PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69727268T2 16.12.2004
EP-Veröffentlichungsnummer 0000822260
Titel SUBSTANZ FA-70D, HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNGEN
Anmelder Taiho Pharmaceutical Co. Ltd., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder KITANO, Shizuo, Itano-gun, Tokushima 771-02, JP;
SASAKI, Toru, Tokushima-shi, Tokushima 771-01, JP;
YOSHIDA, Kenichiro, Tokushima-shi, Tokushima 770, JP;
OTANI, Toshio, Itano-gun, Tokushima 771-12, JP;
YU, Lei, Chongwen District, Beijing, CN;
WU, Yun, Chongwen District, Beijing, CN;
KATSUNUMA, Nobuhiko, Tokushima-shi, Tokushima 770, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69727268
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 20.02.1997
EP-Aktenzeichen 979045903
WO-Anmeldetag 20.02.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/JP97/00472
WO-Veröffentlichungsnummer 9731122
WO-Veröffentlichungsdatum 28.08.1997
EP-Offenlegungsdatum 04.02.1998
EP date of grant 21.01.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.12.2004
IPC-Hauptklasse C12P 21/02
IPC-Nebenklasse C07K 5/068   A61K 38/05   C07K 5/06   

Beschreibung[de]
TECHNISCHES SACHGEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Substanz, FA-70D, die proteaseinhibierende Aktivität aufweist und als Arznei nutzbar ist, oder ein Salz davon.

FACHLICHER HINTERGRUND

Als Gruppe von intrazellulär produzierten Enzymen bewirken die Proteasen aus der Reihe der Cathepsine (Cathepsin B, Cathepsin L, Cathepsin H usw.) sowohl intrazellulär als auch extrazellulär eine Vielfalt physiologischer Funktionen. So wird beispielsweise angenommen, daß diese Enzyme intrazellulär an der Verarbeitung von Proteinen, an der Zersetzung unerwünschter Proteine und an der Apoptose beteiligt sind, während sie extrazellulär mit der Zersetzung extrazellulärer Matrizes, wie der Degradation des Kollagens der Knochenmatrix und mit der Verdauung infizierender Bakterien in Verbindung gebracht werden.

Insbesondere Cathepsin L ist für seine sehr starke kollagendegradierende Aktivität bekannt, und es wurde auch bei Versuchstieren gezeigt, daß Cathepsin L-Inhibitoren eine ausgeprägte inhibierende Wirkung auf die Zersetzung von Knochenkollagen aufwiesen. Jede Substanz, die spezifisch Cathepsin L inhibiert, wird als vielversprechender Wirkstoff für die Behandlung der Osteoporose angesehen (FEBS Letters, 269 (1), 189–193, 1990). Darüberhinaus wird ein solcher spezifischer Inhibitor von Cathepsin L als ein vielversprechendes Medikament zur Behandlung der Hypercalcämie betrachtet.

Cathepsin B ist ein Enzym, das als in hohem Maß mit Entzündungen, Krebsmetastasen, Myodystrophie und dergleichen ursächlich zusammenhängend gilt. In den letzten Jahren ist eine zunehmende Zahl von Berichten erschienen, die auf den Zusammenhang zwischen der Bösartigkeit von Krebs, wie Metastasierung und Invasion und der Cathepsin B-Aktivität hinweisen (Cancer Research, 52, 3610–3614, 1992).

Zur Behandlung von Krankheiten, die mit den Proteasen der Cathepsinreihe zusammenhängen, werden heute spezifische Inhibitoren benötigt, doch wurde bisher noch kein befriedigender Wirkstoff entdeckt. Insbesondere ist kein spezifischer Inhibitor des Cathepsins verfügbar, das mit der Knochenresorption bei der Osteporose zusammenhängt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung einer Substanz mit ausgezeichneter Inhibitionswirkung auf Cathepsin durch Verwendung von Mikroorganismen.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine große Zahl von Mikroorganismen aus dem Erdboden isoliert und die von ihnen erzeugten Stoffwechselprodukte auf solche Substanzen abgesucht, die Proteasen der Cathepsinreihe inhibieren könnten. Als Ergebnis haben die Erfinder in Kulturen eines zu den Actinomyceten gehörenden und als FA-70 bezeichneten Stammes von Mikroorganismen eine Substanz mit Inhibitionswirkung auf die Proteasen der Cathepsinreihe entdeckt, diese Substanz isoliert und ihre physikalischchemischen Eigenschaften und ihre Struktur bestimmt. Die vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage dieser Befunde entwickelt.

An Verbindungen, die von Mikroorganismen erzeugt werden, und die strukturell den Verbindungen der vorliegenden Erfindung ähneln, wurden beschrieben: Mer-N5075A (ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 100588/1994; The Journal of Antibiotics, 46, 1622–1624, 1993), &agr;-MAPI und &bgr;-MAPI (Agricultural and Biological Chemistry, 43, 243–250, 1979; Tetrahedron Letters, (7), 625–628, 1979), GE20372 Faktor A und B (The Journal of Antibiotics, 48, 332–334, 1995) und Chymostatinole (JP-A-8003188). Pseudopeptide mit antiviraler Aktivität, die hinsichtlich der Struktur der Verbindung der vorliegenden Erfindung entsprechen, werden in EP-0611776 offenbart.

Jedoch ist die Substanz FA-70D der vorliegenden Erfindung eine neue Verbindung, die hinsichtlich ihrer Struktur einem durch Peptidbindung verbundenen Citrullinmolekül entspricht. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist als Cathepsin L-Inhibitor oder als Arznei, etwa als Therapiemedikament für Osteoporose nützlich.

Daher zielt die vorliegende Erfindung auf die Substanz FA-70D von folgender Formel (1), oder auf ein Salz davon.

Unter einem anderen Gesichtspunkt zielt die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung der Substanz FA-70D oder eines Salzes davon, das die Kultivierung eines Mikroorganismenstammes der Gattung Streptomyces umfaßt, der in der Lage ist, die Substanz FA-70D in einem Kulturmedium zu erzeugen, so daß der Stamm die Substanz erzeugt und in der Kulturflüssigkeit anreichert, und die Gewinnung der Substanz aus jener Flüssigkeit.

