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Dokumentenidentifikation DE69632141T2 31.03.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000854914
Titel LEBENDIMPFSTOFF TRAGENDE STÄMME ZUR STARKEN EXPRESSION VON HETEROLOGEN O-ANTIGENEN GRAM-NEGATIVER PATHOGENE UND DERIVATEN HIERVON ZUM GEBRAUCH ALS LEBEND-IMPFSTOFFE
Anmelder Berna Biotech AG, Bern, CH
Erfinder FAVRE, Didier, CH-3186 Düdingen, CH;
CRYZ, J., Stanley, CH-3176 Neuenegg, CH;
VIRET, Jean-François, CH-3177 Laupen, CH
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69632141
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 04.10.1996
EP-Aktenzeichen 969345487
WO-Anmeldetag 04.10.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/EP96/04334
WO-Veröffentlichungsnummer 0097014782
WO-Veröffentlichungsdatum 24.04.1997
EP-Offenlegungsdatum 29.07.1998
EP date of grant 07.04.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 31.03.2005
IPC-Hauptklasse C12N 1/21
IPC-Nebenklasse A61K 39/116   A61K 39/112   A61K 39/106   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft lebende Trägerstämme für abgeschwächte Gram-negative Impfstoffe, die für die Expression und Lieferung von heterologen O-Antigenen (O-PS) von Gram-negativen Pathogenen nützlich sind. Diese Stämme sind aufgrund einer definierten Deletion innerhalb des rfbA-, rfbB-, rfbD- und/oder rfbE-Gens oder jeder Kombination hieraus nicht in der Lage, homologes O-PS zu exprimieren und können daher ein gewünschtes heterologes O-PS in ausreichender Menge exprimieren, um eine Immunantwort auszulösen, und zwar in der Weise, dass es entweder an den homologen oder den heterologen LPS-Kern des Lipid A kovalent gebunden ist. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Lebendimpfstoff tragenden Stämme, die ein heterologes Gen oder eine Gruppe heterologer Gene enthalten, die O-PS codieren. Bevorzugt enthalten diese Stämme zusätzlich Gene, die für die Synthese des vollständigen, glatten, heterologen LPS notwendig sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch aus diesen Stämmen bestehende Lebendimpfstoffe, bevorzugt zur Immunisierung gegen Gram-negative Entero-Pathogene (enterische Pathogene).

Gram-negative enterische Pathogene sind die Ursache für eine Reihe von Krankheiten, die ein breites Spektrum an Symptomen aufweisen, das von leichtem, wässrigen Durchfall bis zu ernsten, lebensbedrohenden Symptomen wie Fieber, blutigem Durchfall, Perforation oder Geschwürbildung in Magen oder Darm, einzeln oder in Kombination reicht. Beispiele solcher Krankheiten schließen ein typhoides Fieber, Shigellose, Cholera, Infektionen mit enterotoxinogenen, enteropathogenen und enterohämorrhagischen Escherichia coli und Infektionen mit Heliobacter pylori und Campylobacter jejuni.

Das erste Stadium des Infektionsprozesses findet an der Schleimhaut-Oberfläche innerhalb des Verdauungstraktes statt. Daher bietet das Einschreiten in diesem anfänglichen Stadium der Infektion vor dem Eintreten der Symptome einen besonders attraktiven Ansatz. Die wirksamste Maßnahme, mit der dies erreicht werden kann, wäre, eine örtliche schützende Immunantwort durch den Einsatz eines oral verabreichten Impfstoffes hervorzurufen. (Mestecky, J. Clin. Immunol. 7 (1987), 265–276; McGhee und Kiyono, Infect. Agents Dis. 2 (1993), 55–73; Walker, Vaccine 12 (1994), 387–400). Zur Zeit sind 2 orale, abgeschwächte Impfstoffe gegen enterische Erkrankung für die Anwendung beim Menschen zugelassen, dies sind der Ty21a-Stamm von Salmonella typhi zum Schutz vor thyphoidem Fieber und der CVD103-HgR-Stamm von Vibrio cholerae zum Schutz vor Cholera (Germanier und Fürer, 7. Infect. Dis. 131 (1975), 553–558; Levine et al., Lancet ii (1988), 467–470).

Es gibt eine große Anzahl von Hinweisen, die darauf hin deuten, dass Schutz gegen zahlreiche enterische Pathogene, wie etwa S. typhi, E. coli, und Shigella-Arten, mit dem Hervorrufen einer Immunantwort gegen Bestandteile der Zelloberflächen verbunden ist, besonders der O-Antigen-Einheit von LPS, allgemein als O-Polysaccharid (O-PS) bezeichnet. Zum Beispiel ist die Immunität gegen Shigellose nach Erholung von einer entweder natürlich erworbenen oder experimentell ausgelösten Erkrankung mit einer wesentlichen Erhöhung von Serotyp-spezifischen anti-LPS-Antikörpern verbunden (DuPont et al., J. Infect. Dis. 125 (1972), 5–11; Dupont et al., J. Infect. Dis. 12 (1972), 12–16; Herrington et al., Vaccine 8 (1990), 353–357). Darüber hinaus haben epidemiologische Felduntersuchungen auch ergeben, dass Schutz gegen Shigella-Infektionen mit erhöhten Spiegeln von anti-LPS-Antikörpern verbunden waren (Cohen et al., J. Infect. Dis. 157 (1988), 1068–1071 ). Hohe Spiegel von Serum-Antikörpern gegen Shigella-LPS können bei Individuen gefunden werden, die in Gebieten leben, in denen solche Arten von Shigella endemisch sind, vermutlich durch natürliche Exposition und/oder Infektion mit diesen Pathogenen erworben.

LPS ist ein wesentlicher Bestandteil der Gram-negativen äußeren Membran und kann bis zu 70% der, Zelloberflächen-Bestandteile ausmachen. LPS ist aus 3 Regionen zusammengesetzt:

im Innersten befindet sich Lipid A, das in die äußere Phospholipid-Doppelmembran eingebettet ist. Das Kern-Polysaccharid ist normalerweise über 2-Keto, 3-Desoxyoktonat (KDO) mit der Lipid A-Einheit verbunden. Der Kern besteht normalerweise aus 5 bis 7 Zuckern. Bis heute sind 7 Typen der Kernmoleküle innerhalb der Familie der Enterobacteriaceae identifiziert und mit Ra, R1, R2, R3, R4, K-12 und B benannt worden. Im Vergleich mit den Enterobacteriaceae besitzt V. cholerae eine ungewöhnliche Kernstruktur, indem es Fruktose und ein einzelnes KDO-Molekül im inneren Kern enthält (Kondo et al., Carbohydrate Res. 231 (1992), 55–64). Die Biosynthese des LPS-Kerns wird vom rfa-Genort kodiert. Bei den Enterobacteriaceae scheinen die rfa- und rfb-Genorte nicht verbunden zu sein. Im Gegensatz dazu bestehen einige Hinweise, die bei V. cholerae ein enge Koppelung von zumindest Teilen dieser beiden Genorte vermuten lassen (Manning et al., S. 77–94. In Vibrio cbolerae and Cholera: molecular tc global perspectives (1994); Wachsmuth K., Blake, P. A., und Olsvik, Ø. (Hrsg.), Washington, D. C.: American Society for Microbiology).

Der äußerste Teil des LPS-Moleküls ist aus dem O-PS zusammengesetzt, das aus sich wiederholenden Saccharid-Einheiten mit unterschiedlicher Länge besteht. (Lüderitz et al., Curr. Top. Membr. Trans. 17 (1982), 79–151; Raetz, Annu. Rev. Biochem. 59 (1990), 129–170). Die O-PS-Region des LPS-Moleküls macht die Serospezifität der Bakterien aus. Das LPS-Molekül tritt eng mit anderen Molekülen in Wechselwirkung, die auf der äußeren Membranoberfläche exprimiert werden, wie etwa Porine und andere äußere Membranproteine (OMP), die die Permeabilität der äußeren Membran bestimmen. Es ist bekannt, dass die Anordnung von OMP, wie auch die Sekretion von Proteinen aus der Zelle durch Mutationen im LPS von E. coli beeinträchtigt werden (Laird et al., J. Bactertol. 176 (1994), 2259–2264; Stanley et al., Mol. Microbiol. 10 (1993), 781–787).

Serospezifität ist nicht nur durch die Zucker bedingt, die im O-PS vorhanden sind, sondern auch durch ihre chemische Bindung und Sequenz (Lüderitz et al., Curr. Top. Membr. Trans. 17 (1982), 79–151). Daher ist das O-PS bei den Gram-negativen Bakterienarten hoch variabel, das Kern-Polysaccharid hingegen ist innerhalb einer gegebenen Art oder Gattung relativ konstant (Lüderitz et al., Curr. Topics in Membranes and Transport 17 (1982), 79–151; Jansson et al., Eur. J. Biochem. 115 (1981), 571–577). Zum Beispiel umschließt die Gattung Shigella eine Gesamtheit von 47 bekannten Serotypen, aufgeteilt unter den 4 vorherrschenden pathogenen Arten S. dysenteriae (Untergruppe A, 12 Serotypen), S. flexneri (Untergruppe B, 13 Serotypen), S. boydii (Serogruppe C, 18 Serotypen) and S. sonnei (Untergruppe D, 1 Serotyp) (Ewing, in: Ewing WH, Hrsg. Edwards and Ewing's identification of Enterobacteriaceae, 4. Auflage, New York: Elsevier Sci. Publish. Comp. (1986), 135–172). Zum Beispiel besteht das O-PS in S. sonnei aus einer wiederholten Disaccharid-Einheit mit zwei ungewöhnlichen Zuckern, 2-amino-2-desoxy-L-Alturonsäure, verbunden mit 2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-D-Galactose durch eine 1,4 Bindung (Kenne et al., Carbohydrate Res. 78 (1980), 119-. 126). Im Gegensatz dazu besteht das O-PS des Serotyp 1 von S. dysenteriae (welches der häufigste Verursacher von Dysenterie ist) aus wiederholten Blöcken aus Rhamnose-Rhamnose-Galactose-N-Acetylglucosamin (Ewing und Lindberg, in: Bergan T. (Hrsg.) Methods in Microbiology Bd. 14., Academic Press, London, S. 113–142). Das O-PS von V. cholerae O1 besteht aus 17–18 Perosamin-Untereinheiten, wobei jede mit 3-deoxy-L-glycero-Tetronsäure acyliert ist. Quinovosamin ist ebenfalls in niedrigen Konzentrationen gefunden worden, aber seine Lage innerhalb des O-PS von V. cholerae O1 ist nicht bekannt (Redmond, FEBS Lett. 50 (1975), 147–149; Kenne et al., Carbohydrate Res. 100 (1982), 341–349).

