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Dokumentenidentifikation DE69911350T2 08.07.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0001001798
Titel VORBEUGUNG UND BEHANDLUNG EINER DURCH EINEN IMMUNSCHWÄCHEVIRUS AUSGELÖSTEN INFEKTION
Anmelder Teijin Ltd., Osaka, JP;
Thomas Jefferson University, Philadelphia, Pa., US
Erfinder KUBOTA, Satoshi, Philadelphia, US;
POMERANTZ, Roger J., Philadelphia, US;
KITAHARA, Shigehisa, Tokyo 100-8585, JP
Vertreter Müller-Boré & Partner, Patentanwälte, European Patent Attorneys, 81671 München
DE-Aktenzeichen 69911350
Vertragsstaaten DE, ES, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 30.04.1999
EP-Aktenzeichen 999213515
WO-Anmeldetag 30.04.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/06558
WO-Veröffentlichungsnummer 0099056764
WO-Veröffentlichungsdatum 11.11.1999
EP-Offenlegungsdatum 24.05.2000
EP date of grant 17.09.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.07.2004
IPC-Hauptklasse A61K 38/05
IPC-Nebenklasse A61K 31/22   

Beschreibung[de]
TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung einer humanen Immunschwächevirus(HIV)-Infektion, wobei eine zur Vorbeugung oder Behandlung einer HIV-Infektion wirksame Menge einer &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung oder eines oxidierte Dimers, das durch Dehydrierung von zwei identischen Molekülen dieser Art erhalten wird, eingesetzt werden.

HINTERGRUNDWISSEN

Die möglichen hemmende Wirkungen von Antioxidantien einschließlich Glutathion (GSH) und dessen Vorläufer auf den menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1), wurde in den letzten Jahre gründlich untersucht. Anfängliche Studien ergaben, dass reduzierende Verbindungen, wie D-Penicillamin, 2,3-Dimercapto-1-Propanol und N-Acetylcystein (NAC) bei HIV-1 die LTR (long terminal repeat) gesteuerte Transkription der viralen Gene hemmt (FEBS Letters 1988; 236 : 282–286, AIDS Res Human Retroviruses 1990; 7: 919–927, Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 4884–4888, Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986–990). Parallel zu diesen ersten grundlegenden Studien wurde über das Absinken des GSH-Spiegels im Plasma, in den peripheren Blutzellen und in der Lungenepithelflüssigkeit bei mit HIV-1 infizierten Personen berichtet (Biol Chem Hoppe-Seyler 1989; 370: 101–108, AIDS Res Human Retroviruses 1992; 2: 305–311, Lancet 1989; II: 1294–1298). GSH ist nicht nur bekannt als wichtigstes intrazelluläres Antioxidans, sondern auch als Modulator des Immunsystems (J Immunol 1985; 135: 2740–2747). Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Änderung des GSH-Mangels bei HIV-1 infizierten Personen mit Vorläufern von Glutathion eine der vernünftigsten therapeutischen Strategien sei, um das Fortschreiten von HIV-1 in vivo zu verhindern (AIDS Res Human Retroviruses 1992; 8: 209–215, Blood 1995; 86: 258–267, Blood 1996; 87: 4746–4753). Auf diese Weise wurde die hemmende Wirkung von GSH Pro-Pharmaka, wie z. B. NAC, gegen HIV-1 weiter charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass diese Verbindungen in der Lage sind, die Transkription der HIV-1 Gene, die durch den Tumornekrosefaktor &agr; (TNF-&agr;) oder Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) induziert wird, in latenten Proviren zu hemmen. Das ist ein Modell für das zellulare latente Stadium der HIV-1-Infektion (Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986–990, Cell 1990; 61: 1271–1276). Zudem wurde in einem neueren Bericht die Steigerung des HIV-1 Wachstums durch NAC in peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) beschrieben (AIDS 1997; 11: 33–41). Neue Studien haben gezeigt, dass die Replikation von HIV-1 in lymphoretikulären Geweben kontinuierlich aktiv ist (Nature 1993; 362: 355–358, Nature 1993; 312: 359– 362). Deshalb könnte es schwierig sein, eine HIV-1 Infektion signifikant zu verändern nur indem man latente HIV-1 Proviren in einem nicht-replikativen Zustand hält, ohne die massive Produktion von Viren aus den sogenannten spätphase-infizierten Zellen abzustellen und folglich weitere Infektionszyklen auszuschließen. Es wurde angedeutet, dass es kritisch sei könnte, die Beseitigung der spätphase-infizierten Zellen um das Fortschreiten des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) zu verzögern (Science 1996; 272: 1962). Aber es gab keine Verbindungen, die eine selektive Beseitigung von HIV-1 selbst und HIV-1 infizierten Zellen bewirken, obwohl eine Vielzahl von Kandidaten für Anti-HIV-1-Chemotherapeutika beschrieben wurde. Ähnlich wurde, obwohl es verschiedene Berichte gab, die die Anti-HIV-1 Effekte von einer Vielfalt von Antioxidantien beschrieben (FEBS Letters 1988; 236: 282–286, AIDS Res Human Retroviruses 1990; 7: 919–927, Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 4884– 4888, Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986–990), von keiner dieser Verbindungen berichtet, dass sie eine akute HIV-1-Infektion stoppen.

