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Dokumentenidentifikation DE69532326T2 10.02.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000763101
Titel NUKLEINSÄURESEQUENZEN UND EXPRESSIONSSYSTEME FÜR HEPARINASE III AUS FLAVOBACTERIUM HEPARINUM
Anmelder Biomarin Pharmaceutical Inc., Novato, Calif., US
Erfinder ZIMMERMANN, Joseph, Elm Grove, US;
SU, Hongsheng, Lonquenil, CA;
BLAIN, Françoise, Montreal, CA;
BENNETT, Clark, Pierrefonds, CA;
GU, Kangfu, D.D.O., CA;
MUSIL, Roy, Carlsbad, US
Vertreter KRAMER - BARSKE - SCHMIDTCHEN, 81245 München
DE-Aktenzeichen 69532326
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 09.06.1995
EP-Aktenzeichen 959230269
WO-Anmeldetag 09.06.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/US95/07391
WO-Veröffentlichungsnummer 0095034635
WO-Veröffentlichungsdatum 21.12.1995
EP-Offenlegungsdatum 19.03.1997
EP date of grant 17.12.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.02.2005
IPC-Hauptklasse C12N 1/21
IPC-Nebenklasse C12N 9/88   C12N 15/63   C12N 15/60   C07K 16/40   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft Klonieren, Sequenzieren und Exprimieren von Heparinase III aus Flavobacterium heparinum.

Die Heparin- und Heparansulfat-Familie von Molekülen umfasst Glycosaminoglycane repetitiver Glucosamin- und Hexuronsäurereste, entweder Iduronsäure oder Glucuronsäure, in denen die Position 2, 3 oder 6 von Glucosamin oder die Position 2 der Hexuronsäure sulfatiert sein kann. Variationen beim Ausmaß und dem Ort der Sulfatierung sowie die Konformation des alternierenden Hexuronsäurerestes führen zu hochgradiger Heterogenität der Moleküle innerhalb dieser Familie. Herkömmlicherweise bezieht sich Heparin auf Moleküle, welche einen hohen Sulfatgehalt aufweisen, 2,6 Sulfate pro Disaccharid, und eine höhere Menge an Iduronsäure. Umgekehrt enthält Heparansulfat geringere Mengen an Sulfat, 0,7 bis 1,3 Sulfate pro Disaccharid, und weniger Iduronsäure. Dennoch gibt es Varianten dazwischenliegender Zusammensetzung, wobei noch nicht alle Heparine aus allen biologischen Quellen charakterisiert worden sind.

Spezifische Sulfatierungs-/Glycosylierungsmuster von Heparin wurden mit biologischer Funktion in Zusammenhang gebracht, wie die Antithrombin-Bindungsstelle, die von Choay et al., Thrombosis Res. 18:573-578 (1980), beschrieben wurde, und die Fibroblastwachstumsfaktor-Bindungsstelle, die von Turnbull et al., J. Biol. Chem. 267:10337-10341 (1992) beschrieben wurde. Aus diesen Beispielen geht deutlich hervor, dass die Wechselwirkung von Heparin mit bestimmten Molekülen aus der Konformation resultiert, die durch spezifische Sequenzen ausgelöst wird, und nicht nur auf elektrostatische Wechselwirkungen zurückzuführen ist, die durch seine Zusammensetzung mit hohem Sulfatanteil ausgelöst werden. Heparin geht eine Wechselwirkung mit einer Reihe von Säugetier-Molekülen ein, wodurch mehrere biologische Ereignisse wie Hämostase, Zellproliferation, Migration und Adhäsion moduliert werden, wie von Kjellen und Lindahl, Ann. Rev. Biochem. 60: 443-475 (1991) und Burgess und Macaig, Ann. Rev. Biochem. 58: 575-606 (1989) zusammengefasst ist. Heparin, das aus Rinderlungen und Schweine-Eingeweiden extrahiert wurde, wurde als eine gerinnungshemmende Substanz verwendet, seit seine Antithrombose-Eigenschaften von McLean, Am. J. Physio1.41: 250-257 (1916) entdeckt wurden. Heparin und chemisch modifizierte Heparine werden fortlaufend im Hinblick auf medizinische Anwendungen in den Bereichen der Wundheilung und der Behandlung von Gefäßerkrankungen untersucht.

Heparin abbauende Enzyme, die als Heparinasen oder Heparinlyasen bezeichnet werden, wurden in mehreren Mikroorganismen identifiziert, einschließlich: Flavobacterium heparinum, Bacteriodes sp. und Aspergillus nidulans, so wie von Linhardt et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 12: 135-177 (1986) zusammengefasst. Heparansulfat abbauende Enzyme, die als Heparitinasen oder Heparansulfatlyasen bezeichnet werden, wurden in Plättchen (Oldberg et al., Biochemistry 19: 5755-5762 (1980)), Tumorzellen (Nakajima et al., J. Biol. Chem. 259: 2283-2290 (1984)) und Endothelialzellen (Gaal et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 604-614 (1989)) entdeckt. Säugetier-Heparanasen katalysieren die Hydrolyse des Kohlenhydratgrundgerüsts von Heparansulfat bei der Hexuronsäure (1 → 4)-Glucosamin-Kopplung (Nakajima et al., J. Cell. Biochem. 36: 157-167 (1988)) und werden durch das stark sulfatierte Heparin gehemmt. Genaue biochemische Charakterisierungen dieser Enzyme wurden bisher jedoch durch den Mangel eines Verfahrens zum Erhalten homogener Zubereitungen der Moleküle verhindert.

Flavobacterium heparinum produziert Heparin und Heparansulfat abbauende Enzyme, die als Heparinase I (E.C. 4.2.2.7), wie durch Yang et al., J. Biol. Chem. 260 (3): 1849-1857 (1985) beschrieben, Heparinase II, wie durch Zimmermann und Cooney, U.S.-Patentschrift Nr. 5,169,772 beschrieben, und Heparinase III (E.C. 4.2.2.8), wie von Lohse und Linhardt, J. Biol. Chem. 267: 24347-24355 (1992) beschrieben, bezeichnet werden. Diese Enzyme katalysieren eine eliminierende Spaltung der (&agr;1 → 4) Kohlenhydratbindung zwischen Glucosamin- und Hexuronsäureresten im Heparin/Heparansulfat-Grundgerüst. Die drei Enzymvarianten unterscheiden sich in ihrer Wirkung auf spezifische Kohlenhydratreste. Heparinase I spaltet bei &agr;-D-GlcNp2S6S(1 →4)&agr;-L-IdoAp2S, Heparinase III bei &agr;-D-GlcNp2Ac(oder2S)6OH(1→4)&bgr;-D-GlcAp und Heparinase II bei einer von den zwei Verbindungen, wie von Desai et al., Arch. Biochem. Biophys. 306(2):461-468 (1993), beschrieben. Sekundäre Spaltstellen für jedes Enzym wurden ebenfalls von Desai et al. beschrieben.

Heparinase I wurde klinisch verwendet, um die gerinnungshemmenden Eigenschaften von Heparin zu neutralisieren, wie von Baugh und Zimmermann, Perfusion Rev. 1(2):8-13, 1993, zusammengefasst ist. Bei Heparinase I und III wurde gezeigt, dass sie Zellwachstumsfaktor-Wechselwirkungen, wie durch Bashkin et al., J. Cell Physiol. 151:126-137 (1992) gezeigt, und Zell-Lipoprotein-Wechselwirkungen modulieren, wie von Chappell et al., J. Biol. Chem. 268(19):14168-14175 (1993), gezeigt. Die Verfügbarkeit von Heparin abbauenden Enzymen mit ausreichender Reinheit und Menge könnte zur Entwicklung von diagnostisch und therapeutisch wichtigen Formulierungen führen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte, nicht-glycosylierte Heparinase III bereitgestellt, welche die Aminosäure-Sequenz einer reifen Heparinase III, die einen Methioninrest unmittelbar vor der ersten Aminosäure der reifen Heparinase III besitzt, oder nicht-glycosylierte funktionelle Derivate davon, die Heparansulfat – aber nicht Heparin – abbauen, aufweist.

Vorzugsweise enthält die Heparinase III der vorliegenden Erfindung die Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO:4, die bei Glutamin in Position 25 beginnt und einen Methioninrest unmittelbar vor dem Glutamin enthält.

Die Erfindung stellt auch einen Antikörper oder ein Fragment davon, welcher für eine Heparinase III des ersten Aspektes spezifisch ist, und die Heparinase III des ersten Aspektes zur therapeutischen oder diagnostischen Verwendung bereit.

Vor der vorliegenden Erfindung waren teilweise gereinigtes Heparinase II und III verfügbar, wobei jedoch ihre Aminosäure-Sequenzen unbekannt waren. Klonieren dieser Enzyme war aufgrund der Toxizität für die Wirtszellen schwierig. Die gegenwärtigen Erfinder waren in der Lage, die Gene für Heparinase II und III zu klonieren und stellen hierin ihre Nukleotid- und Aminosäuresequenzen bereit.

Es wird ein Verfahren für die Isolierung von hoch gereinigten, Heparin- und Heparansulfat abbauenden Enzymen aus F. heparinum beschrieben. Die Charakterisierung der Proteine zeigte, dass Heparinase I, II und III Glycoproteine sind. Alle drei Proteine sind an ihrem N-terminalen Aminosäurerest modifiziert. Antikörper, die durch Injizieren von gereinigten Heparinasen in Kaninchen erzeugt wurden, ergaben Anti-Seren, welche einen hohen Grad an Kreuzreaktivität gegenüber Proteinen aus F. heparinum aufwiesen. Polyklonale Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie in Fraktionen, welche den Aminosäureanteil der Proteine binden, und eine Fraktion getrennt, welche die post-translationale Modifikation bindet, welche die Verwendung dieser Antikörper ermöglicht, um die nativen und die rekombinanten Formen jedes Heparinaseproteins deutlich zu unterscheiden.

Informationen über die Aminosäure-Sequenz wurden verwendet, um Oligonukleotide zu synthetisieren, die anschließend in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet wurden, um einen Teil der Heparinase-II- und Heparinase-III-Gene zu amplifizieren. Amplifizierte Regionen wurden beim Versuch verwendet, Klone aus einer &lgr;DASH-II-Gen-Bibliothek zu identifizieren, welche F. heparinum genomische DNA enthielt. Es wurde eine natürliche Auswahl gegen Klone beobachtet, welche die gesamten Heparinase-II- und Heparinase-III-Gene enthielten. Diese wurde umgangen, indem Abschnitte des Heparinase-II-Gens getrennt kloniert und Wirtsstämme auf stabilen Erhalt vollständiger Heparinase-III-Klone überprüft wurden. Die Expression von Heparinase II und III wurde durch die Verwendung eines Vektors erzielt, der eine modifizierte Ribosomen-Bindungsstelle enthält, von der nachgewiesen wurde, dass sie die Expression von Heparinase I auf bedeutende Pegel erhöht.