Unter weiteren Gesichtspunkten zielt die vorliegende Erfindung auf eine Arznei, ein Therapiemedikament gegen Osteoporose oder einen Cathepsin L-Inhibitor, die bzw. das die erwähnte Substanz FA-70D oder auf ein Salz davon umfaßt.

Die vorliegende Erfindung zielt weiterhin auf ein Arzneimittel, das die erwähnte Substanz FA-70D oder ein Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür umfaßt.

Die vorliegende Erfindung zielt weiterhin auf ein Verfahren zur Behandlung der Osteoporose, das die Verabreichung einer wirksamen Menge der Substanz FA-70D oder eines Salzes davon an einen Patienten umfaßt.

Die vorliegende Erfindung zielt unter noch einem weiteren Gesichtspunkt auf die Verwendung der Substanz FA-70D oder eines Salzes davon als Arznei.

Die vorliegende Erfindung zielt weiterhin auf Mikroorganismen, die in der Lage sind, die Substanz FA-70D zu erzeugen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt ein Infrarot-Absorptionsspektrum der Substanz der Erfindung, wie es in Beispiel 1 erhalten wurde.

2 zeigt ein 1H-NMR-Spektrum der Substanz der Erfindung, wie es in Beispiel 1 erhalten wurde.

BESTE AUSFÜHRUNGSWEISE DER ERFINDUNG

Das Salz der Verbindung der Formel (1) gemäß der vorliegenden Erfindung unterliegt keiner besonderen Einschränkung, ist jedoch vorzugsweise ein Basensalz, das durch Reaktion mit einer pharmazeutisch verträglichen basischen Komponente erhalten werden kann. Das vorstehend erwähnte Basensalz schließt Salze mit Alkalimetallcarbonaten, wie Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat usw., Salze mit Alkalimetall-Hydrogencarbonaten, wie Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat usw., Salze mit Alkalimetall-Hydroxiden, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid usw., Salze mit Alkalimetallen, wie Natrium, Kalium usw., Salze mit Erdalkalimetallen, wie Magnesium, Calcium usw., Salze mit Ammoniak, Salze mit Aminen, wie Methylamin, Dimethylamin, Triethylamin, Cyclohexylamin, Piperidin usw. und Salze mit basischen Aminosäuren, wie Arginin und Lysin ein.

Die Substanz FA-70D der vorstehenden Formel (1) schließt optische Isomere ein, daher fallen die Isomere und Gemische davon ebenfalls in den Schutzbereich der Erfindung.

Die Substanz FA-70D der Formel (1) oder ein Salz davon können anhydrisch sein oder in geeigneter Weise hydriert worden sein. Sie kann auch kristallin, pulverförmig oder amorph sein.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz FA-70D sind folgende:

  • (1) Erscheinungsform: weiße Pulver
  • (2) Empirische Formel: C30H42N6O7 (M) [hochauflösende FAB-(Beschuß mit schnellen Atomen)-Massenspektrometrie: gefunden 599,3181; berechnet für C30H43N6O7 (M + H) 599,3193]
  • (3) Molekulargewicht: 598,701 (FAB- (Beschuß mit schnellen Atomen)-Massenspektrometrie))
  • (4) Infrarot-Absorptionsspektrum: KBr-Scheibenverfahren vmax (cm–1): 3375, 2965, 2935 1675–1640, 1555, 1455, 1400, 1205, 1140, 840, 805, 725, 700. (1)
  • (5) Nuklearmagnetisches Resonanzspektrum: Das 400-MHz–1H-NMR-Spektrum in Dimethylsulfoxid-d6 (DMSO-d6) bei 30°C ist in 2 dargestellt. Die chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Phe
Phenylalanin
Cit
Citrullin
Val
Valin
APP
2-Amino-3-phenylpropanol
  • (6) Löslichkeit: Gut löslich in Methanol und Dimethylsulfoxid und schwach löslich in Ethanol. Praktisch unlöslich in Chloroform, Aceton, Ethylacetat, Ether und Hexan.
  • (7) Farbreaktionen:

    Ehrlich-Reaktion: positiv

    Sakaguchi-Reaktion und Ninhydrin-Reaktion: negativ
  • (8) Schmelzpunkt: 157–158°C
  • (9) Spezifische Rotation: [&agr;]D20 = –8,71° (c = 3,56 mg/ml, Methanol)
  • (10) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie: Ein Peak bei einer Retentionszeit (tR) von 5,8 Minuten unter folgenden Bedingungen:

    Säule: Inertsil ODS-2,5 &mgr;m (4,6 mm I.D. × 150 mm, GL Science)

    Mobile Phase: Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser (35 : 0,05 : 65, V/V/V)

    Flußrate: 1 ml/min.

    Detektion: 210 nm (0,04 a. u. f. s.)

Die Substanz FA-70D der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem ein Mikroorganismenstamm, der in der Lage ist, die Substanz der Erfindung zu produzieren (der im folgenden als Substanz FA-70D-produzierender Stamm bezeichnet wird) unter geeigneten Bedingungen, typischerweise unter den folgenden Bedingungen kultiviert wird. Der Substanz FA-70D-produzierende Stamm beinhaltet zur Gattung Streptomyces gehörende Mikroorganismenstämme.

Die vorliegende Erfindung umfaßt die genannte Substanz FA-70D und Salze davon, die erhalten werden kann, indem ein Mikroorganismenstamm der Gattung Streptomyces kultiviert und die Kulturflüssigkeit gewonnen wird.

Als Beispiel eines solchen Mikroorganismenstammes der Gattung Streptomyces kann Streptomyces sp. Stamm FA-70 genannt werden. Dieser Stamm ist ein Streptomyces-Stamm, den die Erfinder der vorliegenden Erfindung aus dem Boden in Chéngdé, hébei, Volksrepublik China isoliert haben, und der am 31. Juli 1995 unter der Bezeichnung: Mikroorganismus Stamm FA-70 (wie zur Bestimmung vom Hinterleger bezeichnet) und der Eingangsnummer FERM BP-5183 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-chome 1–3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) hinterlegt wurde.

