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Dokumentenidentifikation DE68929507T2 23.09.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000424437
Titel REKOMBINANTE MYKOBAKTERIELLE EXPRESSIONS-TRÄGER SOWIE DEREN VERWENDUNG
Anmelder Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass., US;
Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University, New York, N.Y., US;
The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University, Stanford, Calif., US
Erfinder BLOOM, R., Barry, Hastings on Hudson, US;
DAVIS, W., Ronald, Palo Alto, US;
JACOBS, R., William, Bronx, US;
YOUNG, A., Richard, Winchester, US;
HUSSON, Robert N., Tacoma Park, US
Vertreter Patentanwälte Wallach, Koch & Partner, 80339 München
DE-Aktenzeichen 68929507
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 07.07.1989
EP-Aktenzeichen 899080287
WO-Anmeldetag 07.07.1989
PCT-Aktenzeichen PCT/US89/02962
WO-Veröffentlichungsnummer 0090000594
WO-Veröffentlichungsdatum 25.01.1990
EP-Offenlegungsdatum 02.05.1991
EP date of grant 17.12.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.09.2004
IPC-Hauptklasse C12N 1/21
IPC-Nebenklasse C12N 15/74   C12N 15/90   C12Q 1/68   A61K 39/04   

Beschreibung[de]
Hintergrund Immunisierung

Die Immunität gegenüber einem Fremd-Antigen (beispielsweise einem Pathogen oder Toxin) kann durch passive Übertragung bzw. Transfer oder aktive Induktion bereitgestellt werden. Im ersteren Fall werden Antikörper gegen das Fremd-Proteinpathogen einem Individuum mit dem Ergebnis injiziert, dass ein kurzzeitiger Schutz bereitgestellt wird. Im letzteren Fall stimuliert die Injektion einer harmlosen (ungefährlichen) Form des Pathogens, eines Bestandteils des Pathogens oder einer modifizierten Form des Toxins (d. h. eines Toxoids) das Immunsystem des Individuums und verleiht einen Langzeitschutz.

Eine aktive Immunität kann induziert werden, vorausgesetzt, dass das Immunsystem eines Individuums hierzu kompetent ist, indem ein geeignetes Antigen verwendet wird, um das Immunsystem zu stimulieren. Beispielsweise hat die Immunisierung (Vakzinierung) mit einer ungefährlichen oder attenuierten Form des Pathogens auf diese Weise eine unmittelbare Immunreaktion zur Folge, ebenso wie ein immunologisches „Gedächtnis", wodurch ebenso ein Langzeitschutz übertragen wird. Im Allgemeinen schließen Vakzine inaktivierte, nicht-pathogene oder attenuierte Formen eines Pathogens oder infektiösen Mittels ein, die Antigen-Determinanten des Pathogens einschließen und somit eine Immunreaktion hervorrufen. In ähnlicher Weise können Toxine, die antigene Substanzen sind, die von Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren erzeugt wurden, zu Toxoiden umgewandelt werden; d. h. sie können modifiziert werden, so dass ihre toxischen Eigenschaften zerstört werden, dass jedoch ihre Antigenität und als Folge ihre Fähigkeit erhalten bleibt, die Produktion von Antitoxin-Antikörpern zu stimulieren und eine aktive Immunität zu erzeugen. Solche Toxoide können für Vakzine gegen das Toxin verwendet werden.

In beiden Fällen – demjenigen, der eine Stimulierung einer Immunreaktion durch Verabreichung einer veränderten Form eines infektiösen Pathogens einschließt, und derjenige, der die Verabreichung eines Toxoids einschließt – sind gegenwärtig verfügbare Verfahren im Allgemeinen wirksam, jedoch ist bekannt, dass Nebenwirkungen bzw. unerwünschte Wirkungen und Todesfälle sich aus der Vakzinierung ergeben können.

Sichere Vakzine wurden nunmehr durch Anwendung einer besseren Kenntnis der Antigen-Determinanten eines Pathogens und der Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken/Gentechnik entwickelt. Es ist beispielsweise möglich, ein Polypeptid (beispielsweise durch chemische Synthese oder Expression von DNA, die das interessierende Polypeptid kodiert) herzustellen, das ein Bestandteil (beispielsweise eine Antigen-Determinante) eines Protein-Antigens ist, von dem bekannt ist, dass es eine Immunreaktion hervorruft. Der Verabreichung des Polypeptids an einen Wirt folgt eine Immunreaktion durch den Wirt auf die Antigen-Determinante. Die Verwendung eines solchen Polypeptids wird nicht vom Risiko einer Infektion begleitet, das die Verwendung von lebenden oder attenuierten Vakzinen begleitet.

Eine Immunisierung (Verabreichung einer Vakzine) ist ein übliches und weit verbreitetes Verfahren, und die Vakzine, die verwendet wird, kann im Wesentlichen „irgendeine Zubereitung sein, die für eine aktive immunologische Prophylaxe vorgesehen ist", einschließlich Zubereitungen aus abgetöteten Mikroben virulenter Stämme, lebenden Mikroben attenuierter Stämme und mikrobiellen, Pilz-, Pflanzen-, Protozoen- oder Metazoen-Derivaten oder Produkten. Stedman's Illustrated Medical Dictionary (24ste Ausgabe), Williams & Wilkins, Baltimore, Seite 1526 (1982). In vielen Fällen müssen die Vakzinen mehr als einmal verabreicht werden, um eine effektive Protektion bzw. Schutz zu induzieren; beispielsweise müssen bekannte Anti-Toxin-Vakzine in vielfachen Dosen verabreicht werden.

Eine Vakzinierung im Kindesalter ist in entwickelten Ländern üblich und im Allgemeinen erfolgreich, in denen ein ausreichender Zugang zu Gesundheitsdienstleistungen besteht und vielfache bzw. multiple Immunisierungen (beispielsweise Immunisierung gegen multiple Pathogene oder serielle oder multiple Immunisierungen gegen ein einzelnes Pathogen) sind möglich. In den Entwicklungsländern ist eine Vakzinierung weit weniger üblich und weit problematischer. Beispielsweise werden ungefähr 20% der 100 Mio. Kinder, die in den Entwicklungsländern jedes Jahr geboren werden, gegen Diphtherie, Persussis, Tetanus, Masern, Poliomyelitis und Tuberkulose geimpft bzw. vakziniert. Es wird geschätzt, dass jedes Jahr 5 Mio. Kinder in den Entwicklungsländern sterben und weitere 5 Mio. Kinder körperlich oder geistig durch diese Krankheiten behindert sind, was vermieden werden könnte, wenn eine geeignete Immunisierung möglich wäre. Die Verfügbarkeit effektiver Vakzinen, die eine Langzeitimmunität mit einer einzigen Verabreichung verleihen könnten, würde sowohl in entwickelten als auch in Entwicklungsländern wertvoll sein.

Eine Vakzinierung von Erwachsenen ist ebenfalls bei der Vorbeugung vieler Krankheiten bei Erwachsenen von Nutzen und, wie es bei Kindern der Fall ist, können diese sich in Entwicklungsländern als schwierig durchzuführen erweisen, insbesondere, wenn vielfache Immunisierungen notwendig sind. Krankheiten wie Lepra, Malaria, Tuberkulose und Poliomyelitis weisen unter anderem unter Erwachsenen in Afrika, Asien und Lateinamerika eine hohe Inzidenz auf und sind die Ursachen tausender Todesfälle pro Jahr.

Es wurden große Anstrengungen auf die Entwicklung von Vakzinen gerichtet, die gegen wichtige Krankheiten gerichtet sind, und es wurden kürzlich Überlegungen vorgebracht, Vakzinvehikel bzw. träger (beispielsweise gentechnisch veränderte Viren) zu verwenden, um Fremdgene zu exprimieren. Beispielsweise wurde ein rekombinantes Vaccinia-Virus, bei dem virale Antigene in den Vaccinia-Virus eingefügt werden, entwickelt. Beispielsweise wurden Hepatitis-B-Gene, Influenza-Virusgene oder DNA, die Tollwut-Virusantigen kodieren, in Vaccinia-Virus-DNA gespleißt, um Vakzinen herzustellen. Panicali, D., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 80: 5364–5368 (1983); Orr, T., Genetic Engineering News, S. 17, (März 1985); Paoletti, E. und D. Panicali, US-Patent 4 603 112.

Es wird jedoch in großem Maße darin übereingestimmt, dass solche rekombinanten Vaccinia-Viren zumindest zwei bedeutende Nachteile als Vakzine aufweisen würden. Es existiert zunächst eine signifikante Mortalität und Morbidität (1 : 100.000), die mit dem Vaccinia-Virus verbunden sind und die nicht behandelbar sind. Zweitens hat eine Vakzinierung mit rekombinanten Vacciniaviren von Individuen, die vorher dem Vaccinia-Virus gegenüber ausgesetzt waren, oftmals keine zufriedenstellende Immunisierung bereitgestellt. Fenner, F., New Approaches to Vaccine Development, R. Bell und G. Torrigiani (Hrsg.), Schwabe & Co., Seite 187 (1984).

Bis heute wurden Vakzinen entwickelt, die, obwohl sie in vielerlei Hinsicht bei der Induktion einer Immunität gegen ein gegebenes Pathogen wirksam sind, mehr als einmal verabreicht werden müssen und nicht dazu in der Lage sein, einen Schutz auf Langzeitbasis gegen ein Pathogen bereitzustellen. Zusätzlich wurde in vielen Fällen (beispielsweise Lepra, Malaria etc.) eine effektive Vakzine bis jetzt nicht entwickelt.

Mycobakterien

Mycobakterien repräsentieren Hauptpathogene von Mensch und Tier. Beispielsweise wird die Tuberkulose bei Menschen durch Mycobakterium (M.) tuberculosis und bei Vieh von Mycobakterium (M.) bovis erzeugt (die auf Menschen und andere Tiere übertragen werden können, bei denen sie Tuberkulose verursachen). Die Tuberkulose bleibt weit verbreitet und ist ein bedeutendes Problem der öffentlichen Gesundheit, insbesondere in Entwicklungsländern. Es wird geschätzt, dass ungefähr 10 Mio. Fälle an Tuberkulose weltweit existieren, mit einer jährlichen Mortalität von 3 Mio. Joint International Union Against Tuberculosis and World Health Organization Study Group, Tubercle, 63: 157–169 (1982).

Die Lepra, die von M. leprae verursacht ist, betrifft über 10 Mio. Menschen in erster Linie in den Entwicklungsländern. Bloom, B. R. und T. Godal, Review of Infectious Diseases 5: 657– 679 (1984). M. tuberculosis und Mykobakterien der Avium-intracellulare-scrofulaceum (MAIS) Gruppe repräsentieren opportunistische Hauptpathogene von Patienten mit erworbener Immundefizienz-Krankheit (AIDS). Centers for Disease Control, Morbidity and Mortality Weekly Report, 34: 774 (1986). M. pseudotuberculosis ist ein Haupt-Pathogen für Vieh.

Andererseits ist der Bacillus Calmette-Guerin (BCG), ein avirulenter Stamm von M. bovis, die am häufigsten verwendete Vakzine in der Welt und wurde für mehr als 50 Jahre als Lebend-Vakzine verwendet. In den letzten 35 Jahren wurde er an über 2,5 Milliarden Menschen verabreicht, mit bemerkenswert geringen Nebenwirkungen (beispielsweise eine geschätzte Mortalität von 60/Milliarde). BCG zeigte in zahlreichen Studien eine protektive Wirksamkeit gegen Tuberkulose. Jedoch wurde kürzlich herausgefunden, dass er bei der Vorbeugung einer Lungentuberkulose in Südindien nicht wirksam war. Tuberculosis Prevention Trial, Madras, Indian Journal of Medical Research, 72 (Erg.): 1–74 (1980).

Somit sind, obwohl zahlreiche Vakzinen einschließlich BCG verfügbar sind, viele in ihrem Wert deswegen beschränkt, weil sie eine nur eingeschränkte Immunreaktion induzieren, in vielfachen Dosen verabreicht werden müssen und/oder Nebenwirkungen aufweisen. In anderen Fällen (beispielsweise Lepra, Malaria) ist eine Vakzine einfach nicht verfügbar. Es wäre deswegen von großem Wert, wenn eine Vakzine gegen ein Pathogen oder Pathogene von Belang verfügbar wäre, die eine Langzeitstimulierung der Immunität in Empfängern bereitstellen würde, die ausreicht, um einen Schutz gegen das Pathogen (die Pathogene) ohne Nebenwirkungen bereitzustellen.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft genetisch rekombinante (gentechnisch veränderte) kultivierbare Mycobakterien, die DNA von Interesse exprimieren, die in das Mycobakterium inkorporiert wurde, die im mycobakteriellen Genom oder extrachromosomal vorliegt, unter Verwendung von gentechnischen Standardtechniken; betrifft Vektoren, die zum Einbringen von DNA von Interesse in Mycobakterien von Nutzen sind; betrifft Verfahren zur Einbringung von DNA in Mycobakterien und betrifft Verfahren zum Einbau oder integrieren von DNA stabil in das mycobakterielle Genom, um genetisch rekombinante Mycobakterien zu erzeugen. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zum Übertragen von genetischem Material zwischen unterschiedlichen Arten von Mikroorganismen mittels gentechnisch veränderter Shuttle-Vektoren, die Shuttle-Plasmide oder Shuttle-Phasmide sind. Diese Shuttle-Vektoren, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, sind zum Transfer genetischen Materials zwischen unterschiedlichen Arten von Mikroorganismen und zur Einbringung von DNA von Interesse in Mycobakterien nützlich.

Rekombinante DNA-Vektoren der vorliegenden Erfindung sind von zweierlei Typen: ein temperiertes Shuttle-Phasmid und ein bakteriell-mycobakterielles Shuttle-Plasmid (beispielsweise E. coli – mucobakterielles Shuttle-Plasmid). Jeder Typ eines rekombinanten Vektors kann verwendet werden, um DNA von Interesse stabil in Mycobakterien einzubringen, in denen die DNA dann exprimiert werden kann. Im Falle des temperierten bzw. gemäßigten Shuttle-Phasmids, das DNA von Interesse einschließt, tritt eine stabile Integration in die mycobakterielle chromosomale oder genomische DNA über eine ortsspezifische Integration ein. Die DNA von Interesse wird als Teil der chromosomalen DNA repliziert. Im Falle des bakteriell-mycobaktierellen Shuttle-Plasmids, das DNA von Interesse einschließt, wird die DNA von Interesse stabil extrachromosomal als Plasmid aufrechterhalten (als Bestandteil des Plasmids). Die Expression der DNA von Interesse tritt extrachromosomal als Plasmid ein (beispielsweise episomal). Beispielsweise wird ein Gen oder Gene von Interesse in ein bakteriell-mycobakterielles Plasmid kloniert und in ein kultivierbares Mycobakterium eingebracht, wo es eine episomale Replikation durchmacht (extrachromosomale Replikation). Als Folge der hierin beschriebenen Arbeiten wurden Promotoren, die in Mycobakterien exprimieren, definiert; beispielsweise wurde gezeigt, dass der Promotor, der eine Kanamycin-Resistenz exprimiert, der Promotor, der eine Chloramphenicol-Resistenz exprimiert und der cl-Promotor in Mycobakterien exprimieren.

Die rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung sind im Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen, durch das genetisches Material zwischen unterschiedlichen Arten von Mikroorganismen übertragen werden kann (beispielsweise zwischen Bakterien und Mycobakterien). Sie haben es möglich gemacht, in Mycobakterien beispielsweise Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis) und Mycobacterium bovis-BCG (BCG), DNA aus anderer Quelle (beispielsweise DNA aus einer anderen Quelle als das Mycobakterium, in der die DNA eingebaut wird – beispielsweise M. smegmatis oder BCG) einzubringen. Die DNA aus einer anderen Quelle bzw. Herkunft wird hierin als DNA von Interesse bezeichnet. Eine solche DNA von Interesse kann irgendeinen Ursprung aufweisen und ist: 1. DNA, die das Gesamte oder einen Teil eines Gens oder von Genen ist, die ein Protein (Proteine) oder ein Polypeptid (Polypeptide) von Interesse kodieren; 2. DNA, die ein oder mehrere selektierbare Marker kodiert; oder 3. DNA, die sowohl einen oder mehrere selektierbare Marker als auch zumindest ein Protein oder Polypeptid von Interesse kodiert. Die Proteine oder Polypeptide von Interesse können beispielsweise Proteine oder Polypeptide sein, gegen die eine Immunreaktion erwünscht ist (Antigen(e) von Interesse), Enzyme, Lymphokine, Immunverstärker und Reportermoleküle von Interesse in einem diagnostischen Kontext.

DNA von Interesse kann in das mycobakterielle Genom eingebaut oder integriert werden und wird als integrierte DNA oder integrierte DNA von Interesse bezeichnet. Als Folge kann die DNA von Interesse stabil in Mycobakterien eingebracht und in diesen exprimiert werden (d. h., die Produktion von Fremdproteinen wird aus der interessierenden DNA durchgeführt, die in den Mycobakterien vorliegt). Alternativ wird die DNA von Interesse in mycobakterielle DNA durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung als Folge einer homologen Rekombination eingebaut. Gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Plasmid zum Einbringen von DNA von Interesse in mycobakterielle Zellen und zur stabilen Integration der DNA in das mycobakterielle Genom verwendet. Das rekombinante Plasmid, das verwendet wird, schließt Folgendes ein: 1. Mycobakterielle Sequenzen (als Plasmid-getragene mycobakterielle Sequenzen bezeichnet), die zum Auftreten einer homologen Rekombination notwendig sind (zwischen Plasmid-getragenen mycobakteriellen Sequenzen und Sequenzen im mycobakteriellen Genom); 2. DNA-Sequenzen, die zur Replikation und Selektion in E. coli notwendig sind; und 3. DNA von Interesse (beispielsweise DNA, die einen selektierbaren Marker kodiert und DNA, die ein Protein oder Polypeptid von Interesse kodiert). Das rekombinante Plasmid wird in mycobakterielle Zellen unter Verwendung bekannter Techniken eingebracht. Die mycobakteriellen Sequenzen im Plasmid können mit solchen identisch sein, die im mycobakteriellen Genom vorliegen, oder können solchen, die im mycobakteriellen Genom vorliegen, so ausreichend ähnlich sein, dass eine homologe Rekombination möglich gemacht wird. Eine „Erkennung" einer Homologie von Sequenzen, die in der Plasmid-getragenen mycobakteriellen DNA vorliegen und identischer oder ausreichend ähnlicher Sequenzen, die im mycobakteriellen Genom vorliegen, hat ein cross-over zwischen den homologen Bereichen der hinzukommenden (Plasmid-getragenen) mycobakteriellen DNA und der genomischen mycobakteriellen DNA und eine Integration des rekombinanten Plasmids in das mycobakterielle Genom zur Folge. Der Einbau tritt an einer ausgewählten Stelle im mycobakteriellen Genom ein, die nicht-essentiell ist (d. h. für die mycobakterielle Replikation nicht essentiell ist). Die Integration der homologen Plasmid-Sequenzen wird durch einen Einbau der DNA von Interesse in das mycobakterielle Genom begleitet.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Mycobakterien, die interessierende DNA bzw. DNA von Interesse exprimieren, die in die mycobakterielle DNA eingebaut wurde, oder die extrachromosomal als Plasmid aufrechterhalten wird. Solche rekombinanten Mycobakterien können durch Einbringen von DNA von Interesse in irgendein geeignetes Mycobakterium erzeugt werden, wie beispielsweise M. smegmatis, M. bovis-BCG, M. avium, M. phlei, M. fortuitum, M. lufu, M. paratuberculosis, M. habana, M. scrofulaceum und M. intracellulare. In rekombinanten Mycobakterien, in denen DNA von Interesse in genomische DNA eingebaut wird, wird die DNA von Interesse in einer solchen Weise vorliegen, dass 1. ein mycobakterielles Gen ersetzt wird (d. h. nicht mehr länger im mycobakteriellen Genom vorliegt) oder 2. die DNA von Interesse in ein mycobakterielles Gen eingebaut wird, mit dem Ergebnis a) dass das mycobakterielle Gen intakt und funktionell bzw. funktionsfähig gelassen wird oder b) dass das mycobakterielle Gen zerstört und unfunktionell gemacht wird.

Die sich ergebenden gentechnisch veränderten bzw. genetisch rekombinanten Mycobakterien (beispielsweise rekombinantes BCG, rekombinantes M. smegmatis) sind insbesondere als Vehikel bzw. Trägerstoffe von Nutzen, durch die die DNA von Interesse exprimiert werden kann. Diese werden als genetisch rekombinante Mycobakterien oder mycobakterielle Expressionsvehikel bezeichnet. Solche Vehikel können beispielsweise als Vakzin-Vehikeln verwendet werden, die ein Polypeptid oder ein Protein von Interesse exprimieren (oder mehr als ein Polypeptid oder Protein), wie beispielsweise ein Antigen oder Antigene für ein oder mehrere Pathogene von Interesse. Die rekombinanten Mycobakterien können ebenfalls als Vehikel zur Expression von Immunverstärkern, Enzymen, pharmakologischen Mitteln und Anti-Tumor-Mitteln verwendet werden; zur Expression eines Polypeptids oder eines Proteins, das zur Erzeugung eines Anti-Fertilitäts-Vakzin-Trägers von Nutzen ist; oder zur Expression von Stressproteinen, die verabreicht werden können, um eine Immunreaktion hervorzurufen oder bei einer Autoimmunisierungskrankheit (beispielsweise rheumatoider Arthritis) eine Toleranz zu induzieren. Rekombinante Mycobakterien können beispielsweise Proteine) oder Polypeptid(e) exprimieren, die Wachstumsinhibitoren sind oder für Tumorzellen Zell-zerstörend sind (beispielsweise Interferon &agr;, &bgr; oder &ggr;; Interleukine 1–7, Tumornekrosefaktor (TNF) &agr; oder &bgr;) und somit die Basis für eine neue Strategie zur Behandlung bestimmter humaner Krebsarten (beispielsweise Blasenkrebs, Melanom) bereitstellen. Pathogene von Interesse schließen irgendwelche Viren, Mikroorganismen oder andere Organismen oder Substanzen ein (beispielsweise ein Toxin oder Toxoid), das eine Krankheit verursacht. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Vakzinierung eines Wirtes mit dem rekombinanten Mycobakterium, um eine protektive Immunität im Wirt hervorzurufen. Die rekombinante Vakzine kann dazu verwendet werden, eine humorale Antikörper-Immunität zu erzeugen, eine zelluläre Immunität (einschließlich Helfer- und zytotoxische Immunität) und/oder eine mucosale oder sekretorische Immunität zu erzeugen. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der durch das rekombinante kultivierbare Mycobakterium exprimierten Antigene als Vakzine oder als diagnostische Reagenzien.

