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Dokumentenidentifikation DE19921234B4 28.07.2005
Titel Cyanin-Farbstoffe
Anmelder FEW Chemicals GmbH, 06766 Wolfen, DE
Erfinder Reiner, Knut, Dr., 06766 Wolfen, DE;
Ernst, Steffen, Dr., 04103 Leipzig, DE;
Mustroph, Heinz, Dr., 06844 Dessau, DE
Vertreter v. Bezold & Sozien, 80799 München
DE-Anmeldedatum 07.05.1999
DE-Aktenzeichen 19921234
Offenlegungstag 16.11.2000
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 28.07.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.07.2005
IPC-Hauptklasse C09B 23/08
IPC-Nebenklasse G01N 33/52   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Cyanin-Farbstoffe für die Anwendung als Fluoreszenzmarker im Bereich 600 bis 700 nm, die sich gut in Wasser lösen, eine geringe Tendenz zur Aggregation aufweisen und mit einer Reaktivgruppe versehen sind.

Fluoreszenzfarbstoffe werden als Marker auf vielfältige Weise für die Analyse eines Großteils klinisch, biologisch, biochemisch oder chemisch relevanter Substanzen (Trägermaterialien) wie z.B. Zellen, Antikörper, Proteine, Hormone, Nucleinsäuren, Oligonucleotide, Kohlehydrate oder Amine und Mercaptane eingesetzt. In Kombination mit der leicht detektierbaren, durch Laser induzierten Fluoreszenz (LIF; Laser-Induced Fluorescence), sind schnelle Analysen in den o.a. Gebieten möglich.

Durch kovalente Bindung kann eine größere Anzahl Farbstoffmoleküle an eine Probe angeheftet werden, als es im Fall einer unspezifischen nicht-kovalenten Bindung möglich ist, so daß die Intensität des Fluoreszenzlichtsignals stärker ist. Außerdem ermöglicht eine kovalente Bindung die eindeutige Markierung einer spezifischen Zielstruktur in einem Gemisch. Zur kovalenten Bindung des Fluoreszenzfarbstoffes an die Probe werden die Farbstoffe deshalb mit reaktiv Gruppen versehen. Entsprechende reaktiven Gruppen sind z.B. die Iodacetamidogruppe, die Isothio-cyanatgruppe, N-Succinimidester von Alkylcarbonsäuren oder Phosphoramidite der Hydroxyalkylgruppen.

Als Reaktionspartner stehen bei Antikörpern, Proteinen, Hormonen, Nucleinsäuren, und anderen Biomolekülen u.a. Mercapto- (-SH), Amino- (-NH2) und Hydroxygruppen (-OH) zur Verfügung.

Ganz wesentlich für die Verwendbarkeit der Fluoreszenzmarker ist ihre Löslichkeit in wäßrigen Systemen. Farbstoffe mit relativ geringer Wasserlöslichkeit neigen in wäßrigen Systemen zur Bildung von Farbstoffaggregaten (Erscheinen der kürzerwelligen Dimeren- oder H-Bande), die erheblich schlechter fluoreszieren.

Ein weiterer wichtiger Punkt besteht darin, daß die Tendenz, Farbstoffaggregate zu bilden, generell auch mit der Tendenz zu unspezifischen nicht-kovalenten Bindungen des Farbstoffes an beliebige Biomoleküle korreliert. Dimerisierung oder die Farbstoffaggregation zu H-Aggregaten (mit gegenüber dem Monomerspektrum kürzerwelliger Absorption) in wäßrigen Medien, kann durch eine bessere Wasserlöslichkeit des Farbstoffes verhindert werden.

Eine Möglichkeit, die Wasserlöslichkeit zu erhöhen, besteht in der Kombination dieser Farbstoffe mit Oligonucleotiden. Die Wasserlöslichkeit der Farbstoffe wird durch das Oligonucleotid erhöht, so daß man hier N-sulfo-alkylsubstituierte Farbstoffe (WO 98 309 92) verwenden kann:

Eine generelle Lösung des Problems Wasserlöslichkeit und Farbstoffaggregation wird damit jedoch nicht erreicht.