Die &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung der Formel (I):

wobei R eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, substituiert mit einer aromatischen Gruppe ist, oder das oxidierte Dimer, das durch Dehydrierung zwischen zwei &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinestern der Formel (I) erhalten wird, ist bekannt als Antioxidans, das entweder direkt oder als einzigartiges GSH Pro-Pharmakon wirkt, wodurch es vorbeugende oder therapeutische Wirkungen gegenüber Lebererkrankungen, grauem Star, Nierenerkrankungen, Herz- und Leberreperfusionsverletzungen, Arrhytmie und Lungenerkrankungen, wie Asthma zeigt, die durch Schädigungen durch aktiven Sauerstoff und freien Radikalen hervorgerufen werden (WO 88/00182 (→ U.S. Patent No. 4,927,808) and WO 92/18420 (→ U.S. Patent No. 5,631,234)). Insbesondere von &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinethylester (&ggr;-GCE) wurde berichtet, dass es wirksam ist gegenüber grauem Star (Ophthalmic Res 1991; 23: 51–58), Leberschädigung (Res Com Chem Pathol Pharmacol 1993; 82: 49–64), Herz- und Leberreperfusionsverletzungen (Brit J Pharmacol 1991; 104: 805–810, J Am Coll Cardiol 1994; 24: 1391– 1397, Circulation Res 1994; 74: 806–816 und Transplantation 1992; 54: 414–418) und Asthma (Am Rev Respir Dis 1992; 145: 561–565). Aber es gibt keinen Bericht über die Wirkung von &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindungen auf eine HIV-Infektion.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Wirkung von &ggr;-GCE gegen HIV-1, das für die oben erwähnte &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung steht, in vitro untersucht, indem sie (1) eine stark HIV-1-produzierende menschliche T-Lymphozytenzelllinie, ein Modell für eine HIV-1-Produktion von spätphase-infizierten Zellen in einer chronischen HIV-Infektion und (2) HIV-1 beimpfte T-Lymphozyten, ein Modell für eine akute HIV-1-Infektion benutzten, und haben festgestellt, (1) dass &ggr;-GCE, im Gegensatz zu anderen Glutathion Pro-Pharmaka oder anderen Antioxidantien, von denen berichtet wurde, einen neuen zweiphasischen hemmenden Effekt auf chronische HIV-1-Infektion zeigt; der besteht in Folgendem: i) in hohen Dosen, bis zu einer Konzentration von 2,5 mM, bei der weder GSH noch andere GSH-Vorläufer hemmende Wirkung zeigen, hemmt &ggr;-GCE die Produktion von HIV-1 stark durch selektive zytopathisch Wirkung gegenüber infizierten Zellen, während die Lebensfähigkeit und das Wachstum von nicht-infizierten Zellen bei der gleichen Konzentration unbeeinträchtigt sind, ii) in niedrigeren Konzentrationen (200 bis 400 &mgr;M) unterdrückt &ggr;-GCE die virale Produktion von chronisch HIV-1 exprimierenden Zellen signifikant ohne deren Lebensfähigkeit in Mitleidenschaft zu ziehen und iii) der Unterschied der Schwellenwerte für die toxischen Dosen zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen beträgt mehr als Faktor Zehn. Sie haben weiterhin festgestellt (2), dass relativ hohe Dosen von &ggr;-GCE, eingesetzt bei eine akuten HIV-1-Infektion von T-Lymphozyten, die Ausbreitung von HIV-1 gänzlich stoppten und die Zellen vor HIV-1-induziertem Zelltod bewahrten und sie fanden heraus dass &ggr;-GCE in solchen Konzentrationen die Infektionsfähigkeit von HIV-1 innerhalb von vier Stunden direkt hemmt. Solche Ergebnisse weisen darauf hin, dass &ggr;-GCE hervorragende Eigenschaften als Mittel gegen HIV besitzt, es ist nämlich im Stande alle drei kritischen Faktoren einer HIV-Ausbreitung abzuschalten: Es inaktiviert HIV-1 selbst, blockiert eine akute Infektion, unterdrückt die Produktion von Viren durch infizierte Zellen und tötet HIV-1 produzierende Zellen selektiv ab, was noch von keinem anderen Anti-HIV-1 Chemotherapeutikum jemals erreicht wurde.

Aus diesem Grund bezieht sich die vorliegende Erfindung, basierend auf den oben erwähnten Ergebnissen, auf die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung einer menschlichen Immunschwächevirus(HIV)-Infektion aus einer &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung der Formel (I):

wobei R eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, substituiert mit einer aromatischen Gruppe ist, oder das oxidierte Dimer, das durch Dehydrierung zwischen zwei &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinestern der Formel (I) erhalten wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Diese Ergebnisse sind die Mittelwerte von zwei unabhängigen Experimenten.

