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Dokumentenidentifikation DE69723274T2 27.05.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000923292
Titel VERFAHREN ZUR SYSTEMISCHEN VERABREICHUNG VON INSEKTIZIDEN VOM 2,4-DIENSÄURE-TYP AN TERRESTRISCHE SÄUGETIERE
Anmelder Novartis AG, Basel, CH
Erfinder RUDOLPH, Richard, Robin, Grand Prairie, US
Vertreter Spott & Weinmiller, 80336 München
DE-Aktenzeichen 69723274
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 01.08.1997
EP-Aktenzeichen 979375441
WO-Anmeldetag 01.08.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/EP97/04201
WO-Veröffentlichungsnummer 0098005211
WO-Veröffentlichungsdatum 12.02.1998
EP-Offenlegungsdatum 23.06.1999
EP date of grant 02.07.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.05.2004
IPC-Hauptklasse A01N 49/00

Beschreibung[de]
1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung liegt im Gebiet systemisch aktiver Substanzen zur Bekämpfung von Ectoparasiten und Endoparasiten.

2. Hintergrund der Erfindung

Es sind verschiedene organische Verbindungen bekannt als aktiv als systemische Insektizide zur Kontrolle von Flöhen in Landsäugern. Von besonderem Interesse sind Verbindungen für die orale Verabreichung an Hunde und Katzen zur Bekämpfung, Verhinderung oder Eliminierung eines Befalls mit Ctenocephalides felis und Ctenocephalides canis (Katzen- bzw. Hundeflöhe). Eingeschlossen in diese Verbindungen sind Juvenilhormone und dazu chemisch ähnliche Verbindungen, Benzoylharnstoffderivate und Triazinderivate. Eingeschlossen in die Juvenilhormone sind 2,4-Diencarbonsäuren und Phenoxyphenoxyverbindungen, insbesondere Phenoxyphenoxyalkoxyheterocyclen. Beispiele von 2,4-Diencarbonsäuren und verwandten Verbindungen sind Methopren, Hydropren, Neotenin und Epiphenonan. Beispiele von Phenoxyphenoxyverbindungen sind Fenoxycarb und Pyriproxyfen. Beispiele von Benzoylharnstoffen sind Lufenuron, Diflubenzuron, Terflubenzuron, Triflumaron, Hexaflumaron und Flucycloxuron. Ein Beispiel eines Triazinderivats ist 2-Cyclopropylamin-4,6-bis(dimethylamin)-s-triazin.

Diese Verbindungen und andere, die in der Struktur verwandt und von ähnlicher Aktivität sind, waren ursprünglich für die Verwendung durch direkte Anwendung auf Flöhe offenbart. Nachfolgende Studien zeigten, dass eine Aktivität auch durch eine systemische Anwendung der Verbindungen auf das Wirtslebewesen erhalten werden kann. Diese Studien sind in Barnett et al. (Ciba-Geigy Corporation), US 4 973 589 A (27. November 1990); Barnett et al. (Ciba-Geigy Corporation), US 5 416 102 A (16. Mai 1995) und Miller (Virbac, Inc.) US 5 439 924 A (08. August 1995) offenbart, Gemäß dieser Patente und der technischen Literatur, die durch die Lieferanten von Insektiziden veröffentlicht wurde, die diese Patente betreffen, wird die Verhinderung der Entwicklung eines erwachsenen Flohs erreicht, wenn sich die elterlichen Flöhe von dem Blut des Wirtslebewesens ernähren. Erwachsene Flöhe ernähren sich direkt von dem Blut durch die Epidermis des Lebewesens, wähend sich Flohlarven von dem teilweise verdauten Blut ernähren, das in den Fäkalien der erwachsenen Flöhe vorhanden ist. Die Insektizide Aktivität wird daher anscheinend durch Aufrechterhalten einer Insektizidkonzentration in dem Blut erreicht, die das überschreitet, was als eine minimale effektive Konzentration wahrgenommen wird. Da die minimalen effektiven Konzentrationen nicht durch andere Mittel als Verabreichen der Insektizide an lebende Lebewesen und Beobachten des Effektes auf Flöhe und Floheier in den Fellen der Lebewesen verifiziert wurden, wird angenommen, dass die Dosierung für ein Wirtslebewesen, die eine ovizide Aktivität gegen Flohlarven in der unmittelbaren Umgebung des Lebewesens zur Folge hat, eine letale Menge des Insektizids im Blut des Lebewesens erzeugt.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun erkannt, dass bestimmte Insektizide bei einer oralen Verabreichung an das Wirtslebewesen fortdauernd effektiv gegen Flöhe sind, lange nachdem die Menge des Insektizids in dem Blut des Lebewesens nicht länger nachweisbar ist. Es wurde ferner erkannt, dass, wenn Flöhe direkt (und nur) von dem Blut ernährt werden, das aus dem Wirtslebewesen ohne Kontakt mit dem Fell des Lebewesens entnommen wurde, die Konzentration, die zum Erreichen der Insektiziden oder oviziden Aktivität erforderlich ist, beträchtlich größer ist, als die Konzentration, die in dem Blut beobachtet wird, wenn die Flöhe durch systemische Verabreichung an das Lebewesen getötet werden. Demgernäß besteht für diese Insektizide die vorliegende Erfindung in der Bekämpfung von Flöhen und Floheiern durch systemische Verabreichung an das Wirtslebewesen mit Dosierungen, die nicht ausreichend sind, um das aufrechtzuerhalten, was zuvor als die minimal effektive Konzentration in dem Blut betrachtet wurde, aber noch ausreichend ist, um die Insektizide oder ovizide Wirkung zu erreichen. Daher wird im Gegensatz zum Stand der Technik eine effektive Flohbekämpfung mit diesen Insektiziden durch systemische Verabreichung bei Niveaus erreicht, die beträchtlich geringer sind, als jene, die zum Überschreiten einer minimalen Konzentration in dem Blut des Wirtslebewesens benötigt wird.

Details dieser und anderer Merkmale und Zweckmäßigkeiten der Erfindung werden von der folgenden Beschreibung offenbar.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen

Diese Erfindung ist auf die Verwendung von 2,4-Diencarbonsäwen oder -salzen oder -estern der Formel

anwendbar, in der:

R1 für C1-C6 Alkyl steht,

R2 für H, Methyl oder Ethyl steht,

R3 für H oder Methyl steht,

R4 für Methyl oder Ethyl steht,

R5 für H oder Methyl steht,

R6 für H oder Methyl steht,

R7 für Methyl oder Ethyl steht,

R8 für H, C1-C6 Alkyl, C3-C6 Alkenyl, C3-C6 Alkinyl, C3-C8 Cycloalkyl, Phenyl, Naphthyl, C7-C12 Aralkyl oder für Kationen von Lithium, Natrium, Kalium, Calcium, Strontium, Kupfer, Mangan oder Zink steht,

X für Br, Cl, F oder OR9 steht, in dem R9 für H, C1-C6 Alkyl oder C1-C6 Alkanoyl steht,

m für 0, 1, 2 oder 3 steht und

n für 0, 1, 2 oder 3 steht.

Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „Cycloalkyl" auf einen gesättigten Kohlenwasserstoffring, einschließlich Ringen mit einer oder mehreren Alkylgruppen, die von einem Ringkohlenstoff abzweigen. Beispiele sind Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Methylcyclohexyl und Cyclohexylmethyl. Bevorzugte Cycloalkylgruppen sind C3-C6 Cycloalkyl, wobei Cyclopentyl und Cyclohexyl besonders bevorzugt sind. Der Begriff „Aralkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die mit einer aromatischen Gruppe substituiert ist, sowohl mit als auch ohne eine oder mehrere zusätzliche Alkylgruppen, die von einem Ringkohlenstoff abzweigen. Beispiele von Aralkylgruppen sind Benzyl, Phenylethyl, Naphthylmethyl und Ethylbenzyl. Bevorzugte Aralkylgruppen sind C7-C9 Aralkyl, wobei Benzyl und Phenylethyl besonders bevorzugt sind. Der Begriff „Alkanoyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist. Beispiele sind Acetyl, Propionyl, Butyryl und Hexanoyl. Bevorzugte Alkanoylgruppen sind C1-C3 Akanoyl, wobei Acetyl und Propionyl besonders bevorzugt sind.

Innerhalb des Umfangs der oben angegebenen Formel für 2,4-Diencarbonsäwen, -salzen und -estern sind bestimmte Untergattungen bevorzugt. Eine derartige Untergattung ist z. B. definiert als jene, in der Doppelbindungen in E,E- oder Z,E-Konfiguration sind, und am meisten bevorzugt ist eine E,E-Konfiguration. Eine andere derartige Untergattung ist definiert, bei der: R1 für Methyl oder Ethyl steht, R2 für Methyl oder Ethyl steht, R1 für Methyl steht, R8 für C1-C6 Alkyl oder C3-C6 Alkinyl steht, X für Chlor oder OR9 steht, m für 0 oder 1 steht und n für 1 steht, alle anderen variablen Gruppen sind oben definert. Eine dritte derartige Untergattung ist definer, bei der: R1 für Methyl oder Ethyl steht, R2 für Methyl steht, R3 für H steht, R6 für Methyl steht, R5 für H steht, R6 für H steht, R7 für Methyl steht, R8 für C1-C4 Alkyl oder C3-C4 Alkinyl steht, X für Chlor oder OR9 steht, m für 1 steht und n für 1 steht. Eine vierte bevorzugte Untergattung ist dieselbe, wie die dritte, mit der Ausnahme, dass R9 für H, Methyl, Ethyl, Isopropyl, t-Butyl oder Acetyl steht. Eine fünfte ist auch dieselbe, wie die dritte, mit der Ausnahme, dass R9 für Methyl, Ethyl, Isopropyl oder t- Butyl steht. Spezielle Beispiele bekannter Verbindungen innerhalb des Umfangs der Formel sind 1-Isopropyl(E,E)-11-methoxy-3,7,11-trimethyldodecadi-2,4-enoat (Methopren, alternativer Name Trans(2),trans(4)-isopropyl-11-methoxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,4-dienoat), Methyl(E,E)-3,7,11-trimethyldodecadi-2,4-enoat (Hydropren) und 2-Propinyl(E,E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,4-dienoat (Kinopren). Methopren und insbesondere (S)-Methopren sind von besonderem Interesse. Im Falle von Hydropren sind die bevorzugten optischen Konfigurationen (R,S) und (S), während für Kinopren die bevorzugte Konfiguration (S) ist.

Ein Ziel dieser Erfindung ist es, mindestens ungefähr 80% Letalität von Flöhen zu erreichen, die mit der Haut oder dem Haar des Lebewesens und doch mit einer Menge aktiven Ingredienz in Kontakt stehen, die nicht ausreichend ist, um eine Konzentration in dem Blut des Lebewesens aufrechtzuerhalten, die ungefähr 50% letal für Flöhe ist, die aus erwachsenen Flöhen entstehen, die sich direkt von dem Blut ernähren. Innerhalb dieser Parameter kann die Menge des aktiven Ingredienz, das an das Wirtslebewesen als ein einzelner Bolus oder durch tägliche Dosierung verabreicht wird, beträchtlich variieren. In den meisten Anwendungen werden die besten Ergebnisse mit der effizientesten Verwendung der Verbindungen mit einer täglichen Dosierung von ungefähr 0,3 bis ungefähr 10,0 mg aktives Ingredienz pro kg des Körpergewichts des Lebewesens (mg/kg) pro Tag oder irgendeines Dosierungszeitplanes, der zu annähernd äquivalenten Mengen in dem Körper des Lebewesens führt, eneicht. Ein bevorzugter Bereich beträgt ungefähr 1,0 bis ungefähr 5,0 mg/kg. Da die Messung der Konzentration in dem Blut des Lebewesens allgemein ein Index für die Menge ist, die in dem Körper des Lebewesens als ganzes vorhanden ist, können die bevorzugten Dosierungen auch in Begriffen von Mengen ausgedrückt werden, die ausreichend sind, um spezifizierte Blutkonzentrationen des aktiven Ingredienz aufrechtzuerhalten. Ausgedrückt in diesen Begriffen werden die besten Ergebnisse allgemein durch Verabreichen einer Menge erhalten, die ausreichend ist, um eine letale Konzentration des aktiven Ingredienz in dem Haar oder dem Fettgewebe des Lebewesens aufrechtzuerhalten, aber nicht ausreichend ist, um eine Konzentration von 70 Teilen pro Billion auf einer Gewichtsbasis in dem Blut aufrechtzuerhalten.

Während nicht beabsichtigt ist, durch Theorie gebunden zu werden, wird angenommen, dass das aktive Ingredienz zwischen dem Blut und bestimmten Gewebe und Drüsen im Körper des Lebewesens aufgeteilt wird, mit einer bevorzugten Affinität für diese Geweben und Drüsen, insbesondere für lipophiles Gewebe, wie Fettzellen. Es ist möglich, dass ein signifikanter und sogar ein größerer Teil der Wirksamkeit durch die Passage des aktiven Ingredienz zu dem Floh oder Flohei durch das lipophile Gewebe, Talgdrüsen und aprokrine Drüsen eher eneicht wird, als dwch das Blut oder hydrophobe Gewebe.

