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Dokumentenidentifikation DE69924484T2 22.09.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001080208
Titel DSRNA-BEDINGTE REGULATION DER GEN-EXPRESSION IN PFLANZEN
Anmelder Syngenta Participations AG, Basel, CH
Erfinder HEIFETZ, Bernard, Peter, San Diego, US;
PATTON, Andrew, David, Durham, US;
LEVIN, Zvi, Joshua, Durham, US;
QUE, Qiudeng, Apex, US;
DE FRAMOND, Jeanne, Annick, Pittsboro, US;
DUNN, M., Martha, Hillsborough, US;
CHEN, Shong, Jeng, Chapel Hill, US
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69924484
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 25.05.1999
EP-Aktenzeichen 999264146
WO-Anmeldetag 25.05.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/EP99/03608
WO-Veröffentlichungsnummer 0099061631
WO-Veröffentlichungsdatum 02.12.1999
EP-Offenlegungsdatum 07.03.2001
EP date of grant 30.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.09.2005
IPC-Hauptklasse C12N 15/63
IPC-Nebenklasse C12N 15/82   A01H 5/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Veränderung der Expression von Genen in Pflanzen, insbesondere unter Verwendung von senseund antisense-RNA-Fragmenten der Gene, und Pflanzen mit veränderter Genexpression, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.

Entwicklungen in den Techniken der Molekularbiologie und Pflanzentranformation haben die Erzeugung von transgenen Pflanzen mit verschiedenen wünschenswerten Merkmalen erlaubt, zum Beispiel Resistenz gegen Insekten und pilzliche oder mikrobielle Pathogene, Toleranz gegenüber Herbiziden oder Merkmale mit zusätzlichem Wert. Diese wünschenswerten Merkmale werden hauptsächlich durch Überexpression eines Transgens in der Pflanze erhalten. Jedoch ist es in einigen Fällen ebenfalls wünschenswert, Pflanzen so zu modifizierten, daß die Expression eines besonderen Gens verändert ist, um Pflanzen mit wünschenswerten Phänotypen oder Eigenschaften von kommerziellem Interesse zu schaffen. Derzeitige Verfahren zur Veränderung der Expression eines Gens beruhen gewöhnlich Techniken der sense- oder antisense-Unterdrückung. Zum Beispiel führt die sense-Unterdrückung eines Chalconsynthase-Gens in Petunia zu Blüten mit veränderter Pigmentierung, und die antisense-Unterdrückung eines Polygalacturonidase-Gens in der Tomate führt zu verzögerter Fruchtreifung. Unglücklicherweise sind diese Verfahren häufig variabel und unvorhersehbar in ihrer Fähigkeit zur Veränderung der Genexpression, und in vielen Fällen wird eine vollständige Unterbrechung der besonderen Genaktivität nicht erreicht. Andere Verfahren zur Veränderung der Genexpression schließen die Verwendung katalytischer Ribonukleotide oder Ribozyme ein, was technisch herausfordernd sein kann, oder die homologe Genunterbrechung, die, obwohl sie genetisch höchst wünschenswert ist, unglücklicherweise nicht effizient genug mit derzeit verfügbaren Techniken zur routinemäßigen Verwendung für solche Zwecke ist. Deshalb besteht ein seit langem bestehender, aber unerfüllter Bedarf an neuen Verfahren, die die effektive und vorhersagbare Veränderung der Expression eines Gens in Pflanzenzellen zum Erhalt von Pflanzen mit verbesserten und gewerblich bedeutenden Eigenschaften erlauben.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften und Merkmalen unter Verwendung molekularer Techniken und genetischer Transformation. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Veränderung der Expression eines Gens in einer Pflanzenzelle unter Verwendung von Sense- und antisense-RNA-Fragmenten des Gens. Es ist wichtig, daß solche Sense- und antisense-RNA-Fragmente ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können. Die Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzenzellen, die unter Verwendung solcher Verfahren erhalten werden, aus solchen Zellen stammende Pflanzen, die Nachkommenschaft solcher Pflanzen und aus solchen Pflanzen stammende Samen. In solchen Pflanzenzellen oder Pflanzen ist die Veränderung der Genexpression eines besonderen Gens effektiver, selektiv und vorhersagbarer als die Veränderung der Genexpression eines besonderen Gens, die unter Verwendung von derzeit fachbekannten Verfahren erhalten wird.

EP 0 458 367 betrifft eine Technik zum Abschalten ("silencing") der Expression eines Gens durch Einführung von antisense-Kopien eines Zielgens in eine Zelle.

WO 99/32619 betrifft die Verwendung von doppelsträngiger RNA zur Manipulation der Genexpression im Nematoden C. elegans.

Fire et al. (Nature 1988, Bd. 391, S. 806-811) betrifft ebenfalls die Verwendung von doppelsträngiger RNA zur Manipulation der Genexpression in C. elegans.

WO 99/15682 betrifft die Genabschaltung in Pflanzen unter Verwendung eines als "transiently induced gene silencing" (TIGS) bezeichneten Verfahrens, das eine fremde Initiatornukleinsäure oder einen Nukleinsäurekomplex verwendet, die/der vorübergehend in eine Zelle eingeführt wird.

Die Erfindung stellt deshalb bereit:

Ein Verfahren zur Veränderung der Expression eines Zielgens in einer Pflanzenzelle, umfassend das Einführen, in eine Pflanzenzelle, eines sense-RNA-Fragments eines Zielgens und eines antisense-RNA-Fragments des Zielgens, worin das Sense-RNA-Fragment und das antisense-RNA-Fragment ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die RNA-Fragmente in zwei unterschiedlichen RNA-Molekülen enthalten. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die RNA-Fragmente vermischt, bevor sie in die Zelle eingeführt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die RNA-Fragment, bevor sie in die Zelle eingeführt werden, unter Bedingungen vermischt, die ihnen die Bildung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls erlauben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die RNA-Fragmente in die Zelle nach- einander eingeführt. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die RNA-Fragmente in einem RNR-Molekül enthalten. In diesem Fall kann sich das RNA-Molekül vorzugsweise so falten, daß die darin enthaltenen RNA-Fragmente ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden.

Die Erfindung stellt ferner bereit:

Ein Verfahren zur Veränderung der Expression eines Zielgens in einer Pflanzenzelle, umfassend das Einführen, in eine Pflanzenzelle, einer ersten DNA-Sequenz, die ein sense-RNA-Fragment eines Zielgens in der Zelle exprimieren kann, und einer zweiten DNA-Sequenz, die ein antisense-RNA-Fragment des Zielgens in der Zelle exprimieren kann, worin die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz in zwei unterschiedlichen DNA-Molekülen enthalten sind und die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz stabil im Genom der Pflanzenzelle integriert sind und das sense-RNA-Fragment und das antisense-RNA-Fragment ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das DNA-Molekül ferner einen ersten Promotor, der funktionsfähig mit der ersten oder der zweiten DNA-Sequenz verbunden ist.

In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das DNR-Molekül ferner einen ersten Promotor, der funktionsfähig mit der ersten DNA-Sequenz verbunden ist, und einen zweiten Promotor, der funktionsfähig mit der zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, worin der erste Promotor und der zweite Promotor den gleichen Promotor umfassen oder unterschiedliche Promotoren umfassen.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Zielgen ein natives Gen der Pflanzenzelle, bevorzugt ein essentielles Gen der Pflanzenzelle. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein Promotor im DNA-Molekül den nativen Promotor des nativen Zielgens. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ein heterologer Promotor, zum Beispiel ein gewebespezifischer Promotor, ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor, ein konstitutiver Promotor oder ein induzierbarer Promotor. Gegebenenfalls ist der Promotor ein divergenter Promotor, der die Transkription von DNA-Sequenzen an jeder Seite des Promotors einleiten kann. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Gen ein heterologes Gen in der Pflanzenzelle, das bevorzugt stabil im Genom der Pflanzenzelle integriert ist oder alternativ in der Pflanzenzelle als ein extrachromosomales Molekül vorhanden ist.

Die Erfindung stellt ebenfalls ferner bereit:

Eine Pflanzenzelle, die sense- und antisense-RNA-Fragmente der vorliegenden Erfindung umfaßt, worin die Expression des Zielgens in der Pflanzenzelle durch die RNA-Fragmente verändert ist, eine Pflanze und ihre Nachkommenschaft, die aus der Pflanzenzelle stammen, und aus der Pflanze stammende Samen.

Die Erfindung stellt ebenfalls ferner bereit:

Eine Pflanzenzelle, die durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird.

Ein "doppelsträngiges RNA- (ds-RNA)"-Molekül umfaßt ein sense-RNA-Fragment eines Zielgens und ein antisense-RNA-Fragment des gleichen Zielgens, die beide zueinander komplementäre Nukleotidsequenzen umfassen, wodurch den sense- und antisense-RNA-Fragmenten die Paarung und Bildung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls erlaubt wird.

"Komplementär" bezeichnet zwei Nukleotidsequenzen, die antiparallele Nukleotidsequenzen umfassen, die miteinander bei Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen den komplementären Basenresten in den antiparallelen Nukleotidsequenzen paaren können.

"Antiparallel" bezeichnet hier zwei Nukleotidsequenzen, die durch Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basenresten gepaart sind, wobei Phosphodiester-Bindungen in der 5'-3'-Richtung in einer Nukleotidsequenz und in der 3'-5'-Richtung in der anderen Nukleotidsequenz laufen.

Ein "Zielgen" ist jedes Gen in einer Pflanzenzelle. Zum Beispiel ist ein Zielgen ein Gen mit bekannter Funktion oder ein Gen, dessen Funktion unbekannt ist, aber dessen gesamte oder teilweise Nukleotidsequenz bekannt ist. Alternativ sind sowohl die Funktion eines Zielgen als auch seine Nukleotidsequenz unbekannt. Ein Zielgen ist ein natives Gen der Pflanzenzelle oder ein heterologes Gen, das zuvor in die Pflanzenzelle oder eine Mutterzelle der Pflanzenzelle eingeführt wurde, zum Beispiel durch genetische Transformation. Ein heterologes Zielgen ist stabil im Genom der Pflanzenzelle integriert oder ist in der Pflanzenzelle als ein extrachromosomales Molekül vorhanden, zum Beispiel als ein sich autonom vervielfältigendes extrachromosomales Molekül.

Ein "natives" Gen bezeichnet ein Gen, das im Genom der untransformierten Pflanzenzelle vorhanden ist.

Ein "essentielles" Gen ist ein Gen, das ein Protein codiert, wie z.B. ein biosynthetisches Enzym, einen Rezeptor, ein Signalleitungsprotein, ein strukturelles Genprodukt oder ein Transportprotein, das essentiell für das Wachstum oder Überleben der Pflanze ist.

Die "Veränderung" der Expression eines Zielgens in einer Pflanzenzelle bedeutet, daß die Stärke der Expression des Zielgens in einer Pflanzenzelle nach Anwendung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung von seiner Expression in der Zelle vor dem Anwenden des Verfahrens verschieden ist. Die Veränderung der Genexpression bedeutet bevorzugt, daß die Expression des Zielgens in der Pflanzenzelle reduziert ist, bevorzugt stark reduziert ist, besonders bevorzugt die Expression des Gens nicht detektierbar ist. Die Veränderung der Expression eines essentiellen Gens kann zu einem Knockout-mutierten Phänotyp in Pflanzenzellen oder daraus stammenden Pflanzen führen.

"Isoliert" ist im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das von Menschenhand neben seiner nativen Umgebung existiert und deshalb nicht ein Produkt der Natur ist. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kann in einer gereinigten Form existieren oder kann in einer nicht-nativen Umgebung existieren, wie zum Beispiel in einer transgenen Wirtszelle.

"Expressionskassette", wie hier verwendet, bezeichnet eine DNA-Sequenz, die die Expression einer besonderen Nukleotidsequenz in einer geeigneten Wirtszelle ausrichten kann, umfassend einen funktionsfähig mit der interessierenden Nukleotidsequenz verbundenen Promotor, der funktionsfähig mit Terminationssignalen verbunden ist. Sie umfaßt typischerweise ebenfalls Sequenzen, die zur passenden Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind. Die codierende Region codiert gewöhnlich für ein interessierendes Protein, aber kann ebenfalls für eine interessierende funktionelle RNA codieren, zum Beispiel antisense-RNA oder eine nicht-translatierte RNA, in der sense- oder antisense-Richtung. Die Expressionskassette, die die interessierende Nukleotidsequenz umfaßt, kann chimär sein, was bedeutet, daß wenigstens eine ihrer Komponenten heterolog in bezug auf wenigstens eine ihrer anderen Komponenten ist. Die Expressionskassette kann ebenfalls eine solche sein, die natürlich vorkommt, aber in einer rekombinanten Form erhalten wurde, die zur heterologen Expression nützlich ist. Typischerweise ist die Expressionskassette jedoch heterolog in bezug auf den Wirt, d.h. die besondere DNA-Sequenz der Expressionskassette tritt nicht natürlich in der Wirtszelle auf und muß in die Wirtszelle oder einen Vorfahren der Wirtszelle durch ein Transformationsereignis eingeführt worden sein. Die Expression der Nukleotidsequenz in der Expressionskassette kann unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren Promotors stehen, der die Transkription nur einleitet, wenn die Wirtszelle einem gewissen besonderen äußeren Reiz ausgesetzt wird. Im Fall eines mehrzelligen Organismus, wie einer Pflanze, kann der Promotor auch spezifisch für ein besonderes Gewebe oder Organ oder ein Entwicklungsstadium sein.

"Heterolog", wie hier verwendet, bedeutet "von unterschiedlichem natürlichem Ursprung" oder stellt einen nicht-natürlichen Zustand dar. Falls zum Beispiel eine Wirtszelle mit einer Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die aus einem anderen Organismus stammt, insbesondere aus einer anderen Art, dann ist die Nukleinsäuresequenz heterolog in bezug auf die Wirtszelle und ebenfalls in bezug auf Nachkommen der Wirtszelle, die die Nukleinsäuresequenz tragen. In ähnlicher Weise bezeichnet heterolog eine Nukleotidsequenz, die aus einem natürlichen ursprünglichen Zelltyp stammt und in denselben inseriert ist, aber die in einem nicht-natürlichen Zustand vorhanden ist, z.B. mit einer unterschiedlichen Kopiezahl oder unter der Kontrolle unterschiedlicher regulatorischer Elemente.

