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Dokumentenidentifikation DE69822806T2 10.03.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000977578
Titel ZUSAMMENSETZUNGEN ZUR VERSTÄRKUNG ZYTOPROTEKTIVER WIRKUNG VON POLYCYCLISCHER PHENOLVERBINDUNGEN DURCH SYNERGISTICHE WECHSELWIRKUNG VON ANTIOXIDATIONSMITTELN
Anmelder University of Florida Research Foundation, Inc., Gainesville, Fla., US
Erfinder SIMPKINS, W., James, Gainesville, US;
GRIDLEY, E., Kelly, Gainesville, US;
GREEN, S.,, Pattie, Gainesville, US
Vertreter PAe Reinhard, Skuhra, Weise & Partner GbR, 80801 München
DE-Aktenzeichen 69822806
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.01.1998
EP-Aktenzeichen 989035605
WO-Anmeldetag 16.01.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/00963
WO-Veröffentlichungsnummer 0098031381
WO-Veröffentlichungsdatum 23.07.1998
EP-Offenlegungsdatum 09.02.2000
EP date of grant 31.03.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.03.2005
IPC-Hauptklasse A61K 38/06

Beschreibung[de]
Hintergrund

Es besteht ein Bedarf nach Behandlungen, die Zellen vor einem Tod beschützen, der sich aus Krankheitsepisoden, Trauma, Isolierung und Entfernung von Geweben oder Zellen aus dem Körper oder aus der Exposition gegenüber Toxinen ergibt. Dieser Bedarf erstreckt sich auf Behandlungen für einen Nervenzellverlust, der mit chronischen oder akuten neurodegenerativen Störungen oder Verletzungen in Verbindung steht: Behandlungen zur Minimierung einer Gewebsschädigung, die sich aus einer Ischämie ergibt, wobei die Ischämie als Folge eines Schlaganfalls, einer Herzkrankheit, eines Transplantationsereignisses oder eines anderen Ereignisses auftreten kann, die ein Abschneiden der Nährstoffzufuhr zu den Geweben zur Folge hat; und eine Behandlung zur Modulierung eines Zelltodes, der mit Zuständen, wie beispielsweise Osteoporose oder Anämie in Verbindung steht. Das Fehlen einer effektiven cytoprotektiven Therapie kann entweder den Verlust des Lebens oder eine allgemeine Abnahme der Lebensqualität einschließlich einer dauerhaften Behinderung mit hohen Pflegekosten für Patienten, deren Familien und den Gesundheitsversorgern zur Folge haben. Ein Ansatz zur Minimierung pathologischer Veränderungen war ein Versuch, den oxidativen Stress, der mit einer Akkumulation freier Radikale im extrazellulären Raum in Verbindung steht, zu neutralisieren. Mooradian, J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 45 (1993) 509 bis 511, haben berichtet, dass bestimmte Östrogene signifikante antioxidative Eigenschaften in biochemischen in vitro Assays aufweisen, jedoch ist diese Wirkung nicht bei allen Östrogenen ersichtlich. Wegen der Variation antioxidativer Eigenschaften, die von Mooradian in seinen biochemischen Assays bemerkt wurde, schloss er, dass Steroid-Moleküle bestimmte antioxidative Determinanten aufweisen müssen, die bis jetzt unbekannt sind. Ähnliche Beobachtungen, die Steroide mit phenolischen A-Ringen betreffen, wurden in der WO 95/13 076 berichtet, in der biochemische Assays verwendet wurden, die eine antioxidative Wirksamkeit zeigten. Die von Mooradian und von WO 95/13 076 verwendeten Assays waren biochemische Assays und überprüften als solches die Wirkungen dieser Moleküle auf Zellen nicht direkt. US 5,554,601 (1996) beschrieb jedoch zellbasierte Assays zur Bestimmung eines Verfahrens unter Verwendung von Östrogenverbindungen, die eine Neuroprotektion auf eine Zellpopulation übertrugen, auf Grundlage demonstrierter zellproliferativer Wirkungen.

Eine oxidative Schädigung wurde mit einer Vielzahl neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer Krankheit (Alzheimer's Disease = AD) und dem Alterungsprozess in Verbindung gebracht (Benzi et al., Free Radic. Biol. Med. 19 (1995), 77 bis 101, und US 5,554,601, hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen). Der Zelltod tritt auch als Folge eines ischämischen Ereignisses im Körper auf, das sich aus einer Nahrungsverknappung ergibt, die mit einer/einem sich aus einem Verschluss an einem cerebrovaskulären oder cardiovaskulären Ort ergebenden Sauerstoff-Verknappung bzw. -Mangel ergibt oder mit einer Verletzung oder einer Krankheit in Verbindung stehen kann.

Es besteht ein Bedarf nach verbesserten Verfahren, sowohl Männer als auch Frauen vor den Folgen eines abnormalen Zelltodes im Körper zu beschützen.

Zusammenfassung

In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, durch das auf eine Population von Zellen ein Zellschutz übertragen wird, das die Bereitstellung einer polycyclischen Phenol-Verbindung und einer antioxidativen Verbindung bzw. Antioxidansmittel-Verbindung und das Verabreichen der polycyclischen Phenol-Verbindung und der antioxidativen Verbindung an die Population von Zellen in einer wirksamen Dosis einschließt, um einen Zellschutz zu verleihen, so dass die kombinierte cytoprotektive Wirkung der polycyclischen phenolischen Verbindung und der antioxidativen Verbindung größer ist als der zusätzliche bzw. additive Effekt jeder Verbindung, die getrennt unter in anderer Weise ähnlichen Bedingungen verabreicht wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren, um einer Population von Zellen in einem Subjekt einen Zellschutz zu verleihen, einschließlich der Schritte, eine therapeutische Kombinationsdosis zu verabreichen, die ein Antioxidans und eine polycyclische phenolische Verbindung in einer pharmazeutischen Formulierung enthält; die Formulierung in einer wirksamen Dosis an die Population von Zellen derart zu verabreichen, dass die cytoprotektive Wirkung der Kombination im Subjekt größer als der zusätzliche Effekt jeder getrennt bereitgestellten Verbindung ist; und ein Schützen der Zellen im Subjekt, die sich ansonsten verschlechtern und in Abwesenheit der pharmazeutischen Formulierung absterben würden.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann die kombinierte Wirkung eine 100- bis 10.000-fache Steigerung, insbesondere eine 100- bis 5.000-fache Steigerung, insbesondere eine 1.000- bis 5.000-fache Steigerung des Zellschutzes sein, die sich aus der kombinierten Wirkung der polycyclischen Verbindung und des Antioxidans bzw. Antioxidationsmittels im Vergleich mit jeder Verbindung getrennt ergibt. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist die polycyclische Phenolverbindung eine Östrogenverbindung, insbesondere eine Östrogenverbindung mit einer unbeträchtlichen Geschlechts-Wirksamkeit, beispielhaft gezeigt durch das &agr;-Isomer von Östradiol. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist das Antioxidans aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem Thiol-, einem Phenol-, einem Spin-Einfangmittel, einem aromatischen Amin, einem Carotinoid, einem Flavonoid, einem Selen, einem Aminosteroid und einem Ubichinon besteht.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließt der Zellschutz eine Neuroprotektion ein.