Die mikrobiologischen Merkmale des Stammes FA-70D, die nach dem im International Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313–340, 1960 beschriebenen Verfahren untersucht wurden, sind folgende:

(a) Morphologie

Dieser Stamm wurde gemäß dem International Streptomyces Project (ISP) 13 Tage lang bei 27°C auf Medium Nr. 4 (ISP 4) kultiviert. Die Ergebnisse der Beobachtung sind folgende:

Verzweigung der sporulierenden Hyphen: einfache Verzweigung

Form der Sporulation: Spiralen; die Sporen sind von zylindrischer Form

Zahl der Sporen: 10 bis 50 oder mehr Sporen

Sporenoberfläche: glatt

Sporengröße: 0,5–0,6 × 0,8–0,9 &mgr;m

Vorhandensein von Flagellaten: nicht vorhanden

Vorhandensein von Sporangien: nicht vorhanden

Anheftungsstelle der Sporophoren: Luftmycel

Besitz der Fähigkeit zur Sclerotium-Bildung: kein Besitz

(b) Merkmale der Kultur auf verschiedenen Medien

Die Merkmale der Kultur des Stammes FA-70D auf verschiedenen Medien sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Taxonomiefarben wurden gemäß The Japan Color Research Institute (Hrsg.), Standard Color Chart A, 1981, angegeben. Fallweise wurden in Klammern zusätzlich detailliertere Farben nach den Farbcodes gemäß dem von der Container Corporation of America veröffentlichten Color Harmony Manual(4. Auflage, 1985) angegeben.

(c) Physiologische Merkmale
  • Temperaturbereich des Wachstums: gutes Wachstum bei 20–37°C
  • Verflüssigung von Gelatine (Glucose-Pepton-Gelatine-Medium, 27°C): positiv
  • Verflüssigung von Gelatine (einfaches Gelatinemedium, 20°C): negativ
  • Gerinnung von Milch (37°C): negativ
  • Peptonisierung von Milch (37°C): positiv
  • Produktion von melanoiden Pigmenten: negativ auf Tyrosin-Agar (ISP7) und Trypton-Hefeextrakt-Medium (ISP-1); positiv auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP-6).
  • Produktion von Hydrogensulfid (mit 0,5% Hefeextrakt angereicherter Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP-6)): positiv
  • Hydrolyse von Stärke (Stärke-anorganisches Salz-Agar (ISP-4)): positiv
  • Reduktion von Nitraten (Bouillon mit 1% Kaliumnitrat, ISP-8): negativ
  • Zersetzung von Cellulose: negativ
(d) Verwertung von Kohlenstoffquellen (Pridham & Gottlieb-Agar, ISP-9)

Dieser Stamm wächst gut bei Verwertung von D-Glucose, D-Xylose, Inositol, löslicher Stärke, Dextrin, Glycerin und Maltose. L-Arabinose, Saccharose, D-Fructose, D-Mannitol, L-Rhamnose, Raffinose, D-Galactose und Salicin werden nicht verwertet.

(e) Chemotaxonomie

Die ganze Zelle wurde mittels Dünnschichtchromatographie nach dem in: The Society for Actinomycetes Japan (Hrsg.), [Experimental Method for Identifying Actinomycetes], 62–70, 1985 beschriebenen Verfahren auf Säurehydrolysate untersucht. Das Ergebnis war die Feststellung der LL-Form von Diaminopimelinsäure.

Aufgrund der vorstehenden bakteriologischen Merkmale, insbesondere der Bildung eines anhängender Luftmycels, einer großen Zahl von Sporenketten vom vegetativen Mycel, da die konstituierende Aminosäure der Zellwand LL-Diaminopimelinsäure ist, und da weder Geißeln noch Sporangien gebildet werden, gehört der Stamm eindeutig zur Gattung Streptomyces. Daher wurde der Stamm Streptomyces sp. Stamm FA-70 benannt.

Die Substanz FA-70D der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem ein zur Gattung Streptomyces gehörender, Substanz FA-70D-produzierender Stamm in einem Kulturmedium kultiviert wird, und dieser veranlaßt wird, die Substanz FA-70D zu produzieren und in der Kulturflüssigkeit anzureichern, und indem die Substanz aus dieser Flüssigkeit gewonnen wird. Im Detail beinhaltet das Verfahren das Kultivieren eines Substanz FA-70D-produzierenden Stammes der Gattung Streptomyces, wie etwa des erwähnten FA-70-Stammes oder einer Mutante davon in einem geeigneten Medium, das Abtrennen eines Rohextraktes, der die Substanz der Erfindung enthält, von der Kulturflüssigkeit und das Isolieren und Reinigen der Substanz FA-70D aus dem Rohextrakt.

Die Kultivierung des erwähnten Mikroorganismenstammes wird nach dem üblichen Kultivierungsverfahren ausgeführt, im allgmeinen aber ist die aerobe Kultivierung in einem flüssigen Medium nach dem Schüttelverfahren oder das aerobe Spinnerverfahren vorzuziehen.

Als Kulturmedium kann jedes Medium verwendet werden, das Nährstoffquellen enthält, die der Substanz FA-70D-produzierende Stamm verwerten kann, sowie eine Vielfalt synthetischer Medien und natürlicher Medien. Die Kohlenstoffquelle, die verwendet werden kann, beinhaltet Glucose, Saccharose, Fructose, Glycerin, Dextrin, Stärke, Melassen, Maisquellwasser und organische Säuren, ist jedoch nicht auf diese beschränkt, und diese Quellen können allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Die Stickstoffquelle, die verwendet werden kann, beinhaltet organische stickstoffhaltige Substanzen, wie Pharma media, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Casein, Aminosäuren, Harnstoff usw., und anorganische stickstoffhaltige Substanzen, wie Natriumnitrat, Ammoniumsulfat usw. Auch diese Substanzen können allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Wo nötig, kann das Medium mit Natriumsalzen, Kaliumsalzen, Magnesiumsalzen, Phosphaten und Schwermetallsalzen in geeigneten Mengen angereichert werden. Kommt es im Zug der Kultivierung zu übermäßiger Schaumbildung, können dem Medium Schaumverhüter, wie Pflanzenöle, z. B. Sojabohnenöl, Leinsamenöl usw., höhere Alkohole, z. B. Octadekanol, Tetradekanol, Heptadekanol usw. und verschiedene Siliconverbindungen beigegeben werden.

Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise im Neutralbereich gehalten. Die Kultivierungstemperatur sollte innerhalb des Bereichs gehalten werden, der für das Wachstum des FA-70D-produzierenden Stammes geeignet ist, d. h. im allgemeinen 20–37°C und vorzugsweise um die 25–30°C. Die Kultivierungszeit beträgt vorzugsweise 2–6 Tage, und zwar sowohl für die flüssige Schüttelkultur als auch für die aerobe Rührkultur.

Die verschiedenen vorstehend erwähnten Inkubationsbedingungen können je nach Art und Merkmalen der verwendeten Mikroorganismen, äußeren Bedingungen und ähnlichem in geeigneter Weise modifiziert werden, und die optimalen Bedingungen können in Abhängigkeit davon aus den vorstehend genannten Bereichen ausgewählt und innerhalb dieser eingestellt werden.

Das Abtrennen eines Substanz FA-70D-haltigen Rohextraktes aus der Kulturflüssigkeit kann mit der üblichen Prozedur zum Gewinnen von Fermentierungsprodukten erreicht werden. Beispielsweise können Lösungsmittelextraktion, Verteilungschromatographie, Adsorptionschromatographie usw. allein oder in geeigneter Reihenfolge und Kombination verwendet werden. So wird, da die im Zug der Kultivierung hergestellte Substanz FA-70D größtenteils ins Medium sekretiert wird, die Kulturflüssigkeit filtriert oder zentrifugiert, um die Substanz FA-70D-haltige flüssige Fraktion von der festen zellulären Fraktion abzutrennen. Die Substanz FA-70D in der so erhaltenen flüssigen Fraktion wird dann an Diaion HP-20-Harz (Mitsubishi Kasei Corporation) adsorbiert. Nachdem das Harz mit gereinigtem Wasser gespült wurde, wird die Substanz FA-70D mittels Methanol aus dem Harz eluiert, und das Lösungsmittel wird dann unter verringertem Druck abdestilliert, wodurch man ein Substanz FA-70D-haltiges Rohkonzentrat erhält. Zu diesem Rohkonzentrat wird n-Butanol hinzugefügt, um die Substanz FA-70D in das organische Lösungsmittel zu überführen, und das Lösungsmittel wird dann unter verringertem Druck entfernt. Der Überstand wird mit Ethylacetat gewaschen und das Lösungsmittel wird dann unter verringertem Druck wegdestilliert, wodurch man den Substanz FA-70D-haltigen Rohextrakt erhält.

Die Substanz FA-70D kann mit dem Routineverfahren zur Isolation und Reinigung von niedermolekularen Peptiden, z. B. Adsorptionschromatographie auf aktiver Holzkohle, Diaion HP-20, ionischen Adsorptionsharzen usw. und Reversphasenchromatographie unter Verwendung von ODS-gebundenem Silicagel oder ähnlichem aus dem vorstehend erwähnten Rohextrakt isoliert und gereinigt werden. Von diesen Verfahren ist die Diaion HP-20-Chromatographie unter Verwendung eines Gemisches von Methanol und Wasser (pH 2.0) als Elutionsmittel und Reversphasenchromatographie unter Verwendung eines Gemiches von Acetonitril und Trifluoressigsäure als Elutionsmittel besonders nützlich. Darüberhinaus kann, wenn eine weitere Reinigung erforderlich ist, die vorstehende chromatographische Prozedur wiederholt oder in Kombination mit Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Pharmacia) und Alkohol als Elutionsmittel ausgeführt werden. Mit der vorstehenden Prozedur kann ein hoher Reinheitsgrad der Substanz FA-70D erreicht werden.

Zur Bestimmung der Substanz FA-70D während des Reinigungsvorganges wird vorteilhafterweise der Test der Enzymaktivität von Papain oder Cathepsin L, welches von der Substanz gehemmt wird, in Kombination mit dem Nachweis durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ausgeführt.

Die spezifische Prozedur zum Test einer solchen Enzymaktivität wird in den Beispielen und in den Testbeispielen beschrieben.

Die Substanz FA-70D oder ein Salz der Erfindung inhibiert Cathepsin L und unterstreicht somit ihre Wirksamkeit als Therapiemedikament gegen Osteoporose und Hypercalcämie.

Um die vorstehend genannte gereinigte Substanz FA-70D in Gestalt einer Arzneimittelzusammensetzung zu nützen, kann sie je nach der beabsichtigten Anwendung in eine geeignete Dosierungsform verarbeitet werden. Die Dosierungsform schließt orale Dosierungsformen, wie Tabletten, glasierte Tabletten, Pillen, Pulver, Granulate, Feingranulate, Kapseln, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen usw. und parenterale Dosierungsformen, wie Injektionen, Suppositorien, Salben, Pflaster, Aerosole usw. ein. Diese Dosierungsformen können mit den üblichen, auf dem Fachgebiet allgemein bekannten pharmazeutischen Routineverfahren hergestellt werden.

Der Träger für Tabletten beinhaltet unter anderen verschiedene Exzipienten, wie Lactose, Saccharose, Natriumchlorid, Glucose, Harnstoff, Stärke, Calciumcarbonat, Kaolin, kristalline Cellulose, Kieselsäure usw., Bindemittel, wie einfacher Sirup, Glucoselösung, Stärkelösung, Gelatinelösung, Carboxymethylcellulose, Schellack, Methylcellulose, Kaliumphosphat, Polyvinylpyrrolidon usw., Trennmittel, wie getrocknete Stärke, Natriumalginat, Agarpulver, Laminarinpulver, Natriumhydrogencarbonat, Calciumcarbonat, Polyoxyethylensorbit-Fettsäure-Ester, Natriumlaurylsulfat, Stearyl-Monoglycerid, Stärke, Lactose, usw., auftrennungshemmende Mittel, wie Saccharose, Stearinsäure, Kakaobutter, gehärtetes Öl usw., Absorptionsförderer, wie quarternäre Ammoniumbasen, wie Natriumlaurylsulfat usw., Feuchtigkeitsspender, wie Glycerin, Stärke usw., Adsorbentien, wie Lactose Kaolin, Bentonit, kolloides Siliciumdioxid usw. und Schmiermittel, wie gereinigtes Talkum, Stearinsäuresalze, Borsäurepulver, Polyethylenglykol usw. Wo nötig, können solche Tabletten mittels eines gewöhnlichen Beschichtungsfilms zu glasierten Tabletten, zum Beispiel Dragees, gelatinebeschichteten Tabletten, magensaftresistente Tabletten, filmbeschichteten Tabletten usw. weiterverarbeitet werden, und sie können doppelt oder mehrfach beschichtete Tabletten usw. sein.