In seinem breitesten Sinne bedeutet der Begriff "im wesentlichen ähnlich", wenn er hier in bezug auf eine Nukleotidsequenz verwendet wird, eine Nukleotidsequenz, die einer Referenz-Nukleotidsequenz entspricht, worin die entsprechende Sequenz ein Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Struktur und Funktion wie das Polypeptid codiert, das durch die Referenz-Nukleotidsequenz codiert wird, zum Beispiel wenn nur Veränderungen in den Aminosäuren auftreten, die nicht die Polypeptidfunktion beeinflussen. Wünschenswert codiert die im wesentlichen ähnliche Nukleotidsequenz das Polypeptid, das durch die Referenz-Nukleotidsequenz codiert wird. Der Prozentwert der Identität zwischen der im wesentlichen ähnlichen Nukleotidsequenz und der Referenz-Nukleotidsequenz (Anzahl von komplementären Basen in der komplementären Sequenz geteilt durch die Gesamtanzahl von Basen in der komplementären Sequenz) ist wünschenswert wenigstens 80 %, besonders wünschenswert 85 %, vorzugsweise wenigstens 90 %, besonders bevorzugt wenigstens 95 %, noch mehr bevorzugt wenigstens 99 %.

"Regulatorische Elemente" bezeichnen Sequenzen, die an der Übertragung der Expression einer Nukleotidsequenz beteiligt sind. Regulatorische Elemente umfassen einen Promotor, der funktionsfähig mit der interessierenden Nukleotidsequenz verbunden ist, und Terminationssignale. Sie umfassen typischerweise ebenfalls Sequenzen, die zur passenden Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind.

Eine "Pflanze" bezeichnet jede Pflanze oder jedes Teil einer Pflanze in jedem Entwicklungsstadium. Darin eingeschlossen sind ebenfalls Stecklinge, Zell- oder Gewebekulturen und Samen. Wie in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet, schließt der Begriff "Pflanzengewebe" ein, aber ist nicht beschränkt auf ganze Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzenorgane, Pflanzensamen, Protoplasten, Kallus, Zellkulturen und jede Gruppe von Pflanzenzellen, die zu strukturellen und/oder funktionellen Einheiten organisiert sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Regulation der Genexpression in Pflanzenzellen. Üblicherweise verfügbare Verfahren zur Regulation der Expression eines Gens in Pflanzenzellen fehlt es an Vorhersagbarkeit, und sie zeigen Variabilität in Abhängigkeit davon, welches Gen reguliert werden soll. Das vorliegende Verfahren mildert diese Probleme und liefert eine reproduzierbare und wirksame Regulation eines Gens in Pflanzenzellen.

Die vorliegende Erfindung verwendet ein sense-RNA-Fragment und ein antisense-RNA-Fragment eines Zielgens zur Veränderung der Expression des Gens in einer Pflanzenzelle. In einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Veränderung der Expression eines Zielgens in einer Pflanzenzelle bereit, umfassend das Einführen, in eine Pflanzenzelle, eines Sense-RNA-Fragments eines Zielgens und eines antisense-RNA-Fragments des Zielgens, worin das Sense-RNA-Fragment und das antisense-RNA-Fragment ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können, worin die Expression des Zielgens in der Zelle verändert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die RNA-Fragmente in die Pflanzenzelle durch unterschiedliche Transformationsverfahren eingeführt. Zum Beispiel werden die RNA-Fragmente auf die Wirtszellen unter Verwendung von Teilchenbeschuß übertragen, wie in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung 08/717,676 beschrieben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die RNA-Fragmente in die Protoplasten oder andere Typen von Zellen durch PEG-vermittelte Transformation eingeführt, wie beschrieben in Lebel et al. (1995) Theor. Appl. Genet., 91: 899-906, oder durch Elektroporation. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden andere Techniken verwendet, wie zum Beispiel Mikroinjektion der RNA-Fragmente.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die RNA-Fragmente in zwei unterschiedlichen RNA-Molekülen enthalten. In diesem Fall werden die RNA-Fragmente, bevor sie in die Zelle eingeführt werden, zum Beispiel unter Bedingungen vermischt, die ihnen die Bildung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls erlauben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die RNA-Fragmente nacheinander in die Zelle eingeführt. Bevorzugt ist das Zeitintervall zwischen der Einführung jedes der RNA-Moleküle kurz, bevorzugt weniger als eine Stunde. In noch einer anderen Ausführungsform sind die RNA-Fragmente in einem RNA-Molekül enthalten. Durch Verwendung eines einzelnen RNA-Moleküls befinden sich die zwei komplementären RNA-Fragmente in großer Nähe, so daß die Paarung und Doppelstrangbildung begünstigt wird. In diesem Fall kann sich das RNA-Molekül bevorzugt so falten, daß die darin enthaltenen RNA-Fragmente eine doppelsträngige Region bilden. In diesem Fall erkennen sich die komplementären Teile der RNA-Fragmente gegenseitig, paaren miteinander und bilden das doppelsträngige RNA-Molekül. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die RNA-Fragmente unter Bedingungen inkubiert, die ihnen die Bildung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls vor der Einführung der Zelle erlauben. In noch einer anderen Ausführungsform umfaßt das RNA-Molekül einen Linker zwischen dem sense-RNA-Fragment und dem antisense-RNA-Fragment. Der Linker umfaßt bevorzugt eine RNA-Sequenz, die durch eine Expressionskassette codiert wird, die ein funktionelles Gen umfaßt, zum Beispiel ein selektierbares Markergen. In einer anderen Ausführungsform umfaßt der Linker eine RNA-Sequenz, die durch regulatorische Sequenzen codiert wird, die zum Beispiel Intron-Reifungssignale umfassen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Veränderung der Expression eines Zielgens in einer Pflanzenzelle bereit, umfassend das Einführen, in eine Pflanzenzelle, einer ersten DNA-Sequenz, die ein sense-RNA-Fragment eines Zielgens in der Zelle exprimieren kann, und einer zweiten DNA-Sequenz, die ein antisense-RNA-Fragment des Zielgens in der Zelle exprimieren kann, worin die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz in zwei unterschiedlichen DNA-Molekülen enthalten sind und die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz stabil im Genom der Pflanzenzelle integriert sind und das sense-RNA-Fragment und das antisense-RNA-Fragment ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können.

In der vorliegenden Erfindung sind die DNA-Sequenzen in zwei unterschiedlichen DNA-Molekülen enthalten. Die erste DNA-Sequenz ist funktionsfähig mit einem ersten Promotor verbunden, und die zweite DNA-Sequenz ist funktionsfähig mit einem zweiten Promotor verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die zwei Promotoren den gleichen Promotor oder umfassen alternativ unterschiedliche Promotoren. Terminationssignale sind ebenfalls optional in den DNA-Molekülen eingeschlossen.

In den DNA-Molekülen der vorliegenden Erfindung sind die DNA-Sequenzen bevorzugt funktionsfähig mit Promotoren verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein Promotor im DNA-Molekül einen nativen Promotor des nativen Zielgens, das inaktiviert werden soll, um sicherzustellen, daß die doppelsträngige RNA in den gleichen Geweben und zum gleichen Zeitpunkt in der Entwicklung vorhanden ist, wenn das Zielgen exprimiert wird. In einer anderen Ausführungsform ist der Promotor ein heterologer Promotor, zum Beispiel ein gewebespezifischer Promotor, ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor, ein konstitutiver Promotor, ein divergenter oder ein induzierbarer Promotor. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Gen ein heterologes Gen in der Pflanzenzelle. Terminationssignale sind ebenfalls optional in den DNA-Molekülen eingeschlossen.

Die zwei unterschiedlichen RNA-Moleküle können bevorzugt eine doppelsträngige Region bilden, in der die komplementären Teile der RNA-Fragmente einander erkennen, miteinander paaren und das doppelsträngige RNA-Molekül bilden. DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung werden in Pflanzenzellen transformiert unter Verwendung von Verfahren, die allgemein fachbekannt oder nachfolgend beschrieben sind. Zum Beispiel wird Mikroprojektilbeschuß, Mikroinjektion oder Agrobakterium-vermittelte Transformation verwendet. Ebenfalls wird die Transformation von Protoplasten mit DNA-Molekülen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Elektroporation oder chemischer Behandlung (z.B. PEG-Behandlung) verwendet.

Alternativ werden virale Vektoren verwendet, um DNA-Moleküle oder RNA-Fragmente der vorliegenden Erfindung in Pflanzenzellen einzuführen, zum Beispiel durch sogenannte Agroinfektion. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden DNA-Moleküle oder RNA-Fragmente der vorliegenden Erfindung in Pflanzenzellen eingeführt durch Vakuuminfiltration oder durch Reiben auf der Blattoberfläche.

Die Verfahren können zu Pflanzenzellen führen, die die sense- und antisense-RNA-Fragmente der vorliegenden Erfindung umfassen, worin die Expression des Zielgens in der Pflanzenzelle durch die RNA-Fragmente verändert ist, zu einer Pflanze und ihrer Nachkommenschaft, die aus der Pflanzenzelle stammen, und zu Samen, die aus der Pflanze stammen.

In der vorliegenden Erfindung umfaßt die Länge der komplementären Region zwischen den sense- und antisense-RNA-Fragmenten wünschenswert wenigstens 15 Nukleotide, besonders wünschenswert wenigstens 50 Nukleotide, bevorzugt wenigstens 500 bp. Bevorzugt ist die komplementäre Region weniger als 5 kb, besonders bevorzugt weniger als 2 kb. Gegebenenfalls umfaßt die komplementäre Region zwischen den sense- und antisense-RNA-Fragmenten die codierende Region des Zielgens. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die komplementäre Region untranslatierte Regionen (UTR) des Zielgens, zum Beispiel 5'-UTR oder 3'-UTR. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stammt eine DNA-Sequenz, die ein sense- oder antisense-RNA-Fragment der vorliegenden Erfindung codiert, aus einem cDNA-Molekül. In einer anderen Ausführungsform umfassen die komplementären Sequenzen regulatorische Elemente des Zielgens, dessen Expression verändert wird, wie zum Beispiel einen Promotor oder Terminationssignale.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die komplementäre Region zwischen den sense- und antisense-RNA-Fragmenten identisch mit der entsprechenden Sequenz des Gens, dessen Expression verändert wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die komplementäre Region zwischen den sense- und antisense-RNA-Fragmenten im wesentlichen ähnlich der entsprechenden Sequenz des Gens, dessen Expression verändert wird, und kann noch die Expression des Gens verändern. In diesem Fall ist die komplementäre Region wünschenswert zu wenigstens 50 % identisch mit der entsprechenden Sequenz des Gens, dessen Expression verändert wird, besonders wünschenswert zu wenigstens 70 % identisch, bevorzugt zu wenigstens 90 % identisch, besonders bevorzugt wenigstens zu 95 % identisch. Dabei erlaubt die Verwendung eines einzelnen doppelsträngigen RNA-Moleküls die Veränderung der Expression eines einzelnen Gens oder einer Mehrzahl von Genen, wobei das einzelne Gen Sequenzen umfaßt, die identisch mit der doppelsträngigen RNA oder im wesentlichen ähnlich der doppelsträngigen RNA sind.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält die komplementäre Region zwischen den sense- und antisense-RNA-Fragmenten keinerlei Fehlübereinstimmung zwischen den sense- und antisense-RNA-Fragmenten. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die komplementäre Region zwischen den sense- und antisense-RNA-Fragmenten wenigstens eine Fehlübereinstimmung zwischen den sense- und antisense-RNA-Fragmenten, und die zwei RNA-Fragmente können noch paaren und ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden, wodurch die Expression des Gens verändert wird. Wünschenswert besteht weniger als 50 % Fehlübereinstimmung zwischen den sense- und antisense-RNA-Fragmenten in der komplementären Region, besonders wünschenswert weniger als 30 % Fehlübereinstimmung, bevorzugt weniger als 20 % Fehlübereinstimmung, besonders bevorzugt weniger als 10 % Fehlübereinstimmung, noch mehr bevorzugt weniger als 5 % Fehlübereinstimmung.

Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung wird zum Beispiel zur Veränderung der Expression eines Gens verwendet, das an einem Stoffwechselreaktionsweg einer Pflanzenzelle, an der Resistenz oder Anfälligkeit einer Pflanze für Krankheiten oder an der Zelldifferenzierung beteiligt ist. Solche Veränderungen führen zu Pflanzen mit gewerblich wichtigen verbesserten Merkmalen, wie Modifikationen des besonderen Stoffwechselreaktionsweges, Resistenz gegenüber Krankheiten oder Veränderung der Zelldifferenzierung. Andere Beispiele für Zielgene werden zum Beispiel in US-PSen 5,107,065, 5,283,184 und 5,034,323 beschrieben, die hier durch Verweis eingeführt werden. Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls zur Veränderung der Expression eines Gens verwendet, um seine Funktion zu enträtseln. In diesem Fall werden zum Beispiel DNA-Sequenzen, die senseund antisense-RNA-Fragmente des Gens exprimieren können, in eine Pflanzenzelle durch allgemein fachbekannte oder nachfolgend beschriebene Transformationsverfahren eingeführt. Die DNA-Sequenzen werden zum Beispiel stabil im Genom der Pflanzenzelle integriert. Die Pflanzenzelle wird dann zum Beispiel auf phänotypische oder Stoffwechselveränderungen untersucht. Alternativ wird eine Pflanze aus der Pflanzenzelle regeneriert, und die Pflanze oder ihre Nachkommenschaft wird auf zum Beispiel phänotypische oder Stoffwechselveränderungen untersucht. Zum Beispiel werden essentielle Gene unter Verwendung eines solchen Verfahrens und Durchmusterung der transformierten Pflanze auf zum Beispiel Embryosterblichkeit, Keimlingssterbilichkeit oder andere relevante Phänotypen aufgefunden. Das Wissen um die Funktion des Gens wird dann verwendet, um Kulturpflanzen mit verbesserten Eigenschaften durch genetische Transformation zu erzeugen oder auf neue Chemikalien zu durchmustern. Insbesondere sind essentielle Gene gute Kandidaten als Ziele für herbizide Verbindungen. Essentielle Gensequenzen werden zum Beispiel in einer Pflanze überexprimiert, um Resistenz auf die Pflanze gegen eine herbizide Verbindung zu übertragen, die die Funktion des natürlich vorkommenden Enzyms inhibiert, das durch das Gen codiert wird. Mutierte Varianten des essentiellen Gens werden ebenfalls erzeugt und auf Toleranz gegenüber der herbiziden Verbindung oder verwandten Verbindungen durchmustert. Solche mutierten Varianten werden durch verschiedene fachbekannte Verfahren erzeugt. Das durch das essentielle Gen codierte Enzym wird ebenfalls zur Durchmusterung auf Verbindungen verwendet, die seine Funktion hemmen, zum Beispiel in einer Hochleistungsdurchmusterung in vitro. Die hemmenden Verbindungen werden dann auf herbizide Aktivität getestet.

Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls verwendet, um zufällig die Expression von Genen ohne vorheriges Wissen ihrer Nukleotidsequenz zu verändern. In diesem Fall wird eine Bibliothek aus zufälligen RNA-Fragmenten, die paaren und doppelsträngige RNA-Moleküle bilden können, oder eine Bibliothek aus zufälligen DNA-Sequenzen, die RNA-Fragmente codieren, die paaren und ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können, hergestellt und in Pflanzenzellen unter Verwendung von allgemein fachbekannten oder nachfolgend beschriebenen Verfahren eingeführt. Die transformierten Pflanzenzellen oder Pflanzen werden auf eine besondere Eigenschaft oder einen besonderen Phänotyp durchmustert. Zum Beispiel werden essentielle Gene, wie oben beschrieben, unter Verwendung einer solchen Durchmusterung aufgefunden. Ein anderes Beispiel für eine Durchmusterung ist auf ungehindertes Wachstum oder auf Wachstum, das weniger gehindert als untransformierte Zellen unter verschiedenen Bedingungen ist, wie zum Beispiel höherer Salzgehalt oder osmotischer Druck, höhere Temperatur, Gegenwart von toxischen oder schädlichen Substanzen, zum Beispiel herbizide Verbindungen. Nach einer solchen Durchmusterung wird die doppelsträngige RNA oder das DNA-Molekül, das die doppelsträngige RNA codiert, gewonnen, und die Sequenz der komplementären RNA-Fragmente wird bestimmt, was die Isolierung des Gens erlaubt, dessen Expressionsveränderung verantwortlich für die besondere Eigenschaft oder den besonderen Phänotyp ist. Ein solches Gen wird dann verwendet, um zum Beispiel Kulturpflanzen durch genetische Transformation zu verbessern oder um auf neue Chemikalien zu durchmustern.

Pflanzentransformationstechnik

DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung werden in pflanzliche oder bakterielle Zellen unter Verwendung von herkömmlicher rekombinanter DNA-Technik eingeführt. Allgemein ist ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung in einem Transformationsvektor enthalten. Eine große Anzahl solcher Vektorsysteme, die fachbekannt sind, werden verwendet, wie zum Beispiel Plasmide, Bacteriophagenviren und andere modifizierte Viren. Die Komponenten des Expressionssystems werden ebenfalls modifiziert, zum Beispiel zur Erhöhung der Expression der sense- und antisense-RNA-Fragmente. Zum Beispiel werden trunkierte Sequenzen, Nukleotidsubstitutionen oder andere Modifikationen eingesetzt. Fachbekannte Expressionssysteme werden zur Transformation von praktisch jeder Kulturpflanzenzelle unter geeigneten Bedingungen verwendet. Ein Transgen, das ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfaßt, wird bevorzugt stabil transformiert und in das Genom der Wirtszellen integriert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform befindet sich das Transgen, das ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfaßt, auf einem selbstreplizierenden Vektor. Beispiele für selbstreplizierende Vektoren sind Viren, insbesondere Geminiviren. Transformierte Zellen werden bevorzugt zu ganzen Pflanzen regeneriert.

Erfindungsgemäß transformierte Pflanzen können einkeimblättrig oder zweikeimblättrig sein und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Süßkartoffel, Bohne, Erbse, Chicoree, Salat, Kohl, Blumenkohl, Brokkoli, Steckrübe, Rettich, Spinat, Spargel, Zwiebel, Knoblauch, Paprika, Sellerie, Kürbispflanze, Kürbis, Hanf, Zucchini, Apfel, Birne, Quitte, Melone, Pflaume, Kirsche, Pfirsich, Nektarine, Aprikose, Erdbeere, Traube, Himbeere, Brombeere, Ananas, Avocado, Papaya, Mango, Banane, Soja, Tomate, Sorghum, Zuckerrohr, Zuckerrobe, Sonnenblume, Raps, Klee, Tabak, Karotte, Baumwolle, Luzerne, Reis, Kartoffel, Aubergine, Gurke, Arabidopsis und Holzpflanzen, wie Nadel- und Laubbäume. Sobald eine gewünschte Nukleotidsequenz in eine besondere Pflanzenart transformiert wurde, kann sie in der Art vermehrt oder in andere Sorten der gleichen Art übertragen werden, insbesondere einschließlich gewerblicher Sorten, unter Verwendung herkömmlicher Züchtungstechniken.

A. Anforderungen für die Konstruktion von Pflanzenexpressionskassetten

Gensequenzen, die zur Expression in transgenen Pflanzen beabsichtigt sind, werden zuerst in Expressionskassetten hinter einem geeigneten, in Pflanzen exprimierbaren Promotor zusammengesetzt. Die Expressionskassetten können ebenfalls beliebige weitere Sequenzen umfassen, die für die Expression des Transgens erforderlich sind oder selektiert werden. Solche Sequenzen schließen zum Beispiel ein, aber sind nicht beschränkt auf Transkriptionsterminatoren, fremde Sequenzen zur Steigerung der Expression, wie Introns, vitale Sequenzen und Sequenzen, die zur Ausrichtung des Genprodukts auf spezifische Organellen und Zellkompartimente gedacht sind. Diese Expressionskassetten können dann leicht auf die nachfolgend beschriebenen Pflanzentransformationsvektoren übertragen werden. Das folgende ist eine Beschreibung verschiedener Komponenten typischer Expressionskassetten.

1. Promotoren

Die Auswahl des in Expressionskassetten verwendeten Promotors bestimmt das räumliche und zeitliche Expressionsmuster des Transgens in der transgenen Pflanze. Selektierte Promotoren exprimieren Transgene in spezifischen Zelltypen (wie zum Blattepidermiszellen, Mesophyllzellen, Wurzelkortexzellen) oder in spezifischen Geweben oder Organen (z.B. Wurzeln, Blätter oder Blüten), und die Selektion reflektiert den gewünschten Ort der Anreicherung des Genprodukts. Alternativ treibt der selektierte Promotor die Expression des Gens unter verschiedenen induzierenden Bedingungen an. Promotoren variieren in ihrer Stärke, d.h. in ihrer Fähigkeit zur Förderung der Transkription. Abhängig von dem verwendeten Wirtszellsystem wird jeder einer Anzahl fachbekannter geeigneter Promotoren verwendet. Zum Beispiel werden zur konstitutiven Expression der CaMV 35S-Promotor, der Reis-Actinpromotor oder der Ubiquitinpromotor verwendet. Zum Beispiel wird zur regulierbaren Expression der chemisch induzierbare PR-1-Promotor aus Tabak oder Arabidopsis verwendet (siehe z.B. US-PS 5,689,044).

Eine bevorzugte Kategorie von Promotoren ist diejenige, die wundinduzierbar ist. Zahlreiche Promotoren wurden beschrieben, die an Wundstellen exprimiert werden. Bevorzugte Promotoren dieser Art schließen diejenigen ein, die beschrieben werden von Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989), Xu et al., Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1983), Logemann et al., Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al., Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993) und Warner et al., Plant J. 3: 191-201 (1993).

Bevorzugte gewebespezifische Expressionsmuster schließen grüngewebespezifische, wurzelspezifische, stengelspezifische und blütenspezifische ein. Promotoren, die zur Expression in grünem Gewebe geeignet sind, schließen viele ein, die Gene regulieren, die an der Photosynthese beteiligt sind, und viele davon wurden sowohl aus Einkeimblättrigen als auch Zweikeimblättrigen kloniert. Ein bevorzugter Promotor ist der Mais-PEPC-Promotor aus dem Phosphoenolcarboxylase-Gen (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)). Ein bevorzugter Promotor zur wurzelspezifischen Expression ist derjenige, der beschrieben wird von de Framond (FEBS 290: 103-106 (1991); EP 0 452 269), und ein weiterer bevorzugter wurzelspezifischer Promotor ist derjenige aus dem T-1-Gen, bereitgestellt durch diese Erfindung. Ein bevorzugter stengelspezifischer Promotor ist derjenige, der in US-PS 5,625,136 beschrieben wird und die Expression des Mais-trpA-Gens antreibt.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind transgene Pflanzen, die eine Nukleotidsequenz in einer wurzelspezifischen Weise exprimieren. Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind transgene Pflanzen, die die Nukleotidsequenz in einer wundinduzierbaren oder durch Pathogeninfektion induzierbaren Weise exprimieren.

2. Transkriptionsterminatoren

Eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren sind zur Verwendung in Expressionskassetten verfügbar. Diese sind verantwortlich für die Termination der Transkription hinter dem Transgen und für seine korrekte Polyadenylierung. Geeignete Transkriptionsterminatoren sind diejenigen, die für ihre Funktion in Pflanzen bekannt sind, und schließen den CaMV 355-Terminator, den tml-Terminator, den Nopalinsynthase-Terminator und den Erbsen-rbcS E9-Terminator ein. Diese werden sowohl in einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen Pflanzen verwendet.

3. Sequenzen zur Steigerung oder Regulation der Expression

Es wurde festgestellt, daß zahlreiche Sequenzen die Genexpression aus der Transkriptionseinheit heraus steigern, und diese Sequenzen können in Verbindung mit den Genen dieser Erfindung zur Steigerung ihrer Expression in transgenen Pflanzen verwendet werden. Zum Beispiel wurde gezeigt, daß verschiedene Intronsequenzen, wie Introns des Mais-AdhI-Gens, die Expression steigern, insbesondere in einkeimblättrigen Zellen. Zusätzlich sind eine Anzahl von nicht-translatierten Leitsequenzen, die aus Viren stammen, dafür bekannt, die Expression zu steigern, und diese sind besonders effektiv in zweikeimblättrigen Zellen.

4. Optimierung der codierenden Sequenz

Die codierende Sequenz des ausgewählten Gens kann gentechnisch manipuliert werden durch Veränderung der codierenden Sequenz auf eine optimale Expression in der interessierenden Kulturpflanzenart. Verfahren zur Modifizierung codierender Sequenzen zum Erreichen einer optimalen Expression in einer besonderen Kulturpflanzenart sind allgemein bekannt (siehe z.B. Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 (1991); und Koziel et al., Bio/technol. 11: 194 (1993)).

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung direkt in das Plastidgenom transformiert. Die Plastidtransformationstechnik wird umfassend beschrieben in US-PSen 5,451,513, 5,545,817 und 5,545,818, in WO 95/16783 und in McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. Die Grundtechnik für die Chloroplastentransformation beinhaltet die Einführung von Regionen klonierter Plastid-DNA, die einen selektierbaren Marker flankiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in ein geeignetes Zielgewebe, zum Beispiel unter Verwendung von Partikelkanonen oder Protoplastentransformation (z.B. Calciumchlorid- oder PEG-vermittelte Transformation). Die als Targeting-Sequenzen bezeichneten 1 bis 1,5 kb flankierenden Regionen erleichtern die homologe Rekombination mit dem Plastidgenom und erlauben dadurch den Austausch oder die Modifikation spezifischer Regionen des Plastoms. Zunächst werden Punktmutationen in den Chloroplast 16S rRNA- und rps12-Genen, die Resistenz gegen Spectinomycin und/oder Streptomycin verleihen, als selektierbare Marker zur Transformation verwendet (Z. Svab, P. Hajdukiewicz und P. Maliga (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; J.M. Staub und P. Maliga (1992) Plant Cell 4, 39-45). Die Gegenwart von Klonierungsorten zwischen diesen Markern erlaubte die Schaffung eines Plastid-Targeting-Vektors zur Einführung von fremden DNA-Molekülen (J.M. Staub und P. Maliga (1993), EMBO J. 12, 601-606). Substantielle Zunahmen der Transformationshäufigkeit werden durch Austausch der rezessiven rRNA- oder r-Protein-Antibiotikaresistenzgene gegen einen dominanten selektierbaren Marker erhalten, das bakterielle aadA-Gen, das das Spectinomycinentgiftende Enzym Aminoglycosid-3'-adenyltransferase codiert (Z. Svab und P. Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Zuvor wurde dieser Marker erfolgreich für die hochfrequente Transformation des Plastidgenoms der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii verwendet (M. Goldschmidt-Clermont (1991), Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089). Andere selektierbare Marker, die für die Plastidtransformation nützlich sind, sind fachbekannt und vom Umfang dieser Erfindung umfaßt.

Plastidexpression, in der Gene durch homologe Rekombination in die mehreren tausend Kopien des in jeder Pflanzenzelle vorhandenen ringförmigen Plastidgenoms inseriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine DNA der vorliegenden Erfindung in einen Plastid-Targeting-Vektor inseriert und in das Plastidgenom einer gewünschten Pflanzenzelle transformiert. Pflanzen werden erhalten, die homoplasmatisch für Plastidgenome sind, die das DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung enthalten, und können vorzugsweise eine hochgradige Expression des DNA-Moleküls liefern. Bevorzugt können sense- und antisense-RNA-Fragmente, die durch das DNA-Molekül codiert werden, paaren und ein doppelsträngiges RNA-Molekül in Pflanzenplastiden bilden, um die Expression von Plastidgenen zu verändern. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die sense- und antisense-Fragmente keinerlei Fehlübereinstimmung in der komplementären Region. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die sense- und antisense-Fragmente wenigstens eine Fehlübereinstimmung in der komplementären Region. In diesem Fall können die DNA-Sequenzen im DNA-Molekül, das die RNA-Fragmente codiert, nicht miteinander rekombinieren.

B. Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren

Zahlreiche Transformationsvektoren, die zur Pflanzentransformation verfügbar sind, sind den Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet der Pflanzentransformation bekannt, und die für diese Erfindung relevanten Gene können in Verbindung mit beliebigen solchen Vektoren verwendet werden. Die Selektion des Vektors hängt von der bevorzugten Transformationstechnik und der Zielart für die Transformation ab. Für bestimmte Zielarten sind unterschiedliche Antibiotika- oder Herbezid-Selektionsmarker bevorzugt. Selektionsmarker, die routinemäßig in der Transformation verwendet werden, schließen das nptII-Gen ein, das Resistenz gegen Kanamycin und verwandte Antibiotika verleit (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)), das bar-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)), das hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), das manA-Gen, das eine positive Selektion in Gegenwart von Mannose erlaubt (Miles und Guest (1984) Gene, 32: 41-48; US-PS 5,767,378), und das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), und das EPSPS-Gen, das Resistenz gegen Glyphosat verleiht (US-PSen 4,940,935 und 5,188,642).