Kurze Beschreibung der Figuren

1 zeigt die Wirkung von Glutathion (GSH) und 17&bgr;-Östradiol auf Nervenzellen (SK-N-SH-Zellen), behandelt mit neurotoxischem &bgr;-Amyloid-Protein (&bgr;AP), wobei &bgr;AP ein Peptid aus 10 Aminosäuren (Aminosäuren 25 bis 35) ist, das nachstehend als „&bgr;AP 25–35" bezeichnet wird. Die Wirkungen von 17&bgr;-Östradiol (2 nM) und GSH (3,25 &mgr;M) auf die durch &bgr;AP 25–35 (20 &mgr;M) induzierte Toxizität auf SK-N-SH-Zellen (106 Zellen/ml) in unterschiedlichen Zellkulturmedien, denen GSH in der Zellkultur-Rezeptur fehlte, ist dargestellt. Die Zellen wurden zu 106 Zellen/ml ausplattiert und wurden gegenüber Träger, &bgr;AP 25–35, 17&bgr;-Östradiol, GSH oder einer Kombination wie angezeigt ausgesetzt. Kontrollen repräsentieren den Durchschnittswert für den Träger, GSH, 17&bgr;-Östradiol und die GSH + 17&bgr;-Östradiolgruppen und wurden zusammengepoolt, nachdem festgestellt wurde, dass diese voneinander nicht statistisch signifikant verschieden waren. Abgebildet sind die Durchschnittswerte ±SEM (Standard Error of Mean = Standardabweichung des Mittelwertes) für 4–5 Wells/Gruppe. *p < 0,05 gegen Kontrollen, bestimmt durch ANOVA, gefolgt von Scheffe's post-hoc-Test.

2 zeigt die Wirkung von GSH und 17&bgr;-Östradiol auf die Anzahl lebender SK-N-SH-Zellen, die mit neurotoxischem &bgr;AP 25–35 in Gegenwart oder in Abwesenheit einer nicht-protektiven Dosis von 17&bgr;-Östradiol (2 nM) behandelt wurden. Die Zellen wurden zu 106 Zellen/ml ausplattiert. Die Auswirkung variierender Konzentrationen von GSH in Gegenwart von 17&bgr;-Estradiol (ausgefüllte Dreiecke) wurde mit den Zellen verglichen, die mit GSH in Abwesenheit von 17&bgr;-Östradiol (nicht ausgefüllte Dreiecke) behandelt wurden. Dargestellt sind Durchschnittswerte ±SEM für 6 Wells/Gruppe. Die Wirkung von 17&bgr;-Östradiol auf die Reaktion gegenüber GSH war hoch signifikant (F = 41,48; p < 0,001). Ein Vergleich der EC50-Werte für die unterschiedlichen Dosiswirkungskurven unter Verwendung des Mann-Whitney Rangsummentests zeigte ein p = 0,036, wobei der EC50 für &bgr;AP 25–35 + 17&bgr;-Östradiol (2 nM) 0,041 ± 0,025 betrug und für &bgr;AP 25–35 (20 &mgr;M) 82,560,4 betrug.

3 zeigt die Wirkung von GSH und 17&bgr;-Östradiol auf die Anzahl lebender SK-N-SH-Zellen, die eine Herausforderung mit &bgr;AP 25–35 (20 &mgr;M) in variierenden Konzentrationen von 17&bgr;-Östradiol in Gegenwart von 3,25 &mgr;M GSH (ausgefüllte Dreiecke) unterworfen wurden, im Vergleich mit den Wirkungen in Zellen, die mit 17&bgr;-Östradiol in Abwesenheit von GSH (offene Dreiecke) behandelt wurden. Dargestellt sind die Durchschnittswerte ±SEM für 4 Wells/Gruppe. Die Wirkung von GSH auf die Reaktion gegenüber 17&bgr;-Östradiol war hoch signifikant (F = 44,33; p < 0,001). Ein Vergleich der EC50-Werte für die unterschiedlichen Dosiswirkungskurven unter Verwendung des Mann-Whitney Rangsummentests zeigte ein p < 0,057, wobei der EC50 für &bgr;AP 25–35 + GSH (3,25 &mgr;M) 0,330,031 und für &bgr;AP 25–35 (20 &mgr;M) 12687,8 betrug.

4 zeigt die Wirkungen einer Dosis 17&bgr;-Östradiol auf die durchschnittliche Anzahl primärer Cortexneurone der Ratte pro fotografischem Feld, wenn sie einer &bgr;AP 25–35 Herausforderung in Gegenwart und Abwesenheit einer nicht-protektiven Dosis GSH unterworfen wurden. Die Zellen wurden wie früher angezeigt bei den erwähnten Dosen ausplattiert und gegenüber den Behandlungen exponiert. Dargestellt sind Durchschnittswerte ±SEM für 4 bis 7 Wells/Gruppe. Die Wirkung von GSH auf die Reaktion gegenüber 17&bgr;-Östradiol war hoch signifikant (F = 8,53; p < 0,005). Ein Vergleich der EC50-Werte für die unterschiedlichen Dosiswirkungskurven unter Verwendung des Mann-Whitney Rangsummentests zeigte einen p < 0,057.

5 zeigt die Wirkungen von Estratrienen in Gegenwart und Abwesenheit von GSH auf die durch &bgr;AP (25–35) in HT22-Zellen induzierte Neurotoxizität. Die Symbole repräsentieren folgendes:

6 zeigt die Wirkungen von 17&bgr;-Östradiol in Gegenwart und Abwesenheit von GSH auf die durch &bgr;AP 1–40 in HT22-Zellen induzierte Neurotoxizität. &#9744; zeigt das Vorhandensein von GSH an und

zeigt das Fehlen von GSH an. Die Linie repräsentiert den Wert der Kontrollgruppe (kein &bgr;AP 1–40). Die Daten werden als Durchschnitt ±SEM für 4 Wells/Gruppe präsentiert. *= p < 0,05 gegen die Gruppe mit &bgr;AP 1–40 alleine, **= p < 0,05 gegen sowohl die Gruppe mit &bgr;AP 1–40 alleine als auch die Kontrollgruppe (kein &bgr;AP 1–40).

Ausführliche Beschreibung

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die neue Erkenntnis, dass die cytoprotektive Wirkung polycyclischer Phenol-Verbindungen wesentlich verbessert wird, wenn sie mit zumindest einer zusätzlichen antioxidativen Verbindung verabreicht werden.

Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere eine cytoprotektive bzw. Zellschutz-Formulierung bereit, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine polycyclische Phenol-Verbindung und eine Antioxidans bzw. antioxidative Verbindung umfasst, um einer Population von Zellen im Falle einer chronischen degenerativen Erkrankung, akuten Erkrankung, Alterung, Verletzung, Osteoporose, Verbrennungen, Gewebstransplantation und einem chirurgischen Eingriff, die einen Verlust an Nährströmung zu diesem Gewebe zur Folge hat, Zellschutz zu verleihen, wobei die polycyclische Phenol-Verbindung (i) zwei oder mehr Ringstrukturen einschließt, von denen zumindest eine ein terminaler Phenolring ist und (ii) eine Größe von weniger als 1.000 Dalton aufweisen, ausgewählt aus 2, 3 oder 4 Ring-Cyclopentanophen-(A)-anthrenringverbindungen mit einer Hydroxylgruppe an den Kohlenstoffatomen 1, 2, 3 und/oder 4 des A-Ringes.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung einer polycyclischen Phenolverbindung in Verbindung mit einer antioxidativen Verbindung zur Herstellung eines Medikamentes zum Verleihen eines Zellschutzes für eine Population von Zellen in den Fällen einer chronisch degenerativen Erkrankung, einer akuten Erkrankung, des Alterns, einer Verletzung, der Osteoporose, von Verbrennungen, Gewebstransplantation und eines chirurgischen Eingriffes bereit, die einen Verlust an Nährströmung zu diesem Gewebe zur Folge haben, wobei die polycyclische Phenol-Verbindung (i) zwei oder mehr Ringstrukturen einschließt, von denen zumindest eine ein terminaler Phenolring ist und (ii) eine Größe von weniger als 1.000 Dalton aufweisen, ausgewählt aus 2, 3 oder 4-Ringcyclopentanophen-(A)-anthrenringverbindungen mit einer Hydroxylgruppe an den Kohlenstoffatomen 1, 2, 3 und/oder 4 des A-Ringes.

