erläutert. Mit diesen Beispielen ist es beabsichtigt, die Erfindung weiter zu verdeutlichen, und es ist nicht beabsichtigt, damit den Bereich der angefügten Ansprüche einzuschränken.

Beispiel 1 Isolierung von multikatalytischer Protease aus menschlichen Geweben

Proben von postmortal erhaltener/erhaltenem menschlicher/menschlichem Leber und Gehirn wurden für eine Isolierung und teilweise Reinigung von MCP über Ionenaustauschchromatographie, Ammoniumsulfatfällung und Gelfiltration verwendet (z. B. Driscoll und Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 787 bis 791 (1989); Yamamoto et al., Biochim, Biophys. Acta 882, 297 bis 304 (1986). Für jedes Ausgangsmaterial wurde Gewebe in 10 Volumeneinheiten 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), enthaltend 20% Glycerol, homogenisiert. Nach einer Zentrifugation bei 40.000 × g für 30 Minuten konnte die proteolytische Aktivität der Chymotrypsin-ähnlichen Komponente von MCP im Überstand nachgewiesen werden (siehe unten). Der Überstand wurde an einer mit Homogenisierungspuffer äquilibrierten DEAE-Sepharose-Schnellflusssäule fraktioniert. Je Liter Überstand wurden 250 ml Harz verwendet. Nach der Probenbeschickung wurde die Säule mit 10 Volumeneinheiten Homogenisierungspuffer gewaschen und die Proteine wurden mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 400 mM (21 für 250 mL Harz) eluiert. Die Fraktionen wurden einem Assay für MCP-Aktivität unterzogen und die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und einer Fällung mit (NH4)2SO4 bei 80% Sättigung ausgesetzt. Die ausgefallenen Proteine wurden durch Zentrifugation gesammelt, in Homogenisierungspuffer resuspendiert und auf eine Sephacryl-S300HR-Säule (500 mL Harzvolumen), welche unter Verwendung von bovinem Serumalbumin (68 kDa) standardisiert wurde, gegeben. Ein einzelnes Signal mit MCP-Aktivität mit einem Molekulargewicht von ~ 650 kDa wurde eluiert. Diese Präparation war frei von anderen messbaren proteölytischen Aktivitäten und behielt ihre MCP-Aktivität bei einer Lagerung für mehr als 6 Monate bei 4°C. Diese Präparation wurde für die meisten Experimente verwendet. Eine weitere Fraktionierung der Präparation an einer Hydroxyapatit-Ultrogel-Säule (Yamamoto et al., vorstehend) führte zu einem höher gereinigten Enzym, welches gemäß denaturierender SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese die erwarteten, mehr als 10 Untereinheiten, mit MT in einem Bereich von 20 bis 35 kDa, umfasste.

Beispiel 2 Assay für Chymotrypsin-ähnliche und Trypsin-ähnliche Aktivitäten von MCP

Das vorstehend beschriebene Verfahren zur MPC-Isolierung erzeugte einen Enzymkomplex, dessen proteolytische Aktivitäten latent waren, aber die durch Zugabe von niedrigen Konzentrationen (0,02 bis 0,05%) von SDS aktiviert werden konnten (Yamamoto et al., vorstehend). Die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität wurde mit einem Assay gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt: In 96-Well-Mikrotiterplatten wurde menschliche MCP 4- bis 10-fach in Homogenisierungspuffer, der 0,04% SDS enthielt, verdünnt. Ein kolorimetrisches Substrat McOSuc-EVKM-para-Nitroanilid (Methoxysuccinyl-Glu-Val-Lys-Met-pNa), gekauft von Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pennsylvania, wurde in einer Endkonzentration von 100 &mgr;M aus einer Stammlösung von 10 mM in Dimethylsulfoxid zugegeben. Die Reaktionsvolumina betrugen 200 &mgr;l pro Well. Nach der Inkubation über verschiedene Zeitintervalle bei 37°C wurde die Konzentration von freiem pNa auf einem Biotech EL-340 Mikroplattenlesegerät, das bei einer Absorption von 490 nm arbeitet, bestimmt. Die Proteaseaktivität wurde unter Bedingungen bestimmt, bei denen die Substrathydrolyse linear mit der Zeit zunahm und die Veränderung der Absorption proportional zur Konzentration an freiem pNa war. Alternativ wurde ein fluorogenes Substrat verwendet, Methoxysuccinyl-Phe-Leu-Pheamidomethylcoumarin (Enzyme Systems Products, Dublin, CA), und die Veränderung der Fluoreszenz wurde bei einer Anregung von 390 nm und einer Emission von 460 nm gemessen.

Die Trypsin-ähnliche Aktivität von menschlichem MCP wurde mit dem vorstehend beschriebenem Assay mit den folgenden Modifikationen bestimmt. Die Umsetzungen wurden in Tris-Glycerol-Puffer (pH-Wert 9,5), ergänzt mit 1 mM 2-Mercaptoethanol, durchgeführt und das Substrat war ein fluorogenes Substrat, Benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-AMC (100 &mgr;M).

Nach der Inkubation über verschiedene Zeitintervalle bei 37°C wurde die Konzentration an freiem AMC an einem Fluoroskan-II-Spektrofluorimeter mit einem Anregungsfilter von 390 nm und einem Emissionsfilter von 460 nm bestimmt. Die Proteaseaktivität wurde unter Bedingungen bestimmt, bei denen die Substrathydrolyse linear mit der Zeit zunahm und die Veränderung der Fluoreszenz proportional zur Konzentration an freiem AMC war.

Beispiel 3 Bestimmung von IC50-Werten von MCP-Inhibitoren

IC50-Werte sind typischerweise als die Konzentration einer Verbindung (in diesem Fall der offenbarte MCP-Inhibitor) definiert, die notwendig ist, um eine 50%ige Hemmung der Enzymaktivität hervorzurufen. IC50-Werte sind nützliche Indikatoren der Aktivität einer Verbindung für deren beabsichtigte Verwendung. Bevorzugt weisen die Inhibitoren der Erfindung IC50-Werte von weniger als etwa 10 mikromolar auf.

Die Inhibierung der Chymotrypsin-ähnlichen oder Trypsin-ähnlichen Aktivität von MCP wurde durch Inkubation des Enzyms mit variierenden Konzentrationen der potentiellen Inhibitoren für 15 Minuten bei 37°C, vor der Zugabe von Substrat, bestimmt. Für jeden experimentellen Zustand wurde eine Dreifachbestimmung und für die hier beschriebenen Inhibitoren wurden Wiederholungsversuche durchgeführt.

Beispiel 4 Aufzeigen der Hemmung der zellulären Muskelaufspaltung: Hemmung von Nichtbelastungsatrophie in juvenilen Ratten

Die Wirkung von mehreren Inhibitoren auf die Nichtbelastungsatrophie des Soleusmuskels in juvenilen Ratten wurde bestimmt. Siehe Tischler, M. E. (1990) Metabolism 39/7: 756 bis 763 (nachstehend „Tischler-1990") für eine allgemeine Erörterung des Verfahrens.

Bei juvenilen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten (80 bis 90 g) wurden, wie in Jaspers, S. R. und Tischler, M. E., (1984) J. Appl. Physiol. 57: 1472 bis 1479, über einen Schwanzverband die hinteren Gliedmaßen fixiert. Die hinteren Gliedmaßen der Tiere wurden über den Boden des Käfigs angehoben, wobei jedes Tier einzeln untergebracht war. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser und wurden zum Zeitpunkt der Fixierung und zum Zeitpunkt des Abbruchs gewogen. Während des Fixierungszeitraums wurden die Tiere täglich überprüft, um sicherzustellen, dass ihre Pfoten nicht den Boden des Käfigs berührten, und dass keine Schwellung am Schwanz wegen des Verbandes auftrat.

A. Aufbau des Experiments – Teil 1

Jedes Experiment begann mit der Fixierung von 20 Ratten, die zufällig in 4 Gruppen von je 5 Tieren eingeteilt wurden. Gruppe A wurde für genau 2 Tage fixiert und stellte Grundliniendaten für eine ungefähre Einschätzung der Größe des Soleusmuskels in anderen Tieren, die für längere Zeit fixiert wurden, bereit. Die durchschnittlichen Körpergewichte der Gruppen zu Beginn der Studie wurden verglichen und als ein Korrekturfaktor für die Unterschiede der Körpergrößen verwendet. Gruppe B war eine zweite Kontrollgruppe, bei der der Soleus von einer Gliedmaße mit einer wässrigen Lösung von Mersalyl, nach zwei Tagen Nichtbelastung, behandelt wurde, um für jede Gruppe der Tiere die Fähigkeit aufzuzeigen, während einer Nichtbelastung die Muskelatrophie zu verlangsamen. Mersalyl wurde kürzlich untersucht und dabei wurde gezeigt, dass es eine Atrophie in einem in vivo-Modell, so wie in der hier verwendeten Vorschrift beschrieben, im Wesentlichen verhindert. Siehe Tischler-1990. Beginnend nach zwei Tagen Nichtbelastung wurde eine wässrige Lösung von Mersalyl (200 nM; 4 &mgr;l/100 g Anfangskörpergewicht) in einen Soleus injiziert, wie früher beschrieben. In den kontralateralen Muskel wurde ein ähnliches Volumen an 0,9%iger Salzlösung („Vehikel") injiziert. Die Tiere wurden während des in situ-Injektionsverfahrens unter Innovar-vet-Beruhigung (10 &mgr;l/00 g Körpergewicht) gehalten. Nach den Injektionen wurden die Tiere zusätzlich für 24 Stunden fixiert und der Soleus wurde entfernt. Die Gruppen C und D von jedem Experiment wurden für die Testung von jeweils zwei verschiedenen Ausführungsformen der offenbarten Verbindungen verwendet. Die Tiere wurden wie bei Gruppe B behandelt, außer, dass 1 mM MCP-Inhibitor, enthalten in Dimethylsulfoxid (DMSO), in den Soleus von einem Bein und nur DMSO in den kontralateralen Soleus injiziert wurde. Auf diese Weise bestand jedes Experiment aus zwei Kontrollgruppen und der Untersuchung von MCP-Inhibitoren der Erfindung. Die Vervollständigung von fünf solchen Experimenten mit unterschiedlichen Paaren von Inhibitoren stellte für die Testung von jedem MCP-Inhibitor einen „n"-Wert von 10 bereit, wobei jeweils mit zwei verschiedenen Chargen von Tieren getestet wurde.

B. Verarbeitung des Soleusmuskels – Teil 1

Nachdem das Tier getötet worden war, wurde der Soleus herausgeschnitten, von Fett- und Bindegewebe abgetrennt, und sorgfältig gewogen. Der Muskel wurde dann in 10%iger Trichloressigsäure (TCA) homogenisiert und das ausgefallene Protein wurde über Zentrifugation pelletiert. Das Pellet wurde dann einmal mit 10%iger TCA und einmal mit Ethanol : Ether (1 : 1) gewaschen. Das Endpellet wurde in 4 mL 1 N Natriumhydroxid gelöst. Unter Verwendung von Albumin als ein Standard wurde die Probe dann über das Biuret-Verfahren auf den Proteingehalt hin analysiert.

C. Datenanalyse – Teil 1

Die Wirkung von MCP-Inhibitoren auf den Gesamtmuskelproteingehalt wurde in erster Linie über den paarweisen Vergleich mit dem unbehandelten kontralateralen Muskel untersucht. Das Verhältnis der Gehalte wurde berechnet und dann statistisch über Varianzanalyse („ANOVA") analysiert. Das linke Bein war immer das behandelte Bein, so dass die Proteingehaltverhältnisse auch mit den nicht-behandelten Kontrolltieren verglichen werden konnten. Auf diese Weise kann durch einen Vergleich des Proteingehalts der zwei Beine ein signifikanter Unterschied gezeigt werden, genauso wie die relative Wirksamkeit der getesteten MCP-Inhibitoren gezeigt werden kann. Auch wurde ein gepaarter Studententest für die Wirkung von jeder einzelnen Behandlung durchgeführt. Die Daten der unbehandelten Kontrolle stellten auch eine Einschätzung des Proteingehalts am Tag 2 bereit. Dies ermöglichte eine ungefähre Abschätzung der Proteinveränderungen über die 24 Stunden der Behandlung in jeder der Gruppen B, C und D.

D. Aufbau des Experiments – Teil 2

Jedes Experiment bestand aus 10 Tieren mit Gruppen von 5 Tieren, die mit einem der Inhibitoren auf ihre Wirkung bei der Proteinsynthese getestet wurden. Kontrolltiere waren für diesen Aspekt der Studie nicht notwendig, da der DMSO-behandelte kontralaterale Muskel als die gepaarte Kontrolle für den Inhibitor-behandelten Muskel diente. In jede Gruppe wurde injiziert, so wie für die Gruppen C und D in Teil 1 beschrieben. Vierundzwanzig Stunden nach der in situ-Behandlung wurde die relative Geschwindigkeit der Proteinsynthese in beiden Soleusmuskeln analysiert. In jeden Muskel wurde eine 0,9%ige Salzlösung (3,5 &mgr;l/100 g Endkörpergewicht), die 3H-Phenylalanin (50 mM; 1 &mgr;Ci/&mgr;l) enthielt, injiziert. Fünfzehn Minuten später wurde das mittlere Zweidrittel des Muskels herausgeschnitten und der Muskel wurde wie unten beschrieben verarbeitet.

E. Verarbeitung des Soleusmuskels – Teil 2

Der Muskel wurde zuerst 10 Minuten lang in 0,84%iger Salzlösung gewaschen, die 0,5 mM Cycloheximid enthielt, um die Proteinsynthese zu stoppen, und die 20 mM, Cycloleucin enthielt, um Phenylalanin in der Zelle abzufangen. Der Muskel wurde dann in 2,5 ml eiskalter 2 %iger Perchlorsäure homogenisiert. Das ausgefallene Protein wurde über Zentrifugation pelletiert. Ein Aliquot des Überstandes wurde für Flüssigszintillationszählung verwendet und ein anderes Aliquot wurde für die Umwandlung von Phenylalanin zu Phenethylamin verarbeitet, um die Konzentration des löslichen Phenylalanins fluorimetrisch zu bestimmen. Siehe Garlick, P. J. et al., Biochem. J., 192 719 bis 723 (1980) und Munoz, K. M. et al., 1993 Metabolism, in Druck. Diese Werte zeigen die spezifische intrazelluläre Aktivität. Die spezifische Aktivität von Phenylalanin im Muskelprotein wurde nach der Hydrolyse des Proteins, durch Erwärmen in 6 N HCl, bestimmt. Die freigesetzten Aminosäuren wurden in Puffer gelöst. Ein Aliquot wurde für die Szintillationszählung verwendet und ein anderes für die Analyse von Phenylalanin in der Überstandfraktion. Die relative Geschwindigkeit der Proteinsynthese wurde berechnet als: spezifische Proteinaktivität/spezifische intrazelluläre Aktivität × Zeit.

F. Datenanalyse – Teil 2

Die Analysen der Proteinsynthese für jeden MCP-Inhibitor gründeten auf einer gepaarten Basis. Über Vergleiche eines gepaarten Studenten-t-Tests der kontralateralen Muskeln wurde bestimmt, ob irgendeine Wirkung des Inhibitors auf die Proteinsynthese vorhanden war. Die Proteinaufspaltung kann ungefähr als die relative Geschwindigkeit der Proteinsynthese (aus Teil 2) plus die relative Geschwindigkeit der Proteinzunahme (aus Teil 1) berechnet werden, wobei bei Proteinverlust ein negativer Wert für die Proteinzunahme erhalten wird.

Qualitativ deutet die Fähigkeit der MCP-Inlibitoren den Proteinverlust zu verlangsamen ohne die Proteinsynthese zu beeinflussen auf eine Verlangsamung des Proteinabbaus hin.

G. Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt den Mangel an Wirkung der MCP-Inhibitoren auf den Kontrollmuskel.

