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Dokumentenidentifikation DE69633094T2 28.07.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000756004
Titel Heparansulfat 2-0-Sulfotransferase
Anmelder Seikagaku Kogyo K.K.(Seikagaku Corp.), Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Kobayashi, Masashi, Nagakute-cho, Aichi-ken, JP;
Habuchi, Hiroko, Nagoya-shi, Aichi-ken, JP;
Habuchi, Osami, Nagoya-shi, Aichi-ken, JP;
Kimata, Koji, Nagoya-shi, Acihi-ken, JP
Vertreter Ullrich & Naumann, 69115 Heidelberg
DE-Aktenzeichen 69633094
Vertragsstaaten DE, DK, FR, GB, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.07.1996
EP-Aktenzeichen 963054101
EP-Offenlegungsdatum 29.01.1997
EP date of grant 11.08.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.07.2005
IPC-Hauptklasse C12N 9/10

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Sulfotransferase. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase, die selektiv eine Sulfatgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes überträgt, der in Heparin und Heparansulfat enthalten ist.

Hintergrund der Erfindung

Heparin und Heparansulfat sind Polysaccharide, die zum Glycosaminoglycan gehören. Heparin und Heparansulfat haben eine ähnliche Zuckerketten-Grundstruktur und werden beide durch Synthese einer Kette hergestellt, die aus N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und Glucuronsäure (GlcA) besteht, die über eine 1 → 4-Bindung verknüpft sind, gefolgt von einer Weiterverknüpfung oder Weiterverarbeitung, wobei jedoch der Grad der Weiterverknüpfung oder Weiterverarbeitung unterschiedlich zwischen den beiden ist. Obwohl nämlich die beiden stark negativ geladen sind, enthält Heparin größere Mengen an N-sulfatiertem Glucosamin, 6-O-sulfatiertem Glucosamin und 2-O-sulfatierter Iduronsäure. Heparansulfat und Heparin liegen in Geweben in einer Proteoglycan-Form vor, in der die Zuckerkette in der gleichen Weise ebenso wie andere Glycosaminoglycane kovalent an ein Kern-Protein bindet.

Heparin-Proteoglycan ist in sekretorischen Granula von Mastzellen und basophilen Zellen gefunden worden, und es kommt in Betracht beim Verpacken von Histaminen und basischer Protease beteiligt zu sein. Heparansulfat-Proteoglycan ist weit verbreitet, z. B. über extrazellulare Matrizen und Zelloberflächen, und es ist bekannt geworden, dass es verschiedene Funktionen aufweist, wie z. B. solche, die relevant für eine Differenzierung, ein Wachstum und eine Bewegung von Zellen und eine Antikoagulation sind.

Nebenbei bemerkt ist der basische Fibroblast-Wachstumsfaktor (bFGF) ein Protein, das ein starkes Wachstum einer extrem breiten Auswahl von Zellen erleichtert, wie z. B. jene eines vaskulären Systems, eines Bindegewebs-Systems, eines Gehirnnervensystems und eines Immunsystems. Auf der anderen Seite ist ein saurer Fibroblast-Wachstumsfaktor (aFGF) ein Protein, das oft im Nervensystem, wie z. B. einem Gehirn und einer Retina, gefunden wird. Da aFGF an einen mit bFGF gemeinsamen Zelloberflächenrezeptor bindet, kommen die beiden in Betracht, dass sie einen im Wesentlichen gleichen Wirkmechanismus aufweisen.

Es ist offenbart worden, dass aFGF und bFGF stark an einen Zuckerkettenrest eines Heparansulfat-Proteoglycans binden, das in extrazelluläre Matrizen oder Basalmembranen von Geweben eingebaut ist. Es ist vor kurzem vorgeschlagen worden, dass ein Heparin oder eine Neparansulfat-Kette für bFGF notwendig ist, um an einen hoch affinen Rezeptor zu binden (Yayon, A. et al., Cell, 64, 841–848 (1991); Rapraeger, A. C., Science, 252, 1705–1708 (1991)). Es ist des Weiteren vorgeschlagen worden, dass die bFGF-Aktivität selbst auch eine Bindung dieser Zuckerketten an den hoch affinen Rezeptor erfordert (Kan, M. et al., Science 259, 1918–1921 (1993); Guimond, S. et al., J. Biol., Chem., 268, 23906–23914 (1993)). Die vorliegenden Erfinder haben gezeigt, dass eine besondere Domainstruktur, die eine Bindung an bFGF betrifft, in der Kette eines Heparansulfats vorliegt, und dass sich die Bindung von bFGF an die Kette eines Heparansulfats außerordentlich auf den bFGF-Stoffwechsel auswirkt (Habuchi, H. et al. (1992) Biochem. J., 285, 805–813). Es ist bekannt, dass die Bindung von bFGF die Gegenwart einer 2-O-Sulfat-Gruppe eines Iduronsäurerestes und eines N-sulfatierten Glucosaminrests in der Heparansulfat-Kette benötigt (Habuchi, H. et al., Biochem. J., 285, 805–813 (1992); Turnbull, J. E. et al., J. Biol. Chem., 267, 10337–10341 (1992)).

Es ist berichtet worden, dass Herapansulfat, das maßgeblich an der Entstehung einer hoch organisierten Basalmembran beteiligt ist, einen hohen Sulfatierungsgrad an der C-6-Position eines Glucosaminrests aufweist (Nakanishi, H. et al., Biochem. J., 288, 215–224 (1992)). Es ist auch berichtet worden, dass die Affinität eines Heparins an Fibronectin in Proportion zu dem Molekulargewicht und dem im Heparin enthaltenen Sulfat ansteigt (Ogamo, A. et al., Biochem. Biophys. Acta, 841, 30–41 (1985)). Es ist auch bekannt, dass je höher die Metastase-Fähigkeit eines Zelllinien-Klons ist, der aus einem Lewis-Lungen-Karzinom stammt, um so größer ist der Inhalt eines 6-O-Sulfats in einem synthetisierten Heparansulfat (Nakanishi, H., Biochem. J., 288, 215–224 (1992)), und dass der Grad der Sulfatierung eines Heparansulfats entsprechend mit einer malignen Veränderung abfällt. Es kommt dementsprechend in Betracht, dass die Sulfatierung eine wichtige Rolle in einer Expression von physiologischen Aktivitäten von Heparin und Heparansulfat spielt.

In Anbetracht auf den Einfluss einer Sulfatierung in einer Expression von physiologischen Aktivitäten von Heparin und Heparansulfat, kann ein Verfahren zur Sulfatierung einer spezifischen Stelle eines Heparins und eines Heparansulfats essentiell für eine Analyse von physiologischen Aktivitäten und einer Modifikation von Funktionen eines Heparins und eines Heparansulfats sein. Von einem Verfahren zum chemischen selektiven Einfügen von Sulfatgruppen im Hinblick auf eine N- oder eine O-Sulfatierung ist schon berichtet worden („Shin-Seikagaku-Jikken-Koza 3, Toshitsu (Saccharides) II", p324, publiziert von Tokyo-Kagaku-Dojin). Es bedarf jedoch komplizierte Behandlungsvorgänge, benötigt viele Arten von Reagenzien und braucht eine lange Zeit. Deshalb ist ein Verfahren zum enzymatischen Einführen einer Sulfatgruppe gefordert worden. Eine Heparansulfat (GlcN)-2-N-Sulfotransferase ist isoliert worden und als ein Enzym für ein N-selektives Einführen einer Sulfatgruppe in einen Glucosamin (GlcN)-Rest gereinigt worden („Shin-Seikagaku-Jikken-Koza 3, Toshitsu II", p194, publiziert von Tokyo-Kagaku-Dojin). Es ist auch versucht worden, ein Enzym zu isolieren und zu reinigen, das eine Sulfatgruppe selektiv an die C-2-Position eines Iduronsäure (IdoA)-Rests eines Heparins und eines Heparansulfats (Heparansulfat (IdoA)-2-O-Sulfotransferase) überträgt. Es wurde jedoch berichtet, dass das Enzym selbst nach einer Reinigung bis zu einem hohen Grad mit einer Heparansulfat (GlcN)-6-O-Sulfotransferase (ein Enzym zur selektiven Übertragung einer Sulfatgruppe an die C-6-Position eines Glucosaminrests eines Heparins und eines Heparansulfats, wenn nötig im Folgenden einfach als „Heparansulfat-6-Sulfotransferase" bezeichnet) kontaminiert war und die Trennung der beiden schwierig war (Wald, H. et al., Glycoconjugate J., 8, 200–201 (1991)). Vor kurzem sind die vorliegenden Erfinder in einer Isolierung und einer Reinigung einer Heparansulfat-6-O-Sulfotransferase erfolgreich geworden (J. Biol. Chem., 270, 4712–4719 (1995)). Eine Heparansulfat (IdoA)-2-O-Sulfotransferase ist jedoch nicht isoliert und gereinigt worden.

