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Dokumentenidentifikation DE69629689T2 17.06.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000832186
Titel ERSATZTHERAPIE FÜR ZAHNKARIES
Anmelder University of Florida Research Foundation, Inc., Gainesville, Fla., US
Erfinder HILLMAN, D., Jeffrey, Gainesville, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69629689
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 07.06.1996
EP-Aktenzeichen 969183813
WO-Anmeldetag 07.06.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/09667
WO-Veröffentlichungsnummer 0096040865
WO-Veröffentlichungsdatum 19.12.1996
EP-Offenlegungsdatum 01.04.1998
EP date of grant 27.08.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 17.06.2004
IPC-Hauptklasse C12N 1/21
IPC-Nebenklasse C12N 15/53   A01N 63/00   A61K 7/16   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung wurde zumindestens in Teilen mit Geldmitteln der Bundesregierung durch eine Förderung des National Institute of Dental Research, Public Health Service, Beihilfe Nr. DEO4529, gemacht. Die Regierung kann bestimmte Rechte an dieser Erfindung besitzen.

Hintergrund der Erfindung Bereich der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Verhinderung von Zahnkaries.

Beschreibung des verwandten Stand der Technik

Die Fähigkeit eines bestimmten Bakteriums einen Wirt zu besiedeln wird durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt, wie die metabolischen Bedürfnisse des Bakteriums und die Wechselwirkungen des Bakteriums mit der bereits existierenden Bakterienflora. Bakterielle Wechselwirkungen können im Allgemeinen entweder als "positiv" oder "negativ" bezeichnet werden. Im Fall von positiven Wechselwirkungen verändert ein bakterieller "Effektor"-Stamm die Mikro-Umgebung, um die Besiedlung durch einen zweiten "Ziel"-Organismus zu fördern. Bei "negativen" Wechselwirkungen verändert der "Effektor"-Stamm die Mikro-Umgebung auf eine Art und Weise, die die Besiedlung durch das Ziel-Bakterium erschwert oder vollständig verhindert. Negative Wechselwirkungen zwischen miteinander konkurrierenden Bakterien während der Wirtsbesiedlung werden im Allgemeinen als bakterielle Interferenz bezeichnet.

Therapeutische Kuren, die die bakterielle Interferenz ausnutzen, um einen pathogenen bakteriellen Stamm mit einem nicht pathogenen Effektor-Stamm zu ersetzen, werden als Austauschtherapien (Ersatztherapien) bezeichnet. Eine erfolgreiche Ersatztherapie erfordert einen Effektor-Stamm, der folgende Eigenschaften besitzt: 1) er ist nicht pathogen, 2) er verändert die Mikro-Umgebung derart, dass die Besiedlung oder das Auswachsen der pathogenen Organismen verhindert wird, 3) er besiedelt den gefährdeten Wirt langfristig, um eine erneute Infektion durch den pathogenen Ziel-Organismus zu verhindern und ersetzt auf aggressive Art und Weise den pathogenen Organismus aus dem gefährdeten Gewebe, wo das Pathogen Teil der bodenständigen Flora des Wirts ist.

Es ist gut bekannt, dass Zahnkaries durch Bakterien verursacht wird, die die Mundhöhle besiedeln. Das grundsätzliche Zahnkaries-verursachende bakterielle Pathogen in Menschen ist das Bakterium Streptococcus mutans. Die charakteristischen Merkmale von S. mutans, die Kariogenese zur Folge haben, beinhalten dessen Fähigkeit Milchsäure zu produzieren, sowie dessen Fähigkeit sich am Zahnschmelz anzulagern (d. h. Plaque-Bildung) (Gibbons et al., 1969, J. Bacteriol., 98: 341–346; Makinen et al., 1972, Int. Dent. J., 22: 362–386; und Jordan, 1965, Ann. N.Y. Acad. Sci., 131: 905–912). Die Anwendung der Prinzipien einer Ersatztherapie würden die Isolierung eines nicht kariogenen Effektor-Stammes von S. mutans erfordern, z. B. eines S. mutans-Stammes, der für Milchsäure-Synthese defizient ist. Die Fortschritte, die durch die Anwendung von Ersatztherapie bei Zahnkaries gemacht wurden, sind kürzlich in einer Übersicht zusammengefasst worden (Hillman et al., 1989, In: New Biotechnologies in Oral Research, H. M. Myers, Hrsg., S. Karger, Basel, Schweiz, Seiten 1–17).

Die Erzeugung eines Milchsäure-defizienten S. mutans-Stammes und somit eines Stammes, der für eine Ersatztherapie bei Zahnkaries geeignet ist, stieß auf beträchtliche Schwierigkeiten. Defekte bei der Milchsäure-Synthese sind lethal für S. mutans. Abhynakar et al., (1985, J. Dent. Res., 64: 1267–1271) erzeugten durch chemische Mutagenese eine Lactat-Dehydrogenase (LDH)-defiziente S. mutans-Mutante, wobei ein atypischer S. mutans-Stamm verwendet wurde, der eine bereits existierende (spontane) Mutation enthielt, die den Pyruvat-Stoffwechsel beeinflusst. Die chemisch induzierten und die spontan generierten Mutationen dieses Stammes blieben jedoch uncharakterisiert. Darüber hinaus können chemischinduzierte, nicht charakterisierte Mutationen in den Wildtyp und somit den pathogenen, kariogenen Phänotyp revertieren. Nachfolgende Versuche LDH-Defekte in anderen S. mutans-Stämmen zu produzieren sind gescheitert (Hillman et al., 1994, Infect. Immun., 62: 60–64; Chen et al., 1994, J. Bacteriol., 176: 1542– 1545).

Es gibt in diesem Fachgebiet eindeutig einen Bedarf für einen stabilen, Milchsäure-defizienten, nicht kariogenen S. mutans-Stamm, der zur Verwendung bei einer Ersatztherapie zur Verhinderung und/oder Behandlung von Zahnkaries geeignet ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung ist auf der Entdeckung begründet, dass Milchsäure-defiziente Streptococcus mutans-Stämme durch Einbringen einer Mutation in ein Gen erzeugt werden können, das an dem Milchsäure-Synthese-Signalweg beteiligt ist und dass die Lethalität dieser Mutation durch das Einbringen eines rekombinanten Alkoholdehydrogenase (adh)-Gens in das Milchsäure-defiziente Bakterium aufgehoben wird. Das rekombinante adh-Gen verhindert die Anreicherung von Metaboliten (z. B. Pyruvat) im Bakterium, wodurch die Lethalität der Milchsäure-Defizienz umgangen wird. Diese Strategie kann angewandt werden, um einen S. mutans-Stamm zu produzieren, der zur Verwendung bei einer Ersatztherapie für Zahnkaries geeignet ist.

Im Allgemeinen stellt die Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zur Verhinderung und/oder Behandlung von Zahnkaries in einem für Zahnkaries anfälligen Wirt bereit.

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung einen rekombinanten Streptococcus mutans-Stamm bereit, der durch eine Defizienz in der Milchsäure-Herstellung gekennzeichnet ist (z. B. aufgrund der Eliminierung von Lactatdehydrogenase-Aktivität) und anstatt dessen durch die Herstellung einer rekombinanten Alkoholdehydrogenase (ADH) gekennzeichnet ist. "Defizienz in der Milchsäureherstellung" oder "Milchsäure-Defizienz" bedeutet, dass der rekombinante S. mutans-Stamm in Bezug auf Wildtyp-S. mutans im Wesentlichen geringere Mengen Milchsäure herstellt. Ein "Milchsäure-defizienter" rekombinanter S. mutans stellt vorzugsweise keine nachweisbarer Milchsäure her. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten Stämme bereit.

Ein bevorzugter rekombinanter S. mutans-Stamm ist durch Folgendes charakterisiert: 1) eine Defizienz in der Milchsäureherstellung; 2) Herstellung einer rekombinanten Alkoholdehydrogenase; und 3) Herstellung eines Bakteriocins, das antibakterielle Aktivität gegen einen Bakteriocinempfindlichen Streptococcus mutans-Stamm besitzt, und 4) er kann gegebenenfalls auxotroph sein (z. B. auxotroph für D-Alanin).

Zusätzliche bevorzugte rekombinante S. mutans-Stämme sind defizient in der Milchsäureherstellung, stellen eine rekombinante Alkoholdehydrogenase her und sind auxotroph (z. B. auxotroph für D-Aanin).

Die Erfindung stellt zusätzlich Arzneimittel bereit, die aus einem rekombinanten Milchsäure-defizienten, rekombinante ADH-herstellenden S. mutans-Stamm und einem pharmazeutisch verträglichen Träger zusammengesetzt sind. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, das in der Lage ist das Auftreten oder die Schwere von Zahnkaries in einem für Zahnkaries anfälligen Wirt zu reduzieren, wobei einem für Zahnkaries anfälligen Wirt ein rekombinanter Streptococcus mutans-Stamm oral verabreicht wird, der 1) ein rekombinantes Alkoholdehydrogenase-Gen besitzt und 2) eine Defizienz in der Milchsäureherstellung besitzt, in einer Menge, die wirksam ist, um den Zahnkaries-verursachenden Streptococcus mutans-Wirtsstamm in der Mundhöhle des Wirts zu ersetzen.

Die Erfindung stellt zusätzlich eine Zusammensetzung zur Erhaltung eines D-Alanin-auxotrophen Bakterienstamms (z. B. ein D-Alanin-auxotropher S. mutans) in der Mundhöhle eines Wirts bereit, die ein bakterielles D-Alanin-Auxotroph umfasst, wobei die Menge an D-Alanin erhalten wird.

Ein Vorteil der Erfindung ist, dass die rekombinanten S. mutans-Stämme 1) Milchsäure-defizient sind und somit keinen Zahnkaries verursachen werden und 2) sie die Zahnkariesverursachenden Stämme von S. mutans in der Mundhöhle des Wirts wirkungsvoll ersetzen werden.

Ein anderer Vorteil ist, dass da wo das rekombinante S. mutans-Bakterium ein D-Alanin-Auxotroph ist, die Besiedlung durch den Stamm durch Verabreichung von D-Alanin kontrolliert werden kann.

Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung, deren bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt die Aminosäure- (SEQ ID NR: 1) und DNA-Sequenz (SEQ ID NR: 2) von Z. mobilis-Alkoholdehydrogenase II.

2 zeigt die Wirkung von Glucose auf das Wachstum, das Überleben und die intrazelluläre Pyruvat-Konzentration der Streptococcus mutans-Stämme CH4ts und NG8 (Kontrolle). Symbole: NG8 mit Glucose, -⧠- NG8 ohne Glucose --O-- ; CH4ts mit Glucose -&shwhcir;-; CH4ts ohne Glucose, -&increment;-.

3 zeigt die Effekte der Glucose-Konzentration und Temperatur auf die kontinuierliche Züchtung des Streptococcus mutans-Stammes CH4ts in einer Verdünnungsrate von 10%. Teil A Symbole: -⧠-, optische Dichte; -&shwhcir;-, Glucose-Konzentration; Teil B Symbole: --O--, pH-Wert; -⧠-, Milchsäure-Konzentration; -&increment;-, theoretischer Abfall (der Kurve); -&shwhcir;-, Ethanol-Konzentration; -- -- , Acetoin-Konzentration.

