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Dokumentenidentifikation DE102004006526A1 02.09.2004
Titel Neues Lysindecarboxylase-Gen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
Anmelder Ajinomoto Co., Inc., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Hirano, Seiko, Kawasaki, Kanagawa, JP;
Yasueda, Hisashi, Kawasaki, Kanagawa, JP
Vertreter Strehl, Schübel-Hopf & Partner, 80538 München
DE-Anmeldedatum 10.02.2004
DE-Aktenzeichen 102004006526
Offenlegungstag 02.09.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.09.2004
IPC-Hauptklasse C12N 1/21
Zusammenfassung Ein Methylophilus-Bakterium, worin ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die mit einer DNA identisch ist, die für ein Protein der folgenden Definition (A) oder (B) codiert, oder ein Gen mit einer solchen Homologie zu der DNA, daß eine homologe Rekombination mit der DNA auftritt, zerstört ist, wodurch die Expression des Gens unterdrückt ist und die intrazelluläre Lysindecarboxylaseaktivität verringert oder ausgeschaltet ist, wird in einem Medium, enthaltend Methanol als Hauptkohlenstoffquelle, zur Herstellung und Anhäufung von L-Lysin in der Kultur gezüchtet, und das L-Lysin wird aus der Kultur gewonnen:
(A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4;
(B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4,
einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste, und mit Lysindecarboxylaseaktivität.

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Lysindecarboxylase-Gen aus Methylophilus-Bakterium, das am Abbau von L-Lysin beteiligt ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch kein Methylophilus-Bakterium, worin die Expression des vorstehend genannten Gens unterdrückt ist, und ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz dieses Bakteriums.

Kurze Beschreibung des Standes der Technik

Lysindecarboxylase ist ein Enzym, das die Reaktion zur Bildung von Cadaverin durch Decarboxylierung von L-Lysin katalysiert. Beispielsweise gibt es in Escherichia coli (E. coli) zwei Enzyme, die als CadA und Ldc bezeichnet werden (WO96/17930). Außerdem wurde aufgrund von Gensequenzinformationen aus Genomen oder experimentellen Ergebnissen vorgeschlagen, daß Lysindecarboxylase in verschiedenen Bakterien, einschließlich Bacillus halodulans, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhimurium, Selenomonas ruminantium, Nicotiana glutinosa und dergleichen, vorhanden ist (KEGG Database (Release 25.0), Januar 2003), Y. Takatsuka, et al., Journal of Bacteriology, Vol. 182, S. 6732–6741 (2000), Y.-S. Lee und Y.-D. Cho, The Biochemical Journal, Vol. 360, S. 657–665 (2001)). Die Existenz des Enzyms ist in Methanol-verwertenden Bakterien jedoch bislang ungewiß.

Inzwischen ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz eines Methylophilus-Bakteriums bekannt und umfaßt das Kultivieren eines Mutantenstammes, der gegen ein Lysinanalogon, wie AEC (S-(2-Aminoethyl)-L-cystein), resistent ist, oder eines rekombinanten Stammes, der einen Vektor mit DNA enthält, die die genetische Information trägt, die an der Biosynthese von L-Lysin beteiligt ist (WO 00/61723). Ein Gen, welches Lysindecarboxylase, abgeleitet aus einem Methylophilus Bakterium, codiert, ist bislang jedoch nicht bekannt, und es gibt bislang keine Berichte über L-Lysin-Produktion unter Verwendung eines Methylophilus-Bakteriums, worin die Expression eines solchen Gens unterdrückt oder ausgeschaltet ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Lysindecarboxylase-Gen aus Methylophilus methylotrophus zu erhalten, welches ein Methanol-verwertendes Bakterium ist, und ein solches Gen zur Herstellung eines L-Lysin-produzierenden Bakteriums der Gattung Methylophilus, worin die Expression des Lysindecarboxylase-Gens in der Zelle unterdrückt ist, zu verwenden. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Kultivieren eines solchen Methylophilus-Bakteriums bereitzustellen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Protein aus der folgenden Gruppe bereitzustellen:

  • (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4;
  • (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste, und mit Lysindecarboxylase-Aktivität.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine DNA bereitzustellen, welche das vorstehend beschriebene Protein codiert.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vorstehend beschriebene DNA bereitzustellen, wobei die DNA aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

  • (a) eine DNA mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 684 bis 2930 in der SEQ ID NO: 3;
  • (b) eine DNA, die mit einer DNA mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 684 bis 2930 in der SEQ ID NO: 3 unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und für ein Protein mit Lysindecarboxylase-Aktivität codiert.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vorstehend beschriebene DNA bereitzustellen, die von einem Chromosom eines Methylophilus-Bakteriums abgeleitet ist.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Methylophilus-Bakterium bereitzustellen, das die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat und so modifiziert ist, daß die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität vermindert oder ausgeschaltet ist.

Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, das vorstehend beschriebene Methylophilus-Bakterium bereitzustellen, worin ein Gen auf einem Chromosom mit einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz der vorstehend beschriebenen DNA identisch ist, zerstört ist, oder ein Gen auf einem Chromosom mit einer Homologie zu der vorstehend beschriebenen DNA in einem solchen Ausmaß, daß eine homologe Rekombination mit der DNA auftritt, zerstört ist, wodurch die Expression des Gens unterdrückt ist und die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität vermindert oder eliminiert ist.

Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bereitzustellen, welches das Kultivieren des vorstehend beschriebenen Methylophilus-Bakteriums in einem Medium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, zur Produktion und Akkumulation von L-Lysin in der Kultur und das Gewinnen des L-Lysins aus der Kultur umfaßt.

Mit der vorliegenden Erfindung wird es möglich, eine neue Lysindecarboxylase und ein für dieses Enzym codierendes Gen bereitzustellen. Außerdem kann durch Kultivieren eines Methylophilus-Bakteriums, das die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat und worin die Expression des Gens unterdrückt ist, L-Lysin effizient hergestellt werden.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Forschungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob Lysindecarboxylase in Methylophilus-Bakterium vorkommt, und sie haben einen offenen Leserahmen (im folgenden als "orf" abgekürzt) mit einer Homologie zu einem bekannten Lysindecarboxylase-Gen, abgeleitet von einer DNA-Sequenz auf dem Genom von Methylophilus methylotrophus, gefunden. Die Homologie der durch dieses Gen codierten Aminosäuresequenz (Anteil identischer Aminosäuren) war 38,18 zu dem cadA-Produkt von Escherichia coli (E. coli K12, NCBI: AAC77092) und 37,85% zu dem ldcC-Produkt desselben Bakteriums (E. coli K12, NCBI: AAC73297). Überdies hatte die durch diesen orf codierte Aminosäuresequenz etwa 38,11 Homologie zu Arginindecarboxylase, welches das Genprodukt von adiA von Escherichia coli ist (E. coli K12, NCBI: AAC77078), und somit war das newldc-Gen identifiziert.

Deshalb haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung versucht, den vorstehend beschriebenen orf von Methylophilus methylotrophus zu zerstören, um dessen Funktion zu untersuchen. Der im Ergebnis erhaltene Stamm wuchs in einem SEII-Medium nicht mehr, worin ein Wildtypstamm von Methylophilus methylotrophus normalerweise wachsen kann. Dies war ein unerwartetes Ergebnis, weil Escherichia coli und dergleichen keine besondere Auxotrophie zeigen, selbst wenn cadA und ldcC deletiert sind.

Da davon ausgegangen wurde, daß ein Nährstoff für Methylophilus methylotrophus aufgrund des Defekts des orf essentiell wurde und nicht in den Komponenten des SEII-Mediums vorhanden war, wurde Cadaverin, ein Abbauprodukt von L-Lysin, oder Agmatin, ein Abbauprodukt von L-Arginin, in einer geeigneten Menge zu dem Medium gegeben. Es zeigte sich, daß der Stamm mit dem Defekt in dem orf in dem Medium wachsen konnte.

Deshalb wurde gefunden, daß in Methylophilus methylotrophus das durch diesen orf codierte Protein für das Wachstum in einem typischen Minimalmedium essentiell ist und daß Cadaverin oder Agmatin für das Wachstum eines Stammes mit einem Defekt im orf notwendig ist.

Ausgehend davon wurde das Gen, das diesen orf enthielt, ldc-Gen genannt.

Wenn die Expression des ldc-Gens in einem L-Lysin-produzierendem Stamm, der von Methylophilus methylotrophus gezüchtet wurde, unterdrückt wurde, wurde die L-Lysin-Produktion verbessert, und somit wurde die vorliegende Erfindung gemacht.

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung eingehend beschrieben.

Die erfindungsgemäße Lysindecarboxylase und die dafür codierende DNA

Die erfindungsgemäße Lysindecarboxylase ist ein Protein, das im folgenden in (A) oder (B) definiert ist:

  • (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4;
  • (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste, und mit einer Lysindecarboxylase-Aktivität.