Der Begriff „Zellschutz" ist hierin und in den Ansprüchen als Schutz von Zellen gegen Zelltod oder eine Zellschädigung definiert, die in anderer Weise in Abwesenheit eines protektiven Mittels auftreten würden, wobei der Zelltod oder die Zellschädigung verursacht sein kann durch irgendeine mechanische Schädigung, Nahrungsmittelentzug, einschließlich Sauerstoffmangel, Verletzung, Krankheitsprozesse, Schädigung aufgrund der Exposition gegenüber Chemikalien oder extreme Temperaturen, Alterung oder eine andere Ursache.

Der Begriff „Östrogen- bzw. Estrogen-Verbindung", wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, ist als irgendeine der Strukturen, wie in der 11. Ausgabe von „Steroids" von Steraloids Inc., Wilton N. H., beschrieben, definiert und hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen. Eingeschlossen in diese Definition sind Isomere oder Enantiomere, die nicht steroidale Östrogene einschließen, gebildet durch Modifikation oder Substitution der Verbindungen in der Literaturstelle von Steroloid. Weitere Östrogenverbindungen, die in diese Definition mit eingeschlossen sind, sind Östrogenderivate, Östrogenmetabolite und Östrogenprecursoren ebenso wie solche Moleküle, die zur Bindung eines zellassoziierten Östrogenrezeptors in der Lage sind, ebenso wie andere Moleküle, wobei das Ergebnis der Bindung spezifisch einen charakterisierten Östrogen-Effekt auslöst. Ebenfalls eingeschlossen sind Gemische aus mehr als einem Östrogen, wobei Beispiele für solche Gemische in Tabelle 2, unten, dargestellt sind. Beispiele für &agr;-Östrogenstrukturen mit Anwendbarkeit entweder alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln sind in 5 dargestellt.

Die Begriffe „17-E2, &bgr;-Östradiol, 17&bgr;-Östradiol, &bgr;-17-E2, E2, 17&bgr;E2, &bgr;E2", wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, sollen synonym sein. In ähnlicher Weise sollen die Begriffe „&agr;17-E2, &agr;-17-E2, &agr;-Östradiol, 17-&agr;-Östradiol, 17&agr;E2, &agr;-E2", wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, synonym sein und entsprechen dem &agr;-Isomer von 17&bgr;-Östradiol.

Die Abkürzung „E-3-ol", wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, repräsentiert Estratrien-3-ol.

Die Bedeutung der Begriffe „polycyclische phenolische Verbindung, polycyclische Verbindungen oder polycyclische Phenole", wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, werden gemäß der Offenbarung von US-A-5,859,001 beispielhaft gezeigt (d. h. die polycylische Phenol-Verbindung (i), die zwei oder mehr Ringstrukturen einschließt, von denen zumindest eine ein terminaler Phenol-Ring ist und (ii) eine Größe von weniger als 1.000 Dalton aufweisen) und schließt jede Verbindung mit einem phenolischen A-Ring, wie unten definiert, ein und kann bis zu drei zusätzliche Ringstrukturen enthalten, die durch folgendes beispielhaft dargestellt sind:

  • a) Cyclopentanophen-(A)-anthrenringverbindungen mit 2, 3, oder 4 Ringen und einer Hydroxylgruppe an den Kohlenstoffatomen 1, 2, 3 und/oder 4 des A-Ringes. Zusätzlich können R-Gruppen, ausgewählt aus Natrium-, Kalium- und/oder Ammoniumsalzen an die &agr;- oder &bgr;-Positionen gebunden werden, um Wasserstoff an jedem verfügbaren Kohlenstoffatom in der Struktur zu ersetzen. Solche Verbindungen können weiter am A-Ring substituiert sein, um eine einzige OH-Gruppe zu erhalten und können weiterhin ein Pyridin, Pyriazin, Pyrimidin, s-Triazin, v-Triazin oder as-Triazin bilden.
  • b) Der Phenol-A-Ring mit möglichen zusätzlichen Substitutionen, die oben aufgelistet sind, kann weiter an einen C6-Ring mit einer oder mehreren der folgenden Strukturen gebunden sein – Benzol, Cyclohexan, 1,2-Pyran; 1,4-Pyran, 1,2-Pyron, 1,4-Pyron; 1,2-Dioxin, 1,3-Dioxin (Dihydroform); Pyridin; Pyridazin; Pyrimidin; Pyrazin; Piperazin; s-Triazin; as-Triazin, v-Triazin, 1,2,4-Oxazin; 1,3,2-Oxazin; 1,3,6-Oxazin (Pentoxazol); 1,2,6-Oxazin; p-Isoxazin; 1,2,5-Oxathiazin; 1,2,6-Oxathiazin; 1,4-2-Oxadiazin, 1,3,5,2-Oxadiazin; Morpholin (Tetrahydro-p-isoxazin). Irgendeine 6-Ring-Struktur, wie oben aufgelistet, kann an irgendeine der folgenden 5-Ring-Strukturen gebunden sein: Furan; Thiophen (Thiofuran); Pyrrol (Azol); Isopyrrol (Isoazol); 3-Isopyrrol (Isoazol); Pyrazol (1,2-Diazol); 2-Isoimidazol (1,3-Isodiazol); 1,2,3-Triazol; 1,2,4-Triazol; 1,2-Diothiol; 1,2,3,Oxathiol, Isoxazol (Furo(a)monozol); Oxazol (Furo(b)monazol); Thiazol; Isothiazol; 1,2,3-Oxadiazol; 1,2,3,4-Oxatriazol; 1,2,3,5-Oxatriazol; 1,2,3-Dioxazol; 1,2,4-Dioxazol; 1,3,2-Dioxazol; 1,3,4-Dioxazol; 1,2,5-Oxathiazol; 1,3-Oxathiol, Cyclopentan.
  • c) Irgendeine der oben aufgelisteten Verbindungen, bei denen die Cyclopentanophen-(A)-anthrenringverbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 1,3,5 (10), 6,8-Estrapentaen; 1,3,5(10), 6,8,11-Estrapentaen; 1,3,5(10), 6-Estratetraen-1,3,5(10), 7-Estratetraen; 1,3,5(10)8-Estratetraen; 1,3,5(10)16-Estratetraen; 1,3,5(10)15-Estratetraen; 1,3,5(10)-Estratrien; 1,3,5(10)15-Estratrien, besteht.

Der Begriff „ Antioxidans", wie hierin und in den Ansprüchen definiert, betrifft jedes Molekül, das eine Oxidation eines speziellen Substrates durch ein zweites Molekül verhindert. Obwohl nicht einschränkend, sind Beispiele für Antioxidantien, die in die Erfindung mit eingeschlossen sind, die folgenden:

Thiole, einschließlich Glutathion, Taurin, Cystein, Homocystein und &agr;-Liponsäure; Phenole, einschließlich Probucol, Salicylate, Trolox C, 3,4-Dihydroxytoluol, 3,4-Dihydroxyzinnaminsäure, Nordihydroxyquaiarectinsäure, 2'',4'-Dihydroxyacetophenon, 2',5'-Dihydroxyacetophenon, 3',4'-Dihydroxyacetophenon, Propylgallat; Spin-Einfangmittel, einschließlich Dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid, N-tert-Butyl-&agr;-phenylnitron, aromatische Amine, einschließlich Promethazin, Chlorpromazin, Ethoxyquin, Allopurinol, Harnsäure; Carotinoide, einschließlich &bgr;-Carotin, &agr;-Carotin, &ggr;-Carotin, Lycopen, Caratol; Flavonoide, einschließlich (+)-Catechin, Dihydroquercetin, Hesperetin, Texasin, Biochanin A, Kaempherol, Quercetin und 6,7-Dihydroxy-4'-methoxy-isoflavanol; Selen-Aminosteroide, einschließlich Trilazad-Mesylat, Methylprednisolon, Suleptanat, Lazaroide, und Ubichinone, beispielsweise Coenzym Q2, Coenzym Q10. Diese Liste ist nicht einschränkend.