1. Vektoren, die für die Agrobakterium-Transformation geeignet sind

Viele Vektoren sind zur Transformation unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens verfügbar. Diese tragen typischerweise wenigstens eine T-DNA-Randsequenz und schließen Vektoren wie pBIN19 ein (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Typische Vektoren, die zu Agrobacterium-Transformation geeignet sind, schließen die binären Vektoren pCIB200 und pCIB2001 sowie den binären Vektor pCIB10 und Hygromycin-Selektionsderivate davon ein (siehe z.B. US-PS 5,639,949).

2. Vektoren, die zur Nicht-Agrobakterium-Transformation geeignet sind

Die Transformation ohne die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens umgeht das Erfordernis für T-DNA-Sequenzen im gewählten Transformationsvektor, und entsprechend werden Vektoren, denen diese Sequenzen fehlen, zusätzlich zu Vektoren wie den oben beschriebenen verwendet, die T-DNA-Sequenzen enthalten. Transformationstechniken, die nicht auf Agrobacterium beruhen, schließen die Transformation über Partikelbeschuß, Protoplastenaufnahme (z.B. PEG und Elektroporation) und Mikroinjektion ein. Die Wahl des Vektors hängt weitgehend von der bevorzugten Selektion für die transformierte Art ab. Typische Vektoren, die zur Nicht-Agrobakterium-Transformation geeignet sind, schließen pCIB3064, pSOG19 und pSOG35 ein (siehe zum Beispiel US-PS 5,639,949).

C. Transformationstechniken

Sobald die interessierende DNA-Sequenz in ein Expressionssystem kloniert ist, wird sie in eine Pflanzenzelle transformiert. Verfahren zur Transformation und Regeneration von Pflanzen sind allgemein fachbekannt. Zum Beispiel werden Ti-Plasmidvektoren zur Übertragung von Fremd-DNA sowie die direkte DNA-Aufnahme, Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion und Mikroprojektile verwendet. Zusätzlich können Bakterien aus der Gattung Agrobacterium zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet werden.

Transformationstechniken für zweikeimblättrige Pflanzen sind allgemein fachbekannt und schließen Techniken auf Agrobacterium-Basis und Techniken ein, die Agrobacterium nicht erfordern. Nicht-Agrobacterium-Techniken beinhalten die Aufnahme von exogenem genetischem Material direkt durch Protoplasten oder Zellen. Dies wird durch PEG- oder Elektroporationvermittelte Aufnahme, Partikelbeschuß-vermittelte Übertragung oder Mikroinjektion erreicht. In jedem Fall werden die transformierten Zellen zu ganzen Pflanzen unter Verwendung von fachbekannten Standardtechniken regeneriert.

Die Transformation der meisten einkeimblättrigen Arten ist jetzt ebenfalls zur Routine geworden. Bevorzugte Techniken schließen den direkten Gentransfer in Protoplasten unter Verwendung von PEG- oder Elektroporationstechniken, den Partikelbeschuß in Kallusgewebe sowie die Agrobacterium-vermittelte Transformation ein.

Pflanzen aus Transformationsereignissen werden herangezogen, vermehrt und gezüchtet, um Nachkommenschaft mit dem gewünschten Merkmal zu liefern, und Samen werden mit dem gewünschten Merkmal erhalten, wobei allgemein fachbekannte Verfahren verwendet werden.

Die Erfindung wird weiter durch Verweis auf die folgenden ausführlichen Beispiele beschrieben. Diese Beispiele werden allein für Zwecke der Erläuterung bereitgestellt und sind nicht zur Beschränkung gedacht, wenn nichts anderes angegeben ist.

BEISPIELE

Standardmäßige rekombinante DNA- und molekulare Klonierungstechniken, die hier verwendet werden, sind allgemein fachbekannt und werden beschrieben von Sambrock et al., Molecular Cloning, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) und von T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984), und von F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, veröff. von Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1987).

BEISPIEL 1: Regulation der Expression eines Luciferasegens Konstruktion eines chimären DNA-Moleküls, das sense- und antisense-Luciferase-RNA-Fragmente codiert (sense/antisense-Konstrukt)

Ein 738 bp "sense"-orientiertes Fragment des Leuchtkäfer-Luciferasegens aus Plasmid pLuc+ (Promega) wird aus pPH108 Plasmid-DNA unter Verwendung der Oligonukleotidprimer ds_Luc1 (5'-CGC GGA TCC TGG AAG ACG CCA AAA ACA-3', SEQ ID NO:1; BamHI-Restriktionsort unterstrichen) und ds_Luc2 (5'-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3', SEQ ID NO:2; HindIII-Restriktionsort unterstrichen) amplifiziert. Hitzebeständige TurboPfu-DNA-Polymerase (Stratagene) wird in 50 &mgr;l-Reaktionen gemäß dem Herstellerprotokoll mit fünf Zyklen von 95°C/1 min, 55°C/1,5 min, 72°C/2 min gefolgt von 25 Zyklen mit 95°C/1 min, 72°C/3,5 min verwendet. In einer ähnlichen Weise wird ein 737 bp "antisense"-orientiertes Fragment des Leuchtkäfer-Luciferasegens aus Plasmid pLuc+ durch PCR aus pPH108-Plasmid-DNA unter Verwendung der Oligonukleotidprimer ds_Luc3 (5'-CGG TCT AGA GGA AGA CGC CAA AAA CAT A-3', SEQ ID NO:3; XbaI-Restriktionsort unterstrichen) und ds_Luc2 (5'-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3', SEQ ID NO:4; HindIII-Restriktionsort unterstrichen) amplifiziert. Die resultierenden DNA-Fragmente werden durch Elektrophorese durch ein 1%iges Trisacetat-Gel, hergestellt aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC), gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktion der ausgeschnittenen Gelscheiben, die die PCR-Produkte enthalten, gereinigt. DNA aus dem sense-Produkt (ds_Luc1/2) wurd mit BamHI und HindIII verdaut, und DNA aus dem antisense-Produkt (ds_Luc3/2) wird mit XbaI und HindIII gemäß Standardverfahren verdaut (Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs erhalten). Die resultierenden DNA-Fragmente mit klebrigen Enden werden wie oben beschrieben gelgereinigt. Ein DNA-Fragment, das den mas 1'-Promotor enthält (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730), wird durch Verdauen von Plasmid CSA104 mit EcoRI und HincII und Reinigen eines 564 bp DNA-Fragments erhalten. Dieses Fragment wird erneut mit BamHI verdaut und das 484 bp EcoRI-BamHI-Unterfragment, das den mas 1'-Promotor enthält, isoliert und gelgereinigt. Zur Konstruktion von Plasmid pPH169 wird DNA aus dem Klonierungsvektor pLitmus29 (New England Biolabs) mit EcoRI und XbaI verdaut, und das isolierte Fragment wird in einer Vierwegereaktion unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) an das mas 1'-Promotor-EcoRI-BamHI-Fragment und die sense- (BamHI-HindIII) und antisense- (HindIII-XbaI) ds_Luc-Luciferasegen-Fragmente ligiert.

Zur Konstruktion des binären Vektors pPH170 zu Agrobacterium-vermittelten Pflanzentransformation mit dem ds_Luc1/2/3-sense/antisense-Konstrukt wird DNA aus dem binären Plasmid pSGCHC1, das ein Kanamycin-Resistenzgen zur bakteriellen Selektion und ein Hygromycin-Resistenzgen zur transgenen Pflanzenselektion trägt, mit EcoRI und XbaI verdaut. Das resultierende isolierte 11,6 kb-Fragment aus pSHCHC1 wird in einer Vierwegereaktion unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) mit dem mas 1'-Promotor EcoRI-BamHI-Fragment und den sense- (BamHI-HindIII) und antisense- (HindIII-XbaI) ds_Luc-Luciferasegen-Fragmenten ligiert.

Transformation von Agrobakterium und Vakuuminfiltration von Arabidopsis-Pflanzen

Das Plasmid pPH170 wird in Agrobacterium tumefaciens GV3101 durch Elektroporation eingeführt, und transformierte Kolonien werden selektiert und amplifiziert. Vier bis fünf Wochen alte Pflanzen von Mutantenlinien von Arabidopsis thaliana, die Luciferase entweder konstitutiv (UBQ3-Promotor (Norris et al. (1993) PMB 21: 895-906)/UBQ3 + CaMV 35S 5' UTR/luc+; pPH108) oder indizierbar exprimieren (Arabidopsis PR-1 Promotor/luc+; pPH135, Linie 6E), werden mit Agrobacterium-Klonen vakuuminfiltriert, die den binären T-DNA-Vektor von pPH170 tragen. Transformierte Pflanzen werden an Hygromycin und Kanamycin koselektiert und unter kontrollierten Phytotron-Bedingungen zur Bestimmung der Luciferaseaktivität kultiviert. Zusätzlich wird Luciferaseaktivität im pPH135-6E-Hintergrund 48 h nach Induktion mit BTH bewertet (BTH-Behandlung im wesentlichen wie beschrieben in Lawton et al, Plant J. 10: 71-82). Die Luciferaseaktivität wird unter Verwendung eines Tests auf Lumineszenzbasis in Gewebeextrakten im Anschluß an die Addition von Luciferinsubstrat quantifiziert. Die Luciferaseaktivität wird ebenfalls in der Pflanze unter Verwendung eines OCD-gekühlten Video-Bildgebungssystems (Hamamatsu) überwacht.

BEISPIEL 2: Regulation der Expression des Arabidopsis GL1-Gens

Das GL1-Gen codiert einen myb-artigen Transkriptionsfaktor, der zum Start der normalen Trichom-(Blatthaar)-Bildung erforderlich ist (Oppenheimer et al. (1991) Cell 67: 483-493). Ausschalten der GL1-Expression in der frühen Entwicklung führt zu Pflanzen, denen Trichome fehlen. Der Knockout-Phänotyp wird leicht in jungen Keimlingen identifiziert und ist nicht tödlich. Drei Vektoren für die konstitutive Expression und drei Vektoren für die GAL4/C1-regulierte Expression werden konstruiert. Die drei unterschiedlichen Vektoren zum Test für jeden Promotor sind sense-(+)-Expression, antisense-(–)-Expression und sense- und antisense-(+/–)-RNA-Expression eines GL1-Genfragments. Die (+)- und (–)-Vektoren sind Kontrollen zum Vergleich auf ihre Wirkung auf die Expression von GL1. In jedem Fall wird ein 5'-Fragment aus den Basen #739 bis #1781 der GL1-Sequenz (GenBank Eingangsnummer M79448) zur Vektorkonstruktion verwendet.

GAL4/C1-regulierte Expression

Das GL1-Genfragment wird in das kreuzungsinduzierbare Vektorkonstrukt pJG304-1 als NcoI-SacI-Fragmente kloniert. Das Plasmid pJG304 stammt aus pBSSK+. Plasmid pBSSk+ (Stratagene, LaJolla, CA) wird mit SacI linearisiert, mit Mungbohnen-Nuklease zur Entfernung des SacI-Ortes behandelt und mit T4-Ligase zur Herstellung von pJG201 erneut ligiert. Die 10XGAL4-Konsensus-Bindungsort/CaMV 35S-Minimalpromotor/GUS-Gen/CaMV-Terminator-Kassette wird aus pAT71 mit KpnI entfernt und in den KpnI-Ort von pJG201 zur Herstellung von pJG304 kloniert. Das Plasmid pJG304 wird partiell mit der Restriktionsendonuklease Asp718 verdaut, um ein lineares Fragment voller Länge zu isolieren. Dieses Fragment wird mit einem molaren Überschuß des Oligonukleotids JG-L mit 22 Basen (5'-GTA CCT CGA G TC TAG ACT CGA G-3', SEQ ID NO:5) ligiert. Restriktionsanalyse wird zur Identifizierung eines Klons verwendet, in dem dieser Linker 5' zum GAL4-DNA-Bindungsort inseriert ist, und dieses Plasmid wird als pJG304DXhoI bezeichnet.

Die NcoI- und SacI-Orte werdeb an die Enden von (+)- und (–)-Fragmenten durch Synthetisieren von PCR-Primern mit den entsprechenden Restriktionsorten an den 5'-Enden addiert. Das (+/–)-GL1-Fragment wird erzeugt, indem zuerst zwei Fragmente erzeugt werden: ein (+)-Fragment mit dem NcoI-Ort am 5'-Ende und einem HindIII-Ort am 3'-Ende, und ein (-)-Fragment mit einem HindIII-Ort am 5'-Ende und einem SacI-Ort am 3'-Ende. Die (+/–)-Einheit wird durch Ligation der resultierenden Fragmente am EcoRI-Ort erzeugt. Die Expressionseinheit enthält die GAL4-DNA-Bindungsdomäne, gefolgt von einer minimalen TATA-Sequenz, und das GL1-Genfragment orientiert entweder (+), (–) oder (+/–) (Guyer et al. (1998) Genetics, 149: 633-639).

Konstitutive Expression

Der mas 1'-Promotor der Mannopinsynthase aus Agrobacterium (Velten et al. (1984) EMBO Journal 3: 2723-2730), der relativ stark und konstitutiv in zweikeimblättrigen Pflanzen ist, wird verwendet. Wie oben werden die GL1 (+)-, (–)- und (+/–)-Fragmente hinter dem 1'-Promotor in pBluescript ligiert. Die drei unterschiedlichen Expressionskassetten werden in pCIB200 als EcoRI/SalI-Fragmente ligiert (Uknes et al. (1993) Plant Cell 5: 159-169).

BEISPIEL 3: Regulation der Expression des Cystathionin-Beta-Lyase-Gens

Das Cystathionin-Beta-Lyase-(CBL)-Gen codiert ein Protein, das einen Schritt in der Methionin-Biosynthesereaktion durchführt. CBL katalysiert die Umwandlung von Cystathionin zu Homocystein (Übersicht in Ravanel et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95: 7805-7812). Die Sequenz einer cDNA für das Arabidopsis-CBL-Gen wurde identifiziert (Ravanel et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29: 875-882). Die Wirkung der Regulation seiner Expression in Pflanzen wird unter Verwendung von Konstrukten zur sense-RNA-Expression (sense-Konstrukt), antisense-RNA-Expression (antisense-Konstrukt) und sense- und antisense-RNA-Expression (sense/antisense-Konstrukt) getestet.