Die erfindungsgemäße DNA codiert für ein vorstehend in (A) oder (B) definiertes Protein.

Die erfindungsgemäße DNA (im folgenden auch als "ldc-Gen" bezeichnet) kann aus einer chromosomalen DNA eines Methylophilus-Bakteriums, wie Methylophilus methylotrophus, isoliert und erhalten werden. Ein Wildtypstamm von Methylophilus methylotrophus, Stamm AS1 (NCIMB Nr. 10515), ist bei den National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Adresse: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Großbritannien) erhältlich, Obwohl ein typisches Kultivierungsverfahren für diesen Stamm im Katalog von NCIMB beschrieben ist, kann er auch in dem SEII-Medium, das in den Beispielen beschrieben ist, gezüchtet werden.

Die genomische DNA des Stammes AS1 kann durch ein bekanntes Verfahren hergestellt werden, und es kann ein käuflich erwerbbarer Kit für die Herstellung des Genoms eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäße DNA kann durch Synthetisieren von Primern auf der Grundlage der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 684 bis 2930 in der SEQ ID NO: 3 und anschließendes Amplifizieren der DNA durch PCR (Polymerasekettenreaktion) unter Einsatz einer chromosomalen DNA eines Bakteriums, wie Methylophilus-Bakterium, als Matrize erhalten werden. Außerdem kann die erfindungsgemäße DNA auch durch Koloniehybridisierung unter Einsatz einer Sonde, hergestellt auf der Grundlage der vorstehend genannten Nukleotidsequenz oder eines Teilfragments, wobei die Sonde durch PCR amplifiziert wurde, erhalten werden.

Herstellungstechniken für die genomische DNA-Bibliothek, die Hybridisierung, PCR, Herstellung von Plasmid-DNA, Verdauung und Ligation von DNA, Transformation und dergleichen, die für das Klonieren der erfindungsgemäßen DNA eingesetzt werden, sind in Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Third Edition (2001) beschrieben.

Beispiele für in der vorstehend genannten PCR eingesetzten Primer umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, Oligonukleotide der SEQ ID NO: 1 und 2.

Die Nukleotidsequenz des ldc-Gens, isoliert aus dem Genom von Methylophilus methylotrophus, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt. Außerdem ist die Aminosäuresequenz der davon codierten Lysindecarboxylase als SEQ ID NO: 4 gezeigt.

Für die vorstehend genannte Aminosäuresequenz wurde eine bekannte Datenbank auf homologe Aminosäuresequenzen durchsucht. Es wurden dadurch zwei Arten von Lysindecarboxylasen (codiert von cadA und ldcC) und Arginindecarboxylase (codiert von adiA) aus Escherichia coli mit Homologien von 38,18%, 37,85% beziehungsweise 38,11% zu der vorstehend genannten Aminosäuresequenz gefunden. Die Homologien wurden als Anteile identischer Aminosäuren zur Gesamtanzahl der Aminosäurereste der für den Vergleich verwendeten Regionen berechnet.

Die erfindungsgemäße DNA kann für eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehreren Positionen codieren, solange die Aktivität der codierten Lysindecarboxylase nicht wesentlich beeinträchtigt ist. Der Ausdruck "mehrere", der hier verwendet wird, variiert in Abhängigkeit von den Positionen der Aminosäurereste in der dreidimensionalen Struktur des Proteins und der Aminosäureart. Die Aminosäuresequenz kann jedoch eine Sequenz mit 70% oder mehr, vorzugsweise 80% oder mehr, stärker bevorzugt 90% oder mehr Homologie zur Gesamtaminosäuresequenz der Lysindecarboxylase mit der Aktivität von Lysindecarboxylase sein.

Genauer gesagt sind "mehrere" vorzugsweise zwischen 2 und 20, stärker bevorzugt zwischen 2 bis 10. Die vorstehend genannte Aktivität von Lysindecarboxylase bedeutet eine Aktivität zur Katalyse der Reaktion zur Herstellung von Cadaverin durch Decarboxylierung von L-Lysin.

Eine DNA, die für ein Protein codiert, das im wesentlichen mit der vorstehend genannten Lysindecarboxylase identisch ist, kann durch Modifizieren der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Nukleotidsequenz erhalten werden. Beispielsweise kann ortsspezifische Mutagenese eingesetzt werden, so daß Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste an einer spezifischen Stelle auftritt. Außerdem kann eine wie vorstehend beschrieben modifizierte DNA auch durch herkömmlich bekannte Mutationsbehandlungen erhalten werden. Beispiele solcher Mutationsbehandlungen umfassen ein Verfahren zur Behandlung des ldc-Gens in vitro mit Hydroxylamin oder dergleichen, ein Verfahren zur Behandlung eines Mikroorganismus, wie ein Escherichia-Bakterium, enthaltend ein ldc-Gen, mit UV-Bestrahlung oder einem Mutagenisierungsmittel, das üblicherweise bei Mutationsbehandlungen eingesetzt wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder EMS.

Die Substitution, Deletion, Insertion, Addition, Inversion und dergleichen von Nukleotiden, wie vorstehend beschrieben, kann auch eine natürlich auftretende Mutation auf der Basis von beispielsweise einem individuellen Unterschied oder einem Unterschied in der Art der Mikroorganismen, welche das ldc-Gen enthalten, sein.

Eine DNA, die im wesentlichen für dasselbe Protein wie Lysindecarboxylase codiert, kann durch Exprimieren einer solchen DNA mit einer vorstehend beschriebenen Mutation in einer geeigneten Zelle und Untersuchen der Aktivität der exprimierten Lysindecarboxylase erhalten werden. Eine DNA, die im wesentlichen für dasselbe Protein wie Lysindecarboxylase codiert, kann auch durch Isolieren einer DNA, die mit einer DNA mit der Nukleotidsequenz, die den Nukleotidnummern 684 bis 2930 der Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 3 entspricht, oder mit einer Sonde, die aus der Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hergestellt werden kann, hybridisierbar ist und für ein Protein mit Lysindecarboxylase-Aktivität codiert, aus einer Zelle, welche das ldc-Gen mit einer Mutation enthält, erhalten werden.

Die "stringenten Bedingungen" umfassen Bedingungen, unter denen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird und ein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig, diese Bedingung durch Zahlenangaben genau auszudrücken. Beispielsweise umfassen stringente Bedingungen jedoch eine Bedingung, bei der DNAs mit hoher Homologie, wie DNAs mit einer Homologie von 70% oder höher, vorzugsweise 80% oder höher, stärker bevorzugt 90% oder höher, noch stärker bevorzugt 95% oder höher, miteinander hybridisieren, und DNAs mit einer Homologie, die niedriger als vorstehend genannt ist, nicht miteinander hybridisieren. Alternativ dazu umfassen stringente Bedingungen eine Bedingung, bei der DNAs miteinander bei einer Salzkonzentration hybridisieren, die typischen Waschbedingungen bei der Southern Hybridisierung entsprechen, nämlich 1 × SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC, 0,1% SDS, bei 60°C.

Eine Teilsequenz des ldc-Gens kann auch als Sonde eingesetzt werden. Eine solche Sonde kann durch PCR unter Einsatz von Oligonukleotiden, hergestellt auf der Grundlage der Nukleotidsequenz des Gens, als Primer und einem DNA-Fragment, welches das Gen enthält, als Matrize durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden. Wenn ein DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 300 bp als Sonde eingesetzt wird, kann die Waschbedingung für die Hybridisierung beispielsweise 50°C, 2 × SSC und 0,1% SDS sein.

Die Aktivität der Lysindecarboxylase kann durch das Verfahren gemessen werden, das in Y.-S. Lee und Y.-D. Cho, The Biochemical Journal, Bd. 360, S. 657–665 (2001) beschrieben ist.

Das erfindungsgemäße ldc-Gen kann zusätzlich zur Konstruktion eines später beschriebenen Stammes mit zerstörtem ldc-Gen beispielsweise für die Produktion der erfindungsgemäßen Lysindecarboxylase eingesetzt werden. Das heißt, die Lysindecarboxylase kann durch Einführen des ldc-Gens in einen geeigneten Wirtsmikroorganismus zur Expression des Gens produziert werden. Dies kann auf dieselbe Weise durchgeführt werden wie ein übliches Verfahren zur Produktion eines nützlichen Proteins unter Verwendung von Genrekombinationstechniken. Das heißt, eine DNA, die für Lysindecarboxylase codiert, kann in einen Vektor eingebaut werden, der einen geeigneten Promotor enthält, ein Wirt, wie Escherichia coli, kann mit dem erhaltenen rekombinanten Vektor transformiert werden, und die Transformante kann zur Expression des vorstehend genannten Gens kultiviert werden. Beispiele des Wirts umfassen, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe und dergleichen. Der Promotor kann jeder beliebige Promotor sein, der in dem eingesetzten Wirt funktioniert, und Beispiele umfassen lac, trp, tac, trc, recA, T7 (Lecture of Biochemical Experiments, New Edition, Vol. 1, Protein, VI Synthesis and Expression, herausgegeben von Japanese Biochemical Society, S. 166, Yasueda, Matsui, 1992, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin), PGK, ADH1, GPD, MFa1, SUC2, PHO5, GAL1, GAL4 (Lecture of Biochemical Experiments, New Edition, Vol. 1, Protein, VI Synthesis and Expression, herausgegeben von Japanese Biochemical Society, S. 215, Sakai et al., 1992, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin) und dergleichen.