1 Feld A zeigt, dass 2,5 mM &ggr;-GCE (ausgefüllte Kreise), GSH (Dreiecke) und NAC (Rechtecke) keine negative Wirkung auf das Wachstum der nicht-infizierten menschlichen T-Lymphozyten-Zelllinie H-9, im Vergleich zur Kontrolle (nichtausgefüllte Kreise), haben.

Feld B zeigt, dass 800 &mgr;M &ggr;-GCE (ausgefüllte Kreise) das Wachstum einer chronisch infizierten stark HIV-1-exprimierenden Linie H-9/IIIB (H-9-Zellen, die mit einem HIV-1-Stamm, HIV-1IIIB, infiziert sind) im Vergleich zur Kontrolle (nicht-ausgefüllte Kreise) dramatisch beeinträchtigt. Gleichzeitig wird beobachtet, dass es nach 12 Tagen mit Behandlung kein signifikantes Zellwachstum gibt und, dass die Lebensfähigkeit der Zellen auch auf unter 40% absank (Daten sind nicht abgebildet); das auf eine starke zytopathische Wirkung von &ggr;-GCE gegenüber HIV-1-produzierenden Zellen schließen lässt.

2 zeigt , dass die zytotoxische Wirkung von &ggr;-GCE bei einer Konzentration von 5 mM auf nicht-infizierte H-9-Zellen (A) bezüglich der Größen Lebensfähigkeit und Wachstum nahezu äquivalent ist zu der Wirkung die für 400 &mgr;M auf infizierte H-9/IIIB-Zellen (B) bezüglich der Größen Lebensfähigkeit und Wachstum gezeigt wurde. Das weist darauf hin, dass infizierte Zellen fast 12,5 Mal empfindlicher gegenüber &ggr;-GCE sind als nicht-infizierte Zellen, was eine selektive Toxizität von &ggr;-GCE gegenüber HIV-1-produzierenden Zellen der H-9-Zelllinie bedeutet (Rechtecke: &ggr;- GCE, gepunktet: Kontrolle).

3 zeigt, dass 1,25 mM (A) oder 2,5 mM (B) &ggr;-GCE (ausgefüllte Kreise), das die Lebensfähigkeit von HIV-1-produzierenden H-9-Zellen selektiv vermindert, die logarithmische Produktion von HIV-1 (dargestellt durch das p24-Antigen) von H-9/IIIB-Zellen fast vollständig ausschließt, während weder GSH (Dreiecke) noch NAC (Rechtecke) die starke HIV-1-Produktion von H-9/IIIB bei 1,25 mM (A) in den Griff bekommen können. Vielmehr steigern sie die Virusproduktion bei 2,5 mM (B) im Vergleich zur Kontrolle (nicht-ausgefüllte Kreise), was eine neuartige Eigenschaft von &ggr;-GCE als ein Anti-HIV-1-Mittel beweist.

4 zeigt, dass 200 &mgr;M (ausgefüllte Rechtecke) oder 400 &mgr;M (ausgefüllte Kreise) &ggr;-GCE die starke HIV-1-Produktion (dargestellt durch das Gesamt-HIV-1-p24-Antigen) von H-9/IIIB-Zellen signifikant hemmt ohne die Lebensfähigkeit und das Wachstum von H-9/IIIB-Zellen zu beeinflussen (wie in Beispiel 3 angegeben), was stark im Gegensatz steht zu den Ergebnissen von GSH oder NAC in 3, in der sie die virale Expression in höheren Konzentrationen nicht verändern und somit die Wirksamkeit von &ggr;-GCE als ein GSH-Pro-Pharmakon gegen aktive und kontinuierliche HIV-1-Produktion beweisen, selbst in niedrigen Konzentrationen, die nicht toxisch für infizierte Zellen sind.

5 zeigt, dass 1,6 mM &ggr;-GCE (ausgefüllte Kreise) die Ausbreitung von HIV-1 (dargestellt durch Gesamt-HIV-1-p24-Antigen) über einen Zeitraum von 21 Tagen nach der Infektion vollständig blockiert, während in Gegenwart von 400 bis 800 &mgr;M &ggr;-GCE (jeweils ausgefüllte Dreiecke und ausgefüllte Rechtecke) eine akute Infektion nicht signifikant inhibiert wurde (Feld C) und dass die Zellen mit 1,6 mM &ggr;-GCE fortfahren aktiv zu wachsen, wobei sie während des gesamten Experiments eine hohe Lebensfähigkeit beibehalten, wogegen das Wachstum der Kontrollzellen (nichtausgefüllte Kreise) mit einer massiven HIV-1-Produktion beeinträchtigtes Zellwachstum (Feld A) und Zelltod (Feld B) zeigte.

6 zeigt, dass eine Vorinkubation mit 2,5 mM (ausgefüllte Kreise) und 1,25 mM (Dreiecke) &ggr;-GCE für einen Zeitraum von vier Stunden HIV-1 direkt vollständig inaktiviert, es zeigt sich in akuten Infektionsexperimenten kein Ausbruch einer akuten Infektion mit diesen vorbehandelten Viren, wogegen eine Vorinkubation des Virus mit 625 &mgr;M &ggr;-GCE (Rechtecke) nur eine Verzögerung des Ausbruchs im Vergleich zur Kontrolle (nicht-ausgefüllte Kreise) zeigte.