Dieses Patent beschreibt die Gen- und Aminosäure-Sequenzen für Heparinase III aus F. heparinum, die in Verbindung mit geeigneten Expressionssystemen verwendet werden können, um die Enzyme zu produzieren. Ferner wird eine modifizierte Ribosomen-Bindungssequenz beschrieben, die verwendet wird, um Heparinase I, II und III zu exprimieren.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt die Modifikationen an der tac-Promotor-Ribosomenbindungsregion, die für den Expressionspegel von Heparinase I evaluiert wurden. Die ursprüngliche Sequenz, wie in pBhep gefunden, und die modifizierten Sequenzen, wie in pGhep und p&Dgr;4hep gefunden, werden mit unterstrichenen Shine-Dalgarno-Sequenzen (S-D) und unterstrichenem Heparinase-I-Gen-Startcodon dargestellt. Die Lücke (in Nukleotiden, nt) zwischen diesen Regionen wird unterhalb jeder Sequenz angezeigt. Die Ribosomen-Bindungsregion für pGB enthält kein Startcodon und weist eine BamHI-Stelle (unterstrichen) auf anstelle der EcoRI-Stelle (GAATTC), die in pGhep gefunden wurde.

2 zeigt die Konstruktion von Plasmiden, die verwendet werden, um das Heparinase-II-Gen aus Flavobacterium heparinum zu sequenzieren. Restriktionsstellen sind: N-NotI, Nc =NcoI, S =SaII, B = BamHI, P = PstI, E=EcoRi, H = HindIII, C = ClaI und K = KpnI.

3 zeigt die Konstruktion von pGBH2, einem Plasmid, das imstande ist, die Expression von aktiver Heparinase II in E. coli aus Tandem-Tac-Promotoren (doppelte Pfeilköpfe) zu leiten. Restriktionsstellen sind: B = BamHI, P = Pst I.

4 zeigt die Nukleinsäuresequenz für das Heparinase-II-Gen aus Flavobacterium heparinum (SEQ ID NO: 1).

5 zeigt die Aminosäuresequenz für Heparinase II aus Flavobacterium heparinum (SEQ ID NO:2). Die Leader-Peptidsequenz ist unterstrichen. Das reife Protein startet bei Q-26. Die Peptide 2A, 2B bzw. 2C sind an ihren entsprechenden Positionen innerhalb des Proteins angezeigt.

6 zeigt die Konstruktion von Plasmiden, die verwendet werden, um das Heparinase-III-Gen aus Flavobacterium heparinum zu sequenzieren. Restriktionsstellen sind: S=SaII, B = BamHI, P = PstI, E = EcoRI, H = HindIII, C = ClaI und K = KpnI.

7 zeigt die Konstruktion von pGBH3, einem Plasmid, das imstande ist, die Expression von aktiver Heparinase III in E. coli aus einem Tandem-Taq-Promotor (Doppelpfeilköpfe) zu leiten. Restriktionsstellen sind. S = SaII, B = BamHI, P = PstI, E = EcoRI, H = HindIII, Bs = BspEI, C = ClaI und K = KpnI.

8 zeigt die Nukleinsäuresequenz für das Heparinase-III-Gen aus Flavobacterium heparinum (SEQ ID NO:3).

9 zeigt die Aminosäuresequenz für Heparinase III aus Flavobacterium . heparinum (SEQ ID NO: 4). Die Leader-Peptidsequenz ist unterstrichen. Das reife Protein beginnt bei Q-25. Die Peptide 3A, 3B und 3C sind an ihren entsprechenden Positionen innerhalb des Proteins angezeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Zum besseren Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche, einschließlich des Umfangs der entsprechenden Begriffe, werden folgende Definitionen bereitgestellt. Gen. Unter dem Begriff „Gen" ist eine DNA-Sequenz zu verstehen, welche durch ihre Matrizen- oder Boten-RNA eine Sequenz von Aminosäuren codiert, die für ein spezifisches Peptid charakteristisch ist. Ferner steht der Begriff für dazwischenliegende, nicht-codierende Regionen sowie für regulatorische Regionen und kann 5'- und 3'-Enden einschließen.

Gensequenz. Der Begriff „Gensequenz" bezieht sich im Allgemeinen auf ein DNA-Molekül, das eines oder mehrere Gene oder Genfragmente enthält, sowie auf ein DNA-Molekül, welches eine nicht-transkribierte oder nicht-translatierte Sequenz enthält. Ferner soll der Begriff alle Kombinationen von Genen, Genfragmenten, nichttranskribierten Sequenzen oder nicht-translatierten Sequenzen miteinschließen, welche sich auf demselben DNA-Molekül befinden.

Die vorliegenden Sequenzen können aus einer Reihe von Quellen gewonnen werden, einschließlich DNA, synthetischer DNA, RNA oder Kombinationen davon. Solche Gensequenzen können genomische DNA aufweisen, welche natürlich vorkommende Introne enthalten kann oder nicht. Außerdem kann eine solche genomische DNA in Verbindung mit Promotor-Regionen oder Poly-A-Sequenzen erhalten werden. Die Gen-Sequenzen, genomische DNA oder cDNA können auf verschiedene Weise erhalten werden. Genomische DNA kann aus geeigneten Zellen, wie zum Beispiel aus Hirnzellen, mit Hilfe auf dem Fachgebiet wohl bekannter Mittel extrahiert und gereinigt werden. Alternativ dazu kann mRNA aus einer Zelle isoliert und verwendet werden, um cDNA durch Umkehr-Transkription oder andere Mittel herzustellen.

Rekombinante DNA. Unter dem Begriff „rekombinante DNA" ist ein Molekül zu verstehen, das durch In-Vitro-Spleißen von cDNA oder einer genomischen DNA-Sequenz rekombiniert worden ist.

Klonierungshilfsmittel. Darunter versteht man eine Plasmid- oder Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die imstande ist, in einer Wirtszelle zu replizieren. Das Klonierungshilfsmittel wird durch eine oder mehrere Endonuklease-Erkennungsstellen, an denen seine DNA-Sequenzen in einer bestimmbaren Weise ohne Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA geschnitten werden können, charakterisiert, welche einen Marker enthalten können, der zur Verwendung bei der Identifikation von transformierten Zellen nützlich ist. Zu den Markern gehören zum Beispiel Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz. Der Begriff Vektor kann verwendet werden, um ein Klonierungshilfsmittel zu bezeichnen.

Expressionskontrollsequenz. Darunter versteht man eine Nukleotidsequenz, welche die Expression von strukturellen Genen kontrolliert oder reguliert, wenn sie mit diesen Genen wirkungsmäßig verbunden ist. Dazu zählen lac-System, der trp-System-Hauptoperator und Promotorregionen des Phagen Lambda, die Kontrollregion von fd-Hüllprotein und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen steuern.

Expressionshilfsmittel. Darunter versteht man ein Hilfsmittel oder einen Vektor, ähnlich einem Klonierungshilfsmittel, das jedoch in der Lage ist, ein Gen zu exprimieren, das in das Expressionshilfsmittel nach Transformation in einen Wirt geklont wurde. Das klonierte Gen wird für gewöhnlich unter die Kontrolle von (d. h. wirkungsmäßig verbunden mit) bestimmten Kontrollsequenzen, wie Promotorsequenzen, gegeben. Die Expressionskontrollsequenzen werden variieren, je nachdem, ob der Vektor ausgelegt ist, um das wirkungsmäßig verbundene Gen in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt zu exprimieren, und sie können zusätzlich transkriptionale Elemente wie Verstärkerelemente, Terminationssequenzen, Gewebespezifizitätselemente und/oder translationale Start- und Terminationsstellen enthalten.

Promotor. Der Begriff „Promotor" steht für eine DNA-Sequenz, die von einer RNA-Polymerase erkannt werden kann. Die Gegenwart einer solchen Sequenz ermöglicht es der RNA-Polymerase, zu binden und die Transkription von wirkungsmäßig verbundenen Gensequenzen zu starten.

Promotorregion. Der Begriff „Promotorregion" schließt im weiteren Sinne sowohl die Promotorsequenz als auch Gensequenzen ein, die für den Start der Transkription erforderlich sein können. Die Gegenwart einer Promotorregion ist daher ausreichend, um die Expression einer wirkungsmäßig verbundenen Gensequenz auszulösen.

Wirkunsgmäßig verbunden. So wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „wirkungsmäßig verbunden", dass der Promotor den Start der Genexpression steuert. Ein Promotor ist wirkungsmäßig mit einer Sequenz einer proximalen DNA verbunden, wenn bei Einführung in eine Wirtszelle der Promotor die Transkription der proximalen DNA-Sequenz oder -Sequenzen in eine oder mehrere RNA-Arten bestimmt. Ein Promotor ist mit einer DNA-Sequenz wirkungsmäßig verbunden, wenn der Promotor in der Lage ist, die Transkription dieser DNA-Sequenz zu starten.

Prokaryot. Der Begriff „Prokaryot" steht für alle Organismen ohne echten Zellkern, einschließlich Bakterien.

Wirt. Der Begriff „Wirt" steht nicht nur für Prokaryote, sondern auch für solche Eukaryote, wie Hefe und faserförmige Pilze, sowie für Pflanzen- und Tierzellen. Die Begriffe schließen somit Organismen oder Zellen ein, die Empfänger eines replizierbaren Expressionshilfsmittels sind.

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Klonieren und der Expression eines zuvor nicht klonierten Enzyms. Obwohl Heparinase III schon früher teilweise gereinigt wurde, war keine Aminosäure-Sequenz verfügbar. Die Erfindung offenbart insbesondere das Klonieren, Sequenzieren und die Expression von Heparinase III aus Flavobacterium heparinum und die Verwendung einer modifizierten Ribosomen-Bindungsregion für das Exprimieren dieses Gens. Zusätzlich zu den Nukleotidsequenzen wird auch die Aminosäure-Sequenz von Heparinase III bereitgestellt. Die Erfindung schafft exprimierte Heparinase III sowie Verfahren zum Exprimieren dieser Enzyme.

Das Klonieren erfolgte unter Verwendung von degenerierten und „Guessmer"-Nukleotidprimern, die aus Aminosäure-Sequenzen von Fragmenten der Heparinasen gewonnen wurden, die wie unten detailliert beschrieben gereinigt worden sind. Die Aminosäure-Sequenzen waren in der Vergangenheit nicht verfügbar. Das Klonieren erwies sich aufgrund des unerwarteten Problems der F. heparinum-DNA-Toxizität in E. coli als besonders schwierig. Die Erfinder entdeckten Techniken, um dieses Problem zu lösen, so wie unten im Detail beschrieben. Auf der Grundlage dieser Offenbarung kann ein Fachmann ohne weiteres zusätzliche Heparinasen und andere Proteine aus F. heparinum oder aus zusätzlichen Quellen unter Anwendung der hierin beschriebenen neuartigen Verfahren klonieren.

Die Expression der Heparinasen wird hierin offenbart. Um Heparinase I, II und III zu exprimieren, sind transkriptionale und translationale Signale, die für einen geeigneten Wirt erkennbar sind, erforderlich. Die klonierte Heparinase codierenden Sequenzen, die durch die oben beschriebenen Verfahren vorzugsweise in Doppelstrangform erhalten wurden, können wirkungsmäßig mit Sequenzen verbunden werden, welche die transkriptionale Expression in einem Expressionsvektor kontrollieren, und in eine Wirtszelle, entweder ein Prokyaryot oder Eukaryot, eingeführt werden, um rekombinante Heparinasen oder ein funktionelles Derivat davon zu erzeugen. In Abhängigkeit davon, welcher Strang der Heparinase codierenden Sequenz wirkungsmäßig mit den Sequenzen verbunden ist, die die transkriptionale Expression kontrollieren, ist es auch möglich, Heparinase-Gegensinn-RNA oder ein funktionelles Derivat davon zu exprimieren.