Die Lysindecarboxylase kann aus einem Wirtsmikroorganismus auf dieselbe Weise wie für die Produktion eines üblichen rekombinanten Proteins gewonnen werden.

Methylophilus-Bakterium der vorliegenden Erfindung

Das erfindungsgemäße Bakterium ist ein Methylophilus-Bakterium mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin und ist so modifiziert, daß die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität vermindert oder ausgeschaltet ist.

Ein Beispiel des Methylophilus-Bakteriums umfaßt Methylophilus methylotrophus. Die "Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin", auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, bedeutet die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Bakteriums, die Anhäufung einer signifikanten Menge von L-Lysin in einem Medium zu bewirken, wenn das Bakterium in dem Medium kultiviert wird.

Die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Lysindecarboxylase-Aktivität wird beispielsweise durch Unterdrücken der Expression des ldc-Gens erreicht. Die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Lysindecarboxylase-Aktivität kann auch durch Modifizieren der Struktur des Lysindecarboxylase-Enzyms, das durch dieses Gen codiert wird, zur Verringerung oder Ausschaltung der spezifischen Aktivität der Lysindecarboxylase erreicht werden. Beispiele für ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Methylophilus-Bakteriums, worin die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität verringert oder ausgeschaltet ist, umfassen ein Verfahren zur Behandlung eines Methylophilus-Bakteriums mit UV-Strahlung oder einem Mutagenisierungsmittel, das in üblichen Mutagenisierungsbehandlungen eingesetzt wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder EMS, und das Selektieren eines Mutantenstammes, welcher die verringerte Aktivität von Lysindecarboxylase zeigt.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bakteriums ist ein Methylophilus-Bakterium, worin das ldc-Gen auf einem Chromosom zerstört ist, wodurch die Expression des Gens unterdrückt wird und die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität verringert oder ausgeschaltet ist. Das in dieser Ausführungsform beschriebene ldc-Gen umfaßt ein Gen, das für Lysindecarboxylase mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 codiert, und ein Gen mit einer Homologie zu diesem Gen in einem Ausmaß, daß homologe Rekombination mit dem Gen mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 auftritt. Die vorstehend erwähnte Homologie in einem Ausmaß, daß homologe Rekombination auftritt, ist vorzugsweise 90% oder mehr, stärker bevorzugt 95% oder mehr, insbesondere bevorzugt 99% oder mehr Homologie.

Das ldc-Gen auf einem Chromosom kann durch ein Verfahren auf der Grundlage von Gensubstitution unter Einsatz homologer Rekombination zerstört werden (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. & Mizushima, S. J. Bacteriol., 162, 1196 (1985), wie in den Beispielen beschrieben. Die Fähigkeit, homologe Rekombination zu bewirken, ist eine allgemein in Bakterien vorhandene Eigenschaft, und die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß Gensubstitution unter Einsatz homologer Rekombination auch in Methylophilus-Bakterien möglich ist. Genauer gesagt wird ein Methylophilus-Bakterium mit einer DNA, die das ldc-Gen enthält, das so modifiziert ist, daß keine Lysindecarboxylase produziert wird, die normal funktioniert (ldc-Gen vom Deletionstyp), transformiert, und die Rekombination wird zwischen dem ldc-Gen vom Deletionstyp und dem ldc-Gen auf einem Chromosom bewirkt. Danach wird, wenn die Rekombination erneut an einer Stelle auf dem Chromosom, in die das Plasmid einverleibt wurde, auftritt, das Plasmid aus dem Chromosom eliminiert. Zu diesem Zeitpunkt kann, in Abhängigkeit von der Rekombinationsstelle, das Gen vom Deletionstyp auf dem Chromosom fixiert sein, und das native Gen kann zusammen mit dem Plasmid aus dem Chromosom eliminiert worden sein, oder das native Gen kann auf dem Chromosom fixiert sein, und das Gen vom Deletionstyp kann zusammen mit dem Plasmid aus dem Chromosom entfernt worden sein, Durch Selektieren eines solchen Stammes, in dem das Erstgenannte aufgetreten ist, kann ein Stamm, worin das Gen vom Deletionstyp gegen das native Gen auf dem Chromosom ausgetauscht worden ist, erhalten werden.

Außerdem haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, daß in Methylophilus methylotrophus das Einführen eines zu einem gewünschten Gen homologen Gens in ein Chromosom in der Form eines linearen DNA-Fragments die homologe Rekombination zwischen dem gewünschten Gen auf dem Chromosom und dem homologen Gen auf dem eingeführten linearen DNA-Fragment in der Zelle bewirkte, wodurch eine Gensubstitution erzielt werden konnte, so daß ein solches Verfahren ebenfalls eingesetzt werden kann. Ein Beispiel der Gensubstitution, durchgeführt unter Einsatz dieses Verfahrens, wird in den Beispielen beschrieben.

Beispiele des vorstehend beschriebenen ldc-Gens vom Deletionstyp umfassen Gene, worin Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in der Nukleotidsequenz der codierenden Region bewirkt wird und dadurch die spezifische Aktivität des codierten Proteins verringert oder ausgeschaltet wird, sowie Gene, deren innerer Bereich oder Endbereich der codierenden Region deletiert ist, Gene, in deren codierende Region eine andere Sequenz eingefügt worden ist, und dergleichen. Beispiele anderer Sequenzen umfassen Markergene, wie das Kanamycinresistenzgen.

Die Expression des ldc-Gens auf einem Chromosom kann auch durch Einführen von Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Additionen oder Inversionen eines oder mehrerer Nukleotide in einer Promotorsequenz des Gens zur Verringerung der Promotoraktivität und damit zur Unterdrückung der Expression des Gens auf Transkriptionsebene verringert oder ausgeschaltet werden (vergleiche Rosenberg, M. & Court, D., Ann. Rev. Genetics, 13, S. 319 (1979); Youderian, P., Bouvier, S. & Susskind, M., Cell, 30, S. 843–853 (1982)).

Außerdem kann die Expression des ldc-Gens auch auf Translationsebene durch Einführen einer Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in eine Region zwischen der SD-Sequenz und dem Initiationscodon des Gens unterdrückt werden (vergleiche Dunn, J. J., Buzash-Pollert, E. & Studier, F. W., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 75, S. 2743 (1978)).

Die Modifikation eines Promotors oder einer Region zwischen der SD-Sequenz und dem Initiationscodon, wie vorstehend beschrieben, kann auf dieselbe Weise wie für die vorstehend beschriebene Gensubstitution durchgeführt werden. Ortsspezifische Mutagenese (Kramer, W. & Frits, H. J: Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) und der Einsatz einer Behandlung mit einem chemischen Mittel, wie Natriumhyposulfit oder Hydroxylamin (Shortle, D. und Nathans, D., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 75, 270 (1978)) kann spezifisch eingesetzt werden, um Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion von Nukleotiden in einem Gen zu bewirken.

Ortsspezifische Mutagenese ist ein Verfahren unter Einsatz synthetischer Oligonukleotide, welche eine willkürliche Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion in spezifische Basenpaare einführen kann. Um dieses Verfahren einzusetzen, wird ein Plasmid, welches ein gewünschtes Gen enthält, das cloniert ist und eine bekannte DNA-Nukleotidsequenz enthält, zunächst denaturiert, um einen Einzelstrang zu erhalten. Dann wird ein synthetisches Oligonukleotid, das zu einer Region, worin eine Mutation eingeführt werden soll, komplementär ist, synthetisiert. Bei dieser Synthese wird die Sequenz des synthetischen Oligonukleotids nicht als vollständig komplementäre Sequenz hergestellt, sondern so hergestellt, daß Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer willkürlicher Nukleotide umfaßt sind. Danach wird die einzelsträngige DNA und das synthetische Oligonukleotid, welches Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer willkürlicher Nukleotide umfaßt, hybridisiert, und ein vollständig doppelsträngiges Plasmid wird unter Einsatz eines Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I und T4-Ligase synthetisiert und in kompetente Zellen von Escherichia coli eingeführt. Einige der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Transformanten tragen ein Plasmid, welches das Gen enthält, worin Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide festgelegt ist. Ein ähnliches Verfahren, welches die Einführung einer Mutation in ein gewünschtes Gen ermöglicht und dadurch die Modifikation oder Zerstörung des Gens ermöglicht, umfaßt das rekombinante PCR-Verfahren (PCR Technology, Stockton Press (1989)).