In Anbetracht auf den Einfluss einer Sulfatierung in einer Expression von physiologischen Aktivitäten eines Heparins und eines Heparansulfats, ist es sehr wichtig, ein Verfahren für eine Übertragung einer Sulfatgruppe zu einem Heparin und zu einem Heparansulfat, nicht nur zum Studium der funktionalen Analysen eines Heparins und eines Heparansulfats, sondern auch um ein Heparin und Heparansulfat für den Zweck einer Gestaltung von Pharmazeutika zu entwickeln, die physiologische Aktivitäten bevorzugt für den Menschen aufweisen. Insbesondere sind nun eine Heparansulfat (GlcN)-2-N-Sulfotransferase und eine Heparansulfat (GlcN)-6-O-Sulfotransferase isoliert worden, und deshalb eine Isolierung und Reinigung einer Heparansulfat (IdoA)-2-O-Sulfotransferase erwünscht worden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist unter Betrachtung der vorhergehenden Standpunkte ausgeführt worden, dessen Aufgabe es ist, eine Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase bereitzustellen, die selektiv eine Sulfatgruppe in die Hydroxylgruppe an der C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines Heparins und eines Heparansulfats einfügt.

Die vorliegenden Erfinder haben unablässig nach einem Enzym gesucht, welches selektiv eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes überträgt, der in einem Heparin und einem Heparansulfat enthalten ist, d. h. eine Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase (wenn nötig im Folgenden als „Heparansulfat-2-Sulfotransferase" oder „das Enzym der vorliegenden Erfindung" bezeichnet), und waren erfolgreich in einer Isolierung und Reinigung des Enzyms, bestätigten, dass das Enzym selektiv eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines Heparins und eines Heparansulfats überträgt, und vollendeten die vorliegende Erfindung.

Und zwar stellt die vorliegende Erfindung eine Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase bereit, die die folgenden Eigenschaften aufweist.

  • (i) Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor selektiv zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines Sulfatgruppenakzeptors übertragen,
  • (ii) Substratspezifität: Die Sulfatgruppe wird zu Heparansulfat, Heparin oder zu chemisch modifiziertem Heparin übertragen, das durch die komplette Desulfatierung der N,O-Sulfatgruppen des Heparins, gefolgt von einer N-Resulfatierung, erhalten wird (vollständig desulfatiertes, N-sulfatiertes Heparin, im folgenden als „CDSNS-Heparin" bezeichnet), aber die Sulfatgruppe wird nicht zu Chondroitin, Chondrotinsulfat, Dermatansulfat und Keratansulfat übertragen,
  • (iii) pH-Reaktionsoptimum: etwa 5 bis 6,5,
  • (iv) Ionenstärke-Optimum: etwa 50 bis 200 mM bei Verwendung von Natriumchlorid,
  • (v) Inhibition und Aktivierung: die Aktivität des Enzyms wird durch Protamin erhöht; die Aktivität des Enzyms wird durch Adenosin-3',5'-diphosphat (3'-5'-ADP) inhibiert und die Aktivität des Enzyms wird durch Dithiothreitol (DTT) bei 10 mM oder weniger beeinflusst; und welches ein durch die Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmtes Molekulargewicht von etwa 44 kDa oder etwa 47 kDa aufweist.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase bereit, welches die Schritte einer Kultivierung von Kulturzellen, die aus dem Ovar von chinesischen Hamstern stammen, und Isolierung der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase aus der Kultur umfasst.

Das Enzym der vorliegenden Erfindung wird in geeigneter Weise als „Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase" oder als „Heparansulfat-2-Sulfotransferase" bezeichnet. Es ist jedoch nicht gemeint, dass das Substrat des Enzyms auf Heparansulfat beschränkt ist. Das Enzym der vorliegenden Erfindung überträgt zum Beispiel eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines CDSNS-Heparins. Unmodifiziertes Heparin weist eine Sulfatgruppe an der C-2-Position von fast allen Iduronsäureresten auf. Heparin, das eine Hydroxylgruppe an dieser Position aufweist, ist jedoch ein wenig vorhanden. Das Enzym der vorliegenden Erfindung überträgt auch eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines solchen Heparins. In dieser Beschreibung sind, wenn nötig, jene als „Heparin" bezeichnet, die ein modifiziertes Heparin, wie zum Beispiel CDSNS-Heparin, enthalten.

Die vorliegende Erfindung wird unten im Detail erklärt werden.

<1> Heparansulfat-2-Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung

Das Enzym der vorliegenden Erfindung ist ein Enzym, welches gemäß der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal isoliert worden ist, und die folgenden Eigenschaften aufweist.

(i) Wirkung

Eine Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor selektiv zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines Sulfatgruppenakzeptors übertragen. Der Sulfatgruppendonor wird vorzugsweise beispielhaft durch aktiviertes Sulfat (3'-Phosphoadenosin 5'-Phosphosulfat, wenn nötig im Folgenden als „PAPS" bezeichnet) erläutert. Die Sulfatgruppe wird kaum zu einem Glucosaminrest übertragen. Der Sulfatgruppenakzeptor enthält Heparin und Heparansulfat.

(ii) Substratspezifität

Die Sulfatgruppe wird zu Heparansulfat, Heparin oder CDSNS-Heparin übertragen, aber die Sulfatgruppe wird nicht zu Chondroitin, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Keratansulfat übertragen.

(iii) pH-Reaktionsoptimum

Das Enzym der vorliegenden Erfindung weist eine hohe Aktivität, um eine Sulfatgruppe zu übertragen, in einem Bereich von pH 5 bis 6,5, vorzugsweise in dem Bereich von pH 5,5 auf.

(iv) Ionenstärke-Optimum

Die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung steigt mit dem Ansteigen der Ionenstärke an. In dem Fall, wenn NaCl verwendet wird, liegt die höchste Aktivität bei 50 bis 200 mM vor, vorzugsweise in der Umgebung von 100 mM. Die Aktivität nimmt fortschreitend ab, wenn die Konzentration von NaCl übermäßig über den voran genannten Bereich ansteigt. Die Aktivität wird bei 500 mM extrem gering.

(v) Inhibition und Aktivierung

Die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird durch Protamin erhöht. Die Aktivität wird durch Protamin um etwa das dreifache auf etwa 0,013 mg/ml oder mehr gesteigert, verglichen mit der bei der Abwesenheit von Protamin.

Die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird durch 3'-5'-ADP inhibiert.

Die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird kaum durch DTT bei 10 mM oder weniger beeinträchtigt.

(vi) Michaelis-Konstante

Das Enzym der vorliegenden Erfindung weist vorzugsweise eine Michaelis-Konstante (Km) von etwa 0,20 &mgr;M für PAPS auf, wenn CDSNS-Heparin als ein Sulfatgruppenakzeptor und PAPS als ein Sulfatgruppendonor verwendet werden.