Weiterhin ist bekannt, daß Arylsulfogruppen gegenüber N-Alkylsulfogruppen zu einer deutlichen Verbesserung der Wasserlöslichkeit eines Farbstoffes führen und damit zur Verhinderung von Dimeren oder H-Aggregaten. Entsprechende Fluoreszenzmarker sind in DE 39 12 046 und US 5 268 486 beschrieben:

Es ist ferner allgemein bekannt, daß Arylsubstitution bei Cyaninfarbstoffen die Tendenz zur J-Aggregation (gegenüber dem Monomerspektrum längerwellige Absorption) erhöht. Dementsprechend wurde auch gefunden, daß sowohl Farbstoffe der Struktur:

stark zur Bildung von J-Aggregaten mit längerwelliger Absorption tendieren (DE 44 26 892), als auch Farbstoffe der folgenden Struktur [MUJUMDAR et al.: Bioconjugate Chem. 7 (1996) 356]

Mit den bisher bekannten Kombinationen von Sulfoalkylgruppen, durch die die entsprechenden Farbstoffe zur Bildung von Dimeren oder H-Aggregaten tendieren, oder Sulfoarylgruppen, durch die die entsprechenden Farbstoffe zur Bildung von J-Aggregaten tendieren, wird das Problem nicht gelöst, die Bildung von Dimeren, H-Aggregaten und J-Aggregaten zu verhindern oder zumindest die Tendenz zur Aggregatbildung zu verringern.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, neue Farbstoffe anzugeben, die die oben genannten Nachteile nicht aufweisen und die insbesondere in Wasser gut löslich sind, eine geringe Tendenz zur Aggregation aufweisen, mit einer reaktiven Gruppe versehen sind, und für die Anwendung als Fluoreszenzmarker im Bereich 600 bis 700 nm geeignet sind.

Diese Aufgabe wird durch Cyanin-Farbstoffe mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Verwendungen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Die Grundidee der Erfindung besteht darin, durch eine neue Kombination von Sulfonsäuresubstituenten die bekannten Nachteile der Bildung verschiedener Farbstoffaggregate zu beseitigen. Um die Fluoreszenzquantenausbeute nicht zu verringern und um unspezifische nicht-kovalente Bindungen zu verhindern, kommt es darauf an, jede Art der Farbstoffaggregatbildung zu vermeiden. Dieses Ziel wird durch eine Kombination von Sulfoalkylgruppen und Sulfoarylgruppen erreicht. Die erste Gruppe verhindert die Bildung von J-Aggregaten und die zweite die Bildung von Dimeren oder H-Aggregaten. Des weiteren ist eine reaktive Gruppe (s.o.) zur Bindung an Trägersubstanzen vorgesehen. Die erfindungsgemäßen Cyanin-Farbstoffe besitzen die folgenden Strukturen:

oder
wobei n = 1, 2, R1, R2 = Wasserstoff oder die zur Vervollständigung eines Benzenringes notwendigen vier CH-Gruppen; R3 = Sulfoalkyl mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen; R4 = (CH2)mCOOH oder (CH2)mCH2OH mit m = 2–5; und X = Wasserstoff, Natrium, Kalium bedeuten. R4 umfaßt beispielsweise die N-Hydroxysuccinimid-Ester der Carboxygruppe (CH2)mCOOH mit m = 2–5 und das Bis-(N,N-di-isopropyl)-&bgr;-cyanethyl-phosphoramidit der Hydroxygruppe (CH2)mCH2OH mit m = 2–5.

Mit den neuen Cyaninfarbstoffen läßt sich für die verschiedenen Anregungs-Lichtquellen wie z. B. einen He/Ne-Gaslaser (633 nm), einen Kr/Ar-Gaslaser (647 nm) und Laserdioden (660–690 nm) der Wellenlängenbereich um 640 nm (Formel 1), 660 nm (Formel 2) und 680 nm (Formel 3) abdecken.

Formel 1
Formel 2
Formel 3

In den allgemeinen Formeln 1–3 steht R für eine Carbonsäuregruppe oder eine Methylenhydroxygruppe. In den Farbstoffen mit R = COOH können die Carbonsäuren in ihre N-Succinimid-Ester umgewandelt werden, die dann direkt mit Aminogruppen am Biomolekül reagieren oder über einen sog. Aminolinker mit Hydroxygruppen. In den Farbstoffen mit R = CH2OH können die Hydroxygruppen in Phosphoramidite umgewandelt werden, die direkt mit der freien 5'-OH-Gruppe von Nucleotiden zu einer Phosphitbindung reagieren, die im Folgenden zu einer stabilen Phosphatbindung oxidiert.