Die für die Biosynthese enterobakterieller O-PS benötigten Enzyme werden durch den rfb-Genort kodiert. Im Falle von Shigella-Arten kodiert ein zusätzliches Gen, rfc genannt, die O-PS-Polymerase, deren Funktion die Polymerisierung der einzelnen Wiederholungseinheiten zu Ketten mit unterschiedlicher Länge ist. Bei den meisten Shigella-Arten liegen die rfb/rfc-Genorte auf dem Chromosom (Klena und Schnaitman, Microbiol. Rev. 57 (1993), 655–682). In einigen Shigella-Arten jedoch liegt der gesamte oder ein Teil des rfb-Genortes auf einem Plasmid-Episom (Maurelli und Sansonetti, Ann. Rev. Microbiol. 42 (1988), 127–150). Ein zusätzliches Gen, rfe genannt, das an der Synthese des allgemeinen enterobakteriellen Antigens (ECA) beteiligt ist, wird ebenfalls für die O-PS-Synthese bei Salmonella-Arten der O-Antigen-Gruppen C1 und L benötigt (Kuhn et al., FEMS Microbiol. Rev. 54 (1988), 195–222; Mäkelä et al., J. Gen. Microbiol. 60 (1970), 91–106), wie auch bei einigen Serotypen von E. coli und bei S. dysenteriae Typ 1 (Kuhn et al., FEMS Microbiol. Rev. 54 (1988), 195–222; Schmidt et al., J. Bacteriol. 127 (1976), 755–762; Klena und Schnaitman, Microbiol. Rev. 57 (1993), 655–682). Ein weiteres Gen, rfp genannt, kodiert eine Galactosyl-Transferase und wird bei S. dysenteriae Typ 1 für die Produktion der O-PS in voller Länge benötigt (Klena und Schnaitman, Microbiol. Rev. 57 (1993), 655–682). Darüber hinaus kann eine Veränderung des Serotyps durch die Substitution eines O-PS-Zuckers erreicht werden, hervorgerufen durch bestimmte Phagen, die für Salmonella-Arten und S. flexneri lysogen sind (Clark et al., Gene 107 (1991), 43–52; Verma et al., Gene 129 (1993), 101).

In dem spezifischen Fall von V. cholerae ist der gesamte rfb-Genort chromosomal kodiert. Gene, die an der Perosamin-Synthese (rfbABDE), dem Transport des polymerisierten O-PS zur Zelloberflächen (rfbGHI) und an dem Transfer von Tetronsäure auf die Perosamin-Untereinheit (rfbKLMNO) beteiligt sind, sind sequenziell organisiert, um ein einziges Operon zu bilden. Zusätzlich bilden vier Gene mit unbekannter Funktion, rfbPQRS genannt, das 3'-Ende des Operons. Direkt angrenzend an das rfb-Operon befindet sich das rfb-T-Gen, das die Inaba- und Ogawa-Serospezifität der O1-Stämme von V. cholerae bestimmt. Es wurde kürzlich bewiesen, dass die Stämme des Inaba-Serotyps rfb-T-Mutanten sind (Manning et al., S. 77–94. in: Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994). Wachsmuth, K., Blake, P. A., und Olsvik, Ø. (Hrsg.). Washington, D. C.: American Society for Microbiology.

Wie vorstehend angeführt, kann das Hervorrufen einer örtlichen Immunantwort des Verdauungstraktes das wirksamste Mittel sein, durch das eine Infektion mit einer Reihe von enterischen Pathogenen verhindert werden kann. Ein bewährtes und wirksames Verfahren, mit dem dies erreicht werden kann, ist die Verwendung von oralen, abgeschwächten Lebendimpfstoff-Stämmen. Impfstoff-Stämme, wie etwa vorstehend erwähnte S. typhi Ty21a und V. cholerae CVD103-HgR, durchlaufen einen unvollständigen Infektionsprozess, wobei sie eine Immunantwort hervorrufen, die der durch natürliche Infektion hervorgerufenen sehr ähnlich ist. Die beiden vorstehend genannten Stämme besitzen den entscheidenden Vorteil, beim Menschen außerordentlich sicher zu sein (Levine et al., Rev. Infect. Dis. 11 (1989), (Bd. 3), 552–567; Cryz et al., Infect. Immun. 61 (1993), 1149–1151; Levine und Kaper, Vaccine 11 (1993), 207–212).

Es hat sich herausgestellt, dass Sicherheit die am schwierigsten zu erreichende Eigenschaft bei der Entwicklung von oralen Lebendimpfstoff-Stämmen ist. In den meisten Fällen rufen die zu testenden Impfstoff-Stämme entweder eine schützende Immunantwort hervor, allerdings mit einer nicht annehmbaren Rate an Nebenwirkungen, oder sie sind sicher, aber nicht schützend (Lindberg, in: Vaccine and Immunotherapy. Cryz Jr, S. J. (Hrsg.), New York: Pergamon Press Inc. (1991), S. 95–112; Levine und Hone, in: Vaccine and Immunotherapy. Cryz Jr, S. J. (Hrsg.), New York: Pergamon Press Inc. (1991), S. 59–72).

Nach dem vorstehend gesagten ist es wünschenswert, bewährte orale, abgeschwächte Lebendimpfstoff-Stämme als Träger für die Beförderung von heterologen Impfstoff-Antigenen in den Verdauungstrakt zu benutzen. Versuche, den S. typhi Ty21a-Stamm als einen Träger für Impfstoff-Antigene zu benutzen, führte nicht zu vielversprechenden Ergebnissen (Curtiss III, in: New generation vaccines. Woodrow, G. C. und Levine, M. M. (Hrsg.) New York: Marcel Dekker Inc. (1990), S. 161–188; Cárdenas und Clements, Clin. Microbiol. Rev. 5 (1992), 328–342). Dies kann zu einem großen Teil auf die Tatsache zurück zu führen sein, dass dieser Stamm unter Verwendung eines starken chemischen Mutagens entwickelt worden war, das zahlreiche Mutationen hervorrief. Die genaue schwächende Mutation ist daher nicht bekannt. Darüber hinaus vermehrt sich der Ty21a-Stamm nur schlecht in vivo, und erfordert die Verabreichung von zahlreichen Impfstoff-Dosen. Im Gegensatz dazu wurde der CVD103-HgR Impfstoff-Stamm mit Hilfe rekombinanter DNA-Technik konstruiert, die es erlaubte, die genauen genetischen Veränderungen zu identifizieren (Ketley et al., FEMS Microbiol. Lett. 111 (1993), 15–22). Darüber hinaus scheint dieser Stamm sich in vivo gut zu vermehren, was aus der Tatsache ersichtlich wird, dass nur eine einzige Dosis des Impfstoffes benötigt wird, um ein hohes Maß an Immunität gegen experimentelle Cholera hervor zu rufen (Levine et al., Lancet ii (1988), 467–470).

Anfängliche Versuche zur Verwendung vorstehend erwähnter Stämme als Träger regten die Vorstellung der Entwicklung von bivalenten Impfstoffen an. In einem solchen Fall würde der rekombinante Stamm zwei O-PS-Antigene co-exprimieren. Die erfolgreiche Entwicklung von solchen bivalenten Impfstoff-Stämmen stellte sich jedoch aus einer Reihe von Gründen, von denen einige gerade erst offenbar werden, als außerordentlich schwierig heraus. Erstens haben experimentelle Daten gezeigt, dass die kovalente Bindung zwischen der O-PS-Einheit und der LPS-Kernregion eine Voraussetzung für das wirksame Hervorrufen von Immunität zu sein scheint (Beckmann et al., Nature 201 (1964), 1298–1301; Kuhn et al., FEMS Microbiol. Rev. 54 (1988), 195–222; Attridge et al., Microb. path. 8 (1990), 177–188; Baron et al., Infect. Immun. 55 (1987), 2797–2801). Zweitens führt die Co-Expression von zwei O-PS-Einheiten oft zur Maskierung eines Antigens, wodurch die Immunantwort beeinträchtigt wird (Attridge et al., Microb. path. 8 (1990), 177–188; Forrest et al., Vaccine 9 (1991), 515–520). Drittens muss der rekombinante Stamm die schützenden Antigene, die mit dem Trägerstamm verbunden sind, immer noch vollständig exprimieren. Schließlich sollte die Expression des fremden Antigens die Fähigkeit des bivalenten Stamms, sich entweder in vivo zu vermehren oder sich auf der Schleimhautoberfläche anzusiedeln, nicht wesentlich beeinträchtigen.

Die folgenden Beispiele zeigen die praktischen Probleme, die mit der Konstruktion von bivalenten Impfstoff-Stämmen verbunden sind. Formal et al. (Infect. Immun. 34 (1981), 746-750) brachten das Virulenz-Plasmid 120 Mdal von S. sonnei über Konjugation in S. typhi Ty21a ein. Der entstandene Hybridstamin, 5076-1C genannt, exprimierte das O-PS-Antigen von S. sonnei, kodiert vom Plasmid, wie ein Kapsel-artiges Material auf der Oberfläche von Ty21a, nicht an den S. typhi-LPS-Kern gebunden (Seid et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 9028–9034). Immunisierung von Freiwilligen mit diesem Stamm führte zu einer starken anti-S. sonnei-LPS-Antikörperantwort. In Studien zur Immunreaktion zeigte sich jedoch, dass mehrere Serien dieses Impfstoffes nicht in der Lage waren, gleichmäßig signifikanten Schutz gegen Erkrankung durch S. sonnei zu gewährleisten (Herrington et al., Vaccine 8 (1990), 353–357; Black et al., J.-Infect. Dis. 155 (1987), 1260–1265; Van De Verg et al., Infect. Immun. 58 (1990), 2002–2004). Die genaue Ursache für diesen unterschiedlichen Schutz ist noch nicht identifiziert worden. Mögliche Erklärungen beinhalten 1) die Anwesenheit des S. sonnei-Antigens auf der Oberfläche des Ty21a-Stamms beeinträchtigte seine Fähigkeit zur wirksamen Ansiedlung, 2) das Virulenz-Plasmid zeigte sich innerhalb von Ty21a als genetisch instabil, wodurch spontane Deletionen auftraten, die die Expression des O-PS von S. sonnei und anderen mit Virulenz verbundenen Antigenen beeinträchtigten, 3) Expression des S. sonnei-Plasmids in Ty21a könnte eine Deletionswirkung verursacht haben, die sich nur in vivo manifestiert, etwa durch herabgesetzte Lebensfähigkeit, Fähigkeit zur Vermehrung oder Besiedlung.

Ein bivalenter Impfstoff-Stamm wurde konstruiert, indem die Gene, die die Biosynthese der O-PS von V. cholerae kodieren, in den Ty21a enthaltenden Stamm EX645 eingebracht wurden. Dieser Stamm rief eine schwache anti-V. cholerae-LPS Immunantwort hervor, wenn er Freiwilligen oral verabreicht wurde, selbst dann, wenn das heterologe O-PS an den LPS-Kern gebunden war (Forrest et al., J. Infect. Dis. 159 (1989), 145–146). Es wurde nur ein leichter Schutzstatus gegen experimentelle Cholera erreicht, die auf die Immunisierung mit EX645 folgte. Nachfolgende Studien zeigten, dass das längere O-PS von S. typhi vermutlich die etwas kürzeren O-PS-Einheiten von V. cholerae maskierten, was die schwache Immunantwort verursachte. Ein Derivat von EX645, EX880 genannt, wurde durch die Inaktivierung von Genen entwickelt, die an der Expression der O-PS von S. typhi beteiligt waren. Es zeigte sich, dass EX880 im Vergleich zu EX645 eine weitaus stärkere anti-V.cholerae-LPS-Antikörperantwort hervorrief (Attridge et al., Infect. Immun. 59 (1991), 2279–2284). Die anti-S. typhi-LPS-Antwort war minimal.

