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Dokumentenidentifikation DE69532333T2 07.10.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000792363
Titel PESTIZID-PROTEINE UND STÄMME
Anmelder Syngenta Participations AG, Basel, CH
Erfinder WARREN, Wayne, Gregory, Cary, US;
KOZIEL, Gene, Michael, Clive, US;
MULLINS, Alice, Martha, Cary, US;
NYE, James, Gordon, Raleigh, US;
CARR, Brian, Cary, US;
DESAI, Manoj, Nalini, Cary, US;
KOSTICHKA, Kristy, Durham, US;
DUCK, Brendan, Nicholas, Cary, US;
ESTRUCH, Jose, Juan, Durham, US
Vertreter Spott & Weinmiller, 80336 München
DE-Aktenzeichen 69532333
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 27.09.1995
EP-Aktenzeichen 959353947
WO-Anmeldetag 27.09.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/EP95/03826
WO-Veröffentlichungsnummer 0096010083
WO-Veröffentlichungsdatum 04.04.1996
EP-Offenlegungsdatum 03.09.1997
EP date of grant 17.12.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.10.2004
IPC-Hauptklasse C12N 15/32
IPC-Nebenklasse C07K 14/325   C12N 15/62   C12Q 1/68   C12N 15/82   A01N 63/00   A01H 5/00   C12N 1/21   G01N 33/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Bekämpfung von Pflanzen- und Nichtpflanzenschädlingen. Insbesondere werden neue pestizide Proteine offenbart, die aus der vegetativen Wachstumsstufe von Bacillus isolierbar sind. Bacillusstämme, Proteine und Gene mit Codierung für die Proteine werden bereitgestellt. Die Verfahren und Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Systemen zur Bekämpfung von Pflanzen- und Nichtpflanzenschädlingen verwendet werden.

Insektenschädlinge sind ein Hauptfaktor beim Verlust der kommerziell bedeutenden landwirtschaftlichen Früchte auf der Welt. Chemische Breitspektrumpestizide wurden umfangreich verwendet, um Schädlinge von landwirtschaftlicher Bedeutung zu bekämpfen oder auszurotten. Es gibt jedoch ein merkliches Interesse an der Entwicklung wirksamer alternativer Pestizide.

Mikrobielle Pestizide spielten eine wichtige Rolle als Alternativen für die chemische Schädlingsbekämpfung. Das am umfangreichsten verwendete mikrobielle Produkt basiert auf dem Bakterium Bacillus thuringiensis (Bt). Bt ist ein gram-positiver sporenbildender Bacillus, der während der Sporenbildung ein insektizides Kristallprotein (ICP) bildet. Zahlreiche Varianten von Bt sind bekannt, die mehr als 25 unterschiedliche, jedoch verwandte, ICP's produzieren. Die Großzahl der durch Bt hergestellten ICP's sind für Larven bestimmter Insekten in den Ordnungen Lepidoptera, Diptera und Coleoptera toxisch. Im Allgemeinen, wenn ein ICP durch ein empfängliches Insekt aufgenommen wird, wird der Kristall solubilisiert und durch die Insektendarmproteasen in eine toxische Einheit transformiert. Keines der gegenüber käferartigen Larven, wie Colerado-Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata) oder Gelber Mehlwurm (Tenebrio molitor) wirksamen ICP's hat signifikante Wirkungen auf Mitglieder der Gattung Diabrotica, insbesondere Diabrotica virgifera vergifera, den Westlichen Maiswurzelbohrer (WCRW) oder Diabrotica longicornis barberi, den Nördlichen Maiswurzelbohrer, gezeigt.

Bacillus cereus (Bc) ist eng mit Bt verwandt. Ein Hauptunterscheidungsmerkmal ist das Fehlen eines Parasporenkristalls bei Bc. Bc ist ein weit verbreitetes Bakterium, das üblicherweise im Boden angetroffen wird und aus einer Vielzahl von Nahrungsmitteln und Arzneimitteln isoliert wurde. Der Organismus ist bei dem Verderben von Nahrungsmitteln beteiligt.

Obwohl Bt bei der Bekämpfung von Insektenschädlingen sehr geeignet war, besteht ein Bedarf, die Zahl der potentiellen biologischen Bekämpfungsmittel zu erweitern.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen und Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen bereitgestellt. Insbesondere werden neue pestizide Proteine bereitgestellt, die während dem vegetativen Wachstum von Bacillusstämmen gebildet werden. Die Proteine eignen sich als pestizide Mittel.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen im Wesentlichen gereinigten Bacillusstamm, der während dem vegetativen Wachstum ein pestizides Protein liefert, wobei das Bacillus nicht B. sphaericus SSII-1 ist. Bevorzugt sind Bacillus thuringiensis Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-21225 und NRRL B-21439.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein insektenspezifisches Protein, das während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp jedoch vorzugsweise von einem Bacillus thuringiensis Stamm und einem B. cereus Stamm isolierbar ist, und Komponenten hiervon, wobei das Protein nicht das moskitozide Toxin von B. sphaericus SSII-1 ist. Das insektenspezifische Protein gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise gegenüber Coleoptera- oder Lepidoptera-Insekten toxisch und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 30 kDa oder mehr, vorzugsweise von etwa 60 bis etwa 100 kDa und insbesondere von etwa 80 kDa.

Insbesondere weist das insektenspezifische Protein gemäß der vorliegenden Erfindung ein Spektrum einer insektiziden Wirksamkeit auf, die eine Wirksamkeit gegen die Spezies Agrotis und/oder Spodoptera, jedoch vorzugsweise eine Aktivität gegenüber „Ypsiloneule" (Agrotis ipsilon; BCW) und/oder Herbstheerwurm (Spodoptera frugiperda) und/oder Rübenheerwurm (Spodoptera exigua) und/oder Baumwolleule und/oder Corn Earworm (Helicoverpa zea) umfasst.

Das insektenspezifische Protein gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise aus einem Bacillus spp Stamm isoliert werden, der aus den Hinterlegungsnummern NRRL B-21225 und NRRL B-21439 ausgewählt ist.

Bevorzugt ist ein insektenspezifisches Protein, wobei das Protein eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 5 ausgewählt ist, einschließlich beliebiger Proteine, die strukturell und/oder funktionell hierzu homolog sind.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die das Sekretionssignal darstellenden Sequenzen entfernt oder inaktiviert wurden.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren multimere pestizide Proteine, die mehr als eine Polypeptidkette umfassen und wobei mindestens eine der Polypeptidketten ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt und mindestens eine der Polypeptidketten ein Hilfsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt, das die pestizide Aktivität des insektenspezifischen Proteins aktiviert oder verstärkt.

Die multimeren Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung besitzen vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 50 kDa bis etwa 200 kDa.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren Fusionsproteine, die mehrere Proteindomänen einschließlich mindestens einem insektenspezifischen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen und die bei Translation durch Ribosomen ein Fusionsprotein mit mindestens den vereinigten Attributen des insektenspezifischen Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung und optional der weiteren in der Fusion verwendeten Komponenten liefern.

Hier und im Weiteren in der vorliegenden Anmeldung bedeutet eine wesentliche Sequenzhomologie eine nahe strukturelle Verwandtschaft zwischen Sequenzen von Aminosäuren. Beispielsweise können im Wesentlichen homologe Proteine zu 40%, vorzugsweise zu 50% und insbesondere zu 60 oder 80% oder mehr, homolog sein. Die Homologie umfasst auch eine Verwandtschaft, wobei eine oder mehrere Subsequenzen von Aminosäuren fehlen oder Subsequenzen durch weitere Aminosäuren auseinander gesprengt sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, das während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp isolierbar ist, und Komponenten hiervon, wobei das Protein nicht das moskitozide Toxin von B. sphaericus SSII-1 ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, wobei das Spektrum der insektiziden Aktivität eine Aktivität gegenüber der Agrotis- und/oder Spodoptera-Spezies, jedoch vorzugsweise eine Aktivität gegenüber „Ypsiloneule" (Agrotis ipsilon; BCW) und/oder Herbstheerwurm (Spodoptera frugiperda) und/oder Rübenheerwurm (Spodoptera exigua) und/oder Baumwolleule und/oder Corn Earworm (Helicoverpa zea) umfasst.

Bevorzugt ist ein DNA-Molekül, wobei das Molekül eine Nucleotidseqeunz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst, einschließlich beliebiger DNA-Moleküle, die dazu strukturell und/oder funktionell homolog sind.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, das während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp isolierbar ist, und Komponenten hiervon, wobei das Protein nicht das moskitozide Toxin von B. sphaericus SSII-1 ist, wobei die Nucleotidsequenz zur Expression in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze optimiert wurde.

Bevorzugt ist ein DNA-Molekül, wobei das Molekül eine Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 30 umfasst, einschließlich beliebiger DNA-Moleküle, die hierzu strukturell und/oder funktionell homolog sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein DNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein multimeres pestizides Protein codiert, das mehr als eine Polypeptidkette umfasst und wobei mindestens eine der Polypeptidketten ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt und mindestens eine der Polypeptidketten ein Hilfsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt, das die pestizide Aktivität des insektenspezifischen Proteins aktiviert oder verstärkt.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Fusionsprotein codiert, das mehrere Proteindomänen einschließlich mindestens einem insektenspezifischen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst und durch im Rahmen erfolgende genetische Fusionen gebildet wurde, die bei Translation durch Ribosomen ein Fusionsprotein mit mindestens den vereinigten Attributen des insektenspezifischen Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung und optional den Attributen der anderen in der Fusion verwendeten Komponenten liefern.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein DNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Fusionsprotein codiert, das ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, das an eine Signalsequenz, vorzugsweise an eine Sekretionssignalsequenz oder eine Targetsequenz, die das Transgenprodukt zu einer speziellen Organelle oder einem speziellen Zellkompartment steuert, anfusioniert ist, wobei die Signalsequenz von heterologem Ursprung bezüglich der Empfänger-DNA ist.

Die vorliegende Erfindung umfasst des weiteren ein DNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, das zur Expression in einem Mikroorganismus oder in einer Pflanze optimiert wurde.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein optimiertes DNA-Molekül, wobei die für das Sekretionssignal codierenden Sequenzen von seinem 5'-Ende entfernt wurden.

Hier und im Folgenden in der vorliegenden Anmeldung bedeutet wesentliche Sequenzhomologie eine enge strukturelle Verwandtschaft zwischen Nucleotidsequenzen. Beispielsweise können im Wesentlichen homologe DNA-Moleküle zu 60%, vorzugsweise 80% und insbesondere zu 90 oder 95% oder mehr, homolog sein. Eine Homologie umfasst auch eine Verwandtschaft, wobei eine oder mehrere Subsequenzen von Nucleotiden oder Aminosäuren fehlen oder Subsequenzen durch weitere Nucleotide oder Aminosäuren unterbrochen bzw. auseinander gesprengt sind.

Unter die vorliegende Erfindung fallen auch DNA-Moleküle, die an ein DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung gemäß der obigen Definition, jedoch vorzugsweise an eine Nucleotidsonde, die aus dem DNA-Molekül erhältlich ist, das einen nahe benachbarten Bereich der Codiersequenz für das insektenspezifische Protein mit einer Länge von mindestens 10 Nucleotiden umfasst, unter moderaten Stringentenbedingungen hybridisieren und die eine insektenspezifische Aktivität aufweisen, und auch die durch die DNA-Moleküle codierten insektenspezifischen Proteine.

Bevorzugt sind DNA-Moleküle, wobei die Hybridisierung bei 65°C in einem Puffer erfolgt, der 7% SDS und 0,5 M Natriumphosphat umfasst.

Speziell bevorzugt ist ein DNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das die folgenden Stufen umfasst:

  • (a) Gewinnen eines DNA-Moleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, und
  • (b) Hybridisieren des DNA-Moleküls mit einer Oligonucleotidsonde gemäß Anspruch 107, erhalten aus einem DNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst, und
  • (c) Isolieren der hybridisierten DNA.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein insektenspezifisches Protein, wobei das Protein durch ein DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung codiert wird.

Unter die vorliegende Erfindung fällt auch eine Expressionskassette, die ein DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, das operativ mit Expressionssequenzen einschließlich den Transkriptions- und Translationsregulatorsignalen, die für die Expression der assoziierten DNA-Konstrukte in einem Wirtorganismus, vorzugsweise in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze, notwendig sind, und optional mit weiteren Regulatorsequenzen verknüpft ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein Vektormolekül, das eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfasst.

Die Expressionskassette und/oder das Vektormolekül gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise Teil des Pflanzengenoms.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Wirtorganismus, vorzugsweise einen Wirtorganismus, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pflanzen- und Insektenzellen, Bakterien, Hefe, Baculoviren, Protozoen, Nematoden und Algen besteht, der ein DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Expressionskassette, die das erfindungsgemäße DNA-Molekül umfasst, oder ein Vektormolekül, das die Expressionskassette, vorzugsweise stabil eingebaut in das Genom des Wirtorganismus umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren eine transgene Pflanze, vorzugsweise jedoch eine Maispflanze, einschließlich Teilen sowie Nachkommen und Samen hiervon, die ein DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder ein Vektormolekül, das die Expressionskassette umfasst, vorzugsweise stabil eingebaut in das Pflanzengenom umfasst.

Bevorzugt ist eine transgene Pflanze einschließlich Teilen sowie Nachkommen und Samen hiervon, die stabil mit einem DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung, einer das DNA-Molekül umfassenden Expressionskassette oder einem die Expressionskassette umfassenden Vektormolekül transformiert wurde.

Ferner bevorzugt ist eine transgene Pflanze einschließlich Teilen sowie Nachkommen und Samen hiervon, die ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine transgene Pflanze, vorzugsweise eine Maispflanze, gemäß der vorliegenden Erfindung gemäß der obigen Definition, die ferner einen zweiten unterschiedlichen Insektenbekämpfungsgrundbestandteil, jedoch vorzugsweise ein Bt &dgr;-Endotoxin exprimiert. Die genannte Pflanze ist vorzugsweise eine Hybridpflanze.

Teile von transgenen Pflanzen, die unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen sollen und beispielsweise Pflanzenzellen, Protoplasten, Gewebe, Callus, Embryos sowie Blumen, Stämme, Früchte, Blätter, Wurzeln, die in transgenen Pflanzen oder ihren Nachkommen entstehen, die zuvor mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül transformiert wurden und folglich zumindest teilweise aus transgenen Zellen bestehen, sind auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren Pflanzenvermehrungsmaterial einer Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung, die mit einem Samenschutzüberzug behandelt wurde.

Die vorliegende Erfindung umfasst des weiteren einen Mikroorganismus, der mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, einer das DNA-Molekül umfassenden Expressionskassette oder einem die Expressionkassette umfassenden Vektormolekül transformiert wurde, wobei der Mikroorganismus vorzugsweise ein Mikroorganismus ist, der sich auf Pflanzen vermehrt, und stärker bevorzugt ein Wurzeln besiedelndes Bakterium.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Betrifft ein eingekapseltes insektenspezifisches Protein, das einen Mikroorganismus umfasst, der ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine entomozide Zusammensetzung, die einen Wirtorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung, jedoch vorzugsweise einen gereinigten Bacillusstamm in einer Insektizid wirksamen Menge zusammen mit einem geeigneten Träger umfasst.

Weiter unter die vorliegende Erfindung fällt eine entomozide Zusammensetzung, die ein isoliertes Proteinmolekül gemäß der vorliegenden Erfindung alleine oder in Kombination mit einem Wirtorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einem eingekapselten insektenspezifischen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung in einer insektizidwirksamen Menge zusammen mit einem geeigneten Träger umfasst.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten insektenspezifischen Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren ein Applizieren einer das insektenspezifische Protein umfassenden Lösung auf eine NAD-Säule und ein Eluieren von gebundenem Protein umfasst.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Insektenaktivität eines insektenspezifischen Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

Züchten eines Bacillusstammes in einer Kultur;

Gewinnen des Überstands aus der Kultur;

Füttern der Insektenlarven mit dem Überstand und

Bestimmen der Mortalität.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren eines insektenspezifischen Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

Züchten eines Bacillusstammes in einer Kultur;

Gewinnen des Überstands aus der Kultur;

Isolieren des insektenspezifischen Proteins aus dem Überstand.

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zum Isolieren eines DNA-Moleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, das die insektizide Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine zeigt, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

Gewinnen eines DNA-Moleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, und

Hybridisieren des DNA-Moleküls mit aus einer Bacillusspezies erhaltener DNA und

Isolieren der hybridisierten DNA.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur Erhöhung des Insektentargetbereichs durch Verwendung eines insektenspezifischen Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination mit mindestens einem zweiten insektiziden Protein, das von dem insektenspezifischen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung verschieden ist, jedoch vorzugsweise mit einem insektiziden Protein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bt-&dgr;-Endotoxinen, Proteaseinhibitoren, Lectinen, &agr;-Amylasen und Peroxidasen besteht.

Bevorzugt ist ein Verfahren zur Erhöhung des Insektentargetbereichs in einer Pflanze durch Exprimieren in der Pflanze eines insektenspezifischen Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination mit mindestens einem zweiten insektiziden Protein, das von dem insektenspezifischen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung verschieden ist, jedoch vorzugsweise mit einem insektiziden Protein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bt-&dgr;-Endotoxinen, Proteaseinhibitoren, Lectinen, &agr;-Amylasen und Peroxidasen besteht.

Auch unter die vorliegende Erfindung fällt ein Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegenüber einem durch einen Insektenschädling, jedoch vorzugsweise durch die Spodoptera- und/oder Agrotis-Spezies und insbesondere durch einen Insektenschädling, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus „Ypsiloneule" (Agrotis ipsilon, BCW), Herbstheerwurm (Spodoptera frugiperda), Rübenheerwurm (Spodoptera exigua), Baumwolleule und Corn Earworm (Helicoverpa zea) besteht, verursachten Schaden, das das Applizieren einer entomoziden Zusammensetzung oder eines Toxinproteins gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Pflanze oder die Wachstumsfläche der Pflanze umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegenüber einem durch einen Insektenschädling, vorzugsweise jedoch durch die Spodoptera- und/oder Agrotis-Spezies und insbesondere durch einen Insektenschädling, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus „Ypsiloneule" (Agrotis ipsilon, BCW), Herbstheerwurm (Spodoptera frugiperda), Rübenheerwurm (Spodoptera exigua), Baumwolleule und Corn Earworm (Helicoverpa zea), besteht, verursachten Schaden durch Pflanzen einer das insektenspezifische Protein gemäß der vorliegenden Erfindung exprimierenden transgenen Pflanze auf einer Fläche, wo das Schadinsekt vorkommen kann.