Zur Herstellung von Pillen könne verschiedene Exzipienten, wie Glucose, Lactose, Stärke, Kakaobutter, gehärtetes Pflanzenöl, Kaolin, Talkum, usw., Bindemittel, wie Gummiarabicum-Pulver, Tragacanth-Pulver, Gelatine usw. und Trennmittel, wie Laminarin, Agar usw. als Träger verwendet werden.

Kapseln können in der üblichen Weise hergestellt werden, d. h. indem man die Verbindung der Erfindung mit dem vorstehend erwähnten Träger vermischt und das Gemisch in Hartgelatine-Kapselschalen oder Weichkapselschalen füllt.

Was die flüssigen Zubereitungen für orale Verabreichung betrifft, so können Lösungen, Sirupe und Tränke hergestellt werden, indem man einen Geschmacksverbesserer, einen Puffer, einen Stabilisator usw. mit dem Routineverfahren zum Wirkstoff der Erfindung hinzufügt. Als Geschmacksverbesserer können unter anderem Saccharose, Orangenschalen, Zitronensäure, Weinsäure usw. verwendet werden. Als Puffer kann Natriumcitrat verwendet werden, er ist jedoch nicht auf dieses beschränkt, und der Stabilisator kann unter anderen Substanzen Tragacanth, Gummiarabicum und Gelatine sein.

Zur Verwendung als Injektionen werden die Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen vorzugsweise sterilisiert und isotonisch zum Blut gemacht. Als Verdünnungsmittel zur Herstellung solcher Injektionen können unter anderen Wasser, Ethylalkohol, Macrogole, Propylenglykol, ethoxylierter Isostearylalkohol, polyoxylierter Isostearylalkohol und Polyoxyethylensorbit-Fettsäure-Ester verwendet werden. Bei dieser Prozedur kann der pharmazeutischen Zusammensetzung eine ausreichende Menge Natriumchlorid, Glucose oder Glycerin zugesetzt werden, um sie isotonisch zu machen. Es ist auch möglich, dem Träger ein Mittel zur Kontrolle des pH-Wertes, einen Puffer, einen Stabilisator, ein Mittel zur örtlichen Betäubung usw. als Additiv hinzuzufügen, und so Injektionen für intravenöse, intramuskuläre, subcutane, intradermale oder intraperitoneale Verabreichung herzustellen. Das Mittel zur Kontrolle des pH-Wertes oder der Puffer kann unter anderem Natriumcitrat, Natriumacetat, und Natriumphosphat sein, ist jedoch nicht auf diese Substanzen beschränkt. Der Stabilisator kann unter anderen Substanzen Natriumpyrosulfit, Ethylendiamintetraessigsäure, Thioglykolsäure und Thiomilchsäure sein. Als Mittel zur örtlichen Betäubung können unter anderen Procainhydrochlorid und Lidocainhydrochlorid verwendet werden, es ist jedoch nicht auf diese beschränkt.

Suppositorien können durch Hinzufügen einer Suppositoriengrundlage, wahlweise eines Tensids, zum Wirkstoff der Erfindung in der per se bekannten Weise hergestellt werden. Als Grundlage können unter anderen ölige Basen, wie Macrogole, Lanolin, Kakaobutter, Fettsäuretriglyceride, Witepsol® (Dynamit Nobel) usw. verwendet werden.

Zur Herstellung von Salben werden die üblichen Träger, wie Salbengrundlagen, ein Stabilisator, ein feuchtigkeitsspendendes Mittel und ein Konservierungsmittel wie erforderlich zur Verbindung der Erfindung hinzugefügt, und das Gemisch und die Zubereitung werden in routinemäßiger Weise verarbeitet. Als Salbengrundlagen können flüssiges Paraffin, weißes Petrolatum, gebleichtes Bienenwachs, Octyldodecylalkohol und Paraffin verwendet werden, sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Das Konservierungsmittel kann Methyl-p-hydroxybenzoat, Ethyl-p-hydroxybenzoat und Propyl-p-hydroxybenzoat sein, um nur einige zu nennen.

Die Pflaster können durch Beschichten eines üblichen Trägers mit der erwähnten Salbe, Paste, Creme oder dem Gel in der routinemäßigen Weise hergestellt werden. Als Träger können vorteilhafterweise gewebte oder nichtgewebte Stoffe aus Baumwolle, gesponnenem Rayongarn oder chemischen Fasern, Filme aus flexiblem Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polyurethan usw. und geschäumte Folien aus solchen Materialien verwendet werden; er ist jedoch nicht nur auf diese beschränkt.

Wo nötig, können den vorstehend beschriebenen Dosierungsformen andere Additive beigegeben werden, wie Farbstoffe, Konservierungsstoffe, Duftstoffe, Geschmacksstoffe, Süßstoffe usw. und andere medizinisch wirksame Inhaltsstoffe.

Der Anteil des Wirkstoffs der Erfindung an der Arzneimittelzusammensetzung der Erfindung ist nicht so kritisch und kann aus einem weiten Bereich frei gewählt werden, doch beträgt er im allgemeinen vorzugsweise 1–70 Gewichts-%.

Es gibt keine bestimmte Einschränkung hinsichtlich der Verabreichungsweise der Erfindung der Arzneimittelzusammensetzung. Somit kann je nach der einzelnen Dosierungsform, dem Alter und Geschlecht und anderen Faktoren des Patienten und der Schwere der Erkrankung ein geeigneter Modus gewählt werden. Beispielsweise werden Tabletten, Pillen, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulate und Kapseln oral verabreicht. Injektionen werden entweder allein oder unter Beimischung mit einer gewöhnlichen Infusion, wie einer Glucoselösung oder einer Aminosäureinfusion auf dem intravenösen Weg verarbeicht. Wenn nötig, können Injektionen allein intramuskulär, intradermal, subcutan oder intraperitoneal verabreicht werden. Suppositorien werden in den After verabreicht. Salben werden auf die Haut oder auf die Schleimhäute in der Mundhöhle verabreicht.