Die rfb/rfc- und die rfaR1-Genorte von S. sonnei wurden mit Hilfe von kompatiblen Plasmiden in CVD103-HgR eingebracht (Viret et al., Mol. Microbiol. 7 (1993), 239–252). Dies erlaubte die wirksame Expression des an den LPS-Kern gebundenen S. Sonnei-O-PS. Wenn jedoch die gleichen genetischen Genorte in das Chromosom von CVD103-HgR (Stämme CH3 und CH9) eingebracht wurden, wurde nur wenig oder gar kein S. sonnei-O-PS kovalent an den LPS-Kern gebunden (Viret und Favre, Biologicals 22 (1994), 361–372). Statt dessen wurde das Material auf der Oberfläche von CVD103-HgR als ein Kapsel-ähnliches Material exprimiert.

Die vorstehend beschriebenen Beobachtungen weisen auf Folgendes hin: 1) heterologes O-PS kann nur wirksam an den homologen oder heterologen LPS-Kern gebunden werden, wenn die Synthese von homologem O-PS unterdrückt wird, 2) unter geeigneten Bedingungen kann es möglich sein, heterologes O-PS kovalent an den einzigen Kern von V. cholerae zu binden, wodurch die Notwendigkeit der Einführung von Genen, die ein heterologes Kernmolekül kodieren, umgangen wird und 3) die Co-Expression von zwei bestimmten O-PS-Molekülen durch den selben Trägerstamm, die zu einem bivalenten Impfstoff führen würde, kann nicht durchführbar sein. Die wirksame gleichzeitige Expression von zwei vollständigen LPS-Molekülen, von denen jedes unterschiedliche O-PS-Einheiten präsentieren, kann die Kapazität eines einzelnen Wirtsstammes übersteigen. Mögliche Gründe umschließen Wechselwirkung mit der Expression der betreffenden Gene auf der Ebene der Transkription, Wettbewerb um limitierende Bestandteile, die an der Biosynthese der äußeren Membranstruktur beteiligt sind, wie etwa Moleküle, die an der Verlagerung der O-PS-Moleküle an die äußere Oberfläche der Zelle beteiligt sind, oder Wettbewerb zwischen den O-PS-Molekülen um Transfer oder Bindung an geeignete Stellen auf dem LPS-Kernmolekül.

In einem Versuch, diese Schwierigkeiten zu umgehen, wurden zuvor spontane, nicht definiere Mutanten von V. cholerae CVD103-HgR isoliert, die kein O-PS synthetisieren konnten. Solche Stämme waren in der Lage, die kovalente Bindung von S. sonnei-O-PS, das von den chromosomal integrierten rfb/rfc-Genorten kodiert wurde, an einen LPS-Kern zu unterstützen. Die nicht definierte(n) Mutation(en), die in solchen Stämmen vorhanden sind, machen sie jedoch für die Anwendung beim Menschen unakzeptabel.

Das technische Problem, welches der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht daher darin, abgeschwächte Trägerstämme für Lebendimpfstoff bereit zu stellen, die zur Expression und Herstellung von heterologem O-Antigen (O-PS) von Gram-negativen Bakterien in der Weise nützlich sind, dass das heterologe O-PS eine Immunantwort hervorrufen kann, und die sicher und akzeptabel bei der Verabreichung als Impfstoff sind.

Die Lösung des genannten technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen beschriebenen Ausführungsformen erreicht. Es wurde überraschend herausgefunden, dass eine definierte Deletion innerhalb des rfbA-, rfbB-, rfbD- und/oder rfbE-Gens oder jeder Kombination hieraus in einen abgeschwächten Lebendimpfstoff-Stamm eingebracht werden kann, die die Funktionen des Trägerstammes nicht beeinträchtigt, der benötigt wird, um den genannten Stamm als Träger für ein heterologes Antigen geeignet zu machen, und die bei dem genanntem Stamm zum Verlust der Fähigkeit zur Synthese von homologem O-PS führt und dadurch ermöglicht, ein gewünschtes heterologes O-PS in ausreichender Menge zu exprimieren, um eine Immunantwort hervorzurufen, und zwar in der Weise, dass das heterologe O-PS kovalent an den LPS-Kern gebunden ist und eine Immunantwort hervorrufen kann.

Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erlauben unter anderem die Konstruktion eines monovalenten Impfstoffstamms mit den folgenden Eigenschaften: 1) Verwendung eines oralen, abgeschwächten Lebendimpfstoff-Stammes, bevorzugt V. cholerae CVD103-HgR, geeignet für Anwendung beim Menschen als ein Träger für heterologe Antigene, 2) Veränderung des genannten Trägerstammes in der Weise, dass er die Fähigkeit zur Synthese von homologem O-PS verliert, indem bestimmte Mutationen eingebracht werden, z. B. innerhalb des rfb-Gens, die nicht tödlich sind, die die Synthese von homologem Inaba-O-PS zum Erliegen bringen und die Expression und kovalente Bindung von heterologem O-PS an den LPS-Kern erlauben, 3) Beinhalten von Genen, die für die Produktion von heterologen, polymerisierten LPS-Molekülen notwendig sind, die aus anderen enterischen Pathogenen stammen und ihre Expression, wobei stabile Expression erreicht wird, indem die clonierten heterologen Gene an einer Stelle integriert werden, die den Phänotyp des Trägerstamms nicht wesentlich beeinträchtigt, insbesondere jene Eigenschaften, die ihm ermöglichen, eine schützende Immunantwort als Folge oraler Verabreichung hervorzurufen, 4) Expression des heterologen O-PS-Gens in der Weise, dass das kodierte O-PS kovalent entweder an den LPS-Kern des Trägerstamms oder an einen heterologen LPS-Kern gebunden ist, der vom Trägerstamm nach Einbringung des geeigneten rfa-Genortes produziert wird, 5) das LPS-Molekül, das die heterologe O-PS-Einheit trägt, wird an der Oberfläche des Trägerstamms exprimiert, bevorzugt integriert in das äußere Membranprotein und 6) der Genotyp/Phänotyp des Trägerstamms, der ihn geeignet für die Anwendung bei Menschen macht, bleibt erhalten.

Um solche Impfstoff-Stämme zu entwickeln, wurden zahlreiche genetische Veränderungen in die Gene für die Expression des O-PS des Trägerstamms eingebracht, um die Synthese der O-PS auszuschalten.

Überraschend hatte die Deletion des gesamten Inaba-rfb-Genortes (etwa 20 kB) eine tödliche Wirkung für CVD103-HgR und seine S. sonnei-rfb/rfc tragenden Derivate (Stämme CH3 und CH9). Daher nahm man an, dass es innerhalb oder angrenzend an den rfb-Genort Gene geben müsse, die lebenswichtige Funktionen kodieren, und dass Stämme, denen diese Funktionen fehlten, vermutlich wegen ihrer Unfähigkeit, eine funktionierende äußere Membranstruktur zu synthetisieren, nicht in der Lage wären, sich zu vermehren. Es wurde daher versucht, spezifische Deletionen einzubringen, zum Beispiel innerhalb der drei distinkten Regionen des rfb-Lokus. Das Ziel war, zu versuchen, nicht-tödliche Deletionen in den rfb-Genort einzubringen, die in Ergänzung zur Unterdrückung der Expression der homologen Inaba-O-PS-Einheit die kovalente Bindung des heterologen S. sonnei-O-PS an den Inaba-LPS-Kern unterstützen. Die erste solche Konstruktion war ein rfbEGHI-Mutant. Der rfbE-Genort kodiert die Perosamin-Synthetase, während die rfbG-, -H- und -I-Genorte an dem Transport des Inaba-O-PS durch die äußere Membran beteiligt sind (Manning et al., in: Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994) S. 77–94; Wachsmuth, K., Blake, P. A. und Olsvik Ø. (Hrsg.), Washington, D. C.: American Society for Microbiology). Es stellte sich heraus, dass die rfbEGHI-Deletion für CVD103-HgR tödlich war. In einem zweiten Stamm führte die Deletion des rfbN-Genortes (der an der Synthese des Perosamin-Substituenten 3-doxy-L-Glycerotetronsäure beteiligt ist) unerwartet zu einer nur schwachen Produktion des heterologen S. sonnei-O-PS, welches nicht an den Inaba-Kern gebunden war. Spezifische Genfunktionen innerhalb des Inaba-rfb-Genortes sind daher sowohl für die Expression der heterologen rfb-Gene von S. sonnei, als auch für die kovalente Bindung an den V. cholerae-LPS-Kern in einer noch nicht identifizierten Weise nützlich. Als nächstes wurden die rfbA- und rfbB-Genorte durch Deletion eines 1,2 kB großen Fragments inaktiviert, das die Verbindung zwischen den beiden Genorten überlappt. Diese Genorte sind an der Synthese der Perosamin-Komponente des Inaba-O-PS beteiligt. Genauer ist das RfbA-Protein mit Enzymen verbunden, die Phospho-Mannose-Isomerase- oder Mannose-1-Phosphatase-Guanyl-Transferase-Aktivitäten aufweisen, während die rfbB-Genorte eine vermutliche Phospho-Manno-Mutase kodieren. Die Einbringung der rfbA/rfbB-Mutation in CVD103-HgR, das die rfb/rfc-Genorte von S. sonnei enthält, erlaubte die Expression und kovalente Bindung der S. sonnei-O-PS an den Inaba-LPS-Kern, was zu Hybrid-LPS-Molekülen in voller Länge führte. Rekombinante Stämme, die die Inaba-rfbA/rfbB-Deletion zusammen mit den rfb/rfc-Genorten von S. sonnei mit oder ohne den R1-Kern exprimierten, zeigten sich während der Passage in vitro als genotypisch und phänotypisch stabil. Darüber hinaus besaßen diese Stämme alle jene Eigenschaften des CVD103-HgR-Stamms, die ihn für die Anwendung beim Menschen geeignet machen, einschließlich 1) dem Fehlen von Choleratoxin-Aktivität, 2) der Produktion der nicht toxischen B-Untereinheit des Choleratoxins, 3) der Expression von Toxin-co-regulierten Pili und 4) der Fähigkeit, bei Anwesenheit erhöhter Spiegel von Quecksilberionen zu wachsen.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung abgeschwächte Lebendimpfstoff-Stämme gegen Gram-negative enterische Pathogene, die durch die nachstehenden Eigenschaften gekennzeichnet sind:

  • (a) Ausschalten der Expression von homologem O-PS aufgrund einer definierten Deletion innerhalb des rfbA-, rfbB-, rfbD- und/oder rfbE-Gens oder jeder Kombination hieraus, und
  • (b) Expression von heterologem O-PS in ausreichender Menge, um eine Immunantwort hervorzurufen, in der Weise, dass das genannte heterologe O-PS kovalent an den LPS-Kern gebunden ist.

Genannte Deletionen sollten bevorzugt nicht das Auftreten von Revertanten hervorrufen. Geeignete Deletionen im Einklang mit der vorliegenden Erfindung können bei Befolgung der Anweisungen, die in den nachstehenden Beispielen gegeben werden, durch Fachleute auf diesem Gebiet eingebracht werden. Solche Deletionen sollten die Funktionen des Trägerstammes, der benötigt wird, um genannten Stamm als einen Träger für ein heterologes O-PS geeignet zu machen, nicht beeinträchtigen, sollten aber in ausreichender Weise die Expression von homologem O-PS unterdrücken. Zum Beispiel sollten die genannten Deletionen, die die Biosynthese des homologen O-PS beeinträchtigen, die Expression von Genen, die für die Synthese des vollständigen, heterologes O-PS enthaltenden LPS wesentlich sind, nicht beeinträchtigen, z. B. die Gene, die an der Synthese von Lipid A, dem LPS-Kern, der Synthese und dem Transport von O-PS an die äußere Zelloberfläche und der Verankerung des LPS-Moleküls in der äußeren Membran beteiligt sind.