Das aktive Ingredienz kann in jeder herkömmlichen Weise für die Verabreichung an das Wirtlebewesen formuliert sein. Die Wahl der Formulierung wird von der Art des Lebewesens, der Größe des Lebewesens und des Verfahrens der Verabreichung unter anderen Faktoren, wie beispielsweise Bequemlichkeit und Kosten, abhängen. Beispiele verschiedener Formulierungen sind Pulver, Tabletten, Körnchen, Kapseln und Emulsionen. Für die orale Verabreichung kann das aktive Ingredienz mit dem Futter des Lebewesens dwch einfaches Mischen oder durch Einbau in oder dwch Verkleidungen von Pellets, Brocken oder Teilchen der Nahrungsmaterie kombiniert werden. Beispiele sind Biskuits, Leckerbissen oder kaubare Tabletten, die mit dem aktiven Ingredienz verkleidet oder imprägniert sind, und flüssige Formen des aktiven Ingredienz, die in Wasser dispergiert werden können. Das aktive Ingredienz kann weiter mit Hilfsmitteln ergänzt sein, die üblicherweise als Formulierungshilfen verwendet werden, wie auch mit jenen, die die freiwillige Aufnahme mit der Nahrung dwch das Lebewesen stimulieren, wie Düfte oder Geschmäcke. Beispiele von Hilfsmitteln zum Einschließen in die Formulierungen sind Füller und Binder einschließlich Zucker, wie Lactose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol, cellulose Zubereitungen, Calciumphosphate, Stärken, wie beispielsweise Mais-, Weizen-, Reis- oder Kartoffelstärke, Gelatine, Traganth, Methylcellulose, Agar und Natriumalginat. Andere Beispiele sind flussregulierende Mittel und Gleitmittel, wie beispielsweise Silica, Talkum, Stearinsäwe und Salze davon und Polyethylenglykol. Weitere Beispiele werden jenen, die in der Formulierungstechnik bewandert sind, leicht offenbar sein.

Die Verabreichung kann auch parenteral oder durch ein Implantat eneicht werden. Die parenterale Verabreichung kann durch subkutane, intravenöse oder intramuskulare Injektion oder durch transdermale Verabreichung eneicht werden. Implantate werden z. B. durch Dispergieren des aktiven Ingredienz durch eine Matrix, wie beispielsweise festem Gummi, aus dem das aktive Ingredienz auslaugen kann, oder durch Anordnen in einer hohlen Kapsel mit Wänden, durch die das aktive Ingredienz diffundieren kann, erzeugt werden. Derartige Formulierungen und Verfahren der Verabreichung sind unter den Fachleuten bekannt.

Diese Erfindung ist eine Anwendung der Behandlung von Landsäugern, deren Umfang und Bedeutung unter den Fachleuten der Tierviehzucht und der Haustiere gut bekannt ist. In diese Klasse eingeschlossen sind Haustiere, Vieh und verschiedene Kameradschaftstiere. Spezielle Beispiele sind Hunde, Katzen, Hamster und Frettchen. Von besonderem Interesse sind Hunde und Katzen, wobei die Hunde vom größten Interesse sind.

Die Verfahren dieser Erfindung sind auf die Verwendung zur Eliminierung oder Verringerung eines Flohbefalls durch Verabreichung an ein Lebewesen, das an einem derartigen Befall leidet, anwendbar. Die Verfahren sind auch auf die Verhinderung eines Flohbefalls durch Verabreichung an ein Lebewesen anwendbar, das nicht so befallen ist, aber in eine Umgebung gebracht wird oder für das erwartet wird, dass es sie betritt, in der der Hund oder die Katze andernfalls für einen derartigen Befall empfänglich wären. Der Begriff „Flohbekämpfung" wird hier benutzt, um sowohl die Eliminierung als auch die Verringerung eines schon vorhandenen Befalls und die Verhinderung eines Befalls, bevor er auftritt, zu bezeichnen.

Die folgenden Beispiele dienen nur zum Zwecke der Veranschaulichung.

Beispiel 1

Das folgende Beispiel zeigt, dass (S)-Methopren im Blut der Hunde nicht für mehr als 48 bis 96 Stunden verbleibt, wenn es an Hunde als eine einzelne orale Dosis verabreicht wird. Die verabreichte Dosis in diesem Experiment ist dieselbe Dosis, die in Beispiel 2 unten als effektiv beim Bekämpfen von Flöhen für 14 Tage gezeigt ist, wieder nach einer einzelnen oralen Dosis.

6 gesunde, gemischt gezüchtete Hunde, 3 männliche und 3 weibliche, eines Gewichtes, das von 14 bis 22 kg pro Hund reicht, und eines Alters, das von 2 bis 5 Jahren reicht, wurden verwendet. Für jeden Hund wurde eine Gelatinekapsel vorbereitet, die ein gemessenes Volumen von (S)-Methopren enthielt, basierend auf dem Gewicht des Hundes, um eine Dosis von 50 mg/kg des Körpergewichtes des Hundes in einer einzelnen Gelatinekapsel für jeden Hund zu ergeben. Man ließ die Hunde 24 Stunden vor der Verabreichung ihrer individuellen Kapseln fasten, und die Dosierung wurde durch Anordnen der Kapsel im hinteren Rachen jedes Hundes und durch Veranlassen, dass der Hund schluckte, eneicht. Nahrung wurde dann für zusätzliche 8 Stunden vorenthalten, obwohl Wasser immer erhältlich war, und die Hunde wurden einmal am folgenden Morgen gefüttert.

Zu jedem Zeitpunkt einer Probenentnahme wurden 50 ml Blut aus der Oberschenkelvene jedes Hundes in 25 ml Spritzen gesammelt. Proben wurden 7 Tage vor dem Dosieren (um eine Basislinie zu etablieren), gefolgt von 3 Stunden, 1 Tag, 2 Tagen, 4 Tagen und 7 Tagen nach dem Dosieren genommen. Hematokriten wurden bei jeder Probe ausgeführt, um zu sichern, dass der Hematokrit nicht um mehr als 30% über den Zeitraum des Experimentes abfiel.

Um die Blutproben für die Bestimmungen des Methoprengehaltes vorzubereiten, wurde jeweils eine 25 ml Blutprobe mit 200 ml Acetonitril, 25 g wasserfreiem Na2SO4 und 10 g CELITE® in einem Mischer für 3 Ein-Minuten-Segmente gemischt, wobei man die Mischblätter 30 Sekunden zwischen den Segmenten abkühlen ließ. Die Mischung wurde dann vakuumfiltriert, wobei ein Waschen mit 50 ml Acetonitril eingeschlossen war. Das Filtrat wurde mit Petroleumether 1 Minute lang extrahiert, dann mit 700 ml entionisiertem Wasser verdünnt. Dazu wurden 50 g NaCl gegeben und die Lösung wurde auf pH 2 mit 0,5 N HCl angesäuert. Die wässrige Phase wurde dann verworfen und die Petroleumetherphase wurde zweimal mit 600 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Der Petroleumether wurde dann durch einen Glaswollestopfen, der mit 50 g Na2SO4 bedeckt war, gefiltert. Das Na2SO4 wurde dann mit 15 ml Petroleumether gespült und das Extraktionsmittel wurde auf 10 ml in einem Rotationsverdampfer unter Verwenden einer Badtemperatur von 30°C konzentriert. Das konzentrierte Extraktionsnttel wurde dann bis zum nächsten Schritt in der Analyse in einem Kühlschrank gelagert.