Durch Ersetzen des nativen Gens auf einem Chromosom eines Methylophilus-Bakteriums durch das Gen, in das eine Mutation eingeführt worden ist und das dadurch wie vorstehend beschrieben modifiziert oder zerstört wurde, kann die Expression des ldc-Gens in der Zelle unterdrückt werden.

Das Methylophilus-Bakterium mit verringerter oder ausgeschalteter Lysindecarboxylase-Aktivität ist ein Methylophilus-Bakterium mit einer Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin. Ein Methylophilus-Bakterium mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin, wie ein Stamm von Methylophilus methylotrophus, kann durch Mutagenesebehandlung eines solchen Stammes, der die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin nicht hat oder eine geringe Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat, unter Verleihung einer Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon, wie S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (im folgenden als "AEC" abgekürzt) erhalten werden. Beispiele des Verfahrens zur Mutagenesebehandlung umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, Verfahren zur Behandlung von Zellen von Escherichia coli mit einem chemischen Mutagenisierungsmittel, wie NTG oder EMS, oder mit UV-Strahlung oder dergleichen. Spezifische Beispiele eines solchen Stammes umfassen Methylophilus methylotrophus AJ13608. Dieser Stamm wurde durch Übertragung der AEC-Resistenz auf den Stamm Methylophilus methylotrophus AS1 gezüchtet. Methylophilus methylotrophus AJ13608 wurde am 10. Juni 1999 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (derzeit das unabhängige Verwaltungsinstitut National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-17416. Dann wurde die Hinterlegung am 31. März 2000 in eine internationale Hinterlegung gemäß den Regelungen des Budapester Vertrages umgewandelt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-7112.

Ein Methylophilus methylotrophus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin kann auch durch Einführen einer DNA, die genetische Information trägt, die an der Biosynthese von L-Lysin beteiligt ist, oder durch Verstärken der Expression der DNA mit einer genetischen Rekombinationstechnik gezüchtet werden. Das oder die einzuführenden Gene codieren für ein Enzym des Biosyntheseweges von L-Lysin, wie Dihydrodipicolinatsynthase und Succinyldiaminopimelattransaminase. Im Fall eines Gens für ein Enzym, das einer Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, wie Dihydrodipicolinatsynthase, ist es bevorzugt, ein mutiertes Gen einzusetzen, das für ein Enzym codiert, das frei von Rückkopplungshemmung ist.

Außerdem kann die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin auch durch Verstärken der Aktivität eines Proteins, das an der Sekretion von L-Lysin beteiligt ist, verbessert werden. Beispielsweise ist als ein Protein, das an der Sekretion von L-Lysin beteiligt ist, das LysE-Protein, das durch das lysE-Gen codiert wird, bekannt (M. Vrljic, H. Sahm and L. Eggeling, Molecular Microbiology 22, S. 815–826 (1996); Internationale Patentveröffentlichung WO 97/23597). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten, daß obwohl ein Wildtyp-lysE, abgeleitet aus Brevibacterium Bakterien, in Methylophilus-Bakterien überhaupt nicht funktionierte, dieses Gen modifiziert werden konnte, so daß es in Methylophilus-Bakterien funktionierte. Beispiele solcher Varianten des LysE-Proteins umfassen LysE24, das in den Beispielen beschrieben ist (vergleiche US-2003-0124687-A1).

Das LysE-Protein, das durch das lysE-Gen codiert wird, hat 6 hydrophobe Helixregionen. Einige dieser hydrophoben Regionen sind vermutlich Transmembrandomänen. Es wird auch vermutet, daß eine Region zwischen der dritten und der vierten Region, bezogen auf den N-Terminus, hydrophil ist und eine Schleifenstruktur aufweist. Die Nukleotidsequenz des Wildtyp-lysE und die Aminosäuresequenz des LysE-Proteins von Brevibacterium lactofermentum sind in der SEQ ID NO: 21 und der SEQ ID NO: 22 gezeigt. In dieser Aminosäuresequenz korrespondieren die hydrophoben Helixregionen mit den Aminosäurenummern 5-20, 37-58, 67-93, 146-168, 181-203 und 211-232. Die Schleifenregion entspricht den Aminosäurenummern 94 bis 145.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden, daß das lysE-Gen in Methylophilus-Bakterien letal war, jedoch auch, daß eine DNA, die für eine Variante des LysE-Proteins codiert, welche die Schleifenregion nicht hatte oder im wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices bestand, die Sekretion von L-Lysin aus der Zelle eines Methanol-verwertenden Bakteriums heraus erhöhte (US-2003-0124687-A1). Das lysE24 codiert für ein solches mutiertes LysE-Protein, dem die vorstehend beschriebene Schleifenregion, die in einem Wildtyp-LysE-Protein vorhanden ist, fehlt oder im wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices besteht.

Das vorstehend beschriebene mutierte LysE ist nicht besonders eingeschränkt, solange es eine oder mehrere hydrophobe Helices hat und, wenn es in einem Methanol-verwertenden Bakterium exprimiert wird, zu einer erhöhten Sekretion von L-Lysin führt. Genauer gesagt ist eine DNA, die für ein mutiertes LysE codiert, das alle, nämlich die erste bis sechste hydrophobe Helix, bezogen auf den N-Terminus, codiert, mit umfaßt. Genauer gesagt ist eine DNA, die für ein Peptid codiert, das die erste bis dritte hydrophobe Helix, bezogen auf den N-Terminus, enthält, und eine DNA, die für ein Peptid codiert, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix, bezogen auf den N-Terminus, codiert, mit umfaßt. Das vorstehend genannte lysE24 ist ein Beispiel eines mutierten lysE, das für ein Peptid, das die erste bis dritte hydrophobe Helix enthält, und für ein Peptid codiert, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix enthält. Das lysE24-Gen wird durch eine Mutation im Stoppcodon stromabwärts der Region, die für die dritte hydrophobe Helix codiert, eingeführt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bestätigt, daß wenn eine Region stromabwärts von diesen Stoppcodon deletiert wird, das mutierte lysE24-Gen die Akkumulation von L-Lysin in dem Medium nicht bewirkte, wenn es in dem Methylophilus methylotrophus Stamm AS1 exprimiert wurde. Deshalb wird angenommen, daß ein Peptid, das die erste bis dritte hydrophobe Helix enthält, und ein Peptid, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix enthält, getrennt voneinander translatiert werden und in Methylophilus-Bakterium funktionieren. Die Ergebnisse zeigen, daß die Einführung des lysE24-Gens in ein Methylophilus-Bakterium zu einer Verbesserung der Produktion von L-Lysin führt.

Jeder Mikroorganismus kann eingesetzt werden, um eine DNA zu erzeugen, die für ein Protein codiert, das an der Sekretion von L-Lysin aus der Zelle heraus beteiligt ist, d. h. das lysE-Gen oder sein homologes Gen, solange es eine Variante des Gens hat, welches die L-Lysin-sekretorische Aktivität in einem Methanol-verwertenden Bakterium exprimieren kann.

Genauer gesagt umfassen Beispiele solcher Mikroorganismen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, coryneforme Bakterien, wie Corynebacterium glutamicum und Brevibacterium lactofermentum, Escherichia-Bakterien, wie Escherichia coli, Pseudomonas-Bakterien, wie Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium-Bakterien, wie Mycobacterium tuberculosis und dergleichen.

Um die Expression des Gens zur Lysinsekretion in einem Methanol-verwertenden Bakterium zu verstärken, wird ein Genfragment an einen Vektor ligiert, der in einem Methylophilus-Bakterium funktionieren kann, vorzugsweise ein Mehrkopienvektor, um rekombinante DNA herzustellen, die dann eingesetzt wird, um den Wirt, nämlich das Methanol-verwertende Bakterium, zu transformieren. Alternativ dazu kann das Gen in ein Transposon eingebaut und in ein Chromosom eingeführt werden. Außerdem kann ein Promotor, der eine leistungsfähige Transkription in einem Methanol-verwertenden Bakterium induziert, stromaufwärts von dem Gen ligiert werden.

Um ein gewünschtes Gen, wie ein L-Lysin-Biosynthesegen oder Gen für die L-Lysin-Sekretion, in Methylophilus-Bakterien einzuführen und dessen Expression zu verstärken, kann das Gen an einen Vektor ligiert werden, der in einer Zelle von Methylophilus-Bakterien autonom replizierbar ist, wobei rekombinante DNA hergestellt wird, die dann eingesetzt wird, um Methylophilus methylotrophus beispielsweise durch Elektroporation zu transformieren. Zusätzlich ist es auch möglich, ein gewünschtes Gen in ein Wirtschromosom durch ein Verfahren unter Einsatz von Transduktion, Transposon (D. E. Berg und C. M. Berg, Bio/Technol., 1 S. 417 (1983)), Mu phage (Offengelegtes Japanisches Patent (Kokai) Nr. 2-109985) oder homologe Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)) einzuführen.