Die Vakzine der vorliegenden Erfindung weist bedeutende Vorteile gegenüber gegenwärtig verfügbaren Vakzinen auf. Zunächst weisen Mycobakterien adjuvante Eigenschaften auf, die zu den gegenwärtig besten bekannten gehören und stimulieren somit das Immunsystem eines Empfängers, so dass es auf weitere Antigene mit einer großen Effektivität reagiert bzw. antwortet. Dies ist ein besonders wertvoller Aspekt der Vakzine, weil sie eine Zell-vermittelte Immunität induziert und somit insbesondere bei der Bereitstellung einer Immunität gegen Pathogene in den Fällen von Nutzen sein wird, in denen eine Zell-vermittelte Immunität für eine Resistenz entscheidend zu sein scheint. Zweitens stimuliert das Mycobakterium das Langzeitgedächtnis oder die Immunität. Als Folge hiervon kann eine einzige (einmalige) Inokulation verwendet werden, um eine Langzeitsensibilisierung gegenüber Protein-Antigenen zu erzeugen. Unter Verwendung des Vakzin-Vehikels der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein lang anhaltendes T-Zell-Gedächtnis zu primen bzw. zu starten, das sekundäre Antikörper-Reaktionen stimuliert, die das infektiöse Mittel oder das Toxin neutralisieren. Dies ist beispielsweise gegen Tetanus- und Diphtherie-Toxine, Pertussis, Malaria, Influenza, Herpesviren und Schlangengifte von Nutzen.

Insbesondere BCG weist bedeutende Vorteile als Vakzin-Vehikel auf, dahingehen, als: 1. er die einzige Kinder-Vakzine ist, die gegenwärtig bei Geburt gegeben werden kann; 2. er in den 40 Jahren eine sehr geringe Inzidenz von Nebenwirkungen aufwies, wenn er als Vakzine gegen Tuberkulose verabreicht wurde; und 3. er wiederholt in einem Individuum verwendet werden kann (beispielsweise in multiplen Formeln).

Ein weiterer Vorteil von BCG insbesondere, ebenso wie von Mycobakterien im Allgemeinen, ist der große Umfang seines Genoms (ungefähr 3 × 106 bp Länge). Weil das Genom groß ist, ist es dazu in der Lage, eine große Menge an DNA anderer Herkunft aufzunehmen (d. h. DNA von Interesse) und kann somit dazu verwendet werden, einen Multi-Vakzin-Träger (d. h. einer, der DNA von Interesse trägt, die protektive Antigene für mehr als ein Pathogen kodiert) herzustellen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt die Ergebnisse einer Transfektion von Mycobacterium-smegmatis-Spheroplasten mit Mycobakteriophagen D29 DNA.

2 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Shuttle-Phasmids, phAE1.

3 zeigt Ergebnisse der Bestimmung von Shuttle-Phasmid phAE1.

3A zeigt Agarose-Gel von Mycobakteriophagen TM4 DNA und Shuttle-Phasmid phAE1 DNAs, digeriert mit KpnI. Bahn 1 enthält Lampbda-DNA, digeriert mit Hind III; die Bahnen 2 und 3 enthalten TM4 DNA, die unligiert war (Bahn 2) oder ligiert war (Bahn 3) vor dem Digestionsschnitt mit KpnI; die Bahnen 4 und 5 enthalten phAE1 DNA, isoliert aus Phagenteilchen, vermehrt auf M. smegmatis (Bahn 4) und phAE1 isoliert aus E. coli Zellen als Plasmid (Bahn 5). Es sei erwähnt, dass die Pfeile auf die 2,1 Kb und die 1,8 Kb Fragmente weisen, die ein 3,9 Kb Fragment formen, wenn sie an den kohäsiven Enden ligiert sind.

3B zeigt die Ergebnisse einer Southern-Blot-Analyse von Phasmid phAE1 unter Verwendung von pHC79 als Sonde (Tafel B). Die Autoradiographie von 3A ist nach Blotten auf eine Biotrans Nylonmembran (ICN) und Sondieren mit pHC79 DNA dargestellt, die mit 32P-dCTP Nick-translatiert wurde.

4 zeigt die Replikation von phAE1 auf BCG. Sie vergleicht die Lyse des Glaxo Vakzin-Stammes von BCG durch DS6A, der eine Mycobakteriophage ist, von der bekannt ist, dass sie an M. tuberculosis und BCG binden, jedoch nicht an andere Mycobakterien; Phage 33D, von dem bekannt ist, dass er an M. smegmatis und nicht BCG bindet; und Phage TM4, der an beide Spezies bindet.

4A zeigt die Lyse von BCG durch die Phagen. Die Phagentiter (pfu/ml), der in einer Verdünnung von 10–1 verwendet wurde, war wie folgt: DS6a, 2 × 106 auf M. tuberculosis, H37Ra; 33D, 2 × 106 auf M. smegmatis, mc26; TM4, 3 × 108 auf mc26; und phAE1, 3 × 108 auf mc26. Verdünnungen von Phagen (5 &mgr;l) wurden auf einem Weichagar-Überzug getüpfelt, der 108 BCG-Zellen enthielt. Die sich ergebende Lyse wurde nach Inkubation für 10 Tage bei 37°C photographiert.

4B zeigt das Vorhandensein von Cosmid-DNA in phAE1. Plaque-Abhebungen auf diesen Platten wurden wie unten beschrieben durchgeführt und mit 32P-markierter pHC79 DNA hybridisiert; dem folgt eine Autoradiographie.

4C ist eine Elektronenmikrographie von Shuttle-Phasmid phAE1 Phagen-Teilchen. Phagen-Teilchen, die auf CsCl-Gradiente gereinigt wurden, wurden auf Kohlenstoff-beschichteten Parloidon-beschichteten Gittern angeordnet, geblottet und mit einem Tropfen von 1% Phosphorwolframsäure gewaschen. Elektronenmikrophotographien wurden unter Verwendung eines JEOL 1200EX Elektronenmikroskops bei 80 kV, 30.000X, vorgenommen.

5 zeigt die Integration des Mycobakteriophagen L1 und L1-Shuttle-Phasmid-DNA in das M. smegmatis-Chromosom. DNAs von Phage L1 und L1-Shuttle-Phasmide und chromosomale DNAs der entsprechenden Lysogene wurden mit BamHI verdaut bzw. digeriert und in Agarose elektrophoretisiert. Tafel A zeigt ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel. Tafel B zeigt die Autoradiographie der Southern-Analyse dieses Gels, das mit 32P-markierter Phagen L1-DNA sondiert wurde. Das Folgende ist in der angezeigten Bahn dargestellt: Phagen-DNA vom Stammphagen L1 (Bahn 2), vom Shuttle-Phasmid phAE15 (Bahn 4) und vom Shuttle-Phasmid phAE19, das das aph-Gen enthält (Bahn 6); bakterielle chromosomale DNA vom Stamm M. smegmatis-Stamm (Bahn 1), vom mit L1 lysogenisierten Stamm (Bahn 3), mit phAE15 (Bahn 5) und mit phAE19 (Bahn 7). L1, phAE15 und phAE19 wurden ortsspezifisch innerhalb des Chromosoms ihrer entsprechenden Lysogene (Tafel B, Bahnen 3, 5 und 7) integriert, wie es durch den vorherrschenden Verlust einer einzelnen 6,7 kb Bande, die bei jedem Phagen vorlag (man bemerke das Quadrat in L1, Bahn 2) und durch das Erscheinen zweier neuer Banden, 9,0 kb und 1,7 kb in jedem Lysogen (Kreise), bewiesen wurde.

6 ist eine schematische Darstellung der Verwendung eines temperaten Shuttle-Phasmids als Klonierungsvektoren, um stabil DNA von Interesse in das mycobakterielle Chromosom einzubringen. DNA von Interesse (bezeichnet als Gen X) kann in einzigartige bzw. einzeln vorkommende Restriktionsstellen in Shuttle-Phasmid-DNA eingebracht und anschließend in Mycobakterien eingefügt werden. In Mycobakterien kann das Shuttle-Phasmid, das die DNA von Interesse trägt, lysogenisieren und kann stabil als Prophage gehalten werden.

7 zeigt die Expression einer Kanamycin-Resistenz durch Lysogenie unter Verwendung des temperaten Shuttle-Phasmids phAE19. Die Kolonien erschienen, wo phAE19 mc26-Zellen lysogenisierte, und demonstrierte somit die Expression einer Kanamycin-Resistenz. In vielfachen Experimenten wurden Kanamycin-Resistenz-Kolonien weder von den spontanen Mutanten von mc26-Zellen noch mc26-Zellen, die mit phAE15 lysogenisiert waren, beobachtet.

8 ist eine schematische Darstellung der zur Erzeugung einer Bibliothek bzw. Bank aus Hybrid-Plasmid-Molekülen, die aus E. coli-Plasmid, plJ666 bestand, verwendete Strategie, das Markergene enthält, die eine Resistenz gegenüber Neomycin/Kanamycin (neo) und Chloramphenicol (cat) verleihen, eingefügt an zusätzlichen Stellen um das pAL5000-Genom herum.

9 zeigt Ergebnisse einer Agarosegel-Elektrophoreseanalyse von DNA aus p1J666::pAL5000 rekombinanten Shuttle-Plasmiden, isoliert aus drei unabhängigen Pools von M. smegmatis-Transformanten (Bahnen 1, 2, 3). Im Anschluss an die getrennten Transformationen jedes dieser Plasmid-Pools in E. coli-Stamm &khgr;2338 wurden einmal vorkommende Plasmide aus einzelnen gereinigten Transformanten isoliert, bezeichnet als pYUP13, pYUP14 und pYUP15 und sind in den Bahnen 5, 6 bzw. 7 dargestellt. Bahn 4 enthält das M.-fortuitum-Plasmid, pAL5000 und Bahn 8 enthält die Bibliothek bzw. Bank von p1J666::pAL5000 Rekombinanten. Die Größe der Shuttle-Plasmide, die entweder aus M. smegmatis oder E. coli isoliert wurden, ist zur Größe der rekombinanten Bibliothek identisch, was auf die Stabilität des Konstrukts hinweist.

10 zeigt eine Transformation von BCG mit Shuttle-Plasmid-DNA. Tafel A zeigt Kanamycin-resistente BCG-Kolonien, die sich nach Elektroporation von BCG-Zellen mit Shuttle-Plasmid-DNA ergeben; Tafel B zeigt Kanamycin-resistente BCG-Kolonien, die sich nach Elektroporation von BCG-Zellen ohne Shuttle-Plasmid-DNA ergaben.

11 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines rekombinanten Plasmids, bei dem eine Kan-Insertion im PyrF-Gen des Plasmid-Vektors pUC19 existiert.

12 ist eine schematische Darstellung der Transformation von mycobakteriellen Zellen mit dem rekombinanten Plasmid pUC19, bei dem das PyrF-Gen eine Kan-Insertion enthält.

12A ist eine schematische Darstellung der Selektion unter Verwendung eines Wachstums auf Kanmycin-enthaltendem Medium von mycobakteriellen Zellen, bei denen das PyrF-Gen, das das Kan-Gen enthält, vorliegt.

12B ist eine schematische Darstellung der Selektion unter Verwendung eines Wachstums auf Fluororotsäure-enthaltendem Medium von mykobakteriellen Zellen, die das PyrF-Gen, das das Kan-Gen enthält, in die genomische DNA integriert aufweisen.

13 ist eine schematische Darstellung der Integration von Kan und DNA, die ein selektiertes Antigen (bezeichnet als Fan) kodiert, in mycobakterielle DNA.

14 ist eine schematische Darstellung des Ersatzes des mycobakteriellen PyrF-Gens durch ein Gen, das eine Kanamycin-Resistenz kodiert.

15 ist eine schematische Darstellung der Integration eines PyrF-Gens und einer DNA von Interesse in ein rekombinantes Mycobakterium, wie es in 14 dargestellt ist.

16 ist eine schematische Darstellung der Verwendung einer Expressionskassette zur Kontrolle der Expression von DNA von Interesse, die in ein mycobakterielles Genom integriert ist.

17 zeigt die Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse, die die Expression des M. leprae-Gens zeigt, das das Stress-induzierte 65-kD-Antigen in M. smegmatis und BCG kodiert.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Mycobacterium-bovis-BCG (BCG oder M.-bovis-BCG) ist ein avirulentes M.-bovis-Derivat, das in weiten Bereichen der gesamten Welt verwendet wird und üblicherweise dazu verwendet wird, einen Schutz gegen Tuberkulose bereitzustellen, obwohl seine Effektivität kürzlich in Frage gestellt wurde. Mycobacterium smegmatis ist ein nicht-pathogener Bazillus, der Antigene und adjuvante Eigenschaften mit BCG teilt. Beide können relativ leicht in Kultur gezüchtet werden.

Weil beide Mycobakterien eine ausgezeichnete adjuvante Wirksamkeit zur Induktion einer Zell-vermittelten Immunität aufweisen, das Langzeitgedächtnis (Immunität) stimulieren und eine geringe mit ihrer Verwendung assoziierte Mortalität aufweisen, sind sie ausgezeichnete Kandidaten als rekombinante Vakzine. Das heißt, sie sind ausgezeichnete Kandidaten zur Verwendung als Vehikel (Vakzin-Vehikel), in die genetisches Material (DNA) von Interesse (DNA von anderer Herkunft als das Mycobakterium, in das sie eingebracht wird) eingefügt und anschließend exprimiert werden kann.

DNA von Interesse kann irgendeiner Herkunft sein und ist: 1. DNA, die die Gesamtheit oder einen Teil eines Gens oder von Genen ist, die ein Protein(e) oder Polypeptid(e) von Interesse kodieren; 2. DNA, die einen selektierbaren Marker oder mehrere Marker kodiert; oder 3. DNA, die sowohl einen selektierbaren Marker (oder selektierbare Marker) zumindest ein Protein oder Polypeptid von Interesse kodiert. Der Begriff Polypeptid von Interesse, wie hierin verwendet, schließt die Gesamtheit oder einen Teil eines zu exprimierenden Proteins ein. Eine solche DNA von Interesse wird in genetisch rekombinanten Mycobakterien exprimiert, in denen es im mycobakteriellen Genom (in dieses integriert) vorliegt oder extrachromosomal vorliegt. Eingebaute DNA, wie hierin definiert, schließt DNA ein, die in chromosomaler DNA vorliegt oder in Mycobakterien extrachromosomal (episomal) vorliegt. Die DNA wird mittels eines Shuttle-Plasmides oder Shuttle-Phasmides eingebracht, was die Integration in die mycobakterielle chromosomale oder genomische DNA oder das Vorliegen von DNA von Interesse episomal (extrachromosomal) zur Folge hat. Der Einbau von DNA von Interesse kann durch homologe oder nicht-homologe Rekombination auftreten, wie beispielsweise eine ortsspezifische Rekombination eines Phagen-kodierten Systems oder durch Rekombination, die durch ein transponsables Element vermittelt wird, eintreten.

Bis zum jetzigen Zeitpunkt war es nicht möglich, ein Mycobakterium durch Verwendung von Phasmid-DNA zu transformieren. Es war bis jetzt ebenfalls nicht möglich, rekombinante mycobakterielle Vakzin-Vehikel zu erzeugen, in denen DNA, die ein Polypeptid oder Protein, wie beispielsweise eines kodiert, gegen das eine Immunreaktion erwünscht ist, stabil integriert wird, und zwar an ausgewählten Orten und ausgewählten Ausrichtungen bzw. Orientierungen in der genomischen DNA.

Ein Hauptziel der Arbeit bei der Entwicklung rekombinanter Mycobakterien, die als Expressionsvehikel oder Vakzin-Vehikel verwendet werden sollen, ist die Einbringung von DNA-Vektoren in das Mycobakterium, das die Expression der DNA, die ein Produkt oder Produkte kodiert, leitet, beispielsweise ein Protein oder Polypeptid, das wichtig zum Schutz gegen eine oder mehrere Pathogene ist. Es ist nunmehr möglich, unter Verwendung des Verfahrens und des Shuttle- oder Phasmid-Vektors der vorliegenden Erfindung, DNA von Interesse in ein kultivierbares Mycobakterium einzubauten (beispielsweise in das mycobakterielle Genom oder in einer solchen Weise in das Mycobakterium, dass es extrachromosomal exprimiert wird).

Der Shuttle-Phasmid-Vektor der vorliegenden Erfindung ist dahingehend einzigartig, als er Sicherheitsplasmid in Bakterien und als Phage in Mycobakterien repliziert. In einer speziellen Ausführungsform schließt der Shuttle-Phasmid-Vektor, der als ein Shuttle-Phasmid bezeichnet wird, zwei Arten bzw. Spezies spezifischer kohäsiver Enden (oder cos-Orte) ein: einen für den Lambda-Phagen, der in E. coli funktioniert; und einen für Mycobakterien (beispielsweise den Mycobakteriophagen TM), der in Mycobakterien funktioniert. Das heißt, er enthält zwei Sätze von kohäsiven Enden. Weil er einen Satz für Lambda und einen für Mycobakterien enthält, kann er in beide eingebaut werden. Das Vorhandensein der Lambda-COS-Sequenz macht es ebenfalls möglich, die effiziente Technik des Cosmid-Klonierens anzuwenden, die das Lambda-in-vitro-Verpackungssystem zum effizienten Klonieren großer DNA-Moleküle in E. coli verwendet. Weiterhin weist der Shuttle-Vektor eine einmal vorkommende EcoRI-Stelle auf, in die Antigen-kodierende DNA eingefügt werden kann. Somit haben es die Shuttle-Vektoren möglich gemacht, ein Transfektionssystem zu entwickeln, das den Einbau rekombinanter DNA-Moleküle in Mycobakterien erlaubt.

Es existieren mehrere Mittel, durch die genetisches Material von Interesse in Mycobakterien eingebaut werden kann, um rekombinante Mycobakterien der vorliegenden Erfindung zu produzieren. Beispielsweise kann DNA von Interesse stabil in mycobakterielle Zellen eingebracht werden (beispielsweise in das mycobakterielle Chromosom integriert werden), durch Klonieren in ein Shuttle-Phasmid, insbesondere ein temperates Shuttle-Phasmid (beispielsweise einen Phagen, der zum Lysogenisieren einer Zelle in der Lage ist). Die Einbringung von DNA von Interesse in dieser Art und Weise hat die Integration der DNA in das mycobakterielle Chromosom zur Folge.

Beispielsweise wurde ein E. coli-Cosmid in den temperaten Mycobakteriophagen L1 eingebracht, wodurch Shuttle-Phasmide erzeugt wurden, die zum Replizieren als Plasmide in E. coli oder zum Lysogenisieren des mycobakteriellen Wirtes in der Lage waren. Diese temperaten Shuttle-Phasmide bilden trübe Plaques auf M. smegmatis und verleihen nach Lysogenisierung gegenüber einer Superinfektion eine Resistenz und integrieren sich innerhalb des mycobakteriellen Chromosoms. Wenn ein L1-Shuttle-Phasmid, das ein kloniertes Gen, das Kanamycin-Resistenz in E. coli verleiht, in M. smegmatis eingebracht wurde, wurden stabile Kanamycin-resistente Kolonien (d. h. Lysogene) erzielt.

Alternativ kann ein Plasmid-Vektor dazu verwendet werden, DNA von Interesse in Mycobakterien einzubringen, in denen die DNA extrachromosomal exprimiert wird. Beispielsweise wurde das Shuttle-Plasmid M. fortuitum::E. coli Hybrid-Plasmide aus mycobakteriellen und E. coli-Replikons konstruiert, die Kanamycin- und Chloramphenicol-Resistengene enthalten. Wenn sie in M. smegmatis oder BCG durch Elektroporation eingebracht wurden, verliehen diese Shuttle-Plasmide stabile Kanamycin- und Chloramphenicol-Resistenz für die Transformanten. Somit haben es die Vektoren möglich gemacht, ein Transfektionssystem zu entwickeln, das die Einbringung rekombinanter DNA-Moleküle in Mycobakterien erlaubt.

Es ist ebenfalls möglich, DNA von Interesse einzufügen und zu verursachen, dass diese in Wirtschromosomen ohne Phagen integriert. Dies kann beispielsweise durch homologe Rekombination, ortsspezifische Rekombination oder nicht-homologe Rekombination (beispielsweise mittels eines Transposons, das eine zufallsbedingte Insertion in chromosomales Material des Wirtes zur Folge hat) erreicht werden. Eine homologe Rekombination wurde wie unten beschrieben dazu verwendet, DNA von Interesse zu integrieren (beispielsweise ein Kanamycin-Resistenzgen, 65 KD M. leprae-Gen).

Um DNA von Interesse erfolgreich in ein Mycobakterium oder in das mycobakterielle Genom mittels des Shuttle-Vektors oder Plasmid-Vektors der vorliegenden Erfindung oder durch homologe Rekombination einzubringen, wurden die folgenden Ansätze befolgt. Obwohl sie bezüglich M. smegmatis und M.-bovis-BCG beschrieben sind, sollte verständlich sein, dass sie ebenfalls zum Einbringen von DNA von Interesse in andere Mycobakterien verwendet werden können und dass diese anderen gentechnisch rekombinanten Mycobakterien ebenfalls Expressions- oder Vakzin-Vehikel sein können. Solche anderen Mycobakterien schließen Folgendes ein: M. smegmatis, M.-bovis-BCG, M. avium, M. phlei, M. fortuitum, M. lufu, M. paratuberculosis, M. habana, M. scrofulaceum und M. intracellulare. Im Falle von langsam wachsenden Mycobakterien (beispielsweise M.-bovis-BCG und M. tuberculosis), die als Vakzin-Vehikel verwendet werden sollen, ist es besonders wertvoll, durch M. smegmatis und anschließend durch M.-bovis-BCG zu gehen (d. h. DNA einzubringen, die ein Antigen oder Antigene von Interesse hierin kodiert).