Aufgrund der genannten Deletionen synthetisieren genannte Stämme LPS-Moleküle, die nur aus dem homologen Lipid A und dem homologen und/oder, in einer besonderen Ausführungsform, die nachstehend beschrieben ist, einem heterologen LPS-Kern bestehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Impfstoff-Stamm eine Deletion innerhalb des rfbA- und/oder rfbB-Gens.

Am meisten bevorzugt ist ein Impfstoff-Stamm, bei dem die genannte genetische Veränderung eine Deletion ist, die der Deletion entspricht, die für pSSVI255-20 in 1 abgebildet ist. Diese Deletion liegt am Anfang des rfbinaba-Operons und betrifft die Ausschaltung eines 1,2 kBp großen HindIII-Fragmentes. Sie inaktiviert die rfbA- und rfbB-Gene, die an der Biosynthese der Untereinheit des Perosamin-O-Antigens beteiligt sind.

Geeignete Impfstoff-Stämme können, in Abhängigkeit vom gewünschten Zweck, von Fachleuten auf diesem Gebiet ausgewählt werden. Solche Stämme sind zum Beispiel CH19, CH21, CH22, CH24, CH25 oder CH30, die nachfolgend beschrieben werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist genannter Impfstoff-Stamm ein E. coli-Stamm, ein Stamm aus der Gattung Shigella, S. typhi, O1 oder O139 V. cholerae, Helicobacter pylori oder Campylobacter jejuni. Bevorzugte S. typhi-Stämme sind S. typhi Ty21a, S. typhi CVD908 oder S. typhi CVD908 welche zusätzliche, abschwächende Mutationen enthalten. Beispiele von zusätzlichen, abschwächenden Mutationen sind Mutationen in den viaB- oder htpR-Genen, die Transkriptionssignale kodieren, wie etwa den RpoS-Sigma-Faktor, oder in Genen, die an den Virulenz-Eigenschaften beteiligt sind, wie etwa der Resistenz gegen Stress durch Umweltfaktoren oder der Fähigkeit zur Anpassung an neue Wachstumsbedingungen, oder in Genen, die an der Synthese von aromatischen Säuren beteiligt sind.

Bevorzugte V. cholerae-Stämme sind V. cholerae CVD103, V. cholerae CVD103-HgR, CVD110, CVD111, CVD112, Bengal-15 oder Peru-14.

Bevorzugte Shigella-Stämme sind S. dysenteriae, S. sonnei, S. boydii oder S. flexneri Serotyp Y.

Die vorstehend genannten Impfstoff-Stämme können zur wirksamen Expression von heterologem O-PS verwendet werden. Zu diesem Zweck werden ein heterologes Gen oder eine Gruppe heterologer Gene, die O-PS kodieren, mit Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, zum Beispiel den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren, in den Impfstoff-Stamm inseriert.

Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung Impfstoff-Stämme, die darüber hinaus durch die Anwesenheit eines heterologen Gens oder einer Gruppe von heterologen Genen, die O-PS kodieren, gekennzeichnet sind.

Die Insertion der genannten Gene (des genannten Gens), die ein heterologes O-PS kodieren, sollte in der Weise durchgeführt werden, dass (i) die genannten Gene (das genannte Gen) stabil exprimiert werden und die Synthese von LPS erlauben, welches in voller Länge und glatt vorliegt und im wesentlichen nicht vom Elternstamm zu unterscheiden ist und (ii) ein intaktes Hybrid-LPS gebildet wird, das aus dem Lipid A des Impfstoff-Stammes, gebunden an die homologe Kernregion besteht. Daher sollten Fachleute auf diesem Gebiet für die Insertion der genannten Gene (des genannten Gens)

  • i) einen bakteriellen Trägerstamm verwenden, der frei von den Genen ist, die das homologe O-PS kodieren,
  • ii) ein Plasmid verwenden, zum Beispiel pMAK700oriT, das alle Gene enthält, die das heterologe O-PS kodieren, flankiert von homologen genetischen Regionen, die dem Genort entsprechen, an dem die genannten heterologen O-PS-Gene inseriert werden sollen, und
  • iii) damit verfahren, wie in Beispiel 3, nachstehend, beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Impfstoff-Stämme sind die heterologen Gene (das heterologe Gen) entweder auf einem Plasmid-Vektor vorhanden oder stabil in das Chromosom des genannten Stammes an einer definierten Integrationsstelle integriert, die nicht wesentlich für das Hervorrufen einer schützenden Immunantwort durch den Trägerstamm sein darf.

Die Gruppe der heterologen Gene sollte in einen Deletionsvektor cloniert werden, der aus einem temperaturempfindlichen Replikon, zum Beispiel pMAK700riT, und einer homologen genetischen Region besteht, die dem Gen entspricht, bei dem die Insertion stattfinden soll. Die heterologen Gene werden in die Mitte der homologen Region cloniert werden. Zur Integration der heterologen Gene sollte dieses Plasmid in einen geeigneten Trägerstamm eingebracht werden und dann wie in den nachstehenden Beispielen 5, 6, 7 und 8 behandelt werden.

Geeignete Stellen für die Integration der heterologen Gene (des heterologen Gens) in das Chromosom des Impfstoff-Stammes sind Gene, die in keiner Weise Eigenschaften des Stammes betreffen, die für seine Immunogenizität und Sicherheit notwendig sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das genannte heterologe Gen oder die Gruppe heterologer Gene entweder in die hlyA-, hlyB-, rfbA- und/oder rfbA/rfbB-Genorte von V. cholerae integriert.

Eine weitere, besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft einen S. typhi-Stamm bei dem das genannte heterologe Gene oder Gruppe von heterologen Genen integriert wird (werden) entweder in das H2S produzierende Gen, in das ilv-, in das viaB-, in htpR-Gene, die Transkriptionssignale wie etwa den Rpos-Sigma-Faktor kodieren, in Gene, die an den virulenten Eigenschaften wie etwa der Resistenz gegen Stress durch Umweltfaktoren oder der Fähigkeit zur Anpassung an neue Wachstumsbedingungen, oder in alle Gene, die an der Synthese von aromatischen Säuren beteiligt sind. Gene, die an der Resistenz gegen Stress durch Umweltfaktoren oder der Fähigkeit zur Anpassung an neue Wachstumsbedingungen beteiligt sind, sind Gene des OmpR-EnrZ-Systems, PhoP-PhoQ-Systems und des cya-crp-Systems zur Regulierung der Transkription. Gene, die an der Synthese aromatischer Säuren beteiligt sind, sind zum Beispiel aroA, aroC und aroD.

Alternativ enthalten die vorstehend genannten Impfstoffstämme das rfa-, rfe-, rfp- und/oder jedes zusätzliche Gen (Gene), das (die) für die Synthese des vollständigen, glatten heterologen LPS benötigt wird (werden), die gemeinsam an einer einzigen Stelle des Chromosoms integriert oder unabhängig voneinander an individuellen Stellen integriert sind.

Zusätzliche Gene, die für die vollständige Synthese des vollständigen, glatten, heterologen LPS notwendig sind, sind zum Beispiel rfc und rff. Die Integration der vorstehend genannten Gene in einer solchen Weise, dass sie richtig und in einer koordinierten Weise exprimiert werden, kann durch Fachleute auf diesem Gebiet nach wohlbekannten Verfahren oder zum Beispiel dem von Hamilton et al., J. Bacteriology 171 (1989), 4617–4622, beschriebenen durchgeführt werden.

Solche Impfstoffstämme erlauben die Expression von heterologem O-PS, das kovalent an eine heterologe LPS-Kernregion gebunden ist, die bevorzugt einen Grad der Polymerisation aufweist, der sich wesentlich nicht von dem LPS unterscheidet, das natürlicherweise von den enterischen Pathogenen produziert wird. Solche Impfstoffstämme können, falls erwünscht, in der Weise verändert werden, dass sie zu der Synthese des homologen LPS-Kerns nicht in der Lage sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform kodieren die heterologen rfa-Gene den Ra-, R1-, R2-, R3-, R4-, K-12 oder B-LPS-Kern, bevorzugt den R1-Kern.

Die Erfindung betrifft auch einen Lebendimpfstoff, der aus dem vorstehend genannten Impfstoffstamm und bei Bedarf einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff und/oder einer Pufferlösung zur Neutralisierung der Magensäure und/oder einem System zur Ausbringung des genannten Impfstoffes in den Verdauungstrakt in einem lebensfähigen Status besteht.

Der genannte Impfstoff besteht aus einer immunschützenden und nicht toxischen Menge des genannten Impfstoffstammes. Geeignete Mengen können von Fachleuten auf diesem Gebiet bestimmt werden und bestehen typischerweise aus 107 bis 109 Bakterien.

Pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, geeignete neutralisierende Pufferlösungen und geeignete Systeme zur Ausbringung können von Fachleuten auf dem Gebiet ausgewählt werden.

In einem bevorzugten Ausführungsform wird der genannte Lebendimpfstoff zur Immunisierung gegen Gram-negative entern Bakterien verwendet.

Die Art der Verabreichung der Impfstoffe der vorliegenden Erfindung kann jeder geeignete Weg sein, auf dem eine immunschützende Menge des Impfstoffes in das Individuum gebracht wird. Bevorzugt wird der Impfstoff jedoch oral oder intranasal verabreicht.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehend genannten Impfstoffstämme zur Herstellung eines Lebendimpfstoffes zur Immunisierung gegen Gram-negative enterische Pathogene. Für diese Verwendung werden die Impfstoffstämme mit den Trägerstoffen, Pufferlösungen und/oder Systemen zur Ausbringung kombiniert, die vorstehend beschrieben werden.

Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Zusammenfassend wird die Nützlichkeit von Inaba-rfbA/rfbB-Deletionsmutanten als Träger oder Vektoren für heterologe O-PS-Antigene gezeigt. Der rfb-Genort von O139 V. cholerae wurde auf ein etwa 32 kB-Fragment cloniert und in den hlyA::mer-Genort des rfbA/rfbB-Deletionsmutanten integriert. Diese Konstruktion exprimierte O139 O-PS, das an den Inaba-Kern gebunden war und von spezifischen anti-O139-Antikörpern erkannt wurde. In ähnlicher Weise wurden die rfb/rfp-Genorte von S. dysenteriae, die die Produktion von O-PS erlauben, auf ein 13,8 kB großes Fragment cloniert und in den rfbA/rfbB-Deletionsmutanten von CVD103-HgR integriert, wie vorstehend beschrieben. In dieser Konstruktion wurde das O-PS von S. dysenteriae auf der Zelloberfläche produziert, kovalent an den Kern gebunden und von spezifischen anti-S. dysenteriae-O-PS erkannt. Diese Konstruktion exprimierte jedoch nur sehr kurze LPS-Moleküle statt der vollständigen Leiter-artigen Struktur der natürlich vorkommenden LPS von S. dysenteriae. Das Hinzufügen des rfe-Gens von E. coli jedoch, von dem angenommen wurde, dass es an der Polymerisation von O-PS beteiligt ist, auf einem Plasmid oder in das Chromosom der Konstruktion integriert, führte zu der Synthese eines LPS mit einem Phänotyp, der von dem des natürlich vorkommenden S. dysenteriae nicht zu unterscheiden ist.

