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Dokumentenidentifikation DE69634610T2 29.09.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000871737
Titel VERFAHREN ZUM SCHUTZ VON KULTURPFLANZEN VOR SCHÄDLICHEN INSEKTEN
Anmelder Syngenta Participations AG, Basel, CH
Erfinder GAY, Bernard, Philippe, F-68100 Mulhouse, FR
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69634610
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.12.1996
EP-Aktenzeichen 969446517
WO-Anmeldetag 23.12.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/EP96/05828
WO-Veröffentlichungsnummer 0097026339
WO-Veröffentlichungsdatum 24.07.1997
EP-Offenlegungsdatum 21.10.1998
EP date of grant 13.04.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.09.2005
IPC-Hauptklasse C12N 15/32
IPC-Nebenklasse C12N 15/82   C07K 14/325   C07K 14/32   A01N 63/00   A01H 5/00   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von Sesamia-Arten in Kulturpflanzen durch Verwendung von Toxinproteinen, die aus Bacillus thuringiensis und/oder anderen Bacillus-Arten erhältlich sind.

Bacillus thuringiensis gehört zur großen Gruppe von Gram-positiven, aeroben, endosporenbildenden Bakterien. Anders als andere, sehr eng verwandte Arten von Bacillus, wie z. B. B. cereus oder B. anthracis, erzeugt die Mehrzahl der bislang bekannten Bacillus thuringiensis-Arten im Verlauf ihrer Sporulation einen parasporalen Einschlusskörper, der aufgrund seiner kristallinen Struktur allgemein als kristalliner Körper bezeichnet wird. Dieser kristalline Körper ist aus insektizid aktiven kristallinen Protoxinproteinen, den sogenannten &dgr;-Endotoxinen, zusammengesetzt.

Diese Proteinkristalle sind verantwortlich für die Toxizität von Bacillus thuringiensis für Insekten. Das &dgr;-Endotoxin übt seine insektizide Aktivität erst nach der oralen Aufnahme des kristallinen Körpers auf, wenn letzterer im Darmsaft der Zielinsekten aufgelöst wird. In den meisten Fällen wird die tatsächliche toxische Komponente aus dem Protein als Ergebnis von proteolytischer Spaltung freigesetzt, die durch die Wirkung von Proteasen aus dem Verdauungstrakt der Insekten verursacht wird.

Die &dgr;-Endotoxine der verschiedenen Bacillus thuringiensis-Stämme sind durch eine hohe Spezifität gegenüber bestimmten Zielinsekten gekennzeichnet, speziell in Bezug auf verschiedene Lepidoptera-, Coleoptera- und Diptera-Larven, und durch einen hohen Aktivitätsgrad gegen solche anfälligen Larven. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von &dgr;-Endotoxinen von Bacillus thuringiensis beruht auf der Tatsache, dass die Toxine harmlos für Menschen, andere Säugetiere, Vögel und Fische sind.

Die verschiedenen insektiziden Kristallproteine aus Bacillus thuringiensis wurden auf Basis ihres Wirkungsspektrums und ihrer Sequenzähnlichkeit klassifiziert. Die von Höfte und Whiteley, Microbiol. Rev. 53: 242–255 (1989) vorgestellte Klassifikation unterteilte die damals bekannten insektiziden Kristallproteine in vier Hauptklassen. Allgemein werden die Hauptklassen durch ihr Aktivitätsspektrum definiert, wobei die CryI-Proteine gegen Lepidoptera aktiv sind, die CryII-Proteine gegen sowohl Lepidoptera als auch Diptera aktiv sind, die CryIII-Proteine gegen Coleoptera aktiv sind und die CryIV-Proteine gegen Diptera aktiv sind.

Innerhalb jeder Hauptklasse werden die &dgr;-Endotoxine gemäß ihrer Sequenzähnlichkeit gruppiert. Die CryI-Proteine werden typischerweise als 130–190 kDa Protoxinproteine erzeugt, die proteolytisch gespalten werden, um insektizid aktive Toxinproteine mit einer Größe von ca. 60–70 kDa zu erzeugen. Der aktive Teil des &dgr;-Endotoxins liegt im NH2-terminalen Anteil des Moleküls voller Länge. Höfte und Whiteley, s. o., klassifizierten die damals bekannten CryI-Proteine in sechs Gruppen, IA(a), IA(b), IA(c), IB, IC und ID. Seit damals wurden ebenfalls als CryIE, CryIF, CryIG, CryIH und CryIX klassifizierte Proteine charakterisiert.

Das Spektrum der insektiziden Aktivität eines individuellen &dgr;-Endotoxins aus Bacillus thuringiensis neigt relativ eng zu sein, wobei ein gegebenes &dgr;-Endotoxin aktiv gegen nur wenige Insekten ist. Spezifität ist das Ergebnis der Effizienz der verschiedenen Schritte, die an der Erzeugung eines aktiven Toxinproteins beteiligt sind, und seiner anschließenden Fähigkeit zur Wechselwirkung mit den Epithelzellen des Insektenverdauungstrakts.

Bis heute ist keine solche Aktivität für Arten der Lepidotera-Gattung Sesamia berichtet worden, die beträchtliche Schädigung in Getreidepflanzen verursacht, insbesondere in der südlichen Hemisphäre einschließlich des Mittelmeergebiets. Die Ertragsverluste, die durch Sesamia-Arten in Mais verursacht werden, befinden sich in einem Bereich von 5 bis 10%, aber können in schweren Fällen bis zu 40% erreichen. Im Gegenteil wurde auf diesem Gebiet angenommen, dass Bt-Toxine, wie die obengenannten Toxine vom CryI-Typ, nicht aktiv gegen Sesamia-Arten sind und nicht in geeigneter Weise zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Nutzpflanzen verwendet werden können.

Es ist deshalb eine der Aufgaben dieser Erfindung, ein Verfahren zur Bekämpfung von Sesamia-Arten in Nutzpflanzen, aber bevorzugt in Mais und anderen Getreidepflanzen, bereitstellen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Sesamia nonagrioides, S. inferens, S. calamistis, S. cretica, etc. Diese Aufgabe konnte überraschend im Umfang der Erfindung durch Ausbringen eines &dgr;-Endotoxinproteins von Bacillus thuringiensis auf die zu schützende Nutzpflanze erreicht werden. Insbesondere kann eine Klasse von Toxinproteinen, die aus vegetativen Kulturen von Bacillus-Arten erhältlich sind, die sogenannten VIPs, einschließlich VIP1, VIP2 und VIP3 (EP-A 0 690 916; Internationale Anmeldung Nr. EP95/03826, deren Offenbarung hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt wird], in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Schutz von Pflanzen gegen Schädigung, die durch Sesamia-Arten verursacht wird, umfassend das direkte oder indirekte Verabreichen eines Toxinproteins von Bacillus spp., bevorzugt eines obengenannten Proteins vom VIP-Typ, auf die zu schützende Pflanze oder den zu schützenden Pflanzensamen oder das zu schützende Anbaugebiet, entweder rein oder in Form einer insektiziden Zusammensetzung, die wenigstens eines der Proteine oder einen Mikroorganismus, aber speziell einen Bacillus thuringiensis- und/oder einen Bacillus cereus-Stamm, umfasst, der wenigstens ein Toxingen enthält, das die Toxinproteine codiert. Die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen können entweder natürlich vorkommende Stämme oder alternativ ein rekombinanter Stamm sein, der die Toxin-codierende DNA in rekombinanter Form umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße transgene Pflanze in einem Verfahren zum Schutz von Pflanzen gegen Schädigung verwendet werden, die durch Sesamia-Arten verursacht wird, umfassend das Transformieren der Pflanze mit einem Toxingen, das ein Toxinprotein aus einer Bacillus-Art codiert, aber speziell ein Protein vom VIP-Typ oder ein Protein vom VIP-Typ und ein Protein vom CryI-Typ, und Exprimieren des Toxinproteins in einer ausreichenden Menge, um Kontrolle gegen Sesamia-Arten bei Pflanzung der so transformierten Pflanze innerhalb eines Gebiets bereitzustellen, in dem der Insektenschädling auftreten kann.