Entwicklung eines Shuttle-Vektors zum Transfer von DNA in Mycobakterien Transfektion von Mycobakteriophagen-DNA in M. smegmatis

Um ein System zu entwickeln, das die Manipulation von DNA in Mycobakterien erlaubt, war es zunächst notwendig, ein effizientes Mittel zum Übertragen von DNA in den Bazillus zu entwickeln. Die verwendete Technologie war eine Modifikation derjenigen von Okanishi und Hopwood bezüglich der für die Herstellung von Seroplasten für Streptomyces beschriebenen Technologie. Streptomyces sind wie Mycobakterien Actinomycetales. Okanishi, M. et al., Microbiology, 80: 389–400 (1974), Hopwood, D. A. und H. M. Wright, Molecular Genetics, 162: 307–317 (1978). Die modifizierte Technik wurde in Kombination mit dem Zusatz von Polyethylenglykol verwendet, um den Eintritt von DNA-Molekülen in bakterielle Seroplasten zu erleichtern.

Wegen der Nicht-Verfügbarkeit nützlicher selektierbarer Antibiotika-Resistenzmarker in Plasmiden zum Transformieren von Mycobakterien war das zur Auswertung optimaler Bedingungen für den DNA-Transfer in Mycobakterien ausgewählte System die Transfektion von DNA aus lytischen Mycobakteriophagen. Zwei Vorteile eines solchen Systems sind, dass die erzielten Ergebnisse quantitativ waren und als Plaque innerhalb von 24 Stunden visualisiert werden konnten.

Eine Transfektion von Mycobakteriophagen-DNA in M. smegmatis ist ausführlich in Beispiel 1 beschrieben. Kurz gesagt wurde die DNA anfänglich in Mycobakterien eingebracht, bei denen die Gesamtheit oder ein Teil der Zellwände entfernt wurde (d. h. Protoplasten oder Seroplasten) unter Verwendung von Polyethylenglykol. Transfektionsexperimente wurden mit DNA aus dem Mycobakteriophagen D29 begonnen, der sich auf einer Vielzahl von Mycobakterien vermehrt und große reine Plaques auf M. smegmatis bildet. Platten-Lysate von D29-Phagen, hergestellt auf M. smegmatis, ergaben beständig mehr als 1011 pfu (Plaque Forming Units = Plaque bildende Einheiten) pro ml Lysat. Die geernteten Phagen wurden zweimal auf CsCl Gleichgewichtsgradienten gereinigt; sie bandierten bei einer Gleichgewichtsschwebedichte bzw. Schwimmdichte von 1,51. Phagen-DNA wurde durch Proteinase-K-Behandlung und Phenol-Chloroform-Extraktion extrahiert. Eine Restriktionsanalyse ligierter und nicht-ligierter D29-DNA zeigte, dass die genomische Phagen-DNA doppelsträngig war, 50 kb Größe aufwies und kohäsive Enden besaß.

Die Ergebnisse der Transfektion von M. smegmatis-Spheroplasten durch Mycobakteriophagen D29-DNA sind in 1 dargestellt. Effizienzen von 103 bis 104 pfu pro &mgr;g D29-DNA wurden erzielt, wodurch das erste effiziente Transfektionssystem für Mycobakterien demonstriert wurde. Dass diese Plaque das Ergebnis einer Transfektion von M. smegmatis-Spheroplasten war, wurde durch das Folgende demonstriert: (i) die Transfektion wurde durch DNase aufgehoben; (ii) ein osmotischer Schock behandelter Zellen vermied eine produktive Transfektion; und (iii) Spheroplasten, abgeleitet von einem D29-Phagen-resistenten Mutanten von M. smegmatis wurde in Häufigkeiten transfiziert, die dem Ausgangsstamm bzw. Mutterstamm vergleichbar waren. Eine weitere Verfeinerung dieser Techniken machte es möglich, Häufigkeiten von mehr als 105 pfu pro &mgr;g D29-DNA zu erzielen.

Einbringung von DNA von Interesse in Mycobakterien

Ein Vektor, der sowohl die Manipulation und Amplifikation mycobakterieller DNA-Konstrukte in E. coli als auch den anschließenden Transfer und die Replikation in Mycobakterien erlauben würde, wurde entwickelt. Es war insbesondere in hohem Maße erwünscht, die Fähigkeit des Einbringens von DNA von Interesse in rasch wachsende nicht-pathogene My cobakterien (beispielsweise M. smegmatis) ebenso wie in langsam wachsende Mycobakterien (beispielsweise M.-bovis-BCG und M. tuberculosis) zur Verfügung zu haben. Obwohl Plasmide in einigen mycobakteriellen Stämmen innerhalb des MAIS-Komplexes und in M. fortuitum zu finden sind, wurden bis jetzt keine beschrieben, die sich innerhalb von M. smegmatis, M.-bovis-BCG oder M. tuberculosis replizieren. Mit einer Ausnahme besitzt keines dieser Plasmide selektierbare Marker. Crawford, J. T. und J. H. Bates, Infections and Immunity, 24: 979–981 (1979); Mizuguchi, Y. et al., Journal of Bacteriology, 146: 656–659 (1981); Meissner, P. S. und J. O. Falkinham, Journal of Bacteriology, 157: 669–672 (1984). Im Gegensatz hierzu wurde eine Vielzahl von Phagen, die in M. smegmatis, M.-bovis-BCG und M. tuberculosis replizieren, zum Typisieren von Isolaten beschrieben und verwendet.

Die verwendete Strategie bestand darin, einen Vektor zu konstruieren, der sich als Plasmid in E. coli und als Phage in Mycobakterien repliziert. Ein Ansatz zur Erreichung dieser Entwicklung eines Shuttle-Plasmides basierte auf der Idee, dass, weil mycobakterielle DNA in E. coli nicht gut exprimiert wird, es möglich sein sollte, in einem Plasmid-Vektor ein funktionelles Mycobakteriophagen-Genom zu klonieren, das der E. coli-Wirt nicht lysieren würde. Es wäre somit dazu in der Lage, sich in beiden Arten von Organismen zu replizieren. Weil eine Transfektion von M. smegmatis Mycobakteriophagen-Teilchen ergeben würde, könnte die Einbringung von DNA von Interesse in langsam wachsende Mycobakterien (beispielsweise BCG) durch eine Phagen-Infektion erreicht werden. Ein bifunktioneller Vektor für Streptomyces wurde von Suarez und Chafer beschrieben. Suarez, J. E. und K. F. Chater, Nature, 286: 527– 529 (1980). Ein Lampbda-Co1E1-Vektor mit dualen Eigenschaften in E. coli wurde von Brenner und Mitarbeitern als Phasmid bezeichnet. Brenner S. et al., Gene, 17: 27–44 (1982).

Zu diesem Zweck wurde der Mycobakteriophage TM4 verwendet. Es wurde berichtet, dass TM4 ein lysogener Phage ist, isoliert aus M. avium. Timme, T. L. und P. J. Brennan, Journal of General Microbiology, 130: 205–209 (1984). Er wurde als eine Phage charakterisiert, die M. smegmatis lysogenisiert. Es wurde dargestellt, dass er dazu in der Lage ist, sich in M. smegmatis, BCG und M. tuberculosis zu replizieren und wurde als temperat bezeichnet. Diese Phage weist ebenfalls ein doppelsträngiges DNA-Genom von 50 kb auf und besitzt kohäsive Enden. Es ist jedoch möglich, andere Mycobakteriophagen mit ähnlichen Eigenschaften zu verwenden. Die folgenden Verfahren, die unter Verwendung von TM4 beschrieben wurden, können ebenfalls mit anderen solchen Mycobakterienphagen bei der Konstruktion eines Vektors verwendet werden.

Die zum Einbringen eines E. coli-Plasmid-Replikons in Phage TM4 zur Erzeugung eines Vektors verwendete Strategie, die sich in E. coli als Plasmid und in Mycobakterien als eine Phage repliziert, ist in 2 schematisch dargestellt. Plattenstamm-Lysate und genomische DNA eines TM4-Phagen wurden wie für D29-Phagen beschrieben hergestellt (siehe Beispiel 1). TM4-DNA wurde in hohen Konzentrationen zur Bildung langer Konkatamere von wiederverbundenen kohäsiven Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde teilweise mit Sau3A digeriert. Sau3A schneidet das 7M4-Genom häufig (beispielsweise im Durchschnitt einmal alle 300 bp) zu Fragmenten einer Größe von 30–50 kb. Es erzeugt eine Reihe von DNA-Fragmenten, deren Länge diejenige des gesamten TM4-Genoms oder von TM4-Genomen mit kleinen Deletionen entsprach, sind jedoch an allen Sau3A-Stellen innerhalb des Genoms gespalten. Diese DNA-Fragmente wurden an das 6,5 kb Cosmid pHC79 ligiert, das das Gen für eine Resistenz gegenüber Ampicillin enthielt und wurden mit BamHI gespalten. Hohn, B. und J. Collins, Gene, 9: 291–298 (1980). Um nach rekombinanten Molekülen der geeigneten Größe zu selektieren, wurde das Ligationsgemisch in vitro in Bakteriophagenlambda-Köpfe verpackt. Dies selektiert nach DNA-Fragmenten, die Lampbda-COS-Stellen enthalten und zwischen 38 und 53 kb Größe aufweisen. Die sich ergebenden Phagenteilchen wurden in E. coli transduziert und Kolonien, die pHC79::TM4 DNA-Moleküle enthalten, wurden auf Medien selektiert, die Ampicillin enthalten. Kovalent verschlossene ringförmige Plasmid-DNA wurde aus 40.000 gepoolten Ampicillin-resistenten (ampr) Kolonien isoliert. Birnboim, H. und Doly, Journal of Nucleic Acid Research, 7: 1513–1525 (1979).

Diese Bibliothek enthält rekombinante Moleküle des TM4-Genoms, in das pHC79 Cosmid-DNA zufallsbedingt in Sau3A-Stellen um das TM4-Genom herum eingefügt wurde. Sie wurde in M. smegmatis-Spheroplasten transfiziert, um nach TM4-Phagen zu selektieren, die pHC79 in nicht-essentielle Bereiche eingefügt aufwiesen. Solche Phagen waren somit Shuttle-Phasmide. Die Transfektion ergab 100 Plaque-bildende Einheiten (pfu) pro &mgr;g Plasmid-DNA. Plaque-Abhebungen wurden dazu verwendet, um nach einer Hybridisierung an 32P-markierte pHC79-DNA zu screenen; nur 10 von 4.000 Plaque-hybridisierten an markierte pHC79.

Im Anschluss an die Plaque-Reinigung und -vermehrung auf M. smegmatis-Zellen wurde ein solcher Phage ausführlich untersucht und als Phasmid, phAE1 bezeichnet. Phasmid phAE1 wurde (26. Februar 1986) gemäß den Regularien des Budapester Vertrages, bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD) unter der Zugangsnummer 40306 hinterlegt. Alle Beschränkungen bezüglich des öffentlichen Zugangs der Hinterlegung werden unwiderruflich nach Erteilung eines US-Patentes basierend auf dieser Anmeldung entfernt werden. Die DNA wurde aus phAE1-Phagenteilchen isoliert, die auf M. smegmatis gezüchtet, auf CsCl-Gradienten aufgereinigt, zur Bildung von Konkatameren ligiert und in vitro in Bakteriophagenlambda-Köpfe verpackt wurden. Die sich ergebenden Teilchen übertrugen eine Ampicillin-Resistenz auf E. coli-Zellen und produzierten, wenn sie transfiziert waren, Plaques auf M. smegmatis. Dies war der Beweis, dass phAE1 als Shuttle-Vektor funktioniert.

Ein Restriktionsverdau von phAE1-DNA, isoliert aus Phagenteilchen, die auf M. smegmatisvermehrt wurden, und von phAE1-DNA, isoliert als Plasmid-DNA, isoliert aus E. coli, zeigten identische Muster außer das Vorhandensein von nicht wieder miteinander verbundenen Fragmenten, die durch kohäsive Enden zusammengebunden waren, die in der Phagen-DNA-Zubereitung ersichtlich war (3A): Eine Southern-Analyse demonstrierte, dass das Cosmid pHC79 in einem der beiden 11 kb KpnI Restriktionsfragmente des TM4-Genoms kloniert war (3B). In der Elektronenmikroskopie ähneln die phAE1-Teilchen dem Bakteriophagen Lambda mit hexagonalen Kopfteilen, die durchschnittlich 50 &mgr;m Durchmesser aufweisen. Jedoch weisen diese Teilchen lange Schwänze (180–220 &mgr;m Länge) mit einer scheibenartigen Basis bzw. Grundplatte auf, die auf vielen der Schwanzteilen vorliegt (4C). Die Struktur ist derjenigen der Stammphage TM4 sehr ähnlich. Timme, T. L. und P. J. Brennan, Journal of Gen. Microbiology, 130: 205–209 (1984).

Eine Restriktionsanalyse von DNAs aus isolierten Phagen, die sich aus der Transfektion der pHC79::TM4-Bibliothek in M. smegmatis ergab, die nicht an pHC79 hybridisierte, zeigte, dass diese identisch waren. Der Phage scheint aus einem Rekombinationsereignis entstanden zu sein, das in transfizierten Zellen auftrat, die zwei oder mehr pHC79::TM4-Moleküle enthielten, wodurch ein Wildtyp-TM4-Genom erzielt wurde.

Von speziellem Interesse ist die Beobachtung, dass das Shuttle-Phasmid, phAE1, das aus M. smegmatis gewonnen wurde, dahingehend wie sein Stamm-TM4 ist, als es dazu in der Lage ist, drei unterschiedliche getestete M.-bovis-BCG-Vakzinstämme zu infizieren und sich in diesen zu replizieren: den Glaxo-, Pasteur- und Danish-BCGs. Diese Ergebnisse sind in den 4A und 4B dargestellt.

Dies demonstriert somit erfolgreich die Konstruktion von mycobakteriellen E. coli-Shuttle-Phasmiden, die rekombinante DNA-Moleküle sind, die nicht nur die Fähigkeit aufweisen, sich in E. coli als Plasmide und in Mycobakterien als Phagen zu replizieren, sondern auch die Fähigkeit aufweisen, in die Kopfteile des Bakteriophagen Lambda oder in Mycobakteriophagen-Teilchen verpackt zu werden. Dies zeigt ebenfalls, dass rekombinante DNA sowohl in schnell-wachsendes Mycobakterium (M. smegmatis) als auch langsam wachsendes Mycobakterium (M.-bovis-BCG) eingebracht wurde. Dies macht es möglich, BCG-Vakzinstämme mit den Shuttle-Phasmiden zu infizieren und somit klonierte Gene in Mycobakterien einzubringen. Dies eliminiert somit die Notwendigkeit, ein Transfektionssystem für BCG zu entwickeln. Das heißt, weil das mykobakterielle E. coli Shuttle-Phasmid nach Transfektion in Mycobakterien in mycobakterielle Teilchen verpackt wird, können DNA von Interesse in langsam wachsende Mycobakterien (beispielsweise BCG) eher durch Transduktion eingebracht werden, als durch eine Transfektion. Bis jetzt konnte dies nicht durchgeführt werden, und dieser Vorteil macht es möglich, rekombinante mycobakterielle Vakzine-Vehikel zu erzeugen, die zum Immunisieren gegen ein oder mehrere interessierende Antigene verwendet werden können.

Die Verwendung einer In-vitro-Verpackung zur Konstruktion dieser Phasmide kann als effiziente Strategie zum Klonieren von Genen in diese Vektoren erweitert werden (beispielsweise Genen oder DNA von Interesse, die ein Antigen oder Antigene für ein oder mehrere Pathogene, gegen die eine Immunreaktion erwünscht ist, kodieren), so lange die Beschränkungen der Größe des Verpackungssystems nicht überschritten werden. Es ist ebenfalls möglich, durch Screening zusätzlicher rekombinanter TM4::pHC79 Phasmide die maximale Menge an DNA zu bestimmen, die aus den TM4-Phagen deletiert wurde, um zusätzliche nicht-essentielle Regionen des Phagen-Genoms zu definieren, in die DNA eingefügt werden kann.

Eine Einbringung neuer Gene (beispielsweise DNA von Interesse, die Antigene kodiert) in Mycobakterien mittels des Shuttle-Phasmides umfasst das Klonieren von DNA-Fragmenten in das Shuttle-Phasmid in E. coli und das anschließende Transfizieren dieser in M. smegmatis-Spheroplasten. Dies erzeugt rekombinante Phagenteilchen, die kloniertes Gen (Gene) enthalten. Unter Verwendung der sich ergebenden M. smegmatis-Spheroplasten, die rekombinante Phagen enthalten, ist es möglich, BCG mit hoher Effizienz zu infizieren (nahezu 100% Effizienz), wodurch die DNA von Interesse, die in den rekombinanten Phagen eingeschlossen ist, in BCG eingebracht wird. Die Entwicklung von Bedingungen zur Etablierung einer Lysogenie oder Rekombination, um eine stabile Expression des Fremdgenes (der Fremdgene) in mycobakteriellen Zellen zu ermöglichen, ist in hohem Maße wünschenswert.

Einbringung von DNA von Interesse in mycobakterielle Zellen

Die oben und in den anschließenden Abschnitten beschriebenen Shuttle-Vektoren können dazu verwendet werden, DNA von Interesse in Mycobakterien einzubringen, die ein oder mehrere Antigene für ein oder mehrere Pathogene von Interesse kodiert, wie beispielsweise M.-bovis-BCG oder M. smegmatis. Er kann ebenfalls dazu verwendet werden, durch Einbringung von DNA, die geeignete Antigene kodiert, wie beispielsweise humanes Gonadotropin-Hormon(HGH)-Fragmente, in Mycobakterien, eine Antifertilitäts-„Vakzine" zu produzieren. Diese Vektoren können ebenfalls dazu verwendet werden, DNA einzubringen, die ein Protein oder ein Polypeptid kodiert, das ein Wachstumsinhibitor für oder zytotoxisch für Tumorzellen ist. Die sich ergebenden rekombinanten Mycobakterien können jeweils verwendet werden, um unspezifisch Immunreaktionen auf Fremdantigene zu fördern, die in Mycobakterien exprimiert werden, und um einige menschliche Krebsarten zu behandeln. Die Shuttle-Vektoren stellen ein Mittel zum Manipulieren und Amplifizieren rekombinanter DNA-Konstrukte in einem Bakterium (beispielsweise E. coli, Streptomyces, Bacillus) oder in einem anderen Organismus (beispielsweise Hefe) bereit, und ein Mittel, diese anschließend in ein Mycobakterium zu übertragen, in dem die DNA exprimiert wird.

Es ist als Folge möglich, rekombinante mycobakterielle Vakzinen zu erzeugen, die zum Immunisieren von Individuen gegen beispielsweise Lepra, Tuberkulose, Malaria, Diphtherie, Tetanus, Leishmania, Salmonellen, Schistomiasis, Masern, Mumps, Herpes und Influenza verwendet werden können. Gene, die ein oder mehrere protektive Antigene für ein oder mehrere die Krankheit verursachende Pathogene kodieren, können in das Mycobakterium eingebracht werden. Von speziellem Wert ist die Fähigkeit, Gene einzubringen, die Antigene von Pathogenen kodieren, die ein T-Zell-Gedächtnis oder eine Effektorfunktion erfordern. Eine Verabreichung der sich ergebenden mykobakteriellen Vakzine an den Wirt hat die Stimulierung des Immunsystems des Wirtes zur Folge, so dass eine protektive Immunreaktion erzeugt wird.

Eine Vakzine gegen ein Pathogen oder Toxin kann unter Verwendung des Shuttle-Plasmides der vorliegenden Erfindung durch das folgende Verfahren erzeugt werden: DNA, die ein Antigen (oder Antigene) für das Pathogen oder Toxin kodiert, gegen das ein Schutz erwünscht ist, wird gewonnen. Die DNA kann durch Isolierung der natürlich vorkommenden DNA (beispielsweise aus dem pathogenen Organismus oder Toxin-produzierenden Organismus); durch Klonieren und Amplifikation der DNA-Sequenz von Interesse, unter Verwendung bekannter gentechnischer Techniken (siehe beispielsweise Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982); oder durch mechanische Synthese, gewonnen werden.

Durch das folgende Verfahren werden das Gen oder die Gene von Interesse (d. h. die ein oder mehrere Antigene, gegen die Immunität erwünscht ist, kodieren) in ein Shuttle-Phasmid kloniert. Dies kann unter Bezugnahme auf 2 erklärt werden, die eine schematische Darstellung des Shuttle-Phasmids phAE1 ist. Die kohäsiven Enden des Shuttle-Phasmides werden unter Verwendung bekannter Techniken ligiert. Das sich ergebende Shuttle-Phasmid-Material wird mit einem einzigartigen Restriktionsenzym (beispielsweise ein Restriktionsenzym, das an einmal vorkommenden bzw. einzigartigen Stellen schneidet, wie beispielsweise EcoRI und EcoRV im Shuttle-Phasmid) geschnitten (digeriert bzw. verdaut). Ein alternativer Ansatz für Schnitte, die auf diese Weise hergestellt sind, ist der Zusatz (durch Ligation) eines Polylinkers (Oligonukleotid-Sequenz), der mit anderen Restriktionsenzymen verwendbar ist (durch die er geschnitten werden kann). In diesem Falle wird der Linker mit einem ausgewählten Restriktionsenzym aufgeschnitten, wodurch Stellen produziert werden, an denen die DNA von Interesse eingefügt werden kann.