Extraktionssäulen wurden durch Wärmeaktivieren von FLORISIL® (Magnesiumsilicatabsorbens) bei 200°C 24 Stunden lang, dann 45 Minuten lang Kühlenlassen des FLORISIL, Zugeben von 5 ml destilliertem Wasser pro 50 g FLORISIL, Schütteln der Mischung und 3 Stunden lang ins Gleichgewicht kommen lassen vorbereitet. Eine Glassäule mit 28 mm Innendurchmesser wurde mit Glaswolle gestopft und mit Petroleumether gefüllt. Eine 1 cm Schicht von Na2SO4 wurde langsam in die Säule gegossen, gefolgt von 6,5 cm FLORISIL und 1,5 cm Na2SO4. Der Petroleumether wurde dann abgelassen, bis er die Schicht des Na2SO4 eneichte. Das Extraktionsmittel des vorstehenden Absatzes wurde dann in die Spitze der Säule mit einer Glaspipette geladen und sein Inhalt wurde mit Petroleumether gespült und in die Säule gegeben. Die Säule wurde dann abgelassen, bis sich die Lösemittelschicht oberhalb des Na2SO4 befand, und der Eluent wurde verworfen.

Die Elution wurde mit 1 l 5%-igem Diethylether/Petroleumether für jede Probe ausgeführt, und Fraktionen von 175 ml und 825 ml wurden gesammelt. Die 825 ml Fraktion wurde dann auf 5 ml verdampft und in einem Kühl-schrank gelagert.

Um die 825 ml Fraktion für eine Gaschromatographie vorzubereiten, wurde 1 ml eines internen Standards zu der Probe gegeben und das Probenvolumen wurde auf ungefähr 0,3 ml mit Stickstoff verdampft. Zwei Aliquote von jeweils 5 &mgr;l wurden in einen Gaschromatographen injiziert (Perkin Elmer, Sigma 300, mit einem Wasserstoffflammenionisationsdetektor und Datensystem), der mit einer 182,88 cm × 0,635 cm (6-Fuss × 1/4-Inch) Glassäule mit 3% OV-101 Chrom W HP 100/120 Maschendrahtfülllcörper ausgerüstet war, unter Verwenden von Stickstoff bei 60 ml/min als das Trägergas und Injektor-, Säulen- und Detektortemperaturen von 300°C, 166°C bzw. 280°C. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten gezeigt.

TABELLE I
Methopren-Blutkonzentrationen (&mgr;g/ml) in Hunden nach einer einzelnen oralen Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht

Diese Ergebnisse zeigen, dass in 2 der 6 Hunde das Methoprenniveau unter nachweisbare Mengen nach 48 Stunden fiel, und in den verbliebenen 4 Fällen fiel das Methoprenniveau unterhalb nachweisbarer Mengen nach 96 Stunden.

BEISPIEL 2

Das Beispiel zeigt die ovizide Wirksamkeit von (S)-Methopren, wenn es oral an Hunde als Einzeldosen derselben Größe, wie die Dosierung des Beispiels 1 oder weniger, verabreicht wird.

Neun willkürlich gezüchtete, klinisch gesunde Hunde, für männliche und vier weibliche, deren Gewicht von 7,5 bis 14,9 kg und deren Alter von 7 Monate bis 68 Monate reichte, und die Haarfelle besaßen, die von fein bis grob und von 1,0 bis 2,5 cm Länge reichten, wurden verwendet. Die Hunde wurden drei Behandlungsgruppen, basierend auf dem Gewicht, zugeteilt, einer Gruppe, die bestimmt war einen Placebo zu erhalten (Gelatinekapseln, die kein (S)-Methopren enthielten), der zweiten Gruppe, um Gelatinekapseln zu erhalten, die individuell vorbereitet waren, um die geeignete Menge von (S)-Methopren derart zu enthalten, dass eine Kapsel 25,0 mg (S)-Methopren pro kg des Körpergewichts eines bestimmten Hundes lieferte, und der dritten Gruppe, um Gelatinekapseln zu erhalten, die individuell vorbereitet waren, um 50,0 mg/kg des Körpergewichts pro Hund zu liefern. Jedem Hund wurde 1 Kapsel oral am Tag 0 und eine zweite Kapsel oral am Tag 33 verabreicht, zusätzlich zu einem regulären Fütterungszeitplan von Hundefutter und Wasser.

11 Tage vor der Verabreichung der ersten Gelatinekapsel (d. h. am Tag -11) und wöchentlich danach bis zum Tag 59 ließ man jeden Hund von ungefähr 200 ein bis zwei Wochen alten, nicht gefütterten erwachsenen C. feils-Flöhen eines gemischten Geschlechtsverhältnisses befallen. Jeder Hund wurde ungefähr 1 Minute lang zurückgehalten, während die Flöhe entlang des Dorsurns freigelassen wurden.

Floheier wurden an den Tagen –7, 0, 1, 2, 4, 7 und wöchentlich danach bis zum Tag 63 gesammelt. Vor der Eiersammlung wurden die Käfige, in denen die Hunde gehalten wurden, und die Sammeltabletts mit Isopropylalkohol gespült und das Wasser wurde abgestellt, Fütterungsschalen und Ruhepolster wurden aus jedem Käfig entfernt. Die Tabletts, die mit einem Schirm aus einem 8-Inch-Eisenwarengewebe bedeckt waren, wurden unter den Käfigen angeordnet, und schweres weißes Metzgerpapier wurde unter dem Eisenwarengewebe angeordnet. Nach einem Zeitabstand von 14 bis 16 Stunden wurde das Papier gekehrt und die Trümmer und die Floheier, die so gesammelt wurden, wurden auf eine Metallpfanne übertragen. Die Trümmer wurden von den Eiern durch Sieben getrennt und die Eier wurden in 236,59 cm3 Plastikkartons (eines halben Pints) angeordnet und dann auf 10 cm × 10 cm große Glasplatten übertragen. Unter Verwenden eines Präpariermikroskops und eines feinen angespitzten Künstlerpinsels wurden 100 Floheier von den Kehrrückständen jedes Hundes gezählt und in 4 Wiederholungen von jeweils 25 Eiern getrennt. Die Eier wurden in 15 mm × 60 mm Wegwerfplastikpetrischalen angeordnet und bei 26,1–26,6°C (79– 80°F) und 80% relativer Feuchte inkubiert. 72 Stunden nach dem Sammeln wurde das Auflcommen der Larven bestimmt. Sowohl tote als auch lebende Larven wurden gezählt, um die ovizide Wirkung der Behandlung zu bestimmen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II unten aufgelistet, wobei jeder Eintrag die prozentuale Verhinderung des Schlüpfens von Flöhen aus den Floheiern relativ zu der Placebogruppe repräsentiert, und jeder Eintrag ist der Durchschnitt aller Wiederholungen und aller drei Hunde in der bestimmten Behandlungsgruppe.

TABELLE II
Systemische Floh-ovizide Methopren-Aktivität bei oraler Verabreichung an Wirtshunde

Diese Ergebnisse zeigen, dass (S)-Methopren ovizid wirksam bei Flöhen ist, wenn es systemisch an Wirtshunde verabreicht wird, sowohl bei der Dosierung, die in Beispiel 1 verwendet wird, als auch bei der Hälfte dieser Dosierung, und dass die ovizide Wirksamkeit für zwei Wochen oder mehr anhält, weit nach dem Zeitpunkt, an dem die (S)-Methopren-Konzentration in dem Blut der Hunde unterhalb nachweisbarer Niveaus fällt.