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Wirtorganismus, der stabil in sein Genom integriert ein DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst und vorzugsweise ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, durch Transformieren des Wirtorganismus mit einem DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung, einer das DNA-Molekül umfassenden Expressionskassette oder einem die Expressionskassette umfassenden Vektormolekül.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze oder Pflanzenzelle, die stabil integriert in das Pflanzengenom ein DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst und vorzugsweise ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, durch Transformieren der Pflanze bzw. Pflanzenzelle mit einem DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung, einer das DNA-Molekül umfassenden Expressionskassette oder einem die Expressionskassette umfassenden Vektormolekül.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer entomoziden Zusammensetzung, die einen isolierten Bacillusstamm und/oder einen Wirtorganismus und/oder ein isoliertes Proteinmolekül und/oder ein eingekapseltes Protein gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Insektizid wirksamen Menge mit einem geeigneten Träger umfasst.

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung transgener Nachkommen einer transgenen Elternpflanze, die stabil eingebaut in das Pflanzengenom ein DNA-Molekül umfasst, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein insektenspezifisches Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, durch Transformieren der Elternpflanze mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül der Elternpflanze mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, einer das DNA-Molekül umfassenden Expressionskassette oder einem die Expressionskassette umfassenden Vektormolekül und Übertragen der pestiziden Eigenschaft auf die Nachkommen der transgenen Elternpflanze unter Verwendung bekannter Pflanzenzüchtungstechniken.

Auch unter die vorliegende Erfindung fällt eine Oligonucleotidsonde mit der Fähigkeit zur spezifischen Hybridisierung an eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein insektenspezifisches Protein, das während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp isolierbar ist, und Komponenten hiervon, wobei das Protein nicht das moskitozide Toxin von B. sphaericus SSII-1 ist, wobei die Sonde einen benachbarten Bereich der Codiersequenz für das insektenspezifische Protein einer Länge von mindestens 10 Nucleotiden umfasst und wobei die Verwendung der Oligonucleotidsonde zum Screenen eines beliebigen Bacillusstammes oder eines weiteren Organismus zur Bestimmung, ob das insektenspezifische Protein natürlich vorhanden ist oder ob ein spezieller transformierter Organismus das Gen umfasst.

Die vorliegende Erfindung erkennt, dass pestizide Proteine während des vegetativen Wachstums von Bacillusstämmen gebildet werden (im Folgenden als VIPs bezeichnet).

Die vorliegenden VIPs sind nach der Sporenbildung nicht reichlich und werden insbesondere während dem Wachstum der logarithmischen Phase vor der stationären Phase exprimiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist das vegetative Wachstum als der Zeitraum vor dem Einsetzen einer Sporenbildung definiert. Für derartige VIPs codierende Gene können isoliert, kloniert und in verschiedene Abgabevehikel zur Verwendung in Schädlingsbehandlungsprogrammen transformiert werden.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfassen die Schädlinge – ohne darauf begrenzt zu sein – Insekten, Pilze, Bakterien, Nematoden, Milben, Zecken, Protozonpathogene, tierische parasitäre Leberegel und dergleichen. Insektenschädlinge umfassen Insekten, die aus den Ordnungen Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera usw., insbesondere Coleoptera und Lepidoptera, ausgewählt sind.

Die Tabellen 1 bis 10 liefern eine Liste von mit den hauptsächlichen Feldfrüchtepflanzen assoziierten Schädlingen und Schädlingen von humanem und veterinärmedizinischem Interesse. Derartige Schädlinge fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.

Tabelle 1 Lepidoptera (Schmetterlinge und Nachtfalter) Mais
  • Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünler
  • Agrotis ipsilon, Ypsiloneule
  • Helicoverpa zea, Corn Earworm
  • Spodoptera frugiperda, Herbstheerwurm
  • Diatraea grandiosella, südwestlicher Maiszünsler
  • Elasmopalpus lignosellus, kleiner Maisstengelbohrer
  • Diatraea saccharalis, Zuckerrohrstengelbohrer
Sorghum
  • Chilo partellus, Sorghumstengelborher
  • Spodoptera frugiperda, Herbstheerwurm
  • Helicoverpa zea, Corn Earworm
  • Elasmopalpus lignosellus, kleiner Maisstengelbohrer
  • Feltia subterranea, Granulaterdraupe
Weizen
  • Pseudaletia unipunctata, Heerwurm
  • Spodoptera frugiperda, Herbstheerwurm
  • Elasmopalpus lignosellus, kleiner Maisstengelbobrer
  • Agrotis orthogonia, blasse westliche Erdraupe
  • Elasmopalpus lignosellus, kleiner Maisstengelbohrer
Sonnenblume
  • Suleima helianthana, Sonnenblumenwickler
  • Homoeosoma electellum, Sonnenblumennachtfalter
Baumwolle
  • Heliothis virescens, Baumwolleule
  • Helicoverpa zea, Baumwollkapselbohrer
  • Spodoptera exigua, Rübenheerwurm
  • Pectinophora gossypiella, rosa Kapselbohrer
Reis
  • Diatraea saccharalis, Zuckerrohrstengelbohrer
  • Spodoptera frugiperda, Herbstheerwurm
  • Helicoverpa zea, Corn Earworm
Sojabohne
  • Pseudoplusia includens, Sojablumenspannerlarve
  • Anticarsia gemmatalis, Samtbohenraupe
  • Plathypena scabra, grüner Kleewurm
  • Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünsler
  • Agrotis ipsilon, Ypsiloneule
  • Spodoptera exigua, Rübenheerwurm
  • Heliothis virescens, Baumwollkapselbohrer
  • Helicoverpa zea, Baumwollkapselbohrer
Gerste
  • Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünsler
  • Agrotis ipsilon, Ypsiloneule
Tabelle 2 Coleoptera (Käfer) Mais
  • Diabrotica virgifera virgifera, westlicher Maiswurzelbohrer
  • Diabrotica longicornis barberi, nördlicher Maiswurzelbohrer
  • Diabrotica undecimpunctata howardi, südlicher Maiswurzelbohrer
  • Melanotus spp., Drahtwürmer
  • Cyclocephala borealis, nördlicher Maikäfer (weiße Larve)
  • Cyclocephala immaculata, südlicher Maikäfer (weiße Larve)
  • Popillia japonica, Japanischer Käfer
  • Chaetocnema pulicaria, Maiserdfloh
  • Sphenophorus maidis, Maiskornwurm
Sorghum
  • Phyllophaga crinita, weiße Larve
  • Elendes, Conoderus und Aeolus spp., Drahtwürmer
  • Oulema melanopus, Getreideblattkäfer
  • Chaetocnema pulicaria, Maiserdfloh
  • Sphenophorus maidis, Maiskornwurm
Weizen
  • Oulema melanopus, Getreideblattkäfer
  • Hypera punctata, Kleeblattrüsselkäfer
  • Diabrotica undecimpunctata howardi, südlicher Maiswurzelbohrer
Sonnenblume
  • Zygogramma exclamationis, Sonnenblumenkäfer
  • Bothyrus gibbosus, Karottenkäfer
Baumwolle
  • Anthonomus grandis, Sonnenkäfer
Reis
  • Colaspis brunnea, Traubencolaspis
  • Lissorhoptrus oryzophilus, Reiswasserrüsselkäfer
  • Sithophilus oryzae, Reisrüsselkäfer
Sojabohne
  • Epilachna varivestis, Mexikanischer Bohnenkäfer
Tabelle 3 Homoptera (Weiße Fliegen, Blattläuse usw.) Mais
  • Rhopalosiphum maidis, Maisblattlaus
  • Anuraphis maidiradicis, Maiswurzelblattlaus
Sorghum
  • Rhopalosiphum maidis, Maisblattlaus
  • Sipha flava, gelbe Zuckerrohrblattlaus
Weizen
  • Russische Weizenblattlaus
  • Schizaphis graminum, Getreideblattlaus
  • Macrosiphum avenae, Englische große Getreideblattlaus
Baumwolle
  • Aphis gossypii, Baumwollblattlaus
  • Pseudatomoscelis seriatus, Baumwollflohhüpfer
  • Trialeurodes abutilonea, Bandedwinges Whitefly
Reis
  • Nephotettix nigropictus, Reissingzirpe
Sojabohne
  • Myzus persicae, grüne Pfirsichblattlaus
  • Empoasca fabae, Kartoffelsingzirpe
Gerste
  • Schizaphis graminum, Getreideblattlaus
Ölsamenraps
  • Brevicoryne brassicae, Mehlige Kohlblattlaus
Tabelle 4 Hemiptera (Wanzen) Mais
  • Blissus leucopterus leucopterus, Chinch Bug
Sorghum
  • Blissus leucopterus leucopterus, Chinch Bug
Baumwolle
  • Lygus lineolaris, gefleckte Pflanzenwanze
Reis
  • Blissus leucopterus leucopterus, Chinch Bug
  • Acrosternum hilare, grüne Baumwanze
Sojabohne
  • Acrosternum hilare, grüne Baumwanze
Gerste
  • Blissus leucopterus leucopterus, Chinch Bug
  • Acrosternum hilare, grüne Baumwanze
  • Euschistus servus, braune Baumwanze
Tabelle 5 Orthoptera (Grashüpfer, Grillen und Schaben) Mais
  • Melanoplus femurrubrum, rotfüssige Heuschrecke
  • Melanoplus sanguinipes, Wanderheuschrecke
Weizen
  • Melanoplus femurrubrum, rotfüssige Heuschrecke
  • Melanoplus differentialis, amerikanische Heuschrecke
  • Melanoplus sanguinipes, Wanderheuschrecke
Baumwolle
  • Melanoplus femurrubrum, rotfüssige Heuschrecke
  • Melanoplus differentialis, amerikanische Heuschrecke
Sojabohne
  • Melanoplus femurrubrum, rotfüssige Heuschrecke
  • Melanoplus differentialis, amerikanische Heuschrecke
Gebäude/Haushalt
  • Periplaneta americana, amerikanische Schabe
  • Blattella germanica, deutsche Schabe
  • Blatta orientalis, orientalische Schabe
Tabelle 6 Diptera (Fliegen und Moskitos) Mais
  • Hylemya platura, Saaten- oder Wurzelfliege
  • Agromyza parvicornis, Maisfleckenminierfliege
Sorghum
  • Contarinia sorghicola, Sorghummücke
Weizen
  • Mayetiola destructor, Hessenfliege
  • Sitodiplosis mosellana, Weizenmücke
  • Meromyza americana, Weizenstammfliege
  • Hylemya coarctata, Weizenknollenfliege
Sonnenblume
  • Neolasioptera murfedtiana, Sonnenblumensamenmücke
Sojabohne
  • Hylemya platura, Saaten- oder Wurzelfliege
Gerste
  • Hylemya platura, Saaten- oder Wurzelfliege
  • Mayetiola destructor, Hessenfliege
Insekten, die Menschen und Tiere attackieren, und Krankheitsträger
  • Aedes aegypti, Gelbfiebermoskito
  • Aedes albopictus, Waldtagmoskito
  • Phlebotomus papatasii, Sandfliege
  • Musca domestica, Hausfliege
  • Tabanus atratus, schwarze Pferdefliege
  • Cochliomyia hominivorax, Goldfliege
Tabelle 7 Thysanoptera (Blasenfüßer) Mais
  • Anaphothrips obscurus, Grasthrips
Weizen
  • Frankliniella fusca, Tabakthrips
Baumwolle
  • Thrips tabaci, Zwiebelthrips
  • Frankliniella fusca, Tabakthrips
Sojabohne
  • Sericothrips variabilis, Sojabohnenthrips
  • Thrips tabaci, Zwiebelthrips
Tabelle 8 Hymenoptera (Blattwespen, Ameisen, Wespen usw.) Mais
  • Solenopsis milesta, Räuberameise
Weizen
  • Cephus cinctus, Weizenstammsägewespe
Tabelle 9 Andere Ordnungen und repräsentative Spezies
  • Dermaptera (Ohrwürmer)
  • Forficula auricularia, Europäischer Ohrwurm
Isoptera (Termiten)
  • Reticulitermes flavipes, östliche unterirdische Termiten
Mallophaga (Kauende Läuse)
  • Cuclotogaster heterographa, Hühnchenkopflaus
  • Bovicola bovis, Rinderbeisslaus
Anoplura (Saugende Läuse)
  • Pediculus humanus, Kopf- und Körperlaus
Siphonaptera (Flöhe)
  • Ctenocephalides felis, Katzenfloh
Tabelle 10 Acari (Milben und Zecken) Mais
  • Tetranychus urticae, zweifleckige Blattspinnmilbe
Sorghum
  • Tetranychus cinnabarinus, karminrote Blattspinnmilbe
  • Tetranychus urticae, zweifleckige Blattspinnmilbe
Weizen
  • Acetia tulipae, Weizenkräuselmilbe
Baumwolle
  • Tetranychus cinnabarinus, karminrote Blattspinnmilbe
  • Tetranychus urticae, zweifleckige Blattspinnmilbe
Sojabohnen
  • Tetranychus turkestani, Erdbeerblattspinnmilbe
  • Tetranychus urticae, zweifleckige Blattspinnmilbe
Gerste
  • Petrobia latens, braune Weizenmilbe
Wichtige human und tierische Acari
  • Demacentor variabilis, amerikanische Hundezecke
  • Argas persicus, Geflügelzecke
  • Dermatophagoides farinae, amerikanische Hausstaubmilbe
  • Dermatophagoides pteronyssinus, europäische Hausstaubmilbe

Nun, da erkannt wurde, dass pestizide Proteine aus der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus isoliert werden können, können andere Stämme durch Standardtechniken isoliert und bezüglich einer Aktivität gegenüber speziellen Pflanzen- und Nichtpflanzenschädlingen getestet werden. Im Allgemeinen können Bacillusstämme aus jeder beliebigen Umweltprobe einschließlich Erde, Pflanzen, Insekten, Getrieidespeicherstaub und anderem Probenmaterial usw. nach auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert werden. Siehe beispielsweise Travers et al. (1987) Appl. Environ Microbiol. 53: 1263 bis 1266; Saleh et al. (1969) Can. J. Microbiol. 15: 1101 bis 1104; DeLucca et al. (1981) Can. J. Microbiol. 27: 865 bis 870, und Norris et al. (1981) "The genera Bacillus and Sporolactobacillus" bei Starr et al., (Hrsg.) The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, Band II, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. Nach der Isolierung können die Stämme bezüglich pesitzider Aktivität während des vegetativen Wachstums getestet werden. Auf diese Weise können neue pestizide Proteine und Stämme identifiziert werden.

Derartige Bacillusmikroorganismen, die erfindungsgemäß Verwendung finden, umfassen Bacillus cereus und Bacillus thuringiensis sowie die in Tabelle 11 angegebenen Bacillusspezies.

Tabelle 11 Liste der Bacillusspezies Morphologische Gruppe 1
  • B. megaterium
  • B. cereus*
  • B. cereus var. mycoides
  • B. thuringiensis*
  • B. licheniformis
  • B. subtilis*
  • B. pumilus
  • B. firmus*
  • B. coagulans
Morphologische Gruppe 2
  • B. polymyxa
  • B. macerans
  • B. circulans
  • B. stearothermophilus
  • B. alvei*
  • B. laterosporus*
  • B. brevis
  • B. pulvifaciens
  • B. popilliae*
  • B. lentimorbus*
  • B. larae*
Morphologische Gruppe 3
  • B. spaericus*
  • B. pasteurii
Nicht zugeordnete Stämme Untergruppe A
  • B. apiarus*
  • B. filicolonicus
  • B. thiaminolyticus
  • B. alcalophilus
Untergruppe B
  • B. cirroflagellosus
  • B. chitinosporus
  • B. lentus
Untergruppe C
  • B. badius
  • B. aneurinolyticus
  • B. macroides
  • B. freundenreichii
Untergruppe D
  • B. pantothenicus
  • B. epiphytus
Untergruppe E1
  • B. aminovorans
  • B. globisporus
  • B. insolitus
  • B. psychrophilus
Untergruppe E2
  • B. psychrosaccharolyticus
  • B. macquariensis

* = Diese Bacillusstämme, die zuvor in Verbindung mit Insekten gefunden wurden.

Einteilung gemäß J. M. Parry et al (1983), Color Atlas of Bacillus species, Wolfe Medical Publications, London.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können die während des vegetativen Wachstums produzierten pestiziden Proteine aus Bacillus isoliert werden. In einer Ausführungsform können während des vegetativen Wachstums produzierte insektizide Proteine isoliert werden. Verfahren zur Proteinisolierung sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt. Im Allgemeinen können Proteine durch herkömmliche Chromatographie, einschließlich Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Immunoaffinitätschromatographie, durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, wie Umkehrphasenhochleistungsflüssigkeitschromatographie, Ionenaustauschhochleistungsflüssigkeitschromatographie, Größenausschlusshochleistungsflüssigkeitschromatographie, Hochleistungschromatofocussierchromatographie und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie usw., durch elektrophoretische Trennung, wie eindimensionale Gelelektrophorese, zweidimensionale Gelelektrophorese usw., gereinigt werden. Derartige Verfahren sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt. Siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology, Band 1 und 2, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, NY (1988). Darüber hinaus können Antikörper gegen im Wesentlichen reine Präparationen des Proteins hergestellt werden. Siehe beispielsweise Radka et al. (1983), J. Immunol. 128: 2804, und Radka et al. (1984), Immunogenetics 19: 63. Eine beliebige Kombination von Verfahren kann verwendet werden, um Protein mit pestiziden Eigenschaften zu reinigen. Wie das Protokoll formuliert ist, wird die pestizide Aktivität nach jedem Reinigungsschritt bestimmt.

Derartige Reinigungsschritte führen zu einer im Wesentlichen gereinigten Proteinfraktion. Unter „im Wesentlichen gereinigt" oder „im Wesentlichen rein" wird Protein verstanden, das im Wesentlichen frei von einer beliebigen normalerweise mit dem Protein in seinem natürlichen Zustand assoziierten Verbindung ist. „Im Wesentlichen reine" Zubereitungen von Protein können durch das Fehlen von anderen nachweisbaren Proteinbanden nach einer SDS-PAGE gemäß visueller Bestimmung oder durch Bestimmung mittels densitrometrischer Abtastung beurteilt werden. Alternativ kann das Fehlen von weiteren Amino-terminalen Sequenzen oder N-terminalen Resten in einer gereinigten Zubereitung das Reinheitsniveau angeben. Reinheit kann durch Rechromatographie „reiner" Präparationen, die das Fehlen von weiteren Peaks durch Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie oder Kapillarelektrophorese zeigt, verifiziert werden. Die Ausdrücke „im Wesentlichen rein" oder „im Wesentlichen gereinigt" sollen keine künstlichen oder synthetischen Gemische der Proteine mit anderen Verbindungen ausschließen. Die Ausdrücke sollen nicht die Gegenwart von geringfügigen Verunreinigungen ausschließen, die die biologische Aktivität des Proteins nicht stören und die beispielsweise aufgrund einer unvollständigen Reinigung vorhanden sein können.