Beispiel 1: Clonierung und physische Kartierung des rfb-Genortes von V. cholerae CVD103-HgR

Herstellung der Genbank. Eine V. cholerae CVD103-HgR DNA-Genbank wurde in dem in geringer Anzahl vorliegenden Cosmid pLAFR5 (Keen et al., Gene 70 (1988), 191–197) hergestellt. DNA-Fragmente aus isolierter CVD103-HgR chromosomaler DNA wurden durch partielle Sau3A Restriktion erzeugt und auf einem Sucrose-Gradienten nach Größen fraktioniert. Fraktionen, die 20 bis 30 kB große Fragmente enthielten, wurden gereinigt und in den BamHI- und ScaI-cut-Vektor ligiert. Das ligierte Gemisch wurde in vitro nach den Anweisungen des Herstellers verpackt (Gigapack II Plus Verpackungs-Kit, Stratagene GMBH, Zürich, Schweiz). Die verpackte DNA wurde dann in den E. coli-Stamm HB101 transfiziert, und die resultierende Kultur wurde auf LB-Platten ausgebracht, die 12,5 &mgr;g/ml Tetracyclin enthielten (LBTc-Platten), um die Transfektanten zu selektieren. Resistente Kolonien wurden zusammengegeben, in Aliquots aufgeteilt, und die Aliquots wurden in 40% Glycerin bei –70°C gelagert.

Durchmustern der Genbank. Ein gefrorenes Aliquot der Cosmid-Bank wurde verdünnt und auf LBTc-Platten ausgebracht. Entstehende Kolonien wurden auf Nitrozellulosefilter überführt. Mit den Filtern wurde darauf für die Immunodetektion verfahren, wie in den veröffentlichten Protokollen angegeben (Sambrook et al., Molecular cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor USA, (1989)). Sondierung der Filter mit dem für Inaba/Ogawa spezifischen monoclonalen Antikörper (mAb) VCO4 (früher H4 genannt; Gustafsson und Holme, J. Clin. Microbiol. 18 (1983), 480–485) erlaubte die Isolierung von mehreren unabhängigen Clonen, die stark positiv blieben, wenn sie mit dem selben mAB wiederholt getestet wurden. Drei Clone, pSSVI255-3, pSSVI255-5, und pSSVI255-7 genannt, wurden weiter untersucht.

Restriktionsanalyse von pSSVI255-3, pSSVI255-5 und pSSVI255-7. Das Restriktionsmuster, das mit einer Reihe von Enzymen erhalten wurde, zeigte einen großen Überlappungsgrad zwischen den drei Clonen an. Alle drei Clone wurden unter Verwendung von EcoRI, SacI, and PstI kartiert. Mit der Hilfe einer bekannten DNA-Sequenz eines etwa 20 kB großen SacI-Fragmentes, das den rfb-Genort des E1 Tor Ogawa V. Cholerae-Stammes 017 umfasste (Manning et al., In Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994), S. 77–94; Wachsmuth K., Blake, P. A., und Olsvik, Ø. (Hrsg.), Washington, D. C.: American Society for Microbiology) konnte die genaue Lage des rfb-Genortes in jedem Clon bestimmt werden. Auf der Basis dieser Information wurde ausschließlich Clon pSSVI255-7 (1) für die weiteren Schritte verwendet.

Beispiel 2: Konstruktion von Deletionsplasmiden für die Einführung von chromosomalen Deletionen in V. cholerae

Um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, eine erfolgreiche Deletion innerhalb des rfb-Genortes von V. cholerae zu erhalten, wurden vier genau bestimmte Fragmente innerhalb des rfb-Genortes ausgewählt, um individuelle Deletionen vorzunehmen. 1 fasst die zahlreichen Deletionsvektoren zusammen, die erzeugt wurden. Die Plasmide pSSVI205-1 and pSSVI205-2 wurden dadurch hergestellt, dass 23,5 kB der DNA zwischen den äußeren SacI-Stellen in pSSVI255-7 entfernt wurden, und die übrig bleibende Insertion in beiden Richtungen in die geglättete HindIII-Stelle von pMAK700oriT subcloniert wurde (2). Das letztere Plasmid entspricht dem Suizid-Vektor pMAK700 (Hamilton et al., J. Bacteriol. 171 (1989), 4617–4622), der durch das Hinzufügen der oriT-Region von Plasmid pJFF350 mobilisierbar gemacht wurde (Fellayet al., Gene 76 (1989), 215–226). Plasmid pSSVI255-12 entspricht pMAK700oriT, das das zentrale, 10,5 kB große SalI-HindIII-Fragment von pSSVI255-7 trägt, von dem das innere, 3,8 kB große BamHI-Fragment deletiert worden war. Diese Deletion inaktiviert die rfbEGHI-Gene. Gen rfbE ist die vermutete Perosamin-Synthetase, rfbG, -H und -I hingegen sind an dem Transport der von rfbinaba kodierten O-PS-Bestandteile durch die äußere Membran beteiligt (Manning et al., In Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994), S. 77–94; Wachsmuth K., Blake, P. A., und Olsvik, Ø. (Hrsg.), Washington, D. C.: American Society for Microbiology). Die Plasmide pSSVI255-19 und pSSVI255-20 wurden beide aus pSSVI255-7 gewonnen, indem definierte Restriktionsfragmente in den in hoher Anzahl vorliegenden Vektor pMTL22p (Chambers et al., Gene 1988, 68: 139–149) subcloniert wurden, Deletion einer zentralen Region vorgenommen, und die resultierende Insertion in pMAK700oriT weiter subcloniert wurde. pSSVI255-19 entspricht dem 5,3 kB großen ClaI-Fragment (Kartierungsposition 15770 bis 21030, 1), von dem das innere 1,9 kB große SalI-Fragment deletiert worden war. Die Deletion überlappt das rfbN-Gen, von dem man annimmt, dass es an der Synthese des Perosamin-Substituenten 3-deoxy-L-glycero-Tetronsäure beteiligt ist. pSSVI255-20 entspricht dem 5,3 kB großen BamHI-SacI-Fragment, das am Anfang des rfbInaba-Operons liegt (Kartierungsposition 18500 bis 23400), von dem das 1,2 kB große, innere HindIII-Fragment deletiert worden war. Diese Deletion inaktiviert die rfbA- und rfbB-Gene, die direkt an der Biosynthese der O-Antigen-Untereinheit von Perosamin beteiligt sind. Die Funktion von rfbA ist eng mit Proteinen verbunden, die Phospho-Mannose-Isomerase- oder Mannose-1-phosphat-Guanyl-Transferase-Aktivität aufweisen, und RfbB ist vermutlich eine Phospho-Manno-Mutase.

Beispiel 3: Einführun rfbBA-Deletionen in Ziel-Trägerstämme: Konstruktion der Stämme CH15, CH19 und CH30

Die verschiedenen, in Beispiel 2 beschriebenen Plasmide wurden zunächst durch Elektroporation in den E. coli-Einsetzungsstamm S 17.1 (Simon et al., Bio/Technology 1 (1983), 784–791) übertragen und dann in V. cholerae CVD103-HgR eingesetzt. Zusätzlich wurde pSSVI255-20 in den E1-Tor-Ogawa-Impfstoffstamm CVD111 eingesetzt.

Die Transkonjugate wurden durch Ausbringen bei 30°C auf selektive BHI-Cm-Platten isoliert. Die Transkonjugate wurden dann bei 30°C in flüssigen Kulturen (BHI-Cm-Medium) vermehrt, und geeignete Verdünnungen wurden auf BHI-CM-Platten ausgebracht und bei 30°C oder 40–42°C inkubiert. Typischerweise war die Plattierungswirksamkeit bei 40–42°C etwa 104-mal niedriger als bei 30°C. Dadurch dass das Plasmid aufgrund seines temperaturempfindlichen Repikons nicht in der Lage ist, sich bei 41°C oder mehr zuvermehren, sollten sich Kolonien bei der nicht zugelassenen Temperatur von jenen seltenen Zellen abheben, die das gesamte Deletionsplasmid in ihrem Chromosom haben. Ein Reihe von Kolonien, die zum Wachstum bei 41–41°C in der Lage waren, wurden weiter auf BHI-Cm-Platten ausgestrichen, die bei 41–42°C inkubiert wurden. Die Selektion von Zellen, die frei von Vektorsequenzen waren, wurde über Ausstreichen auf nicht selektiven BHI-Platten bei 30°C durchgeführt. Nachfolgend erlaubte immunologische Durchmusterung die Isolierung von Kolonien, die auf den VCO4-mAb negativ ansprachen. Dieser Antikörper erkennt sowohl das Ogawa- als auch das Inaba-O-PS. Diese Kolonien wurden weiter durchmustert, um zu bestätigen, dass sie die Eigenschaft der Chloramphenicol-Resistenz, die mit dem Vektor verbunden ist, verloren haben.

Solche stabilen Integranten wurden jedoch nicht immer isoliert, was darauf hinweist, dass einige Deletionen tödlich waren. Daher konnte die Herstellung von Stämmen, in denen entweder der vollständige rfb-Genort oder die rfbEGHI-Gene deletiert waren, nicht erreicht werden. Der Stamm, der durch die Einführung der rfbN-Deletion in CVD103-HgR unter Verwendung von pSSVI255-19 erhalten wurde, wurde CH15 genannt, und die Mutanten mit rfbAB-Deletion in CVD103-HgR und CVD111 unter Verwendung von pSSVI255-20 wurden entsprechend CH19 und CH30 genannt. Diese Deletionsstämme wurden durch Southern-Hybridisierung mit Sonden, die für den rfb-Genort spezifisch waren, genetisch charakterisiert. Es stellte sich heraus, dass die genetische Struktur aller untersuchten Stämme mit den Erwartungen überein stimmten.

Beispiel 4: Einführung von rfbAB-Deletionen in rekombinante V. cholerae-Stämme die O-PS von S. sonnei allein oder in Kombination mit dem rfaR1-LPS-Kern von E coli exprimieren Konstruktion der Stämme CH13, CH14, CH17, CH21

Die vorstehend beschriebenen Plasmide wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, in die Stämmen CH3 und CH9 eingesetzt.

Im Fall von CVD103-HgR konnte das Einfügen der vollständigen rfb-Genort-Deletion in CH3 oder CH9 nicht erreicht werden, vermutlich aufgrund seiner tödlichen Wirkung. In ähnlicher Weise waren die Einführung der 2 kB großen SalI-Deletion von pSSVI255-19 oder der 1,2 kB großen HindIII-Deletion von pSSVI255-20 in Stamm CH3 nicht erfolgreich. Die rfbEGHI-Deletionsmutanten, die aus der Integration von pSSVI255-12 in CH3 und CH9 entstehen, werden als CH 13 und entsprechend CH 14 bezeichnet. Die Insertion der rfbN-Deletion unter Verwendung von pSSVI255-19 in CH9 wurde als CH17 bezeichnet, und ein Deletionsmutant von CH9, der die rfbAB-Deletion von pSSVI255-20 trug, wurde CH21 genannt. Diese Deletionsmutanten wurden durch Southern-Hybridisierung genetisch charakterisiert, indem zusätzlich zu einer Sonde für das hlyA-Gen, dem Zielort für die Integration des rfb/rfcsonnei-Genortes, Sonden verwendet wurden, die entweder für die rfbInaba- oder rfb/rfcsonnei-Genorte spezifisch waren. Der Genotyp aller untersuchten Stämme entsprach den Erwartungen.