BEISPIEL 3

Dieses Experiment vergleicht die ovizide Wirksamkeit von (S)-Methopren, wenn es oral an Hunde verabreicht wird, mit der oviziden Wirksamkeit von (S)-Methopren in Hundeblut, das denselben Hunden entzogen wurde und direkt an Flöhe in einer in-vitro-Verabreichung gefüttert wurde. Das (S)-Methopren wurde in anfänglichen Bolusdosierungen verabreicht, gefolgt von einer täglichen Verabreichung bei niedrigen Mengen pro Zeiteinheit.

Für die in-vitro-Tests wurde ein künstliches Fütterungssystem mit Käfigen für erwachsene Katzenflöhe C. feils, wie von Wade, S. E., et al., J. Med. Ent. 25 (3): 186–190 (Mai 1988), beschrieben, benutzt. Innerhalb jedes Käfigs wurden 100 eine Woche alte, ungefütterte erwachsene C. feils angeordnet. Jeder Käfig enthielt einen Container für behandeltes Blut, das von den Flöhen durch eine PARAFILM®-Membran getrennt war, und ein Abteil, das dünne Papierstreifen enthielt, um lose angeordnetes sauberes Hundehaar zu tragen und einen Futterhalt für die Flöhe zu liefern, wenn sie sich von dem Blut dwch die Membran ernährten.

15 Gesunde männliche Beagle-Hunde, 1 Jahr alt, mit Gewichten, die von 10,29 kg bis 13,87 kg reichten, wurden in drei Gruppen von jeweils 5 Hunden unterteilt. Eine Gruppe wurde mit einem anfänglichen Bolus von 50 mg/kg von (S)-Methopren gefüttert, gefolgt von einer täglichen Fütterung mit einer Standarderhaltungsdiät, die 0,02% (S)-Methopren enthielt. Die zweite Gruppe wurde mit einem anfänglichen Bolus von 25 mg/kg (S)-Methopren gefüttert, gefolgt von einer täglichen Fütterung mit einer Standarderhaltungsdiät, die 0,01% (S)-Methopren enthielt. Die dritte Gruppe erhielt dieselbe Diät, aber ohne (S)-Methopren, wodurch sie als eine Kontrol-le diente. Die tägliche Fütterung von 0,02% (S)-Methopren in der ersten Gruppe belief sich auf ungefähr 3,6 mg/kg, während sich die tägliche Fütterung von 0,01% (S)-Methopren in der zweiten Gruppe auf ungefähr 1,8 mg/kg belief. Das (S)-Methopren wurde in einer Gelatinekapsel verabreicht, wobei die Kontrolle eine Verabreichung einer Gelatinekapsel beinhaltete, die Pflanzenöl anstelle von (S)-Methopren enthielt, und die Standarddiät war eine Science Diet Canine Maintenance. Die tägliche Fütterung des (S)-Methoprens dauerte 6 Wochen an, die nach dem anfänglichen Bolus folgten.

7 Tage nach dem anfänglichen Bolus und wöchentlich danach 5 weitere Wochen lang, mit Ausnahme der Woche 4, wurden 50 ml Blut von jedem Hund in einer Spritze gesammelt, die mit 3 ml einer 20%-igen (Gew.-%), wässrigen Natriumcitratlösung vorbeladen war. Die 50 ml Proben jeder Behandlungsgruppe wurden bei jedem Aderlass in einem Pool gesammelt. Aliquote von jeweils 10 ml jeden Pools wurden in getrennten Fütterungskammem der künstlichen Flohfütterungskäfige angeordnet.

Floheier wurden aus jedem Käfig in geeigneten Zeitabständen gesammelt. Einhundert (100) gesund erscheinende Flöhe wurden unter einem Präpariermikroskop aus jedem Käfig gezählt, in zwei Unterproben unterteilt und in 60 mm × 15 mm Plastikpetrischalen angeordnet. Die Proben wurden bei 25,6°C (78°F) und 85% relativer Feuchte 3 Tage lang inkubiert, und dann auf Larvenschlupf durch visuelle Beobachtung durch das Präpariermil&sgr;oskop gezählt. Die Daten aller Wiederholungen in jeder Behandlungsgruppe wurden kombiniert, um den mittleren Prozentsatz des Eierschlupfs zu ergeben, und die prozentuale Verhinderung des Eierschlupfs wurde relativ zu der Kontrolle berechnet.

3 Tage vor dem Datenpunkt der Woche 4 ließ man jeden Hund mit Flöhen in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise befallen. In der Woche 4 wurden die Floheier von den Hunden selbst in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise gesammelt, und die prozentuale Verhinderung des Eierschlupfs für die in dieser Weise gesammelten Flöhe wurde wie in Beispiel 2 bestimmt.

Die in-vitro-Ergebnisse unter Verwenden der künstlichen Füttungskammem sind in Tabelle III gezeigt, und die in-vivo-Ergebnisse sind Tabelle N gezeigt.

TABELLE III
Floh-ovizide (S)-Methopren-Wirksamkeit in vitro
TABELLE IV
Systemische ovizide Methopren-Aktivität bei systemischer oraler Verabreichung an Wirtshunde

Diese Ergebnisse zeigen zusammen, dass Blut-Methopren-Niveaus, die nicht ausreichen, um eine effektive ovizide Aktivität durch das Blut direkt zu erreichen, dieselben Blutniveaus sind, die aus einer effektiven oviziden systemischen Verabreichung folgen. Dies beweist, dass es nicht nötig ist, die Konzentration des Methoprens im Blut oberhalb der minimalen oviziden Menge aufrecht zu erhalten, um eine ovizide Wirkung zu eneichen, und dass die Wirkung dwch systemische Verabreichungen bei Dosierungen eneichbar ist, die zu Blutniveaus unterhalb der oviziden Menge führen.

BEISPIEL 4

Dieses Experiment ist ein Vergleichsexperiment, das mit einem Ovizid außerhalb des Umfangs dieser Erfindung ausgeführt wird. Das Ovizid ist Lufenuron (Fluphenacur) und die in diesem Experiment ausgeführten Tests untersuchen die Beziehung zwischen der oviziden Aktivität dieses Ovizids und seiner Konzentration in dem Blut eines Säugers. Dies wurde eneicht dwch Veranlassen, dass die Flöhe sich direkt von dem Blut, das das Ovizid enthielt, in einem künstlichen in-vitro-Fütterungssystem ernährten. Die Ergebnisse dieses Experiments kombiniert mit jenen des Beispiels 5 widerlegen den oviziden Mechanismus, der dwch den Stand der Technik behauptet wird.