(vii) Andere Eigenschaften

Als ein Analyseergebnis einer aktiven Fraktion des Enzyms der vorliegenden Erfindung, die aus einer Kultur von Zellen erhalten wird, die aus einem Ovar von chinesischen Hamstern stammen (d. h., CHO-Zellen), mittels einer Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), sind zwei nah beieinander liegende breite Banden in der Umgebung von 44 kDa und 47 kDa gefunden worden. Es ist nicht klar, ob eines oder keines dieser Proteine das Enzym der vorliegenden Erfindung ist, oder ob diese beiden das Enzym der vorliegenden Erfindung sind. Auf jeden Fall sind die oben beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften des Enzyms der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Enzymfraktion, die die Proteine enthält, die die breiten Banden von 44 kDa und 47 kDa aufweisen, bestimmt worden. Die Mobilität der beiden Proteine in einer Elektrophorese wurde nicht durch die Gegenwart von Mercaptoethanol beeinträchtigt.

Als ein Ergebnis einer Analyse des Enzyms der vorliegenden Erfindung nach einer N-Glycanase (hergestellt von Genzyme)-Behandlung mittels einer SDS-PAGE sind die voran genannten breiten Banden von 44 kDa und 47 kDa verloren gegangen, während Banden von 34 kDa und 38 kDa neu erschienen sind. Es ist entsprechend vorgeschlagen worden, dass diese Proteine Glycoproteine sind, die nicht weniger als 19 Gewichtsprozent Zucker enthalten.

Das Enzym der vorliegenden Erfindung wurde in der Umgebung eines Molekulargewichts von etwa 130.000 bei einer Superose-12 (hergestellt von Pharmacia-LKB)-Gel-Chromatographie eluiert.

Die Aktivität, um eine Sulfatgruppe des Enzyms der vorliegenden Erfindung zu übertragen, kann unter Verwendung von [35S]-PAPS als ein Sulfatgruppendonor und Heparin oder Heparansulfat als ein Sulfatgruppenakzeptor, durch Ermöglichen des Enzyms der vorliegenden Erfindung auf diese zu wirken und durch Messung der Radioaktivität von [35S], das in Heparin oder Heparansulfat eingefügt ist, gemessen werden. Die Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität kann unter Verwendung von CDSNS-Heparin als ein Sulfatgruppenakzeptor gemessen werden. Die Heparansulfat-2-Sulfotransferase, die das Enzym der vorliegenden Erfindung ist, wird nicht durch 10 mM DTT inhibiert, während die Heparansulfat-6-Sulfotransferase, die ein bekanntes Enzym ist, durch 10 mM DTT inhibiert wird. Dementsprechend kann nur die Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität durch Zugabe von 10 mM DTT zu einer Enzym-Reaktionslösung gemessen werden, die [35S]-PAPS, CDSNS-Heparin und eine Sulfotransferase enthält, indem die Heparansulfat-6-Sulfotransferase-Aktivität inhibiert wird. Wenn die Reaktion des Enzyms der vorliegenden Erfindung ausgeführt wird, ist es wünschenswert, dass ein pH einer Enzym-Reaktionslösung 5 bis 6,5 ist, die Ionenstärke etwa 50 bis 200 mM (NaCl) ist, und Protamin in einer Menge von nicht weniger als 0,025 mg/ml hinzugegeben wird. Zum Beispiel insbesondere eine Enzym-Reaktionslösung (50 &mgr;l), die 2,5 &mgr;mol Imidazol-Hydrochlorid (pH 6,8), 3,75 &mgr;g Protamin-Hydrochlorid, 25 nmol CDSNS-Heparin und 50 pmol [35S]-PAPS (etwa 5 × 105 cpm) enthält, und das Enzym bei einer Temperatur von 37°C gehalten wird, gefolgt von einem Erhitzen bei 100°C für eine Minute, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend wird 0,1 &mgr;mol Chondroitin-Sulfat-A als ein Träger hinzugegeben und dann wird ein 35S-markiertes Glycosaminoglycan durch Zugabe von kaltem Ethanol in einer dreifachen Menge der Reaktionslösung präzipitiert, welches 1,3% Kaliumacetat enthält. Des Weiteren werden [35S]-PAPS und dessen abgebauten Produkte durch Aussalzen entfernt, ein Flüssigkeits-Szintillator wird hinzugegeben und eine [35S]-Radioaktivität wird unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers gemessen. Bei der vorliegenden Erfindung wird eine Aktivität, um 1 pmol einer Sulfatgruppe pro Minute unter der voran genannten Bedingung zu übertragen, als eine Enzymmenge von 1 Unit (U) definiert.

<2> Verfahren zur Herstellung des Enzyms der vorliegenden Erfindung

Das Enzym der vorliegenden Erfindung, das die oben beschriebenen Eigenschaften aufweist, kann durch Kultivierung von Zellen, die von Tieren stammen, z. B. von Zellen, die aus einem Ovar chinesischer Hamster stammen, im Speziellen von CHO-Zellen (zum Beispiel ATCC CCL61 und dergleichen) in einem Kulturmedium und durch Isolierung der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase aus der Kultur erhalten werden. CHO-Zellen sind als die für die Kultivierung verwendeten Kulturzellen bevorzugt. Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann aus anderen als den oben beschriebenen Kulturzellen erhalten werden, jedoch sind die oben beschriebenen Kulturzellen aufgrund ihrer guten Wachstumseigenschaften und einer Möglichkeit einer Kultivierung in einer großen Menge unter Verwendung von Zellen in Suspension bevorzugt. Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann auch nach einer Kultivierung aus dem Medium extrahiert werden. Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann als ein Roh-Enzym verwendet werden, wenn es keine andere Sulfotransferase-Aktivität enthält, oder wenn andere kontaminierende Sulfotransferase-Aktivitäten wirksam unterdrückt werden können.

Das Medium, das wie oben beschrieben für die Kultivierung der Kulturzellen verwendet wird, ist nicht besonders eingeschränkt, es ist jedoch bevorzugt ein solches zu verwenden, das für schwimmende Zellen, die z. B. in einer „Spinner-Flask" enthalten sind, zu verwenden, um effizient eine große Zellmenge zu erhalten. Speziell kann ein kommerziell erhältliches Medium verwendet werden, wie z. B. ein CHO-S-SFMII-Medium (hergestellt von Gibco), das für eine Suspensionskultur für CHO-Zellen entwickelt ist.

Um ein Wachstum von Mikroorganismen zu vermeiden, ist es bevorzugt ein Antibiotikum, wie z. B. Penicillin und Streptomycin, zu dem Medium zu geben. Wenn das wie oben beschriebene Medium verwendet wird, um eine Kultivierung in der gleichen Weise wie bei gewöhnlichen Kulturzellen unter Verwendung von Roller-Flaschen, Schalen oder dergleichen durchzuführen, wird das Enzym der vorliegenden Erfindung in der Kultur, insbesondere in Kulturzellen akkumuliert.

Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung eines Ausgangsmaterials, wie z. B. einem Überstand nach einer Zentrifugation, welcher durch Sammeln von Zellen aus einer Kultur nach einer Kultivierung zum Beispiel mittels Zentrifugation erhalten wird, und Aufschluss von Zellen zum Beispiel mittels Homogenisierung, Ultraschallbehandlung oder osmotischen Druck-Schock, und einem Zentrifugieren einer Zell-Aufschluss-Lösung, die durch den vorangehenden Schritt erhalten wird, gereinigt werden. Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann mittels einer Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung einer Heparin-Sepharose-CL-6B (hergestellt von Pharmacia)-Säule, einer 3'-5'-ADP-Agarose-Säule und dergleichen oder einer Gel-Filtrations-Chromatographie unter Verwendung einer Superose-12 (hergestellt von Pharmacia)-Säule gereinigt werden. Wenn nötig, kann das Enzym zusätzlich unter Verwendung bekannter Enzym-Reinigungs-Verfahren, z. B. einer Ionen-Austauscher-Chromatographie, einer Gel-Filtration, einer Elektrophorese, einer hydrophobischen Chromatographie und einem Aussalzen gereinigt werden.

Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann auch unter Verwendung transformierter Zellen, die durch Isolierung eines Gens aus den oben beschriebenen Kulturzellen, welches für das Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, und durch Einfügen dieses in andere Kulturzellen oder mikrobielle Zellen, erhalten werden.