Für die Expression von Heparinase I, II und III in E. coli wurden Vektoren konstruiert, in denen die Expression durch zwei Wiederholungen der tac-Promotoren angetrieben wurde. Modifikationen der Ribosomen-Bindungsregion dieses Promotors wurden durch Einführen von Mutationen mit der Polymerasekettenreaktion hergestellt. In einer bevorzugten Modifikation des Expressionsvektors wurde die Minimal-Konsens-Shine-Dalgarno-Sequenz verbessert, indem eine einzelne Mutation (AGGAA → AGGAG) eingeführt wurde, was den weiteren Vorteil hatte, dass die Anzahl an Nukleotiden zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem ATG-Startcodon verringert wurde. Es wurden weitere Modifikationen unter Verwendung von PCR hergestellt, wobei die Lücke zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Startcodon weiter reduziert wurde. Unter Anwendung derselben Techniken können zusätzliche Modifikationen in dieser Region, einschließlich Insertionen und Deletionen, erzeugt werden, um zusätzliche Heparinase-Expressionsvektoren zu erzeugen. Infolgedessen wird ein Expressionsvektor für die Expression von Heparinasen bereitgestellt, der eine modifizierte Ribosomen-Bindungsregion aufweist, welche eine 5-Basenpaar-Shine-Dalgarno-Sequenz, eine 9-Basenpaar-Abstandsregion zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem ATG-Startcodon und eine rekombinante Nukleotidsequenzcodierung enthält. Ferner werden Modifikationen an diesem Vektor bereitgestellt, welche das Ändern der Länge und Sequenz der Shine-Dalgarno-Sequenz und das Reduzieren des Abstands zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Startcodon auf 8, 7, 6, 5, 4 oder weniger Nukleotide, aufweisen.

Die Expression der Heparinasen in unterschiedlichen Zellen kann zu unterschiedlichen post-translationalen Modifikationen führen, die die Eigenschaften der Heparinasen oder eines funktionellen Derivats davon in eukaryotischen Zellen, und insbesondere Säugetier-, Insekten- und Hefezellen, verändern können. Besonders bevorzugte eukaryotische Wirte sind Säugetierzellen, entweder in vivo, in Tieren oder in Gewebekultur. Säugtierzellen stellen post-translationale Modifikationen an rekombinanten Heparinasen bereit, zu denen Falten und/oder Glycosylierung an Stellen zählen, die ähnlich oder gleich jener Stelle für die nativen Heparinasen sind. Die meisten vorzugsweise Säugetier-Wirtszellen schließen Hirn- und Neuroblastomazellen ein.

Man sagt von einem Nukleinsäuremolekül, wie einer DNA, dass es „imstande ist, ein Polypeptid zu exprimieren", wenn es Expressionskontrollsequenzen enthält, die transkriptionale regulatorische Informationen enthalten, und wenn diese Sequenzen mit der Nukleotidsequenz, welche das Polypeptid codiert, „wirkungsmäßig verbunden" sind.

Eine wirkungsmäßige Verbindung ist eine Verbindung, bei der eine Sequenz mit einer regulatorischen Sequenz (oder Sequenzen) auf solche Weise verbunden ist, dass die Expression der Sequenz unter den Einfluss oder die Kontrolle der regulatorischen Sequenz gerät. Zwei DNA-Sequenzen (wie eine Heparinase codierende Sequenz und eine Promotorregion-Sequenz, die mit dem 5'-Ende der codierenden Sequenz verbunden sind) gelten dann als wirkungsmäßig verbunden, wenn das Herbeiführen der Promotorfunktion zu der Transkription der Heparinase codierenden Sequenz-mRNA führt und falls die Art der Verbindung zwischen den beiden DNA-Sequenzen (1) nicht zum Einführen einer Rahmenverschiebungsmutation führt, (2) die Fähigkeit der regulatorischen Expressionssequenzen, die Expression der Heparinasen zu leiten, nicht beeinträchtigt, oder (3) die Fähigkeit der Heparinase-Matrize, von der Promotorregionssequenz transkribiert zu werden, nicht beeinträchtigt. Somit wäre eine Promotorregion mit einer DNA-Sequenz wirkungsmäßig verbunden, wenn der Promotor imstande wäre, die Transkription dieser DNA-Sequenz auszuführen.

Die genaue Natur der regulatorischen Regionen, die für die Genexpression erforderlich sind, können zwischen Spezies- oder Zelltypen variieren, schließt aber im Allgemeinen, nach Bedarf, 5'-nichttranskribierende und 5'-nichttranslatierende (nichtcodierende) Sequenzen ein, die an dem Start der Transkription bzw. Translation beteiligt sind, wie die TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequenz und dergleichen. Vor allem solche 5'-nichttranskribierenden Kontrollsequenzen werden eine Region einschließen, welche einen Promotor für transkriptionale Kontrolle des wirkungsmäßig verbundenen Gens enthält.

Falls gewünscht, kann ein Fusionsprodukt der Heparinasen konstruiert werden. Zum Beispiel kann die Sequenzcodierung für Heparinasen an eine Signalsequenz gebunden werden, welche die Absonderung des Proteins von, oder die Kompartimentierung des Proteins in einem bestimmten Wirten ermöglicht. Solche Signalsequenzen können mit oder ohne spezifische Proteasestellen ausgelegt werden, so dass die Signalpeptidsequenz für ein späteres Entfernen geeignet ist. Alternativ dazu kann die native Signalsequenz für dieses Protein verwendet werden.

Regulatorische Signale des transkriptionalen Starts können ausgewählt werden, wobei diese eine Unterdrückung oder Aktivierung ermöglichen, so dass die Expression der wirkungsmäßig verbundenen Gene moduliert werden kann.

Auf der Grundlage der vorliegenden Offenbarung kann ein Fachmann ohne weiteres die Sequenzen der vorliegenden Erfindung in zusätzliche Expressionsvektoren anordnen und in eine Reihe von Bakterien transformieren, um rekombinante Heparinase III zu erhalten.

Sobald die Vektor- oder DNA-Sequenz, welche das/die Konstrukt(e) enthält, für die Expression vorbereitet ist, wird/werden das/die DNA-Konstrukte) in eine geeignete Wirtszelle durch ein beliebiges von einer Reihe von geeigneten Mitteln eingeführt, einschließlich Transfektion. Nach dem Einführen des Vektors werden Empfängerzellen in einem selektiven Medium gezüchtet, welches für das Wachstum von vektorenthaltenden Zellen auswählt. Die Expression der klonierten Gensequenzen) führt zur Erzeugung von Heparinase I, II oder III oder zur Erzeugung eines Fragmentes von einem dieser Proteine. Diese Expression kann in fortlaufender Weise in den transformierten Zellen oder in einer kontrollierten Weise stattfinden, zum Beispiel durch Expression, welche auf die Herbeiführung von Differenzierung der transformierten Zellen folgt (zum Beispiel durch Verabreichen von Bromodeoxyuracil an Neuroblastomazellen oder dergleichen).

Das exprimierte Protein wird isoliert und gemäß herkömmlichen Bedingungen, wie durch Extrahieren, Fällung, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen, gereinigt. Die detaillierten Verfahren für das Isolieren der Heparinasen werden im Detail in den Beispielen unten besprochen.

Die Erfindung stellt außerdem funktionelle Derivate der Sequenzen von Heparinase III bereit. So wie hierin verwendet, wird der Begriff „funktionelles Derivat" verwendet, um eine beliebige DNA-Sequenz zu definieren, die durch die ursprüngliche DNA-Sequenz gewonnen wird und welche noch immer die biologischen Aktivitäten des nativen Elternmoleküls besitzt. Ein funktionelles Derivat kann eine Insertion, Deletion oder eine Substitution von einer oder mehreren Basen in der ursprünglichen DNA-Sequenz sein. Die Substitutionen können so sein, dass sie eine native Aminosäure durch eine andere Aminosäure ersetzen, welche die Funktionsweise des Proteins nicht wesentlich beeinträchtigt. Fachleute werden erkennen, dass wahrscheinliche Substitutionen die Funktionsweise des Proteins auf positive Weise einschließen, wie eine kleine, neutral geladene Aminosäure, welche eine andere kleine, neutral geladene Aminosäure ersetzt. Fachleute werden erkennen, dass funktionelle Derivate der Heparinasen durch Mutagenese der DNA unter Verwendung von einem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden können, wie durch stellengerichtete Mutagenese. Außerdem kann Zufallsmutagenese durchgeführt werden, und Mutanten, welche die Funktion behalten, können durch entsprechendes Screening erhalten werden.

Die Antikörper der vorliegenden Erfindung schließen monoklonale und polyklonale Antikörper sowie Fragmente dieser Antikörper ein. Fragmente der Antikörper der vorliegenden Erfindung schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – das Fab-, Fab2- und das Fc-Fragment ein.

Die Erfindung stellt auch Hybridoma bereit, die imstande sind, die oben beschriebenen Antikörper zu erzeugen. Ein Hybridoma ist eine immortalisierte Zelllinie, die imstande ist, einen spezifischen monoklonalen Antikörper abzusondern.

Im Allgemeinen sind auf dem Fachgebiet Techniken zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern sowie Hybridoma, die imstande sind, den gewünschten Antikörper zu erzeugen, wohl bekannt (Campbell, A.M., „Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science, Amsterdam, Niederlande (1984); St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35:-21 (1980)).

Jedes Säugetier, von dem man weiß, dass es Antikörper produziert, kann mit dem Pseudogenpolypeptid immunisiert werden. Verfahren zur Immunisierung sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt. Solche Verfahren schließen subkutane oder interperitoneale Injektionen des Polypeptids ein. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Menge an Heparinase, die für die Immunisierung verwendet wird, in Abhängigkeit von dem Tier, das immunisiert wird, der Antigenizität des Peptids und der Stelle der Injektion variieren wird.

Das Protein, das als Immunogen verwendet wird, kann modifiziert oder in einem Adjuvans verabreicht werden, um die Antigenizität des Proteins zu erhöhen. Verfahren zur Erhöhung der Antigenizität eines Proteins sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt und schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Koppeln des Antigens mit einem heterologen Protein (wie Globulin oder &bgr;-Galactosidase) oder den Einschluss eines Adjuvans während der Immunisierung ein.

Für monoklonale Antikörper werden Milzzellen aus den immunisierten Tieren entfernt, mit Myelomazellen, wie SP2/0-Ag14-Myelomazellen, fusioniert, und es wird ihnen die Möglichkeit gegeben, monoklonale Antikörper produzierende Hybridomazellen zu werden.

Ein beliebiges einer Reihe von auf dem Fachgebiet wohl bekannten Verfahren kann verwendet werden, um die Hybridomazelle zu identifizieren, welche einen Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften erzeugt. Dazu zählen Screening der Hybridomas mit einem ELISA-Test, einer Western-Blot-Analyse oder einem Radioimmuno-Test (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175:109-124 (1988)).