Sobald das gereinigte Protein isoliert ist, kann das Protein oder die Polypeptide, aus denen es besteht, durch Standardverfahren, die auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt sind, charakterisiert und sequenziert werden. Beispielsweise kann das gereinigte Protein oder die Polypeptide, aus denen es besteht, mit Cyanobromiden oder mit Proteasen, wie Papain, Chymotrypsin, Trypsin, Lysyl-C-Endopeptidase usw. (Oike et al. (1982), J. Biol. Chem. 257: 9751 bis 9758; Liu et al. (1983), Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209 bis 215), fragmentiert werden. Die erhaltenen Peptide können vorzugsweise durch HPLC oder durch Trennen von Gelen und Elektroblotten auf PVDF-Membranen getrennt und einer Aminosäuresequenzierung unterzogen werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden die Peptide vorzugsweise durch automatische Sequenziervorrichtungen analysiert. Es ist bekannt, dass N-terminale, C-terminale oder interne Aminosäuresequenzen bestimmt werden können. Aus der Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins kann eine Nucleotidsequenz synthetisiert werden, die als Sonde verwendet werden kann, um die Isolierung des Gens, das für das pestitzide Protein codiert, zu unterstützen.

Es ist bekannt, dass die pestiziden Proteine oligomer sein können und bezüglich des Molekulargewichts, der Zahl der Protomere, der Komponentenpeptide, der Aktivität gegenüber speziellen Schädlingen und anderen Eigenschaften variieren. Durch die hier angegebenen Verfahren können jedoch Proteine mit einer Aktivität gegen eine Vielzahl von Schädlingen isoliert und charakterisiert werden.

Sobald das gereinigte Protein isoliert und charakterisiert wurde, gilt, dass es auf verschiedene Weise einschließlich durch Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Trunkierungen und Insertionen verändert werden kann. Verfahren für derartige Manipulationen sind im allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt. Beispielsweise können Aminosäuresequenzvarianten der pestiziden Proteine durch Mutationen in der DNA hergestellt werden. Derartige Varianten besitzen die gewünschte pestizide Aktivität. Selbstverständlich müssen die Mutationen, die in der für die Variante codierenden DNA gemacht werden, die Sequenz nicht aus dem Leserahmen heraus bringen und vorzugsweise keine komplementären Regionen schaffen, die eine sekundäre mRNA-Struktur liefern könnte. Siehe EP 0 075 444 A.

Auf diese Weise umfasst die vorliegende Erfindung die pestiziden Proteine sowie Komponenten und Fragmente hiervon. D. h. es ist selbstverständlich, dass Komponentenprotomere, Polypeptide oder Fragmente der Proteine gebildet werden können, die die pestizide Aktivität beibehalten. Diese Fragmente umfassen trunkierte Sequenzen sowie N-terminale, C-terminale, interne und intern deletierte Aminosäuresequenzen der Proteine.

Die meisten Deletionen, Insertionen und Substitutionen der Proteinsequenz sollten gemäß Erwartung keine radikalen Veränderungen der Eigenschaften des pestiziden Proteins liefern. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion vor einer derartigen Tätigkeit vorauszusagen, ist es einem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet offensichtlich, dass die Wirkung durch Routinescreeningtests bewertet werden kann. Die hier beschriebenen Proteine oder anderen Komponentenpolypeptide können alleine oder in Kombination verwendet werden. D. h. mehrere Proteine können verwendet werden, um unterschiedliche Insektenschä dlinge zu bekämpfen.

Einige Proteine sind einzelne Polypeptidketten, während andere Proteine aus mehr als einer Polypeptidkette bestehen, d. h. oligomer sind. Darüber hinaus sind einige VIPs als oligomere Pestizide wirksam. In diesen Fällen werden weitere Protomere verwendet, um die pestizide Aktivität zu erhöhen oder um pestizide Proteine zu aktivieren. Diese Protomere, die verstärken oder aktivieren, werden als Hilfsproteine bezeichnet. Hilfsproteine aktivieren oder verstärken ein pestizides Protein durch Wechselwirken mit dem pestiziden Protein unter Bildung eines oligomeren Proteins mit einer erhöhten pestiziden Aktivität, verglichen mit der, die in Abwesenheit des Hilfsproteins beobachtet wird.

Unter den pestiziden Proteinen gemäß der vorliegenden Erfindung konnte eine neue Klasse von insektenspezifischen Proteinen überraschenderweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifiziert werden. Die genannten Proteine, die in dieser Anmeldung als VIP3 bezeichnet werden, können aus Bacillus spp Stämmen, jedoch vorzugsweise aus Bacillus thuringiensis Stämmen und insbesondere aus Bacillus thuringiensis Stämmen AB88 und AB424 erhalten werden. Die genanten VIPs sind hauptsächlich in den Überständen von Bacilluskulturen, wo sie mindestens 75% der Gesamtmasse im Stamm AB88 ausmachen, vorhanden. Die VIP3-Proteine sind des weiteren durch ihr einzigartiges Spektrum einer insektiziden Aktivität gekennzeichnet, das eine Aktivität gegenüber der Agrotis- und/oder Spodoptera-Spezies, jedoch speziell gegen Ypsiloneule (BCW) und/oder Herbstheerwurm und/oder Rübenheerwurm und/oder Baumwolleule (tobacco budworm) und/oder „Corn Earworm" umfasst.

Ypsiloneule ist ein agronomisch wichtiges Insekt, das ziemlich resistent gegen &dgr;-Endotoxine ist. Macintosh et al. (1990), J. Invertebr. Pathol 56, 258 bis 266, berichten, dass die &dgr;-Endotoxine CrylA(b) und CrylA(c) insektizide Eigenschaften gegen BCW mit einem LC50-Wert von mehr als 80 &mgr;g bzw. 18 &mgr;g/ml Nahrung besitzen. Die insektiziden VIP3A-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung liefern eine > 50%ige Mortalität bei Zugabe in einer Proteinmenge, die mindestens 10- bis 500fach, vorzugsweise 50- bis 350fach und insbesondere 200- bis 300fach niedriger ist als die Menge der Cry1A-Proteine, die zur Erreichung einer gerade 50%igen Mortalität notwendig ist. Speziell bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die insektiziden VIP3A-Proteine, die eine 100%ige Mortalität bei Zugabe in einer Proteinmenge liefern, die mindestens 260fach niedriger als die Menge der Cry1A-Proteine ist, die zum Erreichen einer gerade 50%igen Mortalität erforderlich ist.

Die insektiziden VIP3-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung sind hauptsächlich in den Überständen der Kulturen vorhanden und werden folglich als sezernierte Proteine klassifiziert. Sie enthalten vorzugsweise in der N-terminalen Sequenz eine Zahl von positiv geladenen Resten, gefolgt von einer hydrophoben Coreregion und werden während des Exports nicht N-terminal prozessiert.

Wie die anderen hier im Rahmen der vorliegenden Erfindung angegebenen pestiziden Proteine können die VIP3-Proteine in Wachstumsstufen vor einer Sporenbildung nachgewiesen werden, was eine weitere klare Unterscheidung von anderen Proteinen herbeiführt, die zu der &dgr;-Endotoxinfamilie gehören. Vorzugsweise beginnt die Expression des insektenspezifischen Proteins während der mittleren logarithmischen Phase und setzt sich während der Sporenbildung fort. Infolge des speziellen Expressionsmusters in Kombination mit der hohen Stabilität der VIP3-Proteine können große Mengen der VIP3-Proteine in Überständen von sporenbildenden Kulturen festgestellt werden. Speziell bevorzugt sind die VIP3-Proteine, die in den Sequenzen SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 5 angegeben sind, und die entsprechenden DNA-Moleküle, die die Nucleotidsequenzen umfassen, die für die Proteine codieren, jedoch speziell die DNA-Moleküle, die die Nucleotidsequenzen, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 angegeben sind, umfassen.

Die erfindungsgemäßen pestiziden Proteine können in Kombination mit Bt Endotoxinen oder anderen insektiziden Proteinen zur Erhöhung des Insektentargetbereichs verwendet werden. Des weiteren lässt sich die Verwendung der VIPs gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Bt &dgr;-Endotoxinen oder anderen insektiziden Grundbestandteilen unterschiedlicher Natur speziell für die Verhinderung und/oder Handhabung einer Insektenresistenz einsetzen. Weitere insektizide Grundbestandteile umfassen Proteaseinhibitoren (sowohl Serin- als auch Cysteintypen), Lectine, &agr;-Amylase und Peroxidase. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression der VIPs in einer transgenen Pflanze durch die Expression eines oder mehrerer Bt &dgr;-Endotoxine begleitet. Diese Coexpression von mehr als einem insektiziden Grundbestandteil in derselben transgenen Pflanze kann durch genetische Konstruktion einer Pflanze in einer Weise, dass sie alle notwendigen Gene enthält und exprimiert, erreicht werden. Alternativ kann eine Pflanze, Eltern 1, genetisch so konstruiert werden, dass sie die VIPs exprimiert. Eine zweite Pflanze, Eltern 2, kann genetisch so konstruiert werden, dass sie Bt &dgr;-Endotoxin exprimiert. Durch Kreuzen von Eltern 1 mit Eltern 2 werden Nachkommenpflanzen erhalten, die alle Gene, die in die Eltern 1 und Eltern 2 eingebaut wurden, exprimieren. Speziell bevorzugte Bt &dgr;-Endotoxine sind die in der EP 0 618 976 A offenbarten, die hier durch Inbezugnahme aufgenommen wird.

Eine merkliche Zahl von cytotoxischen Proteinen – wenn auch nicht alle – besitzen eine binäre Aktion. Binäre Toxine bestehen typischerweise aus zwei Proteindomänen, eine wird als A-Domäne und die andere als B-Domäne bezeichnet (vgl. Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, J. E. Alouf und J. H. Freer, Hrsg. (1991), Academic Press). Die A-Domäne besitzt eine wirksame cytototoxische Aktivität. Die B-Domäne bindet einen externen Zelloberflächenrezeptor bevor eine Internalisierung erfolgt. Typischerweise muss die cytotoxische A-Domäne durch eine Translokationsdomäne zu dem Cytoplasma eskortiert werden. Häufig sind die A-Domäne und die B-Domäne getrennte Polypeptide oder Protomere, die durch eine Protein-Protein-Wechselwirkung oder eine Disulfidbindung assoziiert sind. Das Toxin kann jedoch ein einzelnes Polypeptid sein, das proteolytisch in der Zelle in zwei Domänen verarbeitet wird, wie im Falle von Pseudomonas exotoxin A. Zusammengefasst weisen binäre Toxine typischerweise drei wichtige Domänen auf, eine cytotoxische A-Domäne, eine Rezeptor-bindende B-Domäne und eine Translokationsdomäne. Die A- und die B-Domäne sind häufig durch Protein-Protein-Wechselwirkungsdomänen assoziiert.

Die Rezeptor-bindenden Domänen gemäß der vorliegenden Erfindung eignen sich zur Abgabe beliebigen Proteins, Toxins, Enzyms, Transkriptionsfaktors, Nucleinsäure, chemischen oder beliebigen anderen Faktors in Targetinsekten mit einem durch die Rezeptorbindungsdomäne der in diesem Patent beschriebenen binären Toxine erkannten Rezeptor. Da binäre Toxine Translokationsdomänen aufweisen, die in Phospholipiddoppelschichtmembranen eindringen und Cytotoxine durch diese Membranen eskortieren, können sich in ähnlicher Weise derartige Translokationsdomänen beim Eskortieren beliebigen Proteins, Toxins, Enzyms, Transkriptionsfaktors, Nucleinsäure, chemischen oder beliebigen anderen Faktors durch eine Phospholipiddoppelschicht, wie die Plasmamembran oder eine Vesikelmembran, eignen. Die Translokationsdomäne kann selbst Membranen durchbohren, sodass sie toxische oder insektizide Eigenschaften aufweist. Des weiteren besitzen alle binären Toxine cytotoxische Domänen, beispielsweise kann eine cytotoxische Domäne als lethales Protein entweder alleine oder bei Verabreichung in eine beliebige Targetzelle (in beliebige Targetzellen), auf jede Weise geeignet sein.

Da binäre Toxine aus den beiden Polypeptiden häufig einen Komplex bilden, ist es des weiteren wahrscheinlich, dass in den Komponenten der binären Toxine gemäß der vorliegenden Erfindung Protein-Protein-Wechselwirkungsregionen vorhanden sind. Diese Protein-Protein-Wechselwirkungsdomänen können bei der Bildung von Assoziationen zwischen einer beliebigen Kombination aus Toxinen, Enzymen, Transkriptionsfaktoren, Nucleinsäuren, Antikörpern, Zellbindungseinheiten oder beliebigen anderen Chemikalien, Faktoren, Proteinen oder Proteindomänen geeignet sein.

Toxine, Enzyme, Transkriptionsfaktoren, Antikörper, Zellbindungseinheiten oder andere Proteindomänen können an pestizide oder insektizide Proteine durch Produzieren im Rahmen befindlicher genetischer Fusionen fusioniert sein, die bei einer Translation durch Ribosomen ein Fusionsprotein mit den vereinigten Attributen des VIPs und der anderen bei der Fusion verwendeten Komponente produzieren. Des weiteren, wenn die an das VIP anfusionierte VIP-Proteindomäne eine Affinität für ein anderes Protein, eine andere Nucleinsäure, ein anderes Kohlenhydrat, ein anderes Lipid oder eine andere Chemikalie oder einen anderen Faktor aufweist, dann kann ein Dreikomponentenkomplex gebildet werden. Dieser Komplex weist die Attribute aller seiner Komponenten auf. Eine ähnliche Logik kann zur Herstellung von Vier- oder Mehrkomponentenkomplexen verwendet werden. Diese Komplexe eignen sich als insektizide Toxine, Pharmazeutika, Laborreagenzien und diagnostische Reagenzien usw. Beispiele, bei denen derartige Komplexe gegenwärtig verwendet werden, sind Fusionstoxine für potentielle Krebstherapien, Reagenzien in ELISA-Tests und Immunoblotanalysen.

Eine Strategie der Veränderung der pestiziden Proteine oder Hilfsproteine ist das Anfusionieren eines 15 Aminosäuren umfassenden „S-tags" an das Protein ohne Zerstörung der Insektenzellbindungsdomäne(n), Translokationsdomänen oder Protein-Protein-Wechselwirkungsdomänen der Proteine. Das S-tag besitzt eine hohe Affinität (Kd = 10–9 M) für ein Ribonuclease-S-Protein, das bei Bindung an das S-tag eine aktive Ribonuclease bildet (vgl. F. M. Richards und H. W. Wyckoff (1971) in „The Enzymes", Band N (P. D. Boyer, Hrsg.), Seiten 647 bis 806, Academic Press, New York). Die Fusion kann auf eine derartige Weise erfolgen, dass die cytotoxische Aktivität des pestiziden Proteins oder Hilfsproteins zerstört wird, wodurch die cytotoxische VIP-Aktivität durch eine neue cytotoxische Ribonucleaseaktivität ersetzt wird. Das Endotoxin würde aus dem S-Protein, einem pestiziden Protein und einem Hilfsprotein bestehen, wobei entweder das pestizide Protein oder das Hilfsprotein als Translationsfusion mit dem S-tag produziert wird. Ähnliche Strategien können verwendet werden, um andere potentielle Cytotoxine an pestizide Proteine oder Hilfsproteine anzufusionieren, einschließlich – ohne darauf begrenzt zu sein – Ribosomen inaktivierenden Proteinen, Insektenhormonen, Hormonrezeptoren, Transkriptionsfaktoren, Proteasen, Phosphatasen, Pseudomonas exotoxin A oder ein beliebiges anderes Protein oder chemischen Faktor, der bei Abgabe in Zellen lethal ist. In ähnlicher Weise können Proteine in Zellen abgegeben werden, die nicht lethal sind, sondern die celluläre Biochemie oder Physiologie verändern können.

Das Toxizitätsspektrum gegenüber unterschiedlichen Spezies kann durch Anfusionieren von Domänen an pestizide Proteine oder Hilfsproteine, die Zelloberflächenrezeptoren von einer anderen Spezies erkennen, verändert werden. Derartige Domänen können – ohne darauf begrenzt zu sein – Antikörper, Transferrin, Hormone oder Peptidsequenzen, die aus mittels Phagenanzeigeaffinität selektierbaren Bibliotheken isoliert wurden, umfassen. Ferner können Peptidsequenzen, die an Nährstoffe, Vitamine, Hormone oder andere Chemikalien, die in Zellen transportiert werden, gebunden sind, verwendet werden, um das Toxizitätsspektrum zu verändern.

Die pesitziden Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Proteine, die eine spezifische pestizide Eigenschaft verleihen. Derartige Proteine können im Molekulargewicht schwanken, wobei sie Komponentenpolypeptide mit mindestens einem Molekulargewicht von 30 kDa oder mehr, vorzugsweise von etwa 50 kDa oder mehr, aufweisen.

Es ist möglich, dass das pestizide Protein eine Komponente eines multimeren pestiziden Proteins sein kann. Ein derartiges pestizides Protein kann im Molekulargewicht schwanken und weist mindestens ein Molekulargewicht von 50 kDa bis zu mindestens 200 kDa, vorzugsweise von etwa 100 kDa bis 150 kDa, auf.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck „vegetatives insektizides Protein" (VIP) die Proteine, die während des vegetativen Wachstums gebildet werden, die alleine oder in Kombination für eine pestizide Aktivität verwendet werden können. Diese umfasst pestizide Proteine, Hilfsproteine und die Proteine, die eine Aktivität lediglich in Gegenwart des Hilfsproteins oder der Polypeptidkomponenten dieser Proteine zeigen.

Es ist selbstverständlich, dass es alternative Verfahren gibt, die verfügbar sind, um die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der vorliegenden Proteine zu erhalten. Beispielsweise können zur Gewinnung der Nucleotidsequenz, die für das pestizide Protein codiert, Cosmidklone aus einer Genombibliothek isoliert werden, die das pestizide Protein exprimieren. Aus größeren aktiven Cosmidklonen können kleinere Subklone hergestellt werden und bezüglich der Aktivität getestet werden. Auf diese Weise können Klone, die ein aktives pestizides Protein exprimieren, sequenziert werden, um die Nucleotidsequenz des Gens zu bestimmen. Anschließend kann die Aminosäuresequenz für das Protein abgeleitet werden. Für allgemeine molekulare Verfahren, vgl. beispielsweise Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band 1 bis 3, Sambrook et al (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), und die dort angegegebenen Literaturstellen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleotidsequenzen aus Organismen, die von Bacillus verschieden sind, wobei die Nucleotidsequenzen durch Hybridisierung mit den Bacillusnucleotidsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung isolierbar sind. Durch derartige Nucleotidsequenz codierte Proteine können bezüglich der pestiziden Aktivität getestet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die durch die Nucleotidsequenzen codierten Proteine. Des weiteren umfasst die vorliegende Erfindung Proteine, die aus Organismen, die von Bacillus verschieden sind, erhalten werden, wobei das Protein mit Antikörpern kreuzreagiert, die gegen die erfindungsgemäßen Proteine erzeugt wurden. Abermals können die isolierten Proteine bezüglich der pestiziden Aktivität durch die hier offenbarten Verfahren oder andere auf dem einschlägigen Fachgebiet wohlbekannte Verfahren getestet werden.