Gene vom CryIA-Typ sind aus verschiedenen Bacillus thuringiensis-Arten bekannt, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Bt kurstaki HD1 [cry IA(a); Schnepf et al. (1985), J. Biol. Chem. 260, 6264–6272], Bt subsp berliner [cry IA(b); Wabiko et al. (1986) DNA 5, 305–314; Höfte et al. (1986) Eur. J. Biochem. 161, 273–280], Bt subsp. kurstaki HD-73 [cry IA(c); Adang et al. (1985) Gene 36, 289–300], Bt HD2 [cry IB; Brizzard et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 2723–2729], Bt subsp entomocidus [cryIC; Honee et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 6240], Bt subsp aizawai [cry IC, cryID, cryIF; cryIX; Sanchis et al. (1988), EP-A-0 295 156; Gawron-Burke et al. (1991), WO 91/16434], Bt subsp darmstadiensis [cry IE; Höfte and Whiteley (1989), EP-A 0 358 557], und Bt subsp kenyae [cryIF; Visser et al. (1990) J. Bacteriol. 172, 6783–6788; Kramer et al. (1995, WO 95/34656)]. Weitere Gene vom cryI-Typ werden in EP-A 0 367 474, EP-A 0 401 979 und in WO 90/13651 offenbart. Bevorzugt zur Verwendung im Umfang der vorliegenden Erfindung sind die Expressionsprodukte von Genen vom cryIA-Typ, aber speziell von Genen vom cryIA(b)-Typ, wie von denjenigen, die aus Bacillus thuringiensis var. kurstaki oder aus synthetischen Varianten davon stammen. Speziell bevorzugt sind die Gene vom cryIA(b)-Typ, die in SEQ ID NOS: 53 bis 55 gezeigt sind.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden insektiziden Zusammensetzungen zum Schutz von Kulturpflanzen gegen Sesamia-Schädlinge umfassen bevorzugt als aktiven Bestandteil wenigstens ein Toxinprotein aus Bacillus thuringiensis oder einen Mikroorganismus, der wenigstens ein Gen enthält, das das Toxinprotein codiert, aber speziell einen Bacillus thuringiensis-Stamm, der wenigstens ein Gen enthält, das das Toxinprotein codiert, oder ein Derivat oder eine Mutante davon, zusammen mit einem landwirtschaftlichen Hilfsstoff, wie z. B. einem Träger, Verdünnungsmittel, Tensid oder einem die Ausbringung fördernden Hilfsstoff. Der in der insektiziden Zusammensetzung enthaltene aktive Bestandteil kann ein Toxin vom VIP-Typ, wie in EP-A 0 690 916 und in der Internationalen Anmeldung Nr. EP95/03826 offenbart, oder ein Mikroorganismus, der wenigstens ein Gen enthält, das das Toxinprotein vom VIP-Typ codiert, oder eine Kombination aus Proteinen vom CryI-Typ und vom VIP-Typ sein, entweder in einer im wesentlichen reinen Form oder als Teil eines Mikroorganismus. Eingeschlossen im Umfang dieser Anmeldung sind Toxinproteine vom VIP-Typ, wie sie in SEQ ID NOS: 1, 2, 4–7, 17–24, 26–32, 35, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 49, 50, 51 oder 52 gezeigt sind.

Die Zusammensetzung kann ebenfalls eine weitere biologisch aktive Verbindung enthalten. Die Verbindung kann sowohl ein Düngemittel als auch ein Mikronährstoffdonor oder andere Zubereitungen sein, die das Pflanzenwachstum beeinflussen. Sie kann ebenfalls ein selektives Herbizid, Insektizid, Fungizid, Bakterizid, Nematozid, Molluskizid oder Mischungen von mehreren dieser Zubereitungen sein, falls gewünscht zusammen mit weiteren landwirtschaftlich akzeptablen Trägern, Tensiden oder die Ausbringung fördernden Hilfsstoffen, die üblicherweise auf dem Formulierungsgebiet eingesetzt werden. Geeignete Träger und Hilfsstoffe können fest oder flüssig sein und entsprechen den Stoffen, die gewöhnlich in der Formulierungstechnologie eingesetzt werden, z. B. natürliche oder regenerierte Mineralstoffe, Lösungsmittel, Dispergiermittel, Benetzungsmittel, Klebrigmacher, Bindemittel oder Düngemittel.

Die Zusammensetzung kann 0,1 bis 99 Gew.-% des aktiven Bestandteils, 1 bis 99 Gew.-% eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und 0 bis 25 Gew.-% eines Tensids umfassen. Der aktive Bestandteil oder die Zusammensetzung, die den aktiven Bestandteil umfasst, können an die zu schützenden Pflanzen oder Kulturpflanzen zusammen mit bestimmten anderen Insektiziden oder Chemikalien (1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Kanada) ohne Wirkungsverlust verabreicht werden. Sie ist mit den meisten anderen, üblicherweise verwendeten landwirtschaftlichen Spritzmitteln kompatibel, aber sollte nicht in äußerst alkalischen Spritzlösungen verwendet werden, falls ein Toxin vom CryI-Typ beteiligt ist. Sie kann als Staub, Suspension, Spritzpulver oder in jeder anderen Stoffform verabreicht werden, die zur landwirtschaftlichen Anwendung geeignet ist.

Der aktive Bestandteil, der bevorzugt ein zuvor genanntes Protein vom VIP-Typ ist, oder die Zusammensetzung, die den aktiven Bestandteil umfasst, kann auf (a) eine Umgebung, in der der Insektenschädling auftreten kann, (b) eine Pflanze oder ein Pflanzenteil, um die Pflanze oder das Pflanzenteil vor Schädigung zu schützen, die durch einen Insektenschädling verursacht wird, oder (c) Saatgut ausgebracht werden, um eine Pflanze, die sich aus dem Saatgut entwickelt, vor Schädigung zu schützen, die durch einen Insektenschädling verursacht wird.

Ein bevorzugtes Ausbringungsverfahren auf dem Gebiet des Pflanzenschutzes ist die Ausbringung auf die Blätter der Pflanze (Blattanwendung), wobei die Anzahl der Anwendungen und die Aufwandmenge von der zu schützenden Pflanze und dem Befallrisiko durch den fraglichen Schädling abhängt. Jedoch kann der aktive Bestandteil ebenfalls die Pflanzen durch die Wurzeln durchdringen (systemische Wirkung), falls der Locus der Pflanzen mit einer flüssigen Formulierung getränkt wird, oder falls der aktive Bestandteil in fester Form in den Locus der Pflanzen eingeführt wird, z. B. in den Boden, z. B. in gekörnter Form (Bodenanwendung). Bei Wasserreisanbauten können solche Granalien in abgemessenen Mengen auf das überflutete Reisfeld ausgebracht werden.