Hybridoma, welche die gewünschten Antikörper absondern, werden kloniert, und die Klasse und die Unterklasse werden unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt (Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1984)).

Für polyklonale Antikörper wird ein Antikörper, der Antisera enthält, von dem immunisierten Tier getrennt und auf die Gegenwart von Antikörpern mit der gewünschten Spezifizität unter Verwendung eines der oben beschriebenen Verfahren untersucht.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner die oben beschriebenen Antikörper in erfassbar markierter Form bereit. Antikörper können erfassbar durch die Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkierungen (wie Biotin, Avidin usw.), enzymatischen Markierungen (wie Meerrettichperoxidase, Alkalischer Phosphatase usw.), fluoreszierenden Markierungen (wie FITC oder Rhodamin usw.), paramagnetischen Atomen, chemo-luminiszenter Markierungen und dergleichen markiert werden. Verfahren zum Durchführen dieser Markierung sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt; siehe zum Beispiel Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Byer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972); Godin, J.W., J. Immunol. Meth. 13:215 (1976).

Die vorliegende Erfindung stellt ferner die oben beschriebenen Antikörper immobilisiert auf einem festen Träger bereit. Beispiele für solche festen Träger schließen Kunststoffe wie Polycarbonat, komplexe Kohlenhydrate wie Agarose und Sepharose, Acrylharze wie Polyacrylamid und Latexperlen ein. Techniken zum Verbinden von Antikörpern mit solchen festen Trägern sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt (Weir et al., Handbook of Experimental Immunology, 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1986)). Die inmobilisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung können zur Immunoaffinitätsreinigung von Heparinasen verwendet werden.

Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie nun mit Hilfe einer Reihe spezifischer Beispiele, die nicht einschränkend sind, besser verstanden werden.

BEISPIEL 1 Reinigung von Heparinasen

Heparinlyaseenzyme wurden aus Kulturen von Flavobacterium heparinum gereinigt. F. heparinum wurde in einem 15 L computergesteuerten Fermenter unter Verwendung einer Variation des definierten Nährstoffmediums kultiviert, das von Galliher et al., Appl. Environ. Microbiol. 41(2):360-365 (1981) beschrieben wird. Diese Fermentierung, die dazu ausgelegt ist, Heparinlyasen zu erzeugen, nehmen halbgereinigtes Heparin (Celsus Laboratories) in die Medien in einer Konzentration von 1,0 g/L als Induktor der Heparinasesynthese auf. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und die gewünschten Enzyme aus dem periplasmatischen Raum durch eine Variation des osmotischen Schockverfahrens freigesetzt, das von Zimmermann und Cooney in der US-Patentschrift Nr. 5,262,325, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben ist.

Eine halbgereinigte Zubereitung der Heparinaseenzyme wurde durch eine Modifikation des Verfahrens, das von Zimmermann et al., US-Patentschrift Nr. 5,262,325 beschrieben ist, erzielt. Proteine aus dem Rohosmolat wurden auf Kationenaustauscherharz (CBX, J.T. Baker) mit einer Leitfähigkeit von 1 – 7 µmho absorbiert. Ungebundene Proteine aus dem Extrakt wurden verworfen und das Harz in eine Chromatographiesäule (5,0 cm i.d. x 100 cm) gepackt. Die gebundenen Proteine eluierten mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 3,75 cm·min–1 mit Stufengradienten von 0,01 M Phosphat, 0,01 M Phosphat/0,1 M Natriumchlorid, 0,01 M Phosphat/0,25 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M Natriumchlorid, alle mit einem pH-Wert von 7,0 +/- 0,1. Heparinase II eluiert in der 0,1 M NaCl-Fraktion, während Heparinase I und III in der 0,25 M-Fraktion eluieren.

Alternativ dazu wurde der 0,1 M Natriumchlorid-Schritt eliminiert und die drei Heparinasen mit 0,25 M Natriumchlorid co-eluiert. Die Heparinase-Fraktionen wurden direkt auf eine Säule geladen, die Cellufinsulfat (5,0 cm i.d. x 30 cm, Amicon) enthielt, und eluierten mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 2,50 cm·min–1 mit Stufengradienten von 0,01 M Phosphat, 0,01 M Phosphat/0,2 M Natriumchlorid, 0,01 M Phosphat/0,4 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M Natriumchlorid, alle mit einem pH-Wert von 7,0 +/- 0,1. Heparinase II und III eluieren in der 0,2 M Natriumchlorid-Fraktion, während Heparinase I in der 0,4 M-Fraktion eluiert.

Die 0,2 M Natriumchlorid-Fraktion von der Cellufinsulfat-Säule wurde mit 0,01 M Natriumphosphat verdünnt, um eine Leitfähigkeit von weniger als 5 µmhos zu ergeben. Die Lösung wurde weiter gereinigt, indem das Material auf eine Hydroxylapatit-Säule (2,6 cm i.d. x 20 cm) geladen und das gebundene Protein mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 1,0 cm·min1 mit Stufengradienten von 0,01 M Phosphat, 0,01 M Phosphat/0,35 M Natriumchlorid, 0,01 M Phosphat/0,45 M Natriumchlorid, 0,01 M Phosphat/0,65 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M Natriumchlorid eluiert wird, alle mit einem pH-Wert von 7,0 +/- 0,1. Heparinase III eluiert in einer einzelnen Proteinspitze in der 0,45 M Natriumchlorid-Fraktion, während Heparinase III in einer einzelnen Proteinspitze in der 0,65 M Natriumchlorid-Fraktion eluiert.

Heparinase I wurde weiter gereinigt, indem Material aus der Cellufinsulfat-Säule, verdünnt auf eine Leitfähigkeit von weniger als 5 µmhos, auf eine Hydroxylapatitsäule (2,6 cm i.d. x 20 cm) geladen und das gebundene Protein mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 1,0 cm·min–1 mit einem linearen Gradienten von Phosphat (0,01 bis 0,25 M) und Natriumchlorid (0,0 bis 0,5 M) eluiert wurde. Heparinase I eluiert in einer einzelnen Proteinspitze ungefähr auf halbem Weg durch den Gradienten.

Die durch dieses Verfahren erhaltenen Heparinase-Enzyme wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung der Technik von Laemmli, Nature 227:680-685 (1970) analysiert und die Gels durch ein Scanningdensitometer (Bio-Rad, Modell GS-670) quantifiziert. Heparinase I, II und III wiesen Molekulargewichte von 42.500 +/- 2.000, 84.000 +/- 4.200 bzw. 73.000 +/- 3.500 Dalton auf. Alle Proteine wiesen Reinheiten von mehr als 99 % auf. Reinigungsergebnisse für die Heparinaseenzyme sind in Tabelle 1 angeführt.

Die Heparinase-Aktivitäten wurden durch den spektrophotometrischen Test bestimmt, der von Yang et al. beschrieben wird. Eine Modifikation dieses Tests mit einem Reaktionspuffer, der 0,018 M Tris, 0,044 M Natriumchlorid und 1,5 g/L Heparansulfat bei einem pH-Wert von 7,5 aufwies, wurde verwendet, um die Heparansulfatabbauaktivität zu messen.

Rekombinante Heparinase I bildet intrazellulare Einschlusskörper, welche Denaturierung und Proteinrückfaltung erfordern, um aktive Heparinase zu erhalten. Zwei Lösungsmittel, Harnstoff und Guanidinhydrochlorid, wurden als löslich machende Mittel getestet. Von diesen war nur Guanidin HCl, bei 6 M, in der Lage, die Heparinase-I-Einschlusskörper aufzulösen. Der höchste Reinheitsgrad wurde jedoch durch sequentielles Waschen der Einschlusskörper in 3 M Harnstoff und 6 M Guanidin-HCl erreicht. Der Harnstoff-Waschschritt diente dazu, kontaminierende E. coli-Proteine und Zelltrümmer vor dem Aufschließen der aggregierten Heparinase I durch Guanidin-HCl zu entfernen.

Rekombinante Heparinase I wurde durch Züchten von E. coli Y1090(pGHepl), einem Strang, der ein Plasmid enthält, das das Heparinase-I-Gen enthält, das aus den Tandem-tac-Promotoren exprimiert wurde, in Luriabrühe mit 0,1 M IPTG hergestellt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation konzentriert und in 1/10 Volumenpuffer, enthaltend 0,01 M Natriumphosphat und 0,2 M Natriumchlorid, bei einem pH-Wert von 7,0 resuspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallung, 5 Minuten lang mit intermittierenden 30-Sekunden-Zyklen, Leistungseinstellung #3, zerrissen und die Einschlusskörper wurden durch Zentrifugation, 7.000 x g, 5 Minuten lang konzentriert.

Die Pellets wurden zweimal 2 Stunden lang bei einem pH-Wert von 7,0 mit kaltem 3 M Harnstoff gewaschen, und das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation gewonnen. Heparinase I wurde in 6 M Guanidin-HCl, das 50 mM DTT enthielt, entfaltet und durch Dialyse in 0,1 M Ammoniumsulfat rückgefaltet. Zusätzliche kontaminierende Proteine setzten sich in dem 0,1 M Ammoniumsulfat ab und konnten durch Zentrifugation entfernt werden. Heparinase I, das auf diese Weise gereinigt wurde, wies eine spezifische Aktivität von 42,21 IU/mg auf und war gemäß SDS-PAGE/Scanning-Densitometrieanalyse zu 90 % rein. Das Enzym kann durch Kationenaustauschchromatographie weiter gereinigt werden, wie oben beschrieben, wobei eine Heparinase-I-Zubereitung erhalten wird, die gemäß SDS-PAGE/Scanning-Densitometrieanalyse zu mehr als 99 % rein ist.

BEISPIEL 2: Charakterisierung von Heparinasen

Über das Molekulargewicht und die kinetischen Eigenschaften der drei Heparinase-Enzyme wurde im Detail von Lohse und Linhardt, J. Biol. Chem. 267:24347-24355 (1992) berichtet. Eine genaue Charakterisierung der posttranslationalen Modifikationen der Proteine wurde jedoch nicht durchgeführt. Heparinase I, II und III, die so wie hierin beschrieben gereinigt wurden, wurden im Hinblick auf die Gegenwart von Kohlenhydrat-Hälften untersucht. Lösungen, die 2 ug Heparinase I, II und III und rekombinante Heparinase I enthielten, wurden durch Zugabe von 0,2 M Natriumacetat auf einen pH-Wert von 5,7 gebracht. Diese Proteinproben wurden einer Kohlenhydratbiotinylierung gemäß Protokoll 2a unterzogen, das im G1ycoTrack-Kit (Oxford Glycosysteme) beschrieben ist. 30 µl jeder biotinylierten Proteinlösung wurden SDS-PAGE (10 % Gel) unterzogen und durch Elektroblotting bei 170 mA konstantem Strom auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Das Erfassen des biotinylierten Kohlenhydrats erfolgte durch Alkalische Phosphatase-spezifische Farbreaktion nach Anheften eines Streptavadin-Alkalische Phosphatase-Konjugats an die Biotingruppen. Diese Analysen ergaben, dass Heparinase I und II glycosyliert und Heparinase III und die rekombinante Heparinase I nicht glycosyliert sind.