Die Vektoren, die in Methylophilus-Bakterien autonom replizierbar sind, umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, RSF1010, ein Vektor mit breitem Wirtsbereich, und Derivate davon, wie pAYC32 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid 16, S. 161–167 (1986)) und pMFY42 (Gene, 44, S. 53 (1990)), pBBR1 und solche, die von Derivaten davon abgeleitet sind (Kovach, M. E., et al., Gene, 166, S. 175–176 (1995)), pRK310 und solche, die von Derivaten davon abgeleitet sind (Hrsg. Murrell, J. C., und Dalton, H., Methane and methanol utilizers, Plenum Press., S. 183–206 (1992)) und dergleichen.

Ein Methylophilus-Bakterium, das die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat und worin die Lysindecarboxylase-Aktivität verringert oder ausgeschaltet ist, kann durch Übertragen der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin auf ein Methylophilus-Bakterium, worin die Lysindecarboxylase-Aktivität verringert oder ausgeschaltet ist, erhalten werden. Außerdem kann ein solches vorstehend erwähntes Bakterium auch durch Modifizieren eines Methylophilus-Bakteriums mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin, so daß die Lysindecarboxylase-Aktivität verringert oder ausgeschaltet ist, erhalten werden.

Produktion von L-Lysin

Die Kultivierung des Methylophilus-Bakteriums, worin die Lysindecarboxylase-Aktivität verringert oder eliminiert ist und das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, in einem Medium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, führt zur Produktion einer erheblichen Menge von L-Lysin und zur Akkumulation des produzierten L-Lysins in dem Medium. Somit ist der Einsatz des erfindungsgemäßen Methylophilus-Bakteriums mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin, worin die Lysindecarboxylase-Aktivität verringert oder ausgeschaltet ist, für die Verbesserung der Akkumulierung von L-Lysin wirksam.

Das für die Produktion von L-Lysin eingesetzte Medium ist ein typisches Medium, das eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Spurennährstoffe, falls erforderlich, enthält. Die Hauptkohlenstoffquelle ist Methanol. Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose und Stärkehydrolysat, Alkohole, wie Glycerin und Sorbitol, und organische Säuren, wie Fumarsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure und Brenztraubensäure, können zusammen eingesetzt werden. Der Ausdruck "Methanol wird als Hauptkohlenstoffquelle eingesetzt" bedeutet, daß der Methanolanteil in der Gesamtkohlenstoffquelle 50% (Gew./Gew.) oder höher, vorzugsweise 80% (Gew./Gew.) oder höher der Gesamtkohlenstoffquelle ist. Wenn Methanol als Kohlenstoffquelle eingesetzt wird, ist deren Konzentration üblicherweise zwischen 0,001 bis 4% (Gew./Vol.), vorzugsweise 0,1% bis 2% (Gew./Vol.). Außerdem ist, wenn Glucose und dergleichen zugegeben werden, deren Konzentration üblicherweise zwischen 0,1% bis 3% (Gew./Gew.), vorzugsweise zwischen 0,1% bis 1% (Gew./Vol.).

Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organische Stickstoffquellen, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas, wäßriges Ammoniak und dergleichen, eingesetzt werden.

Als anorganische Ionen (oder Quellen davon) werden kleine Mengen Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen zu dem Medium gegeben. Als organische Spurennährstoffe werden Vitamin B1, Hefeextrakt und dergleichen in geeigneten Mengen zu dem Medium gegeben.

Die Kultivierung wird vorzugsweise während etwa 16 bis 72 Stunden unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird zwischen 25°C bis 45°C kontrolliert, und der pH-Wert wird während der Kultivierung zwischen 5 bis 8 kontrolliert. Anorganische oder organische saure oder alkalische Substanzen, Ammoniakgas und dergleichen können zur Einstellung des pH-Werts zugegeben werden.

Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung kann L-Lysin aus einer Fermentationsbrühe beispielsweise durch typische Verfahren unter Einsatz von Ionenaustauschharzen, durch Ausfällungsverfahren und dergleichen in Kombination gewonnen werden.

Beispiele

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele eingehender beschrieben.

Beispiel 1: Klonieren des Lysindecarboxylase-Gens (ldc) von Methylophilus methylotrophus

Um eine chromosomale DNA aus Methylophilus methylotrophus AS1 Wildtypstamm zu erhalten, wurde der Stamm AS1 in 50 ml des SEII-Mediums (Zusammensetzung: 5,0 g/l (NH4)2SO4, 1,9 g/l KH2PO4, 1,56 g/l NaH2PO4·2H2O, 200 mg/l MgSO4·7H2O, 72 mg/l CaCl2·6H2O, 5 ug/l CuSO4·5H20, 25 ug/l MnSO4·5H2O; 23 &mgr;g/l ZnSO4·7H2O, 9,7 mg/l FeCl3·6H2O, 0,5% (Vol./Vol.) Methanol) eingeimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Dann wurde die Kulturbrühe zur Gewinnung der Zellen zentrifugiert. Eine chromosomale DNA wurde aus den erhaltenen Zellen unter Einsatz eines käuflich erwerbbaren Kits (Genomic DNA Purification Kit (hergestellt von Edge Biosystems)) gemäß der dort beigefügten Gebrauchsanweisung hergestellt.

Die chromosomale DNA wurde als Matrize zusammen mit den DNA-Primern der SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 eingesetzt, um eine PCR durchzuführen (ein Zyklus, der aus der Denaturierung bei 98°C während 10 Sekunden, dem Annealing bei 55°C während 30 Sekunden und der Verlängerung bei 72°C während 3 Minuten bestand, wurde 25-mal wiederholt). Es wurde Pyorbestpolymerase (Takara Shuzo) eingesetzt. Im Ergebnis wurde ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 3,0 Kilobasenpaaren (im folgenden als "kbp" abgekürzt) erhalten.

Dann wurde das erhaltene Fragment durch das in Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Third Edition (2001) beschriebene Verfahren sequenziert. Es zeigt sich, daß die Region von der Restriktionsenzym-EcoRV-Schnittstelle bis zur Schnittstelle des Restriktionsenzyms DdeI auf dem DNA-Fragment die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 hatte. In dieser DNA-Sequenz war ein offener Leserahmen (im folgenden als "orf" abgekürzt), welcher die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 codiert, enthalten. Dieser orf wurde als orf#3098 bezeichnet. Das Gen, das für die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 codiert, wurde ldc-Gen genannt.

Beispiel 2: Herstellung eines Stammes von Methylophilus methylotrophus mit zerstörtem ldc-Gen (1) Herstellung eines Fragments zur Zerstörung des ldc-Gens

Die in Beispiel 1 erhaltene chromosomale DNA wurde als Matrize zusammen mit den DNA-Primern der SEQ ID NO: 5 und 6 eingesetzt, um eine PCR durchzuführen (Reaktionsbedingungen: TaKaRa Ex Taq wurde eingesetzt, ein Zyklus, der aus der Denaturierung bei 94°C während 30 Sekunden, dem Annealing bei 60°C während 30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion bei 72°C während 2 Minuten bestand, wurde 25-mal wiederholt), wodurch ein Fragment von etwa 1,3 kb erhalten wurde. Die PCR wurde auch unter Verwendung der in der SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigten Primer unter denselben Bedingungen durchgeführt, wobei ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 2,0 kb erhalten wurde.

Eine PCR wurde auch unter Einsatz des Plasmids pKD4 (GenBank Accession Nr. AY048743, Datsenko, K. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (12), 6640–6645 (2000)) als Matrize und den in SEQ ID NO: 9 und 10 gezeigten Primern unter denselben Bedingungen wie vorstehend erwähnt durchgeführt, wobei ein DNA-Fragment, das ein Kanamycinresistenzgen (Km®) enthielt, erhalten wurde (etwa 1,5 kb).

Die drei Arten der vorstehend beschriebenen DNA-Fragmente wurden gemischt und als Matrize zusammen mit den in der SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 gezeigten Primern eingesetzt, um eine PCR durchzuführen (Reaktionsbedingungen: Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt; ein Zyklus, der aus der Denaturierung bei 94°C während 30 Sekunden, dem Annealing bei 60°C während 30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion bei 72°C während 4 Minuten und 30 Sekunden bestand, wurde 25-mal wiederholt), wodurch ein Fragment von etwa 4,7 kb erhalten wurde. Dieses Fragment enthielt das ldc-Gen, das mit dem Kanamycinresistenzgen unterbrochen war. Dieses Fragment wurde unter Einsatz eines käuflich erwerbbaren Kits (Wizard PCR Preps DNA Purification System, hergestellt von Promega) gereinigt und anschließend einer Ethanolpräzipitation unterworfen, und die Präzipitate wurden in TE-Lösung (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA-Lösung) gelöst. Diese DNA-Lösung wurde im folgenden Verfahren als Fragment für die Genzerstörung eingesetzt.