4 zeigt die Effekte der Glucose-Konzentration und der Temperatur auf die kontinuierliche Züchtung des Streptococcus mutans-Stammes CH4ts bei einer Verdünnungsrate von 0,6%. Symbole: -⧠-, optische Dichte; -&shwhcir;-, Glucose; --O-- theoretischer Abfall (der Kurve).

Detaillierte Beschreibung

Zahnkaries wird durch die Herstellung und Anreicherung von Milchsäure durch Streptococcus mutans verursacht, der gewöhnlich die Mundhöhle besiedelt. Da jedoch Mutationen in dem Stoffwechselweg der Milchsäureherstellung von S. mutans für das Bakterium lethal sind, war das Einbringen eines Milchsäure-defizienten S. mutans-Stammes in die Mundhöhle zum Ersatz der Milchsäure-herstellenden S. mutans-Stämme nicht möglich.

Die Erfindung begründet sich auf der Entdeckung, dass lebensfähige, Milchsäure-defiziente Streptococcus mutans-Stämme erzeugt werden können, indem die Stämme mit Nucleinsäure transformiert werden, die eine rekombinante Alkohol-Dehydrogenase (ADH) codieren und durch Einbringen einer Mutation in den Milchsäure-Synthese-Signalweg, um den rekombinanten ADH-produzierenden Stamm Milchsäure-defizient zu machen. Die rekombinante ADH verhindert die Anreicherung von Metaboliten in dem Bakterium, womit die Lethalität der Milchsäure-Defizienz umgangen wird. Diese Strategie kann angewendet werden, um rekombinante S. mutans-Stämme zu erzeugen, die für eine Ersatztherapie bei Zahnkaries geeignet sind.

Erfindungsgemäße rekombinante Streptococcus mutans-Stämme

Ein "rekombinanter Streptococcus mutans-Stamm" ist ein nicht natürlicherweise auftretender Stamm von S. mutans, der erzeugt wurde, indem ein beliebiges aus der Vielzahl rekombinanter Nucleinsäure-Verfahren verwendet wurde (d. h. Verfahren, die die Manipulation von DNA oder RNA beinhalten). Im Allgemeinen ist ein erfindungsgemäßer rekombinanter Streptococcus mutans-Stamm mindestens charakterisiert durch: 1) eine Defizienz in der Milchsäureherstellung und 2) Herstellung einer rekombinanten Alkoholdehydrogenase (ADH).

Rekombinante S. mutans-Stämme sind vorzugsweise weiter dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakteriocin herstellen, das antibakterielle Aktivität gegen einen Bakteriocinempfindlichen S. mutans-Stamm besitzt. "Bakteriocin", wie es hierin verwendet wird, bedeutet das spezifische Bakteriocin oder Bakteriocin-ähnliche Toxin, das von dem S. mutans-Stamm JH1000 hergestellt wird (Hillman et al., 1984, Infect. Immun., 44 141–144). Das Bakteriocin von S. mutans JH1000 hat ein offensichtliches Molekulargewicht von weniger als etwa 1.000 Da und besitzt antibakterielle Aktivität gegen Bakteriocin-empfindliche S. mutans-Stämme. Die Herstellung des Bakteriocins stellt somit den S. mutans-Stamm mit einem selektiven Vorteil gegenüber Nicht-Bakteriocin-produzierenden S. mutans-Stämmen bereit, die normalerweise in der Mundhöhle vorliegen. Das Bakteriocin, falls es in einem erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stamm vorliegt, eliminiert die ansässigen, Bakteriocin-empfindlichen S. mutans-Stämme, beeinträchtigt somit die Besiedelung der Mundhöhle mit Bakteriocin-empfindlichen Stämmen und fördert die Besiedelung durch rekombinanten S. mutans.

Da es wünschenswert sein kann die Besiedelung der Mundhöhle durch den erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stamm zu kontrollieren, ist der rekombinante S. mutans-Stamm vorzugsweise ein für eine organische Substanz auxotropher Stamm, die natürlicherweise in der Mundhöhle des Säugerwirts nicht vorliegt, mehr bevorzugt ein für eine D-Aminosäure auxotropher Stamm, noch mehr bevorzugt ein D-Alanin-auxotropher Stamm. Die Besiedlung durch auxotrophe Stämme kann kontrolliert werden, indem die Menge der organischen Substanz reguliert wird, für die der Stamm auxotroph ist. Somit kann die Besiedlung beendet werden, falls der Bedarf entsteht, indem die Verabreichung der spezifischen organischen Substanz vorenthalten wird, für die der Stamm auxotroph ist.

Somit sind die erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämme charakterisiert durch: 1) eine Milchsäure-Defizienz und 2) die Produktion einer rekombinanten ADH und können weiter charakterisiert werden durch 3) Bakteriocin-Produktion und/oder 4) eine Auxotrophie für eine spezifische organische Substanz, vorzugsweise eine D-Aminosäure, mehr bevorzugt D-Alanin. Die Herstellung jedes erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stammes wird jetzt in Einzelheiten beschrieben.

Ausgangs-Streptococcus mutans-Stamm zur Verwendung erfindungs- gemäßer rekombinanter S. mutans-Stämme

Der Streptococcus mutans-Stamm, der für die Erzeugung der erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämme verwendet werden soll, kann jeder beliebige S. mutans-Stamm sein. Vorzugsweise hat der S. mutans-Stamm, der verwendet werden soll, um erfindungsgemäße rekombinante S. mutans-Stämme zu erzeugen, einen Selektionsvorteil gegenüber Wildtyp S. mutans-Stämmen, die normalerweise die Mundhöhle besiedeln. Der Selektionsvorteil kann durch jede beliebige aus einer Vielzahl von Eigenschaften übertragen werden (z. B. die Herstellung einer antibakteriellen Verbindung, relativer metabolischer Bedürfnisse, relativer Wachstumsrate, die Herstellung von Scavengern für Metabolite), die die Besiedlung der Mundhöhle durch den Stamm und den Ersatz des ansässigen Stammes, der die Mundhöhle besiedelt hat, verstärken. Vorzugsweise wird die Besiedlung. durch die erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämme, die Besiedlung durch andere Nicht-S. mutans-Stämme (z. B. die normale Bakterienflora, die nicht mit Kariogenese assoziiert ist) im Wesentlichen nicht beeinflussen. Die Infektion eines menschlichen Freiwilligen zum Beispiel mit einer Variante des S. mutans-Stammes JH1000, die erhöhte Spiegel an Bakteriocin produzierte, resultierte im Ersatz der kariogenen S. mutans-Stämme (vermutlich teilweise aufgrund der Bakteriocin-Produktion durch den JH1000-Stamm) ohne Wirkung auf andere ansässige Gram-positive Arten der Mundhöhle (Hillman et al., 1987, J. Dent. Res., 66: 1092–1094).

Vorzugsweise produziert der S. mutans-Stamm das Bakteriocin von S. mutans-JH1000. Mehr bevorzugt werden die rekombinanten S. mutans-Stämme aus S. mutans-JH1000-Varianten erzeugt, die in Bezug auf die Menge, die von S. mutans-JH1000 produziert wird, größere Mengen an Bakteriocin produzieren. Eine "Variante" ist ein genetisch modifiziertes Bakterium, das in Bezug auf den elterlichen Stamm, von dem es abstammt, eine phänotypische Veränderung zeigt. Die phänotypische Veränderung kann aus irgendeiner aus einer Vielzahl von genetischen Läsionen resultieren, wie eine Veränderung in: 1) dem Promotor, der funktionell mit dem strukturellen Gen verknüpft ist (z. B. um einen Anstieg der Gen-Transkription zu bewirken); und/oder 2) dem strukturellen Gen, das ein spezifisches Produkt codiert (z. B. derart, dass das Produkt verstärkte Aktivität besitzt). Eine genetische Läsion ist eine Veränderung in einer Wildtyp-Nucleotidsequenz, die in dem Bakterium in einer phänotypischen Veränderung resultiert.

Eine "Bakteriocin-Variante" von S. mutans-JH1000 zum Beispiel ist ein Bakterium, das in Bezug auf den elterlichen (parentalen) S. mutans-JH1000-Stamm eine erhöhte Bakteriocin-Aktivität besitzt. Die Bakteriocin-Aktivität der S. mutans-JH1000-Variante ist vorzugsweise in Bezug auf die Bakteriocin-Aktivität des parentalen S. mutans-Stammes erhöht, vorzugsweise um etwa 10-fach, vorzugsweise etwa 1,5-fach bis 5-fach, mehr bevorzugt etwa 2-fach bis 4-fach, im Allgemeinen etwa 3-fach, in Bezug auf den parentalen S. mutans-JH1000-Stamm. Die erhöhte Bakteriocin-Aktivität dieser Varianten kann aus einem erhöhten Spiegel an Bakteriocin-Produktion in Bezug auf den parentalen Stamm resultieren und/oder der Produktion eines Bakteriocins, das in Bezug auf Wildtyp-S. mutans-Bakteriocin eine verstärkte antibakterielle Aktivität besitzt.

"Varianten" können durch eine Vielzahl von Verfahren erzeugt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie Mutagenese (d. h. Aussetzen (Inkontaktbringen) des Bakteriums mit einem Mutagen), die Selektion spontaner Mutanten oder die genetische Manipulation unter Verwendung von rekombinanten Verfahren. Mutagenese kann erreicht werden, indem das Bakterium ultraviolettem Licht ausgesetzt wird oder irgendeinem aus einer Vielzahl von chemischen Mutagenen, entsprechend den Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind (z. B. Ethylmethansulfonat (EMS), Salpetersäure, Hydroxylamin, Nucleotid-Analogen (z. B. 5-Bromuracil, 2-Aminopurin), oder interkalierenden (eingeschalteten) Substanzen (z. B. Acridin). Verfahren zur Erzeugung bakterieller Mutanten sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

"Spontane Mutationen" sind Mutationen, die natürlicherweise entstehen, d. h. ohne direkte genetische Manipulation durch den Menschen oder durch Inkontaktbringen mit einem Mutagen. Die Selektion spontaner Mutanten kann durchgeführt werden, indem der Stamm gezüchtet wird und die gewünschten Varianten durch beispielsweise die Produktion oder Überproduktion eines spezifischen Faktors des varianten Bakteriums, z. B. Bakteriocin, selektiert werden. Verfahren zur Selektion spontaner Mutanten sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., vorstehend).

Verfahren zur Erzeugung von Varianten, unter Verwendung rekombinanter Techniken, sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, vorstehend). Die S. mutans-JH1000-Varianten, zum Beispiel, die eine erhöhte Bakteriocin-Aktivität besitzen, können durch Expression von multiplen Kopien Bakteriocin-codierender DNA und/oder Mutation des Bakteriocin-Promotors erzeugt werden, wobei höhere Spiegel an Transkription bereitgestellt werden.