Das künstliche Fütterungssystem und die Käfige für erwachsene Katzenflöhe, die in Beispiel 3 beschrieben sind, wurden benutzt. Rinderblut wurde für das Fütterungssystem verwendet und wurde dwch Zugeben von 35 ml einer 20%-igen Natriumcitratlösung pro Liter des Bluts vorbereitet, um eine Gerinnung zu verhindern. Eine Grundlösung von Lufenwon wurde dwch Zugeben von 50,1 mg technisches Lufenwon zu 4,951 g Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereitet, um eine 1,0%-ige Lösung zu ergeben. Eine 1.000 ppm Lösung wurde dann dwch Verdünnen von 1,0 ml der 1,0%-igen Lösung in 9,0 ml DMSO erzeugt und eine 100 ppm Lösung wurde dwch Verdünnen von 1,0 ml der 1.000 ppm Lösung in 9,0 ml DMSO erzeugt. Dimethylsulfoxid selbst wurde als eine Kontrolle verwendet. Um das Blut zu behandeln, wurden die verschiedenen Lösungen (0,05 ml) zu dem mit Citrat behandelten Rinderblut (100,0 ml) gegeben, um Rinderblutlösungen zu ergeben, die 5,0 ppm, 0,5 ppm, 0,05 ppm und 0,00 (Null) ppm Lufenwon enthielten. Jede Lösung wurde gründlich gemischt und bei jeder Konzentration wurden 10 ml in jeweils 5 Füttervonichtungen in das künstliche Fütterungssystem gegeben, um als Wiederholungen zu dienen. Jeden Tag wurden frische Blutlösungen, die den Originalen identisch waren, in die Füttervonichtungen gegeben.

Floheier wurden aus jeder Wiederholung an den Tagen 3, 5 und 7 gesammelt. Einhundert (100) gesund erscheinende Flöhe wurden unter einem Präpariermikroskop aus jeder Wiederholung gezählt, in 2 Unterproben pro Wiederholung unterteilt und in 60 mm × 15 mm Plastikpetrischalen angeordnet. Die Proben wurden bei 25,6°C (78°F) und 85% relativer Feuchte 3 Tage lang inkubiert und dann auf Larvenschlupf dwch visuelle Beobachtung dwch das Präpariermikroskop gezählt. Die Daten von allen Wiederholungen bei jeder Konzentration wurden kombiniert, um den mittleren Prozentsatz Eierschlupf zu ergeben, und die prozentuale Verhinderung des Eierschlupfs wurde relativ zu der Kontrolle berechnet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle V unten gezeigt.

TABELLE V
Floh-ovizide Lufenwonaktivität in vitro

Die 99-perzentile effektive Konzentration (EC99) für die ovizide Aktivität von Lufenuon liegt zwischen 0,5 ppm und 5,0 ppm, wenn es in Rinderblut aufgelöst und an erwachsene Katzenflöhe direkt (in vitro) verfüttert wird. Dies ist mit den im nächsten Beispiel erhaltenen Ergebnissen zu vergleichen.

BEISPIEL 5

Dies ist ein weiteres Experiment, das mit Lufenwon ausgeführt wurde, um die Wirksamkeit von Lufenwon bei einer oralen systemischen Verabreichung an Wirtshunde zu untersuchen.

Sechs willkürlich gezüchtete und reinrassige klinisch gesunde Hunde, drei männliche und drei weibliche, deren jeweiliges Gewicht von 5,5 kg bis 17,2 kg und deren Alter von 5 Monaten bis 42 Monaten reichten und die Haarfelle besaßen, die von mittel bis dicht und von 1,0 bis 5,0 cm in der Länge reichten, wurden verwendet. Die Hunde wurden in 2 Behandlungsgruppen von jeweils 3 Hunden unterteilt. Die Hunde wurden alle mit regulären Fütterungszeitplänen von Hundefutter und Wasser gehalten, und jedem Hund in einer der 2 Gruppen wurde eine geeignete Anzahl von Lufenwon-enthaltenden Gelatinekapseln verabreicht, um eine Dosierung von 10 mg/kg des Körpergewichts des Hundes zu eneichen. Diese Dosierung wird in der technischen Literatur des Lieferanten als die minimale effektive Dosierung für C. feils in Hunden und als die Dosieruung identifiziert, die zu einem Blutkonzentrationsniveau von 0,05 ppm führt, das mindestens 14 Tage nach der Verabreichung einer Einzeldosis verbleibt. Die Verabreichung wurde am Tag 0 und wieder am Tag 28 ausgeführt.

An den Tagen –8 (8 Tage vor der Lufenwonverabreichung), –4, 3, 10, 17, 24, 31, 38, 45, 52 und 59 wurden ungefähr 100 nicht gefütterte erwachsene C. feils Flöhe auf jeden Hund dwch Standardprozeduren aufgebracht. Floheier wurden gesammelt und das Larvenauflcommen (Eierschlüpfen) wurde dwch die Prozeduren des Beispiels 2 an den Tagen –4, 0, 1, 2, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 und 56 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI unten aufgelistet.

TABELLE VI
Systemische Floh-ovizide Lufenwonaktivität bei oraler Administration an Wirtshunde unter Verwenden von Einzeldosen von 10 mg/kg am Tag 0 und am Tag 28

Wenn man diese Ergebnisse mit jenen in Tabelle V oben (Beispiel 4) vergleicht, ist die prozentuale Verhinderung des Floheischlüpfens bei oraler systemischer Administration an Wirtshunde viel höher, als die prozentuale Verhinderung bei direktem in-vitro-Füttern an die Floheier bei derselben Blutkonzentration. Dies ist in sich ein übenaschendes Ergebnis. Außerdem ist, da die technische Literatur zeigt, dass die Konzentration von Lufenwon im Blut nicht unter nachweisbare Niveaus innerhalb von 48 Stunden der systemischen Verabreichung fällt, wie diejenige von Methopren, die fortdauernde Wirksamkeit von Methopren, wie in Beispielen 1 und 2 gezeigt, sogar noch überraschender.

BEISPIEL 6

Zurückkehrend zu (S)-Methopren wird in diesem Beispiel eine Floh-ovizide in-vitro-Aktivität unter Verwenden von Rinderblut zum Vergleich mit Beispiel 4 präsentiert. Die Prozedwen unter Verwenden von Rinderblut waren dieselben wie jene, die in den vorigen Beispielen gezeigt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII unten gezeigt.

TABELLE VII
Floh-ovizide (S)-Methopren-Aktivität in vitro

(Unter Verwenden von Rinderblut)
BEISPIEL 7

Dieses Beispiel zeigt die Verteilung von (S)-Methopren zwischen dem Blut und dem Fettgewebe von Ratten, an die das (S)-Methopren in vivo verabreicht wurde.

Männliche Sprague-Dawley CD® VAF/PLUS® Ratten wurden von Charles River Breeding Laboratories, Inc., Portage, Michigan, USA, erworben. Die Körpergewichte der Ratten betrugen 200 g zum Zeitpunkt der Dosisverabreichung. Die Ratten wurden vor der Verwendung 5 Tage lang in Quarantäne gegeben, mit Ausnahme von Ratten, deren Jugularvene mit einer Kanüle versehen war, denen Dosen 1 bis 3 Tage nach dem Erhalt verabreicht wurden. Die Ratten wurden in 3 Gruppen für die Dosierung mit14C-(S)-Methopren unterteilt: Die Gruppe A erhielt eine Einzeldosis von 10 mg/kg des Ovizids dwch intravenöse Injektion über die Jugularvene. Jeweils 3 Ratten wurden nach 0,5 Stunden, 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden und 7 Stunden nach dem Dosieren getötet.