Sobald die Nucleotidsequenzen, die für die pestiziden Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung codieren, isoliert wurden, können sie manipuliert werden und verwendet werden, um das Protein in einer Vielzahl von Wüten, einschließlich anderen Organismen, einschließlich Mikroorganismen und Pflanzen, zu exprimieren.

Die pestiziden Gene gemäß der vorliegenden Erfindung können optimiert werden für eine erhöhte Expression in Pflanzen. Siehe beispielsweise EP 0 618 976 A, EP 0 359 472 A, EP 0 385 962 A, WO 91 16 432 A, Perlak et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 bis 3328, und Murray et al. (1989), Nucleic Acids Research 17: 477 bis 498. Auf diese Weise können die Gene unter Verwendung bevorzugter Codons für Pflanzen synthetisiert werden. D. h. das bevorzugte Codon für einen speziellen Wirt ist das einzelne Codon, das am häufigsten für die Aminosäure in diesem Wirt codiert. Das für Mais bevorzugte Codon, beispielsweise für eine spezielle Aminosäure, kann von bekannten Gensequenzen von Mais abgeleitet werden. Die Maiscodonverwendung für 28 Gene aus Maispflanzen findet sich bei Murray et al (1989), Nucleic Acids Research 17: 477 bis 498, deren Offenbarung hierin durch Inbezugnahme aufgenommen wird. Synthetische Gene können auch basierend auf der Verteilung der Codons, die ein spezieller Wirt für eine spezielle Aminosäure verwendet, hergestellt werden.

Auf diese Weise können die Nucleotidsequenzen für eine Expression in einer beliebigen Pflanze optimiert werden. Es ist selbstverständlich, dass die gesamte Gensequenz oder ein beliebiger Teil der Gensequenz optimiert werden kann oder synthetisch sein kann. D. h., dass synthetisch oder teilweise optimierte Sequenzen auch verwendet werden können. In ähnlicher Weise können die Nucleotidsequeuezen für eine Expression in einem beliebigen Mikroorganismus optimiert werden. Für eine bei Bacillus bevorzugte Codonverwendung, siehe beispielsweise US 5 024 837 A und Johansen et al. (1988), Gene 65: 293 bis 304.

Methoden zur Konstruktion von Pflanzenexpressionskassetten sowie die Einführung von Fremd-DNA in Pflanzen sind auf dem einschlägigen Fachgebiet beschrieben. Derartige Expressionskassetten können Promotoren, Terminatoren, Verstärker, Leadersequenzen, Introns und andere Regulatorsequenzen, die operativ mit der für das pestizide Protein codierenden Sequenz verknüpft sind, umfassen. Es ist des weiteren selbstverständlich, dass Promotoren oder Terminatoren der VIP-Gene in Expressionskassetten verwendet werden können.

Im Allgemeinen wurden für die Einführung von Fremd-DNA in Pflanzen Ti-Plasmidvektoren für die Abgabe von Fremd-DNA sowie eine direkte DNA-Aufnahme, Liposomen, eine Elektroporation, Mikroinjektion und die Verwendung von Mikroprojektilen eingesetzt. Derartige Verfahren wurden auf dem einschlägigen Fachgebiet veröffentlicht. Vergleiche beispielsweise Guerche et al. (1987), Plant Science 52: 111 bis 116, Neuhause et al (1987), Theor. Appl. Genet. 75: 30 bis 36, Klein et al. (1987), Nature 327: 70 bis 73, Howell et al. (1980), Science 208: 1265, Horsch et al. (1985), Science 227: 1229 bis 1231, DeBlock et al. (1989), Plant Physiology 91: 694–701, Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach und Weissbach, Hrsg.), Academic Press, Inc. (1988), und Methods in Plant Molecular Biology (Schuler und Zielinski, Hrsg.), Academic Press, Inc. (1989). Siehe ferner US Patentanmeldung mit der fortlaufenden Nummer 08 008 374, die hier durch Inbezugnahme aufgenommen wird. Siehe auch EP 0 193 259 A und EP 0 451 878 A. Es ist darauf hinzuweisen, dass das Transformationsverfahren von der zu transformierenden Pflanzenzelle abhängt.

Es ist des weiteren selbstverständlich, dass die Komponenten der Expressionskassette zur Erhöhung der Expression ummodifiziert werden können. Beispielsweise können frankierte Sequenzen, Nucleotidsubstitutionen und andere Modifikationen verwendet werden. Vergleiche beispielsweise Perlak et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 bis 3328, Murray et al. (1989), Nucleic Acids Research 17: 477 bis 498, und WO 91 16 432 A.

Das Konstrukt kann ferner beliebige andere notwendige Regulatoren, wie Terminatoren (Guerineau et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 226: 141 bis 144, Proudfoot (1991), Cell 64: 671 bis 674, Sanfacon et al. (1991), Genes Dev. 5: 141 bis 149, Mogen et al. (1990), Plant Cell 2: 1261–1272, Munroe et al. (1990), Gene 91: 151 bis 158, Ballas et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17: 7891 bis 7903, Joshi et al. (1987), Nucleic Acids Res. 15: 9627 bis 9639), Pflanzentranslationsconsensussequenzen (C. P. Joshi (1987), Nucleic Acids Research 15: 6643 bis 6653), Introns (Luehrsen und Walbot (1991), Mol. Gen. Genet. 225: 81 bis 93) und dergleichen, die operativ mit der Nucleotidsequenz verknüpft sind, umfassen. Es kann günstig sein, 5'-Leadersequenzen in dem Expressionskassettenkonstrukt zu enthalten. Derartige Leadersequenzen können dahingehend wirken, dass sie eine Translation verstärken. Translationsleader sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt und umfassen:

Picornavirusleader, beispielsweise EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5' nicht codierende Region) (O. Elroy-Stein, T. R. Fuerst und B. Moss (1989), PNAS USA 86: 6126 bis 6130);

Potyvirusleader, beispielsweise TEV-Leader (Tobacco Etch Virus) (Allison et al. (1986);

MDMV-Leader (Maize Dwarf Mosaic Virus); Virology 154: 9 bis 20) und

Humanimmunoglobulin-schweres Kettenbindungsprotein (BiP) (D. G. Macejak und P. Sarnow (1991), Nature 353: 90 bis 94);

nicht translatierte Leader aus der Überzugsprotein-mRNA von Alfalfamosaikvirus (AMV RNA 4) (S. A. Jobling und L. Gehrke (1987), Nature 325: 622 bis 625);

Tabakmosaikvirusleader (TMV) (D. R. Gallie et al. (1989), Molecular Biology of RNA, Seiten 237 bis 256) und

Maischlorose-Mottle-Virusleader (MCMV) (S. A. Lommel et al. (1991), Virology 81: 382 bis 385). Siehe ferner Della Cioppa et al. (1987), Plant Physiology 84: 965 bis 968.

Ein Pflanzenterminator kann in der Expressionskassette verwendet werden. Siehe Rosenberg et al. (1987), Gene 56: 125, Guerineau et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 226: 141 bis 144, Proudfoot (1991), Cell 64: 671 bis 674, Sanfacon et al. (1991), Genes Dev. 5: 141 bis 149, Mogen et al. (1990), Plant Cell 2: 1261–1272, Munroe et al. (1990), Gene 91: 151 bis 158, Ballas et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17: 7891 bis 7903, Joshi et al. (1987), Nucleic Acids Res. 15: 9627 bis 9639).

Für eine gewebespezifische Expression können die Nucleotidsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung operativ mit gewebespezifischen Promotoren verknüpft sein. Siehe beispielsweise EP 0 618 976 A, die hier durch Inbezugnahme aufgenommen wird.

Weiter fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung transgene Pflanzen, insbesondere transgene fertile Pflanzen, die mit Hilfe der oben beschriebenen Prozesse transformiert wurden und ihre asexuellen und/oder sexuellen Nachkommen, die das pestizide Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen und es vorzugsweise auch exprimieren. Besonders bevorzugt sind Hybridpflanzen.

Die transgene Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine zweikeimblättrige Pflanze oder eine einkeimblättrige Pflanze sein. Bevorzugt sind einkeimblättrige Pflanzen der Graminaceae Familie einschließlich Lolium-, Zea-, Triticum-, Triticale-, Sorghum-, Saccharum-, Bromus-, Oryzae-, Avena-, Hordeum-, Secale- und Setaria-Pflanzen.

Speziell bevorzugt sind transgener Mais, Weizen, Gerste, Sorghum, Roggen, Hafer, Grashalme und Reis.

Unter den zweikeimblättrigen Pflanzen sind hier Sojabohne, Baumwolle, Tabak, Zuckerrübe, Ölsamenraps und Sonnenblumen speziell bevorzugt.

Der Ausdruck „Nachkommen" soll sowohl „asexuell" als auch „sexuell" erzeugte Nachkommen transgener Pflanzen umfassen. Diese Definition wird auch so verstanden, dass sie alle Mutanten und Varianten umfasst, die mit Hilfe bekannter Verfahren, beispielsweise durch Zellfusion oder Mutantenselektion, erhältlich sind und die noch die charakteristischen Eigenschaften der ursprünglich transformierten Elternpflanze zeigen, zusammen mit allen Kreuzungs- und Fusionsprodukten des transformierten Pflanzenmaterials.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner das Proliferationsmaterial transgener Pflanzen.

Das Proliferationsmaterial transgener Pflanzen wird erfindungsgemäß als beliebiges Pflanzenmaterial definiert, das sexuell oder asexuell in vivo oder in vitro vermehrt werden kann. Speziell bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Protoplasten, Zellen, Calli, Gewebe, Organe, Samen, Embryos, Pollen, Eizellen, Zygoten, zusammen mit einem beliebigen anderen Vermehrungsmaterial, das aus transgenen Pflanzen erhalten wird.

Teile von Pflanzen, wie beispielsweise Blüten, Stämme, Früchte, Blätter, Wurzeln, die transgenen Pflanzen oder ihren zuvor mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens transformierten Nachkommen entspringen und folglich mindestens teilweise aus transgenen Zellen bestehen, bilden auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Bevor ein Pflanzenvermehrungsmaterial (Früchte, Knollen, Körner, Samen), jedoch speziell Samen als kommerzielles Produkt, verkauft wird, wird es üblicherweise mit einem Schutzüberzug behandelt, der herbizide, insektizide, fungizide, bakterizide, nematizide, molluskizide oder Gemische mehrerer dieser Zubereitungen gewünschtenfalls zusammen mit weiteren Trägern, grenzflächenaktiven Mitteln oder eine Applikation fördernden Hilfsstoffen, die üblicherweise auf dem einschlägigen Fachgebiet der Formulierung verwendet werden, umfasst, um einen Schutz gegen einen durch bakterielle, Pilz- oder Tierschädlinge verursachten Schaden bereitzustellen.

Um den Samen zu behandeln kann der Schutzüberzug auf die Samen entweder durch Imprägnieren der Knollen oder Körner mit einer flüssigen Formulierung oder durch Beschichten derselben mit einer kombinierten nassen oder trockenen Formulierung appliziert werden. Darüber hinaus sind in speziellen Fällen andere Verfahren der Applikation auf Pflanzen möglich, beispielsweise eine auf Knospen oder Früchte gerichtete Behandlung.

Der erfindungsgemäße Pflanzensamen, der ein DNA-Molekül umfasst, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein erfindungsgemäßes pestizides Protein umfasst, kann mit einem Pflanzenschutzüberzug behandelt werden, der eine Samenbehandlungsverbindung, wie beispielsweise Captan, Carboxin, Thiram (TMTD®), Methalaxyl (Apron®) und Pirimiphos-methyl (Actellic®) und andere, die üblicherweise bei der Samenbehandlung verwendet werden, umfasst. Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Samenbehandlungsüberzüge, die eine entomizide Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung alleine oder in Kombination mit einem der üblicherweise bei der Samenbehandlung verwendeten Samenschutzüberzüge umfassen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Pflanzenvermehrungsmaterial für kultivierte Pflanzen, jedoch insbesondere Pflanzensamen, der mit einem Pflanzenschutzüberzug gemäß der obigen Definition behandelt ist.

Es ist selbstverständlich, dass die für die pestiziden Proteine codierenden Gene verwendet werden können, um für Insekten pathogene Organismen zu transformieren. Derartige Organismen umfassen Baculoviren, Pilze, Protozon, Bakterien und Nematoden.

Die erfindungsgemäßen Bacillusstämme können zum Schutz von landwirtschaftlichen Feldfrüchten und Produkten vor Schädlingen verwendet werden. Alternativ kann mittels eines geeigneten Vektors ein für das Pestizid codierendes Gen in einen mikrobiellen Wirt eingeführt werden und der Wirt auf die Umgebung oder Pflanzen oder Tiere appliziert werden. Mikroorganismuswirte können aus denen ausgewählt werden, die bekanntermaßen die „Phytosphäre" (Phylloplane, Phyllosphere, Rhizosphere und/oder Rhizoplana) einer oder mehrer interessierender Feldfrüchte besetzen. Diese Mikroorganismen sind so ausgewählt, dass sie in der Lage sind, erfolgreich in der speziellen Umgebung mit den Mikroorganismen des Wildtyps wettzueifern, für eine stabile Aufrechterhaltung und Expression des für das Polypeptidpestizid exprimierenden Gens sorgen und gewünschterweise einen verbesserten Schutz des Pestizids vor einem Umweltabbau und einer Inaktivierung durch die Umwelt liefern.

Derartige Mikroorganismen umfassen Bakterien, Algen und Pilze. Von speziellem Interesse sind Mikroorganismen, wie Bakterien, z. B. Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc und Alcaligenes, Pilze, insbesondere Hefen, z. B. Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium. Von speziellem Interesse sind derartige Phytosphärenbakterienspezies, wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcenscens, Acetobacter xylinum, Agrobakterien, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli und Azotobacter vinlandii, und Phytosphärenhefespezies, wie Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pollulans. Von speziellem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.

Eine Reihe von Wegen zur Einführung eines für das pestizide Protein exprimierenden Gens in den Mikroorganismus wird unter Bedingungen, die eine stabile Beibehaltung und Expression des Gens gewährleisten, verfügbar. Beispielsweise können Expressionskassetten konstruiert werden, die die interessierenden DNA-Konstrukte in operativer Verknüpfung mit den Transkriptions- und Translationsregulatorsignalen zur Expression der DNA-Konstrukte und eine DNA-Sequenz, die mit einer Sequenz im Wirtorganismus homolog ist, wodurch eine Integration erfolgt, und/oder ein Replikationssystem, das in dem Wirt funktional ist, wodurch eine Integration oder stabile Beibehaltung erfolgt, umfassen.

Transkriptions- und Translationsregulatorsignale umfassen – ohne darauf begrenzt zu sein – einen Promotor, eine Transkriptionsinitiationsstartstelle, Operatoren, Aktivatoren, Enhancer, weitere Regulatorelemente, Ribosomenbindungsstellen, ein Initiationscodon, Terminationssignale und dergleichen. Siehe beispielsweise US 5 039 523 A, US 4 853 331 A, EP 0 480 762 A2, Sambrook et al. aao, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Advanced Bacterial Genetics, Davis et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); und die dort angegebenen Literaturstellen.

Geeignete Wirtzellen, wo die pestizidhaltigen Zellen behandelt werden, um die Aktivität des Toxins in der Zelle zu verlängern, wenn die dann behandelte Zelle auf die Umgebung des Targetschädlings (der Targetschädlinge) appliziert wird, können entweder Prokaryonten oder Eukaryonten umfassen, wobei sie normalerweise auf die Zellen begrenzt sind, die keine für höhere Organismen, wie Säugetiere, toxischen Substanzen produzieren. Organismen, die für höhere Organismen toxische Substanzen produzieren, können jedoch verwendet werden in Fällen, in denen das Toxin nicht stabil ist oder das Applikationsniveau ausreichend niedrig ist, um jede Möglichkeit einer Toxizität für den Säugetierwirt zu vermeiden. Als Wirte sind die Prokaryonten und die niedrigeren Eukaryonten, wie Pilze, von speziellem Interesse. Beispiele für Prokaryonten sowohl gram-negativ als auch gram-positiv umfassen Enterobacteriaceae, wie Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella und Proteus, Bacillaceae, Rhizobiceae, wie Rhizobium, Spirillaceae, wie Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum, Lactobacillaceae, Pseudomonadaceae, wie Pseudomonas und Acetobacter, Azotobacteraceae und Nitrobacteraceae. Zu den Eukaryonten gehören Pilze, wie Phycomycetes und Ascomycetes, die Hefe umfassen, wie Saccharomyces und Schizosaccharomyces, sowie Basidiomyceteshefe, wie Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces und dergleichen.

Eigenschaften von speziellem Interesse bei der Auswahl einer Wirtzelle für die Zwecke der Produktion umfassen die Leichtigkeit der Einführung des Proteingens in den Wirt, die Verfügbarkeit von Expressionssystemen, die Effizienz der Expression, die Stabilität des Proteins in dem Wirt und die Gegenwart von Hilfsgenmöglichkeiten. Charakteristika von Interesse zur Verwendung als Pestizidmikrokapsel umfassen Schutzqualitäten für das Pestizid, wie dicke Zellwände, Pigmentierung und intrazelluläre Verpackung oder Bildung von Einschlusskörpern, Blattaffinität, Fehlen einer Säugetiertoxizität, Attraktivität einer Aufnahme durch Schädlinge, Einfachheit eines Abtötens und Fixierens ohne Beschädigung bei dem Toxin und dergleichen. Weitere Überlegungen umfassen die Einfachheit einer Formulierung und Handhabung, ökonomische Belange, die Lagerungsstabilität und dergleichen.

Wirtorganismen von speziellem Interesse umfassen Hefe, wie Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. und Sporobolomyces sp., Phylloplane-Organismen, wie Pseudomonas sp., Erwinia sp. und Flavobacterium sp., oder andere Organismen, wie Escherichia, LactoBacillus sp., Bacillus sp. und dergleichen. Spezielle Organismen umfassen Pseudomonas aeurginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis und dergleichen.

VIP-Gene können in Mikroorganismen eingeführt werden, die sich auf Pflanzen (Epiphyten) multiplizieren, um VIP-Proteine an mögliche Targetschädlinge abzugeben. Epiphyten können beispielsweise gram-positive oder gram-negative Bakterien sein.

Wurzeln kolonisierende Bakterien beispielsweise können aus der interessierenden Pflanze durch auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannte Verfahren isoliert werden. Speziell kann ein Bacillus cereus Stamm, der Wurzeln kolonisiert, aus Wurzeln einer Pflanze isoliert werden (vgl. beispielsweise J. Handelsman, S. Raffel, E. Mester, L. Wunderlich und C. Grau, Appl. Environ. Microbiol. 56: 713 bis 718 (1990)). VIP1 und/oder VIP2 und/oder VIP3 können nach auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Standardverfahren in einen Wurzeln kolonisierenden Bacillus cereus Stamm eingeführt werden.