A: Antisense-Konstrukt: binärer BASTA-Vektor pJG261 wird verwendet, der ein Fragment aus dem pJG304DXhoI-Vektor mit einer Insertion eines Teils des CBL-Gens in einer antisense-Orientierung enthält (Nukleotide #13-1159, Genbank Eingangsnummer #L40511).

pJG304/aCBL: Plasmid pJG304DXhoI wird mit NcoI und SacI verdaut, um das GUS-Gen auszuschneiden. Das GUS-Gen aus pJG304DXhoI wird gegen ein CBL-PCR-Produkt ausgetauscht, das ebenfalls mit NcoI und SacI verdaut wird. Dieses Produkt wird unter Verwendung der Primer DG354 (5'-GAT CGA GCT CCA CGA GAA CTG TCT CCG-3'; SEQ ID NO:6) und DG357 (5'-TCA GCC ATG GGA AGA CAA GTA CAT TGC-3'; SEQ ID NO:7) und der pFL61 Arabidopsis cDNA-Bibliothek (Minet et al. (1992) Plant J. 2: 417-422) als Matrize erzeugt. Plasmid pJG304/aCBL wird aus dem pJG304DXhoI-verdauten Vektor, ligiert an das CBL-PCR-Produkt, konstruiert.

pJG261/aCBL: pJG304/aCBL wird mit XhoI geschnitten, um die Kassette auszuschneiden, die die Fusion GAL4-DNA-Bindungsort/35S-Minimalpromotor/antisense-CBL/CaMV-Terminator enthält. Diese Kassette wird in XhoI-verdautes pJG261 ligiert (Guyer et al., Genetics (1998), 149: 633-639), was pJG261/aCBL erzeugt.

B. Sense-Konstrukt: das gleiche wie das antisense-Konstrukt, außer daß das CBL-Fragment in der entgegengesetzten Orientierung ist. Dieses Konstrukt enthält das ATG-Startcodon und den Großteil des CBL-ORF und dient als Kontrolle zur Regulation der Expression des CBL-Gens.

pJG304/sCBL: Plasmid pJG304DXhoI wird mit NcoI und SacI verdaut, um das GUS-Gen auszuschneiden. Das GUS-Gen aus pJG304DXhoI wird gegen ein CBL-PCR-Produkt ausgetauscht, das ebenfalls mit NcoI und SacI verdaut wird. Dieses Produkt wird unter Verwendung der Primer CBL1 (5'-CTT GCC ATG GCA CGA GAA CTG TCT CCG-3'; SEQ ID NO:8) und CBL2 (5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3'; SEQ ID NO:9) und der pFL61 Arabidopsis cDNA-Bibiliothek als Matrize erzeugt. Plasmid pJG304/sCBL wird aus dem pJG304DXhoI-verdauten Vektor, ligiert an das CBL-PCR-Produkt, konstruiert.

pJG261/sCBL: pJG304/sCBL wird mit XhoI geschnitten, um die Kassette auszuschneiden, die die Fusion GAL4-DNA-Bindungsort/35S-Minimalpromotor/sense-CBL/CaMV-Terminator enthält. Diese Kassette wird in XhoI-verdautes pJG261 ligiert, was pJG262/sCBL erzeugt.

C. Sense/antisense-Konstrukt: Ein CBL-Genfragment (#13-1159) in der sense-Orientierung wird in den SalI-Ort von Vektor pJG304DXhoI stromabwärts der Version des CBL-Gens mit antisense-Orientierung inseriert. Ein Linker mit ca. 10 bp befindet sich zwischen den zwei Kopien von CBL.

pJG304/dsCBL: Plasmid pJG304/aCBL wird mit SacI verdaut. Ein CBL-PCR-Produkt, das ebenfalls mit SacI verdaut wird, wird so inseriert, daß das inserierte CBL-Gen in der sense-Orientierung ist. Dieses Produkt wird unter Verwendung von CBL2 (5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3'; SEQ ID NO:9) und CBL3 (5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'; SEQ ID NO:10) und der pFL61-Arabidopsis-cDNA-Bibliothek als Matrize erzeugt. Das Plasmidkonstrukt mit der gewünschten Orientierung der inserierten DNA wird durch Verdauung mit HindIII identifiziert. Plasmid pJG304/dsCBL wird aus dem pJG304/aCBL-verdauten Vektor, ligiert an das CBL-PCR-Produkt, konstruiert. SURE2 (Stratagene, LaJolla, CA) wird als bakterieller Wirt zur Stabilisierung des Konstrukts verwendet.

pJG261/dsCBL: pJG304/dsCBL wird mit XbaI geschnitten, um die Kassette auszuschneiden, die die Fusion GAL4-DNA-Bindungsort/35S Minimalpromotor/antisense-CBL/sense-CBL/CaMV-Terminator enthält. Diese Kassette wird in SpeI-verdautes pJG261 ligiert, was pJG/dsCBL erzeugt. XL1-BLUE MRF' (Stratagene, LaJolla, CA) wird als bakterieller Wirt verwendet, um das Konstrukt teilweise zu stabilisieren. Nichtumgeordnete DNA für dieses Konstrukt wird durch Agarosegelreinigung isoliert.

D. Erzeugung von GAL4-Bindungsort/Minimal-CaMV 35S/CBL-transgenen Pflanzen

Die drei beschriebenen pJG261/CBL-Konstrukte werden in Agrobacterium tumefaciens recA Stamm AGL1 (Lazo et al. (1991), Bio/Technology 9: 963-967) elektrotransformiert (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), und Arabidopsis-Pflanzen (Ökotyp Columbia) werden durch Infiltration transformiert (Bechtold et al. (1993), C.R. Acad. Sci. Paris, 316: 118-1193). Samen aus den infiltrierten Pflanzen werden auf Keimungsmedium selektiert (Murashige-Skoog-Salze mit 4,3 g/l, Mes mit 0,5 g/l, 1 % Saccharose, Thiamin mit 10 &mgr;g/l, Pyridoxin mit 5 &mgr;g/l, Nicotinsäure mit 5 &mgr;g/l, myo-Inosit mit 1 mg/l, pH 5,8), das Basta mit 15 mg/l enthält.

E. Vergleich der Inhibierung von CBL unter Verwendung eines GAL4/C1-Transaktivators und eines GAL4-Bindungsort/Minimal 35S-Promotors

Transgene Pflanzen, die ein GAL4-Bindungsort/Minimal-CaMV 355-Promotor/CBL-Konstrukt enthalten, werden in Boden transplantiert und im Gewächshaus zur Reife herangezogen. Die Gegenwart eines transgenen CBL-Fragments in jeder Linie wird durch PCR bestätigt. Zur Untersuchung auf das antisense-Konstrukt werden die Primer ASV1 (5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3'; SEQ ID NO:11) und CBL3 (5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'; SEQ ID NO:10) verwendet, um die Gegenwart eines ca. 1200 bp-Produktes zu verifizieren. Sechs transgene Linien mit dem antisense-Konstrukt werden identifiziert. Zur Untersuchung auf das sense-Konstrukt werden die Primver ASV2 (5'-GGA TTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA-3'; SEQ ID NO:12) und CBL3 (5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'; SEQ ID NO:10) verwendet, um die Gegenwart eines ca. 1200 bp-Produktes zu verifizieren. 13 transgene Linien mit dem sense-Konstrukt werden identifiziert. Zur Untersuchung auf das sense/antisense-Konstrukt werden die Primer ASV2 (5'-GGA TTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA-3'; SEQ ID NO:12) und CBL3 (5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'; SEQ ID NO:10) verwendet, um die Gegenwart eines ca. 1200 bp-Produktes zu verifizieren. Zusätzlich werden zur Untersuchung auf das sense/antisense-Konstrukt die Primer ASV1 (5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3'; SEQ ID NO:11) und CBL3 (5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'; SEQ ID NO:10) verwendet, um die Gegenwart eines ca. 1200 bp-Produktes zu verifizieren. 11 transgene Linien mit dem sense/antisense-Konstrukt werden identifiziert.

Auf den primären Transformanten bestehende Blüten werden mit Pollen aus der homozygoten GAL4/Cl-Transaktivatorlinie pAT53-103 (Guyer et al., Genetics (1998) 149; 633-649) gekreuzt. F1-Samen werden auf MS + 2 % Saccharosemedium ausplattiert (Murashige-Skoog-Salze mit 4,3 g/l, Mes mit 0,5 g/l, 2 % Saccharose). Keine der Linien, die das antisense-Konstrukt umfassen, zeigt einen abnormalen Phänotyp für die F1-Nachkommenschaft auf den Platten. Zwei von 13 Linien, die das sense-Konstrukt umfassen, zeigen einen schwachen Phänotyp für etwa die Hälfte der F1-Nachkommenschaft auf jeder Platte. Die anderen 11 von 13 Linien, die das sense-Konstrukt umfassen, zeigen keinen abnormalen Phänotyp für die F1-Nachkommenschaft auf den Platten. 10 von 11 Linien, die das sense/antisense-Konstrukt umfassen, zeigen Phänotypen, die von schwach bis stark für etwa die Hälfte der F1-Nachkommenschaft auf jeder Platte reichen. Pflanzen mit einem starken Phänotyp überleben nicht und besitzen eine Zunahme der violetten Färbung, eine lockere grüne Pigmentierung und versagen in der Bildung von Blättern nach 14 Tagen auf den Platten. Pflanzen mit schwächeren Phänotypen besitzen eine gewisse violette Färbung, sind blasser grün als normal und bilden kleinere Blätter nach 14 Tagen auf den Platten. Somit ist ein sense/antisense-Konstrukt effektiver in der Verringerung der Aktivität eines endogenen essentiellen Gens als ein antisense- oder sense-Konstrukt.

F. Regulation der Expression von CBL unter Verwendung von zwei Promotoren

Das CBL-Gen wird zwischen zwei Promotoren plaziert – einen, der die Transkription des sense-Stranges erzeugt, und den anderen, der die Transkription des antisense-Stranges erzeugt. In diesem Ansatz werden sowohl sense- als auch antisense-RNA in einer Pflanzenzelle erzeugt, und die zwei Typen von Strängen können miteinander hybridisieren, was zur Bildung von doppelsträngigen RNA-Molekülen führt. Das ACTIN2 wird als Promotor verwendet, der beiden Seiten des CBL-Gens flankiert. Für all diese Ansätze gibt es die Option, Transkriptionsterminatoren auf der distalen Seite der Promotoren zu verwenden oder nicht zu verwenden. Falls ein Transkriptionsterminator verwendet wird, würde das Transkript am 3'-Ende eines Promotors beginnen, durch das CBL-Gen in einer Orientierung fortschreiten, durch den zweiten Promotor vom 3'-Ende zum 5'-Ende fortschreiten und am Transkriptionsterminator am 5'-Ende des zweiten Promotors enden. Die Verwendung eines Transkriptionspromotors kann zur Stabilisierung der transkribierten RNA dienen.

BEISPIEL 4: Regulation der Luciferasegenexpression Konstruktion eines chimären DNA-Moleküls, das sense- und antisense-Luciferase-RNA-Fragmente codiert (sense/antisense-Konstrukt)

Ein 670 bp "sense"-orientiertes Fragment des Leuchtkäfer-Luciferasegens aus Plasmid pLuc+ (Promega Vektor pGL3, Genbank Eingangsnummer # U47295) wird auf pPH108-Plasmid-DNA unter Verwendung der Oligonukleotidprimer ds_Luc1 (5'-CGC GGA TCC AAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3', SEQ ID NO:13; BamHI-Restriktionsort unterstrichen) und ds_Luc2 (5'-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3', SEQ ID NO:14; HindIII-Restriktionsort unterstrichen) amplifiziert. Hitzestabile TurboPfu-DNA-Polymerase (Stratagene) wird in 50 &mgr;l-Reaktionen gemäß den Herstelleranweisungen mit fünf Zyklen von 95°C/1 min, 55°C/1,5 min, 72°C/2 min, gefolgt von 25 Zyklen von 95°C/1 min, 72°C/3,5 min verwendet. In einer ähnlichen Weise wird ein 669 bp "antisense"-orientiertes Fragment des Leuchtkäfer-Luciferasegens aus Plasmid pLuc+ durch PCR von pPH108-Plasmid-DNA unter Verwendung der Oligonukleotidprimer ds_Luc3 (5'-CGG TCT AGA AAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3', SEQ ID NO:15; XbaI-Restriktionsort unterstrichen) und ds_Luc2 (5'-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3', SEQ ID NO:16; HindIII-Restriktionsort unterstrichen) amplifiziert. Die resultierenden DNA-Fragmente werden durch Elektrophorese durch ein 1%iges Tris-Acetatgel, das aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC) hergestellt wird, gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktion der ausgeschnittenen Gelscheiben, die PCR-Produkte enthalten, gereinigt. DNA aus dem sense-Produkt (ds_Luc1/2) wird mit BamHI und HindIII verdaut, und DNA aus dem antisense-Produkt (ds_Luc3/2) wird mit XbaI und HindIII gemäß Standardverfahren verdaut (Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs erhalten). Die resultierenden DNA-Fragmente mit klebrigen Enden werden wie oben beschrieben gelgereinigt. Das sense-BamHI-HindIII-Fragment und das antisense-HindII2-XbaI-Fragment werden dann in einer Drei-Wege-Ligation in den Klonierungsvektor pLitmus28 (New England Biolabs) kloniert, der mit BamHI und XbaI verdaut wurde. Das resultierende Konstrukt wird pAdF3 genannt. Ein 563 bp DNA-Fragment, das das offene Leseraster der bar-Gens enthält (D'Halluin et al. (1992), Methods in Enzymology 216: 415-426) wird aus Plasmid-CSA104-DNA unter Verwendung der Oligonukleotide bar-1 (5'-GCG AAG CTT GAT CCA TGA GCC CAG AAC GA-3', SEQ ID NO:17; HindIII-Restriktionsort fettgedruckt) und bar-2 (5'-GCC AAG CTT CCT AGA ACG CGT GAT CTC-3'; SEQ ID NO:18; HindIII-Restriktionsort fettgedruckt) amplifiziert. Hitzestabile Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) wird in 100 &mgr;l-Reaktionen gemäß den Herstelleranweisungen mit 25 Zyklen von 94°C/1 min, 55°C/1 min, 72°C/1 min verwendet. Im Anschluß an eine Reinigung durch Phenol-Extraktion und Ethanol-Ausfällung wird das bar-PCR-Produkt mit HindIII verdaut und durch ein 2%iges Agarosegel wie oben beschrieben gelgereinigt. Plasmid pAdF1 wird durch Ligation des HindIII-bar-DNA-Fragments in Plasmid pAdF3 konstruiert, das mit HindIII verdaut wurde. von den zwei möglichen Konstrukten, die aus dieser nicht-gerichteten Klonierung resultieren, ist pAdF1 durch die Orientierung des bar-Gens gekennzeichnet, die die gleiche wie diejenige des "sense"-Fragments des Luciferasegens ist, das in pAdF3 vorhanden ist. Ein BamHI-SalI 1,2 kb DNA-Fragment, das den Arabidopsis ACT2-Promotor enthält (An et al. (1996) Plant J. 10: 107-121), wird aus pNOV1416 (Konstrukt hergestellt von Scott Rabe; NB171, S. 122; 17.8.1998) ausgeschnitten und in mit BamHI und SalI verdautes pUC21 kloniert, um Konstrukt pAct2 zu erzeugen. Der ACT2-Promotor wird dann aus pAct2 durch Verdauung mit BamHI und SpeI ausgeschnitten.