ARBEITSWEISEN

In der oben erwähnten Formel (I) steht R für eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, substituiert mit einer aromatischen Gruppe. Außerdem bezieht sich das oxidierte Dimer auf ein Dimer, in dem eine Disulfidbrücke (-S-S-) nach Dehydrierung zwischen zwei identischen Molekülen der oben erwähnten Formel (I) gebildet wurde.

Die &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung, angegeben in der oben erwähnten Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer können entsprechend der Methode, beschrieben z. B. in WO 88/00182 (→ U.S. Patent Nummer 4,927,808), einer japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nummer 64-19059 (→ Japanisches Patent Nummer 2569060) und einer japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nummer 64-26516 (→ Japanische geprüfte Patentveröffentlichung Nummer 8-553090) hergestellt werden.

In der oben erwähnten Formel (I), schließen spezifische Beispiele für R eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine N-Hexylgruppe, eine N-Octylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine 2-Methyl-2-Propenylgruppe, eine Cyclohexylgruppe und ein Benzylgruppe ein. Obwohl die Verbindungen, die in der oben erwähnten Formel (I) angegeben sind, alle &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindungen einschließen, in denen eine bestimmte R-Gruppe gebunden ist, beziehen typische Beispiele von dieser Verbindung &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinethylester mit ein.

Im Falle der Anwendung der &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihres oxidierten Dimers als Arzneimittel entsprechend der vorliegenden Erfindung, können diese Verbindungen in ihrer freien Form oder in der Form der pharmakologisch akzeptablen sauren oder basischen Additionssalze eingesetzt werden. Wenn die Verbindungen in Form eines Salzes eingesetzt werden, können die hinzugefügten sauren oder basischen Gruppen entweder anorganische oder organische Verbindungen sein und sind in keiner Weise eingeschränkt, solange sie ausreichend wirksam sind, wenn sie als Salz eingesetzt werden und keine oder geringe Toxizität aufweisen.

Die Verbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer können oral, nicht-oral oder über den Respirationstrakt in der gewünschten Form verabreicht werden, indem sie mit pharmakologisch annehmbaren Trägern, Vehikeln, Lösungsmitteln, Verdünnungsmitteln, Farbstoffen, Konservierungsstoffen, Neutralisierungsmitteln und Stabilisatoren zur sich Vorbeugung und Behandlung in Bezug auf die vorliegende Erfindung gemischt werden.

Orale Präparate können entweder feste Präparate, wie Tabletten, Granulate, Pulver und Kapseln oder flüssige Präparate wie Sirup, Elixiere, Emulsionen und Suspensionen sein. Außerdem können nicht-orale Präparate in Form von Injektionen, Suppositorien oder äußerlichen Präparaten zum Auftragen auf die Haut sein. Diese Präparate werden entsprechend den Routinemethoden hergestellt, indem pharmakologisch akzeptable Adjuvantien der Verbindung mit der oben erwähnten Formel (I) oder ihres oxidierten Dimers zugegeben werden. Darüber hinaus können die Präparate auch entsprechend bekannter Verfahren in Form von zeitverzögert freisetzenden Präparaten hergestellt werden.

Feste Präparate zur oralen Verabreichung werden in Form von Pulvern hergestellt, indem die Verbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer mit einem Vehikel, wie Laktose, Stärke, Cellulosekristall, Methylcellulose, Glycerin, Natriumalginat, Gummiarabikum, Calciumhydrogenphosphat, meta-Magnesium-Alluminiumsilikat, Calciumlaktat, Natriumchlorid, Calciumcarbonat und Kaolin vermischt werden oder sie werden bei Bedarf in Form von Granulaten hergestellt, indem ein sich auflösendes Agens, wie Hydroxypropylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Natriumalginat und Natriumbicarbonat zugefügt wird mit anschließender Granulation. Tabletten werden hergestellt, indem diese Pulver und Granulate so wie sie sind zu Tabletten geformt werden oder indem ein Glanzmittel wie Talk oder Magnesiumstearat zugegeben wird. Darüber hinaus können die oben erwähnten Granulate oder Tabletten mit einer Grundlage, wie Methylmethacrylat-Copolymer oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat beschichtet werden, um ein enteral beschichtetes Präparat zu schaffen, oder sie können mit Ethylcellulose oder einem gehärteten Öl beschichtet werden, um ein zeitverzögert freisetzendes Präparat herzustellen. Kapseln können in Form von harten Kapseln gebildet werden, indem diese mit Pulver oder Granulaten gefüllt werden oder durch Umhüllung mit einem Gelatinefilm in Form von weichen Kapseln gebildet werden, nachdem die Verbindung der oben erwähnten allgemeinen Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer in Glycerin, Polyethylen, Glycol oder Olivenöl usw. suspendiert oder gelöst worden ist.