Tabelle 2 zeigt dre Veränderung im Proteingehalt während des dritten Tages bei Nichtbelastung.

Tabelle 3 zeigt die Wirkung der MCP-Inhibitoren auf das Protein im nicht-belasteten Muskel.

Tabelle 4 zeigt die Wirkung der MCP-Inhibitoren auf die Synthese im nicht-belasteten Muskel.

In den Tabellen bezieht sich die Verbindungsnummer auf die Beispielnummer, unter der der Syntheseweg der Verbindung dargelegt ist.

Tabelle 1

Mangel an Wirkung von MCP-Inhibitoren auf den Kontrollmuskel
Tabelle 2

Veränderung des Proteingehalts während Tag 3 ohne Belastung
Tabelle 3

Wirkung von MCP-Inhibitoren auf das Protein von nicht-belastetem Muskel
Tabelle 4

Mangel an Wirkung der MCP-Inhibitoren auf die Synthese von nicht-belastetem Muskel
Beispiel 5

Aufzeigen von MCP-Inhibierung unter Verwendung von MHC-1-Verarbeitung Verbindungen der Erfindung wurden in einem Assay auf ihre Fähigkeit, die Verarbeitung von exogenem OVA-Antigen über den Klasse-I-Haupthistokompatibilitätsweg (MHC-I) zu inhibieren, untersucht. Die MCP-Inhibitoren wurden auf ein funktionelles Antigenverarbeitungssystem angewendet, welches den Einschluss des Inhibitors innerhalb der Antigen-verarbeitenden Zelle ermöglicht, während sie dem Antigen ausgesetzt ist, gefolgt von der Fixierung der verarbeitenden Zelle. Um die Expression des Peptide-MHC-I-Komplexes zu bestimmen, werden dann in Abwesenheit von Inhibitor T-Zell-Hybridoma zu den verarbeitenden Zellen gegeben, was die Antigenverarbeitung vor der Fixierung zeigt.

A. Zellkultur

Man lies Zellen bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, die unter 5% CO2 gehalten wurde, in einem Standardmedium wachsen: DMEM (Gibco, St. Louis, MO) mit 10% fötalem Kälberserum (Hyclone, Logan UT), 5 × 10-5 M 2-Mercaptoethanol, Antibiotika und den folgenden Zusätzen: L-Arginin HCl (116 mg/L), L-Asparagin (36 mg/L), NaHCO3 (2 g/L), Natriumpyruvat (1 mM). Siehe auch Harding, C. V., (1992) Eur. J. Immunol. 22: 1865 bis 1869. M12.B6-Ze11en (großzügiges Geschenk von Osami Kanagawa, Washington. University, St. Louis, MO) wurden für die Antigendarstellung verwendet; sie wurden durch Vereinigung von murinen M12.C3-B-Lymphomzellen mit LPS-stimulierten Splenozyten (Quelle der B-Lymphoblasten) einer C57BL/6-Maus geschaffen. Dementsprechend exprimieren sie das H-2b-Antigen. DOWB-T-Hybridomzellen sind für das OVA-Peptid (323 bis 339), welches entweder I-Ab- oder I-Ad-gebunden ist, spezifisch. Siehe Yewdell et al., Science 1988 239: 637. B3.1-T-Hybridomzellen entsprechen OVA-Kb (258 bis 276).

B. Elektroporation und Antigenverarbeitungsstudien

Das über den MHC-1-Weg zu verarbeitende und darzustellende exogene Antigen (Ovalbumin; OVA) muss in das Cytosol der verarbeitenden Zellen penetrieren. OVA wurde über das Hilfsmittel Eleletroporation in das Cytosol von verarbeitenden Zellen (M12.B6-Ze11en) eingebracht.

Die Elektroporation wurde mit einer Gibco-BEL-Elektroporatorvonichtung unter Verwendung einer Küvettenkammer mit 4-cm-Lücke durchgeführt. Die Kapazität betrug 800 &mgr;F und die Spannung betrug 50 bis 300 V. Die Elektroporation wurde in Serum-freiem RPMI oder PMEM (Gibco) mit 1,5 × 107 M12.B6-Zellen/ml (Bereich von 0,5 × 107 bis 4,0 × 107) in der Gegenwart von OVA bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden sofort auf Eis gegeben. Dann wurden verschiedene Inhibitoren zugegeben und die Zellen wurden auf 18°C oder 37°C gebracht. Schließlich wurden die Zellen für etwa 10 Minuten mit 1% Paraformaldehyd schwach fixiert und gründlich bei 37°C gewaschen, um weiteres Verarbeiten zu verhindern. Das Ausmaß der Verarbeitung (d. h. die Menge der exprimierten spezifischen Peptid-MHC-Komplexe) wurde über die Fähigkeit der M12.B6-Ze11en, die IL-2-Sekretion bei B3.1- oder DOBW-T-Hybridomzellen zu stimulieren, bestimmt. T-Zellen (105) wurden mit M12.B6-Ze11en (2 × 105 wenn fixiert, 5 × 104 wenn lebensfähig) in 0,2 ml für 18 bis 24 Stunden bei 37°C in einer 102-Kammer abgeschieden. Beide T-Hybridoma antworten auf Antigenstimulierung über die Sekretion von IL-2 (im Assay in den Überständen nachgewiesen, über die Proliferation von IL-2-abhängigen CTLL-Zellen und die Aufnahme von [H3]-Thymidin. Siehe Allen et al., J. Imunol. 132: 1077).

Ergebnisse dieser Studien sind in den 1 bis 3 aufgezeigt. 1 zeigt die Wirkungen der Verbindungen 14 und 16 auf die Verarbeitung von durch Elektroporation eingebrachtem OVA durch M12.B6-Ze11en. Die Abbildungen 2-und 3 zeigen die Wirkung der Verbindungen 14 und 20 auf die MHC-1-OVA-Verarbeitung. Beide Verbindungen inhibieren wirkungsvoll die OVA-Verarbeitung. Diese Daten stellen eine zusätzliche Unterstützung für die MCP-Inhibitorwirkung der Verbindungen der Erfindung bereit. Es ist anerkannt, dass beim klassischen MHC-I-Weg der Antigenabbau über Proteasome eine Rolle spielt. Siehe Goldberg et al., vorstehend. So können die Verbindungen für ein weitergehendes Verständnis der Wichtigkeit der proteolytischen Verarbeitung von Antigenen verwendet werden.

Beispiel 6 A. Reduktion des Cu/Zn-Superoxiddismutaseabbaus (SOD-1) I. Teil 1 – Klonen und Mutagenese.

Ein Mäuse-SOD-1-cDNA-Klon wurde von Jim Mahaffey (North Carolina State University, Raleigh, NC) erhalten. Dieser Klon wurde über Polymerasekettenreaktions-Verfahrensmethoden (PCR) modifiziert, um 1) ein Kozak-Tranlsationsinitiationsconsensussignal (d. h. 5'-GCCGCCACC-3'), direkt strangaufwärts vom ATG-Startcodon, 2) eine Hind-III-Restriktionsstelle, 5' von diesem Consensussignal und 3) eine Xho-I-Restriktionsstelle, am 3'-Terminus der cDNA einzubringen. Die Oligonucleotidprimer, die für die PCR-Verfahren verwendet wurden, waren: 5'-Primer (EH87)= 5'-TCGATCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCGATGAAAGC-3' (SEQ ID-Nr.: 1), 3'-Primer (EH88) = 5'-AGCTAGCCTCGAGCAGATTACAGTTTAATG-3' (SEQ ID-Nr.: 2). Das so erhaltene PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III und Rho I verdaut und in den mit Hind III und Xho I verdauten Vektor pBluescript II SK+ (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) geklont, wobei pSK-HX2 erhalten wurde.

Die FALS-Punktmutationen bei Aminosäure 4 (Ala4 → Val) (GCG → GTG) und bei Aminosäure 113 (Ile113 → Thr) (ATT → ACT) wurden in den SOD-1-cDNA-Klon pSK-HX2 unter Verwendung des Überlappungsextensions-PCR-Mutageneseverfahrens, beschrieben von Ho et al., Gene 77: 51 bis 59 (1989), eingebracht. Die Ile11 3 → Thr – Mutante wurde wie folgt konstruiert: das 5'-PCR-Fragment wurde hergestellt, unter Verwendung des 5'-Primers EH78; bestehend aus der Nucleotidsequenz 5'-TTAATCCTCACTCTAAGAAAC-3' (SEQ ID-Nr.: 3) (Nucleotide 193 bis 213 von SOD-1-cDNA, wobei #1 das A des ATG-Startcodons ist) und des 3'-Primers EH84; bestehend aus der Nucleotidsequenz 5'-TTGTACGGCCAGTGATGGAATGCT-3' (SEQ ID-Nr.: 4) (Nucleotide 351 bis 328), das 3'-PCR-Fragment wurde konstruiert unter Verwendung des 5'-Primers EH83; bestehend aus der Nucleotidsequenz 5'-AGCATTCCATCACTGGCCGTACAA-3' (SEQ ID-Nr.: 5) (Nucleotide: 328 bis 351) und des 3'-Primers EH42; bestehend aus der Nucleotidsequenz 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID-Nr.: 6) (Nucleotide 626 bis 645 von pBluescript II SK+). Fünfzig Nanogramm von sowohl den 5'- als auch den 3'-PCR-Fragmenten wurden im zweiten Schritt der PCR-Umsetzung kombiniert und unter Verwendung der Primer EH78 und EH42 amplifiziert. Dieses PCR-Produkt wurde mit Bal I und Xho I verdaut und in mit Bal I und Xho I verdautes pSK-HX2 kloniert, wobei auf diese Weise das native 255 bp Bal I/Xho I – Fragment mit dem FALS-Mutantenfragment (Klon pSK-113) ersetzt wurde.

Die Ala4 → Val - Mutante wurde wie folgt konstruiert: das 5'-PCR-Fragment wurde hergestellt unter Verwendung des 5'-Primers EH105; bestehend aus der Nucleotidsequenz

(Nucleotide +21 bis –20) und des 3'-Primers EH41; bestehend aus der Nucleotidsequenz 5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3' (SEQ ID-Nr.: 8) (Nucleotide 792 bis 733 von pBluescript II SK+). Das 3'-PCR-Fragment wurde hergestellt unter Verwendung des 5'-Primers EH 104, bestehend aus der Nucleotidsequenz
(Nucleotide –20 bis + 21) und des 3'-Primers EH103; bestehend aus der Nucleotidsequenz 5'-CTTCAGTTAATCCTGTAA-3' (SEQ ID-Nr.: 10) (Nucleotide 123 bis 106). Wie vorstehend wurden 50 ng von sowohl den 5'- als auch den 3'-PCR-Fragmenten im zweiten Schritt der PCR-Umsetzung kombiniert und unter Verwendung der Primer EH41 und EH103 amplifiziert.

Dieses PCR-Produkt wurde mit Hind III und Rsr II verdaut und in mit Hind III und Rsr II verdautes pSK-HX2 kloniert, wobei auf diese Weise das native 51 bp Hind III/Rsr II – Fragment mit dem FALS-Mutantenfragment (Klon pSK-A4V) ersetzt wurde. Alle vorstehend beschriebenen PCR-Produkte wurden unter Verwendung des Sequenaseverfahrens (US Biochemical, Cleveland, OH) sequenziert, um das Vorhandensein der Mutationen und die Abwesenheit von jeglichem PCR-Fehler zu bestätigen. Eine Veranschaulichung des SOD-1-Gens ist in 4 gezeigt, worin die Lagestellen der Mutationen, der Primer und der Restriktionsstellen definiert sind.

Der SOD-1-cDNA-Expressionsvektor wurde durch Verdauen des Wildtyps (pSK-HX2) und der Mutantenkonstrukte (pSK-113 und pSK-A4V) mit Hind III und Xho I konstruiert. Jedes der drei erhaltenen 546 bp Fragmente, welche die SOD-1-cDNA-Sequenzen enthielten, wurde einzeln in den mit Hind III und Xho I verdauten pcDNA I/Neo (Invitrogen Corp., San Diego, CA) kloniert, um jeweils pCMV-HX5 (Wildtyp-SOD), pCMV-113 (Ile113 → Thr) und pCMV-A4V (Ala4 → Val) zu erhalten.

II. Teil 2.

Es wurden Vorexperimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob die verringerte Stabilität der FALS-mutanten SOD-1-Proteine gemäß dem MCP-vermittelten proteolytischen Abbau zustande kam. Die menschliche Nierenzelllinie, die als 293 (menschliche 293-Zellen oder 293-Zellen) bezeichnet wird, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville; Maryland, 20852 (ATCC #CRL 1573) erhalten und man lies sie in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium mit 4,6 g/L Glucose, 10%igem wärme-inaktiviertem Pferdeserum (Gibco/Life Technologies Inc. Gaithersburg, MD) wachsen. Die menschlichen 293-Zellen wurden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 vorgehalten. Die 293-Zellen wurden unter Verwendung des Calciumphosphatverfahrens (Chen, C. et al., Biotechniques 6: 632 (1988)) transient transfiziert. Der pCMV-113-SOD-1-Expressionsvektor wurde in die 293-Zellen eingebracht und 24 Stunden später wurden die Zellen entweder mit Verbindung 34, Verbindung 14 oder Verbindung 24, jeweils mit einer Konzentration von 5 &mgr;M für eine Dauer von 24 Stunden inkubiert. Die bekannten MCP- und andere Proteaseinhibitorverbindungen waren in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Andere 293-Zellkulturen wurden als Negativkontrollen mit einem gleichen Volumen an DMSO inkubiert, oder nur in Medium belassen.

Ungefähr 48 Stunden vor der Zugabe der Testverbindungen wurden 5 × 105 293-Zellen in 36-mm-Schalen ausgesät und bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 vorgehalten. Die Zellen wurden mit MCP-Inhibitoren (Verbindung 34, 14 oder 24) oder mit DMSO als eine Negativkontrolle für eine Dauer von 24 Stunden inkubiert. Zelllysate wurden durch Lysieren der Zellen in ungefähr 75 &mgr;l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) über Cyclen von Einfrieren und Auftauen hergestellt. Die Proteinkonzentrationen der Zelllysate wurden unter Verwendung des BCA-Verfahrens (Pierce, Rockford, IL) bestimmt und 2 bis 2,5 &mgr;g von jeder Probe wurden einer Elektrophorese auf einem 4 bis 20% Polyacrylamidgel (Novex, San Diego, CA) unter Verwendung eines Tris/Glycin/SDS-Puffersystems (25 mM Tris / 192 mM Glycin / 0,1% SDS) unterzogen. Die Proteine wurden durch Elektroelution auf Nitrocellulosefilter übertragen und die Filter wurden durch Inkubation für 30 Minuten in Blottolösung (5% Milchpulver in 25 mM Tris-gepufferter Salzlösung (1 × TBS)) geblockt. Die Filter wurden in eine Lösung von primärem Antikörper (1 : 10.000-Verdünnung in Blottolösung) überführt und für 2 bis 18 Stunden inkubiert. Der in diesen Studien verwendete Antikörper war polyklonales Kaninchenantiserum gegen gereinigtes Mäuse-SOD-1, hergestellt in E. coli (Hazelton Research Products, Denver, PA). Die Filter wurden dreimal für 5 Minuten jeweils in 1 × TBS gewaschen und für 2 Stunden in einer Lösung mit sekundärem Antikörper (1 : 2.000-Verdünnung in Blottolösung) inkubiert. Der sekundäre Antikörper war ein Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit einer alkalischen Phosphatase (Bio-Rad, Richmond, CA). Die Filter wurden dreimal für 5 Minuten jeweils in 1 × TBS gewaschen und durch Inkubation für 5 bis 60 Minuten mit einem im Handel erhältlichen Nachweisreagenz für alkalische Phosphatase (Bio-Rad, Richmond, CA) wurde die Aktivität von alkalischer Phosphatase durch Anfärben sichtbar gemacht. Die dem SOD-1-Protein entsprechenden, gefärbten Banden wurden unter Verwendung eines DocuGel-V-Bildanalysesystems und einer RFLPscan-Software (Scanalytics, Billerica, MA) quantifiziert. Die Mengen von SOD-1 werden als Einheiten der Induktion relativ zur Negativkontrolle (d. h. Einheiten des Experiments dividiert durch Einheiten der Kontrolle) ausgedrückt. Die Immunoblotanalysen der Zelllysate zeigten, dass die SOD-1-Mengen, verglichen mit denen der Kontrollen, bei jeder der drei Proben, die in Gegenwart von MCP-Inhibitoren inkubiert wurden, etwas höher lagen (5). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inhibierung der MCP durch die Verbindungen der Erfindung zu einer Erhöhung der Ansammlung von SOD-1-Protein in der Ile113 → Thr – Mutante führt und dabei wird für MCP anzeigt, dass es für die reduzierten Mengen von SOD-1 in den FALS-Mutation-enthaltenden Zellen verantwortlich ist.