Die in einem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Zusammensetzungen sind ebenfalls geeignet zum Schutz von Pflanzenvermehrungsmaterial, z. B. Saatgut, wie Früchte, Knollen oder Körner, oder Pflanzenstecklingen, vor Insektenschädlingen. Das Vermehrungsmaterial kann mit der Formulierung vor dem Auspflanzen behandelt werden: z. B. kann Saatgut vor dem Aussäen behandelt werden. Der aktive Bestandteil der Erfindung kann ebenfalls auf Körner aufgetragen werden (Überzug), entweder durch Tränken der Körner mit einer flüssigen Formulierung oder durch ihr Überziehen mit einer festen Formulierung. Die Formulierung kann ebenfalls auf den Pflanzungsort ausgebracht werden, wenn das Vermehrungsmaterial ausgepflanzt wird, z. B. auf die Saatgutfurche während des Aussäens. Die Erfindung betrifft ebenfalls diese Verfahren der Behandlung von Pflanzenvermehrungsmaterial und das so behandelte Pflanzenvermehrungsmaterial.

Im Umfang der Erfindung können die Zusammensetzungen in jeder für die Behandlung von Saatgut oder Boden mit bakteriellen Stämmen bekannten Methode angewendet werden. Siehe z. B. US-PS 4,863,866. Die Stämme sind effektiv zur biologischen Bekämpfung, selbst wenn der Mikroorganismus nicht lebendig ist. Jedoch ist die Anwendung des lebenden Mikroorganismus bevorzugt.

Zielkulturpflanzen zum Schutz innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die Wirtspflanzen für Sesamia-Arten sind, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) die folgenden Pflanzenarten: Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Sorghum, Hirse und verwandte Kulturpflanzen, Futtergräser (Knaulgras, Schwingel und dergleichen) und Zuckerrohr.

Der erfindungsgemäße aktive Bestandteil kann in unmodifizierter Form oder zusammen mit jedem geeigneten landwirtschaftlich akzeptablen Träger verwendet werden. Solche Träger sind Hilfsstoffe, die herkömmlich auf dem Gebiet der landwirtschaftlichen Formulierung eingesetzt werden, und sie werden deshalb in bekannter Weise zu emulgierbaren Konzentraten, überziehbaren Pasten, direkt verspritzbaren oder verdünnbaren Lösungen, verdünnten Emulsionen, Spritzpulvern, löslichen Pulvern, Stäuben, Granulaten und ebenfalls Verkapselungen, z. B. in Polymersubstanzen, formuliert. Wie die Natur der Zusammensetzungen werden die Anwendungsverfahren, wie z. B. Versprühen, Atomisieren, Zerstäuben, Verstreuen oder Gießen, gemäß dem beabsichtigten Ziel und den vorherrschenden Umständen ausgewählt. Vorteilhafte Aufwandmengen sind normalerweise ca. 50 g bis ca. 5 kg des aktiven Bestandteils (a. i.) pro Hektar ("ha", ca. 2,471 Acre), bevorzugt ca. 100 g bis ca. 2 kg a. i./ha. Wichtige Aufwandmengen sind ca. 200 g bis ca. 1 kg a. i./ha und 200 g bis 500 g a. i./ha.

Für die Saatgutbehandlung (Beizung) sind vorteilhafte Aufwandmengen 0,5 bis 1.000 g a. i. pro 100 kg Saatgut, bevorzugt 3 bis 100 g a. i. pro 100 kg Saatgut oder 10 bis 50 g a. i. pro 100 kg Saatgut.

Geeignete Träger und Hilfsstoffe können fest oder flüssig sein und entsprechen den Substanzen, die gewöhnlich in der Formulierungstechnologie eingesetzt werden, z. B. natürliche oder regenerierte Mineralstoffe, Lösungsmittel, Dispergiermittel, Benetzungsmittel, Klebrigmacher, Bindemittel oder Düngemittel. Die Formulierungen, d. h. die insektiziden Zusammensetzungen, Zubereitungen oder Mischungen davon mit anderen aktiven Bestandteilen und nach Bedarf einem festen oder flüssigen Hilfsstoff, werden in bekannter Weise hergestellt, z. B. durch homogenes Vermischen und/oder Mahlen der aktiven Bestandteile mit Streckmitteln, z. B. Lösungsmitteln, festen Trägern und in manchen Fällen oberflächenaktiven Verbindungen (Tensiden).

Geeignete Lösungsmittel sind: aromatische Kohlenwasserstoffe, bevorzugt die Fraktionen, die 8 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, z. B. Xylolmischungen oder substituierte Naphthaline, Naphthalate, wie Dibutylphthalat oder Dioctylphthalat, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine, Alkohole und Glykole und ihre Ether und Ester, wie Ethanol, Ethylenglykolmonomethyl- oder monoethylether, Ketone wie Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel, wie N-Methyl-2-pyrrolidon, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid, sowie pflanzliche Öle oder epoxidierte pflanzliche Öle, wie epoxidiertes Kokosöl oder Sojaöl; oder Wasser.

Die z. B. für Stäube und dispergierbare Pulver verwendeten festen Träger sind normalerweise natürliche mineralische Füllstoffe, wie Calcit, Talkum, Kaolin, Montmorillonit oder Attapulgit. Um die physikalischen Eigenschaften zu verbessern, ist es ebenfalls möglich, hochdispergierte Kieselsäure oder hochdispergierte absorbierende Polymere hinzuzugeben. Geeignete granulierte Adsorptionsträger sind poröse Typen, z. B. Bimsstein, zerstoßene Ziegel, Sepiolit oder Bentonit; und geeignete nicht-absorbierende Träger sind Materialien wie Calcit oder Sand. Zusätzlich kann eine große Anzahl von vorgranulierten Materialien anorganischer oder organischer Natur verwendet werden, z. B. speziell Dolomit oder pulverisierte Pflanzenreste.

Abhängig von der Natur der zu formulierenden aktiven Bestandteile sind geeignete oberflächenaktive Verbindungen nicht-ionische, kationische und/oder anionische Tenside mit guten emulgierenden, dispergierenden und benetzenden Eigenschaften. Der Begriff "Tenside" versteht sich als Mischungen von Tensiden umfassend. Geeignete anionische Tenside können sowohl wasserlösliche Seifen als auch wasserlösliche synthetische oberflächenaktive Verbindungen sein. Geeignete Seifen sind die Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze oder unsubstituierten oder substituierten Ammoniumsalze von höheren Fettsäuren (C10-C22), z. B. die Natrium- oder Kaliumsalze von Olein- oder Stearinsäure, oder von natürlichen Fettsäuremischungen, die z. B. aus Kokosöl oder Talgöl erhalten werden können. Weitere geeignete Tenside sind ebenfalls die Fettsäuremethyllaurinsalze sowie modifizierte und unmodifizierte Phospholipide.

Häufiger werden sogenannte synthetische Tenside verwendet, speziell Fettsulfonate, Fettsulfate, sulfonierte Benzimidazolderivate oder Alkylarylsulfonate. Die Fettsulfonate oder -sulfate sind gewöhnlich in Form von Alkalimetallsalzen, Erdalkalimetallsalzen oder unsubstituierten oder substituierten Ammoniumsalzen und enthalten allgemein einen C8-C22-Rest, der ebenfalls die Alkyleinheit von Acylresten einschließt, z. B. das Natrium- oder Calciumsalz von Lignosulfonsäure, von Dodecylsulfat oder von einer Mischung aus Fettalkoholsulfaten, die aus natürlichen Fettsäuren erhalten werden. Diese Verbindungen umfassen ebenfalls die Salze von Schwefelsäureestern und Sulfonsäuren von Fettalkohol/Ethylenoxid-Addukten. Die sulfonierten Benzimidazolderivate enthalten bevorzugt zwei Sulfonsäuregruppen und einen Fettsäurerest, der ca. 8 bis 22 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele für Alkylarylsulfonate sind die Natrium-, Calcium- oder Triethanolaminsalze von Dodecylbenzolsulfonsäure, Dibutylnaphthalinsulfonsäure oder eines Naphthalinsulfonsäure/Formaldehyd-Kondensationsprodukts. Ebenfalls geeignet sind entsprechende Phosphate, z. B. Salze des Phosphorsäureesters eines Addukts aus p-Nonylphenol mit 4 bis 14 mol Ethylenoxid.