Polycyclische Verbindungen mit einem terminalen phenolischen A-Ring in Kombination mit Antioxidantien zur Verbesserung der cytoprotektiven Wirksamkeit in einer synergistischen Weise

Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass ein Antioxidans im extrazellulären Milieu einen verbesserten Zellschutz bereitstellt, wenn es einem Subjekt zusammen mit einer polycyclischen Verbindung mit einem phenolischen A-Ring, beispielsweise Östrogen, in physiologisch und pharmakologisch relevanten Dosen verabreicht wird. Die verbesserte Wirkung der Kombination von polycyclischen phenolischen Verbindungen und Antioxidantien, insbesondere Verbindungen mit einer unbeträchtlichen Geschlechts-Aktivität in Verbindung mit den Antioxidantien der Thiole, insbesondere Östrogenverbindungen mit einer unbeträchtlichen Geschlechts-Aktivität und Glutathion, fördern den Zellschutz über denjenigen hinaus, der bei irgendeiner Einzelverbindung zu beobachten ist. Die Kombination antioxidativer und polycyclischer phenolischer Verbindungen einschließlich von Östrogenen weist einen Nutzen beim Schutz von Zellen vor einer Schädigung auf, die sich aus irgendeinem von mehreren Ereignissen ergibt, von denen bekannt ist, dass sie für die Zelle von Nachteil sind, einschließlich einer chemischen Schädigung, wie sie beispielsweise durch freie Radikale, exzitatorische Aminosäuren und Amyloid-Plaque verursacht wird. Beispielsweise ist die obige Kombination für die Neuroprotektion wirksamer als entweder die antioxidative oder polycyclische phenolische Verbindung alleine und präsentiert deswegen einen neuen therapeutischen Ansatz zur Behandlung eines Neuronverlustes in menschlichen Subjekten, der bei neurodegenerativen Erkrankungen, wie beispielsweise der Alzheimer Krankheit, auftritt. Zusätzlich weist die hier offenbarte Kombinationstherapie eine Nützlichkeit bei der Behandlung weiterer Krankheitsbedingungen auf, die sich aus einem gesteigerten Zelltod ergeben, einschließlich Ischämie, Verletzung und Altern.

Die obigen Beobachtungen sind eine überraschende und unerwartete Erweiterung früherer Beobachtungen, die von uns vorgenommen wurden, bei denen wir die Anwendung polycyclischer phenolischer Verbindungen mit einem phenolischen A-Ring zum Zellschutz erkannten. Wir zeigten kürzlich, dass polycyclische phenolische Verbindungen einen Schutz gegen: eine Neurodegeneration (US-A-5,859,001); einen Zelltod, der mit einer Ischämie in Verbindung steht (US-A-5,877,169); Osteoporose (US-A-5,554,601); und einen Zelltod in Geweben während der Gewebsentfernung vom Körper und der Transplantation (US-A-5,824,672) verleihen können.

Wie in 1 dargestellt ist, war die cytoprotektive Wirkung von 17&bgr;-Östradiol und Glutathion auf humane Nervenzellen (SK-N-SH) signifikant größer als die cytoprotektive Wirkung von 17&bgr;-Östradiol und Glutathion individuell bzw. einzeln. Diese Wirkung wurde beständig beobachtet, wenn die Zellen in unterschiedlichen Medien inkubiert wurden. 2 zeigt weiter diesen Effekt, wobei der maximale Zellschutz früher und bei niedrigeren Konzentrationen an Glutathion zu beobachten war, wenn 17&bgr;-Östradiol im Medium mit enthalten war. Eine ähnliche Beobachtung wurde in den 3 und 4 gemacht, wenn Glutathion in einer konstanten Menge in zunehmenden Konzentrationen von 17&bgr;-Östradiol in humanen Nervenzellen und auch primären Cortexneuronen von Ratten zugesetzt wurde. Ein markanter synergistischer Effekt wurde ebenfalls beobachtet, wenn ein Östrogen mit einer unbeträchtlichen Geschlechts-Aktivität verwendet wurde (&agr;-Östradiol) (5). 5 zeigt weiterhin Zunahmen der neuroprotektiven Wirkung um das 100- bis 600-fache für drei unterschiedliche Östrogenverbindungen. Wir haben herausgefunden, dass Estratriene eine ungefähr 1.000- bis 5.000-fache Steigerung ihrer cytoprotektiven Wirkung erfahren, wenn sie mit dem Antioxidans Glutathion verabreicht werden. In Ausführungsformen der Erfindung fällt die bei unterschiedlichen Kombinationen von Mitteln beobachtete Steigerung in den Bereich von 100-fach bis 10.000-fach. Die synergistische Wirkung eines Antioxidans und seiner Östrogenverbindung wurde weiterhin in Zellen beobachtet, denen ein Östrogenrezeptor fehlt. 6 zeigt die synergistische Wirkung von Glutathion mit 17&bgr;-Östradiol in HT22-Zellen.

Die in diesen Beispielen beschriebenen Verfahren zum Untersuchen einer cytoprotektiven Wirkung kann einfach auf das Identifizieren des Umfanges einer synergistischen Wirkung zwischen zusätzlichen polycyclischen phenolischen Verbindungen und Antioxidantien angewendet werden, über die hierin offenbarten hinaus. Weiterhin können andere Zellen als Nervenzellen gemäß der hier beschriebenen Assays verwendet werden, um die cytoprotektive Wirkung polycyclischer phenolischer Verbindungen mit Antioxidantien zu demonstrieren. Diese Assays und Anwendungen liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung, wie er hierin verkörpert ist.

Obwohl die obigen Beispiele eine Synergie unter Verwendung von Glutathion als Antioxidans beschreiben, können andere Antioxidantien verwendet werden, um den beobachteten synergistischen Effekt zu erzielen. Tabelle 1 stellt eine Zusammenfassung der Wirkungen von 17&bgr;-Östradiol zusammen mit einer Vielzahl von Antioxidantien und deren Kombination, auf Nervenzellen bereit.

Die Anmelder unterliegen keiner Verpflichtung, den Mechanismus zu erklären, durch den die Erfindung funktioniert. Jedoch wird der nachfolgende Mechanismus vorgeschlagen, um die beobachtete synergistische Wirkung zu erklären. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass Östrogenverbindungen lipophile Moleküle sind. Unter Vorgabe des lipophilen Charakters von Östrogen kann Östrogen in die Membran eingefügt werden. Aufgrund der Beobachtung, dass eine intakte phenolische Gruppe für den Zellschutz wünschenswert ist, kann der Hydroxyl-Wasserstoff gespendet werden, um die Kaskade der Membran-Lipid-Peroxidation zu vermeiden. Zusätzlich kann sich die gesteigerte Wirkstärke von Östrogenen aus ihrer Fähigkeit ergeben, aus mehreren Positionen am A-Ring zu spenden (Jellnick und Bradlow, 1990). Eine relativ stabile oxidierte Form von Östradiol kann sich aus dessen Wasserstoff Ionen-Donation ergeben. Es wird hierin vorgeschlagen, dass beispielsweise eine Glutathionperoxidase die reduzierte Form von Östrogen regenerieren kann. Dieses Enzym beruht auf GSH als sein Substrat zur Donation der Wasserstoff-Gruppe zurück an Östrogen und hatte dadurch eine Synergie zwischen der Aktivität der beiden Moleküle zur Folge.