III. Teil 3.

Um ferner zu zeigen, dass die MCP-Aktivität für den SOD-1-Turnover verantwortlich ist, wurden Studien an Zelllinien durchgeführt, die stabil das Wildtyp-Mäuse-SOD-1 oder die FALS-mutanten Proteine, d. h. Val anstelle von Ala4 und Thr anstelle von Ile 113, herstellen. Die Zelllinien, die stabil das native Mäuse-SOD-1 und die zwei FALS-mutanten SOD-1-Proteine exprimierten, wie vorstehend erwähnt, leiteten sich aus einer Calciumphosphat-Transfektion (Chen, C. et al., Biotechniques 6: 632 (1988)) von 293-Zellen mit SOD-1-cDNA-Expressionskonstrukten (vorstehend beschrieben), gefolgt von einer Selektion über Neomycinresistenz, durch Wachstum in der Gegenwart von 1 mg/ml G418 (GeneticinTM, Gibco/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), ab. Die Zellen wurden für drei Wochen unter G418-Selektion gehalten, wobei währenddessen eine Arzneistoffselektion nicht vorhanden war, und die G418-resistenten Kolonien von jedem transformierten Zelltyp wurden für weiteres Wachstum gepoolt. Für diese Studien wurde Verbindung 14 verwendet.

Zelllinien, die die angegebenen SOD-1-Isoformen exprimierten, wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Verbindung 14 für 24 Stunden inkubiert, wobei zu dieser Zeit die SOD-1-Mengen über densitometrisches Scannen von Immunoblots gemessen wurden. Die Mengen von SOD-1 sind als Einheiten der Induktion relativ zu den Proben der Negativkontrollen (wie vorstehend) ausgedrückt und jeder Datenpunkt ist der Durchschnitt von drei Experimenten. Die Dosis-Wirkungs-Analyse von Verbindung 14 zeigte, dass eine Inkubation der transformierten Zellen mit diesem MCP-Inhibitor zu signifikanten Ansammlungen von SOD-1-Proteinmengen führt, wobei die maximale Ansammlung in jenen Zellen stattfand, welche mit Verbindung 14 in einer Konzentration von ungefähr 20 &mgr;M inkubiert wurden (6). Darüber hinaus korreliert der Absolutwert der SOD-1-Ansammlung mit den geschätzten Halbwertszeiten der verschiedenen SOD-Proteine; wobei Wildtyp-SOD-1 am stabilsten und l1a4 → Val am wenigsten stabil ist (Borchelt D. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8292 bis 8296 (1994)). Diese Daten sind in Übereinstimmung mit der Hypothese, dass die FALS-Mutationen die SOD-1-Proteine destabilisieren, möglicherweise über Fehlfaltung und als ein Ergebnis von Strukturänderungen, die über die Mutationen zustande kommen, welche auf einen Abbau dieser Proteine über MCP abzielen. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass Verbindung 14 eine statistisch signifikante Wirkung auf den Turnover des Wildtyp-SOD-1-Proteins hat, und sie unterstützen ferner die Rolle von MCP beim SOD-1-Abbau.

IV. Teil 4.

Um die Spezifität der MCP-Aktivität beim SOD-1-Turnover aufzuzeigen (und um die mögliche Verwicklung von anderen proteolytischen Hauptwegen, wie den der calciumaktivierten Protease Calpain und den der lysosomalen Proteasen auszuschließen), wurden Experimente durchgeführt, in denen zwei transformierte Zelllinien (vorstehend beschrieben, wobei die eine Wildtyp-Protein herstellt, und die andere das SOD-1-Protein mit der Ala4 Val – Mutation) mit verschiedenen Proteaseinhibitoren, von welchen jeder spezifisch für eine einzelne proteolytische Aktivität ist, inkubiert: Verbindung 14 inhibiert MCP; „Calpeptin" (Novabiochem USA, La Jolla, CA, Kat.-Nr.: 03-34-0051; CBZ-Leu-Nle-Aldehyd, Biochem. Biophys. Res. Comm. (1988) 153: 1201), ein durch Zellen penetrierender „Calpain"-Inhibitor (Calpain ist eine Cysteinprotease); und DK-3 (Enzyme Systems Products, Dublin, CA, CBZ-Phe-Ala-CHN2) inhibiert lysosomale Proteaseaktivität. Zusätzlich wurden Zellen mit Verbindung 16 inkubiert, welche ein weniger potenter MCP-Inlibitor ist, verglichen mit einer besonders bevorzugten Verbindung der Erfindung, d. h. Verbindung 14. Zelllinien, welche die angegebenen SOD-1-Isoformen exprimieren, wurden für 24 Stunden mit den folgenden Proteaseinhibitoren inkubiert: Verbindung 14, 20 &mgr;M; Calpeptin, 10 &mgr;M; DK-3, 5 &mgr;M; Verbindung 16, 20 &mgr;M; oder mit DMSO als eine Negativkontrolle. Nach den 24 Stunden der Inkubation mit den Inhibitoren wurden die SOD-1-Mengen über densitometrisches Scannen von lmmunoblots gemessen. Die Mengen von SOD-1 sind wie vorstehend als Einheiten der Induktion, relativ zu den unbehandelten Proben ausgedrückt. Jeder Datenpunkt ist der Durchschnitt von Ergebnissen aus drei Experimenten.

Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Man kann sehen, dass der Turnover der A1a4 → Val – mutanten SOD-1 eine Funktion der MCP-Aktivität ist und dass nur die spezifische Inhibierung von MCP durch die bevorzugte Verbindung 14 zu einer signifikanten (dreifachen) Zunahme bei der Ansammlung von SOD-1-Protein führt. Eine Inkubation mit den Inhibitoren von Calpain oder der lysosomalen Proteasen hatte keine nennenswerte Wirkung auf den SOD-1-Turnover. Ferner führte die Behandlung mit Verbindung 14 zu einem geringfügigen Anstieg bei der Ansammlung von Wildtyp-SOD-1, ein Befund, der kürzlich auch bei den Dosis-Wirkungs-Studien erhalten wurde. Zusammengefasst zeigen diese Studien, dass die MCP-Aktivität entscheidend für den SOD-1-Turnover in den transforinierten 293-Zelllinien ist, und dass die Inhibierung von MCP durch Verbindung 14 zu einer Erhöhung von SOD-1-Protein in den Zellen führt.

Synthese der Inhibitoren

Im Folgenden werden beispielhafte Synthesewege für die Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Andere Synthesevorschriften, genauso wie Modifikationen der folgenden Syntheseschemata werden dem Fachmann ohne weiteres offensichtlich, wenn er die vorliegende Offenbarung einmal voll erfasst hat.

Die Inhibitoren der Erfindung beinhalten Amidbindungen, welche durch bekannte synthetische Verfahren, unter Verwendung der in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Band I (1979), Herausgeber Gross, et al., Academic Press beschriebenen und in den nachstehenden Beispielen 8 bis 11 genau beschriebenen Lösungsphase-Techniken, eingebracht werden können.

Die Inhibitoren können durch die getrennte Synthese und Koppeln der Fragmente: R1-(CH2)n-CH(R2)-COOH und HN2-CH(R3)-CONH-R4 (Kopplungsverfahren I), wie in den Beispielen 14 bis 38 beschrieben, hergestellt werden.

Alternativ können sie durch die getrennte Synthese und Koppeln der Fragmente: R1-(CH2)n-CH(R2)-CONH-CH(R3)-COOH und HN2-R4 (Kopplungsverfahren II), wie nachstehend in den Beispielen 39 bis 42 beschrieben, hergestellt werden.

Wenn der Substituent Q eine Aldehydgruppe enthält (d. h. wenn HN2-R4 ein Aminoaldehyd ist, der sich von einer Aminosäure, z. B. HN2-CH(CH2R)-CHO ableitet), kann der erforderliche Acetal-geschützte Aminoaldehyd wie durch Gacek, et al. Tetrahedron, 30, 4233 (1974) beschrieben oder über die Verfahren, die in Beispiel 12 beschrieben sind, hergestellt werden. Nachdem die Kopplung abgeschlossen ist (über Kopplungsverfahren I oder II), können die Acetal-Schutzgruppen wie in Beispiel 11 (Methode E) beschrieben entfernt werden, um die freie Aldehydgruppe freizusetzen.

Wenn Q ein Methylketon oder ein Diazo-, Brom- oder Chlormethylketon (d. h. wenn HN2-R4 ein alpha-Amino-substituiertes Methylketon oder ein alpha-Diazo-, Brom- oder Chlormethylketon, abgeleitet von einer Aminosäure, ist) ist, ist das Kopplungsverfahren II besonders zweckmäßig. Das Hydrochloridsalz des Chlormethylketons kann gekauft werden (Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, Pennsylvania) oder es kann durch Umwandlung der Boc-geschützten Aminosäure zu einem gemischten Kohlensäureanhydrid, gefolgt von der Umsetzung mit Diazomethan, um das Diazomethylketon zu erhalten, hergestellt werden. Die Brom- und Chlormethylketone werden durch Umsetzung des Diazomethylketons mit Brom- oder Chlorwasserstoff, wie von Kettner, et al. Arch. Biochem. Biophys. 162, 56 (1974), Fittkau, J. Prakt. Chem. 315, 1037 (1973) oder Zimmerman, et al. PCT WO 95/15749, veröffentlicht am 15. Juni 1995, beschrieben, hergestellt. Die entsprechenden Methylketone können durch Hydrogenolyse der Chlormethylketone hergestellt werden, wie von Kettner, et al. U.S. Patent 4,652,552 beschrieben.

Wenn Q ein alpha-Difluormethylketon ist, kann das entsprechende 1-Amino-3,3-difluor-2-propanol über das Kopplungsverfahren II hergestellt und gekoppelt werden, und der so erhaltene Difluoralkohol kann über das von Trainor und Stein, U.S. Patent 4,923,890 beschriebene Verfahren zum Difluorketon oxidiert werden.

Wenn Q ein Trifluormethylketon ist (d. h. wo HN2-R4 ein von einer Aminosäure abgeleitetes Trifluormethylketon ist, z. B. HN2-CH(CH2-R)-COCF3), kann das erforderliche Keton wie von Imperiali und Abeles, Biochemistry 25, 3760 und Zusatzseiten (1986) beschrieben hergestellt werden.

Wenn Q ein von einer Aminosäure abgeleitetes Monofluormethylketon ist (d. h. wenn HN2-R4 einen Fluormethylketonrest enthält, z. B. HN2-CH(CH2-R)-COCH2F), kann das erforderliche Keton über das Verfahren von Palmer in der Europäischen Patentanmeldung EP 442 754 unter Verwendung der Boc-geschützten Aminosäure und Magnesiumbenzylfluormalonat hergestellt werden. Nach der Entfernung der Boc-Schutzgruppen kann das Amin unter Verwendung von Kopplungsverfahren II gekoppelt werden. Alternativ kann das Monofluormethylketon durch Oxidation des entsprechenden Alkohols, wie in Beispiel 42 beschrieben, hergestellt werden.

Wenn Q ein Boraminosäurederivat ist (d. h. Q = -B(OH)2 oder dessen cyclischer Ester), wird der cyclische Ester im Wesentlichen hergestellt, wie von Shenvi, U.S. Patent 4,537,773 beschrieben, und nach dem Koppeln über das Kopplungsverfahren II kann er gegebenenfalls in die freie Peptidboronsäure umgewandelt werden, so wie von Shenvi und Kettner in den U.S. Patenten 4,499,082 und 5,187,157 und in J. Biol. Chem. 259, 15106 (1984) beschrieben.

Wenn Q ein alpha-Diketon oder ein alpha-Ketoester ist (d. h. Q = -C(=O)C(=O)R oder -C(=O)CO2R), können die erforderlichen Aminodiketone oder -alpha-Ketoester wie von Angelastro, et al., J. Med. Chem. 33, 13 (1990) und in den Bezugnahmen darin beschrieben hergestellt werden. Die alpha-Ketoester können hydrolisiert oder amidiert werden, um die entsprechenden alpha-Ketosäuren oder -amide herzustellen. Die. alpha-Ketoamide können auch aus im Handel erhältlichen Boc-geschützten Aminosäuren über eine Modifikation des Verfahrens von Harbeson, et al. J. Med. Chem. 37, 2918 bis 2929 (1994) hergestellt werden. In diesem letzten sehr nützlichen Verfahren wird die Boc-geschützte Aminosäure schrittweise in ein N,O-Dimethylhydroxylamid, einen Aldehyd, ein Cyanohydrin, ein alpha-Hydroxycarboxylat und ein alpha-Hydroxycarboxamid umgewandelt: R1-COOH → R1-CON(CH3)-OCH → R1-CHO → R1-CH(OH)-CN → R1-CH(OH)-COOH → R1-CH(OH)-CONH-R wobei R1 = Boc-NH-CH-(CH2R7)-.

Die Boc-Gruppe wird unter sauren Bedingungen entfernt und nach Neutralisation wird der freie Aminorest wie in Kopplungsverfahren II gekoppelt, um das alpha-Hydroxycarboxamid zu erhalten, welches dann oxidiert wird, um den alpha-Ketocarboxamid-Inhibitor zu erhalten: Boc-NH-CH(CH2R)-CH(OH)-CONH-R7 ---> HN2-CH(CH2R7)-CH(OH)-CONH-R7 -- (Kopplungsverfahren II) --> R1-(CH2)n-CHR2-CONH-CH(R3)-CONH-CH(CH2R7)-CH(OH)-CONHR7 ---> R1-(CH2)n-CH(R2)-CONH-CH(R3)-CONH-CH(CH2R7)-COCONH-R7

Beispiel 7

Methode A: Gemischtes Anhydrid-Verfahren:

Schema:

X = Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)- oder t-Butyloxycarbonyl (Boc)-Gruppe; Y = Acetaloder eine andere Schutzgruppe für den Aminoaldehyd

AA1 = Aminosäure

AA2 = Aminoaldehyd

N-Methylmorpholin (NMM) (1 Äquiv.) wurde zu einer gerührten Lösung der geschützten Aminosäure in Tetrahydrofuran (THF) gegeben. Das Gemisch wurde auf –15°C gekühlt, mit Isobutylchlorformiat (IBCF) (1,1 Äquiv.) behandelt und man lies die Umsetzung für 10 Minuten laufen. Darauffolgend wurde die Aminoaldehydkomponente in der Form der freien Base zugegeben, gefolgt von NMM (1,1 Äquiv., 2,2 Äquiv. wenn es sich um das Säuresalz handelt). Das Rühren wurde für 30 Minuten bei –15°C fortgeführt, und dann bei Raumtemperatur für 3 bis 4 Stunden. Das Reaktionsgemisch wurde in 150 bis 200 mL Ethylacetat (EtOAc) gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde nacheinander mit Wasser, 5% Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3), 2%iger wässriger Zitronensäure und schließlich Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat (Na2SO4) oder Magnesiumsulfat (MgSO4) getrocknet, das Lösungsmittel wurde unter vemngertem Druck entfernt und das so erhaltene Produkt wurde mit Petroleumether verrieben. Das so erhaltene feste Peptid wurde abfiltriert, getrocknet und charakterisiert.