Nicht-ionische Tenside sind bevorzugt Polyglykoletherderivate von aliphatischen oder cycloaliphatischen Alkoholen oder von gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren und Alkylphenolen, wobei die Derivate 3 bis 30 Glykolethergruppen und 8 bis 20 Kohlenstoffatome in der (aliphatischen) Kohlenwasserstoffeinheit und 6 bis 18 Kohlenstoffatome in der Alkyleinheit der Alkylphenole enthalten.

Weitere geeignete nicht-ionische Tenside sind die wasserlöslichen Addukte aus Polyethylenoxid mit Polypropylenglykol, Ethylendiaminopolypropylenglykol und Alkylpolypropylenglykol, das 1 bis 10 Kohlenstoffatome in der Alkylkette enthält, wobei die Addukte 20 bis 250 Ethylenglykolethergruppen und 10 bis 100 Propylenglykolethergruppen enthalten. Diese Verbindungen enthalten gewöhnlich 1 bis 5 Ethylenglykoleinheiten pro Propylenglykoleinheit. Repräsentative Beispiele für nicht-ionische Tenside sind Nonylphenolpolyethoxyethanole, Rizinusölpolyglykolether, Polypropylen/Polyethylenoxid-Addukte, Tributylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol und Octylphenoxypolyethoxyethanol. Fettsäureester von Polyoxyethylensorbitan, wie Polyoxyethylensorbitantrioleat, sind ebenfalls geeignete nicht-ionische Tenside.

Kationische Tenside sind bevorzugt quaternäre Ammoniumsalze, die als N-Substituent wenigstens einen C8-C22-Alkylrest und als weitere Substituenten niedere unsubstituierte oder halogenierte Alkyl-, Benzyl- oder Hydroxyl-Niederalkyl-Reste enthalten. Die Salze sind bevorzugt in Form von Halogeniden, Methylsulfaten oder Ethylsulfaten, z. B. Stearyltrimethylammoniumchlorid oder Benzyldi-(2-chlorethyl)ethylammoniumbromid.

Die auf dem Gebiet der Formulierung herkömmlich eingesetzten Tenside werden z. B. beschrieben in "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publishing Corp. Ridgewood, N. J., 1979; Dr. Helmut Stache, "Tensid-Taschenbuch", Carl Hanser Verlag, München/Wien.

Eine andere besonders bevorzugte Eigenschaft einer erfindungsgemäßen insektiziden Zusammensetzung ist die Beständigkeit des aktiven Bestandteils, wenn sie auf Pflanzen oder Boden ausgebracht wird. Mögliche Ursachen für Aktivitätsverlust schließen Inaktivierung durch UV-Licht, Wärme, Blattausdünstungen und pH ein. Zum Beispiel werden bei hohem pH, insbesondere in Gegenwart eines Reduktionsmittels, &dgr;-Endotoxinkristalle solubilisiert und werden daher der proteolytischen Inaktivierung zugänglicher. Ein hoher Blatt-pH könnte ebenfalls wichtig sein, insbesondere wenn die Blattoberfläche im Bereich von pH 8–10 sein kann. Die Formulierung einer insektiziden Zusammensetzung, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden soll, kann diese Probleme angehen, indem entweder Additive eingeschlossen werden, um Verlust des aktiven Bestandteils verhindern zu helfen, oder indem das Material in einer solchen Weise verkapselt wird, dass der aktive Bestandteil vor Inaktivierung geschützt wird. Die Verkapselung kann chemisch (McGuire und Shasha, J. Econ. Entomol. 85: 1425–1933, 1992) oder biologisch (Barnes und Cummings, 1986; EP-A 0 192 319) erreicht werden. Die chemische Verkapselung beinhaltet ein Verfahren, in dem der aktive Bestandteil mit einem Polymer überzogen wird, während die biologische Verkapselung die Expression der &dgr;-Endotoxingene in einer Mikrobe beinhaltet. Zur biologischen Verkapselung wird die intakte Mikrobe, die das Toxinprotein enthält, als aktiver Bestandteil in der Formulierung verwendet. Die Zugabe von UV-Schutzmitteln könnte effektiv Strahlungsschädigung reduzieren. Inaktivierung aufgrund von Wärme könnte ebenfalls durch Einschließen eines geeigneten Additivs bekämpft werden.

Bevorzugt in der vorliegenden Anmeldung sind Formulierungen, die lebende Mikroorganismen als aktiven Bestandteil umfassen, entweder in Form der vegetativen Zelle oder besonders bevorzugt in Form von Sporen, falls verfügbar. Geeignete Formulierungen können z. B. aus Polymergelen bestehen, die mit mehrwertigen Kationen vernetzt sind und diese Mikroorganismen umfassen. Dies wird z. B. beschrieben von D. R. Fravel et al., Phytopathology, Band 75, Nr. 7, 774–777, 1985, für Alginat als Polymermaterial. Es ist aus dieser Veröffentlichung ebenfalls bekannt, dass Trägermaterialien zusammen verwendet werden können. Diese Formulierungen werden als Regel durch Vermischen von Lösungen aus natürlich vorkommenden oder synthetischen gelbildenden Polymeren, z. B. Alginaten, und wässrigen Salzlösungen mehrwertiger Metallionen hergestellt, so dass sich individuelle Tröpfchen bilden, wobei es für die Mikroorganismen möglich ist, in einer der zwei oder in beiden Reaktionslösungen suspendiert zu sein. Die Gelbildung beginnt mit dem Vermischen in Tropfenform. Anschließendes Trocknen dieser Gelpartikel ist möglich. Dieses Verfahren wird ionotropes Gelieren genannt. Abhängig vom Trocknungsgrad werden kompakte und harte Partikel aus Polymeren gebildet, die strukturell über mehrwertige Kationen vernetzt sind und die Mikroorganismen und einen Träger umfassen, der vorherrschend gleichförmig verteilt ist. Die Größe der Partikel kann bis zu 5 mm sein.

Zusammensetzungen auf Basis von teilweise vernetzten Polysacchariden, die zusätzlich zu einem Mikroorganismus z. B. auch fein verteilte Kieselsäure als Trägermaterial umfassen können, wobei die Vernetzung z. B. über Ca++-Ionen erfolgt, werden in EP-A1-0 097 571 beschrieben. Die Zusammensetzungen besitzen eine Wasseraktivität von nicht mehr als 0,3. W. J. Cornick et al. beschrieben in einem Übersichtsartikel [New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, S. 395–372, Alan R. Liss, Inc. (1990)] verschiedene Formulierungssysteme, Granalien mit Vermiculit als Träger und kompakte Alginatperlen, die durch das genannte ionotrope Gelierungsverfahren hergestellt werden. Solche Zusammensetzungen werden ebenfalls offenbart von D. R. Fravel, Pesticide Formulations and Application Systems: Band 11, ASTM STP 1112 American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 1992, S. 173–179, und können zur Formulierung der erfindungsgemäßen rekombinanten Mikroorganismen verwendet werden. Weitere Verfahren zur Formulierung von lebenden Mikroorganismen werden in WO 96/02683 beschrieben.