Polyklonale Antikörper, die in Kaninchen erzeugt wurden, die mit Wildtyp-Heparinase-I injiziert wurden, konnten in zwei Populationen fraktioniert werden, wie unten beschrieben. Es scheint, als ob eine dieser Fraktionen eine post-translationale Hälfte erkennt, die Proteinen, die F. heparinum hergestellt werden, gemein ist, während die andere Fraktion insbesondere Aminosäure-Sequenzen erkennt, die in Heparinase I enthalten sind. Alle in F. heparinum erzeugten Heparinaseenzyme wurden durch die „nicht-spezifischen" Antikörper erkannt, nicht jedoch Heparinase, die in E. coli erzeugt wurde. Der wahrscheinlichste Kandidat für den Nicht-Protein-Antigendeterminanten aus Heparinase I ist die Kohlenhydratkomponente; somit zeigt das Western-Blot-Experiment an, dass alle Lyasen, die in F. heparinum durchgeführt wurden, glycosyliert sind.

Gereinigte Heparinase II und III wurden durch die Edman-Technik analysiert, um den N-terminalen Aminosäurerest des reifen Proteins zu bestimmen. Die Edman-Chemie war jedoch nicht in der Lage, eine Aminosäure freizusetzen, was darauf hindeutet, dass eine post-translationale Modifikation an der N-terminalen Aminosäure beider Heparinasen eingetreten war. Ein nmol Proben von Heparinase II und III wurden zum Deblockieren mit Pyroglutamataminopeptidase verwendet. Kontrollproben wurden durch Mock-Deblockieren von 1 nmol Proteinproben ohne Zugabe von Pyroglutamataminopeptidase erzeugt. Alle Proben wurden in 10 mM NH4CO3, pH-Wert 7,5 und 10 mM DTT (100 µl Endvolumen) eingebracht. Zu nicht-Kontroll-Proben wurden 1 mU Pyroglutamataminopeptidase hinzugefügt, und alle Proben wurden 8 Stunden lang bei 37 ° C inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden zusätzliche 0,5 mU Pyroglutamataminopeptidase zu den Nicht-Kontroll-Proben hinzugefügt, und alle Proben wurden zusätzliche 16 Stunden bei 37 °C inkubiert.

Deblockierungspuffer wurden gegen 35 % Ameisensäure unter Verwendung einer 10.000 Dalton Cut-Off-Centricon-Einheit ausgetauscht, und die Probe wurde unter Vakuum getrocknet. Die Proben wurden einer Aminosäure-Sequenzanalyse gemäß des Edman-Verfahrens unterzogen.

Die Eigenschaften der drei Heparinase-Proteine aus Flavobacterium heparinum sind in Tabelle 2 aufgelistet.

Heparinase II und III wurden mit Cyanbromid aufgeschlossen, um Peptidfragmente zur Isolierung zu erzeugen. Die Proteinlösungen (1 – 10 mg/ml Proteinkonzentration) wurden auf eine DTT-Konzentration von 0,1 M gebracht und zwei Stunden lang bei 40 °C inkubiert. Die Proben wurden gefroren und unter Vakuum gefriergetrocknet. Das Pellet wurde erneut in 70 % Ameisensäure suspendiert, und Stickstoffgase wurden durch die Lösung gesprudelt, um Sauerstoff auszuschließen. Eine Stammlösung CNBr wurde in 70 % Ameisensäure hergestellt, und die Stammlösung wurde mit Stickstoffgas aufgesprudelt und im Dunklen über kurze Zeiträume gelagert. Für die Zugabe von CNBr wurde ein 500 bis 1000 facher Molarüberschuss von CNBr gegenüber Methioninresten im Protein verwendet. Der CNBr-Stamm wurde den Proteinlösungen hinzugefügt, mit Stickstoffgas aufgesprudelt, und das Röhrchen wurde versiegelt. Das Reaktionsröhrchen wurde 20 Stunden lang bei 24 °C im Dunkeln inkubiert.

Die Proben wurden unter Vakuum teilweise getrocknet, Wasser wurde der Probe hinzugefügt und teilweises Gefriertrocknen wurde wiederholt. Dieses Waschverfahren wurde so lange wiederholt, bis die Probenpellets weiß waren. Die Peptidmischungen wurden in Ameisensäure aufgeschlossen und bei einer Vydac C18 Umkehrphasen-HPLC-Säule (4,6 mm i.d. x 30 cm) angewendet, und einzelne Peptidfragmente wurden mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 6,0 cm·min–1 mit einem linearen Gradienten von 10 bis 90 % Acetonitril in 1 % Trifluoressigsäure eluiert. Fragmente, die aus diesen Reaktionen gewonnen wurden, wurden einer Aminosäurensequenzbestimmung unter Verwendung eines Applied Biosystems 745 A Proteinsequenzers unterzogen. Drei von Heparinase II isolierte Peptide ergaben die Sequenzen EFPEMYNLAAGR (SEQ ID NO:5), KPADIPEVKDGR (SEQ ID NO:6) und LAGDFVTGKILAQGFGPDNQTPDYTYL (SEQ ID NO:7) und wurden als Peptide 2A, 2B bzw. 2C bezeichnet. Drei Peptide aus Heparinase III ergaben die Sequenzen LIKNEVRWQLHRVK (SEQ ID NO:8), VLKASPPGEFHAQPDNGTFELFI (SEQ ID NO:9) und KALVHWFWPHKGYGYFDYGKDIN (SEQ ID NO:10) und wurden als Peptide 3A, 3B bzw. 3C bezeichnet.

BEISPIEL 3: Antikörper gegenüber den Heparinaseproteinen

Heparinase I, II und III sowie rekombinante Heparinase I, die wie hierin beschrieben gereinigt wurden, wurden verwendet, um in Kaninchen polyklonale Antikörper zu erzeugen. Jede der Heparinase I, II und III wurde dem folgenden standardmäßigen Immunisierungsverfahren unterzogen: Die Primärinjektion bestand aus 0,5 – 1,0 mg gereinigtem Protein, aufgelöst in 1 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung, die mit 1 ml Freund'schem Adjuvans (Cedarlane Laboratories Ltd) homogenisiert wurde. Diese Protein-Adjuvans-Emulsion wurde verwendet, um weibliche New Zealand White Kaninchen zu injizieren; 1 ml pro Kaninchen, 0,5 ml pro Hinterpfote, i.m., in den Oberschenkelmuskel nahe der Hüfte. Nach zwei bis drei Wochen erhielten die Kaninchen eine Auffrischungsinjektion, die aus 0,5 bis 1,0 mg gereinigtem Protein, aufgelöst in steriler phosphatgepufferter Salzlösung, homogenisiert mit 1 ml unvollständigem Freund'schen Adjuvans (Cedarlane Laboratories, Ltd.), bestand. Nach weiteren zwei bis drei Wochen erhielten die Kaninchen eine dritte, identische Auffrischungsinjektion.

Ungefähr 10 Tage nach der letzten Auffrischungsinjektion wurde jedem Tier aus der Zentralarterie des Ohres eine Blutprobe entnommen. Ein Serum wurde hergestellt, indem der Probe ermöglicht wurde, zwei Stunden lang bei 22 °C zu gerinnen, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 °C und Klärung durch Zentrifugation bei 5.000 Umdrehungen/Minute über einen Zeitraum von zehn Minuten. Die Antisera wurden 1:100.000 in Tris-gepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,5) verdünnt und einer Western-Blot-Analyse unterzogen, um jene Sera zu identifizieren, die Anti-Heparinase I, II oder III-Antikörper enthielten.

Antikörper, die gegen Wildtyp-Heparinase I, aber nicht rekombinante Heparinase I, erzeugt wurden, wiesen einen hohen Grad an Kreuzreaktivität gegenüber anderen F. heparinum-Proteinen auf. Dies war wahrscheinlich auf die Gegenwart einer antigenen post-translationalen Modifikation, die F. heparinum-Proteinen gemein ist, aber nicht auf Proteinen zu finden ist, die in E. coli synthetisiert wurden, zurückzuführen. Um dies weiter zu untersuchen, wurde rekombinante Heparinase I auf Sepharoseperlen immobilisiert und in eine Chromatographiesäule gepackt. Gereinigte Anti-Heparinase-I-(Wildtyp)-Antikörper wurden auf die Säule geladen und die ungebundene Fraktion gesammelt. Gebundene Antikörper wurden in 0,1 M Glycin, pH-Wert 2,0 eluiert. IgG wurde sowohl in den ungebundenen als auch den gebundenen Fraktionen gefunden und in der Folge in Western-Blot-Experimenten verwendet. Der Antikörper, der aus der ungebundenen Fraktion isoliert wurde, erkannte auf nichtspezifische Weise F. heparinum-Proteine, aber erfasste keine rekombinante Heparinase I (E. coli) mehr, während der Antikörper, der aus der gebundenen Fraktion isoliert wurde, nur Heparinase I erkannte, egal ob in F. heparinum oder E. coli synthetisiert. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass, wie vermutet, zwei Populationen von Antikörpern durch das Exponieren gegenüber dem Wildtyp-Heparinase-I-Antigen gebildet werden: eine, die für das Proteingrundgerüst spezifisch ist und eine andere, die eine post-translational modifizierte Hälfte erkennt, die F. heparinum-Proteinen gemein ist.

Diese Erkenntnis stellt sowohl ein Mittel zum Reinigen spezifischer Anti-Heparinase-Antikörper als auch ein Werkzeug zum Charakterisieren des Wildtyp-Heparinase-I-Proteins bereit.

BEISPIEL 4: Konstruktion einer F. heparinum-Genbibliothek

Eine Flavobacterium heparinum chromosomale DNA-Bibliothek wurde im Lambda-Phagen DASHII konstruiert. 0,4 ug F. heparinum chromosomale DNA wurden teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3A aufgeschlossen, um eine Mehrheit an Fragmenten mit ungefähr 20 kb Größe zu erzeugen, wie in Maniatis, et al., Molecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor (1982) beschrieben. Diese DNA wurde phenol/chloroform-extrahiert, ethanol-gefällt, mit &lgr;DASHII-Armen verbunden und mit Packungsextrakten aus einem &lgr;DASHIIBamHI-Cloning-Kit (Stratagene, La Jolla, CA) gepackt. Die Bibliothek wurde nach dem Packen mit ungefähr 10–5 pfu/ml getitert, auf 10–8 pfu/ml durch das Plattenlyseverfahren amplifiziert und bei – 70 °C gelagert, wie von Silhavy, T.J., et al. in Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1992, beschrieben.

Die F. heparinum chromosomale Bibliothek wurde auf ungefähr 300 pfu/Platte getitert, über einen Rasen von E. coli gelegt, wobei ihr ermöglicht wurde, die Zellen über Nacht bei 37 °C zu transfizieren und dadurch Plaques zu bilden. Die Phageplaques wurden auf Nitrozellulosepapier übertragen und die Phagen-DNA an die Filter gebunden, wie in Maniatis et al., ibid, beschrieben.