Die Spezifität der Interaktion von Östrogenen für dieses Glutathionsystem wird durch zwei Beweislinien gestützt. Zunächst bestehen keine offensichtlichen Interaktionen, die zwischen Östrogen und anderen getesteten Thiolen, Liponsäure oder Taurin oder irgendwelchen anderen Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure oder &agr;-Tocopherol, bemerkt wurden. Es sollte erwähnt werden, dass, während &agr;-Tocopherol an sich ein starkes Antioxidans ist, argumentiert wurde, dass das Östrogen noch stärker ist. Zweitens spricht die Fähigkeit von oxidiertem Glutathion, das in diesem System funktioniert, dafür, dass Östrogen mit dem Glutathionperoxidoxidase/Reduktaseprozess interagieren kann.

Das Vorhandensein von Östrogen in Zellmembranen ist eine Wiederspiegelung der Östrogenmengen, die in den Blutstrom eingebracht wurden. Wenn Östrogen verfügbar ist, kann es sich in die Zellmembranen jeder verfügbaren Zelle ohne Spezifität einfügen, wodurch eine zellprotektive Wirkung bereitgestellt wird. Jedoch, wenn die Östrogenmengen beschränkt werden, können sich die Östrogene in erster Linie in den Membranen von Zellen befinden, die Östrogenrezeptoren tragen.

Auf Basis des obigen Mechanismus machen die Anmelder geltend, dass der sich aus dem synergistischen Effekt polycyclischer phenolischer Verbindungen und Antioxidantien ergebende Zellschutz für jede der Zellen des Körpers eintreten kann und nicht auf die hierin angegebenen Beispiele beschränkt ist. Die Anmelder haben kürzlich die zellprotektive Wirkung polycyclischer phenolischer Verbindungen alleine auf Nervenzellen, Gliazellen (US 5,554,601), Endothelzellen (US-A-5,877,169), Skelettmuskelzellen und Erythrocyten (US-A-5,824,672) demonstriert. Außerdem sollten Osteoblasten, glatte Muskelzellen, einschließlich Herzmuskelzellen, Fibroblasten und Stammzellen durch die synergistische Wirkung polycyclischer phenolischer Verbindungen und Antioxidantien geschützt werden.

Die synergistische Wirkung ist Rezeptor-unabhängig

Wir haben gezeigt, dass die beobachtete synergistische Wirkung nicht vom Kernöstrogenrezeptor (ER) abhängt. Diese Beobachtung kann zu neuen Verfahren zur Entwicklung von Arzneistoffen zur Behandlung abnormaler Zell-Verluste in Menschen führen.

Die ER-unabhängige synergistische Wirkung wurde durch Experimente unter Verwendung der murinen Nervenzelllinie (HT22) bestätigt, der ein funktioneller Östrogenrezeptor fehlt (5 und 6). Wenn diese Zellen gegenüber dem neurotoxischen &bgr;AP 25–35 exponiert wurden, wurden ungefähr 50 bis 60% der Zellen abgetötet. Eine gleichzeitige Behandlung mit jedem von drei Estratrienen, &bgr;-Östradiol, &agr;-Östradiol oder Estratrien-3-ol, hatte eine dosisabhängige Neuroprotektion zur Folge (5). Das Vorliegen einer spezifischen 3H-Östradiolbindung sowohl an Kernextrakte als auch Ganzzellzubereitungen wurde durch Assays bestimmt, die von Miranda et al., J. Neurobiol 31 (1996), 77 bis 87, und von Nakao et al., Arteriosclerosis 38 (1981), 75 bis 80, beschrieben wurden. Die Bindung von Östradiol an HT22 Zellen wurde mit der Bindung an MCF-7-Zellen, die den ER-Rezeptor tragen, verglichen. HT22-Zellen zeigten keine spezifische Bindung in jedem Assay mit nur 63,93 fmol spezifischer Bindung pro Million Zellen im Vergleich zu 566,5 für die ER positive MCF-7-Zelllinie in der Gesamtzellzubereitung und 0,05 fmol pro Million Zellen im Vergleich zu 35,21 für die MCF-7-Zelle im rohen bzw. unbehandelten Kern-Pellet. Der durch physiologische Dosen von Östrogenen auf diese Zellen übertragene Schutz bestätigt, dass ein Hauptanteil der protektiven Wirkungen der Östrogene vom ER unabhängig ist.

Es sollte erwähnt werden, dass, während &bgr;-Östradiol ein Geschlechtshormon ist und von diesem bekannt ist, dass es über den Östrogenrezeptor wirkt, &agr;-Östradiol und Estratrien-3-ol im Allgemeinen gemäß dem Stand der Technik als biologisch inaktiv angenommen werden. Diese Verbindungen sind alle Beispiele für polycyclische phenolische Verbindungen. Die Erfindung umfasst die Verwendung jeder Klasse polycyclischer phenolischer Verbindungen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, an den Östrogenrezeptor zu binden.

Wir testeten Östradiol, gebunden an Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin = BSA), um zu bestimmen, ob Östradiol HT22-Zellen vor &bgr;AP (25–35) schützen könnte, wenn Östrogen auf die extrazelluläre Umgebung beschränkt wurde. Eine Immobilisierung des Steroids durch BSA-Konjugation (17&bgr;-Östradiol-6-(carboxymethyl)oxim: BSA, das 20 &mgr;M 17&bgr;-Östradiol enthielt) beseitigte die Fähigkeit des Steroids, HT22-Zellen vor einer &bgr;AP (25–35) Toxizität in Gegenwart von GSH zu schützen (Beispiel 2a, Tabelle 2). Dies stimmt mit ähnlichen Beobachtungen mit SK-N-SH-Zellen überein. Kollektiv legen diese Daten die Erwünschtheit einer freien Interaktion der Estratriene mit der Zellmembran oder dem intrazellulären Raum nahe, um ihre neuroprotektiven Wirkungen hervorzurufen.

Die in diesen Studien verwendete Dosis von GSH wies keine Wirkung auf &bgr;AP (25–35) induzierte Toxizität per se auf, insofern als &bgr;AP (25–35) eine 54 ± 4% und eine 553% Abnahme der Zelllebensfähigkeit in An- und Abwesenheit von 3,25 pM GSH jeweils verursachte. Jedoch zeigte eine GSH-Dosis von 325 &mgr;M einen signifikanten Schutz vor einer &bgr;AP-Toxizität in SK-N-SH-Neuroblastomzellen (2). Weiterhin verursachte eine Exposition von HT22-Zellen gegenüber 3,25 &mgr;M GSH alleine, 200 nM 17&bgr;-Östradiol alleine oder beides in Kombination keine Zunahme der Zellzahl in Abwesenheit eines Insultes (6), was darauf hinweist, dass die Zunahme der Zellzahl auf einen Schutz und nicht auf eine mitogene Wirkung der Verbindungen zurückzuführen ist.

Anwendungen des beobachteten synergistischen Effektes zwischen polycyclischen phenolischen Verbindungen und Antioxidantien

Eine pharmazeutische Zubereitung, die eine polycyclische phenolische Verbindung und ein Antioxidans einschließt, kann zur Behandlung von Subjekten verwendet werden, die unter einer Verletzung, chronischen degenerativen Erkrankungen oder einer akuten Krankheit, beispielsweise einem ischämischen Anfall, induziert wurden. Beispiele schließen die Alzheimer'sche Krankheit, die Parkinson'sche Krankheit, einen Schlaganfall, eine Ischämie, eine Herzattacke oder eine Angioplastie ein, oder eine Verletzung des Gehirns oder des Rückenmarks, eine Hypoglykämie, Anoxie, Verbrennungen oder chirurgische Eingriffe, die den Verlust der Nährstoffzufuhr zu den Geweben zur Folge haben.