Das Enzym der vorliegenden Erfindung hat eine enzymatische selektive Einfügung einer Sulfatgruppe in die Hydroxylgruppe an der C-2-Position eines Iduronsäurerestes ermöglicht, der in Heparin und Heparansulfat enthalten ist. Die Heparansulfat-2-Sulfotransferase fügt äußerst genau eine Sulfatgruppe selektiv in die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines Heparins und eines Heparansulfats ein. Es wird entsprechend erwartet, dass das Enzym für Reagenzien zu verwerten ist, die nützlich für Studien, wie z. B. funktionellen Analysen von Heparin und Heparansulfat, sind.

In Anbetracht einer Gestaltung eines Heparins und eines Heparansulfats, die zurzeit unbekannte neue physiologische Aktivitäten aufweisen, und eine Applikation als Pharmazeutika unter Verwendung des Enzyms der vorliegenden Erfindung, um selektiv eine Sulfatgruppe in die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines Heparansulfats einzufügen, kann es erwartet werden, ein Heparin oder ein Heparansulfat zu gestalten, das physiologische Aktivitäten vorzugsweise für den Menschen aufweist. Da es bekannt ist, dass der Sulfatierungsgrad eines Heparansulfats in Übereinstimmung mit einer malignen Veränderung abfällt, wird es auch erwartet, dass die Menge des Enzyms mit der malignen Veränderung von Zellen in Verbindung gebracht werden kann, indem ein Antikörper gegen das Enzym der vorliegenden Erfindung hergestellt und das Enzyms der vorliegenden Erfindung in Geweben nachgewiesen wird.

Kurze Erläuterung der Zeichnungen

1 zeigt ein Ergebnis einer ersten Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie für das Enzym der vorliegenden Erfindung. Geschlossene Kreise zeigen eine Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität an (die Aktivität wurde in der Abwesenheit von DTT gemessen), offene Kreise zeigen eine Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität an (die Aktivität wurde in der Gegenwart von 10 mM DTT gemessen), geschlossene Quadrate zeigen eine Proteinkonzentration an und eine unterbrochene Linie zeigt eine NaCl-Konzentration an.

2 zeigt ein Ergebnis einer zweiten Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie für das Enzym der vorliegenden Erfindung. Geschlossene Kreise, offene Kreise, geschlossene Quadrate bzw. eine unterbrochene Linie in 2 zeigen das gleiche wie jene in 1 an.

3 zeigt ein Ergebnis einer Superose-12-Gel-Chromatographie. Geschlossene Kreise bzw. offene Kreise in 3 zeigen das gleiche wie jene in 1 an. Bezifferte Pfeile 1, 2 bzw. 3 in 3 zeigen Positionen einer Elution eines Standard-Proteins an. 1: Rinderserum-Albumin (BSA, 67 kDa), 2: Ovalbumin (43 kDa) und 3: Chymotrypsinogen (25 kDa).

4 ist eine elektrophoretische Aufnahme, die ein Ergebnis einer SDS-PAGE von Fraktionen zeigt, die durch die Superose-12-Gel-Chromatographie fraktioniert sind. Die Zahlen in den oberen Bereichen in 4 zeigen Fraktionsnummern an. M zeigt eine Molekulargewichtsmarke an.

5 ist eine elektrophoretische Aufnahme, die ein Ergebnis einer SDS-PAGE von Enzymfraktionen der vorliegenden Erfindung von jedem der Reinigungsschritte zeigt. M: Molekulargewichtsmarker, Bahn 1: Rohextrakt, Bahn 2: eine Fraktion, die mit einem Abschnitt übereinstimmt, der durch eine horizontale Linie (dicke Linie) in 1 bei der ersten Heparin-Sepharose-CL-6B angezeigt wird, Bahn 3: eine adsorbierte Fraktion in der ersten 3'-5'-ADP-Agarose, Bahn 4: eine Fraktion, die einem Abschnitt entspricht, der durch eine horizontale Linie (dicke Linie) in 2 bei der zweiten Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie angezeigt wird, und Bahn 5: eine adsorbierte Fraktion bei der zweiten 3'-5'-ADP-Agarose.

6 ist eine elektrophoretische Aufnahme, die ein Ergebnis einer SDS-PAGE des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt, das einer oder keiner N-Glycanase-Behandlung unterzogen ist. Bahn 1: das Enzym der vorliegenden Erfindung, welches keiner Behandlung unterzogen ist, Bahn 2: das Enzym der vorliegenden Erfindung, das mit N-Glycanase behandelt ist, und Bahn 3: N-Glycanase.

7 zeigt HPLC-Chromatogramme von Heparitinase-verdauten Reaktionsprodukten, die durch eine Sulfatgruppen-Übertragung unter Verwendung des Enzyms der vorliegenden Erfindung zu (A) CDSNS-Heparin und (B) Heparansulfat erhalten werden, die aus einem EHS-Tumor stammen. Geschlossene Kreise und eine unterbrochene Linie zeigen eine Radioaktivität bzw. eine KH2PO4-Konzentration an.

8 zeigt HPLC-Chromatogramme von Disacchariden, die unter Verwendung einer Partisil-10-SAX-Säule eluiert sind, wobei die Disaccharide durch Abbau mit Nitrit bei pH 1,5 hergestellt werden und Reaktionsprodukte durch einen Sulfatgruppentransfer unter Verwendung des Enzyms der vorliegenden Erfindung zu (A) CDSNS-Heparin und (B) Heparansulfat, die aus einem EHS-Tumor stammen, und einer Reduzierung mit NaBH4 erhalten werden. Geschlossene Kreise und eine unterbrochene Linie zeigen das gleiche wie jene in 7 an.

9 zeigt pH-Enzym-Aktivitäts-Kurven, die ein pH-Optimum des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigen. Offene Kreise zeigen einen Tris-HCl-Puffer an, geschlossene Kreise zeigen einen Imidazol-HCl-Puffer an, offene Quadrate zeigen einen 2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure (MES)-Puffer an und geschlossene Quadrate zeigen einen Kalium-Acetat-Puffer an.

10 zeigt eine NaCl-Konzentrations-Enzym-Aktivitäts-Kurve, die ein NaCl-Konzentrations-Optimum des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.

11 zeigt eine DTT-Konzentrations-Enzym-Aktivitäts-Kurve, die den Einfluss von DTT auf das Enzym der vorliegenden Erfindung zeigt.

12 zeigt eine Protamin-Konzentrations-Enzym-Aktivitäts-Kurve, die den Einfluss von Protamin auf das Enzym der vorliegenden Erfindung zeigt.

Beschreibung einer bevorzugten Ausführungform

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden unten beschrieben werden. Verfügbare Quellen und Verfahren, um die Reagenzien und Proben zu erhalten, die in den Ausführungsformen verwendet werden, sind unten beschrieben.

[35S]-H2SO4 wurde von der Japan Isotope Association bezogen. Ein CHO-S-SFMII-Medium wurde von Gibco bezogen. PAPS, 3'-5'-ADP-Agarose und Heparin wurden von Sigma bezogen. Cosmedium-001-Medium wurde von Cosmo Bio bezogen. Polyethylenglycol #20000 wurde von Nacalai Tesque bezogen. Eine schnelle Entsalzungs-Säule, eine Heparin-Sepharose-CL-6B, eine Superose-12-Säule und eine Superdex-30pg-Säule wurden von Pharmacia-LKB bezogen. Eine PAMN-Säule (Siliziumsäule mit gebundenem Polyamin) wurde von YMC bezogen. Eine Partisil-10-SAX-Säule wurde von Whatman bezogen. Chondroitinase-ABC, Heparitinase I, II, III, Chondroitin-Sulfat-A (aus Walknorpel, 4S/6S:80/20), CDSNS-Heparin, Chondroitinsulfat-C (aus Haiknorpel, 4S/6S:10/90), Dermatansulfat, Keratansulfat und ein Kit von ungesättigten Disacchariden vom Glycosaminoglycan wurden von der Seikagaku Corporation bezogen. [35S]-PAPS wurde gemäß einem von Delfert, D. M. und Conrad, E. H. (1985) in Anal. Biochem. 148, 303–310 beschriebenen Verfahren hergestellt. Chondroitin (aus der Tintenfisch-Haut) wurde gemäß einem von Habuchi, O. und Miyata, K. (1980) in Biochem. Biophys. Acta, 616, 208–217 beschriebenen Verfahren hergestellt. p-Tosyl-L-Lysin-Chloromethyl-Keton wurde von Aldrich bezogen. Phenylmethylsulfonylfluorid und N-Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethyl-Keton wurden von Sigma bezogen. Pepstatin wurde von Wako Pure Chemical Industries bezogen. Heparansulfat aus einem Maus-EHS (Engelbreht-Holm-Swarm)-Tumor, Heparansulfat aus einer Schweine-Aorta und Heparansulfat aus einer Rinder-Leber wurden von der Seikagaku Corporation erhalten.