BEISPIEL 5: Eine modifizierte Ribosomen-Bindungsregion für die Expression von Flavobacterium heparinum Glycosaminoglycanlyasen

Das Gen für das reife Heparinase-I-Protein wurde in die EcoRI-Stelle des

Vektors pB9 kloniert, wo seine Expression durch zwei Wiederholungen des tacPromotors (aus Expressionsvektor pKK223-3, Brosius und Holy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6929-6933 (1984)) getrieben wurde. In diesem Vektor pBhep wird das erste Codon, ATG, für Heparinase I durch 10 Nukleotide aus einer minimalen Shine-Dalgarno-Sequenz AGGA (Shine und Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346 (1974)), 1, getrennt. Dieses Konstrukt wurde in den E. coli Strang JM109 transformiert, bei 37 °C gezüchtet und mit 1 mM IPTG zwei Stunden lang vor dem Ernten induziert. Die Zellen wurden durch Beschallung lysiert, die Zellmembranfraktion wurde pelletiert und die Überstandsflüssigkeit aufbewahrt. Die Membranfraktion wurde in 6 M Guanidin-HCl resuspendiert, um Einschlusskörper aufzuschließen, welche das Enzym der rekombinanten Heparinase I enthielten. Die lösliche Heparinase I wurde durch Verdünnung in 20 mM Phosphatpuffer rückgefaltet. Die Enzymaktivität wurde in der rückgefalteten Pelletfraktion und in der Überstandsflüssigkeitsfraktion bestimmt. Geringe Aktivitätspegel wurden in der Überstandsflüssigkeits- und der Pelletfraktion entdeckt. Eine Analyse der Fraktionen durch SDS-PAGE ergab, dass beide Fraktionen geringe Banden enthalten können, die der rekombinanten Heparinase I entsprechen.

Beim Versuch, die Expressionspegel von pBhep zu erhöhen, wurden zwei Mutationen eingeführt, wie in 1 angezeigt. Die Mutationen wurden erzeugt, um den Translationspegel der Heparinase-I-mRNA durch Vergrößern der Länge der Shine-Dalgarno-Sequenz und durch Verringern des Abstandes zwischen der Shine-Dalagarno-Sequenz und der ATG-Startstelle zu verbessern. Unter Verwendung einer PCR hat eine Einzelbasen-Mutation, welche ein A zu einem G konvertiert, die Shine-Dalgarno-Sequenz von einer minimalen AGGA-Sequenz zu einer AGGAG-Sequenz verbessert, während der Abstand zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und der Translationsstartstelle von 10 auf 9 Basenpaare reduziert wurde. Dieses Konstrukt wurde als pGhep bezeichnet. Im zweiten Konstrukt, p&Dgr;4hep, wurden 4 Nukleotide (AACA) unter Verwendung der PCR gelöscht, um die Shine-Dalgarno-Sequenz auf AGGAG zu verlängern und um sie auf innerhalb 5 Basenpaare der ATG-Startstelle zu bewegen.

Die unterschiedlichen Konstrukte wurden wie oben beschrieben analysiert. Rückgefaltete Pellets aus mit pGhep transformiertem E.Coli wiesen ungefähr eine 7X Steigerung der Heparinase-I-Aktivität im Vergleich zu rückgefalteten Pellets aus E. coli auf, das pBhep enthielt. Andererseits wies E. coli, das p&Dgr;4hep enthielt, zwei bis dreimal weniger Aktivität als das pBhep-enthaltende E. coli auf. Die Pegel der Heparinase-I-Aktivität in den Überstandsflüssigkeiten waren ähnlich.

Das Plasmid pBhep wurde mit EcoRI aufgeschlossen und mit S1-Nuklease behandelt, um DNA mit einem stumpfen Ende zu bilden. Die Plasmid-DNA wurde dann mit BamHI aufgeschlossen, und die Einzelstrang-Enden wurden durch Auffüllen mit Klenow-Fragment doppelstrangig gemacht. Die DNA mit stumpfem Ende wurde verbunden und in E. coli Strang FTB 1 transformiert. Ein Plasmid, welches eine einzigartige BamHI-Stelle und keine Heparinase-I-Gen-DNA enthielt, wurde aus einer Kanamycin-resistenten Kolonie gereinigt und als Plasmid pGB bezeichnet. Eine DNA-Sequenzanalyse ergab, dass das Plasmid pGB die modifizierte Ribosomenbindungsstelle, die in 1 gezeigt wird, enthielt.

VERGLEICHENDES BEISPIEL 1: Nukleinsäure, welche Heparinase II codiert

Vier „Guessmer"-Oligonukleotide wurden unter Verwendung von Informationen aus zwei Peptidsequenzen 2A und 2B und mit Hilfe der Konsenscodone für Flavobacterium, wie in Tabelle 3 gezeigt, konstruiert. Diese waren:

die als 2-1, 2-2, 2-3 bzw. 2-4 bezeichnet wurden. Die Olignukleotide wurden mit einem Bio/CAN (Mississauga, Ontario) Peptidsynthesizer synthetisiert. Paare dieser Oligonukleotide wurden als Primer in PCR-Reaktionen verwendet. F. heparinum chromosomale DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen SaII, XbaI oder NotI aufgeschlossen und die fragmentierte DNA zur Verwendung als Matrizen-DNA kombiniert. Polymerasekettenreaktionsmischungen wurden unter Verwendung des DNA Amplification Reagent Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) erzeugt. Die PCR-Amplifikationen wurden in 100 µl Reaktionsvolumen durchgeführt, das 50 niM KCl, 10 mM Tris HCl, pH-Wert 9, 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM von jedem der vier Deoxyribosenukleotidtriphosphate (dNTPs), 100 pmol jedes Primers, 10 ng der fragmentierten F. heparinum genomischen DNA und 2,5 Einheiten von Taq-Polymerase (Bio/CAN Scientific Inc., Mississauga, Ontario) enthielt. Die Proben wurden auf einem automatisierten Heizblock (DNA Thermal-Cycler, Barnstead/Thermolyne Corporation, Dubuque, IA) angeordnet, der für folgende Schrittzyklen programmiert war: Denaturierungstemperatur 92 °C (1 Minute), Annealingtemperatur von 37 °C, 42 °C oder 45 °C (1 Minute) und Extensionstemperatur 72 °C (2 Minuten). Diese Zyklen wurden 35 Mal wiederholt. Die resultierenden PCR-Produkte wurden auf einem 1,0 % Agarosegel analysiert, das 0,6 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, wie von Maniatis, et al., ibid, beschrieben. DNA-Fragmente wurden durch Oligonukleotide 2-2 und 2-3 erzeugt. Die Fragmente, mit einer Größe von 250 bp und 350 bp, wurden zuerst auf 1 % Agarose-Gelelektrophorese getrennt, und die DNA wurde mit Hilfe des GENECLEAN I kit (Bio/CAN Scientific, Mississauga, Ontario) extrahiert. Gereinigte Fragmente wurden in pTZ/PC (Tessier und Thomas, unveröffentlicht) verbunden, das zuvor mit NotI, 2, aufgeschlossen wurde, und die Verbindungsmischung wurde verwendet, um E. coli FTB 1 zu transformieren, wie in Maniatis et al., ibid, beschrieben. Alle Restriktionsenzyme und die T4-DNA-Ligase wurden bei New England Biolabs (Mississauga, Ontario) gekauft.

Stamm FTB1 wurde in unserem Labor hergestellt. Das F'-Episom aus dem XL-1 Blue E. coli Stamm (Stragene, La Jolla, CA), welche das lac Iq Repressor-Gen trägt und 10 Mal mehr lac-Repressor als Wildtyp-E.coli produziert, wurde, wie von J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972) beschrieben, in den TB 1 E.coli Stamm, beschrieben von Baker, T.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6779-6783 (1984), verschoben. Der FTB1-Hintergrund ermöglicht eine stringentere Repression von Transkription aus Plasmiden, welche Promotoren mit einem lac-Promotor (d. h. lac und Taq-Promotoren) tragen. Kolonien, die aus der Transformation von FTB 1 resultieren, wurden auf LB-Agar enthaltendem Ampicillin ausgewählt und unter Verwendung des Blau/Weiß-Screens, bereitgestellt von X-gal und IPTG, die im Agar-Medium eingeschlossen sind, untersucht, wie von Maniatis et al., ibid, beschrieben. Transformanten wurden durch Kolonie-Cracking analysiert, und Mini-Zubereitungen von DNA wurden für Enzymrestriktionsanalyse unter Verwendung des RPM-Kit (Bio/CAN Scientific Inc., Mississauga, Ontario) hergestellt. Zehn Plasmide enthielten Inserts der korrekten Größe, welche bei Aufschließen mit EcoRI und HindIII freigesetzt wurden.

Eine DNA-Sequenzierung ergab, dass eines der Plasmide, pCE14, ein 350 bp PCR-Fragment der erwarteten DNA-Sequenz enthielt, wie aus dem Peptid 2C gewonnen. DNA-Sequenzen wurden durch das Dideoxy-Kettenterminationsverfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467 (1978), bestimmt.

Sequenzierungsreaktionen wurden mit dem Sequenase-Kit (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) und 35S-dATP (Amersham Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canada) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt.

Das Heparinase-II-Gen wurde aus einer F. heparinum chromosomalen DNA-Bibliothek, 2, kloniert, die wie oben beschrieben konstruiert worden ist. Zehn Plaque-enthaltende Filter wurden mit der DNA-Sonde hybridisiert, die aus dem gelgereinigten Insert von pCE14 hergestellt wurde, das unter Verwendung eines Random tabeling Kit [Zufallsmarkierungs-Kit] (Boehringer Mannheim Canada, Laval, Quebec) markiert wurde. Plaquehybridisierung wurde, wie in Maniatis et al., ibid, beschrieben, 16 Stunden lang bei 65 °C in einem Tek-Star-Hybridisierungsofen durchgeführt (Bio/CAN Scientific, Mississauga, Ontario). Nachfolgende Waschungen wurden bei 65 °C durchgeführt: zweimal 15 Minuten lang in 2X SSC, einmal in 2X SSC/0,1 % SDS 30 Minuten lang und einmal in 0,5 X SSC/0,1 % SDS 15 Minuten lang. Positive Plaques wurden unter Verwendung von Plastikmikropipettenspitzen geerntet und durch Dot-Blot-Analyse bestätigt, wie von Maniatis et al., ibid, beschrieben. Sechs der Phagen, die starke Hybridisierungssignale von sich gaben, wurden für eine Southern-Hybridisierungsanalyse verwendet, wie von Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975) beschrieben. Diese Analyse zeigt, dass ein Phage, HIIS, ein 5,5 kb XbaI-DNA-Fragment enthielt, das mit der Sonde hybridisierte. Klonieren des 5,5 kb XbaI-Fragmentes in die XbaI-Stelle von einem der folgenden Vektoren: pTZ/PC, pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pUC18 (beschrieben in Yanisch-Perron et al., Gene 33:103-119 (1985)) und pOK12 (beschrieben in Vierra und Messing, Gene 100:189-194 (1991)) war nicht erfolgreich, obwohl FTB1-Hintergrund verwendet wurde, um eine Plasmid promotor-abgeleitete Transkription zu unterdrücken. Vektor pOK12, ein Plasmid mit niedriger Kopienzahl, abgeleitet von pACYC184 (ungefähr 10 Kopien/Zelle, Chang, A.C.Y. und Cohen, S.N., J. Bact. 134:1141-1156 (1978)), wurde beim Versuch verwendet, die toxischen Wirkungen eines fremden DNA-Fragmentes in E. coli durch Minimierung der Anzahl der Kopien des toxischen fremden Fragmentes zu umgehen. Außerdem schlug die Insertion des gesamten NotI chromosomalen DNA-Inserts des HIIS-Phage in Plasmid-pOK12-Plasmid fehl. Daraus wurde geschlossen, dass diese Region von F. heparinum-Chromosom eine negativ-selektive Auswirkung auf E. coli Zellen, in denen sie enthalten ist, ausübt. Diese toxische Wirkung wurde zuvor bei anderen F. heparinum chromosomalen DNA-Fragmenten nicht festgestellt.