Ausführungsformen der Erfindung können weiterhin auf das Verfahren der Gewebstransplantation vor, während oder nach der Entfernung oder Reperfusion von Zellen, Geweben oder Organen oder während der Aufbewahrung der Zellen, von Gewebe oder von Organen angewendet werden und ist auf jede der Zellen im Körper anwendbar. Die folgenden Beispiele werden nicht zur Einschränkung, sondern zur Veranschaulichung der neuen biologischen Wirkung der Erfindung präsentiert.

Beispiel 1 Die synergistische Wirkung eines Antioxidans mit einer polycyclischen phenolischen Verbindung unter Verwendung von SK-N-SH-Nervenzellen des Menschen

Glutathion wurde als Antioxidans ausgewählt und 17&bgr;-Östradiol wurde als polycyclische Verbindung ausgewählt. Der Assay verwendete die humanen Neuroblastomzellen SK-N-SH. Die Zellen wurden mit Toxinen behandelt, von denen bekannt ist, dass sie den Zelltod verursachen, zu finden in Amyloidplaque-&bgr;AP (1–40) und &bgr;AP (25–35). Die Zahlen im Anschluss an „AP" entsprechen der Größe und dem Typ des Proteinfragmentes, das durch die Aminosäureresteanzahl identifiziert wird.

Materialien: Lyophilisiertes &bgr;AP 25–35 (1 mg) (Bachem, Torrance, CA) wurden zu Beginn in 200 &mgr;l ddH2O gelöst und unter Zusatz von 800 &mgr;l PBS war eine schnelle Aggregation zu beobachten. 17&bgr;-Östradiol (17&bgr;-Östradiol, Steraloids, Wilton, NH) wurden zu Beginn zu 10 mg/ml in absolutem Ethanol gelöst (Fisher Scientific Inc., Orlando, FL) und in Zellkulturmedien verdünnt, um die notwendigen Konzentrationen zu erzielen. &agr;-Tocopherolacetat wurde zu Beginn in 200 &mgr;l absolutem Ethanol gelöst und in Zellkulturmedien bis zu den geeigneten Konzentrationen verdünnt. Liponsäure (Thiotinsäure), Taurin (2-Aminoethansäure) und Ascorbinsäure wurden zu Beginn in Zellkulturmedien gelöst und in den angegebenen Konzentrationen verwendet. Soweit nichts anderes angemerkt ist, wurden die Materialien von Sigma Chemical Corp. bezogen.

SK-N-SH-Neuroblastomzellkultur: SK-N-SH-Neuroblastomzellen wurden von der American Type Tissue Collection (Rockville, MD) bezogen. Die Zellkulturen wurden bis zur Konfluenz in RPMI-1640 Medium (Fisher Scientific, Inc.), ergänzt mit 10% Kohle/Dextran-behandeltem fötalem Rinderserum (FBS), (Hyclone®, Logan, UT), 100 U/ml Penicillin G und 100 mg/ml Streptomycin (Sigma Chemical Corp.) in Monolayers in 150 cm2 Kolben von Corning (Fisher Scientific, Inc.) bei 37°C unter 5% CO2, 95% Luft gezüchtet. Die Medien wurden dreimal wöchentlich ausgetauscht. Die Zellen wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop (Nikon Diaphot-300) beobachtet.

(a) SK-N-SH-Zellen, die in den nachfolgenden Experimenten verwendet wurden, befanden sich in den Umläufen 4 bis 12. Die Wachstumsmedien wurden zu Beginn dekantiert und die Zellen wurden mit 0,02% EDTA für 30 min bei 37°C gespült. Die Zellen wurden dann auf einen Neubauer Hämocytometer (Fisher Scientific) gezählt und in geeigneten Medien resuspendiert. Die Studien wurden durch Ausplattieren von 1 × 106 Zellen pro Well in 24 Well Platten begonnen, wodurch die Anlagerung in regulären Medien ermöglicht wurde und darauf durch Dekantieren des Mediums und Ersetzen mit der geeigneten Behandlung nach 4 h. Zellen wurden in DMEM oder RPMI-1640 ohne GSH (reduziert) kultiviert, mit 10% FBS und Antibiotika ergänzt, mit absolutem Ethanol als Trägerkontrolle, oder durch Zusatz von &bgr;AP 25–35 (20 &mgr;M), 17&bgr;-Östradiol (0,002 bis 200 nM), GSH (0,0325 bis 325 &mgr;M), &agr;-Tocopherolacetat (50 &mgr;M), Ascorbinsäure (100 &mgr;M), Liponsäure (10 &mgr;M), Taurin (5 mM) oder einer Kombination, wie angezeigt, ergänzt. Die 20 &mgr;M Konzentration von &bgr;AP wurde ausgewählt, weil wir gezeigt haben, dass sie dem LD50 für dieses Peptid nahe liegt (Green et al., 1996). Die Auswahl von Konzentrationen für das Antioxidans wurden auf Grundlage vorläufiger Dosis-Wirkungsauswertungen vorgenommen, die dazu verwendet wurden, die Konzentration zu bestimmen, bei der eine Neuroprotektion nicht erzielt wurde.

Die SK-N-SH-Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens (Black and Berenbaum, 1964; Tennant, 1964) bestimmt. Nach 72 h Inkubation wurden die Behandlungsmedien dekantiert und die Zellen wurden durch Inkubieren mit 0,2 ml 0,02% EDTA für 30 min bei 37°C abgehoben. Die Zellen wurden durch wiederholtes Pipettieren suspendiert. 100 &mgr;l Teilmengen aus jeder Zellsuspension wurden mit 100 &mgr;l Teilmengen 0,4% Trypanblau-Färbung für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Suspensionen wurden auf einem Neubauer Hämocytometer innerhalb von 10 min nach Zusatz von Trypanblau-Färbungen gezählt. Zwei unabhängige Zählungen lebender und toter Zellen wurde für jede Teilmenge durchgeführt.

Tabelle 1

Tabelle 1. Wirkungen von 17&bgr;-Östradiol (17&bgr;-Östradiol), einer Vielzahl von Antioxidantien und deren Kombination auf die &bgr;AP 25–35 induzierte Toxizität auf die Anzahl lebender SK-N-SH-Zellen. Die Zahlen zeigen die Zahlen lebender Zellen an
–p < 0,05 gegen Vehikel behandelte Kontrollen
x
p < 0,05 gegen &bgr;AP behandelte Kontrollen
TRT
Behandlung mit dem angezeigten Antioxidans

Statistik: Die signifikanten Behandlungseffekte auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurden unter Verwendung von ANOVA, gefolgt von Scheffe's post-hoc-Test, bestimmt, mit einer Signifikanz, die bei p < 0,05 bestimmt wurde. Für Dosiswirkungsauswertungen wurden die EC50-Werte durch zufallsbedingtes Zuordnen der Zellzahlen zu den angezeigten Dosen berechnet, um 3 bis 5 Linien pro Behandlung zu erzeugen und durch Bestimmung des Mittelwertes für diese Linien. Die nicht parametrische Mann-Whitney Rangsummenanalyse wurde für die EC50-Werte verwendet, weil die Varianzen für die Standardabweichung nicht äquivalent waren. Vergleiche zwischen Dosiswirkungsbeziehungen wurden unter Verwendung des zweiseitigen ANOVA berechnet, um die Signifikanz von GSH oder der 17&bgr;-Östradiol-An- bzw. -Abwesenheit zu bestimmen.