Beispiel 5: Integration des rfb/rfcsonnei-Genortes in CH19. Konstruktion des Stammes CH22

Da wir unter Verwendung von pSSVI255-20 keinen CH3-Deletionsmutanten erzeugen konnten, wurde ein genotypisch ähnlicher Stamm, CH22, mit dem gegensätzlichen Ansatz erzeugt, namentlich der Integration der rfb/rfbsonnei-Gene, die von Plasmid pSSVI201-1 getragen wurden (3), in das Chromosom von CH19. pSSVI201-1 wurde ursprünglich zur Konstruktion von Stamm CH9 verwendet. Das Plasmid wurde vom E. coli-Stamm S17,1 (pSSVI201-1) in CH19 eingesetzt. Eine Sammlung der Transkonjuganten wurde dann genau dem Integrationsverfahren unterworfen, das in Beispiel 2 beschrieben wurde, mit der Änderung, dass die Anwesenheit des intakten rfb/rfcsonnei-Genortes bei jedem Schritt des Verfahrens durch immunologische Durchmusterung unter Verwendung des mAb Sh5S überprüft wurde (Viret et al., Infect. Immun. 60 (1992), 2741–2747). Ein stabiler Cms/Sh5S+-Integrant wurde isoliert und CH22 genannt (4).

Beispiel 6 Integration des rfb-Genortes von V. cholerae O139 Stamm MO45 in CH19: Konstruktion des Stammes CH25

Konstruktion und Durchmusterung einer DNA-Genbank. Eine chromosomale Genbank, die vom V. cholerae-Wildtyp O139 Stamm MO45, dem epidemischen Referenzstamm O139, abstammte, wurde in pLAFR5 nach dem gleichen Verfahren wie dem in Beispiel 1 beschriebenen angelegt. Die Genbank wurde dann unter Verwendung eines MO45-spezifischen polyclonalen Kaninchen-Antikörpers durchmustert. Diese Clone wurden darauf unter Verwendung einer Reihe von Restriktionsenzymen der Restriktionsanalyse unterzogen, um den Grad der Überlappung zu bestimmen.

LPS-Expression in E. coli. Aus Stämmen, die auf der Basis der Restriktionsmuster der Plasmide ausgewählt wurden, wurden kleine LPS-Anfertigungen (Minipreps) hergestellt. Aliquots dieser Minipreps wurden dann zusammen mit LPS-Minipreps der negativen Kontrollen CH19 und HB101 (pSSVI212-15) und der positiven Kontrolle MO45 mit Silber-gefärbter SDS-PAGE und Immun-Blot (Western Blot) analysiert, wobei als primärer Antikörper das vorstehend beschriebene polyclonale anti-O139 Serum verwendet wurde. Der sich entwickelnde Antikörper war ein Meerrettich-Peroxidase konjugierter anti-Kaninchen Ziegen-IgG (Boehringer Mannheim AG, Rotkreuz, Schweiz). Die Verfahren des Gel-Blottings auf eine Nitrozellulosemembran, nachfolgende Inkubation mit Antikörpern und Detektion entsprachen den schon zuvor beschriebenen (Viret et al., Infect. Immun. 60 (1992), 2741–2747).

Ergebnisse, in 5 gezeigt, zeigen an, dass die meisten Clone ein LPS-Muster aufwiesen, das mit dem von MO45 (Reihe 4, kennzeichnend für alle O139-Stämme) im Bereich der kleinen Molekulargewichte übereinstimmte (Reihen 6–11). Jedoch war nur ein Clon, nämlich pSSVI212-3 (Reihe 5), identisch mit dem vollständigen MO45-LPS-Muster, d. h. sowohl mit dem Material mit niedrigem, als auch mit hohem Molekulargewicht, letzteres ist typisch für verkapselte Polysaccharide. Die leicht unspezifische Antwort des CH19-Trägerstammes (Reihen 2, 9–11) kann auf einige allgemeine Epitoe im LPS-Kern der O1- und O139-Stämme zurück zu führen sein. Da verkapselte Polysaccaride als notwendig für die Erzeugung einer bedeutsamen Immunantwort gegen O139-Pathogene angesehen wurden, wurde pSSVI212-3 für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Konstruktion von CH25. Weitere Restriktionsanalyse von pSSVI212-3 ergab, dass keine NotI-Restriktionsstelle innerhalb der etwa 30 kB großen Insertion vorkam. NotI-Stellen waren jedoch innerhalb des Kosmid-Vektors pLAFR5 auf jeder Seite der Insertion bei 1,0–1,5 kB von der Clonierungsstelle entfernt verfügbar. Demzufolge wurde das etwa 32 kB große NotI-Fragment, das den rfb-Genort von O139 enthielt, glatt in die SalI-Stelle des Integrationsvektors pSSVI209 (6) subcloniert, um pSSVI220 zu erzeugen. Plasmid pSSVI220 wurde dann mittels Elektroporation in E. coli S17.1 eingebracht und in CH19 eingesetzt. Das Integrationsverfahren des rfb-Genortes von O139 in den hlyA::mer-Genort entsprach dem in Beispiel 4 beschriebenen, mit der Änderung, dass die Anwesenheit des intakten rfb-Genortes von O139 unter Verwendung des vorstehend beschriebenen polyclonalen anti-O139 Antiserums überprüft wurde, das gegen CH19 präadsorbiert worden war. Es wurden mehrere Kolonien, die bei 30°C ohne antibiotische Selektion gezüchtet wurden, gefunden, die Cms und reaktiv mit dem anti-O139 Antikörper waren. Eine dieser Kolonien wurde behalten, und der Stamm wurde CH25 genannt.

Beispiel 7: Integration des rfb/rfp-Genortes von S. dysenteriae in das Chromosom von CH19: Konstruktion des Stammes CH23

Konstruktion des Integrationsplasmids pSSVI208-2. Die Quelle für den rfb/rfp-Genort von S. dysenteriae 1 war Plasmid pSS37 (Sturm et al., Microb. Path. 1 (1986), 289–297). Die Insertion XbaI-EcoRV von pSS37 wurde zuerst in Verbindung mit der Sce-Km-Kassette (Viret, BioTechniques 14 (1993), 325–326) in die SalI-Stelle des Wenig-Kopien-Vektors pGB2 cloniert (Churchward et al., Gene 31 (1984), 165–171), um pSS37-1K zu erzeugen. Die 13,8 kB große Insertion wurde darauf mit SalI ausgeschnitten und in die SaIII-Stelle des Integrationsvektors pSSVI199S (7) in beiden Richtungen cloniert, um PSSVI208-1K und pSSVI208-2K zu erzeugen. Die SceI-Km Kassette von pSSVI208-2K wurde dann durch SceI-Restriktion und Selbstligation des Plasmids ausgeschnitten, um pSSVI208-2 (8) zu erhalten.

Konstruktion von CH23. Plasmid pSSVI208-2 wurde mittels Elektroporation in E. coli S17 eingebracht, in CH19 eingesetzt, und die Transkonjugate wurden auf LB-Cm-Platten bei 30°C selektiert. Die nachfolgende Integration wurde in Beispiel 4 beschrieben, mit der Änderung, dass ein polyclonales anti-S. dysenteriae 1-Antiserum vom Kaninchen zur Durchmusterung der Kolonien verwendet wurde, die den rfb/rfp-Genort enthielten. Es wurden mehrere, bei 30°C und ohne antibiotische Selektion gezüchtete Kolonien gefunden, die Cms waren und mit dem anti-S. dysenteriae 1-Antikörper reagierten. Eine dieser Kolonien wurden CH23 genannt.

Beispiel 8: Integration des rfe-Gens von E. coli in CH23. Konstruktion des Stammes CH24

Grundlage für die Verwendung des rfe-Gens. Voraus gehende Untersuchungen hatten gezeigt, das die Expression des rfb/rfp-Genortes von S. dysenteriae 1 in V. cholerae nicht zu der Produktion einer vollständigen LPS-Leiter führt, wie sie im natürlich vorkommenden LPS von S. dysenteriae 1 zu beobachten ist. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Co-Expression des rfe-Gens von E. coli, das das Enzym UDP-N-Acetylglucosamin::Undecaprenylphosphat N-Acetylglucosamin-1-Phosphat-Transferase (Meier-Dieter et al., J. Biol. Chem., 267 (1992), 746–753) codiert, es ermöglichte, zusammen mit dem rfh/rfp-Genort von S. dysenteriae diesen Defekt zu überwinden, was zur Produktion einer LPS-Leiter führte, die von der von S. dysenteriae 1 nicht zu unterscheiden war.

Konstruktion des Integrationsplasmids pSSVI219. Entsprechend wurde ein Plasmid für die Integration des rfe-Gens in das Chromosom von CH23 konstruiert. das 1,5 kB große XmaIII-ClaI-Fragment von Plasmid pRL100 (Meier-Dieter et al., J. Biol. Chem., 267 (1992), 746–753) wurde glatt in die Klenow-geglättete BamHI-Stelle von Plasmid pMAK/hlyA subcloniert, um pSSVI219 (9) zu erzeugen.

Konstruktion von CH24. Plasmid pSSVI219 wurde mittels Elektroporation in E. coli S17.1 eingebracht, in CH23 eingesetzt, und die Transkonjugate wurden auf LB-Cm-Platten bei 30°C selektiert. Nachfolgende Integrationsverfahren waren wie in Beispiel 4 beschrieben, mit der Änderung, dass ein für S. dysenteriae-O-PS spezifischer monoclonaler Antikörper (DysH26, unveröffentlicht) zur Durchmusterung der Kolonien mit intaktem rfe-Gen verwendet wurde. Der DysH26-mAb erkennt spezifisch hoch polymerisiertes LPS von S. dysenteriae und unterscheidet daher zwischen Zellen, die ein aktives oder inaktives rfe-Gen enthalten. Es wurden mehrere, bei 30°C und ohne antibiotische Selektion gezüchtete Kolonien gefunden, die Cms waren und positiv auf mAb DysH26 reagierten. Eine dieser Kolonien wurden CH24 genannt.

Beispiel 9: Heterologe O-PS-Expression von integrierten rfb-Genorten in rfbInaba-Mutanten von V. cholerae

Expression des rfb/rfc-Genortes von S. sonnei allein oder in Kombination mit dem rfaR1-Genort von E. coli. Die Expression von S. sonnei- und Inaba-LPS in CH3 und CH9 und ihrer entsprechenden Inaba-negativen Derivate wurde auf Silber-gefärbten SDS-PAGE-Gels und in Immunblots unter Verwendung von mAb Sh5S (Viret et al., Infect. Immun. 60 (1992), 2741–2747) oder VCO4 untersucht. 10 zeigt die Expression von S. sonnei- und Inaba-LPS in den verschiedenen Deletionsmutanten und ihren entsprechenden Eltern-Stämmen. Alle rfbInaba-Deletionen verhinderten die Produktion von Inaba-O-PS (Tafeln A und C, Reihen f bis 1 gegen Reihen b, d, und e). Ein unerwarteter Befund war, dass diese Deletionen auch die Produktion von heterologem O-PS von S. sonnei in unterschiedlichen Ausmaßen beeinträchtigen. Die Stämme CH3 und CH9, die einen intakten rfbInaba-Genort beherbergen (Reihen d beziehungsweise e) exprimierten beide begrenzte Mengen von Kern-gebundenem O-PS von S. sonnei (Tafel A). Wenn Deletionen in Genen, die Inaba-OP-S Transport/Perosamin-Synthese oder Tetronat-Synthese betrafen, in diese Stämme (CH13/CH14 beziehungsweise CH15) eingebracht wurden, wurde O-PS von S. sonnei kaum exprimiert und blieb ungebunden (Reihen f, g und i auf Tafel B). Im Gegensatz dazu erlaubten Deletionen, die spezifisch für die Perosamin-Synthese waren (Stämme CH21 und CH22), die Expression von großen Mengen an Kern-gebundenem heterologem O-PS von S. sonnei, dargestellt als typische Leiter-artige Strukturen im unteren Teil des Gels (Tafeln A und B, Reihen k und 1).