Ferner kann VIP3 oder ein anderes VIP gemäß der vorliegenden Erfindung mit Hilfe einer Elektrotransformation in den Wurzeln kolonisierenden Bacillusstamm eingeführt werden. Speziell können VIPs in einen Shuttlevektor, beispielsweise pHT3101 (D. Lereclus et al., FEMS Microbiol. Letts. 60: 211 bis 218 (1989)) gemäß Beschreibung in Beispiel 10 kloniert werden. Der Shuttlevektor pHT3101, der die Codiersequenz für das spezielle VIP enthält, kann anschließend mit Hilfe von Elektroporation (D. Lereclus et al. (1989), FEMS Microbiol. Letts. 60: 211 bis 218) in den Wurzeln kolonisierenden Bacillus transformiert werden.

Expressionssysteme können so gestaltet werden, dass VIP-Proteine außerhalb des Cytoplasmas von gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, sezerniert werden. Vorteile einer Sezernierung von VIP-Proteinen sind (1), dass mögliche toxische Effekte der in dem Cytoplasma exprimierten VIP-Proteine vermieden werden und (2), dass das Niveau des exprimierten VIP-Proteins erhöht werden kann und (3), dass eine wirksame Reinigung des VIP-Proteins unterstützt werden kann.

VIP-Proteine können so gestaltet werden, dass sie beispielsweise in E. coli sezerniert werden, indem ein geeignetes E. coli Signalpeptid an das Amino-terminale Ende des VIP-Signalpeptids anfusioniert wird oder das VIP-Signalpeptid durch das E. coli Signalpeptid ersetzt wird. Signalpeptide, die durch E. coli erkannt werden, finden sich in Proteinen, von denen bereits bekannt ist, dass sie in E. coli sezerniert werden, beispielsweise im OmpA-Protein (J. Ghrayeb. H. Kimura, M. Takahara, Y. Masui und M. Inouye, EMBO J. 3: 2437 bis 2442 (1984)). OmpA ist ein Hauptprotein der äußeren Membran von E. coli und somit wird davon ausgegangen, dass sein Signalpeptid in dem Translokationsprozess wirksam ist. Ferner erfordert das OmpA-Signalpeptid keine Modifikation vor einem Prozessieren, wie das möglicherweise für andere Signalpeptide, beispielsweise das Lipoproteinsignalpeptid (G. Duffaud, P. March und M. Inouye, Methods in Enzymology 153: 492 (1987)) notwendig sein kann.

Speziell können einmalige BamHI-Restriktionsstellen an den Amino-terminalen und Carboxy-terminalen Enden der VIP-Codiersequenzen mittels auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Standardverfahren eingeführt werden. Diese BamHI-Fragmente können im Rahmen in den Vektor pIN-III-OmpA1, -A2 oder -A3 kloniert werden (J. Ghrayeb. H. Kimura, M. Takahara, H. Hsiung, Y. Masui und M. Inouye, EMBO J. 3: 2437 bis 2442 (1984)), wodurch ein OmpA: VIP-Fusionsgen erzeugt wird, das in den Periplamaraum sezerniert wird. Die anderen Restriktionsstellen in dem Polylinker von pIN-III-OmpA können nach auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Standardverfahren eliminiert werden, sodass die Amino-terminale VIP-Aminosäurecodiersequenz sich direkt nach der OmpA-Signalpeptidspaltungsstelle befindet. Somit wäre dann die sezernierte VIP-Sequenz in E. coli identisch mit der nativen VIP-Sequenz.

Wenn das native VIP-Signalpeptid für eine geeignete Faltung des reifen Proteins nicht notwendig ist, können derartige Signalsequenzen entfernt und durch die OmpA-Signalsequenz ersetzt werden. Einmalige BamHI-Restriktionsstellen können an den Aminotermini der Proproteincodiersequenzen direkt nach den Signalpeptidcodiersequenzen von VIP und an den Carboxytermini der VIP-Codiersequenz eingeführt werden. Diese BamHI-Fragmente können anschließend wie oben beschrieben in die pIN-III-OmpA-Vektoren kloniert werden.

Allgemeine Verfahren zur Verwendung der Stämme gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Pestizidbekämpfung oder bei der Konstruktion anderer Organismen als pestizide Mittel sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt. Siehe beispielsweise US 5 039 523 A und EP 0 480 762 A2.

VIPs können in einem Bakterienwirt fermentiert und die erhaltenen Bakterien prozessiert und als mikrobielles Spray in derselben Weise verwendet werden, wie Bacillus thuringiensis Stämme als insektizide Sprays verwendet wurden. Im Falle eines VIPs (von VIPs), das (die) aus Bacillus sezerniert wird (werden), wird das Sekretionssignal unter Verwendung von auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Verfahren entfernt oder mutiert. Derartige Mutationen und/oder Deletionen verhindern eine Sekretion des (der) VIP-Proteins (VIP-Proteine) in das Wachstumsmedium während des Fermentationsprozesses. Die VIPs werden in der Zelle gehalten und die Zellen werden anschließend prozessiert, um die eingekapselten VIPs zu erhalten. Ein beliebiger geeigneter Mikroorganismus kann für diesen Zweck verwendet werden. Pseudomonas wurde verwendet, um Bacillus thuringiensis Endotoxine in Form von eingekapselten Proteinen zu exprimieren und die erhaltenen Zellen wurden prozessiert und als ein Insektizid versprüht (H. Gaertner et al., 1993, in Advances Engineered Pesticides, L. Kim, Hrsg.).

Verschiedene Stämme von Bacillus thuringiensis werden auf diese Weise verwendet. Derartige Bt Stämme produzieren Endotoxinprotein(e) sowie VIPs. Alternativ können derartige Stämme nur VIPs produzieren. Es wurde gezeigt, dass ein Bacillus subtilis Stamm mit Sporenbildungsmangel hohe Mengen des CryIIIA-Endotoxins aus Bacillus thuringiensis produziert (H. Agaisse und D. Lereclus, „Die Expression in Bacillus subtilis des Bacillus thuringiensis CryIIIA-Toxingens ist nicht abhängig von einem sporenbildungsspezifischen Sigmafaktor und wird in einer spoOA-Mutante erhöht", J. Bacteriaol. 176: 4734 bis 4741 (1994)). Eine ähnliche spoOA-Mutante kann in Bacillus thuringiensis hergestellt und verwendet werden, um eingekapselte VIPs zu produzieren, die nicht in das Medium sezerniert werden sondern in der Zelle gehalten werden.

Um die VIPs in der Bacilluszelle zu halten, kann das Signalpeptid entschärft werden, sodass es nicht länger als Sekretionssignal fungiert.

Alternativ können die Signalpeptide der VIPs gemäß der vorliegenden Erfindung aus der Sequenz eliminiert werden, wodurch sie als Sekretionsproteine in Bacillus unerkennbar werden. Speziell kann eine Methioninstartstelle vor der Proproteinsequenz unter Verwendung von auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden.

VIP-Gene können in Mikroorganismen eingeführt werden, die sich auf Pflanzen (Epiphyten) multiplizieren, um VIP-Proteine an potentielle Targetschädlinge abzugeben. Epiphyten können beispielsweise gram-positive oder gram-negative Bakterien sein.

Die Bacillusstämme gemäß der vorliegenden Erfindung oder die Mikroorganismen, die genetisch so verändert wurden, dass sie das pestizide Gen und Protein enthalten, können zum Schutz von Ackerbaufrüchten und – produkten vor Schädlingen verwendet werden. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden ganze, d. h. nicht lysierte Zellen eines ein Toxin (Pestizid) produzierenden Organismus mit Reagenzien behandelt, die die Aktivität des in der Zelle produzierten Toxins verlängern, wenn die Zelle auf die Umgebung des Targetschädlings (der Targetschädlinge) appliziert wird.

Alternativ werden die Pestizide durch Einführen eines heterologen Gens in einen zellulären Wirt produziert. Eine Expression des heterologen Gens führt direkt oder indirekt zu einer intrazellulären Produktion und Beibehaltung des Pestizids. Diese Zellen werden anschließend unter Bedingungen behandelt, die die Aktivität des in der Zelle produzierten Toxins verlängern, wenn die Zelle auf die Umgebung des Targetschädlings (der Targetschädlinge) appliziert wird. Das erhaltene Produkt behält die Toxizität des Toxins bei. Diese natürlich eingekapselten Pestizide können anschließend gemäß herkömmlicher Techniken zur Applikation auf die einen Targetschädling beherbergende Umgebung, beispielsweise Erde, Wasser und Blattwerk von Pflanzen, formuliert werden. Vergleiche beispielsweise EP 0 192 319 A und die dort genannten Literaturstellen.

Die aktiven Bestandteile gemäß der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in Form von Zusammensetzungen appliziert und können auf die zu behandelnde Feldfruchtfläche oder Pflanze gleichzeitig oder nacheinander mit anderen Verbindungen appliziert werden. Diese Verbindungen können sowohl Düngemittel als auch Mikronährmitteldonatoren oder andere Zubereitungen, die das Pflanzenwachstum beeinflussen, sein. Sie können ferner selektive Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluskizide oder Gemische mehrer dieser Zubereitungen, gewünschtenfalls zusammen mit weiteren ackerbaulich akzeptablen Trägern, grenzflächenaktiven Mitteln oder eine Applikation fördernden Hilfsstoffen, die üblicherweise auf dem Gebiet der Formulierung verwendet werden, sein. Geeignete Träger und Hilfsstoffe können fest oder flüssig sein und entsprechen den üblicherweise in Formulierungstechniken verwendeten Substanzen, z. B. natürlichen oder regenerierten mineralischen Substanzen, Lösemitteln, Dispergiermitteln, Benetzungsmitteln, klebrig machenden Mitteln, Bindemitteln oder Düngemitteln.

Bevorzugte Verfahren zur Applikation eines wirksamen Bestandteils gemäß der vorliegenden Erfindung oder einer agrochemischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die mindestens eines der durch die Bakterienstämme gemäß der vorliegenden Erfindung produzierten insektenspezifischen Proteine enthält, sind eine Blattapplikation, Samenbeschichtung oder Bodenapplikation. Die Zahl der Applikationen und die Rate der Applikation hängen von der Intensität des Befalls durch den entsprechenden Schädling ab.

Die vorliegende Erfindung liefert somit des weiteren eine entomozide Zusammensetzung, die als wirksamen Bestandteil mindestens eines der neuen insektenspezifischen Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einen rekombinanten Mikroorganismus, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für die neuen insektenspezfischen Proteine in rekombinanter Form codiert, jedoch speziell einen rekombinanten Bacillus spp Stamm, wie Bacillus cereus oder Bacillus thuringiensis, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für die neuen insektenspezifischen Proteine in rekombinanter Form codiert oder ein Derivat oder eine Mutante hiervon zusammen mit einem landwirtschaftlichen Hilfsmittel, wie einem Träger, Verdünnungsmittel, grenzflächenaktiven Mittel oder die Applikation fördernden Hilfsstoff umfasst. Die Zusammensetzung kann ferner eine weitere biologisch aktive Verbindung enthalten. Die genannte Verbindung kann sowohl ein Düngemittel als auch ein Mikronährstoffdonator oder eine andere Zubereitung sein, die das Pflanzenwachstum beeinflusst. Es kann ferner ein selektives Herbizid, Insektizid, Fungizid, Bakterizid, Nematizid, Molluskizid oder Gemisch von mehreren dieser Zubereitungen, gewünschtenfalls zusammen mit weiteren ackerbaulich akzeptablen Trägern, grenzflächenaktiven Mitteln oder die Applikation fördernden Hilfsstoffen, die üblicherweise auf dem Gebiet der Formulierung verwendet werden, sein. Geeignete Träger und Hilfsstoffe können fest oder flüssig sein und entsprechen den üblicherweise in Formulierungstechniken verwendeten Substanzen, z. B. natürlichen oder regenerierten mineralischen Substanzen, Lösemitteln, Dispergiermitteln, Benetzungsmitteln, klebrig machenden Mitteln, Bindemitteln oder Düngemitteln.

Die Zusammensetzung kann 0,1 bis 99 Gew.-% des wirksamen Bestandteils, 1 bis 99,9 Gew.-% eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und 0 bis 25 Gew.-% eines grenzflächenaktiven Mittels umfassen. Der wirksame Bestandteil, der mindestens eines der neuen insektenspezifischen Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen rekombinanten Mikroorganismus, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für die neuen insektenspezifischen Proteine in rekombinanter Form codiert, jedoch speziell einen rekombinanten Bacillus spp Stamm, wie einen Bacillus cereus- oder Bacillus thuringiensis Stamm, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für die neuen insektenspezifischen Proteine in rekombinanter Form codiert, oder ein Derivat oder eine Mutante hiervon, umfasst oder die Zusammensetzung, die den wirksamen Bestandteil enthält, kann auf die Pflanzen oder Feldfrüchte, die geschützt werden sollen, zusammen mit bestimmten anderen Insektiziden oder Chemikalien (1993, Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Kanada) ohne Verlust der Wirksamkeit verabreicht werden. Er ist mit den meisten anderen üblicherweise verwendeten landwirtschaftlichen Sprühmaterialien verträglich, sollte jedoch nicht in extrem alkalischen Sprühlösungen verwendet werden. Er kann als Staub, Suspension, benetzbares Pulver oder in einem beliebigen anderen Material, das sich für eine landwirtschaftliche Applikation eignet, verabreicht werden.

Die vorliegende Erfindung liefert des weiteren Verfahren zur Bekämpfung oder Hemmung von Insektenschädlingen durch Applikation eines wirksamen Bestandteils, der mindestens eines der neuen insektenspezifischen Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen rekombinanten Mikroorganismus, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für die neuen insektenspezifischen Proteine in rekombinanter Form codiert, umfasst, oder eine Zusammensetzung, die den wirksamen Bestandteil umfasst, auf (a) eine Umgebung, in der der Insektenschädling vorkommen kann, (b) eine Pflanze oder einen Pflanzenteil, um die Pflanze oder den Pflanzenteil vor durch den Insektenschädling verursachten Schaden zu schützen oder (c) Samen, um eine Pflanze, die sich aus dem Samen entwickelt, vor einem durch den Insektenschädling verursachten Schaden zu schützen.

Ein bevorzugtes Verfahren der Applikation auf dem Gebiet des Pflanzenschutzes ist die Applikation auf das Blattwerk der Pflanze (Blattapplikation), wobei die Zahl der Applikationen und die Applikationsrate von der zu schützenden Pflanze und dem Befallsrisiko durch den fraglichen Schädling abhängen, Der wirksame Bestandteil kann jedoch auch in die Pflanzen durch die Wurzeln (systemische Wirkung) eindringen, wenn der Standort der Pflanzen mit einer flüssigen Formulierung imprägniert wird oder wenn der wirksame Bestandteil in fester Form in den Standort der Pflanzen, beispielsweise in den Boden, z. B. in körniger Form, eingebaut wird (Bodenapplikation). Bei ungeschälten Reisfrüchten kann ein derartiges Granulat in dosierten Mengen auf das geflutete Reisfeld appliziert werden.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen sich ferner zum Schutz von Pflanzenvermehrungsmaterial, z. B. Samen, wie Früchte, Tuber oder Tuber oder Körner oder Pflanzensetzlingen vor Insektenschädlingen. Das Vermehrungsmaterial kann mit der Formulierung vor dem Pflanzen behandelt werden: Samen kann beispielsweise vor dem Einsähen umhüllt werden. Der wirksame Bestandteil gemäß der vorliegenden Erfindung kann ferner auf Körner (Beschichten) entweder durch Imprägnieren der Körner mit einer flüssigen Formulierung oder durch Beschichten derselben mit einer festen Formulierung appliziert werden. Die Formulierung kann ferner auf die Pflanzstelle appliziert werden, wenn das Vermehrungsmaterial gepflanzt wird, beispielsweise in die Saatfurche während des Sähens. Die Erfindung betrifft auch diese Verfahren der Behandlung von Pflanzenvermehrungsmaterial und das so behandelte Pflanzenvermehrungsmaterial.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die als wirksamen Bestandteil einen rekombinanten Mikroorganismus umfassen, der mindestens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form enthält, jedoch speziell einen rekombinanten Bacillus spp Stamm, wie einen Bacillus cereus Stamm oder einen Bacillus thuringiensis Stamm, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für die neuen insektenspezifischen Proteine in rekombinanter Form codiert, oder ein Derivat oder eine Mutante hiervon können in einem beliebigen zur Behandlung von Samen oder Boden mit Bakterienstämmen bekannten Verfahren appliziert werden. Vgl. beispielsweise US 4 863 866 A. Die Stämme sind wirksam für eine Biobekämpfung, selbst wenn der Mikroorganismus nicht lebendig ist. Bevorzugt ist jedoch die Applikation des lebenden Mikroorganismus.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu schützende Targetpflanzen umfassen beispielsweise die folgenden Pflanzenspezies:

Cerealien (Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Sorghum und verwandte Feldfrüchte), Rüben (Zuckerrüben und Futterrüben), Futtergräser (Knäuelgras, Schwindelgras und dergleichen), Steinfrüchte, Kernfrüchte und weiche Früchte (Äpfel, Birnen, Pflaumen, Pfirsiche, Mandeln, Kirschen, Erdbeeren, Himbeeren und Blaubeeren), Hülsenpflanzen (Bohnen, Linsen, Erbsen, Sojabohnen), Ölpflanzen (Raps, Senf, Mohn, Oliven, Sonnenblumen, Kokosnüsse, Rhizinusölpflanzen, Kakaobohnen, Erdnüsse), Gurkenpflanzen (Gurken, Eierkürbis, Melonen), Faserpflanzen (Baumwolle, Flachs, Hanf, Jute), Citrusfrüchte (Orangen, Zitronen, Grapefruit, Mandarinen), Gemüse (Spinat, Lattich, Spargel, Kohl und andere Brassicae, Zwiebeln, Tomaten, Kartoffeln, Paprika), Lauraceae (Avocados, Karotten, Zimt, Kampfer), Laubbäume und Nadelbäume (z. B. Lindenbäume, Eibenbäume, Eichenbäume, Erlen, Pappeln, Birkenbäume, Tannen, Lärchen, Kiefern) oder Pflanzen, wie Mais, Tabak, Nüsse, Kaffee, Zuckerrohr, Tee, Wein, Hopfen, Bananen und natürliche Kautschukpflanzen, sowie Zierpflanzen (einschließlich Kompositen).