(2) Gewinnung des Stammes von Methylophilus methylotrophus, dem das ldc-Gen fehlt

Dann wurde das Genfragment für die vorstehend beschriebene Genzerstörung in den Methylophilus methylotrophus-Stamm AS1 eingeführt. Das Elektroporationsverfahren (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) wurde für die Transformation eingesetzt. Das genaue Vorgehen ist wie folgt.

Der Methylophilus methylotrophus-Stamm AS1 wurde in einem SEII flüssigen Medium (Methanolkonzentration: 0,5% (Vol./Vol.)) bei 37°C während 16 Stunden unter Rühren kultiviert, und 20 ml der Kulturbrühe wurden 10 Minuten bei 10.000 UpM zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Die Zellen wurden mit 1 mM HEPES-Puffer (pH 7,2, 20 ml) versetzt, darin suspendiert und zentrifugiert, und dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Schließlich wurde 1 ml desselben Puffers zu den Zellen gegeben, um eine Zellsuspension herzustellen, wobei die Elektrozellen für die Elektroporation verwendet wurden. Dann wurde etwa 1 &mgr;g des vorstehend erwähnten DNA-Fragments, enthaltend das mit dem Kanamycinresistenzgen zerstörte ldc-Gen (ldc::Km®), zu 100 &mgr;l der Elektrozellen gegeben, und elektrische Pulse wurden unter den Bedingungen von 18,5 kV/cm, 25 &mgr;F und 200 &OHgr; ausgeübt, um die Elektroporation durchzuführen und dadurch die DNA-Fragmente in die Zellen einzuführen. Das SEII flüssige Medium wurde unmittelbar zu dieser Zellsuspension gegeben, und die Zellen wurden bei 37°C während 3 Stunden kultiviert.

Dann wurde diese Kulturbrühe auf das SEII-Agarmedium, enthaltend 20 &mgr;g/ml Kanamycin, aufgetragen und bei 37°C inkubiert. Nach der Kultivierung während 48 Stunden zeigten sich mehrere zehn Kolonien auf der Platte. Unter diesen wurden 20 Stämme willkürlich ausgewählt, und die Zerstörung des Zielgens in diesen Stämmen wurde durch ein Nachweisverfahren auf der Grundlage der PCR bestätigt. Das heißt, die vorstehend genannten auftretenden Kolonien wurden jeweils in 20 &mgr;l sterilisiertem Wasser suspendiert, mit 5 &mgr;l einer 1 mg/ml Proteinase K und mit 25 &mgr;l P-Lösung (Lösung, die 40 mM Tris, 0,5% Tween 20, 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA (mit HCl auf pH 8,0 eingestellt)) versetzt, gerührt und bei 60°C während 20 Minuten und bei 95°C während 5 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde als Matrize zusammen mit den in der SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 gezeigten Primern eingesetzt, um eine PCR durchzuführen (Reaktionsbedingungen: Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt; ein Zyklus, der aus der Denaturierung bei 94°C während 30 Sekunden, dem Annealing bei 60°C während 30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion bei 72°C während 4 Minuten und 30 Sekunden bestand, wurde 25-mal wiederholt), wodurch die Zerstörung des Zielgens bestätigt wurde. Es wurde gefunden, daß zehn Stämme die gewünschten Stämme mit zerstörtem Gen waren. Deshalb wurde ein Stamm unter diesen als DLC10-Stamm (MLDC-Stamm) bezeichnet und in den folgenden Experimenten eingesetzt.

(3) Phenotyp des Stammes mit einem Defekt im ldc-Gen

Der Stamm DLC10, der wie vorstehend in (2) hergestellt wurde, war ein Stamm, der als Stamm ausgewählt wurde, der auf dem Kanamycin enthaltenden SEII-Agarmedium wachsen konnte. Es wurde jedoch gefunden, daß er nicht weiter wachsen konnte, wenn er auf demselben Agarmedium subkultiviert wurde. Deshalb wurde untersucht, ob die Wachstumshemmung durch die Zugabe von Cadaverin (CAD) und Agmatin (AGM), die Reaktionsprodukte der Lysindecarboxylase (LDC) und Arginindecarboxylase (ADC) sind, zu dem Medium komplementiert werden konnte.

Ein Medium, das aus 4 ml flüssigem SEII-Medium, enthaltend 20 &mgr;g/ml Kanamycin, bestand und mit Cadaverin oder Agmatin bei einer Konzentration von 1 g/l versetzt war, wurde hergestellt. Dann wurde der vorstehend genannte Stamm DLC10 in das Medium eingeimpft und bei 37°C unter Rühren bei 116 UpM kultiviert, und das Wachstum wurde untersucht. Es wurde gefunden, daß der Stamm DLC10 auf dem Medium, das kein Cadaverin oder Agmatin enthielt, nicht wachsen konnte, während der Stamm auf dem Medium, das diese Substanzen enthielt, wachsen konnte. Überdies zeigte die Zugabe von Cadaverin eine bessere Wirkung auf die Wiederherstellung der Wachstumsfähigkeit als die Zugabe von Agmatin.

(4) Bestätigung der Komplementierung des Stammes mit einem Defekt im ldc-Gen durch Einführen von orf#3098

Es wurde untersucht, ob die Cadaverinauxotrophie für das Wachstum des vorstehend beschriebenen Stammes mit einem Defekt im ldc-Gen durch die Einführung des in Beispiel 1 erhaltenen orf#3098 komplementiert werden konnte. Zunächst wurde ein Plasmid für die Einführung von DNA, die nur orf#3098 enthielt, in den Stamm mit dem Defekt im ldc-Gen hergestellt. Die in Beispiel 1 beschriebene chromosomale DNA wurde als Matrize zusammen mit DNA-Primern der SEQ ID NO: 13 und 14 (Sse83871-Schnittstelle wurde an das 5'-Ende ligiert) eingesetzt, um eine PCR durchzuführen (Amplifikationsreaktionsbedingungen: Es wurde Pyrobest DNA-Polymerase, hergestellt von Takara Shuzo, eingesetzt; ein Zyklus, der aus der Denaturierung bei 98°C während 10 Sekunden, dem Annealing bei 55°C während 30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion bei 72°C während 3 Minuten bestand, wurde 25-mal wiederholt). Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 3 kb wurde mit dem Restriktionsenzym Sse8387I (Takara Shuzo) verdaut. Das DNA-Fragment wurde mit dem Vektor pRStac, der auf ähnliche Weise mit Sse8387I verdaut war, ligiert und anschließend einer Dephosphorylierungsbehandlung unterworfen (Ligation Kit Ver. 2, hergestellt von Takara Shuzo). Das Plasmid, das orf#3098 (bezüg(bezüglich dem tac-Promotor in Sinnrichtung) enthielt und wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, wurde pRS-orf#3098 bezeichnet.

Das Plasmid pRStac wurde durch Einführen des tac-Promotors in ein bekanntes Plasmid pRS konstruiert (vergleiche Internationale Patentveröffentlichung in Japanisch (Kohyo) Nr. 3-501682). Das Plasmid pRS hat ein Vektorsegment des Plasmids pVIC40 (Internationale Patentveröffentlichung WO 90/04636, veröffentlichte Internationale Patentanmeldung in Japanisch Nr. 3-501682) und wurde aus pVIC40 durch Deletion einer DNA-Region, welche für das Threoninoperon codiert, das auf dem Plasmid vorhanden ist, erhalten. Das Plasmid pVIC40 ist von dem Vektor pAYC32 mit breitem Wirtsbereich (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986, 16, 161–167), welches ein Derivat von RSF1010 ist, abgeleitet.

Zunächst wurde das Plasmid pRStac mit dem tac-Promotor von dem Plasmid pRS konstruiert. Der pRS-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI verdaut und zu einer Phenol/Chloroformlösung gegeben und zum Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, und die DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von 8 Kilobasenpaaren wurde durch Einsatz von EASY TRAP Ver. 2 (DNA collection kit, Takara Shuzo) gewonnen. Andererseits wurde die tac-Promotorregion durch PCR unter Einsatz des Plasmids pKK223-3 (Expressionsvektor, Pharmacia) als Matrize und den in der SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18 gezeigten Primern amplifiziert (ein Zyklus, der aus Denaturierung bei 94°C während 20 Sekunden, Annealing bei 55°C während 30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C während 60 Sekunden bestand, wurde 30-mal wiederholt). Für die PCR wurde die Pyrobest-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) verwendet. Das DNA-Fragment, welches den amplifizierten tac-Promotor enthielt, wurde unter Einsatz von PCR prep (Promega) gereinigt und dann an den Restriktionsenzymschnittstellen, die vorher in den Primern konstruiert worden waren, d. h. an der EcoRI- und der EcoT22I-Schnittstelle, verdaut. Dann wurde das Reaktionsgemisch zu einer Phenol/Chloroformlösung gegeben und zum Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, und die DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von etwa 0,15 kbp wurde unter Einsatz von EASY TRAP Ver. 2 gewonnen.