Die Menge des Wirkstoffes der Erfindung, die pro Dosierungseinheit der vorstehenden Formen zubereitet wird, läßt sich nicht allgemeingültig festlegen, denn sie hängt vom klinischen Zustand des Patienten und der Dosierungsform ab. Im allgemeinen jedoch beträgt die Menge pro Dosierungseinheit vorzugsweise etwa 1–1000 mg für orale Zubereitungen, etwa 0,1–500 mg für Injektionen und etwa 5–1000 mg für Suppositorien.

Die tägliche Dosis des Wirkstoffes der Erfindung in jeder der vorstehenden Dosierungsformen kann nach dem Zustand, Körpergewicht, Alter, Geschlecht, und anderen Bedingungen des Patienten wohlüberlegt gewählt werden. Gewöhnlich jedoch kann als tägliche Dosis für einen erwachsenen Patienten etwa 0,1–1000 mg/kg und vorzugsweise etwa 1–100 mg/kg angesetzt werden. Diese Dosierung kann einmal täglich oder verteilt auf 2–4 Dosen verabreicht werden.

BEISPIELE

Die folgenden Arbeitsbeispiele und Testbeispiele sind lediglich dazu gedacht, die Erfindung in weiteren Details zu beschreiben, und sollten keineswegs als Definition des Schutzbereichs der Erfindung ausgelegt werden.

Beispiel 1: Herstellung der Substanz FA-70D der Erfindung (a) Kultivierungsvorgang

Ein Erlenmeyerkolben (500 ml) wurde mit 100 ml eines Mediums (pH 7.2) aus 0,5% Glucose, 2,4% löslicher Stärke, 0,3% Rindfleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Pepton, 0,4% Maisquellwasser, 0,002% Kobaltchlorid und 0,4% Calciumcarbonat beschickt und nach der Sterilisierung mit einer Schleife voll Streptomyces sp. Stamm FA-70 (Eingangsnummer FERM BP-5183) inokuliert. Der Kolben wurde dann 3 Tage lang bei 27°C auf einem Rotationsschüttler inkubiert (220 U/min, 7 cm Ausschlag).

Dann wurde ein Medium (pH 7.0), bestehend aus 2,0% Glycerin 2,0% Dextrin, 0,3% Hefeextrakt, 1,0% Soytone, 0,2% Ammoniumsulfat und 0,2% Calciumcarbonat auf konische Kolben von 500 ml Fassungsvermögen verteilt, 100 ml pro Kolben, und nach der Sterilisierung (121°C, 15 min) wurde diese Ansatzkultur in einer Größenordnung von 2% (V/V) zu jedem Kolben hinzugefügt. Die inokulierten Kolben wurden auf einem Rotationsschüttler 3 Tage lang bei 27°C inkubiert (220 U/min, 7 cm Ausschlag).

(b) Abtrennungsvorgang

Die durch die vorstehende Prozedur erhaltene Kulturflüssigkeit (8.5 L, pH 6.1) wurde gewonnen, zentrifugiert (3000 U/min, 15 min) und filtriert. Das so erhaltene Kulturfiltrat wurde mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf pH 8.0 eingestellt, und es wurde Diaion HP-20-Harz (Mitsubishi Kasei Corporation) hinzugefügt (850 ml). Nach einstündigem Schütteln wurde das Harz durch Filtration abgetrennt, und dann wurde das Harz mit Methanol (4250 ml) behandelt, während es mit 1N Hydrochlorsäure unter Rühren auf pH 2.0 eingestellt wurde, um die Substanz FA-70D zu eluieren. Die vorstehende Prozedur wurde noch zweimal wiederholt und der Methanolextrakt wurde mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf pH 6.0 eingestellt und zentrifugiert. Der Überstand wurde unter verringertem Druck konzentriert, um eine methanolfreie Substanz FA-70D-haltige wässrige Lösung zu erhalten. Diese wässrige Lösung wurde mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf pH 8.0 eingestellt und 3 mal mit dem gleichen Volumen (V/V) n-Butanol extrahiert. Der vereinigte n-Butanolextrakt wurde unter verringertem Druck konzentriert, und der feste Überstand wurde 3 mal mit Ethylacetat (50 ml) gespült und getrocknet, wodurch man einen Substanz FA-70D-haltigen Rohextrakt (7,2 g) erhielt.

(c) Isolierung und Reinigungsvorgang

Der vorstehend beschriebene Rohextrakt (4,2 g) wurde in Methanol (84 ml) aufgelöst, und die Lösung wurde zentrifugiert (3000 U/min, 15 min), wodurch die methanollösliche Fraktion von der unlöslichen Fraktion getrennt wurde. Die unlösliche Fraktion wurde weiter mit Methanol (33 ml) verdünnt und zentrifugiert, um die methanollösliche Fraktion von der unlöslichen Fraktion abzutrennen. Die methanollöslichen Fraktionen wurden vereinigt, mit Wasser (2213 ml) verdünnt und mit 1N Salzsäure auf pH 3.0 eingestellt. Das so erhaltene Präzipitat wurde entfernt. Die methanolhaltige wässrige Lösung wurde mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf pH 7.0 eingestellt und auf eine CM-Sephadex-Säule (Pharmacia, CM-Sephadex C-25, H+-Form, 3,6 cm I.D. × 30 cm) aufgebracht. Die Substanz FA-70D-haltige nichtabsorbierte Fraktion (Säulendurchflußfraktion) wurde mit 1N Natriumhydroxid/Wasser auf pH 7.0 eingestellt und auf eine DEAE-Sephadex-Säule (Pharmacia, DEAE-Sephadex A-25, OH-Form, 3,6 cm I.D. × 30 cm) aufgebracht. Die Säule wurde mit Wasser gespült, und die Elution wurde mit 0,1 M Natriumchlorid ausgeführt. Das so erhaltene Eluat wurde erneut auf eine Diaion HP-20-Säule (2 cm I.D. × 15 cm Länge) aufgebracht. Nachdem die Säule mit Wasser gespült wurde, wurde die Elution mit 60% Methanol/Wasser (mit verdünnter Salzsäure auf pH 2.0 eingestellt) ausgeführt. Das so erhaltene Eluat wurde unter verringertem Druck konzentriert und ergab ein trockenes, Substanz FA-70D-haltiges Pulver (240 mg).