Ein rekombinanter Bacillus spp Stamm, wie ein Bacillus cereus oder Bacillus thuringiensis Stamm, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für die neuen insektenspezifischen Proteine in rekombinanter Form codiert, wird normalerweise in Form von entomiziden Zusammensetzungen appliziert und kann auf die zu behandelnde Feldfruchtfläche oder Pflanze gleichzeitig oder aufeinander folgend mit weiteren biologisch aktiven Verbindungen appliziert werden. Diese Verbindungen können sowohl Düngemittel als auch Mikronährstoffdonatoren oder andere Zubereitungen, die das Pflanzenwachstum beeinflussen, sein. Sie können ferner selektive Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluskizide oder Gemische mehrerer dieser Zubereitungen, gewünschtenfalls zusammen mit weiteren Trägern, grenzflächenaktiven Mitteln oder eine Applikation fördernden Hilfsstoffen, die üblicherweise auf dem Gebiet der Formulierung verwendet werden, sein.

Der wirksame Bestandteil gemäß der vorliegenden Erfindung kann in nicht modifizierter Form oder zusammen mit einem beliebigen geeigneten ackerbaulich akzeptablen Träger verwendet werden. Derartige Träger sind üblicherweise auf dem Gebiet der landwirtschaftlichen Formulierung verwendete Hilfsstoffe, und sie werden folglich in bekannter Weise zu emulgierbaren Konzentraten, auftragbaren Pasten, direkt versprühbaren oder verdünnbaren Lösungen, verdünnten Emulsionen, benetzbaren Pulvern, löslichen Pulvern, Stäuben, Granulaten und auch Einkapselungen, beispielsweise in Polymersubstanzen, formuliert. Wie die Natur der Zusammensetzungen, werden die Applikationsverfahren, beispielsweise Sprühen, Zerstäuben, Bestäuben, Verstreuen oder Vergießen, gemäß dem angestrebten Ziel und den vorherrschenden Umständen ausgewählt. Bevorzugte Applikationsraten sind normalerweise etwa 50 g bis etwa 5 kg wirksamer Bestandteil (a. i.) pro Hektar (Ha etwa 2,471 Acres), vorzugsweise etwa 100 g bis etwa 2 kg a. i./Ha. Wichtige Applikationsraten sind etwa 200 g bis etwa 1 kg a. i./Ha und 200 g bis 500 g a. i./Ha.

Für ein Samendressieren vorteilhafte Applikationsraten sind 0,5 g bis 1.000 g a. i. pro 100 kg Saat, vorzugsweise 3 g bis 100 g a. i. pro 100 kg Saat oder 10 g bis 50 g a. i. pro 100 kg Saat.

Geeignete Träger und Hilfsstoffe können fest oder flüssig sein und entsprechen den üblicherweise in Formulierungstechniken verwendeten Substanzen, beispielsweise sind es natürliche oder regenerierte mineralisch Substanzen, Lösemittel, Dispergiermittel, Benetzungsmittel, klebrig machende Mittel, Bindemittel oder Düngemittel. Die Formulierungen, d. h. die entomiziden Zusammensetzungen, Zubereitungen oder Gemische, die den rekombinanten Bacillus spp Stamm, wie einen Bacillus cereus- oder Bacillus thuringiensis Stamm, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für die neuen insektenspezifischen Proteinen in rekombinanter Form umfasst, als wirksamen Bestandteil enthalten, oder Kombination hiervon mit anderen wirksamen Bestandteilen und, falls geeignet, einem festen oder flüssigen Hilfsstoff, werden in bekannter Weise, beispielsweise durch homogenes Vermischen und/oder Vermahlen der wirksamen Bestandteile mit Streckmitteln, z. B. Lösemitteln, festen Trägern und in einigen Fällen grenzflächenaktiven Verbindungen (grenzflächenaktiven Mitteln), hergestellt.

Geeignete Lösemittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise die 8 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltenden Fraktionen, z. B. Xylolgemische oder substituierte Naphthaline, Phthalate, wie Dibutylphthalat oder Dioctylphthalat, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine, Alkohole und Glycole und ihre Ether und Ester, wie Ethanol, Ethylenglycolmonomethylether oder -monoethylether, Ketone, wie Cyclohexanon, stark polare Lösemittel, wie N-Methyl-2-pyrrolidon, Dimehtylsulfoxid oder Dimethylformamid sowie pflanzliche Öle oder epoxidierte pflanzliche Öle, wie epoxidiertes Kokosnussöl oder Sojabohnenöl, oder Wasser.

Die beispielsweise für Stäube und dispergierbare Pulver verwendeten festen Träger sind normalerweise natürliche Füllstoffe, wie Calcit, Talkum, Kaolin, Montmorillonit oder Attapulgit. Zur Verbesserung der physikalischen Eigenschaften ist es auch möglich, hoch dispergierte Kieselsäure oder hoch dispergierte Adsorptionsmittelpolymere zuzugeben. Geeignete granulierte Adsorptionsträger sind poröse Typen, z. B. Bimsstein, Bruchbackstein, Sepiolit oder Bentonit, geeignete nicht sorbierende Träger sind Materialien wie Calcit oder Sand. Darüber hinaus kann eine große Zahl von vorgranulierten Materialien anorganischer oder organischer Natur verwendet werden, z. B. insbesondere Dolomit oder pulverisierte Pflanzenreste.

In Abhängigkeit von der Natur der zu formulierenden wirksamen Bestandteile sind geeignete grenzflächenaktive Verbindungen nicht ionische, kationische und/oder anionische grenzflächenaktive Mittel mit guten Emulgier-Dispergier- und Benetzungseigenschaften. Der Ausdruck „grenzflächenaktive Mittel" soll auch so verstanden werden, dass er Gemische von grenzflächenaktiven Mitteln umfasst. Geeignete anionische grenzflächenaktive Mittel können sowohl wasserlösliche Seifen als auch wasserlösliche synthetische grenzflächenaktive Verbindungen sein. Geeignete Seifen sind die Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze oder die nicht substituierten oder substituierten Ammoniumsalze von höheren Fettsäuren (C10-C22), z. B. die Natrium- oder Kaliumsalze von Ölsäure oder Stearinsäure oder von natürlichen Fettsäuregemischen, die beispielsweise aus Kokosnussöl oder Talgöl erhalten werden können. Weitere geeignete grenzflächenaktive Mittel sind ferner die Fettsäuremethyltaurinsalze sowie modifizierte und nicht modifizierte Phospholipide.

Häufiger werden jedoch so genannte synthetische grenzflächenaktive Mittel verwendet, insbesondere Fettsulfonate, Fettsulfate, sulfonierte Benzimidazolderivate oder Alkylarylsulfonate. Die Fettsulfonate oder -sulfate liegen üblicherweise in Formen von Alkalimetallsalzen, Erdalkalimetallsalzen oder nicht substituierten oder substituierten Ammoniumsalzen vor und enthalten im Allgemeinen einen C8-C22 Alkylrest, der ferner die Alkyleinheit von Acylresten umfasst, beispielsweise das Natrium- oder Calciumsalz von Lignosulfonsäure, von Dodecylsulfat oder von einem Gemisch von Fettalkoholsulfaten, die aus natürlichen Fettsäuren erhalten werden. Diese Verbindungen umfassen auch die Salze von Schwefelsäureestern und Sulfonsäuren von Fettalkohol/Ethylenoxid-Addukten. Die sulfonierten Benzimidazolderivate enthalten vorzugsweise zwei Sulfonsäuregruppen und einen Fettsäurerest mit etwa 8 bis 22 Kohlenstoffatomen. Beispiele für Alkylarylsulfonate sind die Natrium-, Calcium- oder Triethanolaminsalze von Dodecylbenzolsulfonsäure, Dibutylnaphthalinsulfonsäure oder von einem Napthalinsulfonsäure/Formaldehydkondensationsprodukt. Ferner geeignet sind die entsprechenden Phosphate, z. B. Salze des Phosphorsäureesters eines Addukts von p-Nonylphenol mit 4 bis 14 mol Ethylenoxid.

Nichtionische grenzflächenaktive Mittel sind vorzugsweise Polyglycoletherderivate von aliphatischen oder cycloaliphatischen Alkoholen oder gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren und Alkylphenolen, wobei die Derivate 3 bis 30 Glycolethergruppen und 8 bis 20 Kohlenstoffatome in der (aliphatischen) Kohlenwasserstoffeinheit und 6 bis 18 Kohlenstoffatome in der Alkyleinheit der Alkylphenole enthalten.

Weitere geeignete nichtionische grenzflächenaktive Mittel sind die wasserlöslichen Addukte von Polyethylenoxid mit Polypropylenglycol, Ethylendiaminopolypropylenglycol und Alkylpolypropylenglycol mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, wobei die Addukte 20 bis 250 Ethylenglycolethergruppen und 10 bis 100 Propylenglycolethergruppen enthalten. Diese Verbindungen enthalten üblicherweise 1 bis 5 Ethylenglycoleinheiten pro Propylenglycoleinheit. Repräsentative Beispiele für nichtionische grenzflächenaktive Mittel sind Nonylphenolpolyethoxyethanole, Rhizinusölpolyglycolether, Polypropylen/Polyethylenoxidaddukte, Tributylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglycol und Octylphenoxypolyethoxyethanol. Fettsäureester von Polyoxyethylensorbitan, wie Polyoxyethylensorbitantrioleat, sind auch geeignete nichtionische grenzflächenaktive Mittel.

Kationische grenzflächenaktive Mittel sind vorzugsweise quaternäre Ammoniumsalze, die als N-Substituenten mindestens einen C8-C22 Alkylrest und als weitere Substituenten niedrigere nicht subsituierte oder halogenierte Alkyl-, Benzyl- oder Hydroxylniedrigalkylreste enthalten. Die Salze liegen vorzuzgsweise in Form von Halogeniden, Methylsulfaten oder Ethylsulfaten vor, z. B. Stearyltrimethylammoniumchlorid oder Benzyldi-(2-chlorethyl)ethylammoniumbromid.

Die üblicherweise auf dem Gebiet der Formulierung verwendeten grenzflächenaktiven Mittel sind z. B. bei „McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publishing Corp., Ridgewood, N.J., 1979, Dr. Helmut Stache, „Tensid Taschenbuch" (Handbook of Surfactans), Carl Hanser Verlag, München/Wien, beschrieben.

Eine weitere speziell bevorzugte Eigenschaft einer erfindungsgemäßen entomiziden Zusammensetzung ist die Persistenz des wirksamen Bestandteils bei Applikation auf Pflanzen und Erde. Mögliche Ursachen für einen Verlust von Aktivität umassen eine Inaktivierung durch UV-Licht, Wärme, Blattexsudate und den pH-Wert. Beispielsweise werden bei hohem pH-Wert, insbesondere in Gegenwart eines Reduktionsmittels &dgr;-Endotoxinkristalle solubilisiert und werden somit für eine proteolytische Inaktivierung zugänglicher. Ein hoher Blatt-pH-Wert kann auch wichtig sein, insbesondere, wenn die Blattoberfläche im Bereich eines pH-Werts von 8 bis 10 vorliegen kann. Die Formulierung einer entomiziden Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann diesen Problemen begegnen, indem entweder Additive eingearbeitet werden, die dabei helfen, einen Verlust des wirksamen Bestandteils zu verhindern, oder indem das Material in einer derartigen Weise eingekapselt wird, dass der wirksame Bestandteil vor einer Inaktivierung geschützt wird. Eine Einkapselung kann chemisch (McGuire und Shasha, J. Econ. Entomol. 85: 1425 bis 1433, 1992) oder biologisch (Barnes und Cummings, 1986, EP 0 192 319 A) erfolgen. Eine chemische Einkapselung umfasst ein Verfahren, bei dem der wirksame Bestandteil mit einem Polymer beschichtet wird, während eine biologische Einkapselung die Expression der &dgr;-Endotoxingene in einer Microbe umfasst. Für eine biologische Einkapselung wird die intakte Mikrobe, die mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für die neuen insektenspezifischen Proteine in rekombinanter Form umfasst, als wirksamer Bestandteil in der Formulierung verwendet. Die Zugabe von UV-Schutzmitteln kann in wirksamer Weise einen Strahlungsschaden verringern. Eine Inaktivierung infolge von Wärme kann auch durch Einarbeiten eines geeigneten Additivs gesteuert werden.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Anmeldung sind Formulierungen, die lebende Mikroorganismen als wirksamen Bestandteil entweder in Form der vegetativen Zelle oder stärker bevorzugt in Form von Sporen, falls verfügbar, umfassen. Geeignete Formulierungen können beispielsweise aus Polymergelen bestehen, die mit mehrwertigen Kationen vernetzt sind und diese Mikroorganismen umfassen. Dies ist beispielsweise bei D. R. Fravel et al. in Phytopathology, Band 75, Nr. 7, 774 bis 777, 1985, für Alginat als Polymermaterial beschrieben. Es ist aus dieser Veröffentlichung auch bekannt, dass Trägermaterialien mitverwendet werden können. Diese Formulierungen werden grundsätzlich durch Vermischen von Lösungen von natürlich vorkommenden oder synthetischen gelbildenden Polymeren, wie Alginaten, und wässrigen Salzlösungen der mehrwertigen Metallionen, sodass einzelne Tröpfchen gebildet werden, hergestellt, wobei es möglich ist, dass die Mikroorganismen in einer der beiden oder in beiden Reaktionslösungen suspendiert werden. Die Gelbildung beginnt mit dem Vermischen in Tropfenform. Ein nachfolgendes Trocknen dieser Gelteilchen ist möglich. Dieses Verfahren wird als ionotrope Gelbildung bezeichnet. In Abhängigkeit von dem Trocknungsgrad werden kompakte und harte Teilchen von Polymeren gebildet, die strukturell über mehrwertige Kationen vernetzt sind und die Mikroorganismen und einen überwiegend gleichmäßig verteilten Träger, der vorhanden ist, umfassen. Die Größe der Teilchen kann bis zu 5 mm betragen.

Zusammensetzungen auf der Basis von teilweise vernetzten Polysacchariden, die neben einem Mikroorganismus beispielsweise auch feinteilige Kieselsäure als Trägermaterial umfassen können (eine Vernetzung erfolgt beispielsweise über Calcium++-Ionen, sind in EP 0 097 571 A1 beschrieben. Die Zusammensetzungen besitzen eine Wasseraktivität von nicht mehr als 0,3. W. J. Cornick et al. beschreiben in einem Übersichtsartikel (New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultwal Pests and Diseases, Seiten 345 bis 372, Alan R. Liss, Inc. (1990)). Verschiedene Formulierungssysteme, Granulate mit Vermiculit als Träger und kompakte Alginatkügelchen, die durch ein ionotropes Gelbildungsverfahren, das erwähnt ist, hergestellt wurden. Derartige Zusammensetzungen sind auch bei D. R. Fravel in: Pesticide Formulations and Application Systems: 11. Band, ASTM STP 1112 American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 1992, Seiten 173 bis 179, offenbart und können zur Formulierung der rekombinanten Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen entomiziden Zusammensetzungen enthalten üblicherweise etwa 0,1 bis etwa 99%, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 95%, insbesondere etwa 3 bis etwa 90%, des wirksamen Bestandteils, etwa 1 bis etwa 99,9%, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 99% und insbesondere etwa 5 bis etwa 95%, eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und etwa 0 bis etwa 25%, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 25%, insbesondere etwa 0,1 bis etwa 20%, eines grenzflächenaktiven Mittels.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die entomiziden Zusammen setzungen üblicherweise 0,1 bis 99%, vorzugsweise 0,1 bis 95%, eines rekombinanten Bacillus spp Stammes, wie eines Bacillus cereus- oder Bacillus thuringiensis Stammes, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für die neuen insektenspezifischen Proteine in rekombinanter Form umfasst oder eine Kombination hiervon mit anderen wirksamen Bestandteilen, 1 bis 99,9% eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und 0 bis 25%, vorzugsweise 0,1 bis 20%, eines grenzflächenaktiven Mittels.

Obwohl kommerzielle Produkte vorzugsweise als Konzentrate formuliert sind, verwendet der Endverbraucher normalerweise verdünnte Formulierungen einer wesentlich geringeren Konzentration. Die entomiziden Zusammensetzungen können ferner weitere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Antischaummittel, die Viskosität steuernde Mittel, Bindemittel, klebrig machende Mittel sowie Düngemittel oder andere wirksame Bestandteile enthalten, um spezielle Wirkungen zu erreichen.

Die vorliegende Erfindung, die im obigen allgemein beschrieben wurde, soll zum besseren Verständnis anhand der folgenden Beispiele beschrieben werden, die lediglich der Veranschaulichung dienen und den Umfang der vorliegenden Erfindung, sofern nicht anders angegeben, nicht einschränken sollen.

Eine Standardnomenklatur wurde basierend auf der Sequenzidentität der durch die vorliegende Erfindung umfassten Proteine entwickelt. Die Gen- und Proteinnamen für die detaillierten Beispiele, die folgen, und ihre Beziehung zu den in der Stammanmeldung (US-Patentanmeldung mit der fortlaufenden Nummer 314 594/08) verwendeten Namen sind nachfolgend angegeben.

Experimenteller Teil Formulierungsbeispiele

Der in den folgenden Formulierungsbeispielen verwendete wirksame Bestandteil ist der Bacillus cereus Stamm AB78 mit der Hinterlegungsnummer NRRL B-21058, die Bacillus thuringiensis Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227 und NRRL B-21439 sowie die Bacillus spp Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-21228, NRRL B-21229 und NRRL B-21230. All die genannten Stämme sind natürliche Isolate, die die insektenspezifischen Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen.

Alternativ werden die isolierten insektenspezifischen Proteine als wirksamer Bestandteil alleine oder in Kombination mit den oben genannten Bacillusstämmen verwendet.

A1. Benetzbare Pulver

Die Sporen werden gründlich mit den Hilfsstoffen vermischt und das Gemisch wird gründlich in einer geeigneten Mahlvorrichtung gemahlen, wobei benetzbare Pulver erhalten werden, die mit Wasser verdünnt werden können, um Suspensionen der gewünschten Konzentrationen zu liefern. A2. Emulgierbares Konzentrat Bacillus thuringiensis Sporen 10% Octylphenolpolyethylenglycolether (4 bis 5 mol Ethylenoxid) 3% Calciumdodecylbenzolsulfonat 3% Rhizinusölpolyglycolether (36 mol Ethylenoxid) 4% Cyclohexanon 30% Xylolgemisch 50%

Emulsionen einer beliebigen erforderlichen Konzentration können aus diesem Konzentrat durch Verdünnen mit Wasser erhalten werden.