Im ersten Fall (Schneiden unter Verwendung eines einzigartigen („unique") Restriktionsenzyms) sind die Ergebnisse Shuttle-Phasmid-Moleküle, die einmal geschnitten wurden und in die DNA von Interesse eingefügt werden kann. Im zweiten Fall existiert ebenfalls zumindest eine Stelle, an der DNA eingefügt werden kann. Ein Antibiotikaresistenz-kodierendes Gen (beispielsweise ein Ampicillin-Resistenz-kodierendes Gen) und eine DNA, die eine oder mehrere Antigene kodiert, gegen die eine Immunität erwünscht ist, kann unter Verwendung bekannter Techniken an den Restriktionsstellen ligiert werden. Die DNA, die eingefügt wird, und die Shuttle-Phasmid-DNA werden im Allgemeinen in gleichen molaren Mengen ligiert.

Die sich ergebende ligierte DNA, die in diesem Falle die Shuttle-Phasmid-DNA, ein Antibiotika-Resistenzgen und Antigen-kodierende DNA einschließt, wird in Lambda-Bakteriophagen-Köpfe unter Verwendung eines Lambda-in-vitro-Verpackungsgemisches verpackt. E. coli wird anschließend mit dem Phagen transduziert, mit dem Ergebnis, dass es möglich ist, (unter Verwendung eines Antibiotika-enthaltenden Mediums) nach Kolonien zu screenen, die das Antibiotikaresistenz-kodierende Gen und die Antigen-kodierende DNA enthalten.

Die sich ergebene „Bibliothek" wird in M. smegmatis unter Verwendung beispielsweise einer Elektroporation eingebracht. Plaques, die klonierte Insert-DNA enthaltende Shuttle-Phasmide enthalten, werden ausgewählt. Anschließend kann rekombinanter M. smegmatis dazu verwendet werden, kultivierbare Mycobakterien, wie beispielsweise BCG, mit hoher Effizienz zu infizieren. Als Folge wird die Antigen-kodierende DNA in mycobakterielle genomische DNA eingebracht, wo sie exprimiert wird.

Die Selektion von BCG, das die DNA von Interesse enthält (hier eine DNA, die ein oder mehrere Antigene integriert in seine genomische DNA kodiert) kann unter Verwendung eines selektierbaren Markers durchgeführt werden. Ein Ansatz zur Selektion von BCG, der DNA enthält, die ein oder mehrere Antigene kodiert, eingebracht durch Infektion mit dem rekombinanten Phagen, basiert auf der Verwendung eines selektierbaren Markers, der ein Antibiotika-Resistenzgen ist. In diesem Fall schließt das Shuttle-Phasmid ein Gen ein, das beispielsweise einer Kanamycin-Resistenz, Viomycin-Resistenz, Thiostrepton-Resistenz, Hygromycin-Resistenz oder Bleomycin-Resistenz kodiert.

Ein zweiter Ansatz, bei dem ein selektierbarer Marker zum Selektieren von BCG verwendet wird, der die DNA von Interesse enthält, ist eine auxotrophe Strategie (d. h. eine, die auf der Verwendung mutierter Mikroorganismen beruht, die einen bestimmten Nährstoff oder Substanz erfordern, die von dem Organismus, von dem die Mutante abgeleitet ist, nicht benötigt werden). In diesem Falle wird ein Mycobakterium mit der Mutation verwendet, und das Gen, das die fehlende oder mutierte Funktion kodiert, wird in das Shuttle-Phasmid eingebaut (das ebenfalls Antigen-kodierende DNA enthält). Eine Selektion nach Mycobakterien, die die Antigen-kodierende DNA enthalten, basiert somit auf der Fähigkeit von Mycobakterien, in die das Shuttle-Phasmid erfolgreich eingebracht wird, zu überleben, wenn sie auf dem geeigneten Medium gezüchtet werden.

Beispielsweise kann ein System, das eine Wirtsmutante (beispielsweise M. smegmatis, BCG) und einen selektierbaren Marker einschließt, der die Mutation ergänzt, verwendet werden. Ein solches System kann eine Wirtsmutante einschließen, die eine pyrF-BCG-Mutante ist und einen selektierbaren Marker, beispielsweise ein pyrF+-Gen, das im Phasmid-Shuttle-Vektor vorliegt, der zum Einbringen der Antigen-kodierenden DNA in den (mutierten) BCG verwendet wird. Beispielsweise kann das Phasmid zusätzlich zur Antigen-kodierenden DNA, die in die Cosmid-DNA eingefügt wird, das pyrF+-Gen enthalten. Somit können BCG-Mutanten, in die das Phasmid durch Infektion eingebracht wird, durch Ausplattieren auf Minimalmedium selektiert werden. Ein alternativer Ansatz besteht darin, 2-Desoxyglucose-resistente Mutanten zu verwenden; in diesem Fall wird das mycobakterielle Glucokinase-Gen in das Phasmid kloniert und wird zur Selektion, wie oben beschrieben für pyrF, verwendet.

Eine Selektion auf dieser Basis hat BCG zur Folge, das die Antigen-kodierende DNA stabil in die genomische DNA integriert aufweist und durch den Bazillus exprimiert wird. Hierfür werden Genexpressionssignale (beispielsweise Promotoren, Ribosomenbindungsstellen) stromaufwärts der fremd (Antigen-kodierenden)-DNA eingeschlossen, um zu ermöglichen, dass BCG, das die Antigen-kodierende DNA enthält, diese auf Niveaus exprimiert, die ausreichend sind, um in einem Wirt eine Immunreaktion zu induzieren, dem dieser verabreicht wird.

Es ist ebenfalls möglich, BCG, das eine DNA enthält, die ein oder mehrere Antigene kodiert, durch Verwendung monoklonaler Antikörper zu selektieren. In diesem Fall wird ein Gen oder Genfragment, das ein oder mehrere Epitope eines Antigens (beispielsweise M. leprae oder M. tuberculosis) kodiert, für das monoklonale Antikörper verfügbar sind, in das Mycobakterium eingeführt. Solche monoklonalen Antikörper werden dazu verwendet, rekombinantes BCG zu selektieren, das ein Gen oder Gene enthält, die ein oder mehrere dieser Epitope kodieren. Die Antigen-Gene, die auf diese Weise eingebracht werden, enthalten eine Promotorsequenz und andere regulatorische Sequenzen. Als Folge können zusätzliche Reihen (beispielsweise DNA, die andere Antigene kodiert) unter Verwendung von Gentechnik hinzugefügt werden und zwar derart „in frame", dass rekombinantes BCG, das durch monoklonale Antikörper gegen ein Antigen erkannt werden würde, ebenfalls andere Fremdantigen-kodierende DNA, die so eingebracht wird, exprimieren würde.

Eine Parallelstrategie, die Gebrauch von einem Plasmid zur Einbringung einer Antigen-kodierenden DNA in kultivierbare Mycobakterien macht, kann ebenfalls zur Herstellung eines Vakzin-Vehikels verwendet werden. Dies hat die stabile Aufrechterhaltung der DNA von Interesse extrachromosomal als Plasmid und seine anschließende Expression zur Folge.

Eine Konstruktion eines solchen Shuttle-Plasmides ist schematisch in 8 dargestellt. In diesem Falle wird ein selektierbarer Marker, der es möglich machen würde, Zellen zu selektieren, die die Antigen-kodierende DNA enthalten, verwendet. Der selektierbare Marker kann beispielweise ein Antibiotikaresistenz-kodierendes Gen oder ein Gen sein, das dasjenige in einer auxotrophen Mutante fehlende Gen ergänzt, wie es oben unter Bezugnahme auf das Shuttle-Phasmid beschrieben ist. Bei der Auxotrophie-Strategie wird eine auxotrophe mycobakterielle Mutante (beispielsweise eine pyrF-Mutante) isoliert und das Gen im entsprechenden Wildtyp (nicht-mutierten) Mycobakterium wird in das Plasmid eingebaut. Zusätzlich zur pyrF-Mutante ist es möglich, Desoxyglucose-Mutanten zu isolieren, die einen Defekt im Glucokinase-Gen aufweisen, ebenso wie andere, die Mutationen in anderen Biosynthesewegen aufweisen (beispielsweise Mutationen in der Aminosäure-Biosynthese, Vitamin-Biosynthese und Kohlenhydrat-Metabolismus, beispielsweise Arabinose und Galactose).

Bei jedem Ansatz wird eine mycobakterielle Mutante ausgewählt und das Gen, das die Mutation ergänzt, wird in den Plasmid-Vektor eingebaut, der ebenfalls die Antigen-kodierende DNA von Interesse enthält. Die mycobakteriellen Mutanten, in die die Antigen-kodierende DNA erfolgreich eingebracht wird, werden durch Kultivieren auf geeigneten ausgewählten Medien (beispielsweise Medien, die ein Antibiotikum enthalten, gegen das eine Resistenz übertragen wird, Medien, die die in die Biosynthesewege involvierte Nährstoffe enthalten oder diesen fehlen, die bei der verwendeten Mutante beeinträchtigt sind) identifizierbar sein (können ausgewählt werden bzw. selektiert werden) oder durch Selektieren auf Grundlage des Erscheinens von Plaques, die gebildet wurden, wenn das cl-Gen verwendet wird.

Ein anderer Bestandteil eines Plasmids, das bei der Einbringung Antigen-kodierender DNA in das rekombinante Mycobakterien-Vakzin-Vehikel von Nutzen ist, ist eine sich autonom replizierende Sequenz (beispielsweise ein Replikon), dessen Vorliegen eine Schlüsseldeterminante dabei ist, es dem Plasmid zu ermöglichen, sich autonom (extrachromosomal) zu replizieren. Diese Sequenzen können beispielsweise ein Plasmid-Replikon, Segmente eines Mycobakteriophagen oder chromosomale Replikationsursprünge einschließen.

Das Design des Shuttle-Phasmids phAE1 schließt mehrere dieser Faktoren ein. Beispielsweise machte es die Einbringung des E. coli-Cosmids pHC79 in die Mycobakteriophage TM4 möglich, ein E. coli-Plasmid-Replikon-Ursprung und ein selektierbares Ampicillin-Resistenzgen, ebenso wie die kohäsiven (cos) Sequenzen des Bakteriophagen Lambda und eine einmal vorkommende EcoRI-Stelle bereitzustellen. Es existieren keine EcoRI-Stellen innerhalb des TM4-Phagen; die einmal vorkommende EcoRI-Stelle innerhalb von phAE1 kann zur Einbringung eines Fremdgens in das Phasmid verwendet werden. Wie in Beispiel 4 beschrieben ist, wurde ein 1,6 kb EcoRI-Fragment, das das Aminoglycosid Phosphotransferase (aph)-Gen von Tn903 kodiert, in phAE1 unter Verwendung der Cosmid-Klonierungsstrategie kloniert.

Es existieren mehrere nützliche Ansätze, um die Antigen-kodierende DNA effizient in ein kultivierbares Mycobakterium einzubringen, wie beispielsweise M.-bovis-BCG oder M. smegmatis, das als ein Vakzin-Vehikel verwendet werden soll. Für das Plasmid, das eine DNA einschließt, die das Antigen (Antigene) von Interesse, einen selektierbaren Marker und eine sich autonom replizierende Sequenz kodiert, kann eine Protoplastenfusion zur effizienten Einbringung in das Mycobakterium verwendet werden. In diesem Falle wird E. coli oder Streptomyces mit einem klonierten Plasmid unter Verwendung bekannter Techniken mit einem mycobakteriellen Spheroplasten fusioniert. Unter Verwendung dieses Ansatzes ist es möglich, die fremd (Antigen-kodierende) DNA in das Mycobakterium zu übertragen. Alternativ können E. coli-Minizellen, die Plasmid-DNA und im Wesentlichen keine chromosomale DNA enthalten, bei der Durchführung einer Minizell-Protoplastenfusion verwendet werden.

Als Alternative kann DNA von Interesse effizient in das Mycobakterium bewegt werden, eine sich autonom replizierende Sequenz ist nicht notwendig und stattdessen kann die DNA von Interesse (beispielsweise die Antigen-kodierende DNA) in die mycobakteriellen Chromosome eingebaut werden. Dies kann beispielweise unter Verwendung einer Minizell-Protoplastenfusion erreicht werden. In diesem Falle kann ein selektierbarer Marker für das Mycobakterium, der ein Antibiotika-Resistenzgen oder einer chromosomale Mutation sein kann, in ein E. coli-Cosmid kloniert werden. Ebenfalls wird im E. coli-Cosmid DNA vorliegen, die einen effizienten Einbau von DNA von Interesse in das mycobakterielle Chromosom ermöglicht. Beispielsweise tritt in M. leprae eine repetitive Sequenz auf, die mit einer Rekombination verbunden zu sein scheint; analoge Sequenzen können in BCG und M. smegmatis identifiziert und aus diesen isoliert werden, in das E. coli-Cosmid eingebaut werden (zusammen mit dem selektierbaren Marker) und einen hohen Rekombinationsgrad zur Folge haben.

Ein Gen oder Gene von Interesse (die ein oder mehrere Antigene kodieren) kann in das beschriebene Konstrukt (das beispielsweise ein E. coli-Replikon, ein Segment einer mycobakteriellen chromosomalen DNA, die mit einer Rekombination (einer rekombinogenen Sequenz) und zwei selektierbaren Markern verbunden ist – von denen einer als Marker in E. coli und der zweite als Marker im Mycobakterium dient) eingebaut werden. Das Gen (die Gene) können dann in die mycobakterielle chromosomale DNA eingebaut werden, wie beispielsweise BCG oder M. smegmatis chromosomale DNA. Wenn das Gen (die Gene) von Interesse auf diese Weise in M. smegmatis eingebaut wird, können dieses/diese ebenfalls in BCG mittels eines allgemein transduzierenden Phagen bewegt werden. Es wird in diesem Falle bevorzugt, zusätzlich zu den anderen Konstruktbestandteilen zwei rekombinogene Sequenzen einzuschließen: eine von M. smegmatis und eine von BCG.

Verfahren zur Erzeugung und zur Verwendung der rekombinanten Mycobakterien der vorliegenden Erfindung sind ausführlich in den anschließenden Abschnitten beschrieben. Solche Abschnitte beschreiben und führen beispielhaft Folgendes auf: die Einbringung von DNA von Interesse in Mycobakterien mittels eines Shuttle-Phasmids, um die DNA von Interesse in die mycobakterielle chromosomale DNA einzubauen; die Einbringung von DNA von Interesse in die Mycobakterien mittels eines Shuttle-Plasmids, um Mycobakterien zu erzeugen, in denen die DNA von Interesse episomal exprimiert wird; die Einbringung von DNA von Interesse in Mycobakterien mittels eines rekombinanten Plasmid-Vektors, um DNA von Interesse in mycobakterielle chromosomale DNA durch homologe Rekombination zu integrieren; Eigenschaften der rekombinanten Mycobakterien; und Verwendungen solcher Produkte.

Einbringung von DNA von Interesse mittels eines Shuttle-Phasmids

Die vorliegende Arbeit hatte die Identifizierung eines Mycobakteriophagen zur Folge, der stabil M. smegmatis lysogenisiert. Von einer solchen Phage, nämlich L1, wurde kürzlich berichtet, dass sie trübe Plaque auf M. smegmatis erzeugt und vermeintliche Lysogene waren gegenüber einer Superinfektion resistent und konnten zur Produktion von Phagen induziert werden. Doke, S., J. Kunamoto, Med. Soc. 34: 1360–1373 (1960). Tokunaga, T. & Sellers, M. I. in Host-Virus Relationships in Mycobacterium, Norcardia, and Actinomycetes (Hsg. Juhasz, S. E. 6 Plummer, G.), 227–243 (Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1970). Diese Beobachtungen wurden bestätigt und zusätzlich hat eine Southern-Analyse demonstriert, dass ein Prophage in das M. smegmatis-Chromosom integriert wird (5, Tafel B, Bahnen 2, 3). Eine Analyse multipler unabhängiger Lysogene zeigte identisch Muster einzigartiger Banden, die sich aus der Phagen-Integration ergaben, was nahelegt, dass die L1-Phagenintegration ortsspezifisch ist (5, Tafel B).

L1 hat sich somit als M. smegmatis stabil lysogenisierend erwiesen. L1-Shuttle-Phasmide wurden durch Einbringung des E. coli-Cosmids, nämlich pHC79, das einen ColEI-Replikationsursprung und ein Ampicillin-Resistenzgen zur Selektion in E. coli enthielt, in eine nicht-essentielle Region des L1-Genoms konstruiert (6). Das L1-Shuttle-Phasmid, bezeichnet als phAE15, replizierte in E. coli als Plasmid und in Mycobakterien als Phage und integriert wie die Stamm-Phage in das M. smegmatis-Chromosom (5, Tafel B, Bahnen 4, 5). Dem L1-Phagen fehlen EcoRI-Stellen. Die Einbringung von pHC79 ergab eine einzigartige EcoRI-Stelle für den phAE15-Shuttle-Vektor, wodurch es möglich gemacht wurde, Gene von Interesse einzubringen. Es wurde gezeigt, dass diese Gene in die Mycobakterien nach Lysogenisierung mit dem Shuttle-Phasmid-Vektor (6) eingebracht und stabil gehalten werden können.

Ein 1,6 kb Fragment, das das Aminoglycosidphosphotransferase-(aph)-Gen von Tn903 enthielt, das in E. coli eine Kanamycin-Resistenz verleiht, wurde durch eine Cosmid-Klonierungsstrategie in phAE15 eingebracht. Oka, A., Sugisaki, H. & Takanami, M., J. Biol. 147, 217–226 (1981). Das aph-Gen mit EcoRI-Enden wurde in lineare phAE15-DNA ligiert und in vitro in Bakteriophagenlambda-Köpfe verpackt. Die sich ergebenden rekombinanten Moleküle wurden in E. coli transduziert. Geschlossene ringförmige Phasmid-DNA wurde aus einem E. coli-Klon isoliert, der sowohl gegenüber Ampicillin als auch Kanamycin resistent war und wurde in M. smegmatis-Protoplasten transfiziert. Dies hatte mycobakterielle Phagenteilchen zur Folge, die verpackte Phasmid-DNA aufwiesen. Dieses Phasmid, bezeichnet als phAE19, wies die Fähigkeit auf, M. smegmatis-Zellen zu lysogenisieren und Kanamycin-Resistenzkolonien zu erzeugen (7). Mycobakteriophagen, die aus diesen Lysogenen induziert wurden, kotransduzierten eine Immunität gegenüber einer L1-Infektion und einer Kanamycin-Resistenz für empfindliche M. smegmatis-Zellen, was demonstriert, dass die Resistenz gegenüber Kanamycin aus der Expression des klonierten aph-Genes folgte. phAE19 kann ebenfalls M.-bovis-BCG lysogenisieren und auf dieses eine Kanamycin-Resistenz übertragen.

Die Kanamycin-Resistenz stellt somit den ersten verwendeten selektierbaren Marker für die Mycobakterien dar. Zusätzlich demonstrieren diese Ergebnisse, dass eine Lysogenie ein Mittel ist, durch das DNA von Interesse in Mycobakterien eingebracht und exprimiert werden kann.

Einbringung von DNA von Interesse mittels eines Shuttle-Plasmids

Die Einbringung von DNA von Interesse mittels eines Shuttle-Plasmids erweitert die Möglichkeiten bzw. Fähigkeiten von Phagen durch Bereitstellen einer erhöhten Klonierungskapazität, Erleichterung einer DNA-Manipulation und einer erhöhten Kopienzahl. Plasmide von M. smegmatis wurden bis jetzt nicht beschrieben und die genetische Manipulation in Mycobakterien ist schwierig. Deswegen wurde ein Shuttle-Plasmid-Vektor, der zum Replizieren und Exprimieren von DNA von Interesse sowohl in E. coli als auch Mycobakterien in der Lage ist, wie folgt konstruiert. Um ein funktionelles Replikon für Mycobakterien sicherzustellen, wurde ein E. coli-Plasmid, nämlich pIJ666, das das Neomycin/KanamycinphosphotransferaseII (neo)-Gen von Tn5 enthält und der P15A Replikationsursprung und das Chloramphenicolacetyltransferase(cat)-Gen von pACYC 184 zufallsbedingt in das Plasmid pAL5000 eingefügt, das sich in M. fortuitum repliziert. Kieser, T. und R. E. Melton, Gene, 65: 83–91 (1988); Berg, D. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3628–3632 (1975); Chang, A. C. Y. und S. N. Cohen, J. Bact., 134: 1141–1156 (1978); Labidi, A. et al., FEMS Microbiology Letters, 30: 221–225 (1985). 8 stellt die Konstruktion der pIJ666::pAL5000-Bibliothek dar.

Die Transformation dieser Bibliothek in M. smegmatis-Spheroplasten war schwierig, was möglicherweise auf das Problem der Regenerierung lebensfähiger Zellen zurückzuführen war. DNA wurde deswegen direkt in intakte M. smegmatis-Zellen durch Elektroporation eingeführt, um eine mögliche Schädigung mycobakterieller Zellen zu vermeiden, die sich aus der Verwendung von Vorschriften zur Herstellung von Spheroplasten ergeben könnte. Bedingungen wurden zur Elektroporation lytischer Phagen-DNA entwickelt, die mehr als 5 × 103 pfu/&mgr;g ergab. Die Elektroporation der pIJ666::pAL5000-Bibliothek unter diesen Bedingungen in M. smegmatis ergab Kanamycin- und Chloramphenicol-resistente Transformanten. Plasmid-DNA, die aus Pools von M. smegmatis-Transformanten in drei getrennten Experimenten isoliert wurde, wurde zurück in E. coli transformiert, unter Selektion nach einer Kanamycin-Resistenz. Obwohl pIJ666 an unterschiedlichen Stellen in das pAL5000-Genom in vielen der isolierten E. coli-Transformanten eingefügt wurde, waren alle Plasmide in beiden Spezies (9) stabil. Diese Verfahren haben es möglich gemacht, einige BCG-Vakzin-Stämme mit der rekombinanten pIJ666::pAL5000-Bibliothek unter Expression einer Kanamycin-Resistenz wie in Beispiel 9 beschrieben und in 10 dargestellt, zu transformieren. Tafel A von 10 zeigt Kanamycin-resistente BCG-Kolonien, die sich nach einer Elektroporation von BCG-Zellen mit Shuttle-Plasmid-DNA entwickelten; Tafel B zeigt Kanamycin-resistente BCG-Kolonien, die sich nach einer Elektroporation ohne Shuttle-Plasmid-DNA ergaben. Unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes wurde das 65 kD M. leprae-Gen in BCG eingebracht, in dem es exprimiert wurde, wie durch die in 17 dargestellten Ergebnisse gezeigt wird.