Alkoholdehydrogenase-Gene

Da Defekte in der Milchsäure-Synthese für S. mutans lethal sind (Hillman et al., 1994, Infect. Immun., 62: 60–64; Hillman et akl., 1994, J. Bacteriol., 176: 1542–1545), muss der Defekt in den rekombinanten, Milchsäure-defizienten S. mutans-Stämmen durch die Produktion einer rekombinanten Alkoholdehydrogenase (ADH) komplementiert werden. Die Produktion von rekombinanter ADH verhindert die Anreicherung von Metaboliten, z. B. Pyruvat, die andernfalls den Tod von Milchsäure-defizienten S. mutans verursachen.

"Die Produktion einer rekombinanten ADH" bedeutet, dass der rekombinante S. mutans-Stamm ein funktionelles ADH-Enzym exprimiert, das unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren in die S. mutans-Stämme eingebracht wurde (d. h. S. mutans wurde mit DNA transformiert, die ein ADH-Enzym codiert). "Transformation" bedeutet eine dauerhafte (d. h. stabile) genetische Veränderung, die in einer Zelle induziert wurde, nachdem eine neue DNA aufgenommen wurde (d. h. DNA, die in Bezug auf die Zelle exogen vorliegt).

Die ADH-codierende DNA kann von einem beliebigen Organismus abstammen, vorzugsweise von einem Bakterium, mehr bevorzugt von Zymomonas mobilis oder Streptococcus rattus, sogar noch mehr bevorzugt von Z. mobilis. Die ADH-codierende DNA kann von S. mutans abstammen, sodass durch das Einbringen der ADH-codierenden DNA, in Verbindung mit dem nativen S. mutans-adh-Gen, multiple Kopien der ADH-codierenden DNA in dem S. mutans-Genom bereitgestellt werden. In einer alternativen Ausführungsform kann das rekombinante ADH erzeugt werden, indem eine Mutation in den regulatorischen Mechanismus des S. mutans-adh-Gens eingebracht wird (z. B. eine Mutation in dem adh-Promotor, wobei eine verstärkte Transkription des adh-Gens bereitgestellt wird). Vorzugsweise ist die Rekombinante ADH Alkoholdehydrogenase II von Z. mobilis, die cloniert und sequenziert wurde (Genbank-Registrier-Nr. M15394; Conway et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 2591–2597, hierin durch Bezugnahme enthalten). Die Aminosäure- (SEQ ID NR: 1) und DNA-Sequenzen (SEQ ID NR: 2) von Z. mobilis-Alkoholdehydrogenase II sind in 1 gezeigt.

Verfahren zur Identifizierung, Clonierung, stabilen Transformation und Expression von DNA-Fragmenten, die eine DNA von Interesse codieren (z. B. ADH), sind Routine und im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Die Isolierung von DNA zum Beispiel, die ADH codiert, kann durch PCR-Amplifikation der Sequenz anhand von genomischer DNA durchgeführt werden, oder ausgehend von einem bereits existierenden Clon des Gens. Die Expression von rekombinanter ADH kann erreicht werden, indem das strukturelle adh-Gen mit einem Promotor funktionell verknüpft wird, der die Expression in S. mutans erleichtert (z. B. spaP oder den nativen ldh-Promotor).

Die Erzeugung einer funktionellen ADH kann zum Beispiel unter Verwendung herkömmlicher ADH-Aktivitätstests getestet werden (z. B. Tests zur NAD-abhängigen Oxidation von Ethanol), die im Stand der Technik gut bekannt sind (Neal et al., 1986, Eur. J. Biochem., 154: 119–124, hierin durch Bezugnahme enthalten).

Erzeugung von Milchsäure-defizientem S. mutans

"Milchsäure-defizient" oder "Defizienz in der Milchsäureherstellung " bedeutet, dass der S. mutans-Stamm in Bezug zu Wildtyp S. mutans im Wesentlichen erniedrigte Mengen Milchsäure produziert. Vorzugsweise produziert ein "Milchsäure-defizienter" rekombinanter S. mutans-Stamm keine nachweisbare Milchsäure.

Erfindungsgemäße rekombinante S. mutans-Stämme sind Milchsäure-defizient als Ergebnis eines Defektes im Milchsäuresynthese-Signalweg. Ein "Defekt" ist eine Veränderung in der das Gen codierenden DNA, die die Expression eines funktionellen Genprodukts verhindert. "Defekte" beinhalten Veränderungen, die in der Hemmung oder einer wesentlichen Erniedrigung der Gen-Transkription und/oder -Translation resultieren. "Defekte" beinhalten auch Veränderungen in einem strukturellen Gen, sodass das transkribierte und translatierte Genprodukt nicht funktionell ist, oder in Bezug auf das Wildtyp-Genprodukt mit einem wesentlich erniedrigten Aktivitäts-Spiegel funktioniert.

Ein "Defekt in dem Milchsäuresynthese-Signalweg" ist ein genetischer Defekt, der die Produktion von Milchsäure verhindert oder wesentlich erniedrigt. Milchsäuresynthese-Signalweg-Defekte können zum Beispiel genetische Läsionen in einem Enzym beinhalten, das die Milchsäuresynthese begünstigt und/oder in einem Promotor, der mit einem strukturellen Gen verknüpft ist, das ein Enzym codiert, das für die Milchsäuresynthese notwendig ist. Vorzugsweise beruht der Defekt in dem Milchsäuresynthese-Signalweg auf einem Defekt in dem Gen, das Lactatdehydrogenase (ldh) codiert (z. B. ein Defekt im ldh-Strukturgen und/oder ein Defekt im Promotor, der mit dem ldh-Strukturgen funktionell verknüpft ist. S. mutans-Stämme, die einen Defekt im LDH-Gen haben, werden als LDH Stämme bezeichnet.

Der Defekt im Milchsäuresynthese-Signalweg kann durch Mutagenese eingebracht werden (d. h. Inkontaktbringen des Bakteriums mit einem Mutagen), durch Selektion von spontanen Mutanten oder genetische Manipulation unter Verwendung von rekombinanten Verfahren. Wie vorstehend diskutiert, sind alle diese Verfahren im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., vorstehend). Vorzugsweise ist der Milchsäuresynthese-Signalweg-Defekt unter Verwendung von rekombinanten Verfahren eingebracht worden, z. B. Einbringen eines defekten ldh-Strukturgens in das Bakterium und nachfolgende ortsspezifische Rekombination, wobei das Wildtyp ldh-Gen mit dem defekten ldh-Gen ersetzt wird. Das S. mutans-ldh-Gen ist cloniert worden, seine Nucleotidsequenz bestimmt worden (Genbank-Zugangs-Nr. M72545) und das rekombinante ldh-Gen in Escherichia coli exprimiert worden (Duncan et al., 1991, Infect. Immun., 59: 3930–3934; Hillman et al., 1990, Infect. Immun., 58: 1290–1295, alle hierin durch Bezugnahme enthalten).

Erzeugung auxotropher rekombinanter S. mutans-Stämme

Für den Fall, dass es wünschenswert wird, den Wirt von dem rekombinanten S. mutans-Stamm zu befreien, der die Mundhöhle besiedelt, ist der infizierende rekombinante S. mutans-Stamm vorzugsweise ein Auxotroph. Ein "Auxotroph" ist ein Bakterium, das eine Quelle einer spezifischen organischen Substanz/spezifischer organischer Substanzen zusätzlich zu einer Kohlenstoffquelle benötigt, um zu wachsen. Ein "D-Alanin-Auxotroph" zum Beispiel ist ein Bakterium, das nicht ohne eine Quelle von D-Alanin wachsen kann. Obwohl Auxotrophe häufig für eine kurze Zeit in Abwesenheit der benötigten organischen Substanz fortbestehen können (d. h. Überleben ohne Wachstum), erfordert die Aufrechterhaltung der auxotrophen Besiedelung die periodische Ergänzung dieser organischen Substanz.

D-Alanin-auxotrophe Bakterien zum Beispiel benötigen den periodischen Zusatz von D-Alanin, um zu wachsen und die Besiedelung einer Nische wie die Mundhöhle aufrechtzuerhalten. Da Säuger normalerweise keine D-Aminosäuren produzieren und D-Alanin durch Organismen der normalen Flora normalerweise nicht sekretiert wird, kann D-Alanin von einem D-Alanin-Auxotrophen aus der normalen Umgebung der Mundhöhle des Wirts nicht erhalten werden. Somit stellt die Verwendung von Auxotrophen in dem erfindungsgemäßen therapeutischen Verfahren den Vorteil bereit, dass die orale Besiedelung durch den rekombinanten S. mutans-Stamm dadurch unterbrochen werden kann, dass die spezifische organische Ergänzung, z. B. die D-Alanin-Ergänzung vorenthalten wird.

Bakterielle Auxotrophe können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren erzeugt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie chemische Mutagenese, Selektion spontaner Mutanten und/oder durch rekombinante Verfahren (z. B. Transposon-Mutagenese, Austausch durch Rekombination mit einem defekten oder nicht funktionellen Gen) (siehe zum Beispiel Sambrook et al., vorstehend). Bevorzugt werden auxotrophe S. mutans-Stämme entweder durch Selektion spontaner Mutanten oder durch rekombinante Verfahren (z. B. Einbringen eines Defekts in einen synthetischen Signalweg für eine D-Aminosäure) erzeugt. Bevorzugt werden D-Alanin-auxotrophe S. mutans-Stämme durch Einbringen eines Defekts in das Gen erzeugt, das Alanin-Racemase codiert, das Enzym, das L-Alanin in D-Alanin umwandelt. Die Gene, die Alanin-Racemase von einigen verschiedenen Bakterien codieren, sind cloniert worden (Bacillus stearothermophilus, Tanizawa et al, (1988) Biochem., 27: 1311–16; Bacillus subtilis, Ferrari et al., Subtilis, (1985) Biotechnol. (NY) 3: 1003–7; E. coli, Lobocka, (1994), J. Bacteriol. 176: 1500–10; Salmonella typhimurium, Galakatos et al., (1986) Biochem. 23: 3255–60; und Salmonella typhimurium, Wasserman et al., (1984) Biochem. 23: 5182–7).

Arzneimittel, die den erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stamm enthalten

Ein "Arzneimittel" ist eine Zusammensetzung, die zur oralen Verabreichung eines erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stammes an einen Zahnkaries-gefährdeten Patienten geeignet ist. Im Allgemeinen sind erfindungsgemäße Arzneimittel aus einem rekombinanten S. mutans-Stamm und einem pharmazeutisch verträglichen Träger zusammengesetzt. Ein "pharmazeutisch verträglicher Träger" bedeutet ein Vehikel zur Bereitstellung eines rekombinanten S. mutans-Stammes in die Mundhöhle des Wirts, wobei das Vehikel sowohl mit der bakteriellen Zelle als auch mit der Lebensfähigkeit der Zellen des Wirts verträglich ist. Pharmazeutisch verträgliche Träger, die zur Verwendung bei der Verabreichung lebensfähiger erfindungsgemäßer rekombinanter S. mutans-Stämme geeignet sind, sind den Fachleuten gut bekannt. Die Auswahl des pharmazeutisch verträglichen Trägers hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich dem zu verabreichenden rekombinanten S. mutans-Stamm und der Formulierung, die verwendet wird, um den rekombinanten S. mutans-Stamm bereitzustellen.