(b) Humane SK-N-SH wurden in 96 Well Platten in einem RPMI-Medium, dem Glutathion fehlte, rückkultiviert. 4 h später wurde eine Gruppe von Zellplatten simultan mit dem neurotoxischen &bgr;-Amyloidprotein &bgr;AP 25–35 behandelt: (20 &mgr;M) und eine Reihe von Konzentrationen von Glutathion im Bereich von 0 bis 325 &mgr;M. Eine zweite Gruppe von Zellplatten wurde gleichzeitig mit A&bgr; 25–35: (20 &mgr;M), einer Reihe von Glutathionkonzentrationen im Bereich von 0 bis 325 &mgr;M und einer Einzeldosiskonzentration von 17&bgr;-Östradiol (2 nM) behandelt. Nach 72 h Inkubation wurden die lebenden Zellen mit Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Wie in 2 dargestellt, wies in Abwesenheit von 17&bgr;-Östradiol Glutathion einen ED50 von 32,5 &mgr;M auf und zeigte eine nur geringe neuroprotektive Wirkung bei 3,25 &mgr;M. Im Gegensatz hierzu zeigte das Vorhandensein von 17&bgr;-Östradiol einen ED50 von 0,325 &mgr;M, der eine 1.000-fach höhere Neuroprotektivität als mit Glutathion alleine bereitstellte.

(c) Unter Verwendung des oben beschriebenen Assays wurden SK-N-SH-Zellen mit A&bgr; 25–35 (20 &mgr;M), einer einzigen Konzentration Glutathion (3,25 &mgr;M) und variablen Konzentrationen von 17&bgr;-Östradiol im Bereich von 0 bis 200 nM behandelt. Nach 72 h Inkubation wurden die Zellen mit Trypanblau gefärbt. Eine Neuroprotektion wurde in Konzentrationen von 200 nM &bgr;-Östradiol in Abwesenheit von Glutathion mit einem ED50 von 100 nM beobachtet. In Gegenwart von Glutathion und &bgr;-Östradiol war die ED50 0,02 nM. Somit erreicht die neuroprotektive Wirkstärke von 17&bgr;-Östradiol in Gegenwart von Glutathion den 5.000-fachen Wert im Vergleich zur Abwesenheit von Glutathion (3).

Die alleine durch 17&bgr;-Östradiol bereitgestellte Neuroprotektion war 628-fach weniger als in Gegenwart von GSH. Im Anschluss an eine &bgr;AP (1–40) Behandlung von Zellen, ergab eine 200 nM 17&bgr;-Östradioldosis 99,9% bzw. 35,6% Schutz in Gegenwart und Abwesenheit von GSH (1). &agr;-17-E2 und E-3-ol-östrogene verhielten sich beide ähnlich mit einer ED50 von 6 nM bzw. 14 nM in Gegenwart von GSH und einer ED50 von 1.014 nM und 3.683 nM in Abwesenheit von GSH.

Beispiel 2

Die synergistische neuroprotektive Wirkung eines Antioxidans mit einer polycyclischen phenolischen Verbindung auf murine Nervenzellen, denen funktionelle Östrogenrezeptoren fehlen (HT22) unter Verwendung eines in vitro Assays.

(a) Wirkungen von 17&bgr;-Östradiol und 17&bgr;-Östradiol-6-(carboxymethyl)oxim: BSA-Konjugat an &bgr;AP 25–35 induzierte Toxizität an HT22-Zellen

Die Experimente wurden durch Ausplattieren von Zellen in Nunc 24 Well Platten begonnen und man ließ die Zellen für 4 h vor der Behandlung anhaften. Die Zellen wurden gegenüber 20 &mgr;M &bgr;AP 25–35 in Gegenwart der angezeigten Dosis von 17&bgr;-Östradiol oder 17&bgr;-Östradiol-BSA in RPMI-Medium exponiert, das 3,25 &mgr;M GSH enthielt. Nach 48 h wurden die Zellen suspendiert und die Lebensfähigkeit unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode bestimmt (Tennant J. R. (1964), Transplantation 2 (1964), 685 bis 694. Steroide und &bgr;AP wurden, wie vorher beschrieben, zubereitet (Green et al., Neuroscience Lett. 218 (1996), 165 bis 168). Die Daten wurden durch einseitige Varianzanalyse untersucht und eine Scheffe's post-hoc-Analyse wurde für einen geplanten Vergleich zwischen den Gruppen verwendet. Die Daten sind als Durchschnittswert ± Standardabweichung des Durchschnittswertes für 4 Wells pro Gruppe angegeben. *= p < 0,05 gegen die &bgr;AP (20 &mgr;M) Gruppe.

Tabelle 2

Tabelle 2. Wirkungen von 17&bgr;-Östradiol und 17&bgr;-Östradiol-6-(carboxymethyl)oxim: BSA-Konjugat auf eine &bgr;AP (25–35) induzierte Toxizität auf HT22-Zellen
(b) Wirkungen von Estratrienen in Gegenwart und Abwesenheit von Glutathion auf die durch &bgr;AP 25–35 in HT22-Zellen induzierte Neurotoxizität.

Die Experimente wurden durch Ausplattieren von Zellen in Nunc®24 Well Platten begonnen. Man ließ die Zellen für 4 h vor der Behandlung anhaften. Die Zellen wurden gegenüber 20 &mgr;M &bgr;AP in Gegenwart der angezeigten Dosis von 17&bgr;-Östradiol oder &agr;17-E2 oder E-3-ol (0 bis 20.000 nM) entweder in RPMI-Medium, das 3,25 &mgr;M GSH enthielt oder RPMI-Medium, ohne GSH enthielt, exponiert. Nach 48 h wurden die Zellen suspendiert und die Lebensfähigkeit unter Verwendung des Trypanblaufarbstoff-Ausschlussverfahrens bestimmt (Tennant (1964). Steroide und &bgr;AP wurden, wie vorher beschrieben, hergestellt (Greene et al. (1996)). Die ED50-Werte wurden durch zweiseitige Varianzanalyse untersucht. Die Unterschiede zwischen den Effekten wurde durch eine Scheffe's post-hoc-Analyse mit einem p < 0,05, der als signifikant betrachtet wurde, bestimmt. Die Glutathionwirkung ist mit einem p < 0,001 signifikant. Die Daten wurden mit der &bgr;AP freien Kontrollgruppe als 100% Schutz vereinheitlicht bzw. normiert und mit der &bgr;AP alleine Gruppe als 0% Schutz. Der Durchschnitt ± Standardabweichung d. M. für 3 bis 5 Well pro Gruppe ist in 3 dargestellt.

(c) Wirkungen von 17&bgr;-Östradiol in Gegenwart und Abwesenheit von Glutathion auf die durch &bgr;AP (1–40) in HT22-Zellen induzierte Neurotoxizität.

Die Experimente wurden, wie in Beispiel 2 (b) beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass &bgr;AP (1–40) 4 Tage vor Verdünnung zu 20 &mgr;M in den Kulturmedien inkubieren gelassen wurde. Die Alterung von &bgr;AP ist notwendig, um das Peptid zu aggregieren, um die toxische Wirkung auf die Zellen zu erbringen (Pike et al., J. Neurosci. 13 (1993), 1676 bis 1687). Die Daten wurden als Durchschnitt ± Standardabweichung für 3 bis 4 Wells pro Gruppe präsentiert. Die Daten wurden durch einseitige Varianzanalyse analysiert und ein p < 0,05 wurde als signifikant betrachtet (5).

Die in 5 und 6 dargestellten Ergebnisse zeigen die neuroprotektive Wirkung mit beiden GSH mit &bgr;-Östradiol auf HT22-Zellen im Anschluss an eine Behandlung mit einem von zwei Typen des Neurotoxins &bgr;AP. Eine synergistische Interaktion zwischen neuroprotektiven Östrogenen und dem durch das intrazelluläre Antioxidans GSH verliehenen Schutz wurde beobachtet. 17&bgr;-Östradiol, das wirkstarke natürlich vorkommende Östrogen, schützte HT22-Zellen vor einem durch das neurotoxische Amyloidfragment &bgr;AP (25–35) induzierten Zelltod mit einer ED30 von 5 nM und erbrachte eine signifikante Neuroprotektion mit 2 nM des Steroids und 3,25 pM GSH (5).