Die Feststellung aktiver, Substanz FA-70D-haltiger Fraktionen in jeder Stufe geschah mit Hilfe des Tests auf Papain-inhibierende Aktivität (Biochemical Journal, 201, 189–198, 1982).

Dazu wurden 0,5 ml 400 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6.8) mit 8 mM Dithiothreitol und 4 mM Tetranatrium-Ethylendiamintetraacetat, 0,8 ml einer Enzymlösung mit 5 &mgr;M Papain und 0,1% Brij 35 (Polyoxyethylen (23) Laurylether) (Wako Pure Chemical Ind.) und 0,2 ml einer wässrigen Lösung, die eine Probe enthielt, 10 Minuten lang bei 40°C präinkubiert. Dann wurden 0,5 ml einer 0,1%igen wässrigen Dimethylsulfoxid-Lösung mit 20 &mgr;M Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid hinzugefügt, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 40°C inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Hinzufügen von 2,0 ml 100 nM Natriumacetatpuffer (pH 4.3) mit 100 mM Natriummonochloracetat gestoppt, und die Intensität der Fluoreszenz (F) bei einer Exzitationswellenlänge von 350 nm und einer Emissionswellenlänge von 458 nm wurde gemessen. Als Kontrolle wurden der Probe 0,2 ml Wasser anstelle der 0,2 ml der erwähnten wässrigen Lösung hinzugefügt und die Intensität der Fluoreszenz (F0) bei 458 nm in ähnlicher Weise gemessen. Die enzyminhibierende Aktivität wurde mittels folgender Formel berechnet:

Enzyminhibierende Aktivität (%) = F/F0 × 100

Das so erhaltene Trockenpulver wurde in Methanol aufgelöst, und die Lösung wurde auf eine Gelfiltrationssäule (Pharmacia, Sephadex LH-20, 2 cm I.D. × 127 cm) aufgebracht. Die Elution wurde mit Methanol ausgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde entfernt und ein trockenes Pulver gewonnen (37 mg). Dieses trockene Pulver wurde in Methanol aufgelöst und der Reversphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterworfen, und zwar auf einer Inertsil ODS-2-Säule (GL-Science, 5 &mgr;m, 10 mm I.D. × 250 mm) und mit Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser (V/V/V, 35 : 0,05 : 65) als mobiler Phase bei einer Durchflußrate von 4,0 ml/min. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und das organische Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck wegdestilliert. Die restliche wässrige Lösung wurde lyophilisiert und ergab so Substanz FA-70D als weißes Pulver (11 mg).

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der so erhaltenen Substanz FA-70D waren folgende:

  • (1) Erscheinungsform: weiße Pulver
  • (2) Empirische Formel: C30H42N6O7 (M) [hochauflösende FAB- (Beschuß mit schnellen Atomen)-Massenspektrometrie: gefunden 599,3181; berechnet für C30H43N6O7 (M + H) 599,3193]
  • (3) Molekulargewicht: 598,701 (FAB- (Beschuß mit schnellen Atomen)-Massenspektrometrie)
  • (4) Infrarot-Absorptionsspektrum: KBr-Scheibenverfahren: vmax (cm–1): 3375, 2965, 2935 1675–1640, 1555, 1455, 1400, 1205, 1140, 840, 805, 725, 700. (1)
  • (5) Nuklearmagnetisches Resonanzspektrum: Das 400-MHz-1H-NMR-Spektrum in Dimethylsulfoxid-d6 (DMSO-d6) bei 30°C ist in 2 dargestellt. Die chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
Phe
Phenylalanin
Cit
Citrullin
Val
Valin
APP
2-Amino-3-phenylpropanol
  • (6) Löslichkeit: Gut löslich in Methanol und Dimethylsulfoxid und schwach löslich in Ethanol. Praktisch unlöslich in Chloroform, Aceton, Ethylacetat, Ether und Hexan.
  • (7) Farbreaktionen:

    Ehrlich-Reaktion: positiv

    Sakaguchi-Reaktion und Ninhydrin-Reaktion: negativ
  • (8) Schmelzpunkt: 157–158°C
  • (9) Optische Rotation: [&agr;]D20 = –8,71°

    (c = 3,56 mg/ml, Methanol)
  • (10) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie: Ein Peak bei einer Retentionszeit (tR) von 5,8 Minuten unter folgenden Bedingungen:

    Säule: Inertsil ODS-2,5 &mgr;m (4,6 mm I.D. × 150 mm, GL Science)

    Mobile Phase: Acetonitril/Trifluoressigsäure/Wasser (35 : 0,05 : 65, V/V/V)

    Flußrate: 1 ml/min

    Detektion: 210 nm (0,04 a. u. f. s.)

Testbeispiel 1 Bestimmung der enzyminhibierenden Aktivität der Substanz FA-70D

Die inhibierende Aktivität gegenüber Cathepsin L oder Cathepsin B wurde mit dem Verfahren von A. J. Barrett et al. [Biochemical Journal, 201, 189–198, 1982] geprüft. Die Chymotrypsin- oder Trypsin-inhibierende Aktivität wurde in Übereinstimmung mit den in Tsuru, D. und Funatsu, M. (Hrsg.), Seikagaku-Jikkenho-Tanpakushitsu Bunkai Koso II [Methods of Biochemistry, Proteolytic Enzymes II], Bd.31, 7–14, 1993 beschriebenen Verfahren geprüft.