A3. Stäube

Gebrauchsfertige Stäube werden durch Vermischen des wirksamen Bestandteils mit den Trägern und Vermahlen des Gemisches in einer geeigneten Mahlvorrichtung erhalten. A4. Extrudiergranulat Bacillus thuringiensis Sporen 10% Natriumlignosulfonat 2% Carboxymethylcellulose 1% Kaolin 87%

Der wirksame Bestandteil oder eine Kombination wird mit den Hilfsverbindungen vermischt und vermahlen und das Gemisch nachfolgend mit Wasser angefeuchtet. Das Gemisch wird extrudiert, granuliert und in einem Luftstrom getrocknet. A5. Beschichtetes Granulat Bacillus thuringiensis Sporen 3% Polyethylenglycol (Molekulargewicht 200) 3% Kaolin 94%

Der wirksame Bestandteil oder eine Kombination wird in einem Mischer gleichmäßig zu dem mit Polyethylenglycol befeuchteten Kaolin zugegeben. Nicht staubige beschichtete Granulate werden auf diese Weise erhalten. A6. Suspensionskonzentrat Bacillus thuringiensis Sporen 40% Ethylenglycol 10% Nonylphenolpolyethylenglycolether (15 mol Ethylenoxid) 6% Natriumlignosulfonat 10% Carboxymethylcellulose 1% 37% wässrige Formaldehydlösung 0,2% Siliconöl in Form einer 75%igen wässrigen Lösung 0,8% Wasser 32%

Der wirksame Bestandteil oder eine Kombination wird innig mit den Hilfsstoffen gemischt, wobei ein Suspensionskonzentrat erhalten wird, aus dem Suspensionen einer beliebigen gewünschten Konzentration durch Verdünnen mit Wasser erhalten werden können.

Beispiel 1. Bakterienkultur

Eine Subkultur eines Bc Stammes AB78 wurde verwendet, um das folgende Medium, das als TB-Brühe bekannt ist, anzuimpfen: Trypton 12 g/l Hefeextrakt 24 g/l Glycerin 4 ml/l KH2PO4 2,1 g/l K2HPO4 14,7 g/l pH-Wert 7,4

Das Kaliumphosphat wurde nach Abkühlen zu der autoclavierten Brühe zugegeben. Die Kolben wurden bei 30°C auf einem Rotationsschüttelgerät bei 250 Upm 24 h bis 36 h, was eine frühe bis mittlere logarithmische Wachstumsphase darstellt, inkubiert.

Das obige Vorgehen kann ohne Schwierigkeiten maßstabmäßig auf große Fermentatoren nach auf dem einschlägigen Fachgebiet gut bekannten Verfahren vergrößert werden.

Während des vegetativen Wachstums, üblicherweise 24 h bis 36 h nach dem Starten der Kultur, was eine frühe bis mittlere logarithmische Wachstumsphase darstellt, wurden die AB78-Bakterien von dem Kulturüberstand abzentrifugiert. Der das aktive Protein enthaltende Kulturüberstand wurde in Bioassays verwendet.

Beispiel 2. Insektenbioassays

Der B. cereus Stamm AB78 wurde gegen verschiedene Insekten, wie nachfolgend beschrieben, getestet.

Westlicher, Nördlicher und Südlicher Maiswurzelbohrer, Diabrotica virgifera virgifera, D. longicornis barberi bzw. D. undecempunctata howardi: Verdünnungen wurden aus dem AB78-Kulturüberstand, der 24 h bis 36 h gezüchtet worden war, hergestellt, mit geschmolzener künstlicher Nahrung (Marrone et al. (1985), J. of Economic Entomology 78: 290 bis 293) vermischt und verfestigen gelassen. Verfestigte Nahrung wurde geschnitten und in Schalen gegeben. Neugeborene Larven wurden auf die Nahrung gesetzt und bei 30°C gehalten. Die Mortalität wurde nach 6 Tagen aufgezeichnet.

E. coli Klon Bioassay: E. coli-Zellen wurden über Nacht in Brühe, die 100 &mgr;g/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C gezüchtet. 10 ml Kultur wurden dreimal jeweils 20 sec lang beschallt. 500 &mgr;l beschallte Kultur wurden zu geschmolzener Nahrung für Westlichen Maiswurzelbohrer zugegeben.

Colorado Kartoffelkäfer, Leptinotarsa decemlineata: Verdünnungen in Triton X-100 (auf eine Endkonzentration von 0,1% TX-100) wurden aus AB78-Kulturüberstand, der 24 h bis 36 h wachsen gelassen worden war, hergestellt. 5 cm2 große Kartoffelblattstücke wurden in diese Verdünnungen eingetaucht, an Luft getrocknet und auf feuchtes Filterpapier in Plastikschalen gegeben. Neugeborene Larven wurden auf die Blattstücke gesetzt und bei 30°C gehalten. Die Mortalität wurde nach 3 bis 5 Tagen aufgezeichnet.

Gelber Mehlwurm, Tenebrio molitor: Verdünnungen wurden aus AB78-Kulturüberstand, der 24 h bis 36 h wachsen gelassen worden war, hergestellt, mit geschmolzener künstlicher Nahrung (Bioserv, F9240) vermischt und verfestigen gelassen. Verfestigte Nahrung wurde geschnitten und in Plastikschalen gegeben. Neugeborene Larven wurden auf die Nahrung gesetzt und bei 30°C gehalten. Die Mortalität wurde nach 6 bis 8 Tagen aufgezeichnet.

Europäischer Maiszünsler, Ypsiloneule, Baumwolleule, Tabakschwärmer und Rübenheerwurm, Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis virescens, Manduca sexta bzw. Spodoptera exigua: Verdünnungen in TX-100 (auf eine Endkonzentration von 0,1% TX-100) wurden aus AB78-Kulturüberstand, der 24 h bis 36 h wachsen gelassen worden war, hergestellt. 100 &mgr;l wurden auf die Oberfläche von 18 cm2 einer verfestigten künstlichen Nahrung (Bioserv, F9240) pipettiert und an Luft trocknen gelassen. Neugeborene Larven wurden anschließend auf die Oberfläche der Nahrung gesetzt und bei 30°C gehalten. Die Mortalität wurde nach 3 bis 6 Tagen aufgezeichnet.

Nördliche Hausstechmücke, Culex pipiens: Verdünnungen wurden aus AB78-Kulturüberstand, der 24 h bis 36 h wachsen gelassen worden war, hergestellt. 100 &mgr;l wurden in 10 ml Wasser in eine 30 ml fassenden Plastikschale pipettiert. Larven der dritten Erscheinungsform wurden zu dem Wasser zugegeben und bei Raumtemperatur gehalten. Die Mortalität wurde nach 24 h bis 48 h aufgezeichnet. Das Spektrum der entomiziden Aktivität von AB78 ist in Tabelle 14 angegeben.

Tabelle 14

Aktivität von AB78-Kulturüberstand gegen verschiedene Insektenspezies

Der neu gefundene B. cereus Stamm AB78 zeigte ein signifikant unterschiedliches Spektrum einer Insektiziden Aktivität verglichen mit bekannten käferaktiven &dgr;-Endotoxinen von Bt. Insbesondere zeigte AB78 eine selektivere Aktivität gegenüber Käfern als bekannte käferaktive Bt Stämme dahingehend, dass es speziell gegen Diabrotica spp aktiv war. Insbesondere ist es am aktivsten gegen D. virgifera virgifera und D. longicornis barberi, jedoch nicht gegen D. undecimpunctata howardi.

Eine Reihe von Bacillusstämmen wurde einem Bioassay unterzogen, um die Aktivität während des vegetativen Wachstums (Tabelle 15) gegenüber Westlichem Maiswurzelbohrer zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass AB78 einzigartig dahingehend ist, dass die Aktivität gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer nicht ein allgemeines Phänomen ist.

Tabelle 15

Aktivität von Kulturüberständen aus verschiedenen Bacillus spp gegen Westlichen Maiswurzelbohrer

Die spezifische Aktivität von AB78 gegen Westlichen Maiswurzelbohrer ist in Tabelle 16 angegeben.

Tabelle 16

Aktivität eines AB78 Kulturüberstands gegen neugeborenen Westlichen Maiswurzelbohrer

Der LC50-Wert wurde mit 6,2 &mgr;l Kulturüberstand pro ml Nahrung für den Westlichen Maiswurzelbohrer berechnet.

Das Zellpellet wurde ferner einem Bioassay unterzogen und wies keine Aktivität gegen WCRW auf. Somit zeigt die Gegenwart einer Aktivität lediglich im Überstand, dass dieses VIP ein Exotoxin ist.

Beispiel 3. Cosmidklonierung von Gesamt-DNA aus dem B. cereus Stamm AB78

Das VIP1A(a)-Gen wurde aus Gesamt-DNA, die aus dem Stamm AB78 hergestellt worden war, wie folgt kloniert:

Isolierung von AB78-DNA erfolgte wie folgt:

  • 1. Züchten von Bakterien in 10 ml L-Brühe über Nacht. (Verwende 50 ml fassendes steriles Zentrifugenrohr.)
  • 2. Zugeben von 25 ml frischer L-Brühe und Ampicillin (30 &mgr;g/ml).
  • 3. Züchten von Zellen während 2 h bis 6 h bei 30°C unter Schütteln.
  • 4. Rotierenlassen der Zellen in einem 50 ml fassenden Polypropylenröhrchen mit orangem Deckel in einer IEC-Tischklinikzentrifuge mit ¾ Geschwindigkeit.
  • 5. Resuspendieren des Zellpellets in 10 ml TES (TES = 50 mM TRIS eines pH-Werts von 8,0, 100 mM EDTA, 15 mM NaCl).
  • 6. Zugeben von 30 mg Lysozym und Inkubieren während 2 h bei 37°C.
  • 7. Zugeben von 200 &mgr;l 20% SDS und 400 &mgr;l Proteinase K Vorratslösung (20 mg/ml). Inkubieren bei 37°C.
  • 8. Zugeben von 200 &mgr;l frischer Proteinase K-Lösung. Inkubieren während 1 h bei 55°C. Zugeben von 5 ml TES zur Herstellung von 15 ml Endvolumen.
  • 9. Zweimalige Phenolextraktion (10 ml Phenol, Durchwirbeln bei Raumtemperatur bei ¾ Geschwindigkeit in einer IEC-Tischklinikzentrifuge). Überführen des Überstands (obere Phase) in ein reines Röhrchen unter Verwendung einer Pipette mit breiter Bohrung.
  • 10. Einmaliges Extrahieren mit 1 : 1 Volumina Phenol : Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24 : 1).
  • 11. Fällen der DNA mit einem gleichen Volumen an kaltem Isopropanol. Zentrifugieren, um die DNA zu pelletieren.
  • 12. Resuspendieren des Pellets in 5 ml TE.
  • 13. Fällen der DNA mit 0,5 ml 3 M NaOAc eines pH-Werts von 5,2 und 11 ml 95% Ethanol. 2 h bei –20°C aufbewahren.
  • 14. „Anhaken" der DNA aus dem Röhrchen mit einer Plastikschlaufe, Überführen in ein Mikrozentrifugenröhrchen, Durchwirbeln, Abpipettieren von überschüssigem Ethanol, Trocknen im Vakuum.
  • 15. Resuspendieren in 0,5 ml TE. 90 minütiges Inkubieren bei 65°C, um dabei zu helfen, dass die DNA zurück in Lösung geht.
  • 16. Bestimmen der Konzentration unter Verwendung von Standardverfahren.

Cosmidklonieren von AB78

Alle Verfahren wurden, sofern nicht anders angegeben, gemäß dem Stratagene Protokoll, Supercos 1 Instruktionshandbuch, Kat. Nr. 251301, durchgeführt.

Im Allgemeinen waren die Stufen die folgenden:

  • A. Sau 3A-Teilverdau der AB78-DNA.
  • B. Herstellung der Vektor-DNA.
  • C. Legieren und Verpacken der DNA.
  • D. Titrieren der Cosmidbilbiothek.
  • 1. Starten einer Kultur von HB 10 l-Zellen durch Einbringen von 50 ml einer Über-Nacht-Kultur in 5 ml TB mit 0,2% Maltose. 3,5 h Inkubieren bei 37°C.
  • 2. Herausrotieren der Zellen und Resuspendieren in 0,5 ml 10 mM MgSO4.
  • 3. Gemeinsames Zugeben von

    100 l Zellen

    100 l verdünntes Verpackungsgemisch

    100 l 10 mM MgSO4

    30 l TB
  • 4. Adsorbieren bei Raumtemperatur während 30 min während nicht geschüttelt wird.
  • 5. Zugeben von 1 ml TB und schonendes Mischen. 30 minütiges Inkubieren bei 37°C,
  • 6. Plattieren von 200 l auf L-amp-Platten. Über Nacht Inkubieren bei 37°C.

Mindestens 400 Cosmidklone wurden willkürlich ausgewählt und bezüglich einer Aktivität gegen Westlichen Maiswurzelbohrer gemäß Beschreibung in Beispiel 2 gescreent. DNA aus fünf aktiven Klonen und fünf nicht aktiven Klonen wurde in Southern-Hybridisierungen verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Hybridisierung unter Verwendung der oben beschriebenen Oligonucleotidsonde mit einer Aktivität des Westlichen Maiswurzelbohrers korrelierte (Tabelle 18).

Die Cosmidklone P3-12 und P5-4 wurden bei der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern NRRL B-21061 bzw. NRRL B-21059.

Tabelle 18

Aktivität der AB78-Cosmidklone gegen Westlichen Maiswurzelbohrer
Beispiel 4. Reinigung von VIPs aus dem Stamm AB88:

Eine flüssige Bakterienkultur wurde über Nach (12 h) bei 30°C in TB-Medium wachsen gelassen. Die Zellen wurden 20 min bei 5.000 g zentrifugiert und der Überstand zurück behalten. In dem Überstand vorhandene Proteine wurden mit Ammoniumsulfat (7%ige Sättigung) gefällt, 15 min bei 5.000 g zentrifugiert und das Pellet zurück behalten. Das Pellet wurde in dem ursprünglichen Volumen von 20 mM Tris eines pH-Werts von 7,5 resuspendiert und über Nacht gegen denselben Puffer bei 4°C dialysiert. AB88-Dialysat war trüber als vergleichbares Material von AB78. Das Dialysat wurde unter Verwendung von 20 mM Natriumcitrat (pH-Wert 2,5) auf einen pH-Wert von 4,5 titriert und nach 30 minütiger Inkubation bei Raumtemperatut wurde die Lösung bei 3.000 g 10 min zentrifugiert. Das Proteinpellet wurde in 20 mM Bis-tris-propan eines pH-Werts von 4,0 abermals gelöst.

AB88-Proteine wurden nach verschiedenen unterschiedlichen Verfahren nach einer Klärung einschließlich einem isoelektrischen Fokussieren (Rotofor, BioRad, Hercules, CA) einer Fällung bei pH-Wert 4,5, einer Ionenaustauschchromatographie, einer Größenausschlusschromatographie und Ultrafiltration getrennt.

Die Proteine wurden auf einer Poros HQ/N Anionenaustauschsäule (perSeptive Biosystems, Cambridge, MA) unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 500 mM NaCl in 20 mM Bis-tris-propan eines pH-Werts von 9,0 bei einer Strömungsrate von 4 ml/min getrennt. Das Insektizide Protein eluierte bei 250 mM NaCl.

Gegen Europäischen Maiszünsler (ECB) aktives Protein verblieb in dem Pellet, das durch eine Fällung des Dialysats bei einem pH-Wert von 4,5 erhalten worden war. Wenn eine präparative IEF mit dem Dialysat unter Verwendung von Ampholyten eines pH-Werts von 3 bis 10 durchgeführt wurde, zeigte sich eine ECB insektizide Aktivität in allen Fraktionen mit einem pH-Wert von 7 oder mehr. Eine SDS-PAGE-Analyse dieser Fraktionen zeigte Proteinbanden eines Molekulargewichts von ungefähr 60 kDa und etwa 80 kDa. Die 60 kDa und 80 kDa Banden wurden durch Anionenaustausch-HPLC auf einer Poros-Q-Säule (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) getrennt. Die endterminale Sequenz wurde aus zwei Fraktionen, die Proteine etwas unterschiedlichen Molekulargewichts enthielten, erhalten, beide wiesen jedoch eine Größe von etwa 60 kDa auf. Die erhaltenen Sequenzen waren zueinander und zu einigen &dgr;-Endotoxinen ähnlich.

Wenn das ECB aktive pH-Wert 4,5 Pellet weiter durch Anionenaustausch auf einer Poros-Q-Säule getrennt wurde, wurde Aktivität lediglich in Fraktionen festgestellt, die eine Hauptbande von ungefähr 60 kDa enthielten.

Gegen Ypsiloneule aktives Protein verblieb auch in dem Pellet, wenn AB88-Dialysat auf einen pH-Wert von 4,5 herunter gebracht wurde. Bei einer präparativen IEF unter Verwendung von Ampholyten eines pH-Werts 3 bis 10, wurde keine Aktivität in den ECB aktiven IEF-Fraktionen festgestellt. Statt dessen war sie am höchsten in einer Fraktion eines pH-Werts von 4,5 bis 5,0. Seine Hauptkomponenten wiesen Molekulargewichte von etwa 35 und etwa 80 kDa auf.

Das pH-Wert 4,5 Pellet wurde durch Anionenaustausch-HPLC getrennt, wobei Fraktionen, die lediglich das 35 kDa-Material enthielten und Fraktionen, die sowohl die 35 kDa- als auch die 80 kDa-Bande enthielten, erhalten wurden.

Beispiel 5. Charakterisierung des AB88-VIPs

Fraktionen, die verschiedene lepidoptäreaktive vegetative Proteine enthielten, wurden gemäß Beschreibung in Beispiel 4 erzeugt. Fraktionen mit insektizider Aktivität wurden in 8 bis 16% SDS-Polyacrylamidgelen getrennt und auf PVDF-Membranen überführt (LeGendre et al. (1989) in: A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Hrsg. P. T. Matsudaria (Academic Press Inc., New York)). Eine biologische Analyse der Fraktionen zeigte, dass unterschiedliche VIPs für die unterschiedliche Lepidoptärespeziesaktivität verantwortlich waren.

Die Aktivität gegenüber Ypsiloneule ist auf ein 80 kDa- und/oder ein 35 kDa-Protein, das entweder alleine oder in Kombination abgegeben wird, zurückzuführen. Diese Proteine sind nicht mit irgendwelchen &dgr;-Endotoxinen aus BT verwandt, wie durch das Fehlen einer Sequenzhomologie von bekannten BT &dgr;-Endotoxinensequenzen nachgewiesen wird. Das insektizide VIP3A(a)-Protein aus dem Stamm AB88 ist hauptsächlich (mindestens 75% der Gesamtmenge) in Überständen von AB88-Kuluren vorhanden.

Ferner finden sich diese Proteine nicht in den AB88 &dgr;-Endotoxinkristallen. N-terminale Sequenzen der Haupt-&dgr;-Endotoxinproteine wurden mit den N-terminalen Sequenzen des 80 kDa- und 35 kDa-VIPs verglichen, wobei sich keine Sequenzhomologie zeigte. Die N-terminale Sequenz des Insektiziden VIP3A(a)-Proteins besitzt eine Reihe von positiv geladenen Resten (von Asn2 bis Asn7) gefolgt von einer hydrophoben Core-Region (von Thr8 bis Ile34). Anders als die meisten der bekannten Sekretionsproteine wird das Insektizide VIP3A(a)-Protein vom Stamm AB88 während eines Exports nicht N-terminal prozessiert.