Beispiel 3 Die neuroprotektive Wirkung der Östrogenverbindungen mit einem Antioxidans auf primäre kortikale Nervenzellen der Ratte

Um sicherzustellen, dass der in den Beispielen 1 und 2 beobachtete synergistische Effekt nicht auf die Zellherkunft oder Tumorigenität zurückzuführen war, führten wir ähnliche Experimente in kortikalen primären Rattenneuronen durch.

Primäre kortikale Ratten-Kultur: Primäre Nervenzellkulturen wurden gemäß des von Chandler et al. verwendeten Verfahrens hergestellt: Alcoholism: Clinical and Experimental Research 17 (1993), 54 bis 60.

Die Behandlungen wurden direkt am Kulturtag 10 auf primäre Kulturen angewendet, unter Aufrechterhaltung eines konstanten Volumens, das ohne Rücksicht auf die folgende Behandlung zugesetzt wurde: Kontrollen: Absoluter Ethanol und PBS, Proben: &bgr;AP 25–35 (10 &mgr;M), 17&bgr;-Östradiol (0,02 nM–2 &mgr;M), GSH (3,25 &mgr;M) oder Kombinationen, wie angezeigt. Wenn einmal die Behandlungen zugesetzt wurden, wurden die primären Kulturen für zusätzliche 24 h inkubiert und die Lebensfähigkeit unter Verwendung des LIVE/DEAD® Lebensfähigkeits-/Cytotoxizitäts-Kits (Molecular Probes, Eugene, OR) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Lebende Zellen werden durch das Vorhandensein einer intrazellulären Esteraseaktivität unterschieden, die den Calcein-AM-Farbstoff spaltet, wodurch eine hellgrüne Fluoreszenz nach Anregung erzeugt wird. Das Ethidiumhomodimer dringt in die Zellen mit geschädigten Membranen ein und erzeugt nach der Bindung an Nucleinsäuren eine rote Fluoreszenz. Beide Farbstoffe werden bei 485 nm angeregt und Kulturplatten wurden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (Nikon Diophot-300) betrachtet. Drei zufällig ausgewählte Felder wurden fotografiert und die durchschnittliche Zahl lebender Zellen pro Feld wurde durch Zählen der Anzahl hellgrüner Zellen bestimmt. Erneut wurde die Fähigkeit von Östradiol in Gegenwart und in Abwesenheit von GSH (3,25 &mgr;M) ausgewertet (x). Der Zusatz von &bgr;AP 25–35 (10 &mgr;M) zu primären kortikalen Neuronen hatte eine 39 bis 40%ige Reduktion der durchschnittlichen Zahl lebensfähiger Zellen pro Feld in An- und Abwesenheit von GSH jeweils zur Folge (4). Wenn zunehmende Dosen von 17&bgr;-Östradiol mit &bgr;AP 25–35 ausgewertet wurden, war die 200 &mgr;M Dosis von 17&bgr;-Östradiol die am niedrigsten als protektiv gefundene Dosis, was voll mit unseren SK-N-SH-Zelllinienstudien übereinstimmt (1 bis 3). Mit Zusatz von GSH (3,25 &mgr;M) zu 17&bgr;-Östradiol waren alle Dosen von 17&bgr;-Östradiol von 2 &mgr;M oder höher protektiv (4). Eine Auswertung der EC50-Werte zeigt ähnliche Veränderungen der Wirkstärke von 68,1 ± 79 &mgr;M in Abwesenheit von GSH bis 4,3 ± 5,9 &mgr;M in Anwesenheit von GSH. Desgleichen zeigte die Auswertung der Wirkung von GSH auf die neuroprotektive Wirkung von 17&bgr;-Östradiol in primären Rattenkulturen unter Verwendung eines zweiseitigen ANOVA einen signifikanten Effekt (F: 8,53; p < 0,005).


Anspruch[de]
  1. Zellschützende Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine polyzyklische Phenol-Verbindung und eine Antioxidationsmittel-Verbindung umfasst, und einer Population von Zellen in Fällen einer chronischen degenerativen Erkrankung, akuten Erkrankung, des Alterns, einer Verletzung, der Osteoporose, von Verbrennungen, einer Gewebstransplantation und eines chirurgischen Eingriffes Zellschutz verleiht, die einen Verlust der Nährstoff-Flusses zum Gewebe zur Folge haben, wobei die polyzyklische Phenol-Verbindung (i) zwei oder mehrere Ringstrukturen einschließt, von denen zumindest eine ein endständiger Phenol-Ring ist und (ii) eine Größe von weniger als 1.000 Dalton aufweist, und die aus 2, 3 oder 4 Ring-Cyclopentanophen (A) anthren-Ringverbindungen mit einer Hydroxyl-Gruppe an den Kohlenstoffen 1, 2, 3 und/oder 4 des A-Ringes ausgewählt ist.
  2. Formulierung nach Anspruch 1, wobei die polyzyklische phenolische Verbindung eine Östrogenverbindung ist, die vorzugsweise eine unbeträchtliche geschlechtsbezogene Wirkung aufweist.
  3. Formulierung nach Anspruch 2, wobei die Östrogenverbindung ein Estratrien ist.
  4. Formulierung nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Antioxidationsmittel aus einem Thiol, einem Phenol, einem Spineinfangmittel, einem aromatischen Amin, einem Karotinoid, einem Flavonoid, einem Selen-Aminosteroid und einem Ubichinon ausgewählt ist.
  5. Formulierung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das Antioxidationsmittel ein Glutathion ist.
  6. Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei eine beobachtete synergistische Wirkung auf den Zellschutz der Bindung der polyzyklischen Phenol-Verbindung an die Antioxidationsmittel-Verbindung zuzuschreiben ist.
  7. Formulierung nach Anspruch 6, wobei die synergistische Wirkung im Bereich von 100 bis 10.000 fach erfolgt.
  8. Formulierung nach einem der Ansprüche 1–7, wobei der Zellschutz in Fällen der Alzheimer Krankheit, Parkinsonschen Krankheit, Ischämie oder Schlaganfall verliehen wird.
  9. Formulierung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei die Population der Zellen Nervenzellen, kardiovaskuläre Zellen, zerebrovaskuläre Zellen oder Körperzellen sind, die einem ischämischen Ereignis ausgesetzt worden sind.
  10. Verwendung einer polyzyklischen Phenol-Verbindung in Verbindung mit einer Antioxidationsmittel-Verbindung zur Herstellung eines Medikamentes, das einer Population von Zellen in Fällen einer chronischen degenerativen Erkrankung, einer akuten Erkrankung, des Alterns, einer Verletzung, der Osteoporose, von Verbrennungen, einer Gewebstransplantation und einem chirurgischen Eingriff, die einen Verlust eines Nährstoff-Flusses an Gewebe zur Folge haben kann, Zellschutz verleiht, wobei die polyzyklische Phenol-Verbindung (i) zwei oder mehrere Ringstrukturen einschließt, von denen zumindest eine ein endständiger Phenol-Ring ist und (ii) eine Größe von weniger als 1000 Dalton aufweist, und die aus 2, 3 oder 4 Ring Cyclopentanophen (A) anthren-Ringverbindungen ausgewählt ist, die eine Hydroxylgruppe an den Kohlenstoffen 1, 2, 3 und/oder 4 des A-Ringes aufweisen.
Es folgen 7 Blatt Zeichnungen






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