Die in einem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden insektiziden Zusammensetzungen enthalten gewöhnlich ca. 0,1 bis ca. 99%, bevorzugt ca. 0,1 bis ca. 95% und am meisten bevorzugt ca. 3 bis ca. 90% des aktiven Bestandteils, ca. 1 bis ca. 99,9, bevorzugt ca. 1 bis ca. 99% und am meisten bevorzugt ca. 5 bis ca. 95% eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und ca. 0 bis ca. 25%, bevorzugt ca. 0,1 bis ca. 25% und am meisten bevorzugt ca. 0,1 bis ca. 20% eines Tensids.

Während kommerzielle Produkte bevorzugt als Konzentrate formuliert werden, wird der Endanwender normalerweise verdünnte Formulierungen mit wesentlich geringerer Konzentration einsetzen. Die insektiziden Zusammensetzungen können ebenfalls weitere Bestandteile enthalten, wie Stabilsatoren, Antischaummittel, Viskositätsregulatoren, Bindemittel, Klebrigmacher sowie Düngemittel oder andere aktive Bestandteile, um spezielle Effekte zu erhalten.

Es wurde überraschend gefunden, dass eine quantitativ variable Kombination von zwei aktiven Bestandteilen, einerseits eines Cry-Typ- oder &dgr;-Endotoxinproteins und andererseits eines Proteins vom VIP-Typ, eine synergistische Wirkung aufweist, die vorteilhaft geeignet zur Bekämpfung von Sesamia-Arten in Kulturpflanzen ist und die die Grenzen der Wirkung beider Toxinproteine in zweierlei Hinsicht erweitert:

Erstens werden die Aufwandmengen der Verbindung des Toxinproteins vom Cry-Typ und der Proteine vom VIP-Typ reduziert, während eine gleich gute Wirkung beibehalten wird. Zweitens erreicht die kombinierte Mischung ebenfalls einen hohen Grad an Schädlingsbekämpfung, wenn beide individuellen Substanzen vollständig unwirksam geworden sind, wenn ungeeignet geringe Mengen ausgebracht werden. Dies erlaubt eine erhöhte Sicherheit bei der Verwendung.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind wertvoll für die präventive und/oder heilende Behandlung auf dem Gebiet der Schädlingsbekämpfung, selbst bei geringen Aufwandmengen, während sie durch warmblütige Arten, Fische und Pflanzen gut toleriert werden und für diese nicht toxisch sind und ein sehr vorteilhaftes biozides Spektrum aufweisen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind aktiv gegen alle oder individuelle Entwicklungsstadien von Sesamia-Schädlingen. Die insektizide Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann offensichtlich werden entweder direkt, d. h. durch Zerstörung der Schädlinge unmittelbar, oder erst nach Ablauf einer gewissen Zeit.

Entsprechend betrifft die Erfindung ferner eine insektizide Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil ein Toxinprotein vom Cry-Typ und ein Protein von VIP-Typ umfasst, bevorzugt in einer synergistisch effektiven Menge zusammen mit einem landwirtschaftlich akzeptablen Träger. Bevorzugt ist eine Zusammensetzung, die eine Kombination aus einem Protein vom CryI-Typ und einem Protein vom VIP-Typ umfasst.

Eine synergistische Wirkung ist immer dann vorhanden, wenn die Wirkung der Kombination des aktiven Bestandteils aus dem Toxinprotein vom Cry-Typ mit den Proteinen vom VIP-Typ die Gesamtheit der Wirkung der aktiven Bestandteile übersteigt, wenn sie individuell angewendet werden. Jedoch dürfen nicht nur quantitative Mittel in der Bewertung einer synergistischen Aktivität eingesetzt werden, sondern ebenfalls qualitative Mittel, wie z. B. eine Verbreiterung des Aktivitätsspektrums.

Die Zusammensetzung kann in Form einer chemischen Mischung bereitgestellt werden, die die Toxinproteine in einer im wesentlichen reinen Form umfasst, oder in Form einer Mischung, die wenigstens eines der Toxinproteine als Teil eines Mikroorganismus oder einer transgenen Pflanze umfasst. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann einer der aktiven Bestandteile direkt auf die Pflanze ausgebracht werden, z. B. durch Blattanwendung wie hier zuvor beschrieben, wohingegen der zweite Wirkstoff durch die Pflanze selbst bei Expression eines zuvor transformierten Gens bereitgestellt werden kann, das den zweiten Wirkstoff codiert.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung betrifft die Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus, der ein Toxingen umfasst, das ein Toxinprotein aus Bacellus thuringiensis codiert, in einem Verfahren zur Kontrolle von Nutzpflanzen gegen Schädigungen, die durch Sesamia-Arten verursacht werden, wobei der rekombinante Organismus entweder direkt auf die zu schützende Pflanze ausgebracht werden kann oder das rekombinant erzeugte Toxinprotein zuerst aus dem rekombinanten Mikroorganismus isoliert und in der oben beschriebenen Weise formuliert werden kann, bevor es auf die zu schützende Nutzpflanze ausgebracht wird. Der rekombinante Mikroorganismus kann ein Toxingen enthalten, das ein Toxinprotein vom VIP-Typ codiert, wie in EP-A 0 690 916 und in der Internationalen Anmeldung Nr. EP95/03826 offenbart, oder eine Kombination aus Genen, die wenigstens ein Toxin vom Cry-Typ bzw. ein Toxin vom VIP-Typ codieren.

Für die rekombinante Erzeugung des Toxinproteins in einem Wirtsorganismus kann die codierende Sequenz in eine Expressionskassette inseriert werden, die für den gewählten Wirt geschaffen wurde, und in den Wirt eingeführt werden, wo sie rekombinant erzeugt wird. Die Wahl spezifischer regulatorischer Sequenzen, wie z. B. ein Promotor, eine Signalsequenz, 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen und ein für den gewählten Wirt geeigneter Verstärker, liegt im Geschick des Fachmanns. Das resultierende Molekül, das die individuellen Elemente enthält, die in einem geeigneten Leseraster verbunden sind, kann in einen Vektor inseriert werden, der in die Wirtszelle transformiert werden kann. Geeignete Expressionsvektoren und Verfahren zur rekombinanten Erzeugung von Proteinen sind allgemein für Wirtsorganismen bekannt, wie z. B. E. coli (siehe z. B. Studier und Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113 (1986); Brosius, DNA 8: 759 (1989)), Hefe (siehe z. B. Schneider und Guarente, Meth. Enzymol. 194: 373 (1991)) und Insektenzellen (siehe z. B. Luckow und Summers, Bio/Technol. 6: 47 (1988)). Spezifische Beispiele schließen Plasmide ein, wie pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA) und Baculovirus-Expressionsvektoren, z. B. diejenigen, die aus dem Genom des Kernpolyedervirus von Autographica californica (AcMNPV) stammen. Ein bevorzugtes Baculovirus/Insekten-System sind pVI11392/Sf21-Zellen (Invitrogen, La Jolla, CA).

Das rekombinant erzeugte Toxinprotein kann unter Verwendung einer Vielzahl von Standardtechniken isoliert und gereinigt werden. Die tatsächlichen Techniken, die verwendet werden können, werden abhängig vom verwendeten Wirtsorganismus, ob das Toxinprotein zur Sezernierung geschaffen ist und anderen solchen Faktoren variieren, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. Kapitel 16 in F. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", veröffentlicht von John Wiley & Sons, Inc. (1994)).