Flüssige Präparate zur oralen Verabreichung können in Form eines Sirups hergestellt werden, indem die Verbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer zusammen mit einem Süßstoff wie Glycerin oder Sorbit in Wasser aufgelöst werden, oder in Form eines Elixiers, indem Ethanol oder Essenz zugegeben werden oder in Form einer Emulsion oder Suspension hergestellt werden, indem Polysorbat 80, Natriumcarboxymethylcellulose oder Gummiarabikum usw. zugegeben werden.

Präparate zur Injektion werden in Form einer Einzeldosis oder als Präparate zur lang- oder kurzfristigen Injektion zur subcutanen, intramuskulären, intravenösen oder intraarteriellen Injektion hergestellt, indem die Verbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer in destilliertem Wasser zur Injektion zusammen mit einem pH-Regulator wie Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Natriumhydroxid, Salzsäure, Milchsäure oder Natriumlaktat, einem isotonischen Agens wie Glukose oder Natriumchlorid und einem SH-Gruppenstabilisator wie Natriumbisulfit, Ascorbinsäure oder Natriumethylendiamintetraacetat aufgelöst werden und nach einer Sterilfiltration in Ampullen oder Polyethylen- oder Glasbehälter gefüllt werden. Außerdem können Injektionspräparate von der Art, die direkt vor Gebrauch zubereitet werden, im Anschluss an die Zugabe von Dextrin, Cyclodextrin, Mannitol, Gelatine usw. mit Hilfe von Gefriertrocknung unter Vakuum hergestellt werden. Außerdem kann die Verbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer auch in Form eines Injektionspräparats, das Liposome oder Mikrosphären beinhaltet, in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren hergestellt werden.

Suppositorien können durch Erhitzen und Schmelzen der Verbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihres oxidierten Dimers mit Polyethylenglykol, Lanolin, Mono-, Di- oder Triglyceriden von Fettsäuren oder Kakaobutter und durch Beschichten mit Gelatine, etc. hergestellt werden, nachdem man es entweder zum Plastifizieren abkühlen lässt oder es in Sojabohnenöl, Polyethylenglykol usw. suspendiert oder aufgelöst hat.

Präparate zur äußerlichen Anwendung auf der Haut können hergestellt werden, indem die Verbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer zu Polyethylenglykol, weißer Vaseline oder flüssigem Paraffin etc. zugegeben werden und zu einer Salbe, Creme oder zu einem Gel verarbeitet werden.

Präparate, die über den Respirationstrakt verabreicht werden, werden in Form von feinen Granulaten von der Verbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihres oxidierten Dimers unter Einsatz von Routinemethoden zur Inhalation verabreicht. Es ist wünschenswert, dass die feinen Partikel, die das Arzneimittel als wirksame Komponente enthalten, in Form von einem Aerosol oder Pulver vorliegen und eine Partikelgröße von 0,5 bis 50 &mgr;m haben. Beispiele für Vorrichtungen, die eingesetzt werden können, um das Aerosol zu bilden, umfassen Ultraschall- und Druckluftvernebler und Zerstäuber, die niedere Alkane oder fluorierte Alkane als Treibmittel benutzen. Außerdem werden Pulver verabreicht, indem man einen einfachen Inhalator gekoppelt mit einer spontanen oder erzwungenen Inhalation verwendet.

Obwohl es bei der vorliegenden Arzneimittelzubereitung keine bestimmten Einschränkungen für die Konzentration der Verbindung, die in Formel (I) dargestellt ist oder ihr oxidiertes Dimer gibt, sind im allgemeinen 0,1 bis 70 Gew.-% und vorzugsweise 1 bis 50 Gew.-% als Konzentration im Präparat geeignet. Außerdem sind, obwohl es keine Einschränkung für die Dosierung gibt, 0,01 bis 5 g/Tag/Patient und vorzugsweise 0,1 bis 2,5 g/Tag/Patient geeignet. Mit Ausnahme von kontinuierlicher Injektion beträgt die Anzahl der Verabreichungen normalerweise 1 bis 4 Mal pro Tag.

BEISPIELE Beispiel 1 Selektive Cytotoxizität von &ggr;-GCE gegenüber HIV-1-produzierenden Zellen

Die nicht-infizierte menschliche T-Lymphozyten Zelllinie H-9 oder H-9-Zellen, die mit einem HIV-1-Stamm HIV-1IIIB (H-9/IIIB) infiziert sind (Science 1984; 224: 497–500) wurden auf Gewebekulturplatten mit 24 oder 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 2 bis 2,5 × 105/ml geimpft und wurden in RPMI-1640 Gewebekulturmedium, das mit 10 fötalem Rinderserum (FBS = fetal bovine serum) ergänzt war, mit oder ohne Zusatz einer Vielfalt an Konzentrationen von &ggr;-GCE, GSH oder NAC kultiviert. Alle zwei oder drei Tage wurden 50 bis 80% der Zellsuspension entfernt und die gleiche Menge frisches Medium mit der gleichen Konzentration der Verbindung, die analysiert werden sollte, zur weiteren Inkubation zugegeben. Zu den gleichen Zeitpunkten wurden, um den relativen Zellwachstumswert zu ermitteln, mit Hilfe des Trypan-Blau-Ausschlußverfahrens die lebensfähigen Zellen ausgezählt. Gleichzeitig wurde auch die Lebensfähigkeit der Zellen als der prozentuale Anteil der lebensfähigen Zellen an der gesamten Zellpopulation überwacht.