Plasmid-Vektor zur Integration von DNA von Interesse in mycobakterielle genomische DNA

Ein Plasmid-Vektor, der zum Integrieren von DNA nicht-mycobakteriellen Ursprungs (d. h. aus einer anderen Quelle als die Mycobakterien, in die sie integriert wird) in mycobakterielle genomische DNA verwendet wurde, wurde wie in 11 dargestellt konstruiert. Die Isolierung des M.-bovis-BCG PyrF-Gens wurde wie folgt und wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt. M.-bovis-BCG-DNA wurde teilweise mit einem Restriktions-Enzym Sau3A digeriert, nach der Größe selektiert und in den Vektor pUC19 eingefügt. Die sich ergebende Bibliothek wurde zum Transformieren von E. coli-Zellen verwendet, die eine Insertion im E. coli-PyrF-Gen aufwiesen. Vier unabhängige Kolonien, die die Fähigkeit zum Wachstum in Abwesenheit von Uracil erwarben, wurden identifiziert und die Plasmid-DNA wurde aus diesen isoliert. Die Plasmid-DNA wurde dazu verwendet, den rekombinanten Plasmid-Vektor zu konstruieren. Das PyrF-Gen von M. smegmatis wurde in den pUC19-Plasmid-Vektor an der BamHI-Stelle eingebaut und das Kanamycin-Resistenzgen (Kan) wurde in das PyrF-Gen an der BamHI-Stelle unter Verwendung bekannter Technologien eingefügt. PyrF+-Zellen sind dazu in der Lage, in Medium ohne Uracil zu wachsen und sind Fluororotsäure-empfindlich (FOAS); PyrFZellen benötigen Uracil zum Wachstum und sind Fluororotsäure-resistent (FOAR). Zellen, die ein Kanamycin-Resistenzgen enthalten, sind Kanamycin-resistent (KANR) und solche ohne das Gen sind Kanamycin-empfindlich (KANS). Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Seite 1.5.4, Green Pub. (1987). Plasmid-DNA, die DNA von pUC19, Mycobacterium smegmatis und Tn903 enthielt, bezeichnet als pRH1100, wurde gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) unter der Zugangsnummer 40468 (Hinterlegungsdatum 6. Juli 1988) hinterlegt. Alle Beschränkungen bezüglich des öffentlichen Zugangs der Hinterlegung werden unwiderruflich nach Erteilung eines US-Patentes auf Grundlage dieser Anmeldung entfernt werden.

Stabile Integration von DNA nicht mycobakteriellen Ursprpungs in mycobacterielles genomisches Material

Wie unten und im Beispiel 10 beschrieben, wurde eine Elektroporation zum Einbringen des sich ergebenden rekombinanten Plasmid-Vektors in Mycobakterien verwendet. Wie in 12A dargestellt, trat in Zellen, die mit dem rekombinanten Plasmid transformiert wurden, eine homologe Rekombination zwischen den Sequenzen auf dem eintretenden rekombinanten Plasmid, das das PyrF-Gen enthielt, und homologen bakteriellen chromosomalen (genomischen) Sequenzen auf, wobei die ankommenden PyrF- und Kan-Sequenzen integriert wurden. Mycobakterielle Zellen, die das integrierte rekombinante Plasmid enthalten, das das Kan-Gen enthält, wurden durch Kultivieren der elektroporisierten Zellen auf Kanamycin-enthaltendem Medium kultiviert. Nur solche Zellen, bei denen eine Integration des Kan-Genes auftrat, überlebten.

Mycobakterielle Zellen, bei denen die DNA von Interesse (hier das Kan-Gen) identifiziert wurden, wurden wie folgt behandelt. Das gesamte integrierte rekombinante Plasmid ist instabil, weil das mycobakterielle Genom, in das es integriert wird, zwei identische Sequenzen in enger Nachbarschaft zueinander enthält. Als Folge kann eine Rekombination homologer Sequenzen erneut eintreten. Dies hat ein Looping-out (ebenfalls als Resolution bezeichnet) zur Folge, was eine Entfernung des rekombinanten Plasmids zur Folge hat, wodurch keine Nettoveränderung dessen mycobakteriellen Genoms erzeugt wird, oder was eine Entfernung des rekombinanten Plasmids in einer solchen Weise zur Folge hat, dass das Kan-enthaltende PyrF-Gen im mycobakteriellen Genom verbleibt. Die Resolution tritt mit einer niedrigen oder geringen Häufigkeit auf, jedoch können Zellen, bei denen diese auftrat, identifiziert und auf Basis des Phänotyps, den sie zeigen, isoliert werden. PyrF+-Zellen (solche, bei denen sich die Nettoveränderung im Gen ergibt), wie in 12 angezeigt, werden Kanamycin-empfindlich und Fluororotsäure-empfindlich (FOAS) sein. Zellen, bei denen die Resolution einen Einbau des Kan-enthaltenden PyrF-Gens zur Folge hat, sind Kanamycin-resistent und zeigen FOAR, weil das PyrF-Gen zerstört und somit nicht funktionell ist. Somit hat das Ausplattieren der mycobakteriellen KANR Population auf FOA-enthaltendem Medium die Identifizierung von Zellen zur Folge, bei denen das Kan-Gen stabil in genomische DNA integriert wird (12B, links unten: KANR, FOAR).

Somit wurde das Kan-Gen stabil in das mycobakterielle Genom unter Verwendung einer homologen Rekombination benachbarter PyrF-Sequenzen integriert. Ein bedeutender Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, das in 12B veranschaulicht ist, besteht darin, dass die Integration der DNA von Interesse ohne begleitende Integration von Plasmid- oder Phagen-DNA in das Genom eintritt. Das heißt, die Nettowirkung besteht darin, dass die Plasmid-Sequenzen nicht in den rekombinanten mycobakteriellen Zellen vorliegen. Eine Expression des Kan-Gens wurde ebenfalls demonstriert, und Zellen, in denen sowohl Integration als auch Resolution auftrat, wurden auf Basis des Zellphänotyps (in diesem Falle KANR, FOAR) selektiert. In der oben beschriebenen Arbeit wurde DNA nicht-mycobakteriellen Ursprungs (d. h. Kanamycin-Resistenzgen) erfolgreich eingebracht und stabil in die genomische M. smegmatis-DNA integriert. Dieselben Techniken können dazu verwendet werden, DNA nicht-mycobakteriellen Ursprungs in M.-bovis-BCG oder andere mycobakterielle genomische DNA einzubringen.

Stabile Integration von DNA, die ein Antigen oder Antigene kodiert, in mycobakterielle genomische DNA Einbau eines unterbrochenen PyrF-Gens

In einer ähnlichen Weise kann DNA, die ein oder mehrere Antigene kodiert, gegen die eine Immunreaktion erwünscht ist, in mycobakterielle genomische DNA eingebaut werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung, durch das DNA von Interesse in mycobakterielle genomische DNA integriert wird, ist schematisch in 13 dargestellt. Das Verfahren wird unter spezieller Bezugnahme auf die Integration von DNA beschrieben werden, die das 65-KD-M. leprae-Gen in M. smegmatis ist, die durchgeführt wurde (siehe Beispiel 11). Es sollte jedoch klar sein, dass derselbe Ansatz dazu verwendet werden kann, das M. leprae-65-Gen in andere Mycobakterien einzubringen, ebenso wie die DNA, die andere Polypeptide oder Proteine kodiert, gegen die eine Immunreaktion erwünscht ist, in M.-bovis-BCG, M. smegmatis oder andere Mycobakterien zu integrieren.

Die Integration von DNA, die ein ausgewähltes Antigen (bezeichnet als Fan, für Fremdantigen) kodiert, ist in 13 dargestellt. Ein geeigneter Plasmid-Vektor (beispielsweise einer, der sich in E. coli, jedoch nicht in Mycobakterien replizieren kann), wie beispielsweise das rekombinante pUC19-Plasmid, dargestellt in 13, wird verwendet. Das rekombinante Plasmid schließt ein mycobakterielles Gen oder DNA-Sequenzen ein, wie beispielsweise das in 13 repräsentierte PyrF-Gen. Sequenzen in diesem Gen, die zu solchen im mycobakteriellen Genom homolog sind, stellen die Grundlage für die homologe Rekombination zwischen Plasmid-getragenen mycobakteriellen Sequenzen und genomischen mycobakteriellen Sequenzen dar. Das rekombinante Plasmid schließt ebenfalls DNA-Sequenzen ein, die zur Replikation und Selektion in E. coli notwendig sind, und DNA-Sequenzen, die zur Selektion in Mycobakterien notwendig sind. Die Sequenzen zur Verwendung in der Selektion übertragen auf die Zelle einen unverkennbaren Phänotyp, wodurch es möglich gemacht wird, Zellen, die das Gen enthalten, zu identifizieren und zu isolieren. Das Gen kann beispielsweise eine Arzneistoffresistenz kodieren. In 13 schließt das rekombinante Plasmid ein Gen ein, das eine Kanamycin-Resistenz einschließt, wodurch es möglich gemacht wird, Mycobakterien zu selektieren, die das Gen enthalten, einfach durch Kultivieren auf Kanamycin-enthaltendem Medium. Das rekombinante Plasmid enthält ebenfalls DNA, die ein oder mehrere Polypeptide oder Proteine kodiert, gegen die eine Immunreaktion erwünscht ist (als Fan bezeichnet), die sich in die mycobakterielle genomische DNA integriert.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde das 65-KD-Gen von M. leprae in genomischer M. smegmatis DNA durch Verwendung eines rekombinanten Plasmids integriert, wie es in 13 dargestellt ist, bei dem Fan das M. leprae-Gen ist.

Das rekombinante Plasmid (beispielsweise ein Plasmid, das das PyrF-Gen enthält, in das das 65-kD-M. leprae-Gen und ein Kan-Gen eingefügt wurden), wurde in mycobakterielle Zellen (M. smegmatis) unter Verwendung von Elektroporations-Standardtechniken eingebracht (siehe Beispiel 11). Die einer Elektroporation unterzogenen Zellen wurden dann auf Kanamycin-enthaltendem Medium ausplattiert. Nur Kanamycin-resistente (KANR)-Zellen wuchsen unter diesen Bedingungen; solche Zellen wiesen in der genomischen DNA das KANR-Gen und das M. leprae-Gen integriert auf und waren ebenfalls FOAS (aufgrund des zerstörten PyrF-Genes aus dem rekombinanten Plasmid und aus dem Mycobakterium).

Die Zellen wurden anschließend auf ein FOA-enthaltendes Medium übertragen, um solche Zellen zu identifizieren, bei denen das Fan-Gen (hier da M. leprae-Gen) stabil in genomische DNA integriert wurde. Wie in der unteren Tafel von 13 (linke Seite) angezeigt, ist in die genomische DNA solcher Zellen (KANR, FOAR) das gestörte bzw. zerstörte PyrF-Gen integriert, das das Kanamycin-Resistenzgen und das Fan-Gen enthält. Wie auf der rechten Seite der unteren Tafel angezeigt, verbleiben mycobakterielle Zellen, die ein Looping-out mit der Folge durchlaufen haben, dass nur ein vollständiges PyrF-Gen im Genom zurückbleibt, sowohl Kanamycin-empfindlich als auch Fluororotsäure-empfindlich.

Somit wurde, wie oben und in Beispiel 11 beschrieben, es möglich, in mycobakterielle genomische DNA DNA zu integrieren, die ein Protein-Antigen kodiert, um solche Zellen zu identifizieren und auszuwählen, die die stabil integrierte DNA von Interesse enthalten. Zusätzlich wurden solche DNA von Interesse in das mycobakterielle Genom an einer ausgewählten Stelle integriert (in diesem Falle an der PyrF-Gen-Stelle). Derselbe Ansatz kann dann natürlich dazu verwendet werden, DNA von Interesse in andere ausgewählte Stellen auf mycobakterieller genomischer DNA zu integrieren. In diesem Falle kann ein Ort bzw. eine Stelle auf dem Genom, an dem die Integration erwünscht ist, ausgewählt werden. Ein rekombinantes Plasmid, das Sequenzen enthält, die zu ausgewählten genomischen Sequenzen homolog oder ausreichend ähnlich sind; DNA von Interesse; Sequenzen, die zur Replikation und Selektion in E. coli notwendig sind; und DNA-Sequenzen, die zur Selektion in Mycobakterien notwendig sind, können konstruiert werden, wie es vorher beschrieben wurde. Die DNA von Interesse kann stabil in mycobakterielle genomische DNA integriert werden und Zellen, die die stabil integrierte DNA von Interesse enthalten, können in der vorher beschriebenen Art und Weise selektiert werden.

Es ist möglich, die Gesamtheit oder einen Teil irgendeines Gens, dessen Expression in Mycobakterien erwünscht ist, unter Verwendung desselben Verfahrens in Mycobakterien einzubringen. Das heißt, das nachfolgende Verfahren kann dazu verwendet werden, DNA von Interesse stabil in ein mycobakterielles Genom zu integrieren:

Ein rekombinanter Plasmid-Vektor, der sich in E. coli, jedoch nicht in Mycobakterien replizieren kann und der Folgendes einschließt:

  • 1. Ein mycobakterielles Gen oder ein Teil hiervon, notwendig zur Rekombination mit homologen Sequenzen im Genom von Mycobakterien, die mit dem rekombinanten Plasmid transformiert werden;
  • 2. die Gesamtheit oder ein Teil eines Gens, das ein Polypeptid oder Protein kodiert, dessen Expression in Mycobakterien erwünscht ist, die mit dem rekombinanten Plasmid transformiert wurden;
  • 3. DNA-Sequenzen, die zur Replikation und Selektion in E. coli notwendig sind; und
  • 4. DNA-Sequenzen, die zur Selektion in Mycobakterien (beispielsweise als Arzneistoffresistenz) notwendig sind.


werden dazu verwendet, mycobakterielle Zellen, beispielsweise M. smegmatis oder M.-bovis-BCG zu transformieren. Das rekombinante Plasmid wird in mycobakterielle Zellen unter Verwendung bekannter Techniken eingebracht. In einer Ausführungsform wird das Plasmid mittels Elektroporation unter Verwendung von bakteriellen Standard-Elektroporationsverfahren eingebracht (siehe Beispiel 11).

Elektroporisierte Zellen wurden unter Bedingungen ausplattiert, die eine Selektion von Zellen ermöglichen, bei denen eine Integration eingetreten war. Wie oben beschrieben kann das Plasmid ein Gen enthalten, das eine Arzneistoff-Resistenz enthält, wie beispielsweise eine Kanamycin-Resistenz. In diesem Falle werden die elektroporisierten Zellen auf Medium ausplattiert, die Kanamycin enthalten. Nur Kanamycin-resistente (KANR)-Zellen, die Zellen sind, bei denen die Plasmid-DNA integriert wurde, überleben unter diesen Bedingungen.

Überlebende Zellen werden anschließend unter Bedingungen ausplattiert, die es möglich machen, solche zu identifizieren und auszuwählen, bei denen die DNA von Interesse stabil in die genomische DNA integriert ist. In dem Fall, in dem das PyrF-Gen durch Insertion von DNA von Interesse gestört wurde, werden überlebende Zellen auf FOA-enthaltendem Medium ausplattiert, was es möglich macht, Zellen zu identifizieren, bei denen eine Resolution auftrat, weil sie FOAR sind (und somit in einem solchen Medium wachsen).

Die DNA, die ein Polypeptid oder Protein kodiert, gegen das eine Immunreaktion gewünscht ist, das im rekombinanten Plasmid vorliegt, kann aus einer Quelle isoliert werden, in der es in der Natur vorkommt, erzeugt mittels gentechnischer Standardverfahren in einem geeigneten Wirt oder kann chemisch oder mechanisch synthetisiert werden. In ähnlicher Weise können Plasmid-getragene DNA-Sequenzen, die für die homologe Rekombination notwendig sind, aus einer Quelle isoliert werden, in der sie in der Natur auftritt, erzeugt mittels gentechnischer Standardverfahren oder kann synthetisch, chemisch oder mechanisch synthetisiert werden. Die Charakteristik, die als Basis zur Selektion von mycobakteriellen Zellen, die integrierte DNA von Interesse enthalten, dient, kann wie beschrieben die Arzneistoff-Resistenz sein. Das Gen kann beispielsweise einer Kanamycin-Resistenz, Viomycin-Resistenz, Thiostrepton-Resistenz, Hygromycin-Resistenz oder Bleomycin-Resistenz kodieren. Alternativ kann eine Auxotrophie-Strategie gewählt werden, wie beispielsweise die Selektion, die auf dem Vermögen von Mycobakterien, in denen die Integration erhalten geblieben ist, basieren zu überleben, wenn sie auf geeignetem Medium gezüchtet werden.

Integration von PyrF-DNA von Interesse (Fan)-Kombination

Ein alternativer Ansatz zu demjenigen, der oben beschrieben ist, bei dem ein mycobakterielles Gen (beispielweise PyrF) durch ein Arzneistoff-Resistenzgen und eine DNA von Interesse gestört wird, ist einer, bei dem die DNA von Interesse in ein mycobakterielles Genom ohne zusätzliche Sequenzen (beispielsweise ohne das Kan-Gen) integriert wird, wie es als Folge des früher beschriebenen Verfahrens eintritt. Dieses Verfahren ist in 14 dargestellt.

In diesem Verfahren werden zunächst rekombinante mycobakterielle Zellen, die Targets für eine weitere Manipulation und Einführung von DNA von Interesse sind, erzeugt. Dies kann beispielsweise durch Herstellen eines genauen Ersatzes des mycobakteriellen PyrF-Gens durch ein Kanamycin-Resistenzgen erfolgen. Standard-DNA-Rekombinationstechniken werden in diesem Ersatzverfahren verwendet, bei dem Sequenzen, die das PyrF-Gen flankieren, zur Insertion des Kan-Gens verwendet werden. Das rekombinante Plasmid, bei dem das PyrF-Gen durch Kan ersetzt wird, wird in mycobakterielle Zellen unter Verwendung von Standardelektroporations-Verfahren eingebracht. Die sich ergebenden elektroporisierten Zellen werden auf Medium ausplattiert, das Kanamycin und kein Uracil enthält. Mycobakterielle Zellen, bei denen sowohl das Kanamycin-Resistenzgen als auch das genomische PyrF-Gen vorliegt, werden an diesem Punkt ausgewählt werden. Alle anderen Zellen (KANRUra; KANSUra; KAN RUra+) werden absterben. Zellen, die auf diese Weise ausgewählt wurden, werden anschließend auf Medium ausplattiert, das Kanamycin, Fluororotsäure und Uracil enthält. Wie in 14 dargestellt, hat dies die Selektion mycobakterieller Zellen zur Folge, die Ura und FOAR sind (weil sie kein PyrF-Gen enthalten) ebenso wie KANR (wegen des integrierten Kan-Gens).

Mycobakterielle Zellen, die auf diese Weise erzeugt wurden, werden in diesem Verfahren als Targets (mycobakterielle Target-Zellen) für eine weitere Manipulation unter Verwendung bekannter Techniken verwendet, durch die DNA von Interesse und ein intaktes PyrF-Gen in mycobakterielle genomische DNA integriert werden. Wie in 15 dargestellt ist, wird ein rekombinantes Plasmid, das demjenigen vorher und in Beispiel 10 beschriebenen ähnlich ist, das ein intaktes PyrF-Gen und DNA von Interesse (benachbart oder eng einem Ende des PyrF-Gens folgend) einschließt, verwendet. Das rekombinante Plasmid wird in die mycobakteriellen „Target"-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken eingebracht (die ein Kan-Gen und kein PyrF-Gen einschließen) (beispielsweise durch Elektroporation). Eine homologe Rekombination tritt zwischen Sequenzen auf einer Seite des Kan-Gens auf, das in den mycobakteriellen Targetzellen vorliegt und einer Seite des PyrF-Gens, das im rekombinanten Plasmid vorliegt, was die Integration in die mycobakteriellen Target-Zellgenome der Kombination aus PyrF-Gen – DNA von Interesse zur Folge hat, wie in 15 dargestellt ist.

Einer Elektroporation unterzogene Zellen werden auf Medium ausplattiert, die Kanamycin und kein Uracil enthalten. Lediglich solche Zellen, die das Kan-Gen und das PyrF-Gen enthalten (mit denen die DNA von Interesse in die Zellen eindrang), werden unter diesen Bedingungen überleben. Eine anschließende Kultivierung der überlebenden Zellen auf Medium, das kein zugesetztes Uracil enthält, hat ein Wachstum lediglich solcher Mycobakterien zur Folge, die in ihre Genome die Kombination aus PyrF-Gen – DNA von Interesse aufweisen, wie in 15 dargestellt ist.

In solchen Fällen, in denen die DNA von Interesse aus einer Quelle stammt, die ihr Unvermögen zur Folge hat, in Mycobakterien exprimiert zu werden, kann eine Expressionskassette verwendet werden. Die Expressionskassette kann einen mycobakteriellen Promotor und eine Ribosomen-Bindungsstelle enthalten, die als Expressionssignale dienen werden, die die Expression der DNA von Interesse kontrollieren. Wie in 16 dargestellt ist, kann die Expressionskassette einen Polylinker in Sequenzen einschließen, die das PyrF-Gen umgeben. Als Folge kann die DNA von Interesse eingefügt werden und die mycobakteriellen Signale werden ihre Expression kontrollieren. Eine Selektion mycobakterieller Zellen, in die die PyrF-Expressionskassetten – DNA von Interesse Kombination stabil integriert ist, kann wie vorher in Bezug auf 15 beschrieben, durchgeführt werden.