Expression von O-PS von S. dysenteriae Typ 1 in CH23 und CH24. Die Expression des LPS von S. dysenteriae in CH23 und CH24 wurde auf Silber-gefärbten SDS-PAGE-Gels und in Immunblots unter Verwendung von mAb MASD-1 (Fält und Lindberg, Microb. Path. 16 (1994), 27–41) untersucht, der sowohl LPS von S. dysenteriae mit niedrigem, als auch mit hohem Molekulargewicht erkennt. 11 zeigt deutlich, dass die Expression des vollständigen LPS von der Anwesenheit des rfe-Gens abhängt (Reihen 2, 5, 6, 8, 10). Daher produziert CH24 (Reihe 10) eine LPS-Leiter, die der der positiven Kontrollen CH19 und CH3-I ähnelt, die mit pSSVI208-1 und pRL100 (Reihen 5 beziehungsweise 6) und DH5&agr; von E. coli (pSS37) (Reihe 2) co-infiziert sind. Im Gegensatz dazu synthetisiert CH23 (Reihe 7) nur eine kleine Menge Material mit niedrigem Molekulargewicht. Die Stämme CH23 (pSSVI219) und CH24 (Reihen 8 beziehungsweise 10) synthetisierten etwas weniger hoch polymerisiertes LPS als ihre Gegenstücke, die die rfb/rfp-Genorie auf einem Plasmid trugen (Reihen 5 und 6). Daher scheint der Unterschied auf die geringere Anzahl an Kopien des rfb/rfp-Genortes in CH24 gegenüber den Stämmen, die die Plasmid-stämmigen Genorte tragen, zurück zu führen sein.

Expression von V. cholerae O139 OA. Die Expression von LPS von V. cholerae O139 in CH25 wurde in Immunblots unter Verwendung von CH19-adsorbiertem, polyclonalem anti-O139-Antiserum untersucht. 12 zeigt, dass CH25 (Reihen 4 und 5) LPS sowohl mit hohem als auch mit niedrigem Molekulargewicht erzeugt, wie es typisch für den O139-Wildtyp-Stamm MO45 (Reihe 3) ist. Ein Vergleich des LPS von CH25 mit LPS von Stämmen, bei denen der rfb-Genort von O139 auf wenig-Kopien-Plasmid-Vektoren in E. coli getragen wird (Reihen 6 und 7) zeigt an, dass die Verminderung der Anzahl der Kopien, die mit der chromosomalen Integration des rfb-Genortes von O139 in CH25 einher geht, nicht zu einer entsprechenden Reduktion der Menge des produzierten LPS führt.

Beispiel 10: Physiologische Charakterisierung des Trägerstamms CH19 und der möglichen Impfstämme CH21 und CH22

Die physiologischen Eigenschaften der genetisch definierten rfbInaba-Deletionsmutanten, die bei 30°C kultiviert wurden, sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Der Phänotyp der Deletionsmutanten wurde wesentlich durch die Züchtung in verschiedenen Kulturmedien beeinflusst, was bei CVD103-HgR nicht der Fall war. Wenn sie bei 37°C kultiviert wurden, zeigten alle Stämme, einschließlich CVD103-HgR, eine drastisch reduzierte Beweglichkeit. Die Unfähigkeit von CVD103-HgR, das Inaba-O-PS nach der Einführung der rfbAB-Deletion (Stamm CH19) zu synthetisieren, führte zu einem Phänotyp, der sich von denen das OP-S von S. sonnei exprimierenden Gegenstücken CH21, CH22, recht deutlich unterschied. So war CH19 kaum bewegungsfähig, wuchs meistens in Form von Einzelzellen oder kurzen Filamenten und, am meisten überraschend, aggregierte in allen untersuchten Kulturmedien spontan. Expression des O-PS von S. sonnei vor dem Hintergrund der rfbAB-Deletion (Stamm CH22) stellte viele der von CVD103-HgR exprimierten Eigenschaften wieder her, wie etwa Beweglichkeit und Wachstum in nicht aggregierter, meistens nicht als Filament vorliegenden Form. Co-expression des R1-Kerns in Stamm 21 führte zu filamentösem Wachstum und einer Verminderung der Beweglichkeit.

Beispiel 11: Weitere physiologische Charakterisierung von CH21 und CH22

Die Stabilität beider Stämme wurde untersucht. Eine Kultur des Teststammes wurde bis zur stationären Phase bei 37°C in LB-Medium gezüchtet, 200-fach in dem selben Medium verdünnt und weiter bis zur stationären Phase bei 37°C inkubiert. Aus jedem Durchgang wurden Verdünnungen der stationären Kultur auf Platten in LB-Medium aufgebracht, um die Stabilität zu bestimmen. Genetische Stabilität wurde als das Verhältnis von Kolonien definiert, die nach 50 oder mehr Wachstumsgenerationen noch den gewünschten Phänotyp (Expression des O-PS von S. sonnei oder Verlust des O-PS von V. cholerae) exprimierten. Es zeigte sich, dass beide Stämme O-PS von S. sonnei stabil exprimierten (> 99,0%). Ein ähnliches Verhältnis wurde für das Beibehalten und Exprimieren des R1-LPS-Kerns in Stamm CH21 gefunden. Auf der anderen Seite exprimierte keine der untersuchten Kolonien das Inaba-O-PS von V. cholerae.

Die Stämme CH21 und CH22 wurden auch auf ihre Unschädlichkeit durch den Y1-Adrenal-Zelltest (Sack und Sack, Infect. Immun. 11 (1975), 334–336), auf die Produktion der B-Untereinheit des Choleratoxins mit Hilfe des GM1-Gangliosid-Bindungstests (Svennerholm und Holmgren, Curr. Microbiol. 1 (1978), 19–23) und auf ihre Resistenz gegen Quecksilber untersucht. Für den letztgenannten Test wurden Kulturen von CVD103-HgR, CH21 und CH22 über Nacht unter Schütteln in BHI-Medium bei 37°C gezüchtet. Die Kulturen in stationärer Phase wurden entweder 200-fach in 2 ml BHI verdünnt, das eine Reihe von HgCl2-Konzentrationen (BHI/HgCl2) enthielt, oder 40-fach in 20 ml BHI. Letztgenannte Kulturen wurden weiter über 2 Stunden bei 37°C inkubiert und wiederum 40-fach in 2 ml BHI/HgCl2-Medium verdünnt, das verschiedene HgCl2-Konzentrationen enthielt. Alle Kulturen wurden dann bis zu 3 Tagen bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Positive Kulturen wurden durch visuelle Untersuchung an den Tagen 1, 2 und 3 überwacht. In allen drei Untersuchungen waren CH21 und CH22 nicht von CVD103-HgR zu unterscheiden.

Toxin-coregulierte Pili, das Produkt des tcp-Regulons, ist als ein wichtiger Faktor für die Anheftung von V. cholerae an die Zellen des Verdauungstraktes bekannt. Um die Expression von tcpA, dem Gen, das die Pili codiert, zu bewerten, wurden Western-Blots von Extrakten ganzer Zellen von CVD103-HgR, CH21 und CH22, die SDS-PAGE-Gels durchlaufen hatten, mit einem Pilin-spezifischen Antiserum sondiert. Die Ergebnisse, in 5 dargestellt, zeigen an, dass sowohl CH21 als auch CH22 Pilin-Mengen erzeugen, die jenen von CVD103-HgR vergleichbar sind.

Beispiel 12: Immunogenizität von Stamm CH22

Seren von Mäusen, die mit ganzen, abgetöteten CH22-Zellen immunisiert worden waren, wurden auf die Anwesenheit von anti-Phase I-S. sonnei und CVD103-HgR-Inaba-LPS-Antikörper untersucht. Als Kontrollen wurden nicht immunisierte Seren oder Seren von Mäusen, die mit ganzen, abgetöteten CVD103-HgR-Zellen immunisiert worden waren, verwendet. Wie in Tabelle 3 gezeigt, rief Immunisierung mit CH22 hohe Titer der anti-S. sonnei-LPS-Antikörper hervor, aber keine anti-Inaba-LPS-Antikörper. Im Gegensatz dazu erzeugten Seren von Mäusen, die mit CVD103-HgR immunisiert worden waren, nur anti-Inaba-LPS-Antikörper. Seren der Kontrollmäuse reagieren mit keinem der LPS-Test-Antigene.

LEGENDEN DER ABBILDUNGEN 1: Restriktionskarte des Inaba-rfb-Clons pSSVI255-7 und davon abstammender Deletionsvektoren

Die Pfeile geben die Richtung der Transkription des rfaD-Gens und -rfbInaba-Operons an. Die weißen Kästen stellen die verschiedenen rfb-Gene dar, und die schraffierten Kästen kennzeichnen funktionale Regionen. Diese Daten sind aus veröffentlichten Ergebnissen zusammengestellt (Manning P. A. et al., S. 77–94. in: Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994). Wachsmuth, K., Blake, P. A., und Olsvik, Ø. (Hrsg.). Washington, D. C.: American Society for Microbiology. Die Linien darunter entsprechen Plasmid-Insertionen, die auf der rechten Seite angeführt sind. Die Abschnitte mit einer dicken Doppellinie repräsentieren homologe Regionen, die für chromosomale Integration und Ausschneiden von Vektorsequenzen verwendet wurden. Die restlichen Abschnitte (dünne Linien) repräsentieren die chromosomalen Regionen, die von jedem Plasmid deletiert wurden.

2: Restriktionskarte des einsetzbaren Suizid-Vektors pMAK700 oriT

ori101: pSC101-Ursprung der Replikation; rep101: Gen für das temperaturempfindliche Initiationsprotein für die Replikation; cam: Gen für Chloramphenicol-Resistenz; oriT: RP4/RK2-Ursprung des Transfers. Koordinaten sind in Basenpaaren angegeben.

3: Restriktionskarte des Integrationsplasmids pSSVI201-1 für den rfb/rfcsonnei-Genort

Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription der gekennzeichneten Gene an. Der weiße Kasten repräsentiert den pMAK700oriT-Vektor. Der unterbrochen schraffierte Kasten entlang der Kartenlinie repräsentiert den rfb/rfc-Genort von S. sonnei. Die Unterbrechung zeigt an, dass seine tatsächliche Ausdehnung größer als hier dargestellt ist. Die dünnen Linien sind die Regionen, die der chromosomalen DNA von CVD103-HgR homolog sind. hlyA: 5'-Ende des hlyA-Gens; mer: Gen für Quecksilber-Resistenz; cat: Gen für Chloramphenicol-Resistenz; rep101ts: Gen für das temperaturempfindliche Initiationsprotein für die Replikation; oriT: RP4/RK2-Ursprung des Transfers.