Zur Konstruktion des binären Vektors pAdF4 für die Agrobacteriumvermittelte Pflanzentransformation mit dem ds_Luc1/2/3-RNA-sense/antisense-Konstrukt wird DNA aus dem binären Plasmid pSGCHC1, das ein Kanamycin-Resistenzgen für die bakterielle Selektion und ein Hygromycin-Restistenzgen für die transgene Pflanzenselektion trägt, mit SpeI und SacI verdaut. Das resultierende isolierte 11,6 kb-Fragment aus pSGCHC1 wird in einer Drei-Wege-Reaktion unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) an das Act2-Promotor-BamHI-SpeI-Fragment und das BamHI-SacI-Fragment aus pAdF3 ligiert, das beide sense- und antisense-Luciferase-Genfragmente enthält. In ähnlicher Weise wurde der binäre Vektor pAdF2 in einer Drei-Wege-Ligation konstruiert, die den 11,6 kb pSGCHC1-Vektor, verdaut mit SpeI und SacI, oben beschrieben, das SpeI-BamHI-Fragment, das den Act2-Promotor trägt, und das BamHI-SacI-Fragment aus pAdF1 einschließt, das die sense- und antisense-Luciferase-Genfragmente enthält, die das bar-Gen umgeben.

Transformation von Agrobacterium und Vakuuminfiltration von Arabidopsis-Pflanzen

Plasmide pAdF2 und pAdF4 werden in Agrobacterium tumefaciens GV3101 durch Elektroporation eingeführt und transformierte Kolonien selektiert und amplifiziert. Vier bis fünf Wochen alte Pflanzen von mutierten Linien von Arabidopsis thaliana, die Luciferase entweder konstitutiv (UBQ3-Promotor (Norris et al. (1993), PMB 21: 895-906)/UBQ3 + CaMV 35S 5'URT/luc+; pPH108) oder induzierbar exprimieren (Arabidopsis PR-1-Promotor/luc+; pCIB200, Linie 6E), werden mit Agrobacterium-Klonen vakuuminfiltriert, die die binären T-DNA-Vektoren von pAdF2 oder pAdF4 tragen. Transformierte Pflanzen werden an Hygromycin und Kanamycin koselektiert und unter kontrollierten Phytotron-Bedingungen zur Bestimmung von Luciferaseaktivität gezüchtet. Zusätzlich wird die Luciferaseaktivität im pCIB200-6E-Hintergrund 48 h nach Induktion mit BTH bewertet (BTH-Behandlung im wesentlichen wie in Lawton et al. beschrieben (1996) Plant J. 10: 71-82). Luciferaseaktivität wird unter Verwendung eines Tests auf Lumineszenzbasis in Gewebeextrakten im Anschluß an die Zugabe von Luciferinsubstrat quantifiziert. Luciferaseaktivität wird ebenfalls in der Pflanze unter Verwendung eines CCD-gekühlten Video-Bildgebungssystems (Hamamatsu) überwacht. Man bemerke, daß das Luciferasegen in pPH108 aus pGL3 ist (Promega, Genbank Eingangsnummer # U47295) und das Luciferasegen in pCIB200-6E aus pGL2 ist (Promega, Genbank Eingangsnummer # X65323).

Luciferase-Tests werden mit einem Luciferase-Testreagens durchgeführt (Promega, Katalognummer E1501). Blattausstanzungen werden in 0,1 M KPO4-Puffer, pH 7,8 bei 4°C gemahlen und kurz auszentrifugiert. Eine Teilmenge des Überstandes wird mit dem Luciferase-Testreagens vermischt, und die Luciferaseaktivität wird in einem Monolight 2010-Luminometer (Becton Dickinson Microbiology System) quantifiziert. Die Ergebnisse für die Analyse von pPH108-Pflanzen, die mit den sense/antisense-Konstrukten pAdF2 und pAdF4 transformiert wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt, und die Ergebnisse für pCIB200-6E-Pflanzen, die mit dem sense/antisense-Konstrukt pAdF4 transformiert wurden, sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 1: Relative Lichteinheiten für Luciferaseaktivität in Pflanzen

Unterschiedliche Pflanzen der Mutterlinie pPH108 werden zur Bestimmung der durchschnittlichen Menge von Luciferase in verschiedenen Pflanzen getestet. Diese Linie ist nicht homozygot, so daß individuelle Pflanzen, die die Höchstmengen von Luciferase zeigen (d.h. Pflanzen 1, 2 und 3), homozygot sein können.

Unabhängige T1-Linien von doppelt-transgenen Pflanzen pPH108(pAdF2), die das pAdF2-Konstrukt in einem pPH108-Hintergrund umfassen, oder pPH108(pAdF4), die das pAdF4-Konstrukt in einem pPH108-Hintergrund umfassen, werden analysiert. Luciferase-Mengen variieren von Linie zu Linie wahrscheinlich aufgrund eines Bereichs von Expressionsstärken des sense/anti-sense-Konstrukts. Unabhängige T1-Ereignisse, Arabidopsis-Columbia-Pflanzen vom Wildtyp, die mit entweder pAdF2 (Columbia(pAdF2)) oder pAdF4 (Columbia(pAdF4)) transformiert wurden, werden ebenfalls als Kontrollen analysiert.

Tabelle 2: Relative Lichteinheiten für die Luciferaseaktivität in individuellen untersuchten Pflanzen

Pflänzlinge aus der Mutterlinie pCIB200-6E werden kultiviert und getestet, ebenso wie unabhängige T1 doppelt-transgene Linien pCIB200-6E(pAdF4). Unanbhängige T1-Ereignisse, Arabidopsis Columbia vom Wildtyp, die mit Konstrukt pAdF4 transformiert ist, werden ebenfalls als Kontrollen analysiert.

BEISPIEL 5: Regulation der Expression eines interessierenden Gens unter Verwendung eines ortsspezifischen Rekombinatiossystems

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden sense- und antisense-RNA-Fragmente unter Verwendung eines ortsspezifischen Rekombinationssystems hergestellt. Die ortsspezifische Rekombination ist ein Verfahren der DNA-Spaltung und -Religation, das durch eine Enzymrekombinase vermittelt wird. Rekombinase erkennt eine hochspezifische DNA-Sequenz. Einige ortsspezifische Rekombinationssysteme verwenden nur ein Protein, um an seinem Zielort zu wirken. Mehrere ortsspezifische Rekombinationssysteme, wie Cre/lox, FLP/FRT, R/RS und Gin/gix, sind dafür bekannt, ortsspezifische Rekombinationsprozesse in Pflanzen zu vermitteln (Ow und Medberry, 1995, Critical Reviews in Plant Sciences 14: 239-261). Abhängig von der Konfiguration von Rekombinase-Erkennungsorten in den Rekombinationssubstraten führt der Rekombinationsprozeß zur Deletion, Inversion oder Integration von DNA-Sequenzen. Eine besondere Reaktion dieser Art, d.h. die Inversion, betrifft diese Erfindung. Zwei Rekombinase-Erkennungsorte werden in die gewünschte Genexpressionskassette in entgegengesetzten Orientierungen plaziert. Der erste Erkennungsort wird stromabwärts des Promotors entweder in die untranslatierte Leitsequenz oder innerhalb der 5'-proximalen Region der das Transgen codierenden Sequenz plaziert. Der zweite Ort wird in die 3'-untranslatiert Region oder in die 3'-proximale Region der das Transgen codierenden Sequenz in der entgegengesetzten Orientierung zum ersten Ort plaziert. Der codierende oder nicht-codierende Strang der gewünschten DNA-Sequenz wird funktionsfähig mit einem Promotor verbunden. In Gegenwart der Rekombinase werden die Sequenzen, die von den zwei Erkennungsorten in entgegengesetzter Orientierung flankiert werden, invertiert. Als Ergebnis des Rekombinationsprozesses werden beide codierenden und nicht-codierenden Stränge der gewünschten Gene funktionsfähig mit dem Promotor verbunden, und beide sense- und antisense-Transkripte werden aus den gleichen genetischen Loci in der gleichen chromosomalen Umgebung erzeugt und können dsRNA-Moleküle bilden.

Eine hochgradige konstitutive Expression von ortsspezifischer Rekombinase, wie zum Beispiel Cre, kann abnormale Phänotypen in manchen Pflanzen verursachen (Que et al., 1998, Plant J., 13: 401-409). Bevorzugt ist die Expression der Rekombinase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Rekombinaseexpressionskassette in den gleichen Transformationsvektor plaziert, der zur Einführung der erwünschten transgenen Sequenzen verwendet wird, flankiert von zwei Rekombinaseerkennungsorten in entgegengesetzter Orientierung. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die transgenen Pflanzen, die das Transgen enthalten, flankiert von den Rekombinaseerkennungsorten, mit Linien gekreuzt, die Rekombinase exprimieren, oder mit einem Rekombinase-exprimierenden Vektor retransformiert. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein rekombinantes RNA- oder DNA-Virus, das die induzierbare Rekombinaseexpressionskassette enthält, zur Infektion von Pflanzen verwendet, die das gewünschte Transgenkonstrukt enthalten. Das rekombinante Virus ist bevorzugt fehlerhaft in der Verursachung abnormaler Phänotypen. In den obigen Ausführungsformen verursacht die Rekombinase die Inversion der chromosomalen Kopie der gewünschten Sequenzen, wodurch die gewünschte dsRNA erzeugt wird.

In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein rekombinantes Pflanzen-DNA-Virus zur Erzeugung von sense- und antisense-RNA-Fragmenten verwendet, die eine dsRNA bilden können. Typischerweise vervielfältigen sich Pflanzen-DNA-Viren epichromosomal. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Konstrukt, das eine Kassette enthält, die eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein RNA-Fragment eines Zielgens exprimieren kann, flankiert von zwei invertierten Rekombinaseerkennungsorten, in Pflanzenzellen neben einen zweiten rekombinanten Virus eingeführt, das eine Rekombinase exprimiert. Alternativ sind sowohl die Rekombinaseexpressionskassette als auch die DNA-Sequenz, die von invertierten Erkennungsorten flankiert wird, in gleichen viralen DNA-Vektor verbunden. Nachdem die viralen DNA-Vektoren in Pflanzen eingeführt sind, wird das Rekombinasegen exprimiert. Die Expression des Rekombinasegens verursacht eine Inversion der viralen DNA-Sequenzen, die von Rekombinaseerkennungsorten flankiert werden, und führt zur Erzeugung einer großen Menge von dsRNA aus den gewünschten DNA-Sequenzen aufgrund der hohen Kopiezahlen von viralem Genom in der Zelle. Bevorzugte Rekombinasesysteme sind Cre/lox, FLP/FRT, R/RS und Gin/gix, die dafür bekannt sind, ortsspezifische Rekombinationsprozesse in Pflanzen zu vermitteln (Ow und Medberry, 1995, Critical Reviews in Plant Sciences 14: 239-261, hier durch Verweis eingeführt).

BEISPIEL 6: Erfordernisse zur Konstruktion von Pflanzenexpressionskassetten

Gensequenzen, die zur Expression in transgenen Pflanzen gedacht sind, werden zuerst in Expressionkassetten hinter einem geeigneten Promotor und stromaufwärts eines geeigneten Transkriptionsterminators zusammengesetzt. Alle Erfordernisse für Konstruktionen von Pflanzenexpressionskassetten treffen auf die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung zu und werden unter Verwendung von allgemein fachbekannten Techniken durchgeführt.

Promotorselektion

Die Selektion des Promotors, der in Expressionskassetten verwendet wird, bestimmt das räumliche und zeitliche Expressionsmuster des DNA-Moleküls in der transgenen Pflanze. Ausgewählte Promotoren exprimieren ein DNA-Molekül in spezifischen Zelltypen (wie Blattepidermiszellen, Mesophyllzellen, Wurzelkortexzellen) oder in spezifischen Geweben oder Organen (z.B. Wurzeln, Blätter oder Blüten), und diese Selektion spiegelt den gewünschten Ort der Biosynthese eines RNA-Fragments wider, das durch das DNA-Molekül codiert wird. Alternativ kann der ausgewählte Promotor die Expression des DNA-Moleküls unter einem lichtinduzierten oder ansonsten zeitlich regulierten Promotor antreiben. Eine weitere Alternative besteht darin, daß der ausgewählt Promotor chemisch reguliert wird. Dies stellt die Möglichkeit der Induzierung der Expression des DNA-Moleküls nur dann bereit, wenn es erwünscht ist und durch Behandlung mit einem chemischen Induktor verursacht wird.

Transkriptionsterminatoren

Eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren sind zur Verwendung in Expressionskassetten verfügbar. Diese sind verantwortlich für die Termination der Transkription und vorzugsweise korrekte Polyadenylierung. Angemessene Transkriptionsterminatoren und diejenigen, von denen bekannt ist, daß sie in Pflanzen funktionieren, schließen den CaMV35S-Terminator, den tml-Terminator, den Nopalinsynthase-Terminator und den Erbsen-rbcS-E9-Terminator ein. Diese können sowohl in einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen Pflanzen verwendet werden.

Sequenzen zur Steigerung oder Regulation der Expression Es wurde festgestellt, daß zahlreiche Sequenzen die Genexpression aus der Transkriptionseinheit heraus steigern, und diese Sequenzen können in Verbindung mit dem DNA-Molekül dieser Erfindung verwendet werden, um seine Expression in transgenen Pflanzen zu erhöhen.

Es wurde gezeigt, daß verschiedene Intron-Sequenzen die Expression steigern, insbesondere in einkeimblättrigen Zellen. Zum Beispiel wurde festgestellt, daß die Introns des Mais-Adh1-Gens signifikant die Expression des Gens vom Wildtyp unter seinem verwandten Promotor steigern, wenn sie in Maiszellen eingeführt werden. Intron 1 wird als besonders effektiv festgestellt und steigerte die Expression in Fusionskonstrukten mit dem Chloramphenicolacetyltransferasegen (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)). Im gleichen experimentellen System hatte das Intron aus dem Maisbronzel-Gen eine ähnliche Wirkung in der Steigerung der Expression (Callis et al., s.o.). Intron-Sequenzen werden routinemäßig in Pflanzentransformationsvektoren eingeführt, typischerweise mit der nicht-translatierten Leitsequenz.