Ein schwach unterschiedliches, jedoch verwandtes Verfahren, durch das DNA von Interesse in mycobakterielle Genome integriert werden kann, macht Verwendung von Mycobakterien, aus denen die normalerweise vorliegenden PyrF-kodierenden Sequenzen unter Verwendung bekannter Techniken entfernt wurden. Ein rekombinantes Plasmid, das dem vorher beschriebenen ähnlich ist, außer dass es ein intaktes (nicht gestörtes) PyrF-Gen in Kombination mit DNA von Interesse einschließt (befindlich an oder nahe einem Ende von PyrF) wird in ein PyrF-deletiertes Mycobakterium eingebracht (beispielsweise durch Elektroporation). Zellen, die ein intaktes PyrF-Gen enthalten (und somit DNA von Interesse) werden durch Kultivieren elektroporisierter Zellen auf Medium identifiziert, das kein Uracil enthält. Nur Zellen, die das PyrF-Gen enthalten, werden überleben. Ein anschließendes Wachstum auf Medium, das kein Uracil enthält, wird ebenfalls solche Zellen identifizieren, bei denen ein Looping-out eine stabile Integration von PyrF und der DNA von Interesse in das mycobakterielle Genom ergab.

Das Outcome dieser beiden letzteren Ansätze, bei denen PyrF durch ein Kan-Gen ersetzt wird oder PyrF aus dem mycobakteriellen Genom deletiert wird, besteht darin, dass das sich ergebende rekombinante mycobakterielle Genom ein funktionelles PyrF-Gen und die DNA von Interesse einschließt, jedoch nicht ein Gen enthält, das eine Arzneistoff-Resistenz (beispielsweise Kan) oder einen anderen selektierbaren Marker kodiert.

Überblick über Verwendungen und Vorteile von Shuttle-Vektoren und Verfahren der vorliegenden Erfindung

Es existieren zahlreiche Verwendungen für und Vorteile des Phasmids und des Plasmid-Vektors der vorliegenden Erfindung ebenso wie für die Verfahren der vorliegenden Erfindung, in denen diese verwendet werden. Diese sind unten beschrieben und ihre Anwendung beim Konstruieren von Vakzine-Vehikeln ist in den folgenden Abschnitten beschrieben. Als Ergebnis der vorliegenden Erfindung, durch die in Mycobakterien eingebrachte DNA exprimiert wird, sind neue genetische Ansätze zum Verständnis von Fragen der Krankheitspathogenese nunmehr verfügbar. Unter Verwendung entweder von Phagen- oder Plasmid-Vektorsystemen sollte es möglich sein, Gene pathogener Mycobakterien einer Insertionsmutagenese zu unterziehen oder diese zu markieren, entweder durch homologe Rekombination oder durch Transposon-vermittelte Insertion oder Deletion mit dem Ziel der Identifizierung spezifischer genetischer Funktionen, die für die Virulenz und Pathogenese erforderlich sind. Beispielsweise können unter Verwendung der Vektoren und Mycobakterien (beispielsweise M. smegmatis, M.-bovis-BCG) Virulenzgene von M. tuberculosis oder M. leprae identifiziert und Diagnostika (diagnostische Tests) entwickelt werden. Es kann beispielsweise durch spezielles Deletieren oder Ersetzen solcher Gene möglich sein, eine spezifischere und effektiv attenuierte Vakzine gegen Tuberkulose zu entwickeln, als die gegenwärtige M.-bovis-BCG-Vakzine. Alternativ wird es nunmehr möglich sein, weil spezifische protektive Antigene für Tuberkulose und Lepra durch Studie von Antigenen identifiziert wurden, die von T-Zellen resistenter Individuen erkannt werden, diese in gegenwärtig existierenden M.-bovis-BCG-Vakzinen einzubringen und zu exprimieren.

Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind die ersten, die es möglich machen, genomische Bibliotheken in einem Mycobakterium zu konstruieren. Dies ist insbesondere beim Identifizieren von Antigenen oder Enzymen oder Arzneistoff-Targets für ein pathogenes Mycobakterium von speziellem Nutzen. Beispielsweise wird im Falle von M. leprae die genomische DNA geschert und kloniert, um sicherzustellen, dass die gesamte genomische DNA eingeschlossen ist. Unter Verwendung der gegenständlichen Vektoren wird die Bibliothek der M. leprae-Fragmente zunächst in einen bakteriellen Wirt eingebracht, wie beispielsweise E. coli, wo er exprimiert wird. Sie wird anschließend in ein Mycobakterium bewegt (beispielsweise M. smegmatis, BCG). Als Folge liegt die Bibliothek in einem mycobakteriellen Wirt vor, wodurch es effizienter möglich gemacht wird, nach mycobakteriellen Antigenen, Enzymen, Arzneistofftargets und diagnostischen Sonden zu suchen.

Ein Shotgun-Ansatz kann dazu verwendet werden, DNA in BCG einzubringen und Klone zu identifizieren, die Gene enthalten, die es ihnen möglich machen, rascher als gegenwärtig verfügbares BCG zu wachsen, das ein langsam wachsendes Mycobakterium ist. Gene, die auf diese Art und Weise identifiziert wurden, können anschließend dazu verwendet werden, BCG zu erzeugen, das rascher als gegenwärtig verwendetes BCG wächst. Ein ähnlicher Ansatz kann dazu verwendet werden, M. leprae-Gene in ein kultivierbares Mycobakterium zu klonieren und solche rekombinanten Zellen zu identifizieren, die wachsen. Dieser Ansatz kann dazu verwendet werden, M. leprae aus einem kultivierbaren Mycobakterium herzustellen, wodurch die gegenwärtigen Schwierigkeiten bei der Erzeugung des Pathogens gelindert werden.

Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls dazu verwendet werden, neue Arzneistoffe für die Prävention oder Behandlung der Tuberkulose oder Lepra zu identifizieren. Es ist beispielsweise möglich, dass ein Target, gegen das ein Arzneistoff gerichtet sein sollte, ein Enzym ist (beispielsweise Gyrase), erzeugt durch das verursachende Mycobakterium. Die entsprechenden Enzym-kodierenden Gene in M. smegmatis können unter Verwendung der gegenständlichen Vektoren ersetzt werden, durch M. tuberculosis- oder das M. leprae-Enzym kodierende Gen(e). Dieses hat die Herstellung eines rekombinanten M. smegmatis zur Folge, das zum Testen zum Identifizieren von Arzneistoffen verwendet werden kann, die wirksam gegen die Enzyme sind (ebenso wie für Arzneistoffe, die gegen M. avium und M. intracellulare wirksam sind).

Die genetischen Ansätze, die hierin beschrieben sind, haben es klar gemacht, dass sowohl die aph- als auch neo-Gene, die eine Kanamycin-Resistenz kodieren, in M.-bovis-BCG-Vakzinstämmen stabil exprimiert werden (und wurden).

Als Ergebnis der hierin beschriebenen Arbeit sind selektierbare Marker (Gene, die identifizierbare Eigenschaften kodieren, auf denen eine Selektion basiert) nunmehr für Mycobakterien verfügbar. Drei solcher selektierbaren Marker sind nunmehr für Mycobakterien verfügbar: 1. die Chloramphenicol-Acetyltransferase oder das cat-Gen, das eine Chloramphenicolresistenz verleiht; 2. die Aminoglycosid-Phosphotransferase oder das aph-Gen von Tn903, das eine Kanamycin-Resistenz verleiht; und 3. das cl-Gen, das das Repressorprotein der L1-Bakteriophage kodiert. Das Wachstum auf Medien, das den geeigneten Arzneistoff enthält, wird in den Fällen der Arzneistoffresistenz-Gene verwendet, um Mycobakterien zu selektieren, die das cat- oder das aph-Gen enthalten. Eine Selektion von Varianten auf Basis des Aussehens (trüb oder klar) der Plaques, die diese bilden, wenn sie kultiviert werden, wird in dem Fall, in dem das cl-Gen verwendet wird, zur Selektion angewendet.

Als Folge der hierin beschriebenen Arbeit wurde gezeigt, dass eine Lysogenie und eine ortsspezifische Rekombination zwischen spezifischen Orten bzw. Stellen auf der mycobakteriellen chromosomalen DNA und auf dem mycobakteriellen Phagen eintritt, die als Anlagerungs- oder att-Stellen bekannt sind. Bei Bakterien, die mit dem Phagen Lambda infiziert sind, ist der körperliche bzw. physikalische Zustand der Phagen-DNA im lytischen und lysogenen Zustand unterschiedlich. Eine Veränderung von einem dieser Zustände zum anderen schließt eine ortsspezifische Rekombination ein. Die Integration von Lambda-DNA in Wirts-DNA (die zur Folge hat, dass die freien Lambda-DNAs Prophagen-DNAs werden) muss eintreten, damit eine Lysogenie erfolgen kann, umgekehrt muss ein Ausschnitt von Prophagen-DNA aus dem Wirtschromosom zur Lyse auftreten. Eine Integration oder Excision schließt eine ortsspezifische Rekombination ein. Obwohl dieses Phänomen für mehrere Arten von Bakterien bekannt ist, ist dies das erste Mal, dass es für Mycobakterien demonstriert wurde. Es kann als Mittel verwendet werden, durch das DNA von Interesse effizient und stabil in Mycobakterien eingebaut werden kann.

Dies kann beispielsweise durch Verwendung dessen erreicht werden, was als cos-att-Vektor bezeichnet wird. Ein solcher Vektor kann Folgendes einschließen: 1. ein E. coli- oder anderen geeigneten bakteriellen Replikationsursprung; 2. ein Gen, das einen selektierbaren Marker wie beispielsweise eine Ampicillin-Resistenz für eine Selektion in E. coli oder einen anderen bakteriellen Wirt kodiert; 3. die att-Region eines temperaten Phagen, wie beispielsweise L1; 4. die Lambda-cos-Stelle, so dass Lambda-in-vitro-Verpackungssysteme verwendet werden können; und 5. ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert, wie beispielsweise Kanamycin-Resistenz, Chloramphenicol-Resistenz oder das Gen, das den cl-Repressor des Phagen L1 kodiert. Dieser Vektor kann unter Verwendung bekannter Techniken und solcher, die hierin beschrieben sind, konstruiert werden. Vorliegend auf demselben Vektor oder, alternativ, in trans bereitgestellt, können Gene werden, die zur Vermittlung einer Integration des Vektors notwendig sind. Die hierin beschriebene Arbeit hatte die Identifizierung von Plasmid-Replikons zur Folge, die sich exochromosomal in Mycobakterien replizieren (beispielsweise M. smegmatis, BCG). Wie beschrieben, wurde das pAL5000-Replikon identifiziert. Dasselbe Verfahren kann dazu verwendet werden, andere zu identifizieren, die ebenfalls verwendet werden können.

Die beschriebene Arbeit demonstriert ebenfalls die erfolgreiche Konstruktion von mycobakteriellen E. coli Shuttle-Phasmiden, die rekombinante DNA-Moleküle sind, die nicht nur die Fähigkeit dazu aufweisen, sich in E. coli als Plasmide und in Mycobakterien als Phagen zu replizieren, sondern ebenfalls die Fähigkeit aufweisen, in Lambda-Bakteriophagen-Köpfe oder in Mycobakteriophagen-Teilchen verpackt zu werden. Es zeigt weiterhin, dass rekombinante DNA in sowohl rasch wachsendes Mycobakterium (M. smegmatis) als auch langsam wachsendes Mycobakterium (BCG) eingebracht wurde. Dies macht es möglich, M.-bovis-BCG-Vakzinstämme mit den Shuttle-Phasmiden zu infizieren und somit klonierte Gene in Mycobakterien einzubringen. Dies eliminiert somit den Bedarf zur Entwicklung eines Transfektionssystems für BCG. Das heißt, weil das mycobakterielle E. coli Shuttle-Phasmid nach Transfektion der Mycobakterien in mycobakterielle Teilchen verpackt wird, kann DNA von Interesse stabil in langsam wachsende Mycobakterien (beispielsweise M.-bovis-BCG) eher durch Transduktion als Transfektion eingebracht werden. Dies macht es möglicht, rekombinante mycobakterielle Vakzin-Vehikel herzustellen, die zur Immunisierung gegen ein oder mehrere Antigene von Interesse verwendet werden können.

Die Verwendung einer In-vitro-Verpackung zur Konstruktion dieser Phasmide, kann als effiziente Strategie zur Klonierung von Genen in diese Vektoren (beispielsweise Gene oder DNA von Interesse, die ein Antigen oder mehrere Antigene für ein oder mehrere Pathogene kodieren, gegen die eine Immunreaktion erwünscht ist) ausgeweitet werden, so lange die Größenbeschränkungen des Verpackungssystems nicht überschritten werden. Es ist ebenfalls möglich, durch Screening zusätzlicher rekombinanter L1::pHC79-Phasmide die maximale Menge an DNA zu bestimmen, die aus dem L1-Phagen deletiert werden kann und zusätzliche nicht-essentielle Regionen des Phagen-Genoms zu definieren, in die DNA eingefügt werden kann.

Konstruktion genetisch rekombinanter Mycobakterien, die zur Expression von DNA von Interesse nützlich sind

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Konstruktion eines genetisch rekombinanten mycobakteriellen Vehikels zur Expression des Proteins (der Proteine) oder des Polypeptids (der Polypeptide), die durch in das Mycobakterium eingebaute DNA von Interesse kodiert sind, von Nutzen. Solche gentechnisch rekombinanten Mycobakterien weisen viele Verwendungen auf.

Vehikel der vorliegenden Erfindung können beispielsweise als Vakzine zur Induktion einer Immunität gegen das durch die DNA von Interesse kodierte pathogene Antigen induziert werden. Ein Pathogen ist jedes Virus, Mikroorganismus oder anderer Organismus oder Substanz (beispielsweise Toxine), die eine Krankheit verursachen. Ein Vakzinvehikel, das zum Immunisieren gegen Lepra verwendet werden kann, kann hergestellt werden. Wegen der außerordentlichen adjuvanten Aktivität bzw. Wirksamkeit von Mycobakterien, beispielsweise BCG, würde eine solche Vakzine zur Erzeugung einer Zell-vermittelten Immunität, insbesondere einer Langzeit oder andauernden Art, wirksam sein. Gene, die Protein-Antigene des Lepra-Parasiten M. leprae kodieren, wurden durch Young isoliert und sind ausführlich in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Serien-Nr. 892 095, eingereicht am 31. Juli 1986, beschrieben, deren Lehren durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind. Insbesondere wurden Gene, die fünf immunogene Protein-Antigene (d. h. Antigene mit einem Molekulargewicht von 65 kD, 36 kD, 28 kD, 18 kD und 12 kD) kodieren, isoliert. Zusätzlich wurden sechs unterschiedliche Epitope, die durch das Gen für das 65-kD-Antigen kodiert sind, definiert. Es wurde gezeigt, dass zumindest eines dieser Epitope für M. leprae einzigartig ist; es zeigte sich, dass die anderen Epitope mit den 65-kD-Proteinen anderer Mycobakterien geteilt werden.

Durch Verwendung der Shuttle-Vektoren und rekombinanten Plasmid-Vektoren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, in BCG einen oder mehrere der Gene einzubringen, die M. leprae-Proteinantigene kodieren, unter Verwendung der oben und in den folgenden Beispielen beschriebenen Verfahren. Das Gen, das das 65-kD-M. leprae-Protein kodiert, wurde tatsächlich in BCG eingebracht und durch rekombinantes BCG exprimiert. Die Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse (17) zeigten das Vorhandensein sowohl des 65-kD-M. leprae-Antigens als auch des selektierbaren Markers. Beispielsweise kann das Gen, das das 65-kD-M. leprae-Antigen kodiert, in BCG eingebracht, stabil in seine genomische DNA integriert und in Konzentrationen exprimiert werden, die ausreichend sind, eine Immunreaktion in einem Wirt, dem es verabreicht wird, zu stimulieren oder zu induzieren. Wie ausführlich in Beispiel 11 beschrieben ist, wurden monoklonale Antikörper, die für das 65-kD-M. leprae-Protein spezifisch sind, dazu verwendet, eine Expression des 65-kD-M. leprae-Gens in Extrakten von M. smegmatis zu demonstrieren, in das das Gen eingebracht wurde. Zusätzlich wurde das Gen, das das SIV1-Envelope-Protein kodiert, in einen ähnlichen Plasmid-Vektor kloniert, der in M. smegmatis unter Verwendung der für die Kan- und M. leprae-Gene beschriebenen Techniken einzubringen ist. Ein ähnliches Konstrukt zur Einbringung in BCG wurde hergestellt. Es ist auf diese Weise möglich, eine Vakzine zu konstruieren, die beinahe dahingehend ideal ist, als sie ein oder mehrere protektive Antigene von M. leprae enthält, keine tolerogenen Determinanten enthält und eine ausgezeichnete Adjuvanz zum Induzieren einer Zell-vermittelten Immunität aufweist. In einer ähnlichen Weise ist es möglich, unter Verwendung eines Shuttle- oder Plasmid-Vektors und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung eine Vakzine zu konstruieren, so dass ein spezieller Schutz gegen Tuberkulose bereitgestellt wird. Eine solche Vakzine ist insbesondere wegen der kürzlichen oben beschriebenen Erkenntnis attraktiv, dass gegenwärtig verwendete Vakzine sich als uneffektiv herausgestellt haben. Gene, die immunogene Protein-Antigene des Tuberkelbazillus M. tuberculosis kodieren, wurden isoliert und sind in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Serien-Nr. 07/010 007 mit dem Titel „Genes Encoding Protein Antigens of Mycobacterium Tuberculosis and Uses Therefor", von Robert N. Husson und Richard A. Young, eingereicht am 2. Februar 1987 (nunmehr fallengelassen) und in der Continuation-in-part-Anmeldung, Serien-Nr. 07/154 331, eingereicht durch das Express-Mail-Verfahren am 10. Februar 1988) mit dem Titel „Genes Encoding Protein Antigens of Mycobacterium Tuberculosis and Uses Therefor" von Robert N. Husson, Richard A. Young und Thomas M. Shinnick, deren Lehren durch diese Bezugnahme hierin in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen sind, beschrieben.

In diesem Fall wird ein Gen, das ein immunogenes Protein-Antigen von M. tuberculosis kodiert, in BCG mittels eines Shuttle- oder Plasmid-Vektors, wie oben beschrieben, eingebracht. Es ist ebenfalls möglich, mehr als ein M.-tuberculosis-Gen in BCG einzubringen, die jeweils ein Protein-Antigen kodieren. Beispielsweise kann ein Gen, das immunogene M. tuberculosis-Antigene mit einem Molekulargewicht von 12 kD, 14 kD, 19 kD, 65 kD und 71 kD kodieren, oder eine Kombination zweier oder mehrerer dieser Gene, in BCG stabil in die genomische DNA integriert eingefügt und exprimiert werden. Das Ergebnis ist eine Vakzine, die für die Immunisierung gegen Tuberkulose spezifisch ist, und die eine Langzeitimmunität gegen den Bazillus induziert.

Es ist ebenfalls möglich unter der Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, eine Vielzweck- oder multifunktionelle Vakzine zu konstruieren (d. h. ein einziges Vakzin-Vehikel, das DNA von Interesse enthält und exprimiert, die mehr als ein Gen enthält, wobei jedes Gen ein Protein-Antigen für ein unterschiedliches Pathogen oder Toxin kodiert). Es ist beispielsweise möglich, in BCG unter Verwendung des Shuttle-Vektor-Phasmids oder des Plasmid-Vektors, der beschrieben wurde, ein Gen einzubringen, das ein Protein-Antigen für M. leprae kodiert, ein Gen, das ein Protein-Antigen für M. tuberculosis kodiert, ein Gen, das ein Protein-Antigen für Leishmania kodiert und ein Gen einzubringen, das ein Protein-Antigen für Malaria kodiert. Die Verabreichung dieser multivalenten Vakzine würde eine Simulierung einer Immunreaktion gegen jedes Antigen bereitstellen und einen Langzeitschutz gegen Lepra, Tuberkulose, Leishmaniasis und Malaria bereitstellen.

Die rekombinanten Mycobakterien können ebenfalls als Antifertilitäts-„Vakzin"-Vehikel verwendet werden. Beispielsweise können Mycobakterien, die DNA, kodierend Antigene, wie beispielsweise humanes Gonadotropinhormon-(HGH)-Fragmente, enthalten, als Anti-Fertilitätsvakzine verwendet und als Geburtskontrollmittel verabreicht werden. Vakzinvehikel der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung von humanem Krebs, beispielsweise Blasenkrebs oder Melanomen (beispielsweise durch Exprimieren von Wachstumsinhibitoren oder zytotoxischen Produkten) verwendet werden. In diesem Kontext sind rekombinante Mycobakterien, die Interferon &agr;, &bgr; und/oder &ggr;, ein oder mehrere Interleukine (Interleukine 1–7) und/oder TNF &agr; oder &bgr; enthalten, besonders von Nutzen. In einer weiteren Anwendung können rekombinante Mycobakterien dazu verwendet werden, Stressproteine zu exprimieren, entweder zum Zweck, eine protektive Immunreaktion hervorzurufen (beispielsweise gegen eine anschließende oder Langzeitinfektion) oder zum Zweck der Induktion einer Toleranz in einer Autoimmunkrankheit (beispielsweise rheumatoider Arthritis). Stressproteine, beispielsweise solche, die in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Serien-Nr. 207 298 mit dem Titel „Stress Proteins and Uses Therefore" von Richard A. Young und Douglas Young, eingereicht am 15. Juni 1988, beschrieben wurden, können zu diesem Zweck verwendet werden. Wegen ihrer großen Genome (beispielsweise ist das BCG-Genom ungefähr 3 × 106 bp lang) können Mycobakterien große Mengen an DNA von Interesse aufnehmen und können somit als Vielzweckvehikel dienen.

Rekombinante Mycobakterien der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung von Polypeptiden von Interesse, beispielsweise Steroiden, verwendet werden. In diesem Falle wird die Gesamtheit oder ein Teil eines Steroid-kodierenden Gens in einen geeigneten mycobakteriellen Wirt, in dem es exprimiert wird, eingebracht. Somit stellen die rekombinanten Mycobakterien ein wertvolles Mittel zur Herstellung solcher Proteine bereit.