Pharmazeutisch verträgliche Träger, die zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämmen geeignet sind, beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, gepufferte physiologische Kochsalz-Lösungen (z. B. Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung), pharmazeutisch verträgliche Kulturmedien (z. B. Luria-Brühe, Hirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI)) oder andere Lösungen, die die Lebensfähigkeit des Bakteriums erhalten. Zusätzlich können solche pharmazeutisch verträglichen Träger flüssige oder nicht flüssige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen sein. Eine Vielzahl pharmazeutisch verträglicher Träger, die zur oralen Verabreichung lebensfähiger oder lyophilisierter Bakterien geeignet sind, sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg., Gennaro, Hrsg., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, hierin durch Bezugnahme enthalten; und die pharmazeutische Zusammensetzung LACTINEXTM, eine kommerziell erhältliche Formulierung zur oralen Verabreichung von lebensfähigem Lactobacillus).

Die erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämme können in irgendeiner aus einer Vielzahl von Zusammensetzungen formuliert sein, die zur oralen Verabreichung geeignet sind. Der rekombinante S. mutans-Stamm kann zum Beispiel zur Verabreichung als eine lyophile Substanz oder als eine Zellpaste aus einer rekombinanten S. mutans-Kultur formuliert sein, oder die rekombinante S. mutans-Kultur kann direkt in die Mundhöhle verabreicht werden. Der rekombinante S. mutans-Stamm kann auch in Form eines Mundwassers, einer Zahnpaste, einer Zahnseide, eines Kaugummis oder einer Kautablette verabreicht werden.

Das Arzneimittel kann zusätzliche Nährstoffe enthalten, um die Lebensfähigkeit des Bakteriums in der Zusammensetzung zu erhalten. Das Arzneimittel kann auch Aromastoffe, Farbstoffe, Wohlgerüche oder andere Zusammensetzungen enthalten, die die Gaumenfähigkeit der Zusammensetzung erhöhen und/oder die Zustimmung des Patienten erhöhen, ohne die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu beeinträchtigen. Verfahren zur Herstellung von Formulierungen zur oralen Verabreichung sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg., vorstehend, hierin enthalten durch Bezugnahme).

Zusammensetzungen zur Erhaltung des erfindungsgemäßen auxotrophen rekombinanten S. mutans-Stammes

Die Besiedlung der Mundhöhle durch rekombinante auxotrophe S. mutans-Stämme muss durch periodische Verabreichung der organischen Substanz erhalten werden, für die der Stamm auxotroph ist. Bei anhaltender Abwesenheit der organischen Substanz stellen die Auxotrophen das Wachstum ein und der Stamm kann die Mundhöhle nicht länger andauernd besiedeln. In Abwesenheit von D-Alanin zum Beispiel unterziehen sich D-Alanin Auxotrophe aufgrund einer geschwächten Zellwand der Lyse. Die Verwendung eines auxotrophen rekombinanten S. mutans-Stammes in dem erfindungsgemäßen therapeutischen Verfahren stellt einen "betriebssicheren" Mechanismus zur Eliminierung des Stammes bereit, für den Fall irgendeiner nicht gewünschten Nebenwirkung. Da jedoch die erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämme den ursprünglichen S. mutans-Stämmen ähnlich sind, die normalerweise die Mundhöhle besiedeln, ist die Wahrscheinlichkeit auf nicht erwünschte Nebenwirkungen gering. Die Erhaltung der Besiedlung der Mundhöhle durch die erfindungsgemäßen auxotrophen, rekombinanten S. mutans-Stämme kann durch orale Verabreichung einer Auxotroph-erhaltenden Menge der organischen Substanz erreicht werden, für die das Bakterium auxotroph ist. Eine "bakterielles Auxotropherhaltende Menge" ist eine Menge der organischen Substanz, die ausreicht, um die Lebensfähigkeit des bakteriellen Auxotroph in der Mundhöhle aufrechtzuerhalten. Wo zum Beispiel der reombinante S. mutans-Stamm für D-Alanin auxotroph ist, ist eine "D-Alanin-auxotrophes Bakterium-aufrechterhaltende Menge" eine Menge an D-Alanin, die für das Überleben des D-Alanin-auxotrophen Stammes in der Mundhöhle des Wirts ausreichend ist. Im Allgemeinen enthält eine einzelne Dosis einer D-Alanin-auxotrophes Bakterium-aufrechterhaltenden Menge an D-Alanin, etwa 1 mg bis 100 mg, vorzugsweise etwa 5 mg bis 75 mg, mehr bevorzugt etwa 10 mg bis 50 mg, am meisten bevorzugt etwa 20 mg bis 25 mg D-Alanin. Die Konzentration an D-Alanin in dem Arzneimittel in Form einer Lösung liegt in einem Bereich von etwa 0,01 mg/ml bis 167 mg/ml (wobei letzteres eine gesättigte Lösung von D-Alanin in Wasser bei 25°C darstellt), vorzugsweise von etwa 0,1 mg/ml bis 50 mg/ml, mehr bevorzugt von etwa 1 mg/ml bis 25 mg/ml. Die Konzentration von D-Alanin in dem Arzneimittel kann entsprechend dem verwendeten Träger und dem Sättigungspunkt von D-Alanin in diesem spezifischen Träger variieren.

Die organische Substanz, die zur Erhaltung des auxotrophen rekombinanten S. mutans-Stammes in der Mundhöhle erforderlich ist, kann in einer Vielzahl von Arten formuliert werden. Wo zum Beispiel der rekombinante S. mutans-Stamm für D-Alanin auxotroph ist, kann die Zusammensetzung zur Erhaltung des D-Alanin-Auxotrophs als ein Mundwasser, ein Kaugummi, eine Zahnseide, eine Zahnpaste, eine Kautablette formuliert sein, oder als irgendeine andere Formulierung, die zur oralen Verabreichung in die Mundhöhle des Wirts geeignet ist. Zusätzlich zu der organischen Substanz (z. B. D-Alanin) kann die Zusammensetzung Aromastoffe, Farbstoffe, Wohlgerüche oder andere Verbindungen enthalten, die die Gaumenfähigkeit der Zusammensetzung erhöhen und/oder die Anerkennung durch den Patienten verstärken, ohne die Wirksamkeit der organischen Substanz zu beeinträchtigen, die in der Zusammensetzung enthalten ist.

Die Arzneimittel, die zur oralen Verabreichung der erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämme formuliert werden und, wo gewünscht, deren Erhaltung in der Mundhöhle, muss in Anlehnung an die intrinsischen Merkmale der Mundhöhle und jeder beliebigen erwünschten normalen Bakterienflora, die die Mundhöhle besiedelt, entwickelt werden. Verfahren zur Herstellung von Formulierungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg., Gennaro, Hrsg. 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, hierin durch Bezugnahme enthalten).

Verabreichung

Die erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämme können an jeden beliebigen, durch Zahnkaries-gefährdeten Wirt verabreicht werden. Vorzugsweise einen Wirt, in dem S. mutans die Mundhöhle besiedeln kann, vorzugsweise einen Säuger als Wirt (z. B. einen Menschen, Kaninchen, Pferd, Katze, Schaf etc.), mehr bevorzugt einen Menschen als Wirt. Die rekombinanten S. mutans-Stämme können an einen Wirt jedes beliebigen Alters verabreicht werden, z. B. in der Kindheit, dem Jugendalter oder dem Erwachsenenalter.

Die erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämme können auf eine Vielzahl von Arten oral verabreicht werden. Die rekombinanten S. mutans-Stämme können zum Beispiel in Form von Suspensionen, Kautabletten, Pillen, Kapseln, als Rezepturen für eine fortwährende Freisetzung (z. B. ein orales Implantat, das den rekombinanten S. mutans-Stamm enthält) oder als lyophilisierte Pulver verabreicht werden. Die rekombinanten S. mutans-Stämme können auch durch direkte Applikation eines Lyophilisats, einer Kultur oder einer Zellpaste an die Zähne des Patienten verabreicht werden. Jede beliebige Art der Verabreichung ist geeignet, solange das Arzneimittel in der Mundhöhle angewendet wird. Es wird bevorzugt, dass der rekombinante S. mutans-Stamm verabreicht wird, indem eine bakterielle Zellsuspension direkt an den Zähnen des Patienten angewendet wird, z. B. durch Bürsten und die Verwendung von Zahnseide.

Im Allgemeinen ist die Menge an rekombinantem S. mutans-Stamm, die einem Patienten verabreicht wird, eine Menge, die ausreicht, um die Zahnkaries-verursachenden S. mutans-Stämme in der Mundhöhle des Wirts zu ersetzen. "Eine wirksame Menge zum Ersetzen der Zahnkaries-verursachenden S. mutans-Stämme in der Mundhöhle des Wirts" bedeutet eine Menge, die die Besiedelung der Mundhöhle durch den rekombinanten S. mutans-Stamm bewirkt und die ansässigen Milchsäure-produzierenden, Zahnkaries-verursachenden S. mutans-Stämme entfernt (z. B. durch Wettbewerb zwischen den Bakterien um Nährstoffe und/oder durch die Produktion eines Bakteriocins durch den rekombinanten S. mutans-Stamm. Der Begriff "Einheitsdosis", falls er in Bezugnahme auf ein erfindungsgemäßes Arzneimittel verwendet wird, betrifft physikalisch für sich alleine stehende Einheiten, die als einheitliche Dosis für das Individuum geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge aktives Material enthält (z. B. lebensfähigen rekombinanten S. mutans-Stamm), derart berechnet, um in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Träger oder Vehikel, die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzeugen.

Spezifische Dosierungen können in Anlehnung an verschiedene Patientenvariable, einschließlich Größe, Gewicht, Alter, Schwere der Erkrankung (z. B. die Hartnäckigkeit und/oder die Anzahl Milchsäure-produzierender, Zahnkaries-verursachender ansässiger S. mutans-Stämme) und die Ansprechbarkeit auf Therapie (z. B. die Empfänglichkeit der Mundhöhle des Wirts für Besiedlung), weitgehend variieren. Verfahren zur Bestimmung der geeigneten Verabreichungsart und Dosis werden im Allgemeinen auf einer von Fall zu Fall beruhenden Vorgehensweise von dem behandelnden Zahnarzt oder einem anderen Kliniker bestimmt. Solche Bestimmungen sind für einen Durchschnittsfachmann Routine (siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg., Gennaro, Hrsg. 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990).