Am Anfang wurden die Wirkungen von &ggr;-GCE auf die Lebensfähigkeit und das Zellwachstum von nicht-infizierten H-9-Zellen im Vergleich mit GSH und NAC bewertet. Bei einer Konzentration von 2,5 mM zeigte &ggr;-GCE keine negative Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen und auf das Zellwachstum (1A). Diese Ergebnisse ähneln ziemlich den Ergebnissen mit GSH oder NAC. Während der 6-tägigen Inkubation sank die Lebensfähigkeit der Zellen in keinem Fall auf unter 90%, mit dem niedrigsten Wert von 91,75 ± 0,45% (mit NAC behandelte Zellen: an Tag 4), dies lässt ebenfalls auf eine geringe Toxizität von &ggr;-GCE gegenüber nicht-infizierten T-Lymphozyten schließen.

Danach wurden Experimente, ähnlich zu den oben Beschriebenen, mit einer chronisch infizierten Zelllinie H-9/IIIB, die HIV-1 stark exprimiert, durchgeführt. Im Gegensatz zu den nicht-infizierten H-9-Zellen zeigten die H-9/IIIB-Zellen überraschenderweise eine außergewöhnlich hohe Empfindlichkeit gegenüber der zytotoxischen Wirkung von &ggr;-GCE. Wie in 1 B dargestellt ist, war das Zellwachstum, bei einer &ggr;-GCE-Konzentration so gering wie 800 &mgr;M, dramatisch eingeschränkt. Am 6. Tag war das Zellwachstum auf einen Wert von weniger als 40% im Vergleich zur Kontrolle gesunken. Nach 12tägiger Behandlung schließlich wurde kein signifikantes Zellwachstum mehr beobachtet. Die Lebensfähigkeit der Zellen sank nach dem 9. Tag auch auf unter 40% (Daten sind nicht abgebildet), was eine relativ hohe Zytotoxizität von &ggr;-GCE gegenüber HIV-1-produzierenden Zellen andeutet.

Um die zytotoxische Wirkung von &ggr;-GCE auf H-9- und H-9/IIIB-Zellen zu vergleichen, wurden eine Auswahl von Konzentrationen von &ggr;-GCE untersucht, um für jede Zelllinie zwei Dosen zu bestimmen, die äquivalente zytotoxische Profile ergaben. Es wurde beobachtet, dass die zytotoxische Wirkung von &ggr;-GCE bei 5 mM auf H-9-Zellen annähernd äquivalent war zu der, die für 400 &mgr;M bei H-9/IIIB-Zellen nachgewiesen wurde (2). Beide Zelllinien wiesen Verringerungen im relativen Zellwachstum auf und minimale Verminderungen der Lebensfähigkeit nach 6 Tagen Behandlung mit &ggr;-GCE. Folglich wurde gezeigt, dass H-9/IIIB-Zellen annähernd 12,5 Mal empfindlicher gegenüber &ggr;-GCE sind als nicht-infizierte Zellen, was für eine selektive Toxizität von &ggr;-GCE auf HIV-1-produzierende Zellen steht.

Wenn man diese Ergebnisse zusammen fügt, zeigt sich, dass &ggr;-GCE bei einer Konzentration zwischen 800 &mgr;M und 2,5 mM in der Lage ist, die Lebensfähigkeit von H-9/IIIB-Zellen zu verändern, während es nicht-infizierte H-9-Zellen nicht in Mitleidenschaft zieht.

Beispiel 2 Wirksame Hemmung der HIV-1-Produktion durch &ggr;-GCE in Dosen, die selektiv das Wachstum und die Lebensfähigkeit von HIV-1-produzierenden H-9-Zellen beeinträchtigen

Im Anschluss an die Entdeckung der unterschiedlichen zytotoxischen Wirkung von &ggr;-GCE in Beispiel 1 wurde die Wirksamkeit einer solchen selektiven Toxizität für die Einschränkung der HIV-1-Produktion ausgewertet.

H-9/IIIB-Zellen wurden gründlich mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und mit einer Dichte von 1 × 105/ml in RPMI-1640/10% FBS mit oder ohne 1,25 mM oder 2,5 mM &ggr;-GCE, GSH oder NAC resuspendiert. Da H-9/IIIB-Zellen beständig eine große Menge an Viruspartikeln produzieren, war die Stimulation mit Faktoren wie TNF-&agr; oder PMA zur Durchführung dieser Experimente nicht nötig. Nach zwei und vier Tagen wurde der Überstand der Kultur abgenommen, zentrifugiert, um die Zellen und Ablagerungen zu entfernen, und ausgewertet, indem die Menge an HIV-1-p24-Antigen bestimmt wurde. Die Messung des HIV-1-p24-Antigens wurde mit Hilfe eines empfindlichen ELISA's (DuPont) durchgeführt.