Zusätzlich können die Shuttle-Vektoren und genetisch rekombinanten Mycobakterien der vorliegenden Erfindung in einem diagnostischen Kontext verwendet werden. Beispielsweise wird ein Shuttle-Phasmid, das für einen pathogenen Organismus spezifisch ist (dazu in der Lage ist, DNA hierin einzubringen) (beispielsweise M. tuberculosis, M. avium) und das DNA einschließt, die ein Reportermolekül kodiert (beispielsweise Luciferase von einem Vibrio-Bakterium oder von Glühwürmchen-Ursprung; &bgr;-Galactosidase; &bgr;-Glucoronidase; Carecholdehydrogenase) und einen starken mycobakteriellen Promotor einschließt (die DNA-Sequenz, die zum Beginn der Transkription notwendig ist), der die Expression des Reportermolekülkodierenden Gens kontrolliert (antreibt), konstruiert. Eine Probe (beispielsweise Blut, Urin) wird von einem Individuum, das auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit des pathogenen Organismus überprüft wird, bezogen. Wenn das Individuum beispielsweise auf Tuberkulose getestet wird, wird ein Shuttle-Phasmid, das für M. tuberculosis spezifisch ist, verwendet. Die Probe wird kultiviert und mit einer geeigneten Menge des M.-tuberculosis-spezifischen Phasmids kombiniert. Nach einer kurzen Zeitspanne (beispielsweise mehrere Stunden) unter geeigneten Bedingungen wird die Probe überprüft, unter Verwendung bekannter Techniken auf das Auftreten (Vorhandensein oder Abwesenheit oder, falls erwünscht, der Menge des Reportermoleküls, kodiert durch die DNA im Vektor) untersucht. Sogar wenn die Probe M. tuberculosis in sehr niedrigen Konzentrationen enthält wird die im Phagen vorliegende DNA in den Organismus eingebracht werden. Wenn einmal M. tuberculosis in der Probe vorliegt, wird die Phasmid-(Phagen-)DNA, einschließlich derjenigen, die das Reportermolekül kodiert, repliziert werden. Wenn das Reportermolekül Luciferase ist, wird eine beträchtliche Menge an Luciferase erzeugt werden (weil die Produktion durch einen starken Promotor angetrieben wird) und kann unter Verwendung von Standardgeräten, beispielsweise eines Photometers, nachgewiesen werden. Die Bestimmung der An- oder Abwesenheit einer M. tuberculosis-Infektion in Individuen ist somit möglich, wie es auch eine Quantifizierung ist, falls dies erwünscht ist. Bis die vorliegende Erfindung entwickelt wurde, waren verfügbare Techniken zur Diagnose der Tuberkulose langsam (erforderten beispielsweise mehrere Wochen). Die &bgr;-Galaktosidase, die nunmehr in Mycobakterien exprimiert wird, kann ebenfalls als Reportermolekül verwendet werden.

Bei jeder der Verwendungen der rekombinanten Mycobakterien zur Expression eines Proteins oder Polypeptides ist es möglich, in die Shuttle-Vektor-DNA einzuschließen, die eine Signalsequenz kodiert und somit ein Mittel bereitstellt, durch das das exprimierte Protein oder Polypeptid im Zytoplasma hergestellt und darauf zu den Zellwänden sezerniert wird. Beispielsweise könnte die Signalsequenz aus einem Antigen, das in Mycobakterien sezerniert wird, verwendet werden. Alternativ könnte die Signalsequenz für &bgr;-Galaktosidase, Agarase oder &agr;-Amylase verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr durch die nachfolgenden Beispiele beschrieben, die jedoch nicht als einschränkend aufgefasst werden sollen.

Beispiel 1: Transfektion von M. smegmatis-Spheroplasten mit Mycobakteriophagen-D29-DNA

Spheroplasten des M. smegmatis-Stammes mc26 wurden gemäß des folgenden Verfahrens hergestellt. mc6 ist ein Einzelkolonie-Isolat, das der vorherrschende Kolonietyp ist, der aus der ATCC 607 M. smegmatis-Stammkultur isoliert wird. Er bildet orange grobe Kolonien auf Regenerationsmedien. Hopwood, D. A. et al., In: Genetic Manipulation of the Streptomyces-A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, England (1985).

Spheroplasten von M. smegmatis wurden wie für Streptomyces unter Verwendung von Medien für die Spheroplasten-Herstellung hergestellt, beschrieben von Udou et al. für M. smegmatis. Udou, T. et al., Journal of Bacteriology, 151: 1035–1039 (1982). mc26-Zellen wurden in 40 ml tryptischer Soja-Bouillon, die 1% Glukose und 0,2% Tween 80 enthielt, in einem 250-ml Scheidekolben bei 37°C unter moderatem Schütteln bis zu einem A600-0,2 gezüchtet, und zu diesem Zeitpunkt wurde eine 20%ige Glycin-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 1% zugesetzt. Die Zellen wurden für zusätzliche 16 Stunden inkubiert und darauf bei Raumtemperatur durch Zentrifugieren bei 5000 × g für 10 Minuten geerntet. Das Pellet wurde zweimal mit 10 ml 10,3% Saccharose gewaschen und darauf in Protoplasten(P)-Puffer resuspendiert, der 2 mg/ml Lysozym-Lösung enthielt. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37°C wurden 5 ml P-Puffer zugesetzt und die Spheroplasten wurden durch Zentrifugieren bei 3000 × g für 7 Minuten pelletiert. Der Pellet wurde in 10 ml P-Puffer resuspendiert und innerhalb von 3 Stunden verwendet.

mc2 wurde als spontanes D29-resistentes Isolat der ATCC 607 M. smegmatis-Stammkultur isoliert, wenn 108-Zellen it 3 × 108 D29-Plaque-bildenden Einheiten vermischt und auf tryptischen Soja-Agar-Platten ausplattiert wurden. D29-resistente Kolonien entstanden in einer Frequenz von 10–7.

mc26 Spheroplasten wurden mit 1 &mgr;g D29-DNA vermischt; ein Zehntel des sich ergebenden Gemisches wurde auf tryptischen Soja-Agar-Platten ausplattiert, mit oder ohne 0,5 M Saccharose. Sie wurden dann mit dem geeigneten Soft-Agar, der 108 mc26-Zellen enthielt, überschichtet. Die DNase-Behandlung wurde durch Zusatz von DNase1 (Sigma) in einer Endkonzentration von 50 &mgr;g/ml zu D29-DNA durchgeführt.

Äquivalente Mengen von mc211-Spheroplasten wurden in derselben Weise verwendet, jedoch dann anschließend mit mc26-Zellen zur Bestimmung von Plaque-bildenden Einheiten (pfu) überschichtet.

Phagenplatten-Stammlösungen: Plattenlysate von D29 wurden auf tryptischen Soja-Agar-Medien hergestellt, die 2 mM CaCl2 enthielten. M. smegmatis-Zellen, die in einem Scheidetrichter bis zur Midlog-Phase bei 37°C in Middlebrook 7H9-Bouillon gezüchtet wurden, die eine ADC-Anreicherung enthielt, wurden mit einem Phagen vermischt, in MP-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6–10 mM MgCl2–100 mM NaCl–2 mM CaCl2) verdünnt und bei 37°C für 36 Stunden inkubiert, bis die Platten konfluent wurden. Die Phagen wurden mit MP-Puffer geerntet und dann auf 2 CsCl-Gleichgewichtsgradienten aufgereinigt, gefolgt von einer umfasseden Dialyse gegen MP-Puffer. Die DNA wurde aus Phagen extrahiert, durch Zusatz von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 50 mM und durch Behandlung mit Proteinase K bei 100 &mgr;g/ml bei 55°C für 24 Stunden, gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktion und umfassender Dialyse gegen TE-Puffer.

Transfektion: Für jede Transfektion wurden 2,5 ml der Spheroplastensuspension in einem konischen 15-ml-Polystyrolrohr pelletiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde vorsichtig dekantiert und die Spheroplasten wurden im verbleibenden Tropfenpuffer resuspendiert. Nach Zusetzung von 1 &mgr;g DNA in einem Gesamt-Volumen von weniger als 10 &mgr;l wurden 0,5 ml einer 25% PEG-1000 (J. T. Baker Chemical Col, Phila, PA)-Lösung, hergestellt in P-Puffer, zugesetzt. Die sich ergebende Kombination wurde vermischt. Innerhalb von 3 Minuten wurden 5 ml P-Puffer dem Gemisch zugesetzt und die Spheroplasten wurden wie oben pelletiert. Nach vorsichtigem Abgießen der überstehenden Flüssigkeit wurde das Pellet in 1 ml P-Puffer resuspendiert und die Proben wurden auf einem tryptischen Soja-Agar mit oder ohne 0,5 M Saccharose übertragen. Die Platten wurden dann mit 3,0 ml weichem tryptischen Soja-Agar überschichtet und bei 37°C inkubiert. Die Plaque wurden nach 24 Stunden Inkubation gezählt.

Beispiel 2: Konstruktion des Shuttle-Phasmids phAE1

Die TM4-Phagen-DNA wurde in einer Konzentration von 250 &mgr;g/ml ligiert. Teilmengen wurden teilweise mit Sau3A digeriert, das seriell verdünnt war; Fragmente, die eine durchschnittliche Länge von 30–50 kb aufweisen (wie durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert) wurden auf diese Weise gewonnen. Diese Fragmente wurden in einem 1 : 2-Molverhältnis von TM4-Fragmenten zu pHC79 ligiert, das mit BamHI gespalten wurde. Die Verpackung einer Teilmenge dieser Ligierung mit In-vitro-Verpackungsgemisch (Gigapack plus, Stratagene, San Diego, CA) und eine anschließende Transduktion in ER1381 (hsdR mcrA+ mcrB+, E. Raleigh) ergab 106 Ampicillin-Kolonien pro &mgr;g TM4 DNA-Insert, wenn sie auf L-Agar, der Ampicillin zu 50 &mgr;g/ml enthielt, ausplattiert wurde.

Ein Pool von 40.000 Ampicillin-resistenten Klonen wurde durch Homogenisieren von Kolonien in L-Bouillon mit einem Glaszerstäuber hergestellt. Das Plasmid wurde aus Pools von Klonen durch Alkali-SDS-Extraktion isoliert, gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktion und Konzentration mit Ethanol. Kovalent-geschlossene Plasmid-DNA wurde in mc26-Spheroplasten, wie in Beispiel 1 beschrieben, transfiziert. Die Plaque wurden auf das Vorhandensein von pHC79 durch Durchführung von Plaque-Abhebungen unter Verwendung der Vorschrift von Benton und Davis und von Biotrans Nylonmembranen (ICN) gescreent. Benton, W. D. und R. W. Davis, Science, 196: 180–182 (1977). Die Membranen wurden mit pHC79-DNA hybridisiert, die mit 32P-dCTP Nick-translatiert wurde und eine Autoradiographie wurde durchgeführt.

Beispiel 3: Infektion von BCG und M. smegmatis mit Shuttle-Phasmid phAE1

BCG-Glaxon (W. Jones) wurde in Middlebrook-7H9-Bouillon (Difco), die eine ADC-Anreicherung (Difco) und 0,5% Tween 80 (Sigma) enthielt, in Standkulturen bei 37°C vermehrt. Rasen von BCG-Glaxo oder mc26-Zellen wurde durch Vermischen von 108-BCG-Zellen mit ergänztem weichen Top-Agar und durch Gießen eines Dubos-Agars ohne Tween 80 (Gibco), ergänzt mit OADS-Anreicherung (Difco), hergestellt. Jones, W. D., Jr., Tubercle, 60: 55–58 (1979). Die 4 Phagen, DS6A, TM4, phAE1 und 33D wurden reihenverdünnt und auf die beiden Rasen aufgetüpfelt. Die Platten wurden bei 14 Tagen und 2 Tagen bezüglich BCG-Glaxo bzw. M. smegmatis abgelesen.

Beispiel 4: Klonierung eines Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gens in phAE1

Ein 1,6 kb EcoRI-Fragment, das das Aminoglycosidphosphotransferase-Gen (aph) von Tn903 enthielt, wurde in phAE1 kloniert, in dem aus der Cosmid-Klonierungsstrategie Vorteil gezogen wurde. Plasmid phAE1-DNA wurde aus E. coli isoliert und mit EcoRI geschnitten, wobei das 1,6-Fragment an diese langen DNA-Moleküle ligiert wurde. Das Ligationsprodukt wurde in Lambdaphagen in vitro verpackt, wodurch sich Partikel ergaben, die eine Kanamycin-Resistenz und Ampicillin-Resistenz an E. coli-Zellen transduzierten. Die Plasmid-DNA wurde aus diesen E. coli-Zellen isoliert und es zeigte sich, dass sie hohe Häufigkeiten von Plaquebildenden Einheiten zeigten, wenn sie in M. smegmatis mc26-Protoplasten transfiziert wurde. Dies zeigt, dass es möglich ist, zumindest 1,6 kb zusätzlicher DNA in die einmal vorkommende EcoRI-Stelle von phAE1 zu klonieren. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem Shuttle-Phasmid phAE2, einem Shuttle-Vektor, der ähnliche Eigenschaften wie solche von phAE1 aufweist, jedoch 2 kb kleiner ist als phAE1, erzielt, was die Klonierung von zumindest 3,6 kb zusätzlicher DNA ermöglichen sollte. In beiden Fällen hatte die Einbringung des aph-Gens eine neue NruI-Stelle zur Folge, wodurch ein Beweis bereitgestellt wurde, dass zusätzliche DNA-Fragmente in die Shuttle-Phasmide kloniert und stabil von diesen aufrechterhalten werden können. Somit können diese Vektoren ohne weitere Modifikation zum Klonieren zusätzlicher Gene in Mycobakterien von Nutzen sein.

Beispiel 5: stabile Expression eines selektierbaren Markers in Mycobakterien unter Verwendung eines Shuttle-Phasmids

Shuttle-Phasmide wurden aus dem Phagen L1 (ATTC Nr. 27199) in einer Weise konstruiert, die derjenigen für den TM4-Phagen ähnlich war. Doke, S., Kumamoto Medical Journal, 34: 1360–1373 (1960). Alle identifizierten L1-Shuttle-Phasmide wiesen die Fähigkeiten auf, M. smegmatis zu lysogenisieren. Es zeigte sich, dass L1 sich in das M. smegmatis-Chromosomenmaterial integrierte und stabil Lysogene bildete. Ein weitere Phage, beispielsweise L3 (ATTC Nr. 27200), eine Phage, die als Plasmid (extrachromosomal) verbleibt und L5 (ATTC Nr. 27201) können ebenfalls bei der Konstruktion von Shuttle-Phasmiden verwendet werden. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Shuttle-Phasmide M. smegmatis lysogenisieren werden und es somit möglich gemacht wird, DNA von Interesse zum ersten Mal in Mycobakterien stabil zu integrieren. Das aph-Gen wurde in die einmal vorkommende EcoRI-Stelle des L1-Shuttle-Phasmides kloniert, bezeichnet als PhAE15, wie oben für die TM4-Shuttle-Phasmide in E. coli beschrieben. M. smegmatis-Zellen (mc26) wurden oben auf Agar auf einer Dubos-Agar-Platte überschichtet, die Kanamycin enthielt. Verdünnungen des Shuttle-Phasmids phAE15 und phAE19 (phAE15 mit dem Klon-aph-Gen) wurden auf den Agar-Rasen getüpfelt. Die Platte wurde 5 Tage bei 37°C für 5 Tage inkubiert. Die Kolonien, die wuchsen, wurden alle mit dem L1-Shuttle-Phasmid lysogenisiert, in das das aph-Gen kloniert wurde. Das sich ergebende Shuttle-Phasmid, phAE19, war dazu in der Lage, M. smegmatis-Zellen zu lysogenisieren. Die sich ergebenden Lysogene exprimierten das klonierte aph-Gen, weil sie gegenüber Kanamycin resistent waren. Weiterhin ergaben diese Lysogene Mycobakteriophagen-Teilchen, die ebenfalls den Kanamycin-resistenten Phänotyp nach anschließendem Transfer und Lysogenisierung von Kanamycin-empfindlichen M. smegmatis-Zellen exprimierten. Die Übertragung dieser Phagen hatte eine Co-Transduktion des lysogenen Zustandes zur Folge (d. h. eine Immunität gegenüber einer Superinfektion) und gegenüber einer Kanamycin-Resistenz. Der L1-Phage, verwendet um M. smegmatis zu lysogenisieren, bildete auf BCG keine Plaque. Jedoch wurden Varianten sowohl von L1 als auch des Shuttle-Phasmides phAE19 isoliert, die auf BCG Plaques bilden. Diese können auf ihr Vermögen getestet werden, Gene von Interesse in BCG und M. tuberculosis mittels temperater Shuttle-Phasmide einzubringen und stabil zu exprimieren. Somit weisen diese Phagen die Fähigkeit auf, DNA von Interesse stabil in M. smegmatis einzubringen. Zusätzlich wurden Wirtsbereichsvarianten (beispielsweise phAE19), die BCG infizieren und lysogenisieren, isoliert. Dies hat es möglich gemacht, ein rekombinantes Mycobakterium zu erzeugen, das DNA von Interesse enthält. Solche rekombinanten Mycobakterien können als Vakzine verwendet werden.

Beispiel 6: Integration der Mycobakteriophagen L1 und der L1-Shuttle-Phasmid-DNA in das M. smegmatis-Chromosom

Der Phage L1 wurde durch Ausplattieren des Kulturüberstandes aus einem unspezifizierten Mycobakterium, ATCC 27199, gezüchtet auf tryptischer Sojabouillon, die 0,05% Tween 80 enthielt, auf einem klonierten M. smegmatis-Stamm, nämlich mc26, gewonnen. Jacobs, W. R. Jr., Tuckman, M. & Bloom, B. R., Nature, 327: 532–535 (1987). Der Phage wurde Plaquegereinigt und Plattenlysate mit hohem Titer wurden bei 37°C aus mc26 gewonnen, die auf Dubos Agar-Medium (ohne Tween) gezüchtet wurden, das 2 mM CaCl2 enthielt. Die Phagenteilchen wurden durch CsCl Gleichgewichts-Dichte-Zentrifugation gereinigt und die Phagen-DNA wurde wie früher beschrieben isoliert. Jacobs. W. R. Jr., Tuckman, M & Bloom, B. R., Nature, 327: 532–535 (1987). L1-Shuttle-Phasmide wurden folgend dem früher beschriebenen Protokoll konstruiert unter Verwendung von pHC79 als Cosmid und unter Verwendung der Substitution von L1-DNA für die TM4-DNA. Jacobs, W. R. Jr., Tuckman, M. & Bloom, R. R. Nature, 327: 532–535 (1987). Das aph-Gen von Tn903 wurde in ein L1-Shuttle-Phasmid eingebracht, nämlich phAE154, in dem phAE15 DNA, gespalten an der einmal vor kommenden EcoRI-Stelle, an die Tn903 EcoRI-aph-Kassette (Pharmacia) ligiert wurde. Die sich ergebende Ligation wurde in vivo in Lambda-Phagenköpfe verpackt, die dann in den E. coli-Stamm 2338 transduziert wurden, unter Selektion sowohl für Ampicillin- als auch Kanamycin-Resistenz. Jacobs, W. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 1926–1930 (1986). Plasmid-DNA wurde aus dem E. coli isoliert, in mc26 Protoplasten transfiziert und der sich ergebende Mycobakteriophage wurde als phAE19 bezeichnet. Die Lysogene wurden aus trüben Plaques aufgereinigt, die sich nach Auftüpfeln von Phasmiden auf Agar ergaben, der mc26-Zellen enthielt. Vermeintliche Lysogene wurden auf die Freisetzung von Phagen und auf eine Resistenz gegenüber einer Superinfektion durch L1 getestet. Die chromosomale DNA wurde durch einen Braun-Homogenisierer isoliert, gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktionen. Die Southern-Analyse wurde unter Verwendung von Biotrans (ICN) Nylonmembranen folgend den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die L1-DNA wurde unter Verwendung eines Nick-Translationskits (BRL) und [x-32P]-dCTP (Amersham) radiomarkiert.

Beispiel 7: Expression einer Kanamycin-Resistenz durch Lysogenie unter Verwendung des temperaten Shuttle-Phasmids phAE19

M. smegmatis, mc26 (2 × 107) Zellen, gezüchtet auf Schüttelkulturen bei 37°C in Middlebrook 7H9-Bouillon, ergänzt mit ADC-Anreicherung und 0,05% Tween 80 (M-ADC-TW-Bouillon) wurden mit 3 ml Dubos Topagar vermischt und auf Dubos Agar-Platten überschichtet, die 15 &mgr;g/ml Kanamycin enthielten. Lysate der L1-Shuttle-Phasmide, phAE15 und phAE19 (- phAE15::aph) wurden durch einen 0,45 &mgr;m Filter filtriert und auf ungefähr 5 × 106 pfu/ml unter Verwendung von MP-Puffer verdünnt. Jacobs, W. R. Jr., Tuckman, M. & Bloom, B. R. Nature, 327: 532–535 (1987). Mehrere 10fache Verdünnungen (10 &mgr;l) wurden in den bezeichneten Arealen aufgetüpfelt und die Platten wurden für 5 Tage bei 37°C inkubiert. Wie in 7 dargestellt ist, erschienen Kolonien, wo phAE19 mc26-Zellen lysogenisierte, wodurch eine Expression einer Kanamycin-Resistenz demonstriert wurde. In vielfachen Experimenten wurden Kanamycin-Resistenzkolonien aus spontanen Mutanten weder von mc26-Zellen noch mc26-Zellen beobachtet, die mit phAE15 lysogenisiert wurden. Der M. smegmatis-Stamm, bezeichnet als mc296, der mit phAE19 mc26 lysogenisiert wurde, wurde am 22. Juli 1988 bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) unter der Zugangsnummer 67746 hinterlegt. Alle Beschränkungen des öffentlichen Zugangs bezüglich der Hinterlegung werden unwiderruflich nach Erteilung eines US-Patents auf Grundlage dieser Anmeldung entfernt werden.