Beispiel 8 Methode B: Fmoc-Gruppe-Entschützungsverfahren: Schema:

Fmoc-HN-AA1-AA1-Y ---> H2N-AA1-AA2-Y. Das Fmoc-geschützte Peptid (0,2 bis 4 mmol) in einem Gemisch von 30% Dimethylformamid (DMF) in Ethylacetat (EtOAc) wurde mit einem 50- bis 60-fachen Überschuss an Diethylamin (DEA) für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Lösungsmittel wurde bei 30°C unter verringertem Druck abgedampft, und zum Rückstand wurde Petroleumether gegeben. Wenn ein Niederschlag gebildet wurde, wurde dieser abfiltriert und getrocknet. In anderen Fällen wurde die so erhaltene gummiartige Masse wiederholt mit Petroleumether verrieben, und die gummiartige Masse wurde unter Vakuum gelagert.

Beispiel 9 Methode C: Anfügen einer Cap-Gruppe oder Aminosäure an das Peptid: Schema:

R-COOH + HN2- AA) II COOR' -------> R-CO-HN- (AA)a-COOR' Die Cap-Gruppe (als eine freie Carbonsäure) oder die geschützte Aminosäure (1 Äquiv.), Benzotriazol-l-yloxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) (1,1 Äquiv.) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) (1 Äquiv.) wurden in 5 mL DMF, gefolgt von NMM (2,2 Äquiv.) gelöst. Nach 5 Minuten wurde die entschützte basische Komponente des Peptids oder die Carboxylgruppen-geschützte Aminosäure zugegeben, der pH-Wert wurde auf 8 eingestellt und das Gemisch wurde für 3 bis 4 Stunden gerührt. Dies wurde dann mit 150 bis 300 mL EtOAc verdünnt und nacheinander mit Wasser, 2% NaHCO3, Wasser, 2%iger Zitronensäure und Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei ein Peptid mit Cap-Gruppe oder ein N-geschütztes Peptid erhalten wurde.

Beispiel 10 Methode D: Verfahren zur Entfernung der Carbobenzyloxygruppe (CBZ):

Eine Lösung des CBZ-geschützten Peptids oder Aminosäurederivats (1 g) in Ethylacetat (15 mL) wurde mit 0,2 g Pd/C auf Kohle (10% Pd auf Kohle, das 50 Gew.-% Wasser enthält) gemischt und für 4 Stunden bei 40 Psi. hydriert. Die Lösung wurde durch Celite® (Dimatomeenerde) filtriert und zur Trockene eingedampft, wobei das ungeschützte Peptid oder Aminosäurederivat erhalten wurde.

Beispiel 11 Methode E: Umwandlung von Acetal zu Aldehyd:

Eine Lösung des Peptidacetals (1 Äquiv.) in 3 mL THF wurde mit 3 mL wässriger HCl (2 M) gemischt und für 0,5 bis 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen entfernt und der Endrückstand wurde mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet, wobei man den Peptidaldehyd erhielt.

Beispiel 12

Methode F: Herstellung von Leucinaldiethylacetal:

Stufe 1: NMM (10 mL) wurde zu einer Lösung von CBZ-Leu-OH (25 g, 93 mmol) in 250 mL THF gegeben. Die Lösung wurde auf –15°C gekühlt, mit 13 mL Isobutylchlorformiat (IBCF) behandelt, und man lies die Umsetzung für 10 Minuten laufen. Aufeinanderfolgend wurden eine Suspension von N,O-Dimethylhydroxylamin Hydrochlorid (9,36 g, 96 mmol) in 40 mL DMF und 10 mL NMM zugegeben. Nach 4 Stunden Rühren wurde das Gemisch mit 400 mL EtOAc verdünnt und die Lösung wurde nacheinander mit Wasser, 5%iger NaHCO3-Lösung, Wasser, 2%iger Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und eingedampft, wobei 19,0 g eines farblosen Öls erhalten wurden.

Stufe 2: Eine Lösung des Öls (19 g) von Stufe 1 in 200 mL Ether wurde auf –78°C gekühlt und es wurden 120 mL einer Lösung von Lithiumaluminiumhydrid (LiA1H4) (1,0 M) in Ether tropfenweise über einen Zeitraum von 45 Minuten zugegeben. Die Lösung wurde für 30 Minuten gerührt und 200 mL I M Kaliumhydrogensulfat (KHSO4) wurden tropfenweise unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit KHSO4-Lösung (1 M) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und zu einer farblosen Flüssigkeit (CBZ-Leu-H) eingedampft.

Stufe 3: 104 mL Triethylorthoformiat wurden über einen Zeitraum von 30 Minuten zu einer Lösung von CBZ-Leu-H (12 g) und p-Toluolsulfonsäure (0,9 g) in 100 mL wasserfreiem Ethanol (EtOH) gegeben. Das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt, und wurde dann eingedampft und mit 500 mL Ether verdünnt. Die Etherschicht wurde nacheinander mit gesättigten Lösungen von NaHCO3 und Natriumchlorid gewaschen. Der gelblich-braune halbfeste Stoff wurde in kaltem Hexan umkristallisiert, wobei cremefarbene Nadeln von CBZ-Leucinaldiethylacetal erhalten wurden. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,28 (m, 5H), 5,03 (s, 2H), 4,77 (d, 1H), 4,27 (d, 1H), 3,8 (m, 1H), 3,63 (m, 2H), 3,43 (m, 2H), 1,6 (dd, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,12 (m, 6H), 0,83 (d, 6H).

Stufe 4: Das Produkt (14,8 g) aus Stufe 3 wurde unter Verwendung von Methode D mit 2,5 g Pd/C hydriert, wobei 4,09 g Leucinaldiethylacetal als ein Öl erhalten wurden. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) 6: 4,16 (d, 1H), 3,70 (m, 3H), 3,75 (m, 2H), 2,87 (m, 1H), 1,78 (m, 1H) , 1,33 (m, 2H), 1,23 (m, 6H), 0,935 (dd, 6H).

Beispiel 13

Methode : Synthese von P3-Mimetika (für die Nomenklatur siehe Schechter, I. und Burger, A. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27: 157 bis 162).
Stufe 1: Herstellung von Benzylcyclopentanacetat:

Ein Gemisch von Cyclopentylessigsäure (10,02 g, 78,2 mmol), Benzylalkohol (8,45 g, 78,2 mmol) und p-Toluolsulfonsäure Monohydrat (1,48 g, 7,82 mmol) in Benzol (60 mL) wurde für 2 Stunden unter Verwendung eines Dean-Stark-Wasserabscheiders unter Rückfluss gehalten. Nach dem Abkühlen wurde das Benzol entfernt und das Gemisch wurde mit Ether (50 mL) verdünnt und nacheinander mit gesättigter NaHCO3-Lösung, gesättigter Salzlösung gewaschen, getrocknet undeingedampft, wobei die Verbindung (15,40 g) als ein Öl erhalten wurde; 1H NMR ( 300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,35 (m, 5H), 5,10 (s, 2H), 2,40 (d, j = 8 Hz, 2H), 2,26 (m, 1H), 1,81 (m, 2H), 1,6 (m, 4H), 1,18 (m, 2H).

Stufe 2: Herstellung von Benzyl-2-cyclopentyl-l0-ioddecanoat:

Zu einer gekühlten (–78°C) Lösung von Lithiumdüsopropylamid (20 mmol) in einem Gemisch von THF (20 mL) und Hexan (8 mL) (in situ erhalten aus dem entsprechenden Düsopropylamin und n-BuLi) wurde langsam die in Stufe 1 erhaltene Verbindung (3,96 g, 18 mmol) in wasserfreiem THF (10 mL) zugegeben. Das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt und es wurde 1,8-DÜodoctan (7,19 g, 20 mmol) in Hexamethylphosphoramid (3,50 g, 20 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei –78°C für 30 Minuten gerührt, langsam über einen Zeitraum von 2 Stunden auf 0°C gebracht und durch die vorsichtige Zugabe von 50 mL 12%iger wässriger Natriumchloridlösung abgestoppt. Das Gemisch wurde mit Ether extrahiert, mit Salzlösung gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Das Rohprodukt wurde über eine Flashchromatographie auf Kieselsäure, unter Verwendung von Hexan bis 1% EtOAc in Hexan als Elutionsmittel, zu einem Öl (3,23 g) aufgereinigt; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) 6: 7,35 (m, 5H), 5,15 (s, 2H), 3,20 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,0 (m, 1H), 1,2 bis 1,8 (m, 22H).

Stufe 3: Herstellung von Benzyl-l0-cyano-2-cyclopentyldecanoat:

Ein Gemisch des Iodesters von Stufe 2 (3,99 g, 8,7 mmol) und Natriumcyanid (0,47 g, 9,6 mmol) in 15 mL wasserfreiem DMSO wurde für 30 Minuten bei 70 bis 75°C erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch auf Eis ( 40 g) gegossen, in Ether extrahiert und nacheinander mit Wasser und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde aufkonzentriert, wobei ein Ö1 erhalten wurde (2,89 g). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,35 (m, 5H), 5,15 (s, 2H), 2,30 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,3 bis 1,8 (m, 22H).

Stufe 4: Herstellung von Benzyl-lO-N-phthalimido-2-cyclopentyldecanoat:

Ein Gemisch der Verbindung von Stufe 2 (1,21 g, 2,6 mmol) und Kaliumphthalimid (0,536 g, 3 mmol) in 8 mL DMF wurde für 30 Minuten bei 70 bis 75°C erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch auf Eis ( 40 g) gegossen und in 60 mL Ether extrahiert. Die vereinigten organschen-Phasen wurden mit Wasser und gesättigter Salzlösung gewaschen und zu einem farblosen Ö1 aufkonzentriert (1,24 g). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,85 (m, 2H), 7,70 (m, 2H), 7,35 (m, 5H), 5,10 (s, 2H), 3,65 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,22 bis 1,18 (m, 22H).

Stufe 5: Herstellung von 10-Cyano-2-cyclopentyldecansäure:

Ein Gemisch des Cyanoesters von Stufe 3 (2,89 g, 8 mmol) und 10% Pd-C (0,6 g, DeGussa, H2O-Gehalt: 50%) in wasserfreiem McOH (35 mL) wurde für 2 Stunden (42 bis 26 Psi.) hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Celite®-Pad filtriert und zu einem farblosen Öl aufkonzentriert (2,02 g). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 2,35 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,3 bis 1,9 (m, 22H).

Stufe 6: Herstellung von 2-Cyclopentyl-10-N-phthalimidodecansäure:

Folgend dem Verfahren von Stufe 5 wurde das Produkt (0,41 g) von Stufe 4 zur Titelverbindung umgewandelt (0,31 g). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,85 (m, 2H), 7,70 (m, 2H), 3,70 (t, 8 Hz, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 1,10 bis 1,85 (m, 22H).

Stufe 7: Herstellung von 10-Trifluormethansulfonamido-2-cyclopentyldecansäurebenzylester:

Ein Gemisch des Esters von Stufe 4 (0,874 g, 1,7 mmol) und Hydrazin Monohydrat (0,425 g, 0,41 mL, 8,5 mmol) in Methanol (8 mL) wurde für 30 Minuten unter Rückfluss erwärmt, aufkonzentriert, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, wobei ein weißer Niederschlag erhalten wurde, der abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde aufkonzentriert, wobei ein Öl erhalten wurde (0,540 g). Das Öl wurde in CH2Cl2 (8 mL) gelöst, auf –10°C gekühlt und es wurde Triethylamin (0,324 mL) zugegeben, gefolgt von Trifluormethansulfonylchlorid (0,25 mL). Die Temperatur wurde langsam über einen Zeitraum von 1 Stunde auf Raumtemperatur gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Wasser, 2%iger HCl, Wasser und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde zu einem Ö1 aufkonzentriert und wurde durch Flashchromatographie an Kieselsäuregel unter Verwendung von 10% EtOAc in Hexan als ein Elutionsmittet gereinigt, wobei 10-Trifluormethansulfonamido-2-cyclopentyldecansäurebenzylester als ein Öl erhalten wurde (0,25 g). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,35 (m, 5H), 5,15 (s, breit, 1H), 5,10 (s, 2H), 3,25 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,10 bis 1,7 (m, 22H).

Stufe 8: Herstellung von 2-Cyclopentyl-l0-(trifluormethansulfonamido)-decansäure:

Folgend dem selben Verfahren wie in Stufe 5 beschrieben, wurde die aus Stufe 7 erhaltene Verbindung (0,25 g) zur Titelverbindung (0,20 g) als ein Ö1 umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 6,60 bis 5,60 (b, 1H), 3,30 (d, 8 Hz, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 1,1 bis 1,8 (m, 22H).

Stufe 9: Herstellung von t-Butyl-8-iodcaprylsäure:

Die Titelverbindung wurde aus t-Butylacetat (1,16 g) und 1,6-Diiodhexan (4,06 g) als ein Öl (2,13 g), folgend dem Verfahren wie für die Verbindung in Stufe 2 beschrieben, synthetisiert. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 3,20 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (t, 8 Hz, 2H), 1,75 bis 1,85 (m, 2H), 1,55 bis 1,65 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,25 bis 1,43 (m, 6H).

Stufe 10: Herstellung von 2-Cyclopentyldecan-1,10-disäure-1-benzyl-10-t-butylester:

Unter Verwendung des in Stufe 2 beschriebenen Verfahrens wurden der Ester (6,92 g) von Stufe 1 und der Iodester (11,37 g) von Stufe 9 umgesetzt, wobei die Titelverbindung (7,44 g) als ein Öl erhalten wurde. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,35 (m, 5H), 5,10 (s, 2H), 2,20 (m, 3H), 2,00 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,0 bis 1,9 (m, 20H).

Stufe 11: Herstellung von 2-Cyclopentyldecan-1,10-disäure-l-benzyl-l0-methylester:

Eine Lösung des Diesters von Stufe 10 (2,86 g, 7 mmol) in CH2Cl2 (30 mL) und 10 mL 90 %ige TFA wurden für 30 Minuten gerührt. Das nach dem Eindampfen erhaltene Produkt wurde in einem Gemisch von CH2Cl2 (10 mL) und McOH (6 mL) gelöst. Die Lösung wurde bei –20°C gerührt und dazu wurde langsam über einen Zeitraum von 2 Stunden Thionylchlorid (6 mL) gegeben. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand wurde in Diethylether (20 mL) gelöst. Die organische Schicht wurde nacheinander mit gesättigter NaHCO3-Lösung, Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet, eingedampft und einer Flashchromatographie auf Kieselsäuregel (Elutionsmittel: 2% EtOAc-Hexan) unterzogen, wobei das Produkt als ein Ö1 erhalten wurde (2,05 g). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,35 (m, 5H), 5,10(s, 2H), 3,65 (s, 3H), 2,30 (t, 8 Hz, 2H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,10 bis 1,90 (m, 10H).

Stufe 12: Herstellung von 2-Cyclopentyldecan-1,10-disäure-l0-methylester:

Unter Verwendung des Verfahrens wie in Stufe 5 beschrieben, wurde die Verbindung (4,96 g) von Stufe 11 in die Titelverbindung (3,66 g) als ein Ö1 umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 3,65 (s, 3H), 2,30 (t, 8 Hz, 2H), 2,15 (m, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,10 bis 1,19 (m, 20H).