Die Ostrinia nubilalis-Aktivität ist auf ein 60 kDa VIP zurückzuführen und die Spodoptera frugiperda-Aktivität ist auf ein VIP unbekannter Größe zurückzuführen.

Der Bacillus thuringiensis Stamm AB88 wurde beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL B-21225.

Beispiel 6. Isolierung und biologische Aktivität von B. thuringiensis AB424

Ein B. thuringiensis Stamm mit der Bezeichnung AB424 wurde aus einer moosbedeckten Kiefernzapfenprobe mittels auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert. Eine Subkultur von AB424 wurde wachsen gelassen und für einen Bioassay gemäß Beschreibung in Beispiel 1 zubereitet.

Die biologische Aktivität wurde gemäß Beschreibung in Beispiel 2 bewertet. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Der Stamm AB424 wurde beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL B-21439.

Beispiel 7. Klonieren der VIP3A(a)- und VIP3A(b)-Gene, die für Proteine codieren, die gegen Ypsiloneule aktiv sind

Gesamt-DNA aus den Isolaten AB88 und AB424 wurde isoliert (Ausubel et al (1988) in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)) und mit den Restriktionsenzymen Xba1 (Bibliothek von auf eine Größe von 4,0 bis 5,0 Kb fraktionierten Xba1-Fragmenten von B. thuringiensis AB88-DNA) bzw. EcoRI (Bibliothek von auf eine Größe von 4,5 bis 6,0 Kb franktionierte EcoRI-Fragmente von B. thuringiensis AB424-DNA) verdaut, in zuvor mit denselben Enzymen linearisierten und dephospohrilierten Bluescriptvektor legiert und in E. coli DH5&agr;-Stamm transformiert. Rekombinante Klone wurde auf Nitrocellulosefilter geplottet, die nachfolgend mit 32P markierten 33 Basen langen Oligonucleotiden entsprechend den 11 N-Terminalen Aminosäuren des 80 kDa-Proteins, das gegen Agrotis ipsilon (Ypsiloneule) aktiv ist, sondiert wurden. Eine Hybridisierung erfolgte bei 42°C in 2 × SSC/0,1% SDS (1 × SSC = 0,15 mM NaCl/0,015 M Natriumcitrat, pH-Wert 7,4) während 5 min und 2 × bei 50°C in 1 × SSC/0,1 SDS während 10 min. 4 von 400 rekombinanten Klonen waren positiv. Insektenbioassays der positiven Rekombinanten zeigten eine Toxizität gegen Larven der Ypsiloneule, die vergleichbar mit der der AB88- oder AB424-Überstande ist.

Das Plasmid pCIB7104 enthält ein 4,5 Kb XbaI-Fragment von AB88-DNA. Subklone wurden konstruiert, um die Codierregion des Insektiziden Proteins zu definieren.

E. coli pCIB7105 wurde durch Klonieren des 3,5 Kb XbaI-AccI-Fragments von pCIB7104 in Bluescripts konstruiert.

Das Plasmid pCIB7106 enthielt ein 5,0 Kb EcoRI-Fragment von AB424-DNA. Dieses Fragment wurde weiter mit HincII verdaut, um ein 2,8 kb EcoRI-HincII-Insert (pCIB7107) herzustellen, das noch für ein funktionales insektizides Protein codierte.

Die Nucleotidsequenz von pCIB7104, ein positiver rekombinanter Klon von AB88, und von pCIB7107, ein positiver rekombinanter Klon von AB424, wurden nach dem Didesoxyterminationsverfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 bis 5467 (1977), unter Verwendung des PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kits und des PRISM Sequenase® Terminator Double-Stranded DNA Sequencing Kits bestimmt und auf einem automatischen Sequenziergerät ABI 373 analysiert.

Der Klon pCIB7104 enthält das VIP3A(a)-Gen, dessen Codierregion in SEQ ID Nr. 1 offenbart ist und die codierte Proteinsequenz ist in SEQ ID Nr. 2 offenbart. Eine synthetische Version der Codierregion, die so ausgestaltet ist, dass sie in Mais hoch exprimiert wird, wird durch die SEQ ID Nr. 3 wiedergegeben. Eine Fusion zwischen synthetischen und nativen Sequenzen ist in SEQ ID Nr. 6 offenbart. Eine beliebige Zahl von synthetischen Genen kann basierend auf der in SEQ ID Nr. 2 angegebenen Aminosequenz ausgestaltet werden.

Der Klon pCIB7107 enthält das VIP3A(b)-Gen, dessen Codierregion in SEQ ID Nr. 4 offenbart ist und das codierte Protein ist in SEQ ID Nr. 5 offenbart. Sowohl pCIB7104 als auch pCIB7107 wurden bei der Agricultwal Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer NRRL B-21422 bzw. B-21423.

Das VIP3A(a)-Gen enthält einen offenen Leserahmen (ORF), der sich von Nucleotid 732 bis 3105 erstreckt. Dieser offene Leserahmen codiert für ein Peptid mit 791 Aminosäuren entsprechend einer Molekülmasse von 88.500 Da. Eine Shine-Dalgarno (SD) Sequenz befindet sich 6 Basen vor dem ersten Methionin und ihre Sequenz identifiziert eine starke SD für Bacillus.

Das VIP3A(b)-Gen ist zu 98% identisch mit VIP3A(a).

Wenn Blots von aus AB88 B. thuringiensis Zellen isolierter Gesamt-DNA mit einem 33 Basenfragment, das den N-terminalen Bereich des VIP3A insektiziden Proteins umspannt, sondiert wurden, konnten in unterschiedlichen Restriktionsverdaus einzelne Banden beobachtet werden. Dieses Ergebnis wurde durch Verwendung größerer Sonden, die die Codierregion des Gens umspannen, bestätigt. Eine Suche der Genbankdatabase zeigte keine Homologie mit bekannten Proteinen.

Beispiel 8. Expression der VIP3A insektiziden Proteine

Der Zeitverlauf für eine Expression des VIP3A(a) insektiziden Proteins wurde durch Western Blot analysiert. Proben aus Bacillus thuringiensis AB88-Kulturen wurden entlang der Wachstumskurve und Sporenbildung genommen. Das VIP3A(a) insektizide Protein kann in den Überständen von AB88-Kulturen, während der logarithmischen Phase zu einem frühen Zeitpunkt von 15 h nach Initiation der Kultur nachgewiesen werden. Es erreichte sein maximales Niveau während den frühen Phasen der stationären Phase und verblieb bei hohen Niveaus während und nach der Sporenbildung. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Überstände von AB424 Bacillus cereus Kulturen verwendet wurden. Die Niveaus des VIP3A(a) insektiziden Proteins reflektierten die Expression des VIP3A(a)-Gens gemäß Bestimmung durch Northern Blot. Die Initiation der Sporenbildung wurde durch direkte mikroskopische Beobachtungen und durch Analysieren der Gegenwart von &dgr;-Endotoxinen in Zellpellets bestimmt. Proteine von Cry-I-Typ konnten spät in der stationären Phase während und nach der Sporenbildung nachgewiesen werden.

Beispiel 9. Identifizierung neuer VIP3-ähnlicher Gene durch Hybridisierung

Zur Identifizierung von Bacillus-haltigen Genen, die in Verbindung mit VIP3A(a) aus dem Isolat AB88 stehen, wurden eine Kollektion von Bacillusisolaten durch Hybridisierung gescreent. Kulturen von 463 Bacillusstämmen wurden in Mikrotiterausnehmungen bis zur Sporenbildung wachsen gelassen. Ein 96 Pin Koloniestempel wurde verwendet, um die Kulturen auf 150 mm Platten, die L-Agar enthielten, zu übertragen. Angeinmfte Platten wurden 10 h bei 30°C gehalten, anschließend über Nach bei 4°C. Kolonien wurden auf Nylonfilter geblottet und mit einem 1,2 Kb HindIII, von VIP3A(a) abgeleiteten Fragment, sondiert. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 62°C unter Verwendung von Hybridisierungsbedingungen gemäß Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982). Die Filter wurden mit 2 × SSC/0,1% SDS bei 62°C gewaschen und einem Röntgenfilm ausgesetzt.

Von den 463 Bacillusstämmen, die gescreent wurden, enthielten 60 VIP3-artige Gene, die durch Hybridisierung nachgewiesen werden konnten. Eine weitere Charakterisierung von einigen (AB6 und AB426) zeigte, dass ihre Überstände ein BCW-insektizides Protein ähnlich dem VIP3-Protein, das gegen Ypsiloneule aktiv ist, enthielten.

Beispiel 10. Charakterisierung eines ein kryptisches VIP3-artiges Gen enthaltenden B. thuringiensis Stamms M2194

Durch Koloniehybridisierung gemäß Beschreibung in Beispiel 8 wurde gezeigt, dass ein B. thuringiensis Stamm mit der Bezeichnung M2194 VIP3-artige Gene) enthält. Das VIP3-artige Gen von M2194 wird als kryptisch angesehen, da während der bakteriellen Wachstumsphasen keine Expression entweder durch Imunoblotanalyse oder Verwendung von polyklonalen Antikörpern, die gegen das aus AB88 isolierte VIP3A(a)-Protein erzeugt worden waren, oder durch Bioassay gemäß Beschreibung in Beispiel 2 nachgewiesen werden konnte.

Antiserum gegen gereinigtes VIP3A(a) insektizides Protein wurde in Kaninchen hergestellt. Nitrocellulosegebundenes Protein (50 &mgr;g) wurde in DMSO gelöst und mit vollständigem Freund'schen Adjuvanz (Difco) emulgiert. 2 Kaninchen wurden subkutan Injektionen jeden Monat über 3 Monate hinweg verabreicht. 10 Tage nach der zweiten und dritten Injektion wurden sie bluten gelassen und das Serum wurde aus der Blutprobe gewonnen (Harlow et al. (1988) in: Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab. Press, Pleinview, NY)).

Das VIP3-artige Gen von M2194 wurde nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Protokoll in pKS kloniert, wodurch pCIB7108 geschaffen wurde. pCIB7108, das das VIP3-Gen von M2194 umfasst, enthaltendes E. coli war gegen Ypsiloneule aktiv, was zeigt, dass das Gen für ein funktionelles Protein mit insektizider Aktivität codiert. Das Plasmid pCIB7108 wurde bei der Agricultwal Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL B-21438.

Beispiel 11. Insektizide Aktivität von VIP3A-Proteinen

Das Aktivitätsspektrum der insektiziden VIP3A-Proteine wurde quantitativ in Insektenbioassays bestimmt, in denen rekombinantes E. coli, das die VIP*A-Gene trug, an Larven verfüttert wurde. In diesen Tests waren Zellen, die die VIP3A(a)- und VIP3A(b)-Gene tragen insektizid gegen Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens und Helicoverpacea. Unter denselben experimentellen Bedingungen zeigten bakterielle Extrakte, die die VIP3A-Proteine enthielten, keinerlei Aktivität gegen Ostrinia nubilalis.

Wirkung der insektiziden VIP*A-Proteine auf Agrotis ipsilon-Larven
Wirkung der insektiziden VIP3A-Proteine auf Lepidoptäre Insektenlarven
BCW
= Ypsiloneule;
FAW
= Herstheerwurm,
BAW
= Rübenheerwurm,
TBW
= Baumwolleule,
CEW
= Corn Earworm,
ECB
= Europäischer Maiszünsler

Beispiel 12. Isolierung und biologische Aktivität anderer Bacillusspezies

Weitere Bacillusspezies wurden isoliert, die Proteine mit insektizider Aktivität während eines vegetativen Wachstums produzieren. Diese Stämme wurden aus Umweltproben durch Standardmethoden isoliert. Isolate wurden für einen Bioassay hergestellt, und gemäß Beschreibung in Beispiel 1 bzw. 2 getestet. Isolate, die Insektizide Proteine während eines vegetativen Wachstums mit Aktivität gegen Agrotis ipsilon in dem Bioassay lieferten, sind nachfolgend in der Tabelle aufgeführt. Keine Korrelation wurde zwischen der Gegenwart eines &dgr;-Endotoxinkristalls und einer vegetativen insektiziden Proteinproduktion beobachtet.

Die Isolate AB289, AB294 und AB359 wurden beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern NRRL B-21227, NRRL B-21229 bzw. NRRL B-21226.

Bacillusisolate, die während eines vegetativen Wachstums Insektizide Proteine mit einer Aktivität gegen Diabrotic virgifera virgifera produzieren, sind nachfolgend in der Tabelle aufgeführt.

Die Isolate AB59 und AB256 wurden bei der Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern NRRL B-21228 bzw. NRRL B-21230.

Die folgenden Hinterlegungen wurden beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, durchgeführt:

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. DNA-Molekül mit Codierung für ein pestizides Protein, isolierbar während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp. oder Varianten und Fragmente des Proteins, die die pestizide Aktivität beibehalten, wobei das Protein aus flüssigem Kulurmedium isolierbar ist und wobei das Protein durch eine Nucleotidsequenz codiert wird, die an eine Nucleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1, 3 oder 4 bei 65°C in einem Puffer hybridisiert, der 7% SDS und 0,5 M Natriumphosphat umfasst, oder wobei das Protein mit Antikörpern, die gegen die Proteine mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 oder 5 erzeugt wurden, kreuzreagiert.
  2. DNA-Molekül nach Anspruch 1 mit Codierung für ein Protein gemäß Definition durch SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr.6 und SEQ ID Nr. 7.
  3. DNA-Molekül nach Anspruch 2 mit der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 angegebenen Nucleotidsequenz.
  4. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die vollständig oder teilweise für eine Expression in einer Pflanze durch Nutzen von bevorzugten Pflanzencodons optimiert wurde.
  5. DNA-Molekül nach Anspruch 4 mit der in SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 6 angegebenen Nucleotidsequenz.
  6. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die vollständig oder teilweise für eine Expression in einem Mikroorganismus durch Verwenden von bevorzugten Wirtcodons optimiert wurde.
  7. DNA-Molekül nach Anspruch 1, erhältlich nach einem Verfahren, das die folgenden Stufen umfasst:

    (a) Gewinnen eines DNA-Moleküls, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein pestizides Protein umfasst; und

    (b) Hybridisieren des DNA-Moleküls mit einer Oligonucleotidsonde, die aus einem DNA-Molekül, das in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 definiert ist, erhältlich ist, und

    (c) Isolieren der hybridisierten DNA.
  8. Expressionskassette, die ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in operativer Verknüpfung mit Pflanzenexpressionssequenzen einschließlich der für eine Expression der assoziierten DNA-Kostrukte in einem Wirtorganismus notwendigen Transkriptions- und Translationsregulatorsignale und optional weiterer Regulatorsequenzen umfasst.
  9. Expressionskassette nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtorganismus eine Pflanze ist.
  10. Vektormolekül, das eine Expressionskassette nach Anspruch 8 umfasst.
  11. Pestizides Protein, codiert durch ein DNA-Molekül nach Anspruch 1.
  12. Pestizides Protein nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Molekulargewicht von etwa 60 bis etwa 100 kDa aufweist.
  13. Pestizides Protein nach Anspruch 12 mit der in SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 5 angegebenen Aminosäuresequenz.
  14. Pestizides Protein nach Anspruch 11, isolierbar während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus thuringiensis AB88, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-21225, oder von Bacillus thuringiensis AB424, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-21439.
  15. Wirtorganismus, der ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, eine Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder ein Vektormolekül, das die Expressionskassette umfasst, vorzugsweise stabil eingebaut in das Genom des Wirtorganismus, umfasst.
  16. Wirtorganismus nach Anspruch 15, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Pflanzen- und Insektenzellen, Bakterien, Hefe, Baculoviren, Protozoen, Nematoden und Algen besteht.
  17. Wirtorganismus nach Anspruch 15, der ein Mikroorganismus ist, der mit einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 8 oder 9 oder einem Vektormolekül nach Anspruch 10 transformiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus vorzugsweise ein Mikroorganismus ist, der sich auf Pflanzen multipliziert.
  18. Wirtorganismus nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein Wurzeln kolonisierendes Bakterium oder ein Pseudomonas-Stamm ist.
  19. Wirtorganismus nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrooganismus Bacillus thuringiensis AB88, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-21225, oder Bacillus thuringiensis AB424, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-21439, ist.
  20. Transgene Pflanze, einschließlich Teilen sowie Nachkommen und Samen hiervon, stabil transformiert mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einer Expressionskassette nach Anspruch 9.
  21. Pflanze nach Anspruch 20, die ein pestizides Protein nach Anspruch 11 exprimiert.
  22. Pflanze nach Anspruch 21, die ferner einen zweiten unterschiedlichen Insektenbekämpfungsgrundbaustein, wie Bt &dgr;-Endotoxin, exprimiert.
  23. Pflanze nach einem der Ansprüche 20 bis 22, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Sorghum, Weizen, Sonnenblumen, Baumwolle, Reis, Sojabohne, Gerste und Ölsamenraps besteht.
  24. Pflanze nach Anspruch 23, die eine Maispflanze ist.
  25. Pflanze nach Anspruch 23, die eine Baumwollpflanze ist.
  26. Pflanze nach einem der Ansprüche 20 bis 25, die eine Hybridpflanze ist.
  27. Samen einer Pflanze nach einem der Ansprüche 20 bis 25, behandelt mit einem Samenschutzüberzug.
  28. Verfahren zur Isolierung eines DNA-Moleküls nach Anspruch 1, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

    (a) Gewinnen eines DNA-Moleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein pestizides Protein codiert,

    (b) Hybridisieren des DNA-Moleküls mit einer Oligonucleotidsonde, die aus einem durch SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 definierten DNA-Molekül erhältlich ist, und

    (c) Isolieren der hybridisierten DNA.
  29. Verfahren zur Erhöhung eines Insektentargetbereichs, dadurch gekennnzeichnet, dass eine Expressionskassette nach Anspruch 8 in einer Pflanze zusammen mit mindestens einem zweiten Insektiziden Protein, das von dem durch die Expressionskassette codierten pestiziden Protein verschieden ist, exprimiert wird.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite insektizide Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bt &dgr;-Endotoxinen, Proteaseinhibitoren, Lectinen, &agr;-Amylasen und Peroxidasen besteht.
  31. Verfahren zum Schützen von Pflanzen vor einem Schaden, der durch einen Insektenschädling verursacht wird, durch Anpflanzen einer Pflanze, die für ein DNA-Molekül mit Codierung für ein pestizides Protein transgen ist, das unter moderat stringenten Bedingungen an eine Oligonucleotidsonde hybridisiert, die aus einem durch SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 definierten DNA-Molekül nach Anspruch 1 erhältlich ist, und Exprimieren des pestiziden Proteins.
  32. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein pestizides Protein exprimiert, das ein Transformieren der Pflanze oder Pflanzenzelle mit einer Expressionskassette nach Anspruch 9 oder einem Vektormolekül nach Anspruch 10 umfasst.
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