Eine weitere Aufgabe der Erfindung betrifft die Verwendung von transgenen Pflanzen, die ein Toxingen umfassen und exprimieren, das ein Toxinprotein aus Bacillus thuringiensis codiert, in einer ausreichenden Menge, um Bekämpfung gegen Sesamia-Arten bereitzustellen, in einem Verfahren zum Schützen von Kulturpflanzen gegen Schädigungen, die durch Sesamia-Schädlinge verursacht werden. Speziell bevorzugt sind transgene Pflanzen, die ein Toxingen exprimieren, das ein Protein vom VIP-Typ codiert, wie beschrieben in EP-A 0 690 916 und in der Internationalen Anmeldung Nr. EP95/03826, die hier durch Verweis in ihrer Gesamt eingeführt wird. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von transgenen Pflanzen, die ein Toxingen umfassen und exprimieren, das ein Toxinprotein aus Bacillus thuringiensis codiert, aber speziell ein Toxinprotein vom Cry-Typ, und die ebenfalls ein Toxingen umfassen und exprimieren, das ein Protein vom VIP-Typ codiert, in einer ausreichenden Menge, um Kontrolle gegen Sesamia-Arten bereitzustellen. Eine Wirtspflanze, die die Toxingene exprimiert, wird eine erhöhte Resistenz gegen Insektenbefall von Sesamia-Arten aufweisen und wird deshalb besser ausgerüstet sein, um Ertragsverlusten standzuhalten, die mit einem solchen Angriff verbunden sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression eines oder mehrerer Bt &dgr;-Endotoxine in einer transgenen Pflanze durch die Expression eines oder mehrerer Proteine vom VIP-Typ begleitet. Diese Co-Expression von mehr als einem insektiziden Wirkstoff in der gleichen transgenen Pflanze kann durch genetische Manipulation einer Pflanze erreicht werden, so dass sie alle notwendigen Gene enthält und exprimiert. Alternativ kann eine Pflanze, Elter 1, zur Expression von Proteinen vom VIP-Typ genetisch manipuliert werden. Eine zweite Pflanze, Elter 2, kann genetisch zur Expression von Bt &dgr;-Endotoxin manipuliert werden. Durch Kreuzen von Elter 1 mit Elter 2 werden Nachkommenschaftspflanzen erhalten, die alle in Eltern 1 und 2 eingeführten Gene exprimieren. Besonders bevorzugte Bt &dgr;-Endotoxine sind die in EP-A 0 618 976 offenbarten, hier durch Verweis eingeführt.

Ebenfalls umfasst von der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen oder transgenen Pflanzen, die ein Gen umfassen, das DNA-Moleküle codiert, die mit einem DNA-Molekül hybridisieren, das ein Toxinprotein aus Bacillus-Arten codiert, aber bevorzugt mit einer Oligonukleotidsonde, die aus dem DNA-Molekül erhältlich ist, umfassend einen zusammenhängenden Teil der codierenden Sequenz für das Toxinprotein, der wenigstens 10 Nukleotide lang ist, unter moderat stringenten Bedingungen. Die Erfindung umfasst bevorzugt die Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen oder transgenen Pflanzen, die ein Gen umfassen, das DNA-Moleküle codiert, die mit einem DNA-Molekül hybridisieren, das ein Toxinprotein aus Bacillus thuringiensis oder B. cereus codiert, speziell mit einem DNA-Molekül, das ein Toxinprotein vom VIP-Typ codiert.

Faktoren, die die Stabilität von Hybriden bewirken, bestimmen die Stringenz der Hybridisierung. Ein solcher Faktor ist die Schmelztemperatur Tm, die leicht gemäß der Formel berechnet werden kann, die bereitgestellt wird in DNA PROBES, George H. Keller und Mark M. Manak, Macmillan Publishers Ltd., 1993, Abschnitt Eins: Molecular Hybridization Technology; Seite 8 ff.

Die bevorzugte Hybridisierungstemperatur ist im Bereich von ca. 25°C unterhalb der berechneten Schmelztemperatur Tm und bevorzugt im Bereich von ca. 12–15°C unterhalb der berechneten Schmelztemperatur Tm und im Falle von Oligonukleotiden im Bereich von ca. 5–10°C unterhalb der Schmelztemperatur Tm.

Die Erfindung betrifft ferner einen kommerziellen Beutel, der Saatgut aus einer transgenen Pflanze umfasst, die wenigstens ein Toxingen umfasst, das ein Toxinprotein aus Bacillus thuringiensis codiert, bevorzugt ein Toxinprotein vom VIP-Typ, und die das Toxinprotein in einer Menge exprimiert, die ausreichend zur Bereitstellung von Kontrolle gegen Sesamia-Arten ist, zusammen mit Etikettanweisungen zur Verwendung zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Kulturpflanzen. Bevorzugt innerhalb dieser Erfindung ist ein kommerzieller Beutel, der Saatgut aus einer transgenen Pflanze umfasst, die als aktiven Bestandteil ein Gen umfasst, das wenigstens ein Toxinprotein vom Cry-Typ und ein Protein vom VIP-Typ umfasst, bevorzugt in einer synergistisch effektiven Menge. Speziell bevorzugt ist eine Kombination aus einem CryIA(b)-Toxinprotein mit einem Protein vom VIP-Typ.

Die weitere Aufgabe der Erfindung ist ein kommerzieller Beutel, der eine erfindungsgemäße insektizide Zusammensetzung zusammen mit Etikettanweisungen zur Verwendung zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Kulturpflanzen umfasst.

Mit Pflanze ist jede Pflanzenart gemeint, die genetisch durch fachbekannte Verfahren transformiert werden kann, aber speziell diejenigen Pflanzen, die Wirtspflanzen für Sesamia-Arten sind, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) die folgenden Pflanzenarten: Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Sorghum, Hirse und verwandte Kulturpflanzen, Futtergräser (Knaulgras, Schwingel und dergleichen) und Zuckerrohr.

Fachbekannte Verfahren zur Pflanzentransformation werden nachfolgend erörtert. Wirtspflanzen schließen diejenigen Arten ein (aber sind nicht darauf beschränkt), die zuvor als Zielkulturpflanzen aufgeführt wurden.

Es wurde gefunden, dass die Codonverwendung eines nativen Toxingens aus Bacillus thuringiensis sich signifikant von derjenigen unterscheidet, die typisch für ein Pflanzengen ist. Insbesondere unterscheidet sich die Codonverwendung eines nativen Bacillus thuringiensis-Gens stark von derjenigen eines Maisgens. Als Ergebnis mag die mRNA aus diesem Gen nicht effizient verwendet werden. Die Codonverwendung könnte die Expression von Genen auf der Ebene der Translation oder Transkription oder mRNA-Reifung beeinflussen. Zur Optimierung eines Toxingens zur Expression in Pflanzen, z. B. in Mais, wird die Codonverwendung durch Verwendung der Codonen optimiert, die am meisten bevorzugt in Mais (Mais-bevorzugte Codonen) sind, in der Synthese eines synthetischen Gens, das das gleiche Protein codiert, wie es für die native Toxingensequenz gefunden wird. Die optimierte Maisbevorzugte Codonverwendung ist effektiv zur Expression hoher Mengen des insektiziden Bt-Proteins. Weitere Einzelheiten zur Konstruktion von Maisoptimierten synthetischen Toxingenen können in WO 93/07278 gefunden werden, das hier durch Verweis in seiner Gesamteinheit eingeführt wird.