Im Allgemeinen liegt die Zahl an rekombinanten S. mutans, die einem Patienten verabreicht wird, im Bereich von etwa 102 bis 1015 Bakterien, vorzugsweise von etwa 103 bis 1014 Bakterien, mehr bevorzugt von etwa 105 bis 1012 Bakterien, normalerweise etwa 1011 Bakterien. Dosierungen, die zur Verabreichung geeignet sind, können leicht aus Dosierungen extrapoliert werden, die für die Streptococcus spp.-Besiedelung der Mundhöhle in einem Tiermodell ausreichend sind, zum Beispiel S. rattus-Besiedelung der Mundhöhle von Ratten. Geeignete Dosierungen können auch anhand von Dosierungen bestimmt werden, die für die Besiedelung der menschlichen Mundhöhle durch den Bakteriocin-produzierenden Stamm S. mutans-JH1000 und Varianten davon gefunden wurden, die unterschiedliche Spiegel an Bakteriocin-Aktivität exprimieren (Hillman et al., 1987, J. Dent. Res., 66: 1092–1094, hierin. durch Bezugnahme enthalten).

Multiple Dosen an rekombinanten S. mutans-Stämmen können verabreicht werden, um die Besiedelung der Mundhöhle und den Ersatz der ansässigen, Zahnkaries-verursachenden S. mutans-Stämme des Wirts zu erreichen. Im Allgemeinen müssen die erfindungsgemäßen rekombinanten S. mutans-Stämme dem Patienten nur einmal verabreicht werden. Für den Fall, dass der rekombinante S. mutans-Stamm ein Auxotroph ist, muss die Besiedelung durch den Stamm erhalten werden, indem eine Zusammensetzung verabreicht wird, die die entsprechende organische Substanz enthält. Dort wo zum Beispiel der rekombinante S. mutans-Stamm ein D-Alanin-Auxotroph ist, muss D-Alanin für die andauernde Besiedelung der Mundhöhle verabreicht werden. D-Alanin oder ein anderes entsprechendes organisches Substrat werden im Allgemeinen mindestens einmal pro Woche verabreicht, vorzugsweise mindestens einmal pro Tag, mehr bevorzugt mindestens zweimal pro Tag und können als Teil der Routine-Zahnpflege des Patienten verabreicht werden, z. B. als ein Bestandteil einer Zahnpaste, einer Zahnseide oder eines Mundwassers.

Die erfolgreiche Besiedelung der Mundhöhle des Wirts durch den rekombinanten S. mutans-Stamm kann festgestellt werden, indem die Bakterien der Mundhöhle des Patienten gezüchtet werden und der rekombinante Stamm zum Beispiel durch die Produktion von rekombinantem ADH, die Produktion von Bakteriocin, durch ELISA, durch Wachstum auf selektivem pH-Indikator-Medien oder andere Verfahren zur Identifizierung eines bakteriellen Stammes, die im Stand der Technik gut bekannt sind, identifiziert wird.

Die nachfolgenden Beispiele beabsichtigen die Erfindung zu. veranschaulichen, aber nicht einzuschränken. Während sie typisch sind für diejenigen, die verwendet werden könnten, können andere Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, in einer anderen Ausführungsform verwendet werden.

BEISPIELE Beispiel 1. Materialien und Methoden Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen

Verfahren zur Erzeugung des S. mutans-Stammes CH4ts (Chen et al., 1994, J. Bacteriol., 176: 1542–1545) und zur Isolierung des S. mutans-Stammes NG8 (Lee et al., 1989, Infect. Immun. 57: 3306–3313) sind zuvor beschrieben worden. Der E. coli-Stamm DH5&agr;, der zur Clonierung verwendet wurde, ist öffentlich erhältlich. Die Erzeugung des Plasmids pL01276 (Conway et al., 187, J. Bacteriol., 169: 949–954), das das clonierte Zymomonas mobilis-Pyruvatdecarboxylase (PDC)-Gen enthält, das Plasmid pLOI286 (Conway et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 2591–2597), das das clonierte Z. mobilis-Alkoholdehydrogenase II (adh)-Gen enthält, das auf pCR2 beruhende Plasmid pCR3-8, das das clonierte S. mutans spaP-Gen enthält (Crowley et al., 1995, J. Dent. Res., 74, Abstract Nr. 1511) und das Plasmid pVA981, das ein Tetracyclin-Resistenzgen enthält, das von S. mutans abstammt (Tobian et al., 1984, J. Bacteriol., 160: 556–563) sind zuvor beschrieben worden. Jede der vorstehend zitierten Referenzen sind hierdurch durch Bezugnahme ihrer jeweiligen Beschreibungen zur Erzeugung der angegebenen Plasmide und der Erzeugung oder Isolierung der vorgetragenen Stämme, enthalten. Batch- und fortlaufende Kulturen von CH4ts wurden in dem von Carlsson definierten Medium (Carlsson et al., 1970, Caries Res., 4: 297–304) gezüchtet, das mit 0,5% Trypton und 1% Glucose angereichert war. Zellen für den Test auf ADH-Aktivität wurden in Todd-Hewitt-Brühe gezüchtet, die mit 1% Glucose angereichert war. Falls angemessen, wurden Ampicillin (50 &mgr;g/ml), Tetracyclin (10 &mgr;g/ml) und Erythromycin (5 &mgr;g/ml) verwendet.

Tests der Kulturen

Proben von Batch- und fortlaufenden Kulturen wurden zu bestimmten Zeiten entnommen und ihr pH-Wert und die Absorption bei 550 nm bestimmt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4°C entnommen und die resultierende zellfreie Flüssigkeit wurde enzymatisch (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) auf Glucose, Ethanol und Milchsäure getestet und durch Gas-Flüssig-Chromatographie (Hillman et al., 1987, Infect. Immun., 55: 1399–1402) auf Aceton. Die pelletierten Zellen wurden einmal durch Zentrifugation mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und chemisch getestet (Friedmann et al., 1957, In: S. P. Colowick and N. O. Kaplan (Hrsg.) Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., New York, S. 414–418), um die intrazellulären Pyruvat-Konzentrationen zu bestimmen. Die in den Figuren dargestellten Daten sind die Durchschnittswerte von zwei Experimenten.

Tests für Alkoholdehydrogenase-Aktivität

Zellen von 200 ml über Nacht-Kulturen von E. coli und S. mutans-Stämmen wurden durch Zentrifugation bei 4°C gewonnen und zweimal in 100 mM KPO4-Puffer (pH 8,5) gewaschen. Die Zellpellets (Zellrückstände) wurden in 1 ml Puffer resuspendiert und durch Passage durch eine French-Presse bei 15.000 psi aufgebrochen. Zellrückstände wurden durch 30 Minuten Zentrifugation bei 4°C entfernt. Die zellfreien Extrakte wurden auf Eis aufbewahrt und auf die NAD-abhängige Oxidation von Ethanol entsprechend den Verfahren von Neale et al. (Neal et al., 1986, Eur. J. Biochem., 154: 119–124) getestet.

Test für Lactatdehydrogenase-Aktivität

LDH-Aktivitätstests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Hillman et al., 1990, Infect. Immun., 58: 1290–1295). Kurz, LDH-Aktivität wurde als Fructose-1,6-diphosphat (FDP)- und Pyruvat-abhängige Oxidation von NADH bei 340 nm mit einem Spectralphotometer gemessen. Das Reaktionsgemisch enthielt 100 &mgr;mol Kaliumphosphat, pH 6,2, 0,2 &mgr;mol NADH, 10 &mgr;mol Natriumpyruvat und 1–5 &mgr;l zu testende Probe in einem Endvolumen von 1 ml. Es wurden 1 Minute lang Hintergrundspiegel an Aktivität gemessen und dann wurde die Umsetzung durch die Zugabe von 20 &mgr;mol FDP initiiert.

Beispiel 2: Clonierung des Zymomonas mobilis-adh-Strukturgens zur Expression in S. mutans

Das Plasmid pADH enthält den offenen Leserahmen des Z. mobilis-adh-Gens, fusioniert an die regulatorischen Sequenzen des S. mutans-spaP-Gens. pADH wurde erzeugt, indem zuerst das Plasmid pCR3-8 mit SacI und DraIII gespalten wurde und dann die gespaltene DNA mit Nuclease aus der Mung-Bohne (Mung Bean-Nuclease) behandelt wurde, um das gesamte spaP-Gen mit Ausnahme seines Promotors, der Ribosomen-Bindungsstelle und 52 Basen vom 5'-Ende des offenen Leserahmens zu entfernen: Ein 4,2 kb-Fragment des linearisierten pCR3-8-Plasmids wurde durch Agarose-Gelelektrophorese wiedergewonnen.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um den gesamten offenen Leserahmen des Z. mobilis-adh-Gens mit Ausnahme seines Translations-Start-Codons (ATG) plus eine zusätzliche (G)-Base aus dem Plasmid pLO1286 zu amplifizieren, wobei die synthetischen Primer vorwärts (5'-CTTCTTCAACTTTTTATATTCCTTTCG (SEQ ID NR: 3)) und rückwärts (5'-CGGAGGCATTGTTTG (SEQ ID NR: 4)) verwendet wurden. Das amplifizierte Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese wiedergewonnen mit Mung Bean-Nuclease und Polynucleotid-Kinase behandelt und in das pCR3-8-Fragment ligiert, wobei die translationelle Fusion mit spaP erzeugt wurde. Das resultierende Plasmid pADH wurde verwendet, um Escherichia coli DH5&agr;-Zellen zu transformieren. DH5&agr;-Transformanten wurden auf LB-Medium, das Ampicillin enthält, ausgewählt. Die exakte Größe und Orientierung der pADH-Inserierung wurde durch Restriktionsenzym-Analyse bestätigt.

Bei der Vorbereitung- zur Clonierung in S. mutans, wurde pADH in pADH-tet umgewandelt, indem das 3,5 kb HincII-Fragment von pVA981, das ein Tetracyclin-Resistenzgen enthält, das von S. mutans abstammt (Tobian et al., 1984, J. Bacteriol., 160: 556– 563) in die ScaI-Restriktionsschnittstelle von pADH inseriert wurde. Das pADH-tet-Konstrukt wurde verwendet, um DH5&agr; zu transformieren und die Transformanten, die auf Luria-Brühe (LB) mit Tetracyclin ausgewählt wurden, wurden auf Sensitivität für Ampicillin getestet. S. mutans wurde dann mit pADH-tet transformiert, wobei die Verfahren von Perry and Kuramitsu (Perry et al., 1981, Infect. Immun., 32: 1295–1297) verwendet wurden.

Beispiel 3: Auswirkungen der Glucose-Konzentration auf das Wachstum von CH4ts und NG8 in Batch-Kulturen

Über Nacht-Batch-Kulturen von CH4ts (ldhts) und von dessen parentalem Stamm S. mutans-NG8 wurden bei 30°C gezüchtet. CH4ts enthält eine Temperatur-sensitive Mutation der Lactatdehydrogenase (LDH). Die LDH von CH4ts verhält sich bei 30°C wie der Wildtyp, nach einem Kultur-Temperatursprung auf 42°C jedoch ist die Hitze-empfindliche LDH inaktiv. Somit erlaubt dieser Stamm Experimente, um die Rolle. von LDH für die Lethalität von LDH-Mutanten von S. mutans zu bestimmen. Gewaschene Zellen wurden 1 : 1.000 in, frischem Medium mit und ohne Glucose verdünnt und in einem 42°C Wasserbad inkubiert.