Stufe 13: Herstellung von 6-Cyanohexan-l-sulfinsäure Natriumsalz:

In einen Dreihalskolben, der mit einer Wasserkondensationsvorrichtung, einem mechanischen Rührer und einem Tropftrichter ausgestattet war, wurde eine Lösung von 1-Brom-6-cyanohexan (8,04 g, 42,3 mmol) in 75 mL 95%igem EtOH gegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluss erwärmt und dazu wurde langsam über einen Zeitraum von 30 Minuten eine Lösung von Natriumsulfat (8,00 g, 63,5 mmol} in 50 mL H2O gegeben. Das Gemisch wurde für 2 Stunden erwärmt und dann unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 95 %igem EtOH (200 mL) gelöst, zum Sieden erwärmt und filtriert. Das Filtrat wurde aufkonzentriert und in einem Eisbad abgekühlt. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und getrocknet, wobei 3,00 g eines weißen Feststoffs erhalten wurden. Aus der Mutterlauge konnten durch weiteres Aufkonzentrieren 2,2 g einer anderen Charge des Produkts hergestellt werden. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 2,50 (t, j = 8 Hz, 2H), 2,40 (t, 8 Hz, 2H), 1,55 (m, 4H), 1,3 (m, 4H).

Stufe 14: Herstellung von 6-Cyanohexan-l-sulfonylchlorid:

Ein Gemisch des Produkts von Stufe 13 (0,340 g, 1,6 mmol), Thionylchlorid (0,95 g, 8 mmol) und ein Tropfen DMF wurden für 30 Minuten bei 75 bis 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand wurde mit Eiswasser (5 mL) behandelt. Die organische Schicht wurde in 30 mL Ether extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden mit 3%iger NaHCO3-Lösung und Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO4) und filtriert. Das Filtrat wurde mit Aktivkohle (Darco) behandelt, filtriert und aufkonzentriert, wobei ein farbloses Öl (0,240 g) erhalten wurde, welches ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

Die Beispiele 14 bis 38 beschreiben die Synthesen der in Tabelle 5 aufgeführten MCP-Inhibitoren. Die entsprechenden Reinigungsbedingungen sind in Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 5

Multikatalytische Protease-Inhibitoren
Tabelle 5 Fortsetzung)
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Beispiel 14 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: Fluorenylmethyloxycarbonyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Fmoc-Arg(NO2)-OH (4,41 g, 10 mmol) wurde gemäß Methode A (Beispiel 7) unter Verwendung von 1,29 mL IBCF, 2,2 mL NMM und 10 mL THF (anstelle von DMF, wie in Methode A in Beispiel 7) mit Leu-Acetal (1,89 g, 10 mmol) gekoppelt. Das Rohpeptid wurde als amorpher Feststoff erhalten. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,75 (d, 2H), 7,55 (d, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,29 (m, 2H), 6,21 (d, 1H), 5,91 (d, 1H), 4,30 (m, 5H), 3,66 (m, 3H), 3,63 (d, 2H), 3,32 (m, 2H), 1,72 (m, 4H), 1,29 (m, 2H), 1,17 (b, 6H), 0,89 (m, 6H).

Stufe 2: Ng-Nitro-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Die Fmoc-Gruplie wurde von 3,5 g des Produkts von Stufe 1 unter Verwendung der Entschützungsmethode B (Beispiel 8) entfernt. Die freie Base (2,5 g) wurde als halbfester Stoff erhalten. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 8,6 (b, 1H), 7,61 (d, 1H), 4,27 (d, 1H), 3,90 (m, 1H), 3,59 (m, 1H), 3,45 (m, 4H), 3,14 (m, 2H), 1,54 (m, 4H), 1,33 (m, 3H), 1,10 (tt, 6H), 0,83 (dd, 6H).

Stufe 3: 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Gemäß Methode C (Beispiel 9) wurde 10-Cyano-2-cyclopentyldecansäure (2 g, 7,5 mmol) aus Methode G in 16 mL DMF mit dem Produkt von Stufe 2 (2,15 g, 5,5 mmol) unter Verwendung von BOP (3,34 g, 7,5 mmol) und HOBt (1,01 g, 7,5 mmol) behandelt, wobei das Rohpeptid (3,85 g) als ein blass-gelber Feststoff erhalten wurde. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 8,31 (bd, 1H), 8,0 (bd, 1H), 7,83 (d, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,24 (d, 1H), 3,91 (m, 1H), 3,56 (m, 4H), 3,43 (m, 2H), 3,16 (m, 2H), 2,47 (t, 3H), 2,03 (m, 1H), 1,76 (m, 2H), 1,15 bis 2,0 (m, 25H), 1,07 (m, 6H), 0,81 (d, 6H).

Stufe 4: Eine Lösung des Produkts von Stufe 3 (0,2 g) in 10 mL Acetonitril (ACN), das 30%

TFA enthielt, wurde für 1 Stunde gerührt, und das Lösungsmittel wurde abgedampft und Verbindung 14 wurde unter Verwendung von Diethylether gefällt. Die HPLC-Reinigungsbedingungen sind in Tabelle 6 angegeben. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,38 (s, 1H), 8,56 (b, 1H), 8,3 (d, 1H), 7,99 (dd, 1H), 4,38 (m, 1H), 4,17 (m, 1H), 3,37 (m, 4H), 3,17 (m, 2H), 2,26 (t, 3H), 1,0 bis 2,0 (m, 27H), 0,86 (dd, 6H).

Beispiel 15

10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-Larginyl-L-leucinäldiethyiacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde 10-Cyano-2-cyclopentyldecansäure (2 mmol, aus Stufe 5 in Methode G von Beispiel 13) mit Ng-(2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinaldiethylacetal (1,8 mmol, von Stufe 2 in Verbindung 14) gekoppelt, wobei die Verbindung als Feststoff erhalten wurde.

Stufe 2: 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-Larginyl-L-leucinal.

Folgend Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt von Stufe 1 (0,3 g) zu Verbindung 15 (0,2 g) umgewandelt und über HPLC gereinigt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,38 (s, 1H), 8,23 (d, 1 H), 7,8 (s, 1 H), 7,72 (d, 1 H), 7,49 (t, 1 H), 7,48 (s, 1 H), 4,34 (m, 1 H), 4,14 (m, 1 H), 3,05 (m, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,50 (s, 3H), 2,46 (s, 3H), 2,25 (m, 4 H), 2,00 (s, 3H), 1,74 (t, 2H), 1,6 bis 1,0 (m, 25H), 1,13 (s, 6H), 0,82 (dd, 6H).

Beispiel 16

10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinalsemicarbazon
Semicarbazid Hydrochlorid (0,20 mmol), Natriumacetat (0,3 mmol) und Wasser (0,5 mL) wurden zu einer Lösung von Verbindung 14 (0,050 g, 0,089 mmol) in 4,5 mL Ethanol gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und die so erhaltene Verbindung 16 wurde wie in Tabelle 6 angegeben über HPLC gereinigt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,91 (s, 1H), 8,51 (s, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,29 (s, 2H), 4,44 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 3,16 (s, 2H), 2,08 bis 1,00 (m, 33H), 0,87 (dd, 6H).

Beispiel 17

10-Cyano-2-cycopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinaloxim
Hydroxylamin Hydrochlorid (0,037 g, 0,534 mmol) wurde zu einer Lösung des Produkts von Stufe 4 in Beispiel 14 (0,05 g, 0,089 mmol) in Pyridin (0,175 g, 2,2 mmol) bei Raumtemperatur und dann für 30 Minuten bei 80°C gegeben. Das Produkt wurde, wie in Tabelle 6 angegeben, über HPLC isoliert.

Beispiel 18

10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal-O-methyloxim
Folgend dem Verfahren von Beispiel 17 wurde Verbindung 18 unter Verwendung von O-Methylhydroxylamin Hydrochlorid (0,031 g, 0,38 mmol) hergestellt und, wie in Tabelle 6 angegeben, als ein Gemisch von zwei Signalen über HPLC isoliert.

Beispiel 19

10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal-O-benryloxim

Folgend dem Verfahren wie bei der Herstellung von Beispiel 17 wurde unter Verwendung von Verbindung 14 (0,05 g, 0,089 mmol), O-Benzylhydroxylamin Hydrochlorid (0,043 g, 0,267 mmol) und Pyridin (0,092 mL, 1,14 mmol) Verbindung 19 hergestellt. Die Verbindung wurde bei den HPLC-Reinigungen in zwei Signale aufgetrennt.

Beispiel 20

9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: Fmoc-Ng-(2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde Fmoc-Ng-(2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl)-Larginin (3,31 g, 5 mmol) unter Verwendung von BOP (2,21 g, 5 mmol), HOBt (0,67 g, 5 mmol) und NMM (0,7 mL) in 12 mL DMF mit L-Leucinaldiethylacetal (0,85 g, aus Methode F, Beispiel 12) gekoppelt, wobei das Dipeptidacetal (3,24 g) erhalten wurde. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,89 (s, 1H), 7,78 (d, 2H), 7,6 (d, 2H), 7,4 (t, 2H), 7,31 (t, 3H), 6,4 (d, 2H), 5,92 (d, 1H), 4,58 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,35 (m, 3H), 3,69 (m, 2H), 3,53 (m, 2H), 3,30 (m, 2H), 2,6 (t, 2H), 2,58 (s, 6H), 2,12 (s, 3H), 1,80 (tt, 2H), 1,64 (m, 3H), 1,32 (m, 10H), 1,18 (q, 6H), 0,89 (t, 6H).

Stufe 2: Ng-(2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.

Folgend Methode B (Beispiel 8) wurde die Fmoc-Gruppe vom Produkt (1,6 g) aus Stufe 1 entfernt, wobei ein halbfester Stoff (1,3 g) erhalten wurde. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 7,6 (d, 1H), 6,76 (b, 1H), 6,46 (b, 1H), 4,27 (d, 1H), 3,9 (m, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,44 (m, 4H), 3,11 (t, 1H), 3,01 (m, 2H), 2,58 (t, 2H), 2.47 (s, 6H), 2,03 (s, 3H), 1,77 (t, 2H), 1,5 (m, 5H), 1,26 (s, 6H), 1,09 (m, 6H), 0.83 (dd, 6H).

Stufe 3: 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde 9-Methyloxycarbonyl-2-cyclopentylnonansäure (0,56 g) unter Verwendung von BOP (0,66 g, 1,5 mmol), HOBt (0,202 g, 1,5 mmol) und NMM (2,2 mL, 2 mmol) in 5 mL DMF mit Ng-(2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinaldiethylacetal (0,7 g, 1,1 mmol) gekoppelt, wobei das Produkt (1,8 g) als Feststoff erhalten wurde. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 7,5 bis 8.0 (m, 2H), 6,66 (m, 1H), 6,4 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,24 (d, 1H), 3,93 (m, 1H), 3,57 (m, 6H), 3,44 (m, 4H), 3,04 (m, 2H), 2,59 (t, 2H), 2,48 (s, 6H), 2,28 (m, 3H), 2,03 (s, 3H), 1,77 (t, 2H), 1,48 (m, 22H), 1,26 (s, 6H), 1,1 (tt, 9H), 0,81 (dd, 6H).

Stufe 4: 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.

Gemäß der Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt (0,2 g) von Stufe 1 zu Verbindung 20 umgewandelt und direkt über HPLC gereinigt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,37 (s, 1H), 8,2 bis 7,4 (m, 2H), 6,69 (drm, 1H), 6,4 (brm, 1H), 4,3 (m, 2H), 3,58 (s, 3H), 3,03 (m, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,48 (s, 6H), 2,26 (m, 4H), 2,03 (s, 3H), 1,77 (t, 2H), 1,47 (brm, 28H), 1,24 (s, 3H), 0,80 (dd, 6H).

Beispiel 21

9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzol-lsulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzol-lsulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonansäure (1,2 mmol, von Stufe 12 in Methode G) mit Ng-(4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzol-l-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinaldiethylacetal (1,0 mmol) gekoppelt, wobei das Peptid als Festoff erhalten wurde.

Stufe 2: Folgend Methode E (Beispiel 11) wurde das Acetal von Stufe 1 zu Verbindung 21 umgewandelt und über HPLC gereinigt. 1H NMR (300 MHz, CDCl3/DMSO-d6) &dgr;: 9,42 (s, 1H), 8,25 (d, 1H), 7,92 (d, 1H), 7,84 (s, 1H), 6,4 (m, 2H), 4,40 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 3,26 (m, 2H), 2,64 (s, 3H), 2,55 (s, 3H), 2,36 (m, 2H), 2,07 (s, 3H), 1,8 bis 1,0 (m, 30H), 0,87 (dd, 6H).

Beispiel 22

9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal
Stufe 1: 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinaldiethylacetal.

Unter Verwendung von Methode C (Beispiel 9) wurde 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonansäure (1 mmol) unter Verwendung von BOP (1 mmol), HOBt (1 mmol) und NMM (2,5 mmol) in 5 mL DMF mit Ng-(2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinaldieirylacetal (0,69 mmol, erhalten aus Stufe 1 in Beispiel 30, folgend Methode B) gekoppelt. Das Reaktionsgemisch wurde für 4,5 Stunden gerührt und das Peptid wurde isoliert (0,37 g, 0,42 mmol).

Stufe 2: 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal.

Gemäß Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt (0,37 g, 0,42 mmol) von Stufe 1 zu Verbindung 22 (0,33 g) umgewandelt und über HPLC gereinigt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-db) &dgr;: 9,29 (s, 1 H), 7,79 (d, 1 H), 7, 89 (d, 1 H), 7,3 I (t, 1 H), 7,26 (s, 2H), 4,17 (m, 1 H), 3,94 (m, 1 H), 3,49 (s, 3H), 2,94 (m, 2H), 2,74 (t, 2H), 2,51 (t, 2H), 2,37 (s, 6H), 2,20 (m, 4H), 1,94 (s, 3H), 1,14 (s, 6H), 1,0 bis 1,8 (m, 3H), 0,74 (t, 3H).

Beispiel 23 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal

Stufe 1: 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde 9-Methoxycarbonyl-2-cyclopentylnonansäure (0,66 g, 0,33 mmol) unter Verwendung von BOP (0,146 g, 0,33 mmol), HOBt (0,0449 g, 0,33 mmol) und NMM (0,105, 0,95 mmol) in 7 mL DMF mit dem Produkt von Stufe 2 in Beispiel 14 (0,109 g, 0,28 mmol) gekoppelt, wobei die Titelverbindung von Stufe 1 (0,124 g) erhalten wurde. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 8,31 (m, 2H), 6,69 (br d, 1H), 6,15 (br d, 1H), 4,5 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,53 (m, 4H), 3,32 (m, 2H), 2,68 (m, 2H), 2,29 (t, 3H), 2,0 bis 1,0 (b m, 34H), 0,90 (dd, 6H).

Stufe 2: Folgend Methode E (Beispiel 11) wurde das Peptid (von Stufe 1, 0,124 g) zu Verbindung 23 (0,106 g) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,39 (s, 1H), 8,54 (m, 1H), 8,31 (d; 1H), 7,99 (br d, 2H), 4,36 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,33 (s, 3H), 3,16 (m, 2H), 2,27 (t, 2H), 2,03 (m, 2H), 1,0 bis 1,7 (m, 28H), 0,83 (dd, 6H).

Beispiel 24

2-Cyclopentyl-lO-N-phthalimidodecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal

Stufe 1: 2-Cyclopentyl-lO-N-phthalimidodecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde das Produkt (0,25 g, 0,65 mmol) von Stufe 6 in Methode G (Beispiel 13) unter Verwendung von BOP (0,288 g, 0,65 mmol), HOBt (0,088 g, 0,65 mmol) und NMM (0,130 mL, 0,130 mmol) in 5 mL DMF mit dem Produkt von Stufe 2 in Beispiel 14 (0,195 g, 0,5 mmol) gekoppelt, wobei die Titelverbindung (0,557 g) als ein Feststoff erhalten wurde. 1H NMR (300 DMSO-d6) &dgr;: 8,57 (br m, 1H), 7,91 (d, 1H), 7,85 (br d, 4H), 7,55 (d, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,23 (dd, 1H), 3,90 (m, 1H), 3,55 (t, 3H), 3,43 (m, 4H), 3,14 (m, 2H), 2,0 (br m, 1H), 1,74 (br m, 2H), 2,0 bis 1,15 (2 br m, 28H), 1,09 (tt, 6H), 0,79 (dd, 6H).

Stufe 2: 2-Cyclopentyl-lO-N-phthalimidodecanoyl-Ng-nitroarginyl-L-leucinal.