Ausführungsbeispiele
Beispiel 1:
A) 2-(4-Acetanilino-1,3-butadienyl)-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-3H-indolium Hydroxid, Innersalz:

Ein Gemisch aus 11,8 g 1-(4-Sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolium Hydroxid und 10,32 g Malondianil-Hydrochlorid in 80 ml Essigsäureanhydrid wird 1 h bei einer Badtemperatur von 120°C zur Reaktion gebracht. Nach Abkühlung werden 300 ml Essigsäureethylester zugesetzt und der anfallende Niederschlag abgesaugt. Ausbeute: 15,8 g

B) Kaliumsalz des 1-(5-Carboxypentyl)-2,3,3-trimethyl-5-sulfoindoliumbromids:

2,8 g Kaliumsalz des 2,3,3-Trimethyl-5-sulfoindolenins und 2,1 g 6-Bromhexansäure werden in Substanz 2 h bei einer Badtemperatur von 110°C unter Rühren zur Reaktion gebracht. Nach beendeter Reaktion wird der ölige Rückstand mehrmals mit Aceton versetzt, bis ein Feststoff zurück bleibt. Ausbeute: 3,1 g

C) 1-(5-Carboxypentyl)-2-[5-(1,3-dihydro-3,3-dimethyl-l-(4-sulfobutyl)-2H-indol-2-yliden)-penta-1,3-dienyl]-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium Hydroxid, Innersalz, Kaliumsalz:

2,30 g der Verbindung aus A) und 2,36 g der Verbindung aus B) werden in 20 ml Ethanol gelöst und nach Zugabe von 2 g Kaliumacetat 20 min am Rückfluß erhitzt. Danach wird die Lösung unter weiterem Rühren auf 5–8°C gekühlt. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und mit Essigsäureethylester gewaschen. Anschließend werden 30 ml destilliertes Wasser zugegeben und die Suspension 1 h bei Raumtemperatur verrührt. Danach wird abfiltriert, getrocknet und der Rohfarbstoff über Kieselgel säulenchromatographisch gereinigt. (&lgr; = 646 nm in MeOH)

Beispiel 2:
A) 2-(4-Acetanilino-1,3-butadienyl)-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-benzo[e]-indolium Hydroxid, Innersalz:

34 g 3-(4-Sulfobutyl)-1,1,2-trimethyl-benzo[e]-indolium Hydroxid und 25,8 g Malondianil-Hydrochlorid werden in 100 ml Essigsäureanhydrid 1 h bei einer Ölbadtemperatur von 120°C zur Reaktion gebracht. Nach Abkühlung wird mit 500 ml Essigsäureethylester versetzt und abgesaugt. Ausbeute: 34,5 g

B) Natriumsalz des 1-(5-Carboxypentyl)-2,3,3-trimethyl-5-sulfoindoliumbromids:

2,61 g Natriumsalz des 2,3,3-Trimethyl-5-sulfoindolenins und 2,1 g 6-Bromhexansäure werden in Substanz 2 h bei einer Badtemperatur von 110°C unter Rühren zur Reaktion gebracht. Nach beendeter Reaktion wird der ölige Rückstand mehrmals mit Aceton versetzt, bis ein Feststoff zurück bleibt. Ausbeute: 2,9 g

C) 1-(5-Carboxypentyl)-2-[5-(1,3-dihydro-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-2H-benzo[e]indol-2-yliden)-penta-1,3-dienyl]-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium Hydroxid, Innersalz, Natriumsalz:

2,58 g der Verbindung aus A) und 2,28 g der Verbindung aus B) werden in 20 ml Ethanol gelöst und nach Zugabe von 2 ml Triethylamin 20 min. am Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Reaktion werden 0,8 g Natriumiodid zugesetzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und der ausgefallene Niederschlag filtriert. Der Rückstand wird mit Aceton verrührt, filtriert, in Methanol aufgenommen und mit einem Tropfen halbkonzentrierter HCl versetzt. Der nach Zugabe von Diethylether erhaltene Rohfarbstoff wird durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt.

(&lgr; = 665 nm in MeOH)

Beispiel 3:
A) 2-(4-Acetanilino-1,3-butadienyl)-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-benzo[e]-indolium Hydroxid, Innersalz:

Substanz A) wird analog Beispiel 2 hergestellt.