Zu den in 2 angegebenen Zeitpunkten (Tafel A) wurden die Lebendzellzahlen bestimmt, indem die Proben auf Gehirn-Herz-Infusions (brain heart infusion; BHI)-Platten ausgesät und die Platten bei 30°C inkubiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass in Abwesenheit von Glucose (gestrichelte Linie), CH4ts (offene Dreiecke) und NG8 (offene Kreise) sich identisch verhielten: Das Wachstum hörte nach 3 Stunden auf und wurde von langsamem Zelltod nachgefolgt (Halbwertszeit = 23,5 Stunden). Im Gegensatz zu seinem elterlichen Stamm (offene Quadrate), stoppte CH4ts (offene Kreise) jedoch das Wachstum innerhalb von 3 Stunden nachdem er in Anwesenheit von Glucose ausgebracht wurde (durchgezogene Linien) und unterzog sich einem beschleunigten Zelltod (Halbwertszeit = 12,1 Stunden). Dieser Unterschied korrellierte zeitlich mit der Anreicherung hoher intrazellulärer Konzentrationen an Pyruvat in der Mutante (2, Tafel B).

Beispiel 4: Wirkung von Glucose und Temperatur auf Wachstum und Endprodukt-Konzentration in fortlaufenden Kulturen von CH4ts und NG8

CH4ts wurde in dem Reaktionsgefäß eines Chemostaten bei 30°C bis zur Sättigung gezüchtet. Der Medium-Einfluss, der eine Verdünnungsrate von 0,1/Std, bereitstellte, wurde 72 Stunden lang aufrechterhalten, bevor die Temperatur der Kultur auf 42° C verändert wurde. Innerhalb von 3 Stunden begann die Zelldichte in einer Rate abzunehmen, die der theoretischen Auswaschrate entspricht, was das Aufhören von Zellwachstum anzeigt (3). Das korrellierte mit einem Anstieg der Glucosekonzentration, die in dem Reaktionsgefäß beobachtet wurde.

Wenn das fortlaufende Kultur-Experiment unter Verwendung einer Verdünnungsrate von 0,006/Std. wiederholt wurde, wurde ein stabiles Wachstum von CH4ts erhalten, sobald die Temperatur auf 42°C verändert wurde (4). Sofort nach dem Temperatursprung fielen die Milchsäure-Konzentrationen in Übereinstimmung mit der vorhergesagten Auswaschrate ab. Das Einstellen der Lactat-Produktion wurde durch die Initiation von Ethanol- und Acetoin-Produktion begleitet, was in der fortlaufenden Kultur in einem schrittweisen Anstieg des pH-Wertes resultierte. Glucose-Konzentrationen blieben während des ganzen Experiments nicht nachweisbar.

Diese Ergebnisse zeigen, dass stabiles Wachstum von CH4ts bei 42°C unter Glucose-einschränkenden Bedingungen in der fortlaufenden Kultur erhalten werden kann. Unter Glucoseeinschränkenden Bedingungen verhielt sich CH4ts, im Hinblick auf die erhöhte Ethanol- und Acetoin-Produktion anstelle der Milchsäure-Produktion, wie chemisch erhaltene LDH-defiziente Mutanten von S. rattus (Hillman et al., 1987, Infect. Immun., 55: 1399–1402). Diese Ergebnisse entsprechen Fermentations- und Enzymologie-Studien, die zeigen, dass S. mutans regulierte alternative Signalwege für den Pyruvat-Stoffwechsel besitzt. Unter geeigneten Kulturbedingungen produziert Wildtyp S. mutans, zusätzlich zu Lactat, beträchtliche Mengen an Formiat, Acetat, Ethanol und Acetoin (Yamada et al., 1975, J. Bacteriol., 124: 55–61; Hillman et al., 1987, Infect. Immun., 55: 1399–1402). Diese alternativen Signalwege sind jedoch offensichtlich nicht ausreichend, um die Abwesenheit von LDH-Aktivität zu kompensieren.

Beispiel 5: Die Herstellung von ADH schützt S. mutans vor LDH-Lethalität

Der E. coli-Stamm DH5&agr;, der mit pADH transformiert wurde, das den offenen Leserahmen des adh-Gens von Z. mobilis an die S. mutans-spaP-regulatorischen Sequenzen fusioniert enthält, exprimierte die clonierte ADH-Aktivität (spezifische Aktivität 6,95 &mgr;mol/min/mg Protein). Dieses Ergebnis stimmte mit zuvor publizierten Daten überein, die zeigen, dass der spaP-Promotor und die Ribosomen-Bindungsstelle (rbs) in E. coli aktiv sind (Lee et al., 1988, Infect. Immun., 56: 2114–2119). Der Spiegel an ADH-Aktivität betrug ungefähr 17% von demjenigen, der in DH5&agr; gefunden wurde, die mit pLOI286 transformiert worden waren (spezifische Aktivität 41,8 &mgr;mol/min/mg Protein), das das ursprünglich clonierte adh-Gen und regulatorische Sequenzen aus Z. mobilis enthält. Die Unterbrechung des Ampicillin-Resistenzgens im pCR2-Hintergrund durch Inserierung des Tetracyclin-Resistenzgens aus pVA981 (pADH-tet) beeinflusste den Spiegel an ADH-Aktivität nicht.

Ein Mikrogramm pADH-tet wurde verwendet, um CH4ts zu transformieren. Eine Rekombination vom Campbell-Typ setzte die spaP::adh-Fusion in das Chromosom von CH4ts ein. Die Inserierungsstelle wurde nicht identifiziert, es handelt sich wahrscheinlich aber um einen Homologiebereich, der entweder durch das spaP- oder das endogene adh-Gen bereitgestellt wird.

Transformierte CH4ts wurden ausgewählt für das Wachstum bei 42° C auf Medium, das Tetracyclin enthält. Aus einigen 100 Clonen, die auftraten, enthielt ein aufgereinigtes Isolat, das CH4ts::adh genannt wurde, beträchtlich mehr ADH-Aktivität (spezifische Aktivität, 60,43 &mgr;mol/min/mg Protein) als dessen Wildtyp-Großelter NG8 (spezifische Aktivität, < 1,0 &mgr;mol/min/mg Protein).

CH4ts::adh und NG8 wurden 48 Stunden bei 42°C in Todd-Hewitt-Brühe gezüchtet, die mit 2% Glucose angereichert war. Zellfreie Kulturflüssigkeiten von CH4ts::adh hatten einen signifikant höheren pH-Wert (4,7) und Ethanolgehalt (21,60 mM) als Kulturflüssigkeiten von NG8 (4,0 und < 1 mM). Identische Ergebnisse wurden erhalten, wenn höhere (5, 10 oder 20%) Konzentrationen an Glucose verwendet wurden.

Das Wachstum von CH4ts::adh bei 42°C in definiertem Medium, das mit 0,5% Trypton und verschiedenen Kohlenstoffquellen zu 1% angereichert worden war, wurde mit NG8 verglichen (Tabelle 1).

Die Raten und Zellerträge bei Verwendung von Glucose, Lactose oder Saccharose als Kohlenstollquelle wurden miteinander verglichen. CH4ts::adh hatte beträchtlich kürzere Verdopplungszeiten und höhere Erträge als NG8, wenn Galactose, Sorbit oder Mannit als die Kohlenstoffquelle dienten. Es wurde keine Milchsäure in den Kulturflüssigkeiten von CH4ts::adh nachgewiesen, wenn dieser auf irgendeiner der Kohlenstoffquellen gezüchtet wurde und Ethanol in viel größeren Mengen vorhanden war, als dies für die Kulturflüssigkeiten von NG8 gefunden wurde.

Diese Daten zeigen, dass der rekombinante S. mutans-Stamm CH4ts::adh beträchtlich höhere Spiegel an ADH-Aktivität aufwies, als der NG8 Wildtyp-Kontrollstamm, wenn gleiche Wachstumsbedingungen verwendet wurden. Darüber hinaus wuchsen CH4ts-Transformanten bei der nicht tolerierten (kritischen) Temperatur, was zeigt, dass die clonierte ADH-Aktivität die metabolische Blockade umging, die durch die LDH-Defizienz verursacht wird.

Diese Daten zeigen weiter, dass die Wachstumsraten und Wachstumserträge von CH4ts::adh und NG8 ähnlich sind, wenn Glucose, Lactose oder Saccharose als die einzigen Kohlenstoffquellen dienten und die Wachstumserträge waren ebenfalls vergleichbar. NG8 wuchs unter aerobischen Bedingungen jedoch schlecht, sowohl auf Mannit als auch Sorbit, wohingegen CH4ts::adh gut gewachsen ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass die clonierte ADH-Aktivität ausreichend Ethanol-Produktion bereitstellte, um als geeignetes "Ausgussbecken" für überschüssige Elektronen zu dienen, die während des Polyol-Metabolismus erzeugt wurden. NG8 wuchs auch auf Galactose schlecht. Es ist nicht klar, warum CH4ts::adh auf dieser Kohlenstoffquelle, die über den Tagatose 6-Phosphat-Signalweg in S. mutans metabolisiert wird (Hamilton et al., 1979, J. Bacteriol., 140: 1102–1104), besser wachsen sollte als NG8, insbesondere, da deren Wachstum auf Lactose vergleichbar war.

Beispiel 6: Die Produktion von Pyruvatdecarboxylase schützt nicht vor LDH-Lethalität in S. mutans

Eine Studie, ähnlich der, die in den Beispielen 2–5 beschrieben ist, wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob ein Defekt in der LDH durch die Produktion einer Pyruvatdecarboxylase aufgehoben werden kann. Das Pyruvatdecarboxylase (pdc)-Gen von Z. mobilis (Conway et al., 1987, J. Bacteriol., 169: 949–954) wurde mit spaP fusioniert und in einem Suizid-Vektor in CH4ts eingebracht, wie für das Z. mobilis-adh-Gen beschrieben. Tetracyclin-resistente, PDC-exprimierende Transformanten wurden isoliert und bei der nicht tolerierten (kritischen) Temperatur von 42°C, wie vorstehend beschrieben, getestet. LDH-S. mutans, der die clonierte PDC-Aktivität exprimierte, wuchs nicht bei der nicht tolerierten Temperatur. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Lethalität des LDHDefekts in S. mutans durch die Produktion von PDC nicht aufgehoben werden kann. Darüber hinaus zeigen diese Daten, dass die Konzentration von ADH für den Metabolismus von Pyruvat in LDH-defizienten Mutanten von S. mutans nicht sättigend war.