<1> Verfahren zur Messung einer Sulfotransferase-Enzym-Aktivität (1) Messung einer Sulfotransferase-Aktivität

Die Enzymaktivität wurde gemäß einem in den Reinigungsschritten der Heparansulfat-2-Sulfotransferase, in der Analyse der Eigenschaften des Enzyms usw. unten beschriebenen Verfahren gemessen.

Eine Enzym-Reaktionslösung war eine Mischung (50 &mgr;l), die 2,5 &mgr;mol Imidazol-Hydrochlorid (pH 6,8), 3,75 &mgr;g Protamin-Hydrochlorid, CDSNS-Heparin (25 nmol, wie es in einer Hexosamin-Menge umgesetzt ist), 50 pmol [35S]-PAPS (etwa 5 × 105 cpm) und das Enzym enthält. Diese Reaktionslösung wurde bei einer Temperatur von 37°C für 20 Minuten gehalten, gefolgt von einem Erhitzen bei 100°C für eine Minute, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend wurde Chondroitinsulfat A (0,1 &mgr;mol, wie es in einer Glucoronsäure-Menge umgesetzt ist) als ein Träger hinzugegeben, und dann wurde 35S-Glycosaminoglycan durch Zugabe kalten Ethanols in einer dreifachen Menge der Reaktionslösung präzipitiert, welches 1,3% Kaliumacetat enthält. Des Weiteren wurden [35S]-PAPS und seine Abbauprodukte unter Verwendung einer schnellen Entsalzungssäule, wie in Habuchi, O. et al., (1993) J. Biol. Chem., 258, 21968–21974 beschrieben, komplett getrennt. Ein Flüssigkeits-Szintillator (Ready Safe Scintillator, hergestellt von Beckman) wurde damit gemischt und eine Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers gemessen, um die Menge einer übertragenen Sulfatgruppe zu berechnen. Eine Aktivität, um 1 pmol einer Sulfatgruppe pro Minute unter der voran genannten Bedingung zu übertragen, wurde als eine Enzymmenge von 1 Unit (U) definiert.

Die Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität wurde wie oben beschrieben unter Verwendung von CDSNS-Heparin als ein Sulfatgruppenakzeptor gemessen. Wenn nötig, wurde wie oben beschrieben die Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität durch Inhibierung der Heparansulfat-6-Sulfotransferase-Aktivität durch Zugabe von 10 mM DTT zu der Enzym-Reaktionslösung gemessen.

(2) Messung des Galactosamin- und Glucosamin-Gehalts im Glycosaminoglycan

Ein Galactosamin- und Glucosamin-Gehalt im Glycosaminoglycan wurde durch ein Elson-Morgan-Verfahren nach einer Hydrolysierung des Glycosaminoglycans in 6 M HCl bei 100°C für vier Stunden gemessen.

<2> Heparansulfat-6-Sulfotransferase- und Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Verteilung in CHO-Kulturzellen

Um die Heparansulfat-6-Sulfotransferase- und Heparansulfat (HexA)-2-Sulfotransferase-Verteilung (eine Sulfatgruppe ist zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Hexuronsäure (HexA)-Rests übertragen) in CHO-Kulturzellen zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt.

CHO-Zellen (ATCC CCL61) wurden für 48 Stunden in Cosmedium-001-Medium kultiviert. Danach wurde die Sulfotransferase-Aktivität für das Medium und für eine Extraktlösung aus Zellen (Überstand, der durch Homogenisierung von Zellen mit Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 20% Glycerol und 0,1% Triton X-100), der 0,15 M NaCl enthält, durch Steigerung der Konzentration von Triton X-100 bis 0,5% und der Durchführung einer Extraktion für eine Stunde unter Agitation, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 × g für 30 Minuten erhalten wird) unter Verwendung von CDSNS-Heparin als ein Substrat und [35S]-PAPS als ein Sulfatgruppendonor gemessen. Als ein Ergebnis, wie in Tabelle 1 gezeigt, waren nicht weniger als 95% der Heparansulfat-(HexA)-2-Sulfotransferase in den Zellen vorhanden, und nicht mehr als 5% davon waren in dem Medium vorhanden. In Tabelle 1 ist die Heparansulfat-(HexA)-2-Sulfotransferase einfach als „2-Sulfotransferase" ausgedrückt.

Tabelle 1

Auf der anderen Seite ist es schon von den vorliegenden Erfindern berichtet worden, dass nicht weniger als 90% einer Heparansulfat-6-Sulfotransferase in dem Medium vorlagen. Gemäß diesen Beobachtungen ist es gezeigt worden, dass eine Reinigung der Heparansulfat-2-Sulfotransferase als das Enzym der vorliegenden Erfindung bevorzugt von einer Extraktlösung ausgeht, die aus CHO-Zellen erhalten wird.

<3> Reinigung einer von CHO-Zellen produzierten Heparansulfat-2-Sulfotransferase (1) Kultivierung von CHO-Zellen und Herstellung eines Rohextrakts

CHO-Zellen (ATCC CCL61) wurden in CHO-S-SFMII-Medium (10 ml), das 50 &mgr;g/ml Streptomycin und 50 Units Penicillin (1 ml) enthält, in einer Zelldichte von 2 × 106 Zellen/100 mm pro Schale inokuliert, und für vier Tage kultiviert. Danach wurden die Kulturzellen in ein CHOS-SFMII-Medium (500 ml) in einer Zelldichte von 3,0 × 105 Zellen/ml inokuliert und in einem Schwebestadium in einer Spinner-Flasche (hergestellt von Techne) für vier Tage unter Agitation bei 90 rpm kultiviert. Eine erhaltene Flüssigkultur wurde, um Zellen zu sammeln, bei 1.000 × g für fünf Minuten zentrifugiert, und die Zellen wurden dann mit kaltem Phosphatpuffer (PBS (–)) gewaschen. Um eine Sulfotransferase aus den Zellen zu extrahieren, wurde ein Extraktionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5% w/v Triton X-100, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,15 M NaCl, 20% v/v Glycerol, vier Protease-Inhibitor-Arten (5 &mgr;M p-tosyl-L-lysin-chloromethyl-Keton, 3 &mgr;M N-tosyl-L-phenylalanin-chloromethyl-Keton, 30 &mgr;M Phenylmethylsulfonylfluorid und 3 &mgr;M Pepstatin) in einer Menge von 55 ml zu 1 × 109 Zellen hinzugegeben. Die Zellen in dem Extraktionspuffer wurden zehnmal unter Verwendung eines Glas-Homogenisiergeräts homogenisiert, gefolgt von einer Agitation bei 4°C für eine Stunde. Eine extrahierte Lösung wurde bei 10.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde als ein Rohextrakt verwendet und vereinigt (1,8 L), und der Rohextrakt wurde bei –20°C bis zum Beginn der Reinigung gelagert.

(2) Reinigung einer Heparansulfat-2-Sulfotransferase

Die gesamten folgenden Arbeitsgänge wurden bei 4°C durchgeführt.