Das Verfahren zum Testen der inhibitorischen Aktivität gegenüber Cathepsin B ist folgendes: Es wurden 0,5 ml 400 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6.0) mit 8 mM Dithiothreitol und 4 mM Tetranatrium-Ethylendiamintetraacetat, 0,8 ml einer Enzymlösung mit 5 &mgr;M Cathepsin B und 0,1% Brij 35 (Wako Pure Chemical Ind.) und 0,2 ml einer wässrigen Lösung der Verbindung der Erfindung 10 Minuten lang bei 40°C präinkubiert. Dann wurden 0,5 ml einer 0,1%igen wässrigen Dimethylsulfoxid-Lösung mit 20 &mgr;M Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginin-4-methylcoumaryl-7-amid hinzugefügt, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 40°C inkubiert. Dann wurde die Enzymreaktion durch Hinzufügen von 2,0 ml 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 4.3) mit 100 mM Natriummonochloracetat gestoppt. Die Intensität der Fluoreszenz (F) wurde bei einer Exzitationswellenlänge von 350 nm und einer Emissionswellenlänge von 458 nm bestimmt. Als Kontrolle wurden der Probe 0,2 ml Wasser anstelle der 0,2 ml der erwähnten wässrigen Lösung der Verbindung hinzugefügt und die Intensität der Fluoreszenz (F0) bei 458 nm in ähnlicher Weise gemessen. Die enzyminhibierende Aktivität wurde mittels folgender Formel berechnet:

Enzyminhibierende Aktivität (%) = F/F0 × 100

Die inhibierende Aktivität gegenüber Cathepsin L wurde folgendermaßen gemessen: Mit Ausnahme der Tatsache, daß Cathepsin L anstelle von Cathepsin B in der gleichen Konzentration verwendet wurde, und daß die 400 mM Natriumphosphatpuffer auf pH 5.5 eingestellt wurden, wurde die vorstehend beschriebene Testprozedur zur Bestimmung der enzyminhibierenden Aktivität wiederholt.

Die inhibierende Aktivität gegenüber Chymotrypsin wurde folgendermaßen gemessen: Es wurden 0,1 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5), 0,15 ml Wasser, 0,01 ml 5 ng/ml Chymotrypsin/Wasser und 0,04 ml einer wässrigen Lösung der Verbindung der Erfindung 5 Minuten lang bei 37°C präinkubiert. Dann wurden 0,1 ml einer wässrigen Lösung von 100 &mgr;M Succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosin-4-methylcoumaryl-7-amid hinzugefügt, und das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Hinzufügen von 0,5 ml 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 4.3) mit 100 mM Natriummonochloracetat gestoppt, und die Intensität der Fluoreszenz (F) wurde bei einer Exzitationswellenlänge von 350 nm und einer Emissionswellenlänge von 458 nm gemessen. Als Kontrolle wurden der Probe 0,04 ml Wasser anstelle von 0,04 ml der erwähnten wässrigen Lösung der Verbindung der Erfindung hinzugefügt und die Intensität der Fluoreszenz (F0) bei 458 nm in ähnlicher Weise gemessen. Die enzyminhibierende Aktivität wurde mittels folgender Formel berechnet:

Enzyminhibierende Aktivität (%) = F/F0 × 100

Die inhibierende Aktivität gegenüber Trypsin wurde folgendermaßen gemessen: Mit Ausnahme der Tatsache, daß Trypsin in der gleichen Konzentration an Stelle von Chymotrypsin und Benzoyl-L-leucyl-L-lysyl-argingin-4-methylcoumaryl-7-amid in der gleichen Konzentration an Stelle von Succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosin-4-methylcoumaryl-7-amid verwendet wurde, wurde die vorstehend beschriebene Prozedur zur Bestimmung der inhibierenden Aktivität gegenüber Chymotrypsin wiederholt, und die enzyminhibierende Aktivität wurde in der gleichen Weise wie vorstehend berechnet.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4

Aus dem Testbeispiel geht klar hervor, daß die Substanz FA-70D der Erfindung Cathepsin L stärker inhibiert als Cathepsin B und Chymotrypsin stärker inhibiert als Trypsin. Formulierungsbeispiel 1: Kapseln Substanz FA-70D 10 mg Lactose 50 mg Maisstärke 47 mg Kristalline Cellulose 50 mg Talkum 2 mg Magnesiumstearat 1 mg pro Kapsel 160 mg

Nach dem vorstehenden Rezept wurden Kapseln durch das routinemäßige Verfahren hergestellt. Formulierungsbeispiel 2: Injektion Substanz FA-70D 5 mg Destilliertes Wasser zur Injektion q.s. pro Ampulle 5 ml

Nach dem vorstehenden Rezept wurde eine Injektion das routinemäßige Verfahren hergestellt. Formulierungsbeispiel 3: Suppositorien Substanz FA-70D 20 mg Witepsol W-35 (Warenzeichen von Dynamit Nobel) 1380 mg pro Suppositorium 1400 mg

Nach dem vorstehenden Rezept wurden Suppositorien das routinemäßige Verfahren hergestellt.

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Die Substanz FA-70D der Erfindung inhibiert Proteasen der Cathepsinserie stark und ist als therapeutisches Arzneimittel für verschiedene Krankheiten im Zusammenhang mit diesen Enzymen wertvoll, besonders für die Osteoporose.


Anspruch[de]
  1. Verbindung der Formel I
    oder ein Salz, Isomer oder Isomerengemisch davon.
  2. Basisches Salz der Verbindung gemäß Anspruch 1.
  3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder eines Salzes, Isomers oder Isomerengemisches davon, umfassend (i) das Kultivieren eines zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismusstammes, welcher zur Herstellung einer Verbindung der Formel I in einem Kulturmedium fähig ist, und (ii) das Abtrennen der Verbindung aus dem Fermentationsmedium.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Mikroorganismusstamm ein Streptomyces sp. FA-70 Stamm oder eine Mutante davon ist.
  5. Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder ein Salz, Isomer oder Isomerengemisch davon, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Exzipienten.
  6. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, welche ein Inhibitor für Kathepsinproteaseaktivität ist.
  7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 oder 6, welche ein Kathepsin L-Inhibitor ist.
  8. Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Verwendung in der Therapie.
  9. Verbindung gemäß Anspruch 8 zur Verwendung in der Therapie als Kathepsin L-Proteaseinhibitor.
  10. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als Kathepsinproteaseinhibitor.
  11. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder eines Salzes, Isomers oder Isomerengemisches davon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Bekämpfung von durch Kathepsinproteaseaktivität verursachten Leiden.
  12. Verwendung gemäß Anspruch 11 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Bekämpfung von Osteoporose oder Hyperkalzämie.
  13. Mikroorganismus, der zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 fähig ist, wobei es sich um den Streptomyces sp. FA-70 Stamm handelt.
  14. Mikroorganismus gemäß Anspruch 13, entsprechend der am 31. Juli 1995 am National Institute of Bioscience and Human Technology gemachten Hinterlegung mit der Eingangsnummer FERM BP-5183.
Es folgen 2 Blatt Zeichnungen






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com