Beispiel 7: Isolierung von JH1000 und JH1000-Varianten, die erhöhte Spiegel an Bakteriocin-Aktivität produzieren

Die Isolierung von S. mutans-JH1000 ist beschrieben worden (Hillman et al., 1984, Infect. Immun., 44: 141–144). Kurz, JH1000 wurde in frischen Isolaten von Mutans-Streptococcen identifiziert, die von 115 Individuen auf Mitis salivarius-Agar, der Bacitracen enthielt, erhalten wurden. JH1000 hemmte das Wachstum aller anderen S. mutans-Stämme, sowie einer großen Anzahl und Vielfalt von Laborstämmen in einem verzögerten Antagonismus-Test. Der Nachweis zeigt an (Hillman et al., 1984, Infect. Immun., 44: 141–144), dass JH1000 eine kleine (weniger als 1.000 Da) stabile Antibiotikum-ähnliche, Bakteriocin-ähnliche Verbindung produziert, die gegenwärtig charakterisiert wird. Diese Verbindung wird als S. mutans-Bakteriocin bezeichnet. Mikrobiologische und serologische Tests bestätigten, dass JH1000 ein Vertreter der S. mutans-Arten ist. Varianten von Bakteriocin-anfälligen Stämmen, entweder natürlicherweise auftretend oder durch chemische Mutagenese erzeugt, die gegen die Tötungseigenschaften von Bakteriocin resistent sind, sind nicht identifiziert worden. Dieses Ergebnis zeigt an, dass im Gegensatz zu den meisten Antibiotika, das Risiko einer Superinfektion durch resistente Wildtyp-(Krankheits-verursachende) Stämme minimal ist.

Der JH1000-Stamm wurde einer chemischen Mutagenese unterzogen, wobei Ethylmethansulfonat (EMS) entsprechend den im Stand der Technik gut bekannten Verfahren verwendet wurde (Hillman et al., 1978, Infect. Immun., 21: 206–212). JH1005 ist eine exemplarisch EMS-induzierte Variante von JH1000. Varianten, die erhöhte Spiegel an Bakteriocin produzieren, wurden durch Wachstum einer Brühe-Kultur des zu testenden Stammes für 8 Stunden oder mehr identifiziert. Die Kultur wurde zentrifugiert, um die bakteriellen Zellen zu entfernen und 20 &mgr;l-Proben des Kulturüberstandes wurden serienmäßig in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte verdünnt. 100 Mikroliter Top-Agar, der einen Target-Stamm (Zielstamm) enthielt (gewöhnlich S. rattus-BHT-2, StrR) und 1 mg/ml Streptomycin wurden in jede Vertiefung hinzugegeben. Nach Inkubation über Nacht wurde die niedrigste Verdünnung des Indikator-Stammes bestimmt, die das Wachstum verhinderte.

Unter Verwendung dieses Überlagerungs-Verfahrens wurden von EMS-abstammende (JH1005) und spontane (JH1140) Varianten von JH1000 gefunden, die ungefähr dreifach erhöhte Spiegel an Bakteriocin-ähnlicher Aktivität produzieren. JH1000 sowie die JH1000-Varianten produzieren Milchsäure und sind somit für Ersatztherapien zur Verhinderung und/oder Behandlung von Zahnkaries nicht geeignet.

Beispiel 8: Besiedlung der menschlichen Mundhöhle durch S mutans-JH1000-Varianten

Die Besiedlung der Mundhöhle von Nagern und Menschen durch JH1000-Varianten, die erhöhte Bakteriocin-Aktivität besitzen, wurde beschrieben (Hillman et al., 1987, J. Dent. Res., 66: 1092–1094). Kurz, JH1000 oder JH1000-Varianten wurden an den Zähnen von menschlichen Patienten angewandt, wobei eine Infektionskur verwendet wurde, die eine Standard-Zahnprophylaxe beinhaltete, gefolgt von dem Bürsten und Anwenden von Zahnseide aus einer Zellsuspension, die etwa 1011 JH1000-Bakterien oder JH1000-Variante-Bakterien enthält.

Die Spiegel an Bakteriocin-Aktivität und die Fähigkeit, die Mundhöhle zu besiedeln wurden stark miteinander korreliert. Über einen Zeitraum von einem Jahr nach Infektion mit dem JH1005-Stamm wurden die bodenständigen Mutans-Streptococcen stufenweise durch JH1005 ersetzt. Zusätzlich wurde die Gesamtanzahl an Mutans-Streptococcen in zwei der drei getesteten Individuen signifikant erniedrigt.

Beispiel 9: Erzeugung von rekombinanten Mutanten von S mutans, wobei Transposon-Mutagenese des S. mutans-Stammes verwendet wurde

Das Plasmid pTV1-OK ist ein repA(ts)-Derivat des Lactococcus lactis-Plasmids pWV01 (Leenhouts et al., 1991, Plasmid, 26: 55– 66) zur konditionalen Replikation sowohl in S. mutans als auch in E. coli. Es besitzt ein Kanamycin-Resistenzgen im Plasmid-Hintergrund, das sowohl in E. coli als auch S. mutans exprimiert wird und das Transposon Tn917, das in S. mutans Erythromycin-Resistenz verleiht.

Das pTV1-OK-Plasmid wurde in den S. mutans-Stamm-JH1005 eingebracht und transformierte Zellen wurden bei 28°C auf BHI-Agar, der Kanamycin enthielt, ausgewählt. Die Transformation von JH1005 mit 1 mg pTV1-OK-DNA ergab 4 Kanamycin-resistente Transfomanten, was in Übereinstimmung mit den Transformationsfrequenzen aus früheren Experimenten ist (Hillman et al., 1994, Infect. Immun., 62: 60–64). Unabhängige Ereignisse von Tn917-Insertionen in die chromosomale DNA des Wirts wurden durch Temperatursprung (45°C) erzeugt, wie von Camilli et al. beschrieben (1990, J. Bacteriol, 172: 3738– 3744). Kurz, gesättigte Kulturen, die in Anwesenheit von Kanamycin bei der tolerierten Temperatur (28°C) gezüchtet wurden, wurden in 1 : 50 oder 1 : 100 Verdünnungen subkultiviert. Nachfolgend eines Sprungs auf 45°C und Inkubation über Nacht wurden die Inserierungen von Tn917 in das Chromosom des Wirts isoliert, indem Proben auf BHI-Agar ausplattiert wurden, der ausgewählte Konzentrationen von Erythromycin enthielt. Von 90 aus 100 ausgewählten Erythromycin-resistenten Kolonien konnte mit Hilfe von Replika-Filtern (Replika-Abdrücken) gezeigt werden, dass sie sensitiv für Kanamycin sind. Dieser Befund zeigte, dass 90% der Erythromycin-resistenten Clone das Ergebnis des gemeinsam auftretenden Verlusts von pTV1-OK und der Transposition von Tn917 in das JH1005-Chromosom war. Southern-blot-Analyse von zufällig ausgewählten Erythromycinresistenten Mutanten wies darauf hin, dass die Tn917-Transposition zufällig war und in einzelnen chromosomalen Insertionen resultierte. Die Southern Blot-Analyse zeigte auch an, dass die 10% Eythromycin-resistenten/Kanamycin-resistenten Clone das Ergebnis von Replikon-Fusionen waren, die das gesamte pTV1-OK-Plasmid in das JH1005-Chromosom eingebaut hatten.

Unabhängige Vorräte von Kanamycin-sensitiven Clonen wurden auf Bakteriocin-Produktion, Sensitivität für 1% Glycin, Säure-Sensitivität und die Unfähigkeit anaerob auf Mannitol oder in Abwesenheit von D-Alanin-Zusatz zu wachsen, durchmustert. In jeder Kategorie wurden Mutanten in Frequenzen im Bereich von 1 – 2 × 10–3 isoliert.

Die Southern Blot-Analyse von zwei Bakteriocin-defizienten Mutanten zeigte die Existenz von mindestens zwei nicht miteinander verknüpften Genen, die bei der Bakteriocin-Produktion beteiligt sind und mindestens drei nicht miteinander gekoppelten genetischen Loci, die bei der Säure-Sensitivität beteiligt sind. Nach Einbringen der Tn917-induzierten Säure-sensitiven Allele, die aus JH1005 isoliert worden waren, in NG8 mit Hilfe von natürlicher Transformation, wurde das Transposon (das Erythromycin-Resistenz codiert) mit den mutierten Phänotypen in hohen Frequenzen gemeinsam vererbt. Diese Kopplung zeigt an, dass der Verlust, der durch Tn917 induziert wurde, für die mutierten Phänotypen verantwortlich war. Eine Reihe von Tn917-Mutanten wurden mit ähnlichen Transpositionsfrequenzen und Effizienzen an Plasmidverlust in dem natürlich transformierbaren Stamm NG8 nach Temperatursprung erhalten.

Ein Gen, das an der Bakteriocin-Produktion beteiligt ist, wurde in E. coli cloniert, wobei ein Marker-Schutz-Verfahren (marker rescue technique) verwendet wurde. Die chromosomale DNA-Mutante wurde mit EcoRI (das nicht innerhalb von Tn917 spaltet) vollständig gespalten und in die EcoRI-Restriktionsschnittstelle der multiplen Clonierungssequenz von pUCl9 ligiert. Die Bibliothek wurde mit Selektion für Ampicillin-Resistenz in NC1061 transformiert und Kolonien, die entstanden, wurden auf Medium mit Erythromycin repliziert. Von zwei Clonen, die entstanden, wurde gezeigt, dass sie Plasmid-DNA enthalten, die in einer Dot Blot-Analyse mit einer Tn917-Sonde reagierten (hybridisierten). Diese Plasmide werden derzeit sequenziert, wobei Primer verwendet werden, die von den Eryhtromycin-proximalen- und Erythromycin-distalen Enden von Tn917 nach außen lesen.

Dies ist die erfolgreiche Verwendung von Tn917-Mutagenese bei S. mutans und bei oralen Streptococcen. Frühere Fehlversuche, wobei Konstrukte wie pTV1 oder pLTV3 verwendet wurden (Youngman, 1987, In: Plasmids: A Practical Approach, Hardy, Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 79–103; Camilli et al., 1990, J. Bacteriol., 172: 3738–3744), wurden auf die Unfähigkeit des Plasmid-Hintergrundes in S. mutans zu replizieren zurückgeführt. Bei Verwendung der replikativen Funktionen des Lactococcus-Replikons pWV01Ts fand sich, dass pTV1-OK bei der tolerierten Temperatur in S. mutans stabil erhalten werden konnte, wobei ausreichend Gelegenheit für das Auftreten der Tn917-Transposition bei der nicht tolerierten Temperatur bereitgestellt wurde. Somit kann das vorstehend beschriebene Verfahren verwendet werden, um auxotrophe S. mutans-Stämme, sowie andere von S. mutans-abstammende Stämme zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, die die erwünschten Phänotypen besitzen.