Unter Verwendung von Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt von Stufe 1 (0,45 g) in Verbindung 24 (0,32 g) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,38 (s, 1H), 8,31 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,85 (m, 4H), 4,38 (m, 1H), 4,15 (1, 1H), 3,57 (tt, 3H), 3,15 (m, 2H), 2,00 (m, 1H), 1,9 bis 1,0 (br m, 30H), 0,86 (dd, 6H).

Beispiel 25

10-(Trifluormethansulfonyl)-amino-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: (Trifluormethansulfonyl)-10-amino-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-Lleucinaldiethylacetal.

Unter Verwendung von Methode C (Beispiel 9) wurde 10-(Trifluormethansulfonyl)-amino-2-cyclopentyldecansäure (0,199 g, 0,51 mmol) unter Verwendung von BOP (0,22 g, 0,51 mmol), HOBt (0,069 g, 0,51 mmol) und NMM (0,052 mL, 0,47 mmol) in 5 mL DMF mit dem Produkt von Stufe 2 in Beispiel 14 (0,175 g, 0,45 mmol) gekoppelt. Das Acetal wurde als ein Feststoff erhalten (0,42 g). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 6,06 (br m, 1H), 5,81 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,32 (d, 1H), 4,13 (m, 1H), 3,73 (q, 4H), 3,53 (m, 2H), 3,30 (q, 3H), 2,0 bis 1,0 (2 br m, 36H), 0,9 (dd, 6H).

Stufe 2: 10-(Trifluormethansulfonyl)-amino-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-Lleucinal.

Folgend Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt von Stufe 1 (0,35 g) in Verbindung 25 (0,17 g) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-db) &dgr;: 9,27 (s, 1H), 8,46 (br m, 1H), 4,30 (m, 1H), 3,87 (m, 1H), 3,09 (m, 5H), 2,8 bis 1,0 (2 br m, 30H), 0,78 (dd, 6H).

Beispiel 26

Monomethylazelayl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: Monomethylazelayl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde die Titelverbindung unter Verwendung von Azelainsäuremonomethylester (0,708 g, 3,5 mmol), BOP (1,55 g, 3,5 mmol), HOBt (0,47 g, 3,5 mmol), NMM (0,38 mL, 3,5 mmol), Ng-Nitro-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal (erhalten aus Stufe 2 in Beispiel 14, folgend Methode B, Beispiel B) (1,306 g, 3,5 mmol) in 12 mL DMF hergestellt. Das Peptid wurde als ein amorpher Feststoff erhalten (2,17 g). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 6,58 (d, 1H), 6,04 (d, 1H), 4,47 (m, 1H), 4,30 (d, 1H), 4,17 (m, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,53 (m, 2H), 3,2 bis 3,4 (t, d, 2H), 2,3 (m, 3H), 2,2 (t, 1H), 1,83 (m, 1H), 1,2 bis 1,8 (m, 24H), 1,2 (m, 3H), 0,9 (d, 3H).

Stufe 2: Monomethylazelayl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal.

Unter Verwendung von Methode E (Beispiel 11) wurde das Peptidacetal (von Stufe 1) (250 mg) in Verbindung 26 (0,22 g) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,38 (s, 1H), 7,73 (d, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,15 (m, 2H), 3,01 (q, 1H), 2,75 (m, 1H), 2,24 (m, 7H), 1,50 (m, 12H), 1,24 (b, 14H), 0,86 (m, 6H).

Beispiel 27

Monomethylazelayl-Ng-nitro-L-arginyl-L-phenylalaninal

Stufe 1: Phenylalaninaldiethylacetal.

Folgend dem selben Verfahren, welches bei Leucinaldiethylacetal (Methode F, Beispiel 12) verwendet wurde, wurde CBZ-Phe-OH (6,0 g, 2 mmol) zu Phenylalaninaldiethylacetal umgewandelt.

Stufe 2: Fmoc-Arg(NO2)-OH.

Eine Lösung von Fluorenylmethyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimidylester (32 mmol) in 60 mL THF wurde zu einer gerührten Lösung von Ng-Nitro-L-arginin (35 mmol) und NaHCO3 (70 mmol) in 70 mL H2O gegeben. Die milchige Lösung klarte nach einer Stunde auf und die Lösung wurde mit fester Zitronensäure angesäuert, auf einen pH-Wert von 2 bis 3, und mit 300 mL EtOAc extrahiert. Die organische Schicht wurde einmal mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft, wobei die Verbindung als weißer Feststoff erhalten wurde (26,8 mmol).

Stufe 3: Fmoc-Arg(NO2)-Harz.

Eine Lösung von 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Ng-nitro-L-arginin (von Stufe 2, 26,8 mmol), BOP (30 mmol), HOBt (30 mmol) und NMM (55 mmol) in 40 mL DMF wurde mit 10 g PAC-Harz (&agr;-Methylphenacyllinker, angefügt an Polystyrol – 1% Divinylbenzol, Substitution 0,97 mmol/g, bereitgestellt von Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA) gemischt und für 4 Stunden gerührt. Das Harz wurde abfiltriert, mit DMF, DCM und McOH gewaschen und getrocknet, wobei das Endprodukt Fmoc-Arg(NO2)-Harz erhalten wurde (11,1 g). Das Harz Fmoc-Arg(NO2)-Harz (11,1 g) wurde mit 100 ml einer Lösung behandelt, die Piperidin (30 %), DMF (35%) und Toluol(35%) enthielt, und wurde für 2,5 Stunden gerührt. Das Harz, von dem Fmoc entfernt wurde, wurde abfiltriert und nacheinander mit DCM/DMF (50 : 50) und McOH gewaschen, wobei das Produkt erhalten wurde (9,2 g).

Stufe 4: McOAz:Arg(NO2)-Harz.

Monomethylazelat (20 mmol) wurde zu einer gerührten Aufschlämmung von Arg(NO2)-Harz (9,2 g), BOP (20 mmol), HOBt (20 mmol) und NMM (um den pH-Wert auf 8 anzupassen) gegeben. Nach Rühren über Nacht wurde ein Gemisch von Monomethylazelat (10 mmol), BOP (10 mmol), HOBt (10 mmol) und NMM (20 mmol) zugegeben und für 24 Stunden gerührt. Das Harz wurde mit DMF, DCM und Methanol gewaschen, wobei 10,56 g des Harzes erhalten wurden.

Stufe 5: Monomethylazelayl-Ng-nitro-L-arginin.

Das Produkt von Stufe 4 (10,56 g) wurde für 5 Stunden in einer Lösung von 100 mL (67%) DCM, (30%) TFA und (3%) Anisol gerührt. Die Aufschlämmung wurde abfiltriert und das Lösungsmittel abgedampft und mit Ether verrieben, wobei das Peptid erhalten wurde (1,11 g, 2,75 mmol).

Stufe 6: Monomethylazelayl-Ng-nitro-L-arginyl-L-phenylalaninaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde Methoxyazelaoyl-Ng-nitro-L-arginin (1 mmol) unter Verwendung von BOP (1,3 mmol), HBOt (1,3 mmol) und NMM (um den pH-Wert auf 8 anzupassen) mit L-Phenylalaninaldiethylacetal (1,3 mmol) gekoppelt, wobei das Titelpeptid erhalten wurde (0,82 mmol).

Stufe 7: Monomethylazelayl-Ng-nitro-L-arginyl-L-phenylalaninal.

Unter Verwendung von Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt (0,82 mmol) von Stufe 6 zur Titelverbindung (0,81 mmol) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 9,59 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,31 bis 7,09 (m, 7H), 6,71 (d, 1H), 4,69 (m, 1H), 4,60 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,41 (m, 2H), 3,27 (m, 2H), 2,31 (t, 2H), 2,2 (t, 2H), 1,80 bis 1,2 (m, 14H).

Beispiel 28

Monomethylazelayl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyi-L-leucinal

Stufe 1: Monomethylazelayl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde Monomethylazelat (1,42 g, 7,0 mmol) unter Verwendung von je 7,0 mmol BOP, HOBt und NMM mit Ng-(2,2,5,7,8-Pentamethylclroman-6-sulfonyl)-Larginyl-L-leucinaldiethylacetal (3,06 g, 5,0 mmol, erhalten aus Stufe 2 in Beispiel 20) gekoppelt, wobei die Verbindung (3,43 g) als Feststoff erhalten wurde. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 6,58 (d, 1H), 6,04 (d, 1H), 5,4 (br, 1H), 5,06 (br, 1H), 4,47 (m, 1H), 4,30 (d, 1H), 4,17 (m, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,53 (m, 4H), 3,23 (d, 1H), 3,19 (t, 2H), 2,30 (m, 2H), 2,2 (tt, 2H), 2,0 bis 1,25 (2 br m, 17H), 1,20 (tt, 6H), 0,90 (dd, 6H).

Stufe 2: Monomethylazelayl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinal.

Unter Verwendung von Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt (0,30 g) von Stufe 1 zu Verbindung 28 (0,22 g) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,38 (s, 1H), 8,5 (br, IH), 4,30 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,15 (m, 2H), 3,00 (t, 2H), 2,75 (m, 2H), 2,12 (t, 2H), 1,8 bis 1,20 (2 br m, 17H), 0,86 (dd, 6H).

Beispiel 29

Monomethylazelayl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-D-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-D-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-D-arginin (3 mmol) unter Verwendung von BOP (3 mmol), HOBt (3 mmol) und NMM (5 mmol) in 5 mL DMF mit Leucinaldiethylacetal (2,5 mmol) gekoppelt, wobei das Peptid (1,72 g, 2 mmol) als ein Feststoff erhalten wurde.

Stufe 2: McOAz-D-Arg(PMC)-Leucinaldiethylacetal.

Unter Verwendung von Methode C (Beispiel 9) wurde Monomethylazelat (1,0 mmol) unter Verwendung von BOP (1 mmol), HBOt (1 mmol) und NMM (3 mmol) in 5 mL DMF mit Ng-(2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl)-D-arginyl-L-leucinaldiethylacetal (0,54 g, 0,88 mmol), das aus dem Titelprodukt in Stufe 1, folgend Methode B (Beispiel 8) erhalten wurde, gekoppelt, wobei das Produkt (0,735 g) erhalten wurde.

Stufe 3: Monomethylazelayl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-D-arginyl-Lleucinal.

Unter Verwendung von Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt (0,1 g) von Stufe 2 zu Verbindung 29 umgewandelt und über HPLC gereinigt. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 9,49 (s, 1H), 7,74 (t, 1H), 7,43 (d, 1H), 6,43 (d, 1H), 6,34 (s, 2H), 4,60 (m, 1H), 4,51 (s, 3H),. 4,54 (s, 3H), 4,37 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,31 (m, 2H), 2,63 (t, 2H), 2,26 (m, 4H), 2,09 (s, 3H), 1,80 (t, 2H), 1,57 (m, 7H), 1,26 (m, 16H), 0,90 (dd, 6H).

Beispiel 30

Monomethylazelayl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal
Stufe 1: Fmoc-Ng-(2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-L-norleucinal.

Gemäß der Methode C (Beispiel 9) wurde Fmoc-Arg(PMC)-OH (2 mmol) unter Verwendung von BOP (2 mmol), HOBt (2 mmol) und NMM (6 mmol) in 6 mL DMF mit Norleucinaldiethylacetal (2 mmol, erhalten von CBZ-NIe-OH, folgend den Verfahren bei der Herstellung von Leu-Acetal) gekoppelt, wobei das Peptid (1,37 g, 1.64 mmol) erhalten wurde.

Stufe 2: McOAz-Arg(PMC)-L-Norleucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde Monomethylazelat (2 mmol) unter Verwendung von BOP (2 mmol), HOBt (2 mmol) und NMM (6 mmol) mit Arg(PMC)-Norleucinaldiethylacetal (1,39 mmol, erhalten in Stufe 1, folgend Methode B, Beispiel 8) gekoppelt und über Nacht gerührt. Am nächsten Tag wurde je 1 mmol Monomethylazelat, BOP, HOBt und NMM zugegeben und für 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde wie in Methode C, Beispiel 9 aufgearbeitet, wobei das Peptid (0,37 g, 0,84 mmol) erhalten wurde.

Stufe 3: Folgend Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt von Stufe 2 (0,94 g, 0,84 mmol) in Verbindung 30 (0,58 g) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 9,54 (s, 1H), 7,49 (t, 1H), 6,74 (d, 1H), 6,26 (s, 2H), 6,23 (d, 1H), 4,58 (m, 1H), 4,31 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,34 (m, 2H), 2,63 (t, 2H), 2,58 (s, 3H), 2,56 (s, 3H), 2,29 (t, 2H), 2,23 (t, 2H), 1,9 bis 1,5 (m, 22H), 1,30 (s, 6H), 0,86 (t, 3H).

Beispiel 31

Monomethylazelayl-Ng-(p-toluolsulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1:Fmoc-Ng-(p-toluolsulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Unter Verwendung von Methode C (Beispiel 9) wurde Fmoc-Ng-(p-Toluolsulfonyl)-L-arginin (5 mmol) unter Verwendung von HBTU (5,5 mmol), HOBt (5,5 mmol) und NMM (11 mmol) in 15 mL DMF mit Leucinaldiethylacetal (5,5 mmol) gekoppelt. Das Peptid wurde als ein Feststoff (2,86 g, 3,96 mmol) isoliert.

Stufe 2: Monomethylazelayl-Ng-(p-toluolsulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde Monomethylazelat (6 mmol) unter Verwendung von 1-Benzotriazol-l-yl-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) (6 mmol), HOBt (6 mmol) und NMM (12 mmol) in 15 mL DMF mit Ng-(p-Toluolsulfonyl)-L-arginyl-Lleucinaldiethylactal (2,7 g, 4,7 mmol, erhalten aus Schritt 1, unter Verwendung von Methode B, Beispiel 8) gekoppelt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsausbeute wurde erhöht, indem Monomethylazelat (3 mmol) und Diphenylphosphorylazid (3 mmol) zugegeben wurden und für 4 Stunden gerührt wurde, wobei das Peptid als Feststoff (1,92 g) erhalten wurde.

Stufe 3: Monomethylazelayl-Ng-(p-toluolsulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal

Gemäß Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt von Stufe 2 (1,92 g, 2,8 mmol) in Verbindung 31 (1,64 g) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-db) &dgr;: 9,37 (s, 1H), 8,97 (d, 1H), 8,37 (d, 1H), 7,66 (d, 2H), 7,37 (m, 1H), 7,29 (d, 2H), 7,03 (s, 1H), 6,63 (s, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,44 (m, 1H), 3,04 (m, 2H), 2,26 (s, 3H), 2,33 (t, 2H), 2,13 (t, 2H), 2,80 bis 1,09 (m, 7H), 0,86 (dd, 6H).

Beispiel 32

Monomethylazelayl-Ng-(4-methoxy-2,3,6-trimethyl-l-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinalsemicarbazon

Siehe Basak, A. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36 7 bis 17 (1990). Ein Gemisch von McOAz-Arg(MTR)-Leu-H (Beispiel 34) (67 mg, 0,10 mmol), Semicarbazid Hydrochlorid (11 mg, 0,1 mmol) und Natriumacetat (9 mg, 0,11 mmol) in 3 mL 90%igem EtOH wurde für 18 Stunden auf 70°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde aufkonzentriert, wobei ein hellgelber Feststoff (Verbindung 32) erhalten wurde, der darauffolgend über HPLC, so wie in Tabelle 6, gereinigt wurde. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,91 (t, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,22 (s, 1H), 4,37 bis 4,46 (m, 1H), 4,2 bis 4,3 (m, 1H), 4,04 (d, 1H), 3,7 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 2,6 (s, 3H), 2,27 (dd, 2H), 2,05, 2,12 (s, 3H), 1,2 bis 1,64 (m, 12H), 0,85 (t, 6H).