Weder GSH noch NAC konnten die starke HIV-1-Produktion von H-9/IIIB bewältigen. Im Gegenteil, sie steigerten bei einer Konzentration von 2,5 mM die Virusproduktion, was im Widerspruch zu einem früheren Bericht steht (AIDS 1997; 11: 33–41). 1,25 mM oder 2,5 mM &ggr;-GCE bringt jedoch die logarithmische Produktion von HIV-1 aus H-9/IIIB-Zellen, offensichtlich durch zytotoxische Wirkung fast völlig zum Stillstand (3). Diese Daten zeigen eine neuartige Eigenschaft von &ggr;-GCE als ein Mittel gegen HIV-1.

Beispiel 3 Signifikante Unterdrückung der HIV-1-Produktion durch &ggr;-GCE in Dosen, die die Lebensfähigkeit von HIV-1-produzierenden H-9-Zellen nicht in Mitleidenschaft ziehen

Da &ggr;-GCE ein wirksames Antioxidans ist, wurde die Hemmung von HIV-1 LTR-gerichteter Transkription innerhalb eines nicht-toxischen Bereichs von &ggr;-GCE ebenfalls vorhergesagt. Dennoch wurde vermutet, dass es schwierig für diese Art von Verbindung sein könnte, eine derart beständige und starke retrovirale Produktion zu hemmen.

H-9/IIIB-Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit einer Dichte von 2 × 105/ml in RPMI-1640/10% FBS mit oder ohne 0,2 mM oder 0,4 mM &ggr;-GCE überimpft. Drei und sechs Tage nach Beginn des Experiments, wurde von den Überständen der Kulturen, wie oben beschrieben, Proben genommen. Am dritten Tag wurden 72% von jeder Zellsuspension entfernt und frisches Medium mit einem entsprechenden GSH Pro-Pharmakon zugegeben. Die Werte für die gesamte HIV-1-p24-Antigen-Produktion am sechsten Tag wurden abgeleitet, indem die Rohdaten vom sechsten Tag mit dem Verdünnungsfaktor vom dritten Tag multipliziert wurden.

Die Behandlung von H-9/IIIB-Zellen mit geringen Konzentrationen von &ggr;-GCE ist in 4 dargestellt. Wie erwartet hemmte &ggr;-GCE die starke HIV-1-Produktion von H-9/IIIB-Zellen in niedrigen Konzentrationen (200 &mgr;M und 400 &mgr;M) signifikant, wogegen höhere Konzentrationen von GSH oder NAC die virale Expression nicht veränderten (3). Bei einer solchen Behandlung mit &mgr;-GCE wurde bei beiden Dosen die Lebensfähigkeit der Zellen nicht signifikant in Mitleidenschaft gezogen (> 86%). Langsameres Zellwachstum wurde nur bei einer Konzentration von 400 &mgr;M beobachtet (wie in 2B dargestellt), aber nicht bei 200 &mgr;M (Daten sind nicht abgebildet). Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit von &ggr;-GCE als ein GSH Pro-Pharmakon gegen aktive und kontinuierliche HIV-1-Produktion, sogar in geringen Konzentrationen.

Beispiel 4 Hemmung von akuter HIV-1-Infektion durch &ggr;-GCE

Wenn &ggr;-GCE in der Lage ist, HIV-1-produzierende Zellen wirksam zu beseitigen, wird von ihm erwartet, dass es während einer akuten Infektion die Ausbreitung von HIV-1 über die gesamte Zellpopulation verhindert. Um die Richtigkeit dieser Hypothese zu bestätigen, wurde eine akute Infektionsstudie durchgeführt.

Für diese Experimente, wurde ein HIV-1-Stamm, NL4-3 (J. Virol. 1986; 59: 284–291) vorbereitet, der eher einzusetzen ist als das HIV-1IIIB-Isolat (Science 1984; 224: 497– 500), dem bestimmte virale akzessorische Gene und ihre Translationsprodukte fehlen, von denen für einige bewiesen wurde, dass sie die frühe Phase der Infektion verändern.