Beispiel 10: Erzeugung eines LDH-, ADH+-Bakteriocinproduzierenden S. mutans-Stammes

Das ldh-Gen von JH1000 wurde cloniert und sequenziert (Hillman et al., 1990, Infect. Immun., 58: 1290–1295; Duncan et al., 1991, Infect. Immun., 59: 3930–3934). Kurz, das JH1000-ldh-Gen wurde in dem Escherichia coli-Stamm MC1061 cloniert, wobei pBR322 als der Vektor verwendet wurde. Ein Clon, p10-5, der das ldh-Gen enthält, wurde durch Hybridisierung mit einer Oligonucleotid-Sonde identifiziert, die von der aminoterminalen Sequenz des LDH-Proteins. abstammt, das aus JH1000 gereinigt wurde (Hillman et al., 1990, Infect. Immun., 58: 1290–1295). Diese Ergebnisse wurden überprüft, indem man in ungereinigten zellfreien Extrakten von p10-5/MC1061-Transformanten JH1000-LDH-Aktivität nachwies. Die Nucleotid-Sequenz des clonierten ldh-Gens wurde bestimmt und seine regulatorischen Signale und der offene Leserahmen abgeleitet. Die Sequenz des JH1000-ldh-Gens ist von Genbank mit der Zugangs-Nr. M72545 (Beschreibung LDH SM) erhältlich. Das clonierte ldh-Gen wird durch Spaltung des p10-5-Kontrukts mit dem Restriktionsenzym HpaI inaktiviert. Das resultiert im Entfernen von 510 Basen aus dem ldh-offenen Leserahmen, womit das Gen andauernd inaktiviert wird. Das durch diese Spaltung erhaltene DNA-Fragment von entsprechender Größe wird durch Agarose-Gelelektrophorese wiedergewonnen, mit Mung Bean-Nuclease behandelt, um glatte Enden zu produzieren und durch Umsetzung mit Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert.

Der gesamte offene Leserahmen des Z. mobilis-adh-Gens (mit Ausnahme der Substitution der ersten drei Basen mit einem Guanidin-Rest und der Anfügung eines translationaien und transkriptionalen Codons am Ende des offenen Leserahmens) wird durch PCR amplifiziert. Nach Gelreinigung wird das Fragment mit Mung Bean-Nuclease behandelt, um glatte Enden zu produzieren und durch Umsetzung mit Polynucleotid-Kinase phosphoryliert. Dieses Produkt und das vorstehend beschriebene p10-5-Produkt werden ligiert und in E. coli DHS&agr; mit Selektion für Ampicillin-Resistenz transformiert. Permeabilisierte Zellen gereinigter Clone werden dann, wie vorstehend beschrieben, auf ADH-Aktivität durchmustert. Plasmide von ADH-positiven Clonen werden dann aufgereinigt und durch Restriktionskartierung überprüft, um das genetische Konstrukt zu bestätigen.

Ein solches genetisches Konstrukt wird durch Entfernung des Ampicillin-Resistenzgens aus dem pBR322-Hintergrund und Ersatz durch das Tetracyclin Resistenzgen aus pVA981 weiter modifiziert. Dieses Konstrukt wird verwendet, um JH1140 zu transformieren, die Transformanten werden auf Tetracyclinenthaltendem Medium selektioniert. Heterodiploide Transformanten, die entstehen, werden gereinigt, über Nacht in Todd-Hewitt-Brühe gezüchtet und geeignete Verdünnungen werden auf Glucose-Tetrazolium-Medium ausplattiert. Nach drei Tagen Inkubation in Kerzengläsern (candle jars) werden rote Kolonien, die entstehen, die die Deletion von LDH anzeigen (oder verminderte Säureproduktion anzeigen), isoliert und als putative (vermeintliche) LDH-defiziente Mutanten gereinigt.

Der Phänotyp und der Genotyp der Transformanten wird bestätigt, indem zwei Tage alte Brühe-Kulturen mit Hilfe von Southern Blot-Analyse und durch spektralphotometrische Tests von zellfreien Extrakten auf LDH-Aktivität, wie vorstehend beschrieben, auf Milchsäure und Ethanol getestet werden. Es wird erwartet, dass die Milchsäure-Produktion in diesen Stämmen nicht nachweisbar ist, wohingegen erwartet wird, dass der Ethanolgehalt des Mediums in Brühe, die 1% oder mehr Glucose enthält, etwa 25 mM beträgt. Es wird erwartet, dass die LDH-Aktivität dieser Transformanten nicht nachweisbar ist. Die transformierten Stämme werden weiter durch Testen des Wachstums der parentalen und transformierten Stämme auf verschiedenen Kohlenstoff-Quellen, mit und ohne Sauerstoff, weiter charakterisiert. Es wird erwartet, dass der transformierte Stamm im Hinblick auf die Generationszeit und den Zellertrag genauso gut oder besser wächst als der parentale Stamm. Die parentalen und transformierten Stämme werden auch in Chemostat-Kulturen gezüchtet, um die Fermentations-Endprodukte unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen genau zu bewerten. Es wird erwartet, dass der transformierte Stamm unter allen Züchtungsbedingungen keine nachweisbare Milchsäure produziert und ausschließlich während aerober Inkubation signifikant Acetoin herstellt.

Das kariogene Potenzial des transformierten Stammes wird auch in einem Rattenmodell für Zahnkaries bestimmt, wobei herkömmliche und/oder keimfreie Ratten verwendet werden. Es wird erwartet, dass der transformierte Stamm so gut wie nicht kariogen ist, wohingegen der parentale Stamm Kariesläsionen in starkem Ausmaß und hohem Schweregrad produzieren sollte. Die Plaque-Produktion und Bakteriocin-Produktion durch den transformierten und den parentalen Stamm werden ebenfalls getestet.

Dort wo der transformierte Stamm die vorstehend beschriebenen Erwartungen zumindest minimal befriedigt (d. h, ist defizient für Milchsäure-Produktion und ist nicht kariogen), ist der transformierte Stamm ein rekombinanter S. mutans-Stamm, der für die Verwendung zur Verhinderung oder zur Behandlung von Zahnkaries geeignet ist.

Die nachfolgenden Bakterienstämme sind am oder vor dem 7. Juni 1995 bei der American Type Culture Collection, 1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) hinterlegt worden. Hinterlegung ATCC-Hinterlegungs-Nr. JH1000 HINTERLEGUNGS-NR. 55677 JH1140 HINTERLEGUNGS-NR. 55676

Diese Hinterlegung wurde nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages zur Internationalen Erkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren und den diesen unterliegenden Regularien durchgeführt worden (Budapester Vertrag). Dieser versichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung an. Die Bakterien sind von ATCC entsprechend den Bedingungen des Budapester Vertrages erhältlich und der Anmelder versichert fortlaufende und uneingeschränkte Erhältlichkeit der Nachkommen der Kultur für die Öffentlichkeit, nach Erteilung des entsprechenden U.S. Patents oder nach Offenlegung einer beliebigen U.S. oder fremden Patentanmeldung für die Öffentlichkeit, was auch immer zuerst auftritt, und versichert die Erhältlichkeit der Nachkommen für jemanden, der von dem U. S.-Beauftragten für Patente und Schutzmarken gemäß 35 U.S.C. § 122 bestimmt wurde in diesen entsprechenden Regularien des Beauftragten (einschließlich 37 CFR § 1.14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) dazu befugt zu sein. Der Bevollmächtigte/Rechtsnachfolger der vorliegenden Anmeldung stimmt zu, dass die Kultur-Hinterlegung, falls sie während der Züchtung unter geeigneten Bedingungen sterben sollte oder verloren gehen sollte oder zerstört werden sollte, sie sofort nach Ankündigung mit einer lebensfähigen Probe der gleichen Kultur ersetzt wird. Die Erhältlichkeit des hinterlegten Stammes ist nicht als eine Lizenz zur Durchführung der Erfindung entgegen den gewährten Rechten gemäß der Befugnisse jeder beliebigen Regierung in Übereinstimmung mit deren Patentgesetzen auszulegen.


Anspruch[de]
  1. Rekombinanter Streptococcus mutans-Stamm, gekennzeichnet durch

    (a) eine Defizienz in der Milchsäureherstellung; und

    (b) Herstellung einer rekombinanten Alkoholdehydrogenase.
  2. Stamm nach Anspruch 1, wobei die Milchsäureherstellungsdefizienz durch einen Defekt im Lactatdehydrogenase-Gen verursacht ist.
  3. Stamm nach Anspruch 1 oder 2, wobei das rekombinante Alkoholdehydrogenase-Gen ein Zymomonas mobilis- oder ein Streptococcus rattus-Alkoholdehydrogenase-Gen ist, vorzugsweise das Zymomonas mobilis-Alkoholdehydrogenase-II-Gen.
  4. Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welcher weiter durch die Herstellung eines Bakteriocins gekennzeichnet ist.
  5. Stamm nach Anspruch 4, wobei das Bakteriocin ein Molekulargewicht von weniger als 1000 Dalton und eine antibakterielle Aktivität gegen einen Bakteriocin-empfindlichen Streptococcus mutans-Stamm hat.
  6. Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der für eine organische Substanz auxotroph ist, vorzugsweise für eine D-Aminosäure, und am meisten bevorzugt für D-Alanin.
  7. Stamm nach Anspruch 6, der einen Defekt im Alaninracemase-Gen enthält.
  8. Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der von JH1000 stammt oder von einer Variante des rekombinanten Streptococcus mutans-Stammes nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Variante ein Bacteriocin mit antibakterieller Aktivität gegen einen Bakteriocin-empfindlichen Streptococcus mutans-Stamm erzeugt.
  9. Stamm nach Anspruch 8, wobei die Variante relativ zu Streptococcus mutans-JH1000 mehr Bakteriocin herstellt.
  10. Stamm nach Anspruch 9, wobei die Variante Streptococcus-mutans-JH1140 oder eine Variante davon ist.
  11. Streptococcus mutans-JH1140 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 55676.
  12. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Streptococcus mutans-Stammes nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend die Schritte:

    (a) Transformieren eines Streptococcus mutans-Stammes mit einem Gen, das Alkolioldehydrogenase codiert; und

    (b) Einführen einer Mutation in den Milchsäuresyntheseweg.
  13. Arzneimittel, umfassend einen rekombinanten Streptococcus mutans-Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger:
  14. Arzneimittel nach Anspruch 13, weiter umfassend D-Alanin.
  15. Arzneimittel nach Anspruch 13 oder 14, weiter umfassend ein geschmacksverstärkendes Agens.
  16. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 13 bis 15, formuliert als Mundwasser, Zahnpasta, Kaugummi, Zahnseide, Kautablette, Lyophil oder Kulturmedium.
  17. Verwendung eines rekombinanten Streptococcus mutans-Stammes nach einem der Ansprüche 1 bis 10 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verminderung des Auftretens oder des Schweregrads von Zahnkaries.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei der rekombinante Streptococcus mutans-Stamm in Mundwasser, Zahnpasta, Kaugummi, Zahnseide, einer Kautablette, Lyophil oder Kulturmedium enthalten ist.
  19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, die weiter die Verwendung von D-Alanin zur Herstellung des Arzneimittels umfasst.
  20. Zusammensetzung zum Erhalt eines bakteriellen D-Alanin-Auxothrophs in der Mundhöhle eines Wirts, umfassend D-Alanin.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die bakterielle D-Alanin-Auxothroph-erhaltende Konzentration etwa 0,01 mg/ml bis 167 mg/ml ist.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 21, wobei die Zusammensetzung weiter ein geschmacksverstärkendes Agens umfasst.
  23. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, formuliert als Mundwasser, Zahnpasta, Kaugummi, Zahnseide oder Kautablette.
  24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei das bakterielle D-Alanin-Auxotroph ein D-Alanin-Streptococcus mutans-Auxotroph ist.
Es folgen 4 Blatt Zeichnungen






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