Das Verdauungsprodukt des pRS-Vektors, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, und das tac-Promotor-Regionfragment wurden unter Einsatz eines DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Die Ligationsreaktionslösung wurde zur Transformierung von Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) eingesetzt. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium, enthaltend 20 mg/l Streptomycin, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden in ein LB-Flüssigmedium, enthaltend 20 mg/l Streptomycin, eingeimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Die Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRStac erhalten wurde. Ein Plasmid, worin die Transkriptionsrichtungen des Streptomycinresistenzgens auf dem pRS-Vektor und des tac-Promotors identisch waren, wurde als pRStac ausgewählt.

Unter Verwendung des Plasmids pRS-orf#3098, hergestellt wie vorstehend beschrieben, oder pRStac als Kontrollplasmid wurde der Stamm DLC10 durch Elektroporation transformiert und auf dem SEII-Agarmedium (enthaltend 20 &mgr;g/ml Kanamycin, 50 &mgr;g/ml Streptomycin und 1 g/l Cadaverin) selektiert.

Wenn der ausgewählte Stamm DLC10/pRS-orf#3098 in das SEII-Agarmedium, das Cadaverin nicht enthält (enthaltend 20 ug/ml Kanamycin und 50 &mgr;g/ml Streptomycin), eingeimpft wurde, war das Wachstum des Stammes mit dem eingeführten Plasmid pRStacorf#3098 möglich, während der Stamm DLC10/pRStac als Kontrollstamm nicht wachsen konnte. Außerdem wurden Plasmide aus dem Stamm DLC10/pRS-orf#3098 unter Einsatz von Wizard Minipreps, hergestellt von Promega, extrahiert und durch Elektrophorese bestätigt. Es wurde bestätigt, daß der Stamm das gewünschte Plasmid enthielt, und daher wurde gefunden, daß das Protein, das auf dem Plasmid von orf#3098 codiert wird, in trans wirkt, so daß Komplementierung erzielt wurde. Es wird angenommen, daß die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß das Fehlen von orf#3098 die Cadaverinauxotrophie für das Wachstum des Stammes verursachte.

Beispiel 3: Komplementierung des Defekts in orf#3098 in Methylophilus methylotrophus durch Einführen eines ldcC-Gens, abgeleitet von E. coli (1) Herstellung eines Plasmids, welches ein von E. coli abgeleitetes ldcC-Gen trägt

Um zu untersuchen, ob ein von E. coli abgeleitetes ldcC-Gen die Cadaverinauxotrophie des Stammes DLC10 für das Wachstum komplementiert, wurde zunächst ein Plasmid hergestellt, das das von E. coli abgeleitete ldcC trägt. Der E.-coli-Stamm W3110 wurde über Nacht bei 37°C in dem LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl) kultiviert, und eine chromosomale DNA wurde von den erhaltenen Zellen unter Einsatz eines Genomic DNA Purif. Kit, hergestellt von Edge Bio Systems, hergestellt. Diese chromosomale DNA wurde als Matrize zusammen mit DNA-Primern (eine PstI-Schnittstelle wurde an das 5'-Ende ligiert) mit den in der SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16 gezeigten Sequenzen (J. Bacteriol., 179 (14), 4486–4492 (1997)) eingesetzt, um eine PCR durchzuführen (Amplifikationsreaktionsbedingungen: Es wurde die Pyrobest DNA-Polymerase, hergestellt von Takara Shuzo, eingesetzt; ein Zyklus, der aus der Denaturierung bei 98°C während 10 Sekunden, dem Annealing bei 60°C während 30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion bei 72°C während 2 Minuten bestand, wurde 25-mal wiederholt). Das erhaltene DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 2,3 kb wurde mit dem Restriktionsenzym PstI (Takara Shuzo) verdaut. Getrennt davon wurde der Vektor pRStac mit Sse8387I verdaut, dann einer Dephosphorylierungsbehandlung unterzogen und mit dem vorstehend erwähnten PCR-Fragment ligiert (es wurde ein Ligation Kit Ver. 2, hergestellt von Takara Shuzo, eingesetzt). Das Plasmid, welches das ldcC aus E. coli trägt und wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wurde als pRS-ldcC-F (welches ldcC in Vorwärtsrichtung in Bezug auf den tac-Promotor trägt) oder pRS-ldcC-R (welches ldcC in Umkehrrichtung in Bezug auf den tac-Promotor trägt) bezeichnet.

(2) Bestätigung der Komplementierung des Defekts in orf#3098 des Stammes DLC10 durch von E. coli abgeleitetes LDC

Der Stamm DLC10 wurde mit jeweils einem der wie vorstehend beschrieben hergestellten Plasmide durch Elektroporation transformiert, und die Transformanten wurden auf dem SEII-Agarmedium (enthaltend 20 &mgr;g/ml Kanamycin, 50 &mgr;g/ml Streptomycin und 1 g/l Cadaverin) selektiert. Es konnte keine Transformante mit pRStac-ldcC-F erhalten werden, und eine Transformante konnte nur mit pRStac-ldcC-R erhalten werden.

Der Stamm DLC10/pRStac-ldcC-R wurde auf das SEII-Agarmedium aufgetragen, das Cadaverin nicht enthielt (enthaltend 20 &mgr;g/ml Kanamycin und 50 &mgr;g/ml Streptomycin), und es wurde bestätigt, daß der Stamm DLC10/pRStac-ldcC-R wachsen konnte, während der Stamm DLC10/pRS-tac als Kontrollstamm nicht wachsen konnte. Die Ergebnisse zeigen, daß LDC (Lysindecarboxylase) aus E. coli die Cadaverinauxotrophie von Methylophilus methylotrophus mit dem Defekt in orf#3098 komplementieren konnte.

Beispiel 4: Herstellung von L-Lysin durch einen Stamm von Methylophilus methylotrophus mit zerstörtem orf#3098 (ldc-Gen) (1) Konstruktion des Plasmids pRSlysE24 für die L-Lysin-Produktion

Um ein lysE-Gen, welches für ein Protein mit der Aktivität codiert, Lysin in Corynebacterium glutamicum auszuscheiden, in ein Methylophilus-Bakterium einzuführen, wurde ein Plasmid pRSlysE24 für die Expression von lysE unter Einsatz des vorstehend beschriebenen pRStac konstruiert.

Das Plasmid pRStac, hergestellt in Beispiel 2, (4) wurde mit Sse8387I (Takara Shuzo) und SapI (New England Biolabs) verdaut und zu einer Phenol/Chloroformlösung gegeben und zum Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, und DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von etwa 9,0 kbp erhalten wurde.

Das lysE-Genfragment wurde auch durch PCR unter Einsatz eines Chromosoms, extrahiert aus dem Stamm Brevibacterium lactofermentum 2256 (ATCC 13869), als Matrize und den in SEQ ID NO: 19 und 20 gezeigten Primern amplifiziert (Denaturierung bei 94°C während 20 Sekunden, Annealing bei 55°C während 30 Sekunden und Strangverlängerungsreaktion bei 72°C während 90 Sekunden). Für die PCR wurde Pyrobest-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) verwendet. Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Sse8387I und SapI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroformlösung gegeben und unter Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, und DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen, auf 0,8% Agarosegel gereinigt und gewonnen.

Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektors und des lysE-Genregionfragments, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurden unter Verwendung eines DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde eingesetzt, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf LB-Agarmedium, enthaltend 20 mg/l Streptomycin, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium, enthaltend 20 mg/l Streptomycin, eingeimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Rühren kultiviert. Eine Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmen der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei pRSlysE erhalten wurde. In pRSlysE ist das lysE-Gen so angeordnet, daß die Transkriptionsrichtung dieselbe wie diejenige des tac-Promotors ist.

Das wie vorstehend beschrieben hergestellte pRSlysE wurde in den Stamm Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) durch Elektroporation eingeführt (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Es zeigte sich, daß kaum eine Transformante erhalten werden konnte. Außerdem wurde, wenn Nukleotidsequenzen von Plasmiden, die aus mehreren Kolonie-bildenden Stämmen extrahiert wurden, untersucht wurden, eine Mutation in das lysE-Gen eingeführt. Und wenn die Kolonien kultiviert wurden, häufte sich L-Lysin in den Kulturüberständen nicht an. Wenn jedoch viele Kolonien weiter untersucht wurden, konnte ein mutiertes lysE-Gen, das die Fähigkeit zur Bildung von L-Lysin auf Methylophilus-Bakterien übertragen konnte, d. h. funktionieren konnte, durch Analyse von pRSlysE, worin eine Mutation eingeführt war, erhalten werden.

Dieses mutierte lysE-Gen wurde als lysE24-Gen bezeichnet. Die Nukleotidsequenz des lysE24-Gens wurde analysiert, und es wurde gefunden, daß die Mutation nicht zu einer Aminosäuresubstitution, sondern zu einer Unsinnmutation führt, welche ein Stoppcodon in der Nähe des Zentrums der Translationsregion von lysE einführt. Die Nukleotidsequenz des Wildtyp-lysE-Gens und die Aminosäuresequenz, die davon codiert wird, sind in der SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 22 gezeigt. In lysE24 wurde T (Thymin) nach G (Guanin) an der Position 355 des Wildtyp-lysE-Gens, gezeigt in SEQ ID NO: 21, eingeführt. Die Nukleotidsequenz von lysE24 und die Aminosäuresequenz, die davon codiert wird, sind in der SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt. Das Plasmid, welches lysE24 trägt, wurde pRSlysE24 genannt.