Es ist bekannt, daß eine Anzahl von nicht-translatierten Leitsequenzen, die aus Viren stammen, ebenfalls die Expression steigern, und diese sind besonders effektiv in zweikeimblättrigen Zellen. Spezifisch wurde gezeigt, daß Leitsequenzen aus dem Tabakmosaikvirus (TMV, die "&OHgr;-Sequenz"), chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) und Lucerne-Mosaikvirus (AMV) effektiv in der Steigerung der Expression sind (z.B. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).

BEISPIEL 7: Beispiele der Expressionskassettenkonstruktion

Die vorliegende Erfindung umfaßt die Expression eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung unter der Regulation jedes Promotors, der in Pflanzen exprimierbar ist, unabhängig vom Ursprung des Promotors. Deshalb wird das DNA-Molekül in jede beliebige Expressionskassette unter Verwendung von allgemein fachbekannten Techniken inseriert. Diese Expressionskassetten können dann leicht auf die unten beschriebenen Pflanzentransformationsvektoren übertragen werden.

Außerdem umfaßt die Erfindung ebenfalls die Verwendung jedes pflanzenexprimierbaren Promotors in Verbindung mit etwaigen weiteren Sequenzen, die zur Expression des DNA-Moleküls erforderlich sind oder ausgewählt werden. Solche Sequenzen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Transkriptionsterminatoren, fremde Sequenzen zur Steigerung der Expression (wie Introns [z.B. Adh-Intron1], virale Sequenzen [z.B. TMV-&OHgr;]).

Konstitutive Expression: der CaMV35S-Promotor

Die Konstruktion des Plasmids pCGN1761 wird in EP 0 392 225 beschrieben. pCGN1761 enthält den "doppelten" 35S-Promotor und den tml-Transkriptionsterminator mit einem besonderen EcoRI-Ort zwischen dem Promotor und dem Terminator und hat ein Gerüst vom pUC-Typ. Ein Derivat von pCGN1761 wird konstruiert, das einen modifizierten Polylinker aufweist, der NotI- und XhoI-Orte zusätzlich zum existierenden EcoRI-Ort einschließt. Dieses Derivat wird als pCGN1761ENX bezeichnet. pCGN1761ENX ist nützlich zur Klonierung von cDNA-Sequenzen oder Gensequenzen (einschließlich mikrobiellen ORF-Sequenzen) innerhalb seines Polylinkers für die Zwecke ihrer Expression unter der Kontrolle des 35S-Promotors in transgenen Pflanzen. Die gesamte Kassette 35S-Promotor-Gensequenz-tml-Terminator einer solchen Konstruktion kann durch HindIII-, SphI-, SalI- und XbaI-Orte 5' zum Promotor und XbaI-, BamHI- und BglI-Orte 3' zum Terminator zur Übertragung auf Transformationsvektoren ausgeschnitten werden. Außerdem kann das doppelte 35S-Promotorfragment durch 5'-Herausschneiden mit HindIII, SphI, SalI, XbaI oder PstI und 3'-Herausschneiden mit jedem der Polylinker-Restriktionsorte (EcoRI, NotI oder XhoI) zum Austausch gegen einen anderen Promotor entfernt werden.

Entsprechend wird ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung in pCGN1761ENX zur konstitutiven Expression unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors inseriert.

Expression unter einem chemisch regulierbaren Promotor

Dieser Abschnitt beschreibt den Austausch des doppelten 35S-Promotors in pCGN1761ENX gegen jeden Promotor der Wahl; beispielsweise wird der chemisch regulierte PR-1a-Promotor beschrieben. Der Promotor der Wahl wird bevorzugt aus seinem Ursprung durch Restriktionsenzyme ausgeschnitten, aber kann alternativ unter Verwendung von Primern PCR-amplifiziert werden, die entsprechende terminale Restriktionsorte tragen. Sollte eine PCR-Amplifikation durchgeführt werden, dann sollte der Promotor erneut sequenziert werden, um auf Amplifikationsfehler nach der Klonierung des amplifizierten Promotors in den Zielvektor zu überprüfen. Der chemisch regulierbare Tabak-PR-1a-Promotor wird aus Plasmid pCIB1004 abgespalten (siehe EP 0 332 104) und auf Plasmid pCGN1761ENX übertragen. pCIB1004 wird mit NcoI gespalten, und der resultierende 3'-Überhang des linearisierten Fragments wird durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft. Das Fragment wird dann mit HindIII gespalten, und das resultierende, den PR-1a-Promotor enthaltende Fragment wird gelgereinigt und in pCGN1761ENX kloniert, aus dem der doppelte 35S-Promotor entfernt wurde. Dies erfolgt durch Spaltung mit XhoI und Abstumpfen mit T4-Polymerase, gefolgt von Spaltung mit HindIII und Isolierung des den größeren Vektor-Terminator enthaltenden Fragments, in das das pCIB1004-Promotorfragment kloniert wird. Dies erzeugt ein pCGN1761ENX-Derivat mit dem PR-1a-Promotor und dem tml-Terminator und einem dazwischengeschalteten Polylinker mit besonderen EcoRI- und NotI-Orten.

Ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung wird in diesen Vektor inseriert, und das Fusionsprodukt (d.h. Promotor-Gen-Terminator) wird anschließend auf jeden ausgewählten Transformationsvektor übertragen, einschließlich derjenigen, die in dieser Anmeldung beschrieben werden, wodurch die chemisch induzierbare Expression des DNA-Moleküls ermöglicht wird.

Konstitutive Expression: der Actinpromotor

Es ist bekannt, daß verschiedene Isoformen von Actin in den meisten Zelltypen exprimiert werden, und entsprechend ist der Actinpromotor eine gute Wahl als konstitutiver Promotor. Insbesondere wurde der Promotor aus dem Reis-Act1-Gen kloniert und charakterisiert (McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171 (1990)). Es wird festgestellt, daß ein 1,3 kb-Fragment des Promotors alle regulatorischen Elemente enthält, die zur Expression in Reisprotoplasten erforderlich sind. Außerdem wurden zahlreiche Expressionsvektoren auf Basis des Act1-Promotors spezifisch zur Verwendung in einkeimblättrigen Pflanzen konstruiert (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)). Diese beinhalten das Act1-Intron 1, die Adh1-5'-flankierende Sequenz und das Adh1-Intron 1 (aus dem Mais-Alkoholdehydrogenase-Gen) und die Sequenz aus dem CaMV35S-Promotor. Vektoren, die die höchste Expression zeigen, sind Fusionen aus 35S und dem Act1-Intron oder der Act1-5'-flankierenden Sequenz und dem Act1-Intron. Die von McElroy et al. beschriebenen Promotorexpressionskassetten (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) werden leicht zur Expression eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung modifiziert und sind besonders geeignet zur Verwendung in einkeimblättrigen Wirten. Zum Beispiel werden promotorhaltige Fragmente aus den McElroy-Konstruktionen entfernt und verwendet, um den doppelten 355-Promotor in pCGN1761ENX zu ersetzen, das dann verfügbar für die Insertion spezifischer Gensequenzen ist. Die so konstruierten Fusionsgene werden auf geeignete Transformationsvektoren übertragen. In einem getrennten Bericht wurde ebenfalls festgestellt, daß der Reis-Act1-Promotor mit seinem ersten Intron eine hohe Expression in kultivierten Gerstenzellen ausrichtet (Chibbar et al., Plant Cell Rep. 12: 506-509 (1993)).

Ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung wird stromabwärts eines solchen Promotors inseriert, und die Fusionsprodukte (d.h. Promotor-Gen-Terminator) werden anschließend auf jeden ausgewählten Transformationsvektor übertragen, einschließlich derjenigen, die in dieser Anmeldung beschrieben werden.

Konstitutive Expression: der Ubiquitinpromotor

Ubiquitin ist ein weiteres Genprodukt, von dem bekannt ist, daß es sich in vielen Zelltypen anreichert, und sein Promotor wurde aus verschiedenen Arten zur Verwendung in trangenen Pflanzen kloniert (z.B. Sonnenblume – Binet et al., Plant Science 79: 87-94 (1991), Mais – Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)). Der Mais-Ubiquitin-Promotor wurde in transgenen einkeimblättrigen Systemen entwickelt, und seine Sequenz und Vektoren, die zur Transformation von einkeimblättrigen Pflanzen konstruiert werden, werden in EP 0 342 926 offenbart. Ferner beschreiben Taylor et al. (Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)) einen Vektor (pAHC25), der den Mais-Ubiquitinpromotor und ein erstes Intron umfaßt, und seine hohe Aktivität in Zellsuspensionen zahlreicher einkeimblättriger Pflanzen bei Einführung über Mikroprojektilbeschuß. Der Ubiqutinpromotor ist ersichtlich geeignet zur Expression eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung in transgenen Pflanzen, speziell in einkeimblättrigen Pflanzen. Geeignete Vektoren sind Derivate von pAHC25 oder jedem der Transformationsvektoren, die in dieser Anmeldung beschrieben werden, modifiziert durch die Einführung des entsprechenden Ubiquitinpromotors und/oder der Intronsequenzen.

Ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung wird deshalb in jeden dieser Vektoren inseriert, und die Fusionsprodukte (d.h. Promotor-Gen-Terminator) werden zur Transformation von Pflanzen verwendet, was zur konstitutiven Expression des DNA-Moleküls führt.

Wurzelspezifische Expression

Ein bevorzugtes Muster der Expression für ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung ist die Wurzelexpression. Die Expression der Nukleotidsequenz nur in Wurzelgewebe hat den Vorteil der Veränderung der Expression eines Zielgens nur in den Wurzeln ohne eine begleitende Veränderung seiner Expression in Blatt- und Blütengewebe und Samen. Ein geeigneter Wurzelpromotor ist derjenige, der von de Framond (FEBS 290: 103-106 (1991)) und ebenfalls in EP 0 452 269 beschrieben wird. Der Promotor wird auf einen geeigneten Vektor, wie pCGN1761ENX, übertragen, und das DNA-Molekül wird in einen solchen Vektor inseriert. Die gesamte Promotor-Gen-Terminator-Kassette wird anschließend auf einen interessierenden Transformationsvektor übertragen.

Wundinduzierbare Promotoren

Zahlreiche solche Promotoren wurden beschrieben (z.B. Xu et al., Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann et al., Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al., Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), Warner et al., Plant J. 3: 191-201 (1993)), und alle sind geeignet zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Logemann et al. (s.o.) beschreiben die 5'-Stromaufwärtssequenzen des zweikeimblättrigen Kartoffel-wun1-Gens. Xu et al. (s.o.) zeigen, daß ein wundinduzierbarer Promotor aus der zweikeimblättrigen Kartoffel (pin2) aktiv im einkeimblättrigen Reis ist. Außerdem beschreiben Rohrmeier & Lehle (s.o.) die Klonierung der Mais-Wip1-cDNA, die wundinduziert ist und zur Isolierung des verwandten Promotors unter Verwendung von Standardtechniken verwendet werden kann. Ähnlich beschrieben Firek et al. (s.o.) und Warner et al. (s.o.) ein wundinduziertes Gen aus dem einkeimblättrigen Asparagus officinalis, das an lokalen Wund- und Pathogeninvasionsorten exprimiert wird. Unter Verwendung von allgemein fachbekannten Klonierungstechniken können diese Promotoren auf geeigneten Vektoren übertragen, an ein DNA-Molekül dieser Erfindung fusioniert und zur Expression dieser Gene an den Orten der Insektenschädlingsinfektion verwendet werden.

Mark-bevorzugte Expression

WO 93/07278 beschreibt die Isolierung des Mais-trpA-Gens, das vorzugsweise in Markzellen exprimiert wird. Unter Verwendung von standardmäßigen Techniken der Molekularbiologie kann dieser Promotor oder Teile davon auf einen Vektor übertragen werden, wie z.B. pCGN1761, wo er den 355-Promotor ersetzen kann, und zum Antreiben der Expression eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung in einer Mark-bevorzugten Weise verwendet werden. Tatsächlich werden Fragmente, die den Mark-bevorzugten Promotor oder Teile davon enthalten, auf jeden Vektor übertragen und zum Nutzen in transgenen Pflanzen modifiziert. Die Mark-bevorzugte Expression des DNA-Moleküls wird erreicht durch Inserieren des DNA-Moleküls in einen solchen Vektor.

Pollenspezifische Expression

WO 93/07278 beschreibt ferner die Isolierung des calciumabhängigen Proteinkinase-Gens (CDPK) aus Mais, das in Pollenzellen exprimiert wird. Die Gensequenz und der Promotor erstrecken sich bis zu 1400 bp vom Transkriptionsstart. Unter Verwendung von standardmäßigen Techniken der Molekularbiologie wird dieser Promotor oder Teile davon auf einen Vektor übertragen, wie zum Beispiel pCGN1761, wo er den 35S-Promotor ersetzt, und zum Antreiben der Expression eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung in einer pollenspezifischen Weise verwendet. Tatsächlich können Fragmente, die den pollenspezifischen Promotor oder Teile davon enthalten, auf jeden Vektor übertragen und zum Nutzen in transgenen Pflanzen modifiziert werden.

Blattspezifische Expression

Ein Maisgen, das Phosphoenolcarboxylase (PEPC) codiert, wurde von Hudspeth & Grula beschrieben (Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)). Unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie wird der Promotor für dieses Gen verwendet, um die Expression eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung in einer blattspezifischen Weise in transgenen Pflanzen anzutreiben.

BEISPIEL 8: Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren

Zahlreiche Transformationsvektoren sind für die Pflanzentransformation verfügbar, und ein DNA-Molekül dieser Erfindung wird in jede der oben beschriebenen Expressionskassetten inseriert, so daß sie das DNA-Molekül in gewünschten Zellen unter geeigneten Bedingungen exprimieren können. Eine die Nukleotidsequenz enthaltende Expressionskassette wird dann in jeden geeigneten, nachfolgend beschriebenen Transformationsvektor eingeführt.

Die Auswahl des Vektors zur Verwendung wird von der bevorzugten Transformationstechnik und der Zielart zur Transformation abhängen. Für bestimmte Zielarten können unterschiedliche Antibiotika- oder Herbizidselektionsmarker bevorzugt sein. Selektionsmarker, die routinemäßig in der Transformation verwendet werden, schließen das nptII-Gen ein, das Resistenz gegen Kanamycin und verwandte Antibiotika verleiht (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)), das bar-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)), das hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4: 2929-2931), und das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)).

(1) Konstruktion von Vektoren, die zu Agrobacterium-Transformation geeignet sind

Viele Vektoren sind zur Transformation unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens verfügbar. Diese tragen typischerweise wenigstens eine T-DNA-Randsequenz und schließen Vektoren wie pBIN19 ein (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Nachfolgend wird die Konstruktion von zwei typischen Vektoren beschrieben.