Beispiel 8: Konstruktion und Analyse von E. coli-Mycobakterien-Shuttle-Plasmiden

Plasmid pAL5000 DNA, isoliert wie vorher beschrieben, wurde teilweise mit MboI digeriert und lineare Fragmente von 5 kb wurden aus einem Agarose-Gel im Anschluss an die Elektrophorese isoliert. Birnboim, H. & Doly, J., Nucleic Acid Res., 7: 1513–1525 (1979). Diese Fragmente wurden an den positiven Selektionsvektor pIJ666 ligiert, der das neo-Gen enthält, das von Tn5 herrührt und den P15A-Replikationsursprung und das cat-Gen von pACYC 184, das mit BamHI und EcoRV gespalten und in E. coli transformiert wurde. Kisser, T. und R. E. Melton, Gene, 65: 83–91 (1988); Berg, D. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 72: 3628–3632 (1975); Chang, A. C. Y. und S. N. Cohen, J. Bact., 134: 1141–1156 (1978) und Chi, T. et al., J. Bact., 133: 816–821 (1978). Chloramphenicol-resistente Transformanten (200 Kolonien, resistent gegenüber 25 g/ml) wurden gepoolt und in Mischkulturen gezüchtet, aus denen Plasmide isoliert wurden. Birnboim, H. und J. Doly, Nucleic Acid Res., 7: 1513–1525 (1979). Diese Bibliothek von p1J666::pAL5000-Hybridplasmiden wurde in M. smegmatis durch Elektroporation unter Verwendung des Gene-Pulser (Biorad)-Elektroporators transformiert. Chassy, B. M. und J. L. Flickinger, FEMS Microbiology Letters, 44: 173–177 (1987). Frische Kulturen von mc26-Zellen wurden in M-ADC-TW-Bouillon unter Schütteln bis zu einem A600-1,7 gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in Elektroporationspuffer (7 mM Phosphage, pH 7,2–272 mM Saccharose) gewaschen und auf ein Zehntel des Originalvolumens resuspendiert. Plasmid-DNA (1 &mgr;g) wurde einer Elektroporations-Cuvette zugesetzt, die 0,8 ml M. smegmatis-Zellen enthielt. Im Anschluss einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurden die Zellen einem einzigen Elektroporationsimpuls (25 &mgr;F bei 6.250 V/cm) unterworfen, darauf mit einem gleichen Volumen M-ADC-TW-Bouillon bzw. – Nährlösung vermischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann auf 7H10-Agarplatten plattiert, die 10 &mgr;g/ml Kanamycin enthielten und für 7 Tage bei 37°C inkubiert. Die Kanamycin-resistenten Transformanten wurden in 7H9-ADC-TW-Bouillon subkultiviert, die 10 &mgr;g/ml Kanamycin enthielt, und hielten ihre Fähigkeit, Phagen-D29-Plaque zu bilden, bei, was bestätigt, dass sie M. smegmatis waren. Froman, S. et al, Am. J. Public Health, 44: 1326–1334 (1954). Diese Transformaten waren ebenfalls gegenüber 100 &mgr;g/ml Chloramphenicol resistent. Plasmid-DNA wurde aus 1 ml Probe von Zellen durch eine Modifikation des Verfahrens von Birnboim und Doly isoliert, indem über Nacht sequentiell in Lysozym, alkalischer-SDS und zuletzt salzreichem Medium inkubiert wurde. Die aus M. smegmatis isolierte DNA wurde in 2338 transformiert und ergab mehr als 104 Kanamycinresistente E. coli-Transformanten pro &mgr;g DNA. Birnboim, H. und J. Doly, Nucleic Acids Res., 7: 1513–1525 (1979). Alle einzigartigen Plasmide, die aus den individuellen E. coli-Transformanten isoliert wurden, konnten auf M. smegmatis eine Kanamycin- und Chloramphenicol-Resistenz übertragen und transformieren.

Beispiel 9: Transformation von M. smegmatis und BCG mit Shuttle-Plasmid-DNA

Der BCG-Pasteur-Unterstamm P1173P2 wurde in M-ADC-TW-Bouillon unter Schütteln bei 37°C für 5 Tage gezüchtet (geschätzte Lebensfähigkeit 4,5 × 107 cfu/ml). Diese Zellen wurden durch Elektroporation mit der rekombinanten pIJ666:pAL5000- Bibliothek folgend demselben Verfahren, wie oben beschrieben, transformiert und auf 7H10 Agar ausplattiert, der eine ADC-Anreicherung und 20 &mgr;g/ml Kanamycin enthielt. Ein Pool von 45 Kanamycinresistenten BCG-Zellen wurde in Flüssigmedium kultiviert, das 20 &mgr;g/ml Kanamycin enthielt, für 3 Wochen bei 37°C. Aus dieser Kultur wurden Plasmide wie in Beispiel 8 beschrieben isoliert. Sie wiesen alle eine Größe von 11,2 kb auf und übertrugen auf E. coli-Zellen eine Kanamycin-Resistenz, wenn sie transformiert waren. Diese Plasmid-DNA wurde erneut dazu verwendet, BCG-Zellen zu transformieren. Die oben dargestellten Platten wurden für 18 Tage bei 37°C inkubiert und darauf fotografiert. Der BCG-Pasteur-Unterstamm, der mit Shuttle-Plasmid transformiert war, bezeichnet als pYUP1100 (ebenfalls als pYUB13 bezeichnet), der das Gen einschließt, das eine Kanamycin-Resistenz kodiert und das Gen, das eine Chloramphenicol-Resistenz kodiert, wurde am 22. Juli 1988 bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) unter der Zugangsnr. 67745 hinterlegt. Alle Beschränkungen bezüglich des öffentlichen Zugangs zur Hinterlegung werden unwiderruflich nach Erteilung eines US-Patents auf Grundlage dieser Anmeldung entfernt werden.

Das M. leprae-Gen, das das stressinduzierte 65-kDA-Antigen kodiert, wurde ebenfalls in M. smegmatis und BCG eingebracht und exprimiert. Das M. leprae-Gen wurde in ein E. coli-Mycobakterien-Shuttle-Plasmid kloniert, das als pYUB12 bezeichnet wurde, das ein Element der Gruppe von Shuttle-Plasmiden ist, die früher als pYUP bezeichnet wurden, was pY-UP1100 einschließt. Das sich ergebende Konstrukt, pYUB39 wurde sowohl in M. smegmatis als auch BCG-Pasteur transformiert und Zelllysate aus den Transformanten wurden auf SDS-Polyacrylamid-Gel elektrophoretisiert. Das sich ergebende Gel wurde auf eine Nylonmemb ran geblottet, die dann mit einem monoklonalen Maus-Antikörper sondiert wurde, der das M. leprae-spezifische Epitop IIE9 erkennt. Der Blot wurde dann mit Maus-spezifischen Kaninchen-Antikörpern sondiert, die an alkalische Phosphatase gebunden waren, entwickelt für die Phosphatase-Aktivität und fotografiert. Das sich ergebende Gel zeigt, dass das klonierte Gen, das das M. leprae-65-kDa-Fremd-Antigen kodiert, sowohl in M. smegmatis als auch BCG exprimiert wird, wie in 17 dargestellt ist, die eine Fotografie der Western-Blot-Analyse der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Zelllysaten ist, die die rekombinanten Plasmide pYUB12 oder pYUB39 enthalten.

Beispiel 10: Konstruktion eines rekombinanten Plasmids zur Einbringung des Kan-Gens in M. smegmatis und Einbau von Kan in das M. smegmatis-Genom

Die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: RY1103 (DB6507, Bach, M. L. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76: 386–390 (1979)) HB101, pyrF::Tn5, thr-, leu-, pro-, Bl-, r-, m-, suII und RY1107 (DB6566, Rose, M. et al., Gene, 29: 113–124 (1984)) B15, pyrF::Mu, trpam, lacZam, hsdR, m+, Su-. Beide wurden von Dr. David Botstein (Massachusetts Institute of Technology) erhalten. Y1109 (DH5alpha)F, endA1, hsdR17 (rK, mK+), supE44, thil, recAl, gyrA96, rela, del(argF-lacZYA)U169, lambda, phi80dlacZdelM15, das von den Bethesda Research Laboratories bezogen wurde. MC2-6, ein Einkolonien-Isolat M. smegmatis-prototroph, das von Dr. William Jacobs bezogen wurde (Albert Einstein College of Medicine). FOAR-3 ist eine Spontanmutante von MC2-6 zur Uracil-Auxotrophie und Resistenz gegenüber 5-Fluororotsäure. M.-bovis-BCG (Moreau) ist ATCC 35736. M.-bovis-BCG (Montreal) ist ATCC 35735.

Mycobakterielle genomische DNA-Bibliotheken

Genomische M. smegmatis- DNA wurde von MC2-6 nach Wachstum in tryptischer Soja-Bouillon erzielt, ergänzt mit Glucose und Tween 80. Die Kulturen wurden bis zur Sättigung mit Glycin gezüchtet, zugesetzt zu 0,5% für die letzten Stunden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, gewaschen und in 50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA, 10% Saccharose resuspendiert und darauf mit 0,2 mg pro ml Lysozym für 1 Stunde behandelt, gefolgt von 50 mM EDTA und 1% SDS für 15 Minuten. Multiple Phenol : Chloroform-Extraktionen wurden durchgeführt, gefolgt von Isopropanol-Ausfällung, RNAse-Behandlung, Phenol : Chloroform-Extraktion, Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation. Die Pellets wurden mit 70% Ethanol gewaschen und in TE, pH 7,5 resuspendiert. B.-bovis-BCG (Moreau) genomische DNA war eine freundliche Schenkung von Dr. Graskinsky.

Mycobakterielle genomische DNA wurde teilweise mit Sau3A digeriert, durch Agarose-Gelelektrophorese auf DE81-Papier größenselektiert, mit salzreichem Medium eluiert, Ethanol-präzipitiert und in pUC19 ligiert, das mit BamHI gespalten wurde und mit Kalbsdarm-Phosphatase behandelt. DH5alpha, für die Transformation durch das Verfahren von Hanahan kompetent gemacht, wurde mit dieser Ligation transformiert und auf Luria-Bertani-Agar, der 50 &mgr;g/ml Ampicillin enthielt, ausplattiert. Der Anteil der Kolonien, die rekombinante Plasmide enthielten, wurde durch Ausplattieren auf Indikatorplatten bestimmt, die XGal und IPTG enthielten und unter Bestimmung des Verhältnisses von weißen Kolonien zu den Gesamtkolonien (weiß plus blau). Die gepoolte Plasmid-DNA wurde durch Auskratzen von Kolonien von den Platten, durch Resuspendieren in 50 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose erzielt. Die sich ergebende Suspension wurde durch das alkalische Lyse-Verfahren zur Gewinnung von Plasmid-DNA prozessiert. Die rekombinante M. smegmatis-DNA-Bibliothek besteht aus 35.000 unabhängigen initialen Transformanten, von denen 85% rekombinant waren. Die rekombinante M.-bovis-BCG-DNA-Bibliothek besteht aus 64.000 unabhängigen initialen Transformanten, von denen 55% rekombinant waren.

Die Isolierung rekombinanter Plasmide, die das mycobakterielle pyrF-Gen enthalten

Y1103 und Y1107 wurden durch das V erfahren von Hanahan kompetent gemacht, mit der Plasmid-Bibliothek-DNA transformiert und auf minimalen Agar-Platten ausplattiert. Von 180.000 Transformanten, die ursprünglich für die M. smegmatis-Bibliothek gescreent wurden, waren 31 dazu in der Lage, auf minimalem Medium zu wachsen.

Plasmid-DNA-Isolierung, Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung

Plasmid-DNA wurde aus Flüssigkulturen durch das alkalische Lyse-Verfahren isoliert. Eine Restriktionskartierung rekombinanter Plasmid-DNA wurde mit multiplen Enzymen unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. Ein DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung des Didesoxyverfahrens nach Subklonierung in M13mp18 und M13mp19 durchgeführt, unter Verwendung von Sequenzierungskits von New England Biolabs und U.S. Biochemicals.

Beispiel 11: Integration des M. leprae-65-kD-Gens in die M. smegmatis-genomische DNA Konstruktion rekombinanter Plasmide, die eine Kanamycin-Resistenz und das M. leprae-65-kD-Gen exprimieren

pPP25, ein rekombinantes Plasmid, das DNA aus M. smegmatis enthält, die zur Ergänzung von pyrF E. coli in der Lage ist, wurde mit BamHI digeriert und an das 1,3 kB BamHI-Fragment ligiert, das die Aminoglycosidphosphotransferase von Tn903 kodiert, isoliert aus pUC4kSAC. Das EcoRI-Fragment von Y3178, das das M.leprae-65-kD-kodierende Gen enthielt, wurde im Wesentlichen in die einmal vorkommenden XhoI- und EcoRV-Stellen in die mycobakterielle DNA in dieses Plasmid kloniert. In jedem Fall wurden die Transkriptions-Ausrichtungen des mycobakteriellen offenen Leserasters, das Kanamycin-Resistenzgen und das M. leprae-65-kD-Gen als in derselben Ausrichtung vorliegend bestimmt.

Transformation von Mycobakterien durch Elektroporation

M. smegmatis und M.-bovis-BCG wurde in Middlebrook-7H9-Medium gezüchtet, ergänzt mit ADC-Anreicherung und 0,05% Tween 80 (M-ADC-Tw) bis zu einem A600 von ungefähr 0,3 bis 0,5. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 10 mM Hepes pH 7,0 gewaschen, zentrifugiert und in 1/10 Volumen 10 mM Hepes pH 7,0, 10% Glycerol (M. smegmatis) resuspendiert oder in 1/10 Volumen 7 mM Natriumphosphat pH 7,2, 272 mM Saccharose (BCG) gewaschen und resuspendiert. Die DNA wurde zugesetzt und die Zellen wurden einem einzelnen Impuls von 6,25 kV/cm bei 25 Mikrofarad unter Verwendung des Biorad Gene-Pulsers ausgesetzt. 3–5 Volumina M-ADC-Tw wurden darauf zugesetzt, die Zellen wurden für 2–3 Stunden bei 37°C inkubiert, zentrifugiert, in einem kleinen Volumen M-ADC-Tw resuspendiert und auf tryptischen Soja-Agar ausplattiert, der mit 1% Glucose ergänzt war, die 10 &mgr;g/ml Kanamycin (M. smegmatis) enthielt oder auf Middlebrook-7H10-Agar, der mit ADC-Anreicherung ergänzt war, die 10 &mgr;g/ml Kanamycin enthielt.

Southern-Blot-Analyse

Genomische DNA aus mycobakteriellen Transformanten wurde mit Restriktions-Enzymen digeriert, in Agarosegelen elektrophoretisiert, auf Nitrocellulose übertragen und mit DNA sondiert, die mit 32P durch Nicktranslation markiert war, alles unter Verwendung von Standardverfahren.

Western-Blot(Immunblot)-Analyse

Die Expression des 65-kD-M. leprae-Proteins wurde unter Verwendung von Western-Blot-Techniken demonstriert. Lysate von mycobakteriellen und E. coli-Transformanten wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen, auf Nitrocellulose elektrotransferiert und mit dem monoklonalen Antikörper IIIE9 in einer Verdünnung von ungefähr 1 : 1000 unter Verwendung von Standardtechniken sondiert. Der Protoblot-Kit (Promega Biotec) wurde dazu verwendet, die Bindung des Antikörpers nachzuweisen und wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Dies ergab den Nachweis der Expression des 65-kD-Proteins in Zellen, die mit dem das M. leprae-Gen enthaltende Plasmid transformiert waren.

Äquivalente

Der Fachmann auf dem Gebiet wird unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten viele Äquivalente für die speziellen Ausführungsformen der Erfindung, die hierin speziell beschrieben wurden, erkennen oder diese sicherzustellen. Solche Äquivalente sollen vom Umfang der nachfolgenden Ansprüche mit umfasst sein.


Anspruch[de]
  1. Rekombinantes Mycobakterium, das zur Expression heterologer DNA, die ein Lymphokin oder Immunpotentiator kodiert, in der Lage ist und diese eingebaut hat.
  2. Mycobakterium nach Anspruch 1, wobei das Lymphokin ein Interferon oder ein Interleukin ist.
  3. Mycobakterium nach Anspruch 2, wobei das Interferon IFN&ggr; ist.
  4. Mycobakterium nach Anspruch 2, wobei das Interleukin IL-2 ist.
  5. Mycobakterium nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei das Lymphokin oder der Immunpotentiator sezerniert wird.
  6. Mycobakterium nach Anspruch 5, wobei die heterologe DNA weiterhin eine Signalsequenz zur Sekretion umfasst.
  7. Mycobakterium nach Anspruch 6, wobei die Signalsequenz aus &agr;-Antigen, &bgr;-Galaktosidase, Agarose oder &agr;-Amylase ausgewählt ist.
  8. Mycobakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die heterologe DNA unter der Kontrolle einer Expressions-Kassette steht.
  9. Mycobakterium nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei die heterologe DNA unter der Kontrolle eines Promotors steht (beispielsweise ein mycobakterieller Promotor).
  10. Mycobakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die heterologe DNA in das Chromosom integriert ist oder als ein Episom vorliegt.
  11. Mycobakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das aus Folgendem ausgewählt ist:

    (a) Mycobakterium smegmatis;

    (b) Mycobakterium bovis-BCG;

    (c) Mycobakterium avium;

    (d) Mycobakterium phlei;

    (c) Mycobakterium fortuitum;

    (f) Mycobakterium lufu;

    (g) Mycobakterium paratuberculosis;

    (h) Mycobakterium habana;

    (i) Mycobakterium scrofulaceum;

    (j) Mycobakterium intracellulare;

    (k) Genetische Varianten von einem der Vorhergehenden.
  12. Mycobakterium nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei die heterologe DNA:

    (a) IL-2 oder IFN&ggr; kodiert; und

    (b) als ein Episom vorliegt; und

    (c) unter der Kontrolle eines mycobakteriellen Promotors steht; und

    (d) weiterhin eine Signal-Sequenz zur Sekretion des IL-2 oder IFN&ggr; umfasst.
  13. Immunogene/pharmazeutische Zusammensetzung (beispielsweise Vakzine), die das Mycobakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfasst.
  14. Produkt nach einem der vorgehenden Ansprüche zur Verwendung in der Krebstherapie (beispielsweise zur Verwendung in der Behandlung von Blasenkrebs oder von Melanomen).
  15. Verfahren zur Herstellung des Mycobakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das den Schritt umfasst, einen Vektor, der heterologe DNA wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert umfasst, in ein Mycobakterium einzuführen (beispielsweise durch Transformation, beispielsweise durch Elektroporation).
  16. Verfahren nach Anspruch 15, das die folgenden Schritte umfasst:

    (a) Bereitstellen eines Vektors, der wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definierte heterologe DNA umfasst, der beispielsweise Folgendes umfasst: (i) einen selektierbaren Marker, (ii) die heterologe DNA und (iii) einen Anteil einer mycobakteriellen genomischen DNA;

    (b) Transformieren eines Mycobakteriums (beispielsweise durch Elektroporation) mit dem Vektor, um eine homologe Rekombination zwischen dem Vektor-tragenden Anteil der mycobakteriellen genomischen DNA und der entsprechenden homologen genomischen DNA im Mycobakterium zu bewirken, derart, dass der selektierbare Marker und die heterologe DNA stabil in das mycobakterielle Genom integriert sind.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, das die folgenden Schritte umfasst:

    (a) Bereitstellen eines ersten Plasmids, das einen selektierbaren Marker, begrenzt durch Anteile der mycobakteriellen genomischen DNA enthält;

    (b) Tranformieren eines Mycobakteriums (beispielsweise durch Elektroporation) mit dem ersten Plasmid, um eine homologe Rekombination und anschließende Auftrennung zwischen der im Plasmid getragenen mycobakteriellen genomischen DNA und der entsprechenden homologen genomischen DNA im Mycobakterium zu bewirken, so dass ein mycobakterielles Markergen, das eine zum Identifizieren und Auswählen von Zellen nützliche phänotypische Eigenschaften verleiht (beispielsweise ein Gen, das für den normalen Zell-Metabolismus notwendig ist, beispielsweise pyrF) zumindest teilweise durch den selektierbaren Marker ersetzt oder unterbrochen wird;

    (c) Auswählen von Transformanten aus Schritt (b) auf Basis des selektierbaren Markers, um einen mycobakteriellen Ziel-Stamm zu erzeugen;

    (d) Bereitstellen eines zweiten Plasmides, das die interessierende DNA enthält, begrenzt durch Anteile der mycobakteriellen genomischen DNA, die das gesamte oder einen Teil des mycobakteriellen Markergens umfasst.

    (e) Transformieren des mycobakteriellen Ziel-Stammes mit dem zweiten Plasmid, derart, dass eine homologe Rekombination und eine anschließende Auftrennung zwischen der Plasmid-getragenen mycobakteriellen genomischen DNA und der entsprechenden homologen genomischen DNA im Mycobakterium eintritt, so dass ein Ersetzen des selektierbaren Markers durch die interessierende DNA und die Wiederherstellung des mycobakteriellen Markergens resultiert;

    (f) Identifizieren und Auswählen von Transformanten aus Schritt (e) auf Basis des Vorliegens des rekonstituierten mycobakteriellen Markergens (beispielsweise Wiederherstellung des normalen Zell-Metabolismus).
  18. Verfahren nach Anspruch 15, das die folgenden Schritte umfasst:

    (a) Bereitstellen eines mycobakteriellen Ziel-Stammes, in dem ein mycobakterielles Markergen, das eine zum Identifizieren und Selektieren von Zellen nützliche phänotypische Eigenschaft verleiht (beispielsweise ein Gen, das für den normalen Zell-Metabolismus notwendig ist, beispielsweise pyrF), zumindest teilweise entfernt wird;

    (b) Transformieren des mycobakteriellen Ziel-Stammes mit einem Plasmid, das mycobakterielle Markergen DNA und die heterologe DNA umfasst, derart, dass eine homologe Rekombination und anschließende Auftrennung zwischen der Plasmid-getragenen mycobakteriellen genomischen DNA und der entsprechenden homologen genomischen DNA im Mycobakterium eintritt, so dass eine Rekonstitution des mycobakteriellen Markergens und eine stabile Integration der interessierenden DNA in das mycobakterielle Genom folgt;

    (c) Identifizieren und Selektieren von Transformanten aus Schritt (b) auf Basis des Vorliegens des rekonstituierten mycobakteriellen Markergens (beispielsweise Wiederherstellung des normalen Zell-Metabolismus).
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die heterologe DNA wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert ist.
Es folgen 17 Blatt Zeichnungen






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