(i) Erster Schritt Erste Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie

Ein Drittel des, wie oben beschrieben, hergestellten Rohextrakts (600 ml) wurde auf eine Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (30 × 70 mm, 50 ml) aufgetragen, die mit Puffer A equilibriert ist, der vier Protease-Inhibitor-Arten (p-tosyl-L-lysin-chloromythyl-Keton (5 &mgr;M), N-tosyl-L-phenylalanin-chloromethyl-Keton (3 &mgr;M), Phenylmethylsulfonylfluorid (30 &mgr;M) und Pepstatin (3 &mgr;M)) und 0,15 M NaCl enthält. Die Flussrate betrug 76 ml/Stunde. Die Säule wurde mit Puffer A, der vier Protease-Inhibitor-Arten und 0,15 NaCl enthält, zehnmal in einer Menge des Säulenvolumens gewaschen, um eine Fraktion zu entfernen, die nicht an der Säule adsorbiert ist, und dann wurde eine adsorbierte Fraktion mit einem linearen Konzentrationsgradienten (Gesamtvolumen 1.000 ml) eluiert, indem die NaCl-Konzentration von 0,15 M bis 1,2 M im Puffer A erhöht wurde, der vier Protease-Inhibitor-Arten und NaCl enthält. Auf diese Weise wurden Fraktionen (13 ml jede) gesammelt. Jede der eluierten Fraktionen wurde für die Proteinkonzentration, die Sulfotransferase-Aktivität in der Gegenwart von 10 mM DTT (Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität) und die Sulfotransferase-Aktivität in der Abwesenheit von DTT (Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität) gemessen (1). Fraktionen, die die Sulfotransferase-Aktivität enthalten (übereinstimmend mit einem Teil, der durch eine dicke Linie in 1 angezeigt ist) wurden vereinigt, und die vereinigten Fraktionen wurden in ein Dialyse-Gefäß eingefüllt. Polyethylen-Glycol-Pulver #20000 wurde darauf gesprenkelt, um eine Konzentrierung bis auf etwa 100 ml durchzuführen. Für den nächsten Reinigungsschritt wurde die Konzentration von Triton X-100 auf 1% eingestellt, gefolgt von einer Dialyse gegen Puffer A, der 0,05 M NaCl enthält.

Infolge des oben beschriebenen Arbeitsvorgangs stieg die Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität um etwa das 1,9-fache an. Dies kann durch die Eliminierung der abbauenden Enzyme für PAPS und den Substanzen, die eine Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität inhibieren, durch die Säulenchromatographie verursacht sein.

(ii) Zweiter Schritt 3'-5'-ADP-Agarose-Chromatographie

Die dialysierte Lösung, die in dem oben beschriebenen ersten Schritt erhalten wird, wurde durch eine 3'-5'-ADP-Agarose-Säule (14 × 90 mm, 15 ml) gegeben, die mit Puffer A equilibriert ist, der 0,05 M NaCl enthält. Die Flussrate betrug 13 ml/Stunde. Die Säule wurde achtmal in einer Menge des Säulenvolumens mit Puffer A gewaschen, der 0,05 M NaCl enthält, um eine Fraktion zu entfernen, die nicht an die Säule adsorbiert ist, und dann wurde eine adsorbierte Fraktion fünfmal in einer Menge des Säulenvolumens mit Puffer A eluiert, der 0,05 M NaCl und 0,2 mM 3'-5'-ADP enthält. Zu der Fraktion wurde Puffer A hinzugegeben, der 1 M NaCl enthält, so dass die Endkonzentration von NaCl 0,15 M wurde.

Eine Kombination aus dem ersten und dem zweiten Schritt wurde dreimal wiederholt. Aktive Fraktionen, die durch die dreimaligen Arbeitsvorgänge erhalten wurden, wurden vereinigt. Ein Aliquot der vereinigten Fraktion wurde auf eine kleine Heparin-Sepharose-Säule (Bed-Volumen: 0,6 ml) aufgetragen und die Säule wurde mit Puffer A gewaschen, der 0,15 M NaCl enthält, gefolgt von einer Elution mit Puffer A, der 1,0 M NaCl enthält. Eine erhaltene Fraktion wurde auf ihre Aktivität gemessen, um eine Gesamtaktivität des gereinigten Enzyms in dieser Phase zu bestimmen.

Infolge des oben beschriebenen Arbeitsvorgangs wurde die spezifische Aktivität der Heparansulfat-2-Sulfotransferase in einem Schritt 44-fach, wobei offenbart wurde, dass der Arbeitsvorgang ein äußerst effektives Verfahren zur Reinigung dieses Enzyms war.

(iii) Dritter Schritt Zweite Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie

Die aktive Fraktion der in dem zweiten Schritt erhaltenen Heparansulfat-2-Sulfotransferase wurde auf eine Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (16 × 50 mm, 10 ml) aufgetragen, die mit Puffer A equilibriert ist, der 0,15 M NaCl enthält. Die Säule wurde fünfmal in einer Menge des Säulenvolumens mit Puffer A gewaschen, der 0,15 M NaCl enthält, und dann wurde eine adsorbierte Fraktion mit einem linearen Konzentrationsgradienten (Gesamtvolumen: 300 ml) eluiert, indem die NaCl-Konzentration von 0,15 M bis 1,0 M in dem Puffer gesteigert wurde. Die Proteinkonzentration, die Sulfotransferase-Aktivität in der Gegenwart von 10 mM DTT (Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität) und die Sulfotransferase-Aktivität in der Abwesenheit von DTT (Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität) wurden für jede der eluierten Fraktionen gemessen. Ergebnisse sind in 2 gezeigt.

Unter den, wie oben beschrieben, erhaltenen Fraktionen, die die Herapransulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität enthalten, wurden Fraktionen gesammelt, die durch eine dicke Linie in 2 gezeigt sind. Die Konzentration von Triton X-100 wurde auf 1% erhöht, gefolgt von einer Dialyse gegen Puffer A, der 1 M NaCl enthält, und gefolgt von einer Dialyse gegen Puffer A, der 0,05 M NaCl enthält.

(iv) Vierter Schritt Zweite 3'-5'-ADP-Agarose-Chromatographie

Die in dem dritten Schritt erhaltene Fraktion wurde auf eine 3'-5'-ADP-Agarose-Säule in der gleichen Weise, wie es bei der ersten Chromatographie gemacht wurde, aufgetragen, um eine Chromatographie durchzuführen. Als ein Ergebnis der Chromatographie stieg der Reinigungsgrad 11-fach an und die spezifische Aktivität war in dieser Phase 26.700-fach. Die NaCl-Konzentration einer mit Puffer A eluierten Fraktion, der 0,2 mM 3'-5'-ADP und 0,05 M NaCl enthält, wurde auf 0,15 M eingestellt, und dann wurde die Fraktion auf 8 ml unter Verwendung von Polyethylen-Glycol, in der gleichen Weise wie oben beschrieben, konzentriert. Das Konzentrat wurde gegen Puffer A dialysiert, der 0,1 M NaCl enthält, und wurde danach auf eine kleine Heparin-Sepharose-Säule (Bed-Volumen: 0,6 ml) aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer B gewaschen (identisch mit Puffer A, außer dass nur die Konzentration von Triton X-100 auf 0,02% verändert wurde), der 0,1 M NaCl enthält, gefolgt von einer Elution mit Puffer B, der 1 M NaCl (2,5 ml) enthält. Diese eluierte Lösung wurde auf 0,5 ml konzentriert und das Konzentrat wurde für den nächsten Reinigungsschritt verwendet.