Eine zweite Strategie, die angewendet wurde, um das unerwartete Problem von F. heparinum DNA Toxizität in E. coli zu umgehen, bestand darin, das chromosomale DNA-Fragment mit einer Restriktionsendonuklease aufzuschließen, welche das Fragment, und falls möglich das Heparinase-II-Gen in zwei Teile aufteilen würde, 2. Diese Fragmente könnten einzeln kloniert werden. DNA-Sequenzanalyse des PCR-Inserts in Plasmid pCE14 zeigte, dass BamHI- und EcoRI-Stellen im Insert vorhanden waren. Hybridisierungsexperimente zeigten ebenfalls, dass die BamHI aufgeschlossene F. heparinum DNA in Phage HIIS zwei Bänder mit Größen von 1,8 und 5,5 kb produzierte. Eine Analyse der Hybridisierungsdaten ergab, dass die 1,8 kb Bande das 5'-Ende und die 5,5 kb Bande das 3'-Ende des Gens enthält. Ferner hybridisierte ein 5 kb EcoRI F. heparinum chromosomales DNA-Fragment mit der PCR-Sonde. Die 1,8, 5 und 5,5 kb Fragmente, welche die Heparinase-II-Gensequenzen enthielten, wurden in pBluescript eingefügt, wie oben beschrieben. Zwei Klone, pBSIB6-7 und pBSIB6-21, welche das 5,5 kb BamHI-Insert in verschiedenen Ausrichtungen enthalten, wurden isoliert, und ein Plasmid, pBSIB213, welches das 1,8 kb BamHI-Fragment enthielt, wurde isoliert. Es wurden keine Klone, die das 5 kb EcoRI-Fragment enthielten, isoliert, obwohl umfangreiches Screening möglicher Klone durchgeführt wurde.

Das Molekulargewicht des Heparinase-II-Proteins liegt bei ungefähr 84 kD, so dass die Größe des entsprechenden Gens bei ungefähr 2,4 kb liegen würde. Die 1,8 und 5,5 kb BamHI chromosomalen DNA-Fragmente könnten das gesamte Heparinase-II-Gen enthalten. Die Plasmide pBSIB6-7, pBSIB6-21 und pBSIB2-13, 2, wurden verwendet, um verschachtelte Deletionen mit dem Erase-a-Base-System (Promega Biotec, Madison Wis.) zu erzeugen. Diese Plasmide wurden als Matrizen für die DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung von Universal- und Umkehrprimern und Oligonukleotidprimern verwendet, die aus bekannter Heparinase-II-Sequenz gewonnen wurden. Da Teile des Gens relativ reich an G-C waren und zahlreiche starke, sekundäre Strukturen enthielten, wurde die Sequenzanalyse manchmal unter Verwendung von Reaktionen durchgeführt, bei denen dGTP durch dITP ersetzt wurde. Die Analyse der DNA-Sequenz, 4, zeigte, dass es einen einzelnen, kontinuierlichen offenen Leserahmen gab, der Codone für 772 Aminosäurereste enthielt, 5. Die Suche nach einer möglichen Signalpeptidsequenz unter Verwendung von Geneworks (Intelligenetics, Mountain View, CA) deutete darauf hin, dass es zwei mögliche Stellen für die Bearbeitung des Proteins in eine reife Form gibt: Q-26 (Glutamin) und D-30 (Aspartat). N-terminales Aminosäuresequenzieren von deblockierter, verarbeiteter Heparinase II zeigte, dass das reife Protein mit Q-26 beginnt und 747 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 84,545 Dalton enthält, 5.

VERGLEICHENDES BEISPIEL 2: Expression von Heparinase II in E. Coli

Der Vektor pGB wurde für die Heparinase-II-Expression in E. coli, 3, verwendet. pGB enthält die modifizierte Ribosomenbindungsregion von pGhep, 1, und eine einzigartige BamHI-Stelle, wobei die Expression eines DNA-Fragmentes, das in diese Stelle eingefügt ist, durch einen doppelten tac-Promotor getrieben wird. Der Vektor schließt auch ein Kanamycinresistenzgen und das lac Iq Gen ein, um die Induktion von Transkription mit IPTG zu ermöglichen. Anfangs wurde ein gelgereinigtes 5,5 kb BamHI-Fragment aus pBSIB6-21 mit BamHI-aufgeschlossenem pGB verbunden und in FTB 1 transformiert, das auf LB-Agar mit Kanamycin ausgewählt wurde. Sechs der resultierenden Kolonien enthielten Plasmide mit Inserts in der korrekten Ausrichtung für die Expression des offenen Leserahmens. Die PstI-Aufschließung und Wiederverbindung eines der Plasmide, welche pGBIID bilden, löschte 3,5 kb des 5,5 kb BamHI-Fragmentes und entfernte eine BamHI-Stelle, wodurch nur eine BAMHI-Stelle unmittelbar nach der Shine-Dalgarno-Sequenz übrig blieb. Schließlich wurden zwei synthetische Oligonukleotide konstruiert: 5'-TGAGGATTCATGCAAACCAAGGCCGATGTGGTTTGGAA-3' (SEQ ID NO:15) und 5'-GGAGGATAACCACATTCGAGCATT-3'-(SEQ ID NO:16) zur Verwendung in einer PCR, um ein Fragment zu erzeugen, das eine BamHI-Stelle und ein ATG-Startcodon stromaufwärts von der Sequenz, die das reife Protein codiert, und eine stromabwärts gelegene BamHI-Stelle, 3, enthält. Lambda-Klon HII-I, isoliert zur selben Zeit wie Lambda-Klon HIIS, wurde als Matrizen-DNA verwendet.

Das Klonieren des PCR-Produktes mit stumpfem Ende in pTZ/PC schlug fehl, wobei FTB 1 als Wirt verwendet wurde. Das Klonieren des BamHI-aufgeschlossenen PCR-Produktes in die BamHI-Stelle von pBluescript, wieder unter Verwendung von FTB 1 als Wirt, führte zur Isolierung von 2 Plasmiden, welche das PCR-Fragment enthalten, nach Screening von 150 möglichen Klonen. Eines von diesen, pBSQTK-9, das mit Umkehrprimern und Universalprimern sequenziert wurde, enthielt eine genaue Reproduktion der DNA-Sequenz aus dem Heparinase-II-Gen. Das BamHIaufgeschlossene PCR-Fragment aus pBSQTK-9 wurde in die BamHI-Stelle von pGBIID in solcher Ausrichtung eingefügt, dass sich die ATG-Stelle stromabwärts der Shine-Dalgarno-Sequenz befand. Dieses Konstrukt, pGBH2, platzierte das reife Heparinase-II-Gen unter die Kontrolle der tac-Promotoren in pGB, 3. Stamm E. coli FTB 1 (pGBH2) wurde in LB-Medium, das 50 ug/ml Kanamycin enthielt, bei 37 °C drei Stunden lang gezüchtet. Die Induktion des tac-Promotors erfolgte durch Zugabe von 1 mmol IPTG, und die Kultur wurde entweder unter Raumtemperatur oder 30 °C gehalten. Heparin- und Heparansulfatabbauaktivität wurde in den Kulturen nach vierstündigem Züchten unter Verwendung des von Yang et al., ibid, beschriebenen Verfahrens gemessen. Heparinabbauaktivitäten von 0,36 und 0,24 IU/mg Protein und Heparansulfatabbauaktivitäten von 0,49 und 0,44 IU/mg Protein wurden bei Raumtemperatur bzw. 30 °C beobachtet.

BEISPIEL 6: Nukleinsäure, welche Heparinase III codiert

Die Aminosäuresequenzinformationen, die aus den Peptiden, die von Heparinase III, 9, abgeleitet wurden, gereinigt so wie hierin beschrieben, haben sich in hoch degenerative Oligonukleotide zurück translatiert. Daher erforderte eine Klonierungsstrategie, die auf der Polymerasekettenreaktionamplifikation eines Abschnitts des Heparinase-III-Gens unter Verwendung von Oligonukleotiden beruht, die auf der Grundlage von Aminosäuresequenzinformationen synthetisiert werden, das Eliminieren von einigen der DNA-Sequenzmöglichkeiten. Eine angenommene Codonverwendung wurde auf der Grundlage bekannter DNA-Sequenzen für Gene aus anderen Flavobacterium-Spezies berechnet. Sequenzen für 17 Gene wurden analysiert, und eine Codonverwendungstabelle wurde erstellt – Tabelle 3.

Vier Oligonukleotide wurden konstruiert, indem jedes Codon gemäß der Codonverwendungstabelle ausgewählt wurde. Diese waren: 5'-GAATTCCATCAGTTTCAGCCGCATAAA-3' (SEQ ID NO:17), 5'-GAATTCTTTATGCGGCTGAAACTGATG-3' (SEQ ID NO:18), 5'-GAATTCCCGCCGGGCGAATTTCATGC-3' (SEQ ID NO:19) und 5'-GAATTCGCATGAAATTCGCCCGGCGG-3' (SEQ ID NO:20) und wurden als Oligonukleotide 3-1, 3-2, 3-3 bzw. 3-4 bezeichnet. Diese Oligonukleotide wurden in allen möglichen Kombinationen in einem Versuch verwendet, einen Abschnitt des Heparinase-III-Gens unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion zu amplifizieren. Die PCR-Amplifikationen wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Zyklen von: Denaturierungstemperatur 92 °C (1 Minute), Annealingtemperaturen von 37 °C bis 55 °C (1 Minute) und Extensionstemperatur 72 °C (2 Minuten) wurden 35 Mal wiederholt. Eine Analyse der oben beschriebenen PCR-Reaktionen ergab, dass durch diese Experimente keine DNA-Fragmente erzeugt wurden.

Ein zweiter Satz Oligonukleotide wurde synthetisiert und umfasste 32 Basen-Sequenzen, in welchen die Codonverwendungstabelle verwendet wurde, um die dritte Position von nur der Hälfte der Codone zu erraten. Die Nukleotide innerhalb der Klammern zeigen Degenerationen von zwei oder vier Basen an einer einzigen Stelle. Diese waren:

(SEQ ID NO:24) und wurden als Oligonukleotide 3-5, 3-6, 3-7 und 3-8 bezeichnet. Diese Oligonukleotide wurden beim Versuch verwendet, einen Abschnitt des Heparinase-III-Gens unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion zu amplifizieren, und die Kombination aus 3-6 und 3-7 ergab ein spezifisches 983 bp PCR-Produkt. Es wurde ein Versuch unternommen, dieses Fragment durch Ligation mit stumpfem Ende in den E. coli Vektor pBluescript zu klonen, sowie in zwei spezifisch konstruierte Vektoren für das Klonieren von PCR-Produkten, pTZ/PC und pCRII von dem TA CloningTM Kit (InVitrogen Corporation, San Diego, CA). Alle diese Konstrukte wurden in den FTB1 E. coli Stamm transformiert. Die Transformanten wurden zuerst durch Kolonie-Aufbrechen analysiert, und anschließend wurden Minizubereitungen von DNA zur Enzymrestriktionsanalyse hergestellt. Keine Klone, die dieses PCR-Fragment enthielten, wurden isoliert.