Aus Mikroorganismen stammende Toxingene können sich ebenfalls von Pflanzengenen unterscheiden. Pflanzengene unterscheiden sich von Genen, die in Mikroorganismen gefunden werden, dadurch, dass ihre transkribierte RNA keine definierte Ribosombindungsortsequenz besitzt, die zum einleitenden Methionin benachbart ist. Entsprechend können mikrobielle Gene durch Einschluss eines eukaryontischen Consensus-Translationsinitiators am ATG gesteigert werden. Clontech (1993/1994-Katalog, S. 210) hat die Sequenz GTCGACCATGGTC als Consensus-Translationsinitiator zur Expression des uidA-Gens aus E. coli in Pflanzen vorgeschlagen. Ferner hat Joshi (Nucl. Acids Res. 15: 6643–6653 (1987)) viele Pflanzensequenzen verglichen, die zum ATG benachbart sind, und die Consensus-Sequenz TAAACAATGGCT vorgeschlagen. In Situationen, in denen Schwierigkeiten in der Expression mikrobieller ORFs in Pflanzen angetroffen werden, kann der Einschluss einer dieser Sequenzen am einleitenden ATG die Translation verbessern. In solchen Fällen können die letzten drei Nukleotide der Consensus-Sequenz nicht geeignet zum Einschluss in der modifizierten Sequenz aufgrund ihrer Modifikation des zweiten AA-Restes sein. Bevorzugte Sequenzen, die benachbart zum einleitenden Methionin sind, können sich zwischen unterschiedlichen Pflanzenarten unterscheiden. Durch Untersuchen der Sequenz von Maisgenen, die in der GenBank/EMBL-Datenbank vorhanden sind, kann festgestellt werden, welche zum ATG benachbarten Nukleotide modifiziert werden sollten, um die Translation des in Mais eingeführten Toxingens zu steigern.

Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Entfernung von illegitimen Spleißstellen die Expression und Stabilität eingeführter Gene steigern kann. Gene, die aus nicht-pflanzlichen Quellen kloniert und nicht zur Expression in Pflanzen optimiert sind, können Motive enthalten, die in Pflanzen als 5'- oder 3'-Spleißstellen erkannt werden. Entsprechend kann der Transkriptionsprozess vorzeitig beendet werden, was trunkierte oder deletierte mRNA erzeugt. Die Toxingene können manipuliert werden, um diese illegitimen Spleißstellen unter Verwendung allgemein fachbekannter Techniken zu entfernen.

Es ist allgemein bekannt, dass viele &dgr;-Endotoxinproteine aus Bacillus thuringiensis tatsächlich als Protoxine exprimiert werden. Diese Protoxine werden in der alkalischen Umgebung des Insektendarms solubilisiert und werden proteolytisch durch Proteasen zu einem toxischen Kernfragment umgewandelt (Höfte und Whiteley, Microbiol. Rev. 53: 242–255 (1989)). Für &dgr;-Endotoxinproteine der CryI-Klasse befindet sich das toxische Kernfragment in der N-terminalen Hälfte des Protoxins. Es ist im Umfang der vorliegenden Erfindung, dass Gene, die entweder die Protoxinform voller Länge oder das trunkierte toxische Kernfragment des neuen Toxinproteins codieren, in Pflanzentransformationsvektoren verwendet werden können, um insektizide Eigenschaften auf die Wirtspflanze zu übertragen.

Die rekombinanten DNA-Moleküle können in die Pflanzenzelle in einer Anzahl von fachlich anerkannten Wegen eingeführt werden. Die Fachleute werden einsehen, dass die Wahl des Verfahrens vom Typ der Pflanze, d. h. einkeimblättrig oder zweikeimblättrig, die zur Transformation ausgewählt ist, abhängen könnte. Geeignete Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen schließen Mikroinjektion (Crossway et al., BioTechniques 4: 320–334 (1986)), Elektroporation (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602–5606 (1986)), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915–921 (1988)), direkten Gentransfer (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717–2722 (1984)) und ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von Vorrichtungen ein, die von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware erhältlich sind (siehe z. B. Sanford et al., US-PS 4,945,050; und McCabe et al., Biotechnology 6: 923–926 (1988)). Siehe ebenfalls Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22: 421–477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5: 27–37, (1987) (Zwiebel); Christou et al., Plant Physiol. 87: 671–674 (1988) (Sojabohne); McCabe et al. Bio/Technology 6: 923–926 (1988) (Sojabohne); Datta et al., Bio/Technology 8: 736–740 (1990) (Reis); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305–4309 (1988) (Mais); Klein et al., Bio/Technology 6: 559–563 (1988) (Mais); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440–444 (1988) (Mais); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833–839 (1990); und Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990) (Mais); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526–8530 (1990) (Tabak-Chloroplasten); Koziel et al. (Biotechnology 11: 194–200 (1993)) (Mais); Shimamoto et al., Nature 338: 274–277 (1989) (Reis); Christou et al., Biotechnology 9: 957–962 (1991) (Reis); europäische Patentanmeldung EP 0 332 581 (Knaulgras und andere Pooideae); Vasil et al. (Biotechnology 11: 1553–1558 (1993)) (Weizen); Weeks et al. (Plant Physiol. 102: 1077–1084 (1993)) (Weizen); Wan et al. (Plant Physiol. 104: 37–48 (1994)) (Gerste); Umbeck et al. (Bio/Technology 5: 263–266 (1987)) (Baumwolle).

Ein besonders bevorzugter Satz von Ausführungsformen zur Einführung von rekombinanten DNA-Molekülen in Mais durch Mikroprojektilbombardierung kann in WO 93/07278 gefunden werden, das hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt wird. Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform ist das Protoplasten-Transformationsverfahren für Mais, wie es in EP-A 0 292 435 offenbart wird, das hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt wird.

Die genetischen Eigenschaften, die in die oben beschriebenen transgenen Samen und Pflanzen manipuliert wurden, werden durch geschlechtliche Fortpflanzung oder vegetatives Wachstum weitergegeben und können so in Nachkommenschaftspflanzen aufrechterhalten und vermehrt werden. Allgemein macht die Aufrechterhaltung und Vermehrung Gebrauch von bekannten landwirtschaftlichen Verfahren, die entwickelt wurden, um spezifische Zwecke zu erfüllen, wie z. B. Pflügen, Säen oder Ernten. Spezialisierte Verfahren, wie Hydrokultur oder Gewächshaustechniken, können ebenfalls eingesetzt werden. Da der wachsende Anbau anfällig für Angriffe und Schädigungen ist, die durch Insekten oder Infektionen verursacht werden, sowie für Konkurrenz durch Unkräuter, werden Maßnahmen zur Bekämpfung von Unkräutern, Pflanzenkrankheiten, Insekten, Nematoden und anderen nachteiligen Bedingungen ergriffen, um den Ertrag zu verbessern. Diese schließen mechanische Maßnahmen ein, wie das Pflügen des Bodens oder die Entfernung von Unkräutern und infizierten Pflanzen, sowie die Ausbringung von Agrochemikalien, wie Herbiziden, Fungiziden, Gametoziden, Nematoziden, Wachstumsregulatoren, Reifungsmitteln und Insektiziden.