(v) Fünfter Schritt Superose-12-Gel-Chromatographie

Die in dem vierten Schritt erhaltene Fraktion wurde auf eine Superose-12-Säule aufgetragen, die mit Puffer A equilibriert ist, der 2 M NaCl enthält. Eine Chromatographie wurde bei einer Flussrate von 0,25 ml/Minute durchgeführt, um in jede Fraktion von 0,25 ml zu fraktionieren. Jede der eluierten Fraktionen wurde auf die Sulfotransferase-Aktivität in der Gegenwart von 10 mM DTT (Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität) und die Sulfotransferase-Aktivität in der Abwesenheit von DTT (Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität) gemessen. Eine Hauptaktivität der Sulfotransferase wurde in der Umgebung von einem Molekulargewicht von 130.000 eluiert (Peak auf einer Seite eines hohen Molekulargewichts in 3 (Peak I)). Auf der anderen Seite wurde eine Nebenaktivität, die durch DTT inhibiert wurde, in der Umgebung eines Molekulargewichts von 42.000 (Peak auf einer Seite eines niedrigen Molekulargewichts (Peak II)) eluiert. Eine Heparansulfat-2-Sulfotransferase wird nicht durch DTT inhibiert, aber eine Heparansulfat-6-Sulfotransferase wird durch DTT inhibiert. Entsprechend scheint der Peak in der Umgebung des Molekulargewichts von 42.000 eine Heparansulfat-6-Sulfotransferase zu sein. Zusätzlich ist dieses Molekulargewicht gut übereinstimmend mit einem Molekulargewicht einer Heparansulfat-6-Sulfotransferase, die in einem vorher berichteten Dokument durch die vorliegenden Erfinder beschrieben ist. Des Weiteren enthielt ein Heparitinase-Verdau eines 35S-markierten CDSNS-Heparins unter Verwendung der Fraktion von Peak II &Dgr;Di-(N, 6) diS als eine Hauptkomponente. Fraktionen, die eine Sulfotransferase-Aktivität enthalten, die nicht durch DTT inhibiert wird (übereinstimmend zu dem Abschnitt, der als eine dicke Linie in 3 dargestellt ist), wurden vereinigt, gegen Puffer A dialysiert, der 0,15 M NaCl enthält, und bei –20°C gelagert.

Wie oben beschrieben, wurde die Heparansulfat-2-Sulfotransferase gegenüber dem Rohextrakt um etwa 51.700-fach durch den Reinigungsprozess von fünf Schritten gereinigt, und es gab, wie unten beschrieben (4), zwei annähernd homogene Banden in einer SDS-PAGE. Der Reinigungsgrad in jedem der Schritte ist in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2
(3) Analyse eines gereinigten Enzyms durch eine SDS-PAGE

Das gereinigte Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Enzym und Proben aus jedem der Reinigungsschritte, welche, wie oben beschrieben, erhalten werden, wurden einer SDS-PAGE unter Verwendung eines 10%-igen Gels gemäß einem Verfahren von Laemmli (Laemmli, U. K. (1970) Nature, 227, 680–685) unterzogen. Proteinbanden wurden durch eine Silberfärbung detektiert. Ein Ergebnis einer SDS-PAGE des gereinigten Enzyms ist in 4 gezeigt. Ein Ergebnis einer SDS-PAGE der Proben aus jedem der Reinigungsschritt ist in 5 gezeigt. Nah beieinander liegende breite Banden von etwa 44 kDa und etwa 47 kDa wurden vornehmlich in der Fraktion gefunden, die durch eine Superose-12-Gel-Chromatographie erhalten wird (4). Beurteilend aus dem Elutionsmuster der Enzymaktivität, scheinen die zwei äußerst nah beieinander liegenden Banden, die die Molekulargewichte von etwa 44 kDa und etwa 47 kDa aufweisen, mit der Heparansulfat-2-Sulfotransferase übereinzustimmen.

Als nächstes wurde es untersucht, ob eine oder keine Zuckerkette in dem Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Protein vorhanden war. Das Enzymprotein wurde durch Zugabe von TCA (Trichloressigsäure) zu einer Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Lösung präzipitiert, die 0,15 &mgr;g des Proteins enthält, so dass die Endkonzentration 10% wurde. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das Präzipitat wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet und dann bei einer Temperatur von 37°C für 16 Stunden in einer unten beschriebenen Reaktionslösung belassen.

Die Reaktionslösung enthielt 0,05 M Tris-HCl, pH 7,8, das 0,5% Sodium-Dodecyl-Sulfat (SDS) (10 &mgr;l) enthält, 7,5% (w/v) Nonidet P-40 (5 &mgr;l), 0,25 M EDTA (1,2 &mgr;l), Phenylmethylsulfonylfluorid (0,3 &mgr;l) und 0,5 Unit einer N-Glycanase (rekombinante N-Glycanase: hergestellt von Genzyme).

Als ein Analyseergebnis der oben beschriebenen Reaktionslösung mittels SDS-PAGE verschwanden die nah beieinander liegenden Proteinbanden von 44 kDa und 47 kDa, und Proteinbanden von 34 kDa und 38 kDa erschienen (6). Gemäß diesem Ergebnis wird es vorgeschlagen, dass die Proteine beider Banden Glycoproteine sind, die nicht weniger als 19 Gewichtsprozent Zucker enthalten.

(4) Substratspezifität und Wirkung einer Heparansulfat-2-Sulfotransferase

Um die Substratspezifität der Heparansulfat-2-Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, wurde die Aktivität, um eine 35S-Sulfatgruppe von [35S]-PAPS zu übertragen, unter Verwendung des gereinigten Enzyms und unter Verwendung verschiedener Substrate (25 nmol) als Akzeptoren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Umklammerte Zahlen in der Tabelle zeigen die Aktivität an, um eine Sulfatgruppe in Bezug auf jeden Akzeptor zu übertragen, wenn die Aktivität, um eine Sulfatgruppe unter Verwendung von CDSNS-Heparin als der Akzeptor zu übertragen, als 100 betrachtet wird.

Tabelle 3

Die Heparansulfat-2-Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung übertrug eine Sulfatgruppe zu CDSNS-Heparin und Heparansulfat, welche von einem EHS-Turmor stammen, und übertrug eher schwach eine Sulfatgruppe zu Heparansulfat, das aus einer Schweine-Aorta und einer Rinder-Leber stammt. Jedoch wurde im Hinblick auf Chondroitin, Chondroitinsulfat A und C, Dermatansulfat und Keratansulfat keine Übertragung beobachtet.

Um die Position einer Sulfatgruppe zu untersuchen, die durch die Heparansulfat-2-Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von CDSNS-Heparin und Heparansulfat aus einem EHS-Tumor als Akzeptoren und unter Verwendung von [35S]-PAPS als ein Sulfatgruppendonor übertragen wurde, wurden die Transfer-Reaktions-Produkte bei 37°C für zwei Stunden mit 50 &mgr;l einer gemischten Lösung verdaut, die etwa 25 nmol eines Reaktionsprodukts, 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1 mM CaCl2, 2 &mgr;g Rinderserum-Albumin (BSA), 10 mU Heparitinase I, 1 mU Heparitinase II und 10 mU Heparitinase III enthält.

Der Verdau wurde zusammen mit ungesättigten Standarddisacchariden gemäß einem bekannten Verfahren (Habuchi, H. et al., (1992) Biochem. J., 285, 805–813) unter Verwendung einer HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie, Säule: Siliziumsäule mit gebundenem Polyamin (PAMN-Säule)) getrennt, in Aliquots von jeweils 0,6 ml fraktioniert und mit 3 ml eines Flüssigkeits-Szintillators (Ready Safe Scintillator, hergestellt von Beckman) gemischt, um eine Radioaktivität unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers zu messen. Eine Heparitinase ist ein Enzym, das eine &agr;-N-Acetyl/-Sulfo-D-Glucosaminyl (1 → 4)-Uronsäure-Binding eines Heparansulfats in der Art und Weise einer Eliminations-Reaktion schneidet, um Oligosaccharide herzustellen, die eine &Dgr;4-Hexuronsäure an deren nicht reduzierendem Ende aufweisen.

Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt (A: CDSNS-Heparin als ein Substrat, B: Heparansulfat aus einem EHS-Tumor als ein Substrat). In 7 zeigen die bezifferten Pfeile 1 bis 5 Positionen einer Elution von unten gezeigten ungesättigten Disacchariden an (siehe Formel 1 und Tabelle 4). „&Dgr;DiHS" zeigt ungesättigte Disaccharide an, die durch einen Verdau von Heparin und Heparansulfat durch eine Heparitinase hergestellt sind. „6, N" zeigt eine Position einer Sulfatierung eines Glucosamins an. „U" zeigt an, dass die C-2-Position einer Uronsäure sulfatiert ist.