B) Natriumsalz des 3-(6-Hydroxyhexyl)-7-sulfo-1,1,2-trimethyl-benzo[e]-indolium-iodid:

3,11 g Natriumsalz des 7-Sulfo-1,1,2-trimethyl-benzo[e]-indolenins und 2,51 g 6-Iodhexanol werden 3 h in Substanz bei einer Badtemperatur von 115°C zur Reaktion gebracht. Der Rückstand wird nach Abkühlen mit Aceton verrieben. Ausbeute: 3,2 g

C) 2-[5-(1,3-Dihydro-3-(6-hydroxyhexyl)-1,1-dimethyl-7-sulfo-2H-benzo[e]indol-2-yliden)-penta-1,3-dienyl]-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-1H-benzo[e]indolium Hydroxid, Innersalz, Natriumsalz:

2,58 g der Verbindung aus A) und 2,7 g der Verbindung aus B) werden in 15 ml Methanol gelöst und nach Zusatz von 2 ml Triethylamin 20 min. am Rückfluß erhitzt. Nach beendeter Reaktion werden 0,8 g Natriumiodid zugesetzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Diethylether versetzt und filtriert. Der Rückstand wird mit Aceton verrührt, filtriert, in Methanol aufgenommen und mit einem Tropfen halbkonzentrierter HCl versetzt. Der Rohfarbstoff wird durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt. (&lgr; = 683 nm in MeOH).

Beispiel 4:
A) 2-(4-Acetanilino-1,3-butadienyl)-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-benzo[e]-indolium Hydroxid, Innersalz:

Substanz A) wird analog Beispiel 2 hergestellt.

B) Dinatriumsalz des 3-(5-Carboxypentyl)-6,8-disulfo-1,1,2-trimethyl-benzo[e]-indoliumbromid:

4,13 g Dinatriumsalz des 6,8-Disulfo-1,1,2-trimethylbenzo[e]-indolenins und 2,15 g 6-Bromhexansäure werden in Substanz 1,5 h bei einer Badtemperatur von 110°C erhitzt. Der nach beendeter Reaktion verbleibende Rückstand wird mit Aceton verrieben. Ausbeute: 4,9 g

C) 2-[5-(3-(5-Carboxypentyl)-1,3-dihydro-1,1-dimethyl-6,8-disulfo-2H-benzo[e]indol-2-yliden)-penta-1,3-dienyl]-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-1H-benzo[e]indolium Hydroxide, Innersalz, Dinatriumsalz:

2,58 g der Verbindung aus A) und 3,05 g der Verbindung aus B) werden in 20 ml einer Mischung aus Essigsäureanhydrid und Pyridin (4 : 1) unter Rühren für 2 h am Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 100 ml Essigsäurethylester zugesetzt, abfiltriert und mit Essigsäureethylester gewaschen. Der Rückstand wird in Methanol aufgenommen, mit 2 ml halbkonzentrierter HCl versetzt und durch Zusatz von Diethylether ausgefällt. Der so erhaltene Rohfarbstoff wird durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt. (&lgr; = 682 nm in MeOH).


Anspruch[de]
  1. Cyanin-Farbstoff, mit einer Kombination von Sulfoaryl- und N-Sulfoalkylgruppen und einer reaktiven Gruppe, die die Bindung an Trägersubstanzen ermöglicht, gekennzeichnet durch
    oder
    mit:

    n = 1, 2;

    R1, R2 = Wasserstoff oder die zur Vervollständigung eines Benzenringes notwendigen vier CH-Gruppen;

    R3 = Sulfoalkyl mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen

    R4 = (CH2)mCOOH oder (CH2)mCH2OH mit m = 2–5; und

    X = Wasserstoff, Natrium, Kalium.
  2. Cyanin-Farbstoff gemäß Anspruch 1, bei dem R4 = die N-Hydroxysuccinimid-Ester der Carboxygruppe (CH2)mCOOH mit m = 2–5 und das Bis-(N,N-di-isopropyl)-&bgr;-cyanethylphosphoramidit der Hydroxygruppe(CH2)mCH2OH mit m = 2–5 bedeuten.
  3. Verwendung eines Cyanin-Farbstoff gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche als Fluoreszenz-Markierungsfarbstoff für die Analyse eines klinisch, biologisch, biochemisch oder chemisch relevanter Substanzen.
  4. Verwendung eines Cyanin-Farbstoff gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche als Fluoreszenz-Markierungsfarbstoff für biologische Zellen, Antikörper, Proteine, Hormone, Nucleinsäuren, Oligonucleotide, Kohlehydrate oder Amine und/oder Mercaptane.
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