(2) Herstellung des Plasmids pRSdapA mit dem dapA*-Gen

Ein Plasmid mit einem Gen, das für Dihydrodipicolinatsynthase codiert, das frei von Rückkopplungshemmung durch L-Lysin (dapA*) ist, wurde als L-Lysin-Biosynthesesystem-Enzymgen hergestellt.

Das in Beispiel 2, (4) hergestellte pRStac wurde mit Sse8387I und XbaI verdaut, zu einer Phenol/Chloroformlösung gegeben und zum Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, und DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt, um ein DNA-Fragment von etwa 9 kbp zu erhalten.

Das bekannte Plasmid RSFD80 (WO 90/16042), welches dieses Gen enthält, wurde als Matrize eingesetzt, um dapA* durch PCR unter Einsatz der in SEQ ID NO: 25 und 26 gezeigten Primer zu amplifizieren (Denaturierung bei 94°C während 20 Sekunden, Annealing bei 55°C während 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C während 60 Sekunden). Für die PCR wurde Pyrobest-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) eingesetzt. Das erhaltene dapA*-Fragment wurde unter Einsatz von PCR prep (Promega) gereinigt und dann mit Restriktionsenzymen Sse8387I und XbaI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroformlösung gegeben und zum Abbruch der Reaktion gemischt. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert worden war, wurde die obere Schicht gewonnen, und DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von etwa 0,1 kbp erhalten wurde.

Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektors und des dapA*-Genregionfragments, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurde unter Einsatz eines DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde zur Transformierung von Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) eingesetzt. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium, enthaltend 20 mg/l Streptomycin, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium, enthaltend 20 mg/l Streptomycin, eingeimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln gerührt. Plasmid-DNA wurde aus der Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmen der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei das Plasmid pRSdapR erhalten wurde. In dem Plasmid pRSdapA ist das dapA*-Gen so angeordnet, daß die Transkriptionsrichtung dieselbe ist wie diejenige des tac-Promotors.

(3) Konstruktion des Plasmids pRSlysEdapA mit dem lysE24-Gen und dem dapA*-Gen

Ein Plasmid, das aus pRSlysE24 bestand und worin das dapA*-Gen eingeführt war, wurde konstruiert, um die kombinierte Wirkung von lysE24 und dapA* zu untersuchen.

Das im Beispiel 4(1) hergestellte pRSlysE24 wurde mit einem Restriktionsenzym SapI verdaut und unter Einsatz eines DNA 8lunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen. Außerdem wurde das in Beispiel 4(2) hergestellte Plasmid pRSdapA mit Restriktionsenzymen EcoRI und SapI verdaut, und ein Fragment von etwa 1 kbp, welches den tac-Promotor und die dapA*-Region enthält, wurde auf einem 0,8% Agarosegel abgetrennt. Das Fragment wurde unter Einsatz von ERSY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo) gewonnen. Das Fragment wurde wie vorstehend beschrieben mit glatten Enden versehen und an das vorstehend genannte Verdauungsprodukt von pRSlysE24 unter Einsatz eines DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert.

Die vorstehend genannte Ligationsreaktionslösung wurde zur Transformation von Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) eingesetzt. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium, enthaltend 20 mg/l Streptomycin, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium, enthaltend 20 mg/l Streptomycin, eingeimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei ein Plasmid pRSlysEdapA erhalten wurde. In dem Plasmid sind das lysE24-Gen und das dapA*-Gen so angeordnet, daß deren Transkriptionsrichtung dieselbe ist.

Der E.-coli-Stamm JM109, transformiert mit dem pRSlysEdapA-Plasmid, wurde als AJ13832 bezeichnet, und dieser Stamm wurde am 4. Juni 2001 bei der unabhängigen Verwaltungsorganisation National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-18371. Dann wurde die Hinterlegung gemäß den Vorgaben des Budapester Übereinkommens am 13. Mai 2002 in eine internationale Hinterlegung mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-8042 umgewandelt.

(4) Einführung des L-Lysin-Produktionsplasmids in den Stamm von Methylophilus methylotrophus mit einem Defekt im orf#3098 (ldc) und L-Lysin-Produktion

Der Einfluß des Defekts in dem ldc-Gen auf die L-Lysin-Produktion von Methylophilus methylotrophus wurde untersucht. Zunächst wurde, da der in Beispiel 2 hergestellte Stamm DLC10 aus einem Wildtypstamm hergestellt worden war, die L-Lysin-Produktionsfähigkeit nicht modifiziert. Deshalb wurde, um den Einfluß des Defekts in ldc auf die L-Lysin-Produktion effektiv zu untersuchen, ein Stamm mit zerstörtem ldc aus dem Stamm Methylophilus methylotrophus AS1, enthaltend pRSlysEdapA, auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2(2) hergestellt. Der erhaltene Stamm wurde als Stamm DLC12/pRSlysEdapA bezeichnet.

Der Stamm AS1/pRSlysEdapA als Kontrollstamm und der Stamm DLC12/pRSlysEdapA wurden auf das SEII-Agarmedium, enthaltend 50 &mgr;g/ml Streptomycin, beziehungsweise auf das SEII-Agarmedium, enthaltend 50 &mgr;g/ml Streptomycin und 1 g/l Cadaverin, aufgetragen und über Nacht bei 37°C kultiviert. Dann wurden die Zellen auf etwa 3 cm2 (Quadratzentimeter) von jeder Mediumoberfläche abgeschabt, in 20 ml SEII-Produktionsmedium, enthaltend 1 g/l Cadaverin (enthaltend 50 &mgr;g/ml Streptomycin), eingeimpft und 67 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die L-Lysinkonzentration in dem Kulturüberstand wurde unter Einsatz eines Aminosäure-Analysiergeräts (Nihin Bunko, HPLC) bestimmt.

Es zeigte sich, daß der Stamm AS1/pRSlysEdapA 1,26 g/l L-Lysin in dem Medium akkumulierte, und daß der Stamm DLC12/pRSlysEdapA 1,79 g/l L-Lysin in dem Medium akkumulierte. Somit konnte bestätigt werden, daß der Defekt in ldc die Produktion von L-Lysin verbesserte.

Während die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen eingehend beschrieben wurde, ist für den Fachmann klar, daß verschiedene Abwandlungen gemacht werden können und Äquivalente eingesetzt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Jedes der vorstehend genannten Dokumente, einschließlich des ausländischen Prioritätsdokuments, JP 200347185, wird in die vorliegende Anmeldung durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.

SEQUENZLISTE

Anspruch[de]
  1. Aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Protein:

    (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4;

    (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste, und mit Lysindecarboxylase-Aktivität.
  2. Aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Protein:

    (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4;

    (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste, wobei das Protein Lysindecarboxylase-Aktivität hat und mindestens 90% Homologie zu SEQ ID NO: 4 aufweist.
  3. DNA, die für ein aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Protein codiert:

    (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4;

    (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste, und mit Lysindecarboxylase-Aktivität.
  4. DNA, die für ein aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Protein codiert:

    (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4;

    (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste, wobei das Protein Lysindecarboxylase-Aktivität hat und mindestens 90% Homologie zu SEQ ID NO: 4 aufweist.
  5. DNA nach Anspruch 3, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:

    (a) eine DNA mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 684 bis 2930 in der SEQ ID NO: 3;

    (b) eine DNA, die mit einer DNA mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 684 bis 2930 in der SEQ ID NO: 3 unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und für ein Protein mit Lysindecarboxylase-Aktivität codiert.
  6. DNA nach Anspruch 3, die von einem Chromosom aus Methylophilus-Bakterium abgeleitet ist.
  7. Methylophilus-Bakterium, welches L-Lysin produziert und so modifiziert ist, daß die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität vermindert oder ausgeschaltet ist.
  8. Methylophilus-Bakterium, welches L-Lysin produziert, wobei ein Gen auf einem Chromosom mit einer Nukleotidsequenz, die zu der DNA nach Anspruch 3 identisch ist, zerstört ist oder ein Gen auf einem Chromosom mit einer solchen Homologie zu der DNA des Anspruchs 3, daß eine homologe Rekombination mit der DNA auftritt, zerstört ist, wodurch die Expression des Gens unterdrückt ist und die intrazelluläre Lysindecarboxylase-Aktivität vermindert oder ausgeschaltet ist.
  9. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, welches das Kultivieren des Methylophilus-Bakteriums nach Anspruch 8 in einem Medium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, das Anhäufen von L-Lysin in der Kultur und das Gewinnen des L-Lysins aus der Kultur umfaßt.
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