  • 1: &Dgr;DiHS-6S
  • 2: &Dgr;DiHS-NS
  • 3: &Dgr;DiHS-di (6, N)S
  • 4: &Dgr;DiHS-di (U, N)S
  • 5: &Dgr;DiHS-tri (U, 6, N)S

Tabelle 4

Als ein Ergebnis fiel fast die gesamte Radioaktivität mit der Elutionsposition eines Standard-&Dgr;DiHS-di (U, N)S zusammen, wenn CDSNS-Heparin als ein Akzeptor verwendet wurde (7A). Wenn auf der anderen Seite Heparansulfat von einem EHS-Tumor als ein Akzeptor verwendet wurde, fiel fast die gesamte Radioaktivität in ähnlicher Weise mit der Elutionsposition eines Standard-&Dgr;DiHS-di (U, N)S zusammen (7B).

Des Weiteren wurden das CDSNS-Heparin und das Heparansulfat von einem EHS-Tumor, welche wie oben beschrieben 35S-markiert waren, mit Nitrit bei pH 1,5 abgebaut und dann mit NaBH4 reduziert, um Disaccharid-Fraktionen zu erhalten, und die Fraktionen wurden entsprechend durch eine HPLC unter Verwendung einer Partisil-10-SAX-Säule analysiert. Ein Analyseergebnis der Disaccharid-Fraktion, die vom CDSNS-Heparin stammt, ist in 8A gezeigt. Ein Analyseergebnis der Disaccharid-Fraktion, die aus einem Heparansulfat aus einem EHS-Tumor stammt, ist in 8B gezeigt. Wie unten beschrieben, zeigen in 8A und 8B bezifferte Pfeile 1 bis 5 Elutionspositionen von Disacchariden an. „AMan" zeigt eine 2,5-Anhydro-D-Mannose an und „R" zeigt ein durch eine Reduzierung mit NaBH4 erhaltenes Alditol an. „(2SO4)" zeigt an, dass eine C-2-Position sulfatiert ist. „(6SO4)" zeigt an, dass eine C-6-Position sulfatiert ist.

  • 1: HexA-AManR
  • 2: GlcA (2SO4)-AManR
  • 3: GlcA-AManR (6SO4)
  • 4: IdoA-AManR (6SO4)
  • 5: IdoA (2SO4)-AManR

Als ein Ergebnis fiel fast die gesamte Radioaktivität mit der Elutionsposition von IdoA (2SO4),-AManR zusammen, unabhängig davon, welcher Akzeptor verwendet wird.

Entsprechend den oben beschriebenen Ergebnissen ist es gezeigt worden, dass die Heparansulfat-2-Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes überträgt, der an einen N-Sulfoglucosaminrest anschließt. Eine Sulfatierung eines Glucosaminrests durch das Enzym der vorliegenden Erfindung wurde nicht beobachtet.

(5) Andere enzymatische Eigenschaften einer Heparansulfat-2-Sulfotransferase (i) pH-Optimum

Ein pH-Optimum des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde gemessen. Als Puffer wurden 50 mM Tris-HCl, 50 mM Imidazol-HCl, 50 mM MES-Puffer (hergestellt von Nacalai Tesque) und 50 mM Kaliumacetat-Puffer verwendet, um die Enzymaktivität bei verschiedenen pH's zu messen. Relative Aktivitäten mit Bezug auf eine Enzymaktivität im Imidazol-HCl-Puffer (pH 6,8) sind jeweils in 9 gezeigt. Als ein Ergebnis zeigte das Enzym der vorliegenden Erfindung hohe Enzymaktivitäten bei etwa pH 5 bis 6,5. Eine Spitzenaktivität wurde bei etwa pH 5,5 erhalten.

(ii) Ionenstärke-Optipmum

Um den Einfluss der Ionenstärke auf die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, wurde NaCl zu der Enzym-Reaktionslösung in verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben, um die Enzymaktivität zu untersuchen. Ein Ergebnis ist in 10 gezeigt. Entsprechend dem Ergebnis zeigt das Enzym der vorliegenden Erfindung hohe Enzymaktivitäten in der Umgebung von 50 bis 200 mM NaCl. Eine Spitzenaktivität wurde bei etwa 100 mM NaCl beobachtet. Diese Eigenschaft ist unterschiedlich zu der der N-Sulfotransferase, dessen Aktivität in einer NaCl-konzentrationsabhängigen Weise inhibiert wird.

(iii) Inhibierung und Aktivierung des Enzyms der vorliegenden Erfindung

Um den Einfluss von DTT auf die Aktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, wurde DTT in verschiedenen Konzentrationen zu einer Reaktionslösung hinzugegeben, um die Enzymaktivität zu messen (11). DTT inhibierte die Aktivität bis zu 10 mM kaum. Diese Eigenschaft unterscheidet sich extrem von der einer Heparansulfat-6-Sulfotransferase.

Der Einfluss von Protamin auf die Enzymaktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde untersucht. Ein Ergebnis ist in 12 gezeigt. Die Aktivität der Heparansulfat-2-Sulfotransferase stieg durch Protamin in der gleichen Weise wie die der Chondroitin-4-Sulfotransferase, der Chondroitin-6-Sulfotransferase und der Heparansulfat-6-Sulfotransferase bemerkenswert an.

Als ein Untersuchungsergebnis über den Einfluss von 3'-5'-ADP auf die Enzymaktivität des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde eine starke inhibitorische Wirkung in der gleichen Weise wie bei anderen Sulfotransferasen gefunden.

(iv) Messung einer Michaelis-Konstante

Die Michaelis-Konstante (Km) wurde für das Enzym der vorliegenden Erfindung bestimmt, wenn ein CDSNS-Heparin als ein Sulfatgruppenakzeptor und PAPS als ein Donor verwendet wurde. PAPS (0,125 bis 5 &mgr;m) wurde zu 50 &mgr;l einer Reaktionslösung hinzugegeben, die 0,19 Unit des Enzyms der vorliegenden Erfindung und 25 nmol CDSNS-Heparin enthält, wie es in einer Hexosamin-Menge umgesetzt ist, und bei 37°C für 20 Minuten reagiert, um die Initialgeschwindigkeiten der Reaktion zu messen. Ein Lineweaver-Burk-Plot wurde hergestellt und die Michaelis-Konstante wurde berechnet. Als ein Ergebnis war Km für das Enzym der vorliegenden Erfindung für PAPS 2,0 × 10–7 M.


Anspruch[de]
  1. Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase, die die folgenden Eigenschaften aufweist:

    (i) Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor selektiv zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines Sulfatgruppenakzeptors übertragen,

    (ii) Substratspezifität: Die Sulfatgruppe wird zu Heparansulfat, Heparin oder CDSNS-Heparin übertragen, aber die Sulfatgruppe wird nicht zu Chondroitin, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Keratansulfat übertragen,

    (iii) pH-Reaktionsoptimum: Etwa 5 bis 6,5,

    (iv) Ionenstärke-Optimum: Etwa 50 bis 200 mM bei Verwendung von Natriumchlorid,

    (v) Inhibition und Aktivierung: Die Aktivität des Enzyms wird durch Protamin erhöht; die Aktivität des Enzyms wird durch Adenosin-3',5'-diphospat inhibiert und die Aktivität des Enzyms wird durch Dithiothreitol bei 10 mM oder weniger kaum beeinflusst, und

    welche ein durch die Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmtes Molekulargewicht von etwa 44 kDa oder etwa 47 kDa aufweist.
  2. Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase nach Anspruch 1, wobei der Sulfatgruppendonor 3'-Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat ist.
  3. Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase nach Anspruch 1, welche ein Glycoprotein ist.
  4. Verfahren zur Herstellung der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Schritte der Kultivierung von Zellen in einem Kulturmedium, welche aus dem Ovar von chinesischen Hamstern stammen, und Isolierung der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase aus dieser Kultur.
  5. Verfahren zur Herstellung der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase nach Anspruch 4, wobei die Zellen CHO-Zellen (ATCC CCL61) sind.
  6. Verfahren zur Herstellung der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase nach Anspruch 5, wobei der Isolierungsschritt eine Reinigung durch eine Adenosin-3',5'-diphosphat-Affinitätssäulenchromatographie umfasst.
Es folgen 9 Blatt Zeichnungen






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