4: Genetische Struktur von CH22 am hlyA::rfbsonnei-Genort

Die obere Karte zeigt die Struktur des hlyA::mer-Genortes in CH19, d. h. vor der Integration der rfbsonnei-Region in die SaI-Stelle. Pfeile kennzeichnen die Richtung der Transkription der gekennzeichneten Gene.

5: SDS-PAGE-Analyse von LPS-Minipräparationen von O139-rfb-Clonen in E. coli HB101 und V. cholerae CH19

Tafel A: Silber-gefärbt. Tafel B: Western-Blot unter Verwendung von CH19-absorbiertem, polyclonalem O139-spezifischem Kaninchen-Antiserum. Linien: 1: Molekulargewichtsmarker; 2: CH19; 3: HB101 (pSSVI212-15) negative Kontrolle; 4: MO45 positive Kontrolle; 5: HB101 (ppSVI212-3); 6: HB101 (pSSVI212-10); 7: HB101 (pSSVI212-13); 8: HBI01 (pSSVI212-16); 9: CH19 (pSSVI212-10); 10: CH19 (pSSVI212-13); 11: CH19 (pSSVI212-16).

6: Restriktionskarte des Integrationsvektors pSSVI209

Abkürzungen und Symbole sind wie in 3.

7: Restriktionskarte des Integrationsvektors pSSVI199S

Abkürzungen und Symbole sind wie in 3.

8: Restriktionskarte des Integrationsplasmids pSSVI208-2 für die rfb/rfp-Genorte von S. dysenteriae

Abkürzungen und Symbole sind wie in 3. Kasten links schraffiert: rfp-Genort; rechts schraffiert: rfb-Genort.

9: Restriktionskarte des Integrationsplasmids pSSVI219 für das rfe-Gen von E. coli

Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription der gekennzeichneten Gene an. Weiße Kästen: Region homolog zum Genom von CVD 103-HgR; schwarzer Kasten: rfe-Gen; dünne Linie + punktierte Kästen: pMAK700oriT-Vektor; CmR: Gen für Chloramphenicol-Resistenz; hlyB: 5'-Ende auseinander gerissenen hlyB-Gens; hlyB': 3'-Ende des auseinander gerissenen hlyB-Gens. Ansonsten wie in 3.

10: SDS-PAGE-Analyse der O-PS-Expression in verschiedenen rfbInaba-Mutanten von CVD103-HgR, CH3 und CH9 und in CH22

Tafeln: A: Silber-gefärbtes Gel; B: Immunblot mit dem für S. sonnei spezifischen mAb Sh5S; C: Immunblot mit dem für das O-PS von V. cholerae spezifischen mAb VC04. Linien: a: Molekulargewichtsstandard; b: CVD103-HgR; c: S. sonnei 482-79 (pWR105); d: CH3; e: CH9; f: CH13; g: CH14; h: CH15; i: CH17; j: CH19; k: CH21;1: CH22.

11: Western-Blot-Analysie von LPS-Minipräparationen von CH23, CH24, und V. cholerae-Trägerstämme mit Plasmid-stämmigen rfb/rfp-Genorten allein oder zusammen mit dem Plasmid-stämmigen rfe-Gen

Reihen: 1: Molekulargewichtsmarker; 2: DH5&agr; (pSS37); 3: CH19; 4: CH19 (pSSVI208-2); 5: CH19 (pSSVI208-2/pRL100); 6: CVD-I (pSSVI208-2/pRL100); 7: CH23; 8: CH23 (pSSVI219); 9: CH23 (pRL100), 10: CH24. Antikörper zur Sondierung: S. dysenteriae-O-PSspezifischer mAb MASD-1 der Maus.

12: Western-Blot-Analysie von LPS-Minipräparationen von O139-rfb-Clonen in HB101 von E. coli und CH25 von V. cholerae

Reihen: 1: Molekulargewichtsmarker; 2: HB101 (pSSVI215) negative Kontrolle; 3: MO45 positive Kontrolle; 4 und 5: CH25; 6: HB101 (pSSVI215-12); 7: HB101 (pSSVI215-23). Antikörper zur Sondierung: CH19-adsorbiertes, polyclonales, O139-spezifisches Kaninchen-Antiserum.

Tabelle 2: Phänotypische Charakterisierung von CVD103-HgR- und Inaba-LPS-Mutanten Die Stämme wurden bis zur stationären Phase bei 30°C im angegebenen Medium gezüchtet mikroskopisch bestimmt die meisten Filamente bestanden aus ≥ 10 Zellen große Gruppen zusammenhängender Zellen –: nicht vorhanden
+
bei 1–20% der Population vorhanden
++
bei 20–60% der Population vorhanden
+++
bei 60–100% der Population vorhanden

Tabelle 3. Antikörperreaktion als Folge auf Immunisierung mit V. cholerae-Stämmen CH22 oder CVD103-HgR Gruppen aus sieben Mäusen wurden an den Tagen 0 und 14 intramuskulär (IM) mit 5 × 10 Hitze-inaktivierten Zellen immunisiert. Am 21. Tag wurde eine Auffrischungsdosis intraperitoneal verabreicht. Kontrollmäuse wurden nicht immunisiert. Alte Mäuse wurden am 28. Tag geopfert. die Seren wurden individuell auf LPS-spezifische Antikörper untersucht, indem gereinigte S. sonnei Phase 1 oder V. cholerae Inaba als auskleidende Antigene in einem ELISA-Test verwendet wurden. Die Titer werden als das geometrische Mittel (Bereich) der Reziproken der höchsten Verdünnung angegeben, die ein OD von 0,4 ergibt.

Anspruch[de]
  1. Abgeschwächter Lebendimpfstoffstamm gegen gram-negative enterische Pathogene, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

    (a) Eliminierung der Expression von homologen O-PS durch eine definierte Deletion innerhalb des rfbA-, rfbB-, rfbD- und/oder rfbE-Gens oder einer beliebigen Kombination davon; und

    (b) Expression von heterologen O-PS in ausreichender Menge zum Auslösen einer Immunantwort, wobei das heterologe O-PS an den LPS-Kern kovalent gekoppelt ist.
  2. Impfstoffstamm nach Anspruch 1, wobei die genetische Modifikation innerhalb des rfbA- und/oder rfbB-Gens ist.
  3. Impfstoffstamm nach Anspruch 2, wobei die genetische Modifikation eine Deletion ist, die der für pSSVl255-20 in 1 gezeigten Deletion entspricht, welches pMAK700 (2) mit dem 0,75 kb-oriT-EcoRI-BamHI-Fragment von pJFF350 ist, welches das SacI-BamHI Fragment des rfbinaba-Locus von V. cholerae CVD103HgR an den Koordinaten 5000 bis 10340 trägt, in dem das zentrale HindIII-Fragment deletiert ist.
  4. Impfstoffstamm nach Anspruch 3, der V. cholerae CVD103-HgR &Dgr;rfbAB (CH19) ist, hergestellt unter Verwendung von pSSVl255-20 gemäß der Definition in Anspruch 3, oder V. cholerae CVD111 &Dgr;rfbAB (CH30), hergestellt unter Verwendung von pSSVl255-20 gemäß der Definition in Anspruch 3.
  5. Impfstoffstamm nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der ein E. coli-Stamm, ein Stamm der Gattung Shigella, S. typhi, O1 oder O139 V. cholerae, Heliobacter pylori oder Campylobacter jejuni ist.
  6. Impfstoffstamm nach Anspruch 5, der S. typhi Ty21 a, S. typhi CVD908 oder S. typhi CVD908 ist, enthaltend zusätzliche abschwächende Mutationen.
  7. Impfstoffstamm nach Anspruch 5, der V. cholerae CVD103, V. cholerae CVD 103-HgR, CVD110, CVD111, CVD112, Bengal-15 oder Peru-14 ist.
  8. Impfstoffstamm nach Anspruch 5, der S. dysenteriae, S. sonnei, S. boydii oder S. flexneri-Serotyp Y ist.
  9. Impfstoffstamm nach einem der Ansprüche 1 bis 8, darüber hinaus gekennzeichnet durch die Anwesenheit eines heterologen Gens oder eines Satzes heterologer Gene, die O-PS codieren.
  10. Impfstoffstamm nach Anspruch 9, wobei das heterologe Gen oder der Satz von heterologen Genen entweder auf einem Plasmid-Vektor vorhanden oder an einer definierten Integrationspositon, die nicht essentiell für das Induzieren einer protektiven Immunantwort durch den Trägerstamm sein soll, stabil in das Chromosom des Stamms integriert ist.
  11. Impfstoffstamm nach Anspruch 10, der ein V. cholerae-Stamm ist, wobei das heterologe Gen oder der Satz von hetorologen Genen in die hlyA-, hlyB-, ctxA-, rfbA-, rfbB- und/oder die rfbA/rfbB-Loci von V. cholerae integriert ist.
  12. Impfstoffstamm nach Anspruch 10, der ein S. typhi-Stamm ist, wobei das heterologe Gen oder der Satz von hetorologen Genen integriert ist in das H2S-Produktionsgen, ilv-, viaB-, htpR-Gene, die Transkriptionssignale wie den RpoS Sigma-Faktor codieren, Gene, die an den Virulenz-Eigenschaften, wie dem Widerstand gegen Umweltstress oder der Fähigkeit zur Anpassung an neue Wachstumsbedingungen beteiligt sind, oder ein beliebiges Gen, das an der Synthese von aromatischen Säuren beteiligt ist.
  13. Impfstoffstamm nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei zusätzlich das/die rfa-, rfe-, rfp- und/oder (ein) beliebiges) zusätzliches) Gen(e), das/die notwendig ist (sind) für die Synthese von vollständigem glattem heterologen LPS, in Reihe in eine einzelne chromosomale Position oder unabhängig in individuelle Positionen integriert sind.
  14. Stamm nach Anspruch 13, wobei die rfa-Gene den Ra-, R1-, R2-, R3-, R4-, K-12- und/oder den B-LPS-Kern codieren, vorzugsweise den R1-Kern.
  15. Stamm nach Anspruch 9 oder 10, der V. cholerae &Dgr;ctxA hlyA::mer hlyA::rfb/rfc/csonnei hlyB::rfaR1&Dgr;rfbAB (CH21), erhalten unter Verwendung von pSSVl255-20, wie in Anspruch 3 beschrieben, zum Erzeugen der Deletion, CVD103-HgR &Dgr;rfbAB hlyA::rfb/rfcsonnei (CH22)-Stamm, CVD103-HgR &Dgr;rfbAB hlyA::rfbdysenteriae hlyA::rfe (CH24)-Stamm oder CVD103-HgR &Dgr;rfbAB hlyA::rfbO139 (CH25)-Stamm ist.
  16. Lebendimpfstoff, umfassend den Impfstoffstamm nach einem der Ansprüche 9 bis 15 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder einen Puffer zur Neutralisierung von Magensäure und/oder ein System zur Abgabe des Impfstoffs in einem lebenden Stadium in den Intestinaltrakt.
  17. Lebendimpfstoff nach Anspruch 16 zur Immunisierung gegen gram-negative enterische Pathogene.
  18. Lebendimpfstoff nach Anspruch 16 oder 17 zur oralen oder intranasalen Verabreichung.
  19. Verwendung eines Impfstoffstamms nach einem der Ansprüche 9 bis 15 für die Herstellung eines Lebendimpfstoffs zur Immunisierung gegen gram-negative enterische Pathogene.
Es folgen 13 Blatt Zeichnungen






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