Virusbestände des HIV-1NL4-3-Stamms wurden präpariert und wie früher beschrieben (Hum Gene Ther 1995; 6: 1561–1571) titriert. H-9-Zellen (3 × 105 Zellen) wurden in 1 ml Wachstumsmedium mit oder ohne &ggr;-GCE, in einer Auswahl an Konzentrationen, suspendiert und in eine Kammer von einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen geimpft. Eine Virussuspension, die 30 pg HIV-1-p24-Antigen enthielt, wurde zu jeder Kammer zur anfänglichen Infektion dazu gegeben. Die Infektion wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt, dann wurden die Zellen einmal mit PBS und noch einmal mit Wachstumsmedium gewaschen. Der Überstand des letzten Waschens wurde aufbewahrt als der Zeitpunkt Tag 0. Die gewaschenen Zellen wurden in entsprechendem Medium resuspendiert für eine weitere Inkubation bei 37°C. Einmal in drei Tagen wurden die Zellsuspensionen und die Überstände geerntet, um die Zellen zu zählen und um die Menge an HIV-1-p24-Antigen zu bestimmen. Die Messung von Zellwachstum, Lebensfähigkeit und Virusproduktion wurden wie in einem vorhergehenden Abschnitt beschrieben durchgeführt. An den Erntetagen verblieben 200 &mgr;l Zellsuspension in jeder Vertiefung und 800 &mgr;l frisches Medium mit den entsprechenden Konzentrationen an &ggr;-GCE wurden, um das Zellwachstum zu unterstützen, zugegeben außer am 18. Tag, an dem 400 &mgr;l Zellsuspension übrig waren und 600 &mgr;l Medium in jede Vertiefung zugegeben wurden. Die Anzahl der Zellen wurden zu jedem Zeitpunkt dementsprechend bestimmt, basierend auf der Ansammlung von Verdünnungsfaktoren zusammen mit der Häufigkeit der Durchgänge. Die Infektion von H-9-Zellen ohne &ggr;-GCE löste einen Ausbruch der Virusproduktion am 12. bis 15 Tag nach der Infektion aus. Während in Gegenwart von 400 bis 800 &mgr;M &ggr;-GCE eine akute Infektion nicht signifikant unterdrückt wurde, wurde aber bei einer Konzentration von 1,6 mM &ggr;-GCE die Ausbreitung von HIV-1 für den Zeitraum von 21 Tagen nach der Infektion vollständig blockiert (5, Feld C). Während des gesamten Experiments, wuchsen die Zellen mit 1,6 mM &ggr;-GCE aktiv weiter, behielten eine hohe Lebensfähigkeit bei, wogegen das Wachstum der Kontrollzellen mit einer massiven HIV-1-Produktion beeinträchtigtes Zellwachstum (5, Feld A) und Zelltod aufwies ( 5, Feld B). In allen Kontrollzellkulturen mit einer aktiven Produktion von HIV-1 war die Bildung von Synzytia, am 15. Tag und zu späteren Zeitpunkten offensichtlich. Mit 1,6 mM &ggr;-GCE, wurde die Bildung von Synzytia in den Kulturen nicht signifikant beobachtet (Daten sind nicht abgebildet).

Beispiel 5 Direkte Inaktivierung von HIV-1 durch &ggr;-GCE

Die Ergebnisse der akuten HIV-1 Infektionsstudie warfen eine andere Möglichkeit auf und zwar, dass &ggr;-GCE die Infektionsfähigkeit von HIV-1 vor/während des Infektionsprozesses inaktivieren könnte. Zur Untersuchung von dieser desinfizierenden Wirkung von &ggr;-GCE, entwarfen wir eine weitere Serie von Experimenten und führten sie durch.

Ein HIV-1 Virusstamm (NL4-3), der 6 ng von HIV-1-p24-Antigen enthielt, wurde in Gegenwart oder in Abwesenheit von &ggr;-GCE in 20 ml RPMI-1640/10% FBS vier Stunden lang bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde eine akute Infektion von H-9-Zellen durchgeführt, wobei 10 ml von jeder vorbehandelten Virussuspension auf 1 ml der Zellsuspension ohne &ggr;-GCE, so wie es im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist, eingesetzt wurden. Probenentnahme und Versorgung der Zellkultur wurden auch durchgeführt, dabei wurde nach dem gleichen Verfahren, so wie es im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist vorgegangen, ohne jedwedes &ggr;-GCE während des Durchgangs hinzuzufügen.

Überraschendeniveise bewirkte die vierstündige Behandlung mit &ggr;-GCE bei einer Konzentration von 1,25 mM oder 2,5 mM einen Rückgang der Infektionsfähigkeit von HIV-1, es gab selbst 15 Tage nach der Infektion keine virale Produktion. Sogar in der niedrigsten Konzentration (625 &mgr;M) verursachte &ggr;-GCE einige Verzögerung bei der Ausbreitung von HIV-1 in H-9-Zellen. Aber die einstündige Vorinkubation mit der gleichen Konzentration an &ggr;-GCE ergab keine signifikante Beeinflussung der viralen Infektiosität (Daten sind nicht abgebildet). Diese Daten deuten auf die direkte inaktivierende Wirkung von &ggr;-GCE gegenüber HIV-1-Partikeln hin und könnten an der hemmenden Wirkung beteiligt sein, die in akuten Infektionsexperimenten mit HIV-1 beobachtet wurde.


Anspruch[de]
  1. Verwendung einer &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung der Formel (I):
    wobei R eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, substituiert mit einer aromatischen Gruppe, ist, oder des oxidierten Dimers, das durch Dehydrierung zwischen zwei &ggr;-L-Glutamyl-L-Cysteinestern der Formel (I) erhalten wird, zur Herstellung eines Medikaments für die Prävention oder Behandlung einer menschlichen Immunschwächevirus(HIV)-Infektion.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei R eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei R eine Ethylgruppe ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung oder das Dimer in einer Dosierung zwischen 0,01 bis 5 g/Tag verabreicht wird.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Dosierung zwischen 0,01 bis 2,5 g/Tag liegt.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die HIV-Infektion eine neue HIV-Infektion ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die HIV-Infektion eine asymptomatische HIV-Infektion ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die HIV-Infektion eine HIV-Infektion mit AIDS ist.
Es folgen 6 Blatt Zeichnungen






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