Ein dritter Satz an Oligonukleotiden wurde synthetisiert, indem BamHI-Endonukleasesequenzen an den Enden der 3-6 und 3-7 Oligonukleotidsequenzen aufgenommen wurden. Eine 999-Basenpaar-DNA-Sequenz wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit F. heparinum chromosomaler DNA als Ziel erhalten. Es wurden Versuche unternommen, die amplifizierte DNA in die BamH1-Stelle des Plasmids pBluescript mit hoher Kopieanzahl und der Plasmide pBR322 und pACYC 184 mit niedriger Kopieanzahl zu klonieren. Alle diese Konstrukte wurden wiederum in den FTB 1 E. coli Stamm transformiert. Mehr als 500 Kandidaten wurden untersucht, dennoch wurden keine Transformanten, die ein Plasmid enthalten, das die F. heparinum DNA enthält, erhalten. Wiederum wurde daraus geschlossen, dass diese Region von F. heparinum Chromosom eine negativ-selektive Wirkung auf E. coli Zellen hat, in denen sie enthalten ist.

Wie im Fall der Isolierung des Heparinase-II-Gens wurde das PCR-Fragment aufgeteilt, um das Problem der fremden DNA-Toxizität zu vermeiden. Das Aufschließen des 981 bp BamHI-aufgeschlossenen Heparinase-III-PCR-Fragmentes mit Restriktionsendonuklease ClaI erzeugte zwei Fragmente mit 394 und 587 bp. Die amplifizierte F. heparinum-Region wurde mit ClaI behandelt, und die zwei Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Die 587- und 394-Basenpaar-Fragmente wurden getrennt in Plasmid-pBluescript gebunden, das mit Restriktionsendonukleasen BamHI und ClaI behandelt worden war. Außerdem wurde das gesamte 981-bp-PCR-Fragment gereinigt und in BamHI-geschnittenes pBluescript gebunden. Die gebundenen Plasmide wurden in XL-1 Blue E. coli eingefügt. Transformanten, welche Plasmide mit Inserts enthielten, wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, weiße Kolonien auf LB-Agarplatten mit X-gal, IPTG und 50 ug/ml Ampicillin zu bilden, ausgewählt, wie von Maniatis beschrieben. Plasmid pFB 1, welches das 587 bp F. heparinum-DNA-Fragment enthält, und Plasmid pFB2, welches das gesamte 981 Basenpaar-Fragment enthält, wurden durch dieses Verfahren isoliert. Der XL-1 Blue-Stamm, der – wie Stamm FTB 1, das lac Iq Repressor-Gen auf einem F'-Episom enthält, ermöglichte ein stabiles Aufrechterhalten des kompletten BamHI-PCR- Fragmentes, im Gegensatz zu FTB 1. Der Grund für diese Diskrepanz ist aus den Genotypen der zwei Stränge (d. h. beide sind rec A usw.) nicht ersichtlich.

Die DNA-Sequenzanalyse der F heparinum-DNA in Plasmid pFB 1 zeigte, dass sie eine Sequenz enthielt, welche Peptid Hep3-B codiert, während das F heparinum-Insert in Plasmid pFB2 eine DNA-Sequenz enthielt, welche die Peptide Hep3-D und Hep3-B, 9, codiert. Diese Analyse bestätigte, dass diese Inserts Teil des Gens waren, das Heparinase III codiert.

Das PCR-Fragmentinsert in Plasmid pFB 1 wurde mit 32P-ATP unter Verwendung eines Random Primed DNA Labeling Kit (Boehringer Mannheim, Laval, Quebec) markiert und wurde verwendet, um die F. heparinum-&lgr;DASHII-Bibliothek, 6, zu untersuchen, die wie hierin beschrieben konstruiert wurde. Die Lambda-Bibliothek wurde plattiert, um ungefähr 1.500 Plaques zu erhalten, welche auf Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuel, Keene, NH) transferiert wurden. Die PCR-Sonde wurde durch Ethanolfällung gereinigt. Plaquehybridisierung wurde unter Anwendung der oben beschriebenen Bedingungen ausgeführt. Acht positive Lambda-Plaques wurden identifiziert. Lambda-DNA wurde aus lysierten bakteriellen Kulturen isoliert, wie in Maniatis beschrieben, und weiter durch Restriktionsanalyse und durch Southern-Blotting unter Verwendung einer Hybond-N Nylonmembran (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) gemäß des in Maniatis beschriebenen Protokolls analysiert. Ein 2,7 Kilobasen-HindIII-Fragment aus Lambda-Plaque #3, welches stark an der PCR-Sonde hybridisierte, wurde isoliert und in pBluescript im XL-1 Blue E. coli Hintergrund kloniert, um Plasmid pHindIIIBD, 6, zu ergeben. Dieser Klon wurde weiter durch DNA-Sequenzierung analysiert. Die Sequenzdaten wurden unter Verwendung aufeinanderfolgender verschachtelter Deletionen von pHindIIIBd erhalten, erzeugt mit dem Erase-a-Base System (Promega Corporation, Madison, WI) oder sequenziert unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern.

Die Sequenzanalyse ergab einen einzelnen kontinuierlichen offenen Leserahmen, ohne ein translationales Terminationscodon, von 1929 Basenpaaren, entsprechend 643 Aminosäuren. Weiteres Screening der Lambda-Bibliothek führte zur Identifizierung eines 673 bp KpnI-Fragmentes, das auf ähnliche Weise in die KpnI-Stelle von pBluescript kloniert wurde, wodurch Plasmid pFB4 geschaffen wurde. Das Terminationscodon wurde innerhalb des KpnI-Fragmentes gefunden, indem zusätzliche 51 Basenpaare zum Heparinase-III-Gen und zusätzliche 16 Aminosäuren zum Heparinase-III-Protein hinzugefügt wurden. Das vollständige Heparinase-III-Gen wurde später innerhalb eines 3,2 kb PstI-Fragmentes aus Lambda-Plaque #118 gefunden. Das vollständige Heparinase-III-Gen aus Flavobacterium ist somit 1980 Basenpaare lang, 8, und codiert ein 659 Aminosäurenprotein, 9. N-terminales Aminosäuresequenzieren von deblockierter, verarbeiteter Heparinase III zeigte, dass das reife Protein bei Q-25 beginnt und 635 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 73.135 Dalton, 9, enthält.

BEISPIEL 7: Expression von Heparinase III in E. coli PCR wurde verwendet, um ein reifes, gestutztes Heparinase-III-Gen zu erzeugen, das 16 Aminosäuren aus dem Carboxy-Terminus des Proteins als gelöscht aufwies. Ein Oligonukleotid, bestehend aus 5'-CGCGGATCCATGCAAAGCTCTTCCATT-3' (SEQ ID NO:25) wurde entwickelt, um eine ATG-Startstelle unmittelbar vor dem Codon für die erste Aminosäure (Q-25) der reifen Heparinase III einzufügen, während ein Oligonukleotid, bestehend aus 5'-CGCGGATCCTCAAAGCTTGCCTTTCTC-3' (SEQ ID NO:26) entwickelt wurde, um ein Terminationscodon nach der letzten Aminosäure des Heparinase-III-Gens auf dem 2,7 kb HindIII-Fragment einzufügen. Beide Oligonukleotide enthielten auch eine BamHI-Stelle. Plasmid pHindIIIBD wurde als Matrize in einer PCR-Reaktion mit einer Glühtemperatur von 50 °C verwendet. Ein spezifisches Fragment der erwarteten Größe, 1857 Basenpaare, wurde erhalten. Dieses Fragment codiert ein Protein mit 620 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 71.535 Dalton. Es wurde isoliert und in die BamHI-Stelle des Expressionsvektors pGB eingefügt. Dieses Konstrukt wurde als pGB-H3&Dgr;3', 7, bezeichnet.

Um die fehlende 3'-Region von Heparinase III einzufügen, wurde das BspEI/SaII-Restriktionsfragment aus pGB-H3&Dgr;3' entfernt und durch das BspEI/SaII-Fragment aus pFBS ersetzt. Das Konstrukt, welches das vollständige Heparinase-III-Gen enthielt, wurde als pGBH3, 7, bezeichnet. Rekombinante Heparinase III ist ein Protein mit 636 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 73.266 Dalton. E. coli Stamm XL-1 Blue(pGBH3) wurde bei 37 °C in LB-Medium, das 75 ug/ml Kanamycin enthielt, auf OD600 von 0,5 gezüchtet, wobei an diesem Punkt der tac-Promotor aus pGB durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert wurde. Die Kulturen wurden weitere 2 bis 5 Stunden entweder bei 23 °C, 30 °C oder 37 °C gezüchtet. Die Zellen wurden auf Eis gekühlt, durch Zentrifugation konzentriert und in kalter PBS bei 1/10 des ursprünglichen Kulturvolumens resuspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallung lysiert und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10.000 x g über einen Zeitraum von fünf Minuten entfernt. Die Pellet- und die Überstandsflüssigkeitsfraktion wurden auf Heparansulfat abbauende (Heparinase III) Aktivität untersucht. Heparansulfat abbauende Aktivitäten von 1,29, 5,27 und 3,29 IU/ml wurden bei Kulturen beobachtet, die bei 23 °C, 30 °C bzw. 37 °C gezüchtet wurden.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Erhalten hoch gereinigter Heparin- und Heparansulfat abbauender Proteine durch Exprimieren der Gene für diese Proteine in einem geeigneten Expressionssystem und Anwenden der Schritte der Zellaufbrechung, der Kationenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Hydroxylapatitchromatographie. Variationen dieser Verfahren sind für Fachleute aus der vorhergehenden detaillierten Beschreibung der Erfindung offensichtlich. Solche Modifikationen liegen innerhalb des Schutzumfanges derangeschlossenen Ansprüche.

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Isolierte, nicht-glycosylierte Heparinase III, welche die Aminosäure-Sequenz einer reifen Heparinase III, die einen Methioninrest unmittelbar vor der ersten Aminosäure der genannten reifen Heparinase III besitzt, oder nicht-glycosylierte funktionelle Derivate davon, die Heparansulfat aber nicht Heparin abbauen, aufweist.
  2. Heparinase III gemäß Anspruch 1, welche die Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO:4, beginnend bei Glutamin in Position 25 aufweist, und welche einen Methioninrest unmittelbar vor dem genannten Glutamin enthält.
  3. Antikörper oder ein Fragment davon, der für Heparinase III wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert spezifisch ist.
  4. Heparinase III wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Es folgen 11 Blatt Zeichnungen






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
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D Textilien; Papier
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H Elektrotechnik

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