Die Gruppe B erhielt eine Einzeldosis von 10 mg/kg des Ovizids dwch orale Verabreichung durch Sonden-Dosierung. Jeweils 3 Ratten wurden nach 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden und 8 Stunden nach der Dosierung getötet.

Die Gruppe C erhielt eine Einzeldosis von 100 mg/kg des Ovizids dwch orale Verabreichung durch Sonden-Dosierung. Jeweils 3 Ratten wurden nach 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden und 8 Stunden nach der Dosierung getötet.

Nach dem Dosieren wurden die Ratten individuell in Käfigen gehalten. Die tägliche Raumtemperatur wurde zwischen 69°C und 75°C gehalten und die relative Feuchte betrug zwischen 40% und 70%. Alle Ratten hatten freien Zugang zu Futter und frischem Leitungswasser.

Für Analysen des (S)-Methoprens im Blut wurden ungefähr 7 ml Blut aus jeder Ratte in 60 &mgr;l Heparin und 70 &mgr;l Paraoxon (zum Verhindern der Zersetzung des (S)-Methoprens) extrahiert. Jede Blutprobe wurde gemischt und mit einem Ultraschall-Beschaller 1 Minute lang hämolisiert, dann mit 20 ml einer 1 : 1 (Volumenverhältnis) – Mischung aus Hexan und Diethylether extrahiert. Das Extrakt wurde 3 Minuten lang beschallt, für weitere 3 Minuten dwch Wirbeln vermischt und dann zentrifugiert. Diese Prozedw wurde dreimal wiederholt. Die HexanlEther-Extrakte wurden kombiniert, mit einem Radioassay untersucht, auf einem Rotationsverdampfer verdampft und unter einem Strom von Stickstoff konzentriert. Radioassays wurden dwch Flüssigkeits-Scintillationszählen ausgeführt, wobei die Proben vor der Lösungsmittelextraktion dwch Mischen von 100 &mgr;l des Bluts mit 20 &mgr;l Wasserstoffperoxid entfärbt worden waren. Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde mit den konzentrierten Blutproben ausgeführt, unter Verwenden von vorbeschichteten Silicagel-G-Chromatographieplatten mit einer Dicke von 0,25 mm mit einem Fluoreszenzindikator. Organische Extrakte wurden allein getüpfelt oder mit Referenzstandards Methopren und Methoprensäure co-chromatographiert, und dann in Hexan/Diethylether/Essigsäure 50 : 50 : 1 (Volumenverhältnisse) entwickelt. Radioaktive Bänder und Punkte wurden abgebildet und quantifiziert.

Für Analysen des Ovizids im Fett wurde viszerales Fett aus den getöteten Ratten gesammelt. Die Fettprobe jeder Ratte wurde gründlich 1 : 1 mit Cellulosepulver gemischt und mit ein paar Tropfen Wasser homogenisiert. Ein Teil (0,5 bis 1 g) jeder Fettprobe wurde mit 10 ml einer Mischung Hexan/Diethylether (1 : 1) extrahiert, die kräftig mit einem Beschaller 4 Minuten lang behandelt wurde, dann dwch Wirbeln 2 Minuten lang gemischt und zentrifugiert. Diese Prozedw wurde zweimal wiederholt. Die Extrakte wurden dann kombiniert, mit einem Radioassay untersucht, rotationsverdampft und unter Stickstoff für eine TLC-Analyse konzentriert. Eine kleine Menge Methanol wurde zugegeben, um das Fett zu präzipitieren, um die TLC-Trennung zu verbessern. Radioassays und TLC-Analysen wurden in derselben Weise wie bei den Blutproben ausgeführt.

Die Ergebnisse für nicht zersetztes (S)-Methopren (wie dwch TLC isoliert) sind in den Tabellen VIII und IX aufgelistet. Ein Vergleich dieser Tabellen zeigt eine auffallende Unausgewogenheit in der Verteilung des Ovizids zwischen Blut und Fett, wobei der größere Anteil im Fettgewebe vorhanden ist.

TABELLE VIII
(S)-Methopren-Konzentration im Rattenblut bei einer in-vivo-Verabreichung
TABELLE IX
(S)-Methopren-Konzentration im Fett von Ratten bei einer in-vivo-Verabreichung
BEISPIEL 8

Dieses Beispiel vergleicht die Verteilung von (S)-Methopren zwischen dem Haar und dem Blut von Hunden bei oraler Verabreichung.

12 willkürlich gezüchtete erwachsene Hunde verschiedenen Geschlechts und mittlerem Haarfells wurden basierend auf ihrem Haarfell, der Gesundheit und individueller Verhaltensweisen ausgewählt. Die 12 Hunde wurden in 2 Gruppen von jeweils 6 Hunden gruppiert. Die Gewichte der Hunde reichten von 22,5 kg bis 35,0 kg und die verschiedenen Gewichte und jedes Geschlecht waren in jeder Gruppe repräsentiert. Die Hunde erhielten täglich eine abgemessene Menge eines Science-Diet-Erhaltungshundefutters und Wasser war verfügbar. Die zwei Gruppen von Hunden wurden getrennt gehalten. Den Hunden der Gruppe 1 wurden keine Behandlungen gegeben, während jenen der Gruppe 2 jeweils 50 mg/kg technisches (S)-Methopren einmal am Tag nur beim Beginn der Studie (Tag 0) gegeben wurde.

Blutproben wurden periodisch durch Entnehmen der Proben in 10 cc-Wegwerfspritzen und Übertragen in beschriftete, mit 5 ml Heparin behandelte EDTA-Vacutainern, die mit 50 ml einer Paraoxonlösung bei einer Konzentration von 1 × 10–2 Mol behandelt waren, genommen. Die Blutproben wurden eingefroren, bis sie für die Analyse bereit waren. Haarproben wurden von den Hunden an denselben Tagen, an denen die Blutproben genommen wurden, abgeschnitten und dann in beschriftete Gefriertöpfe mit Aluminiumfolienverschlüssen gegeben und eingefroren.

Um das Hundehaar zu analysieren, wurde ein bekanntes Gewicht (4 bis 8 g) jeder Hundehaarprobe in Hexan extrahiert, der Extrakt wurde verdampft und der Rest wurde in 2 ml Hexan verdünnt. 1 ml des Extraktes wurde durch eine Festphasenextraktion unter Verwenden einer 3 cc/500 mg Silicapatrone gereinigt. Das (S)-Methopren wurde dann aus der Patrone mit 5% Ethylacetat/Hexan eluiert. Der Rest wurde in 1 ml Acetonitril verdünnt und durch Reversephase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer C18-Säule (250 × 4,6 mm, 10 Micron Durchmesser) unter Verwenden eines Diodenanaynachweises bei einer Wellenlänge von 264 nm analysiert, mit einer mobilen Phase von 90 : 10 Methanol : Wasser bei 1,5 nl/min und einem Injektionsvolumen von 100 ml. Der (S)-Methoprenpeak eluierte bei ungefähr 5,1 Minuten. Die Konzentration des (S)-Methoprens wurde basierend auf einer Kalibrierungskurve, die dwch gleichzeitiges Laufenlassen einer Serie von Standards erzeugt wurde, berechnet. Die Quantifizierungsgrenze betrug ungefähr 20 ppb.