Beispiel 33

Monomethylazelayl-Ng-(4-methoxy-2,3,6-trimethyl-l-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinalthiosemicarbazon)

Folgend den selben Stufen wie in Beispiel 32 wurde Verbindung 33 aus der Verbindung von Beispiel 34 (51 mg, 0,07 mmol) und Thiosemicarbazid (7 mg, 0,07 mmol) in 2 mL 90%igem EtOH hergestellt.

Beispiel 34

Monomethylazelayl-Ng-(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzol-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal

Stufe 1: Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Ng-(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzol-1-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal aus 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Ng-(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzol-1-sulfonyl)-L-arginin und L-Leucinaldiethylacetal hergestellt.

Stufe 2: Monomethylazelayl-Ng-(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl)-L-arginyl-Lleucinal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde Monomethylazelat (6 mmol) mit Ng-(4-Methoxy-2,5,6-trimethylbenzol-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal (5 mmol, erhalten aus Stufe 1 unter Verwendung von Methode B, Beispiel 8) gekoppelt, und das Peptid wurde als ein amorpher Feststoff (3,3 g) isoliert.

Stufe 3: Methoxgazelayr Ng-(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzol-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.

Das Produkt von Stufe 2 (0,5 g) wurde gemäß Methode E, Beispiel 11 in Verbindung 34 (0,36 g) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, CDCl2) &dgr;: 9,54 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 6,74 (d, 1H), 6,57 (s, H), 6,40 (s, 2H), 6,31 (s, 1H), 4,66 (m, 1H), 4,41 (m, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 3,33 (m, 2H), 2,73 (s, 3H), 2,66 (s, 3H), 2,33 (t, 2H), 2,26 (t, 2H), 2,17 (s, 3H), 2,00 bis 1,26 (m, 17H), 0,96 (dd, 6H).

Beispiel 35

Methoxyazelayl-Ng-(2,4,6-trimethylbenzol-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: Fmoc-Ng-(2,4,6-Trimethylbenzol-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Eine Lösung von 4 M HCl in Dioxan (10 mL) wurde zu einer Lösung von Boc-Arg(MTS)-OH (6 mmol) in 10 mL Dioxan gegeben. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel entfernt und Ether wurde zugegeben, der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet (3,21 g, 9 mmol). Folgend dem Verfahren wie für die Herstellung des Tosylderivats (Beispiel 31) beschrieben, wurde das Arg-MTS-OH Hydrochlorid in Fmoc-Arg(MTS)-OH umgewandelt, wobei die Titelverbindung als ein weißer Feststoff (2,09 g) erhalten wurde.

Stufe 2: Fmoc-Arg(MTS)-Leu-Acetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde Fmoc-Arg(MTS)-OH (3,361 mmol) unter Verwendung von HBTU (4 mmol), HOBt (4 mmol) und NMM (10 mmol) in 15 mL DMF mit Leucinaldiethylacetal (4 mmol) gekoppelt, wobei das Titelpeptid (1,05 g) erhalten wurde.

Stufe 3: McOAz-Arg(MTS)-Leu-Acetal.

Unter Verwendung von Methode C wurde Monomethylazelat (1,2 mmol) unter Verwendung von BOP (1,2 mmol), HOBt (1,2 mmol) und NMM (3,6 mmol) in 3 mL DMF mit Arg(MTS)-Leu-Acetal (0,85 mmol, erhalten in Stufe 2, folgend Methode B, Beispiel 8) gekoppelt und über Nacht gerührt, wobei das Titelpeptid als ein halbfester Stoff (0,59 g) erhalten wurde.

Stufe 4: Methoxyazelaoyl-Ng-(2,4,6-trimethylbenzol-l-sulfonyl)-L-arginyl-L-leucinal.

Gemäß Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt (0,59 g) von Stufe 3 in Verbindung 35 (0,54 g) umgewandelt und über HPLC gereinigt. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 9,49 (s, 1H), 7,53 (s, 1H), 6,90 (s, 2H), 6,81 (d, 1H), 6,40 (bs, 3H), 4,61 (m, 1H), 4,38 (m, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,67 (s, 6H), 2,29 (t, 2H), 2,20 (t, 2H), 2,0 bis 1,20 (m, 19H), 0,91 (dd, 6H).

Vergleichsbeispiel 36

6-Cyanohexan-l-sulfonyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinal
Stufe 1: 6-Cyanohexan-l-sulfonyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinaldiethylacetal.

6-Cyanohexan-l-sulfonylchlorid (0,19 g, 0,89 mmol) von Stufe 14 in Methode G (Beispiel 13) wurde zu einer Lösung des Produkts (0,55 g, 0,899 mmol) von Stufe 2 in Beispiel 20 in 1 mL DMF gegeben und der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung von NMM auf 8 eingestellt. Nach 4 Stunden Rühren wurde das Reaktionsgemisch, wie in Methode A (Beispiel 7) beschrieben, aufgearbeitet, wobei die Titelverbindung (0,466 g) erhalten wurde.

Stufe 2: 6-Cyanohexan-l-sulfonyl-Ng-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginyl-Lleucinal.

Unter Verwendung von Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt (0,297 g) von Stufe 1 zu Verbindung 36 (0,22 g) umgewandelt und über HPLC, so wie in Tabelle 6 beschrieben, gereinigt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,37 (s, 1H), 6,83 (b, 1H), 6,43 (b, 1H), 3,88 (m, 1H), 3,77 (m, 1H), 3,01 (m, 2H), 2,80 (m, 2H), 2,55 (t, 2H), 2,46 (s, 6H), 2,0 (s, 3H), 1,75 (m, 5H), 1,6 bis 1,3 (m, 15H), 1,23 (s, 6H), 0,84 (dd, 6H).

Vergleichsbeispiel 37

2-Naphthoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: 2-Naphthoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

2-Naphthoylchlorid (0,104 g, 0,55 mmol) wurde zu einer Lösung des Produkts von Stufe 2 von Beispiel 14 in 2 mL DMF und NMM (0,18 mL) gegeben und das Titelprodukt wurde aufgearbeitet, wobei die Titelverbindung als ein Feststoff (0,22 g) erhalten wurde. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) 6: 8,92 (b, 1H), 8,0 bis 7,91 (mm, 10H), 6,93 (d, 1H), 5,07 (m, 1H), 4,37 (d, 1H), 4,17 (m, 1H), 3,69 (m, 3H), 3,53 (m, 3H), 3,38 (m, 2H), 1,77, 1,58, 1,4 (mm, 5H), 0,83 (dd, 6H).

Stufe 2: 2-Naphthoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal.

Unter Verwendung von Methode E (Beispiel 11) wurde das Produkt (0,1 g) von Stufe 1 in die Verbindung 37 (60 mg) umgewandelt. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,43 (s, 1H), 8,72 (d, 1H), 8,53 (m, 2H), 8,0 (m, 6H), 7,6 (m, 2H), 6,20 (m, 1H), 4,57 (m, 1H), 4,14 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 3,2 (m, 2H), 3,0 (d, 1H), 1,77 (m, 5H), 0,86 (m, 6H).

Beispiel 38

CB7-Aminoheptanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal
Stufe 1: CBZ-7-Aminoheptanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinaldiethylacetal.

Folgend Methode C (Beispiel 9) wurde CBZ-7-Aminoheptansäure (0,7 g, 2,5 mmol) unter Verwendung von BOP (1,1 g, 2,5 mmol), HOBt (0,34 g, 2,5 mmol) und NMM (0,253 mL, 2,5 mmol) mit dem Produkt von Stufe 2 in Beispiel 14 (0,78 g, 2,0 mmol) gekoppelt, wobei das Peptid als ein halbfester Stoff erhalten wurde, der direkt in der nächsten Stufe verwendet wurde.

Stufe 2: CBZ-7-Aminoheptanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinal.

Folgend Methode E (Beispiel 11) wurde das Acetal von Stufe 1, nach Rühren der Reaktion für 5 Stunden, in Verbindung 38 (0,8 g) umgewandelt. 1H (300 MHz, DMSO-d6) &dgr;: 9,30 (s, 1H), 8,47 (s, 1 H), 8,46 (s, 1 H), 8,29 (d, 1 H), 8,11 (t, 1 H), 7,80 (s, 1 H), 7,64 (d, 1 H), 7,31 (s, 1 H), 7,23 (s, 5H), 4,91 (s, 2H), 4,23 (m, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,51 (q, 2H), 3,27 (m, 2H), 2,89 (q, 2H), 2,11 (t, 2H), 2,03 (t, 2H), 1,7 bis 1,00 (m, 10H), 0,77 (dd, 6H).

Die Beispiele 39 bis 42 beschreiben die Synthese der in Tabelle 7 aufgeführten MCP-Inhibitoren.

Tabelle 7
Beispiel 39

10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinchlormethylketon.

In diesem und in den folgenden drei Beispielen werden die Inhibitoren der Erfindung über das Kopplungsverfahren II hergestellt. In jedem Fall wird das wie hier beschrieben hergestellte 10-Cyano-l-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginin an ein Enzym-reaktives Aminosäurederivat gekoppelt, um den Inhibitor herzustellen. Diese Inhibitoren werden als ein Gemisch von zwei oder mehreren Diastereoisomeren erhalten, welche in manchen Fällen über HPLC getrennt werden können.

A) 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-argininmethylester

Folgend dem Verfahren von Methode C (Beispiel 9) wurde 10-Cyano-2-cyclopentyldecansäure (2,4 g, 11 mmol) aus Beispiel 13, Stufe 5 in 26 mL DMF mit Ng-Nitro-L-argininmethylester Dihydrochlorid (2,86 g, 11 mmol), BOP (6,6 g, 15 mmol), HOBt (1,62 g, 12 mmol) und 3,6 mL NMM (33 mmol) gerührt, wobei 4,8 g des Methylesters als ein schaumiger Feststoff erhalten wurden. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 8,75 (bs, 1H), 7,81 (bs, 2H), 6,42 (d, 1H), 4,67 (t, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,75 (m, 1H), 3,32 (m, 1H), 2,15 (t, 2H), 2,05 bis 1,12 (m, 28H).

B) 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginin

Eine Lösung von 5,5 g des Methylesters von vorstehendem Teil "A" in 30 mL Methanol wurde mit 24 mL 1,00 N wässrige Natriumhydroxid behandelt. Nach 2 Stunden wurden 100 mL 2%ige wässrige Natriumbicarbonatlösung zugegeben und die so erhaltene Lösung wurde mit 100 mL Ether extrahiert. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und mit 3%iger wässriger Zitronensäure angesäuert und mit 250 mL Ethylacetat extrahiert. Die so erhaltene organische Schicht wurde abgetrennt, über wasserfreiem MgSO4 getrocknet und eingedampft, wobei eine farblose gummiartige Masse erhalten wurde, welche sich durch Verreiben mit Petroleumether zu einem feinen weißen Pulver verfestigte, das 4,4 g wog. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 10,6 (bs, 1H), 8,75 (bs, 1H), 7,82 (bs, 2H), 6,41 (d, 1H), 4,67 (t, 1H), 3,71 (m, 1H), 3,32 (m, 1H), 2,15 (t, 2H), 2,04 bis 1,12 (m, 30H).

C) 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucinchlormethylketon.

Ein Gemisch von 467 mg (1,0 mmol) des Produkts von vorstehendem Teil „B" und 270 mg (1,0 mmol) Leucinchlormethylketon Hydrochlorid (Bachem Biosciences, Inc., King of Prussia, Pennsylvania), 440 mg (1,0 mmol) BOP und 135 mg (1 mmol) HOBt in 4,0 mL DMF wurde mit 0,33 mL (3 mmol) NMM behandelt. Nach 4 Stunden wurde das Gemisch mit 75 mL Ethylacetat verdünnt, mit 2%iger wässriger NaHCO3, Wasser, 3%iger wässriger Zitronensäure und schließlich mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt und getrocknet (MgSO4) und schließlich eingedampft, wobei ein blass-gelbes, viskoses Ö1 erhalten wurde. Diese Verbindung wurde über Flashchromatographie über eine 9 × ½ Inch-Säule auf Kieselsäuregel 60-H unter Verwendung von Ethylacetat für die Elution gereinigt. Die so erhaltene Lösung wurde eingedampft, wobei man eine farblose gummiartige Masse erhielt, die sich beim Stehen in 1 : 1 Ethylacetat/Ether verfestigte, wobei 198 mg farbloses festes Chlormethylketon erhalten wurde. HPLC zeigte die Gegenwart von zwei Diastereoisomeren an, welche über präparative RP-HPLC getrennt wurden. Mit einem Wasser-Acetonitril-Lösungsmittelgradienten (30 bis 80% Acetonitril in 40 Minuten) wurden die Signale bei 22,58 Minuten (Diastereoisomer a) und 23,7 Minuten (Diastereoisomer b) isoliert.

Diastereoisomer a: 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 8,53 (bs, 1H), 7,61 (bs, 2H), 7,31 (bs, 1H), 6,69 (d, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,28 (q, 2H), 3,53 (m, 1H), 3,31 (t, 1H), 2,32 (t, 2H), 1,90 bis 1,11 (m, 31H), 0,93 (q, 6H).

Diastereoisomer b: 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) 6: 8,53 (bs, 1H), 7,61 (bs, 2H), 7,31 (bs, 1H), 6,79 (d, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,28 (q, 2H), 3,53 (m, 1H), 3,31 (t, 1H), 2,32 (t, 2H), 1,90 bis 1,11 (m, 31H), 0,93 (q, 6H).

Beispiel 40

10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginylborleucinpinakolester

Eine Lösung von 467 mg (1,0 mmol) 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginin (Beispiel 39, vorstehender Teil „B") und 264 mg (1,0 mmol) Borleucinpinakolester Hydrochlorid, hergestellt über das Verfahren von Shenvi, U.S. Patent 4,537,773, 440 mg (1,0 mmol) BOP und 135 mg (1,0 mmol) HOBt in 5,0 mL DMF wurde mit 0,33 mL (3 mmol) NMM behandelt. Nach 2 Stunden wurde das Gemisch mit 75 mL Ethylacetat verdünnt und mit 2%iger wässriger NaHCO3 und Wasser gewaschen und die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (MgSO4) und eingedampft, wobei 410 mg eines blass-braunen Pulvers erhalten wurden. Dieser Feststoff wurde mit Chloroform gewaschen, wobei 290 mg des Produkts als ein cremefarbener Feststoff erhalten wurden, welcher ein einzelnes Signal in der HPLC zeigte. 1H-NMR (300MHz, CDCl3) &dgr;: 8,53 (bs, 1H), 7,65 (bs, 2H), 6,71 (t, 1H), 4,61 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 3,31 (m, 2H), 3,05 (m, 1H), 2,82 (m, 1H), 2,38 (t, 2H), 2,06 bis 1,42 (m, 28H), 1,22 (s, 12H), 1,15 (m, 2H), 0,92 (m, 6H).

Beispiel 41

10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucin-alpha-ketoethylamid
A) 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-(1-ethylaminocarbonyl-l-hydroxy-4-methyl)-2-pentylamid

Eine Lösung von 467 mg (1,0 mmol) 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginin und 225 mg 3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexansäure-N-ethylamid Hydrochlorid (hergestellt über das Verfahren von Harbeson et al., J. Med. Chem. 37, 2918 bis 29 (1994)) in 5,0 mL DMF wurde mit 440 mg (1 mmol) BOP, 135 mg (1 mmol) HOBt und 0,33 mL (3 mmol) NMM behandelt. Nach Rühren für 2 Stunden wurde die Lösung mit 75 mL Ethylacetat verdünnt und mit 2 %iger wässriger NaHCO3, Wasser, 3%iger wässriger Zitronensäure, Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO4), wobei nach dem Eindampfen 540 mg der Hydroxyverbindung als ein cremefarbener Feststoff erhalten wurden. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 8,53 (bs, 1H), 7,73 (bs, 2H), 7,04 (bm, 1H), 6,83 (t, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,11 (q, 2H), 3,46 (q, 2H), 3,26 (m, 2H), 2,35 (t, 2H), 1,91 (m, 2H), 1,83 (m, 2H), 1,8 bis 1,2 (m, 28H), 1,13 (t, 3H), 0,88 (m, 6H).