Konstruktion von pCIB200 und pCIB2001

Die binären Vektoren pCIB200 und pCIB2001 werden zur Konstruktion von rekombinanten Vektoren zur Verwendung mit Agrobacterium verwendet und werden in der folgenden Weise konstruiert. pTJS75kan wird durch NarI-Verdauung von pTJS75 erzeugt (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985)), was das Ausschneiden des Tetracyclinresistenz-Gens erlaubt, gefolgt von Insertion eines AccI-Fragments aus pUC4K, das ein NPTII trägt (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). XhoI-Linker werden an das EcoRV-Fragment von pCIB7 ligiert, das die linken und rechten T-DNA-Ränder, ein pflanzenselektierbares nos/nptII-chimäres Gen und die pUC-Polylinker enthält (Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)), und das XhoI-verdaute Fragment wird in SalI-verdautes pTJS75kan kloniert, um pCIB200 zu erzeugen (siehe ebenfalls EP 0 332 104). pCIB200 enthält die folgenden besonderen Polylinker-Restriktionsorte: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI und SalI. pCIB2001 ist ein Derivat von pCIB200, das durch die Insertion zusätzlicher Restriktionsorte in den Polylinker erzeugt wird. Besondere Restriktionsorte im Polylinker von pCIB2001 sind EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI uns StuI. pCIB2001 weist zusätzlich zum Enthalten dieser besonderen Restriktionsorte ebenfalls pflanzliche und bakterielle Kanamycinselektion, linke und rechte T-DNA-Ränder für die Agrobacteriumvermittelte Transformation, die RK2-abgeleitete trfA-Funktion zur Mobilisierung zwischen E. coli und andere Wirten und die OriT- und OriV-Funktionen ebenfalls aus RK2 auf. Der pCIB2001-Polylinker ist geeignet zur Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten.

Jede der oben beschriebenen Pflanzenexpressionskassetten, die ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfaßt, wird in pCIB2001 iseriert, bevorzugt unter Verwendung des Polylinkers.

Konstruktion von pCIB10 und Hygromycin-Selektionsderivaten davon

Der binäre Vektor pCIB10 enthält ein Gen, das Kanamycinresistenz zur Selektion in Pflanzen codiert, rechte und linke T-DNA-Randsequenzen und beinhaltet Sequenzen aus dem Plasmid pRK252 mit weitem Wirtebereich, die in die Vervielfältigung sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium erlauben. Seine Konstruktion wird von Rothstein et al. beschrieben (Gene 53: 153-161 (1987)). Verschiedene Derivate von pCIB10 wurden konstruiert, die das Gen für Hygromycin-B-Phosphotransferase beinhalten, beschrieben von Gritz et al. (Gene 25: 179-188 (1983)). Diese Derivate ermöglichen die Selektion von transgenen Pflanzen allein auf Hygromycin (pCIB743) oder Hygromycin und Kanamycin (pCIB715, pCIB717). Dieser Vektor wird zur Transformation einer Expressionskassette verwendet, die ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfaßt.

(2) Konstruktion von Vektoren, die zur Nicht-Agrobacterium-Transformation geeignet sind

Die Transformation ohne Verwendung von Agrobacterium tumefaciens umgeht das Erfordernis für T-DNA-Sequenzen im gewählten Transformationsvektor, und entsprechend können Vektoren, denen diese Sequenzen fehlen, verwendet werden, zusätzlich zu Vektoren wie denjenigen, die oben beschrieben wurden, die T-DNA-Sequenzen enthalten. Transformationstechniken, die nicht auf Agrobacterium beruhen, schließen die Transformation über Teilchenbeschuß, Protoplastenaufnahme (z.B. PEG und Elektroporation), Mikroinjektion oder Pollentransformation (US-PS 5 629 183) ein. Die Wahl des Vektors hängt weitgehend von der bevorzugten Selektion für die transformierte Art ab. Nachfolgend wird die Konstruktion einiger typischer Vektoren beschrieben.

Konstruktion von pCIB3064

pCIB3064 ist ein aus pUC stammender Vektor, der für direkte Gentransfertechniken in Kombination mit Selektion durch das Herbizid Basta (oder Phosphinothricin) geeignet ist. Das Plasmid pCIB246 umfaßt den CaMV35S-Promotor in funktionsfähiger Fusion mit dem E. coli-GUS-Gen und dem CaMV35S-Transkriptionsterminator und wird in WO 93/07278 beschrieben. Der 35S-Promotor dieses Vektors enthält zwei ATG-Sequenzen 5' zum Startort. Diese Orte werden unter Verwendung von standardmäßigen PCR-Techniken in einer solchen Weise mutiert, daß die ATGs entfernt und die Restriktionsorte SspI und PvuII erzeugt werden. Die neuen Restriktionsorte sind 96 und 37 bp entfernt vom besonderen SalI-Ort und 101 und 42 bp entfernt vom tatsächlichen Startort. Das resultierende Derivat von pCIB246 wird als pCIB3025 bezeichnet. Das GUS-Gen wird dann aus pCIB3025 durch Verdauung mit SalI und SacI ausgeschnitten, die Enden abgestumpft und zur Erzeugung von Plasmid pCIB3060 religiert. Das Plasmid pJIT82 wird vom John Innes Centre, Norwich, erhalten, und ein 400 bp SmaI-Fragment, das das bar-Gen aus Streptomyces viridochromogenes enthält, wird ausgeschnitten und in den HpaI-Ort von pCIB3060 inseriert (Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-2523 (1987)). Dies erzeugte pCIB3064, das das bar-Gen unter der Kontrolle des CaMV 355-Promotors und des Terminators für die Herbizidselektion, ein Gen für die Ampicillinresistenz (zur Selektion in E. coli) und einen Polylinker mit den besonderen Orten SphI, PstI, HindIII und BamHI umfaßt. Dieser Vektor ist geeignet zur Klonierung der Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale zur Ausrichtung der Expression eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung enthalten.

Konstruktion von pSOG19 und pSOG35

pSOG35 ist ein Transformationsvektor, der das E. coli-Gen Dihydrofolatreduktase (DHFR) als selektierbaren Marker verwendet, der Resistenz gegen Methotrexat verleiht. PCR wird zur Amplifizierung des 35S-Promotors (–800 bp), von Intron 6 aus dem Mais-Adhl-Gen (–550 bp) und 18 bp der GUS-untranslatierten Leitsequenz aus pSOG10 verwendet. Ein 250 bp-Fragment, das das E. coli-Dihydrofolatreduktase-Typ II-Gen codiert, wird ebenfalls durch PCR amplifiziert, und diese zwei PCR-Fragmente werden mit einem SacI-PstI-Fragment aus pBI221 (Clontech) zusammengesetzt, das das pUC19-Vektorgerüst und den Nopalinsynthase-Terminator umfaßt. Der Zusammenbau dieser Fragmente erzeugte pSOG19, das den 35S-Promotor in Fusion mit der Intron-6-Sequenz, der GUS-Leitsequenz, dem DGFR-Gen und dem Nopalinsynthase-Terminator enthält. Austausch der GUS-Leitsequenz in pSOG19 gegen die Leitsequenz aus dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) erzeugte den Vektor pSOG35. pSOG19 und pSOG35 tragen das pUC-Gen für Amicillinresistenz und weisen HindIII-, SphI-, PstI- und EcoRI-Orte auf, die zur Klonierung von fremden Sequenzen verfügbar sind, insbesondere eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung.

BEISPIEL 9: Chloroplastentransformation Transformationsvektoren

Zur Expression eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung in Pflanzenplastiden wird der Plastidtransformationsvektor pPH143 (WO 97/32011, Beispiel 36) verwendet. Das DNA-Molekül wird in pPH143 inseriert, wodurch die PROTOX-codierende Sequenz ersetzt wird. Dieser Vektor wird dann zur Plastidtransformation und Selektion von Transformanten auf Spectinomycin-Resistenz verwendet. Alternativ wird das DNA-Molekül in pPH143 inseriert, so daß es das aadH-Gen ersetzt. In diesem Fall werden Transformaten auf Resistenz gegen PROTOX-Inhibitoren selektiert.

Chloroplastentransformation

Samen von Nicotiana tabacum c.v. "Xanthi nc" wurden sieben pro Platte in einer ringförmigen Anordnung mit 1" auf T-Agar-Medium gekeimt und 12-14 Tage nach der Aussaat mit 1 &mgr;m Wolframpartikeln (M10, Biorad, Hercules, CA) beschossen, die mit DNA aus Plasmiden pPH143 und pPH145 beschichtet waren, im wesentlichen wie beschrieben (Z. Svab und P. Maliga (1993), PNAS 90, 913-917). Die beschossenen Keimlinge wurden auf T-Medium für zwei Tage inkubiert, worauf Blätter ausgeschnitten und mit der achsfernen Seite nach oben in helles Licht (350-500 &mgr;mol Photonen/m2/s) auf Platten auf RMOP-Medium (Z. Svab, P. Hajdukiewicz und P. Maliga (1990), PNAS 87, 8526-8530) plaziert wurden, das 500 &mgr;g/ml Spectinomycindihydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO) enthielt. Resistente Schößlinge, die unterhalb der gebleichten Blätter 3 bis 8 Wochen nach dem Beschuß erschienen, wurden auf das gleiche selektive Medium subkloniert, Kallus bilden gelassen und sekundäre Schößlinge isoliert und subkloniert. Die vollständige Trennung von transformierten Plastidgenomkopien (Homoplasmizität) in unabhängigen Subklonen wurde durch Standardtechniken von Southern-Blotting bewertet (Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). BamHI/EcoRI-verdaute vollständige zelluläre DNA (I.J. Mettler (1987), Plant Mol. Biol. Reporter 5, 346-349) wurde an 1 % Tris-borat (TBE) Agarosegelen getrennt, auf Nylonmembranen (Amersham) übertragen und mit 32P-markierten "random primed" DNA-Sequenzen sondiert, die einem 0,7 kb BamHI/HindIII-DNA-Fragment aus pC8 entsprechen, das einen Teil der rps7/12-Plastid-Targeting-Sequenz enthält. Homoplasmatische Schößlinge werden aseptisch auf Spectinomycin-enthaltendem MS/IBA-Medium bewurzelt (K.E. McBridge et al. (1994), PNAS 91, 7301-7305) und in das Gewächshaus überführt.

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Veränderung der Expression eines Zielgens in einer Pflanzenzelle, umfassend das Einführen, in eine Pflanzenzelle, eines sense-RNA-Fragments des Zielgens und eines antisense-RNA-Fragments des Zielgens, worin das sense-RNA-Fragment und das antisense-RNA-Fragment ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können.
  2. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin die RNA-Fragmente in zwei unterschiedlichen RNA-Molekülen enthalten sind.
  3. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin die RNA-Fragmente in einem RNA-Molekül enthalten sind.
  4. Verfahren gemäss Anspruch 3, worin das RNA-Molekül sich so falten kann, dass die darin enthaltenen RNA-Fragmente eine doppelsträngige Region bilden.
  5. Verfahren zur Veränderung der Expression eines Zielgens in einer Pflanzenzelle, umfassend das Einführen, in eine Pflanzenzelle, einer ersten DNA-Sequenz, die ein sense-RNA-Fragment des Zielgens in der Zelle exprimieren kann, und einer zweiten DNA-Sequenz, die ein antisense-RNA-Fragment des Zielgens in der Zelle exprimieren kann, worin (i) die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz in zwei unterschiedlichen DNA-Molekülen enthalten sind; und (ii) die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz stabil im Genom der Pflanzenzelle integriert sind; und (iii) das sense-RNA-Fragment und das antisense-RNA-Fragment ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können.
  6. Verfahren gemäss Anspruch 5, worin das Zielgen ein essentielles Gen der Pflanzenzelle ist.
  7. Verfahren gemäss Anspruch 5, worin das Zielgen ein heterologes Gen ist, das stabil im Genom der Pflanzenzelle integriert ist.
  8. Verfahren gemäss Anspruch 7, worin das heterologe Gen in der Pflanzenzelle als extrachromosomales Molekül vorhanden ist.
  9. Verfahren gemäss Anspruch 5, worin die DNA-Moleküle ferner einen ersten Promotor, der funktionsfähig mit der ersten DNA-Sequenz verbunden ist, und einen zweiten Promotor umfassen, der funktionsfähig mit der zweiten DNA-Sequenz verbunden ist.
  10. Pflanzenzelle, die eine erste DNA-Sequenz, die ein sense-RNA-Fragment eines Zielgens exprimieren kann, und eine zweite DNA-Sequenz umfasst, die ein antisense-RNA-Fragment des Zielgens exprimieren kann, worin (i) die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz in zwei unterschiedlichen DNA-Molekülen enthalten sind; und (ii) die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz stabil im Genom der Pflanzenzelle integriert sind; und (iii) das sense-RNA-Fragment und das antisense-RNA-Fragment ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können und die Expression des Zielgens in der Pflanzenzelle verändert ist, wenn die DNA-Sequenzen exprimiert werden.
  11. Pflanze und Nachkommenschaft davon, die aus der Pflanzenzelle gemäss Anspruch 10 stammt, worin die Pflanze und die Nachkommenschaft davon eine erste DNA-Sequenz, die ein sense-RNA-Fragment eines Zielgens exprimieren kann, und eine zweite DNA-Sequenz umfassen, die ein antisense-RNA-Fragment des Zielgens exprimieren kann, worin (i) die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz in zwei unterschiedlichen DNA-Molekülen enthalten sind; und (ii) die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz stabil im Genom der Pflanze und der Nachkommenschaft davon integriert sind; und (iii) das sense-RNA-Fragment und das antisense-RNA-Fragment ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können und die Expression des Zielgens in der Pflanze und in der Nachkommenschaft davon verändert ist, wenn die DNA-Sequenzen exprimiert werden.
  12. Samen, die aus der Pflanze gemäss Anspruch 11 stammen, worin die Samen eine erste DNA-Sequenz, die ein sense-RNA-Fragment eines Zielgens exprimieren kann, und eine zweite DNA-Sequenz umfassen, die ein antisense-RNA-Fragment des Zielgens exprimieren kann, worin (i) die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz in zwei unterschiedlichen DNA-Molekülen enthalten sind; und (ii) die erste DNA-Sequenz und die zweite DNA-Sequenz stabil im Genom des Samens integriert sind; und (iii) das sense-RNA-Fragment und das antisense-RNA-Fragment ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können und die Expression des Zielgens im Samen verändert ist, wenn die DNA-Sequenzen exprimiert werden.
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