Um die Blutproben zu analysieren, wurden die Proben dreimal mit Methyl-t-butylether extrahiert, eingedampft, in 1 ml Methanol verdünnt und dwch HPLC wie bei den Haaranalysen analysiert.

Die Ergebnisse der Haartests sind in den Tabellen X(A) und X(B) gezeigt, wobei die letztere die Kontrolldaten präsentiert. Die Ergebnisse der Bluttests sind in der Tabellen XI(A) und XI(B) gezeigt, wobei die letztere die Kontrolldaten präsentiert. In jedem Fall sind die Ergebnisse in ppb berichtet, d. h. Teile pro Billion Gewicht des Hundehaares oder des gesamten Blutes. Die Buchstaben „ND" zeigen an, dass das Niveau des (S)-Methoprens unterhalb der Nachweisgrenze war.

TABELLE X(A)
Konzentration von (S)-Methopren auf Hundehaar nach einer oralen Verabreichung bei 50 mg/kg
TABELLE X(B)
Konzentration von (S)-Methopren auf Hundehaar unbehandelter Hunde
TABELLE XI(A)
Konzentration von (S)-Methopren im Hundeblut nach einer oralen Verabreichung bei 50 mg/kg
TABELLE XI(B)
Konzentration von (S)-Methopren im Hundeblut unbehandelter Hunde

Die Daten in diesen Tabellen zeigen klar, dass der größere Anteil des Ovizids im Haar vorhanden ist und lange im Haar vorhanden bleibt, nachdem das Ovizid im Blut nicht länger nachweisbar ist.

Das Vorstehende ist vonangig für die Zwecke der Veranschaulichung angegeben. Es wird den Fachleuten einfach offenbar sein, dass die Anteile, Dosierungen, Verabreichungsverfahren, Formulierungen und andere Parameter der hier beschriebenen Verfahren weiter modifiziert oder in verschiedenen Weisen substituiert werden können.


Anspruch[de]
  1. Verwendung eines 2,4-Diencarbonsäureinsektizids oder eines Salzes oder Esters hiervon zur Herstellung eines Pestizids für die systemische Verabreichung an einen Landsäuger zur Bekämpfung von Flöhen im Fell des Säugers, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des Insektizids, die mindestens ungefähr 80% lethal für sich entwickelnde Flöhe ist, die in Kontakt mit der Haut oder dem Haar des Säugers stehen, und doch unterhalb einer Konzentration im Blut des Säugers ist, die ungefähr 50% lethal für sich entwickelnde Flöhe ist, die aus erwachsenen Flöhen entstehen, die sich direkt vom Blut ernähren, einer täglichen Dosierung von 0,3 bis 15,0 mg/kg des Körpergewichts des Säugers pro Tag äquivalent ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des verabreichten Insektizids einer täglichen Dosierung von 1,0 bis 5,0 mg/kg des Körpergewichts des Säugers pro Tag äquivalent ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des verabreichten Insektizids geringer ist als jene, die benötigt wird, um eine Konzentation von 70 Teilen pro Billion des Gewichts im Blut des Säugers aufrechtzuerhalten.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Insektizid oral verabreicht wird.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Landsäuger ein Hund oder eine Katze ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Landsäuger ein Hund ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Insektizid eine Verbindung ist, mit der Formel
    in der:

    R1 für C1-C6 Alkyl steht,

    R2 für H, Methyl oder Ethyl steht,

    R3 für H oder Methyl steht,

    R4 für Methyl oder Ethyl steht,

    RS für H oder Methyl steht,

    R6 für H oder Methyl steht,

    R für Methyl oder Ethyl steht,

    R8 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die besteht aus H, C1-C6 Alkyl, C3-C6 Alkenyl, C3-C6 Alkinyl C3-C8 Cycloalkyl, Phenyl, Naphthyl, C7-C12 Aralkyl und Kationen von Metallen besteht, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Lithium, Natrium, Kalium, Calcium, Strontium, Kupfer, Mangan und Zink, X ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus Br, Cl, F und OR9 besteht, in der R9 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus H, C1-C6 Alkyl und C1-C6 Alkanoyl besteht,

    m für 0, 1, 2 oder 3 steht und

    n für 0, 1, 2 oder 3 steht.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass

    R1 für Methyl oder Ethyl steht,

    R2 für Methyl oder Ethyl steht,

    R7 für Methyl steht,

    R8 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus C1-C6 Alkyl und C3-C6 Alkinyl besteht,

    X für Chlor oder OR9 steht, wobei R9 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus H,

    C1-C6 Alkyl und

    C1-C6 Alkanoyl besteht,

    m für 0 oder 1 steht und

    n für 1 steht.
  9. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass

    R1 für Methyl oder Ethyl steht,

    R2 für Methyl steht,

    R3 für H steht,

    R4 für Methyl steht,

    R5 für H steht,

    R6 für H steht,

    R7 für Methyl steht,

    R8 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus C1-C4 Alkyl und C3-C4 Alkinyl besteht,

    X für Chlor oder OR9 steht, wobei R9 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus H, C1-C6 Alkyl und

    C1-C6 Alkanoyl besteht,

    m für 1 steht und

    n für 1 steht.
  10. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass

    R1 für Methyl oder Ethyl steht,

    R2 für Methyl steht,

    R3 für H steht,

    R4 für Methyl steht,

    R5 für H steht,

    R6 für H steht,

    R7 für Methyl steht,

    R8 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus C1-C4 Alkyl und C3-C4 Alkinyl besteht,

    X für Chlor oder OR9 steht, wobei R9 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus H, Methyl, Ethyl, Isopropyl, t-Butyl und Acetyl besteht,

    m für 1 steht und

    n für 1 steht.
  11. Verwendung nach Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass

    R1 für Methyl oder Ethyl steht,

    R2 für Methyl steht,

    R3 für H steht,

    R4 für Methyl steht,

    R5 für H steht,

    R6 für H steht,

    R7 für Methyl steht,

    R8 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus C1-C4 Alkyl und C3-C4 Alkinyl besteht,

    X für OR9 steht, wobei R9 ein Rest ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus Methyl, Ethyl, Isopropyl und t-Butyl besteht,

    m für 1 steht und

    n für 1 steht.
  12. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Insektizid eine Konfiguration hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus E,E und Z,E besteht.
  13. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Insektizid eine E,E-Konfiguration hat.
  14. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Insektizid Isopropyl-ll-methoxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,4-dienoat ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Insektizid Isopropyl-(E,E)-(7S)-11-methoxy-3,7,11-trirnethyldodeca-2,4-dienoat ist.
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