B) 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-L-leucin-alpha-ketoethylamid

Eine Lösung von 250 mg der Hydroxyverbindung von vorstehendem Teil „A" in 6,0 mL trockenem Dichlormethan wurde auf 0°C gekühlt und mit 225 mg (ca. 0,5 mmol) Dess-Martin-Reagenz (D. B. Dess und J. C. Martin, J. Org. Chem. 48, 4156 bis 4158 (1983)) gerührt.

Man lies die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde für 2 Stunden gerührt. Die getrübte Suspension wurde mit 50 mL Ethylacetat verdünnt und durch einen feinen Sinterglasfilter filtriert. Das Filtrat wurde mit 10%iger wässriger Na2S2O3 und dann mit gesättigter NaCl gewaschen. Es wurde getrocknet (MgSO4) und eingedampft, wobei 180 mg weißes festes Ketoamidprodukt erhalten wurden. Dies wurde über präparative RP-HPLC unter Verwendung eines Wasser-Acetonitril-Gradientensystems (40 bis 70% Acetonitril in 40 Minuten) gereinigt. Die Signale bei 18,07 Minuten (Diastereoisomer a) und 19,54 Minuten (Diastereoisomer b) wurden gesammelt.

Diastereoisomer a: 1H-NMR (300 MHZ, CDCl3) &dgr;: 8,45 (bs, 1H), 7,58 (bs, 2H), 7,04 (bm, 2H), 6,57 (t, 1H), 5,33 (t, IH), 4,60 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 3,33 (m, 3H), 2,35 (t, 2H), 1,91 bis 1,11 (m, 34H), 0,94 (m, 6H).

Diastereoisomer b: 1H-NMR (300 MHZ, CDCl3) &dgr;: 8,45 (bs, 1H), 7,48 (bs, 2H), 7,25 (m, 1H), 7,04 (t, 1H), 6,85 (m, 1H), 6,62 (d, 1H), 5,32 (t, 1H), 4,81 (m, 1H), 4,58 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 3,35 (m, 3H), 2,35 (t, 2H), 1,95 bis 1,11 (m, 32H), 0,98 (m, 6H).

Beispiel 42

10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginylphenylalaninfluormethylketon
A) Synthese von 1-Nitro-2-phenylethan

Zu einem gerührten Gemisch von trans-&bgr;-Nitrostyrol (5,25 g, 0,035 mol) und Kieselsäuregel (10 g, 230 bis 400 Mesh) in Chloroform (400 mL) und Isopropanol (75 mL) bei Raumtemperatur wurde langsam Natriumborhydrid (5,50 g, 0,145 mol) über einen Zeitraum von 45 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für weitere 15 Minuten gerührt und dann vorsichtig mit 10%iger Salzsäure (20 mL) abgestoppt. Abgetrennter Feststoff wurde abfiltriert und mit Chloroform (50 mL) gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden mit Wasser (1 × 20 mL), Salzlösung (1 × 20 mL) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Durch Abdampfen des Lösungsmittels bei verringertem Druck erhielt man ein Rohmaterial, welches über Flashchromatographie (Kieselsäuregel, 8% Ethylacetat – Hexan) gereinigt wurde, wobei 2,86 g 1-Nitro-2-phenylethan als ein farbloses Öl (Gewürzgeruch) erhalten wurden; Rf (10% Ethylacetat in Hexan): 0,40; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,40 bis 7,20 (m, 5H), 4,60 (t, 2H), 3,30 (t, 2H).

B) Synthese von 1-Fluor-2-hydroxy-3-nitro-4-phenylbutan

Zu einer gekühlten (–78°C) Lösung von Oxalylchlorid (2 M) in Methylenchlorid (11,60 mL, 0,0232 mol) wurde langsam Dimethylsulfoxid (3,65 g, 3,32 mL, 0,0467 mol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 15 Minuten gerührt. Dann wurde eine Lösung von 2-Fluorethanol (1,16 g, 0,0181 mol) in Methylenchlorid (10 mL) langsam in den Reaktionskolben eingebracht. Nach Rühren für weitere 15 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit wasserfreiem Methylenchlorid (180 mL) verdünnt und Triethylamin (9,20 g, 12,63 mL, 0,090 mol) wurde dazu gegeben. Das Rühren wurde für weitere 2 Stunden fortgesetzt, wobei während dieser Zeit die Temperatur auf Raumtemperatur anstieg. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Lösung von 1-Nitro-2-phenylethan (2,74 g, 0,0181 mol) in wasserfreiem Methylenchlorid (10 mL) zum Reaktionsgemisch gegeben und das Rühren wurde über Nacht fortgesetzt. Das Gemisch wurde dann mit Wasser (1 × 30 mL), 4%iger Salzsäure (3 × 20 mL), Wasser (1 × 20 mL), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2 × 20 mL) und Salzlösung (1 × 20 mL) gewaschen. Durch Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels erhielt man ein Rohmaterial, welches über Flashchromatographie (Kieselsäuregel,. 25% Ethylacetat – Hexan) gereinigt wurde, wobei das Produkt als erythro- und threo-Isomere erhalten wurde. Die vereinigte Ausbeute betrug 3,01 g. Eine allgemeine Beschreibung dieses Verfahrens kann man in Imperiali, B., et al., Tetrahedron Lett. 27 (2), 135 (1986) und in Revesz, L., et al., Tetrahedron Lett. 35 (52), 9693 (1994) finden.

Isomer a war ein weißer Feststoff, Schmelzp. 71 bis 73°C; Rf (30% Ethylacetat in Hexan): 0,46; 300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,40 bis 7,10 (m, 5H), 4,90 (m, 1H), 4,60 (m, 1H), 4,50 bis 4,30 (m, 2H), 3,45 bis 3,25 (m, 2H), 2,70 (d, 1H).

Isomer b war ein farbloses Öl; Rf (30% Ethylacetat in Hexan): 0,42; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,40 bis 7,15 (m, 5H), 4,90 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 3,40 bis 3,30 (m,2H), 2,90 (d, 1H).

C) Synthese von 3-Amino-l-fluor-2-hydroxy-4-phenylbutan

Ein Gemisch von vorstehendem Isomer a (0,48 g, 2,25 mmol), absolutem Ethanol (20 mL) und Raney-Nickel (katalytisch) wurde in einer Parr-Apparatur für 5 Stunden hydriert (60 Psi.). Über Filtration durch ein Celite-Pad und Abdampfen des Lösungsmittels erhielt man 410 mg Aminisomer a. Durch eine ähnliche Behandlung des vorstehenden Isomers b (800 mg, 3,75 mmol) erhielt man 510 mg Aminisomer b.

Aminisomer a war ein weißer Feststoff, Schmelzp. 64 bis 67°C; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,40 bis 7,10 (m, 5H), 4,70 (d, 1H), 4,50 (d, 1H), 3,90 bis 3,70 (m, 1H), 3,30 bis 3,10 (m, 1H), 2,95 (dd, 1H), 2,60 bis 2,45 (q, 1H), 2,20 bis 1,70 (breit, 3H).

Aminisomer b war ein weißer Feststoff, Schmelzp. 67 bis 70°C; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 7,40 bis 7,10 (m, 5H), 4,70 (d, 1H), 4,55 (d, 1H), 3,70 bis 3,50 (m, 1H), 3,20 bis 3,00 (m, 1H), 2,95 (dd, 1H), 2,60 bis 2,45 (q, 1H), 2,20 bis 1,65 (breit, 3H).

D) 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginyl-(4-fluor-3-hydroxy-1-phenyl)-2-butylamid

Eine Lösung von 467 mg (1,0 mmol) 10-Cyano-2-cyclopentyldecanoyl-Ng-nitro-L-arginin und 183 mg (1,0 mmol) 3-Amino-l-fluor-2-hydroxy-4-phenylbutan in 5,0 mL DMF wurde mit 440 mg (1,0 mmol) BOP, 135 mg (1,0 mmol) HOBt und 0,33 mL (3 mmol) NMM behandelt. Nach Rühren für 2 Stunden wurde die Lösung mit 75 mL Ethylacetat verdünnt und mit 2 %iger wässriger NaHCO3, Wasser, 3%iger wässriger Zitronensäure, Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO4), wobei nach dem Abdampfen 480 mg der Hydroxyverbindung als ein cremefarbener Feststoff erhalten wurden. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3 + DMSO-d6) &dgr;: 8,15 (bs, 1H), 7,82 (bs, 2H), 7,21 (m, 6H), 5,05 (t, 1H), 4,51 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,75 (m, 2H), 2,95 (q, 2H), 2,35 (t, 2H), 2,04 bis 1,13 (m, 31H).

E) 10-Cyano-2-cyclopentyl-l-decanoyl-Ng-nitro-L-arginylphenylalaninfluormethylketon

Eine Lösung von 250 mg der Hydroxyverbindung von vorstehendem Teil „C" in 6,0 mL wasserfreiem Dichlormethan wurde auf 0°C gekühlt und mit 225 mg (ca. 0,5 mmol) Dess-Martin-Reagenz gerührt. Man lies die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde für 2 Stunden gerührt. Die getrübte Suspension wurde mit 50 mL Ethylacetat verdünnt und durch einen feinen Sinterglasfilter filtriert. Das Filtrat wurde mit 10%iger wässriger Na2S2O3 und dann mit gesättigter NaCl gewaschen. Es wurde getrocknet (MgSO4) und eingedampft, wobei 180 mg weißer Feststoff erhalten wurden. Nach HPLC-Reinigung wurden 42 mg reines Fluormethylketonprodukt erhalten. H-NMR (300 MHz, CDCl3) &dgr;: 8,56 (bs, 1H), 7,62 (bs, 2H), 7,42 (t, 1H), 7,21 (m, 5H), 6,63 (m, 1H), 5,05 bis 4,53 (m, 4H), 3,46 (m, 1H), 3,18 (m, 2H), 2,98 (q, 2H), 2,33 (t, 2H), 2,04 bis 1,13 (m, 27H).

AUFLISTUNG DER SEQUENZEN

Anspruch[de]
  1. Verbindung der Formel
    worin

    R1 aus der Gruppe, bestehend aus -C=N, -C(=O)OR9, Phthalimido, -NN-SO2R9 und -NH-J, ausgewählt ist,

    R2 aus der Gruppe, bestehend aus H, Hydroxyl, Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoftatomen und Cycloalkyl mit drei bis sieben Kohlenstoftatomen, ausgewählt ist,

    R3 aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J und -R6-CN, ausgewählt ist,

    R4 -CH(CH2-R7)-Q ist,

    Q aus der Gruppe, bestehend aus -CH-R8, -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R, -C(O=)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
    ausgewählt ist, wobei p und q unabhängig voneinander zwei oder drei sind, W ein Cycloalkylrest ist,

    R5 aus der Gruppe, bestehend aus -NO2, -CN und -J, ausgewählt ist,

    R6 -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH- ist,

    R aus der Gruppe, bestehend aus Phenyl und Alkyl mit einem bis acht Kohlenstoffatomen, ausgewählt ist, wobei der Alkylrest gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Aryl- oder Heteroarylgruppen substituiert sein kann,

    R8 aus der Gruppe, bestehend aus =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6N5, =NNH-C(=S)-NH2 und =N-NH-J, ausgewählt ist, R9 aus der Gruppe, bestehend aus einem Wasserstoffatom und Alkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, ausgewählt ist, wobei der Alkylrest gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Aryl- oder Heteroarylgruppen substituiert sein kann,

    J eine Schutzgruppe ist,

    n eine ganze Zahl von 3 bis 10 ist und

    m eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R aus der Gruppe, bestehend aus -C≡N, -C(=O)OCH3, Phthalimido und -NH-SO2CF3, ausgewählt ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei R2 aus der Gruppe, bestehend aus N und Cyclopentyi, ausgewählt ist.
  4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R3 -(CH2)3-NH-C(=N-RS)-NH2 ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei R5 aus der Gruppe, bestehend aus -NO2, CN, -PMC, -MTR, -MTS und Tos, ausgewählt ist.
  6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R, aus der Gruppe, bestehend aus -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3 und -C6H5, ausgewählt ist.
  7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Q -CH-R8 ist.
  8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Q aus der Gruppe, bestehend aus -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R, -C(=O)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO-2 R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
    ausgewählt ist.
  9. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Q aus der Gruppe, bestehend aus -CH-R8, -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7,
    ausgewählt ist.
  10. Verbindung nach Anspruch 7, wobei R8 aus der Gruppe, bestehend aus =0, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3 , =N-O-CH2-C6H5 und =NNH-C(=S)-NH2, ausgewählt ist.
  11. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R aus der Gruppe, bestehend aus -C(=O)OCH3, Phthalimido und -NHSO2CF3, ausgewählt ist, R2 Cyclopentyl ist, R3 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2 ist, Q -CH-R8 ist, R -CH(CH3)2 ist und R8 = O ist.
  12. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R -C≡N ist, R2 Cyclopentyl ist, R3 aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2 und -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, ausgewählt ist, Q -CH-R8 ist, R -CH(CH3)2 ist und R8 = Oist.
  13. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R -C≡N ist, R2 Cyclopentyl ist, R3 aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2 und -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, ausgewählt ist, Q aus der Gruppe, bestehend aus -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7,
    ausgewählt ist, und R aus der Gruppe, bestehend aus -CH(CH3)2 und -CH2-CH3, ausgewählt ist.
  14. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R -C≡N ist, R2 Cyclopentyl ist, R3 aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2 und -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, ausgewählt ist, Q -CH-R8 ist, R -CH(CH3)2 ist und R8 aus der Gruppe, bestehend aus =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3 und =N-O-CH2-C6H5, ausgewählt ist.
  15. Zusammensetzung zur Inhibierung multikatalytischer Protease, welche eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  16. Zusammensetzung zur Verringerung des Verlusts der Muskelmasse, welche eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  17. Zusammensetzung zur Behandlung von Muskelschwundstörungen, welche eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei die Störung eine Muskeldystrophie, Herzkachexie, Emphysem, Diabetes, Lepra, Fehlernährung, Knochenerweichung oder Krebskachexie ist.
  19. Zusammensetzung zur Reduktion des Cu/Zn-Superoxiddismutase-1-Enzymabbaus, welche einen Inhibitor der multikatalytischen Protease und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt, wobei der Inhibitor eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 ist.
  20. Zusammensetzung zur Behandlung einer durch eine Reduktion der Cu/Zn-Superoxiddismutase-1-Enzymaktivität gekennzeichneten Störung, welche einen lnhibitor der multikatalytischen Protease und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt, wobei der Inhibitor eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 ist.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die Störung eine amyotropische Lateralsklerose, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Huntingdon-Krankheit, Schlaganfall, Trauma oder Ischämie ist.
  22. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, welches den Schritt des Mischens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  23. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Inhibierung multikatalytischer Protease.
  24. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung des Verlusts der Muskelmasse.
  25. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Muskelschwundstörungen.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Störung Muskeldystrophie, Herzkachexie, Emphysem, Diabetes, Lepra, Fehlernährung, Knochenerweichung oder Krebskachexie ist.
  27. Verwendung einer Verbindung, welche einen Inhibitor der multikatalytischen Protease umfaßt, wobei der Inhibitor eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Reduktion des Abbaus des Cu/Zn-Superoxiddismutase-l-Enzyms in einem Säuger, wobei der Abbau mit einer durch den Abbau verursachten Störung oder Krankheit verbunden ist.
  28. Verwendung einer Verbindung, welche einen Inhibitor der multikatalytischen Protease umfaßt, wobei der Inhibitor eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen, welche durch eine Reduktion der Cu/Zn-Superoxiddismutase-1-Enzymaktivität gekennzeichnet sind.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Störung amyotrophe Lateralsklerose, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Huntingdon-Krankheit, Schlaganfall, Trauma oder Ischämie ist.
Es folgen 7 Blatt Zeichnungen






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