Gebrauch von den vorteilhaften genetischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen und Samen kann ferner in der Pflanzenzüchtung gemacht werden, die auf die Entwicklung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften, wie Toleranz gegenüber Schädlingen, Herbiziden oder Stress, mit verbessertem Nährwert, erhöhtem Ertrag oder verbesserter Struktur, was weniger Verlust durch Umlegen oder Ausfallen verursacht, abzielen. Die verschiedenen Züchtungsschritte sind durch einen wohldefinierten menschlichen Eingriff gekennzeichnet, wie Auswahl der zu kreuzenden Linien, Ausrichten der Bestäubung der Elternlinien oder Auswahl geeigneter Nachkommenschaftspflanzen. Abhängig von den gewünschten Eigenschaften werden unterschiedliche Zuchtmaßnahmen ergriffen. Die relevanten Techniken sind allgemein fachbekannt und schließen ein (aber sind nicht beschränkt auf) Hybridisierung, Inzucht, Rückkreuzungszüchtung, Viellinienzüchtung, Sortenmischung, interspezifische Hybridisierung, aneuploide Techniken, etc. Hybridisierungstechniken schließen ebenfalls die Sterilisation von Pflanzen ein, um männlich- oder weiblich-sterile Pflanzen durch mechanische, chemische oder biochemische Mittel zu liefern. Die Kreuzbestäubung einer männlich-sterilen Pflanze mit Pollen einer unterschiedlichen Linie stellt sicher, dass das Genom der männlich-sterilen, aber weiblich-fruchtbaren Pflanze gleichförmig Eigenschaften beider Elternlinien erhalten wird. So können die erfindungsgemäßen transgenen Samen und Pflanzen zum Züchten von verbesserten Pflanzenlinien verwendet werden, die z. B. die Effektivität herkömmlicher Verfahren, wie Herbizid- oder Pestizidbehandlung, erhöhen oder das Aufgeben der Verfahren aufgrund ihrer modifizierten genetischen Eigenschaften erlauben. Alternativ können neue Kulturpflanzen mit verbesserter Stresstoleranz erhalten werden, die aufgrund ihrer optimierten genetischen "Ausrüstung" geerntete Produkte mit besserer Qualität als in Produkten liefern, die keine vergleichbaren nachteiligen Entwicklungsbedingungen ertragen konnten.

Bei der Saatguterzeugung sind die Keimungsqualität und Einheitlichkeit der Samen wesentliche Produkteigenschaften, wohingegen Keimungsqualität und Einheitlichkeit von Saatgut, das vom Landwirt geerntet und verkauft wird, nicht wichtig sind. Da es schwierig ist, eine Anbaupflanze frei von anderen Kulturpflanzen- und Unkrautsamen zu halten, saatgutbürtige Krankheiten zu bekämpfen und Saatgut mit guter Keimung zu erzeugen, wurden relativ umfassende und wohldefinierte Saatguterzeugungspraktiken durch die Saatguthersteller entwickelt, die auf dem Gebiet der Züchtung, Konditionierung und Vermarktung von reinem Saatgut erfahren sind. So ist es gängige Praxis für den Landwirt, zertifiziertes Saatgut zu kaufen, das spezifische Qualitätsstandards erfüllt, anstatt Saatgut zu verwenden, das von seinem eigenen Anbau geerntet wird. Fortpflanzungsmaterial, das als Saatgut verwendet werden soll, wird gewöhnlich mit einem Schutzüberzug behandelt, der Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematozide, Molluskizide oder Mischungen daraus umfasst. Gewöhnlich verwendete Schutzüberzüge umfassen Verbindungen wie Captan, Carboxin, Thiram (TMTD®), Methalaxyl (Apron®) und Pirimiphos-Methyl (Actellic®). Falls gewünscht, werden diese Verbindungen zusammen mit weiteren Trägern, Tensiden oder die Ausbringung fördernden Hilfsstoffen formuliert, die herkömmlich auf dem Gebiet der Formulierung eingesetzt werden, um Schutz gegen Schädigung bereitzustellen, die durch bakterielle, pilzliche oder tierische Schädlinge verursacht wird. Die Schutzüberzüge können durch Tränken von Fortpflanzungsmaterial mit einer flüssigen Formulierung oder durch Überziehen mit einer kombinierten nassen oder trockenen Formulierung angewendet werden. Andere Verfahren der Anwendung sind ebenfalls möglich, wie die auf die Knospen oder Früchte gerichtete Behandlung.

Es ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, neue landwirtschaftliche Verfahren bereitzustellen, wie die oben exemplarisch angegebenen Verfahren, die durch die Verwendung von transgenen Pflanzen, transgenem Pflanzenmaterial oder transgenem Saatgut gemäß der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet sind, um Bekämpung gegen Sesamia-Arten bereitzustellen.

Zum Züchten von Nachkommenschaft aus Pflanzen, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung transformiert wurden, kann ein Verfahren wie das folgende verwendet werden: Maispflanzen, die wie in den nachfolgenden Beispielen ausgeführt erzeugt wurden, werden in Töpfen in einem Gewächshaus oder im Boden in fachbekannter Weise kultiviert und blühen gelassen. Pollen wird aus der reifen Fahne erhalten und zum Bestäuben der Kolben der gleichen Pflanze, von Geschwisterpflanzen oder jeder wünschenswerten Maispflanze verwendet. In ähnlicher Weise kann der sich an der transformierten Pflanze entwickelnde Kolben durch Pollen bestäubt werden, der aus der gleichen Pflanze, Geschwisterpflanzen oder jeder wünschenswerten Maispflanze erhalten wird. Durch dieses Verfahren erhaltene transformierte Nachkommenschaft kann von nicht-transformierter Nachkommenschaft durch die Gegenwart des (der) eingeführten Gens (Gene) und/oder der begleitenden DNA (Genotyp) oder durch den übertragenen Phenotyp unterschieden werden. Die transformierte Nachkommenschaft kann in ähnlicher Weise geselbstet oder mit anderen Pflanzen gekreuzt werden, wie es normalerweise mit jeder Pflanze erfolgt, die ein wünschenswertes Merkmal trägt. In ähnlicher Weise können Tabak oder andere durch dieses Verfahren erzeugte transformierte Pflanzen geselbstet oder gekreuzt werden, wie es fachbekannt ist, um Nachkommenschaft mit den gewünschten Eigenschaften zu erzeugen. In ähnlicher Weise können andere transgene Organismen, die durch eine Kombination aus den fachbekannten Verfahren und dieser Erfindung erzeugt wurden, in fachbekannter Weise gezüchtet werden, um Nachkommenschaft mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen.

Die so erzeugten Samen und Pflanzen können in ein Pflanzen-Kultivierungsschema eingefügt werden, das entwickelt wurde, um Kulturpflanzen gegen Schädigung zu schützen, die durch Sesamia-Arten verursacht wird.

Es ist seit langem bekannt, dass die Bekämpfung der zweiten Generation von Sesamia-Arten schwierig zu erreichen ist, indem Insektizide angewendet werden, weil sich die Larven gewöhnlich am unteren Ende der ausgewachsenen Pflanze befinden und deshalb schwierig durch Insektizidbesprühung zu erreichen sind. Es ist deshalb ratsam, die Population der Entwicklungspause im Winter und die erste Generation der Sesamia-Arten im Frühling zu bekämpfen und so die Population der zweiten Generation von Insekten zu reduzieren. Im Winter kann die Population der Winterruhe durch Wenden der Erde und gleichzeitiges Mahlen der verbleibenden Pflanzenreste (Pflanzenstumpf, Wurzeln) nach der Ernte bekämpft werden. Im Frühling kann die erste Generation durch Ausbringung von Insektiziden bekämpft werden. Als Ergebnis ist die zweite Generation reduziert und kann mit weniger Aufwand bekämpft werden.

Es ist somit ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein landwirtschaftliches Verfahren zur Bekämpfung der ersten und zweiten Generation von Sesamia-Insekten bereitzustellen, wobei das Verfahren Verfahren des Standes der Technik mit denjenigen kombiniert, die im Umfang dieser Erfindung entwickelt wurden. Insbesondere umfasst das erfindungsgemäße landwirtschaftliche Verfahren das Kombinieren von mechanischen, chemischen und gentechnischen Mitteln, um eine vollständige Bekämpfung von Sesamia in Kulturpflanzen zu erreichen.

Das landwirtschaftliche Verfahren zur vollständigen Bekämpfung von Sesamia-Arten in Kulturpflanzen gemäß der Erfindung umfasst die Verwendung von Samen oder Pflanzen, auf die ein Toxinprotein einer Bacillus-Art, aber bevorzugt ein Toxinprotein vom VIP-Typ oder ein Protein vom VIP-Typ und ein Protein vom CryI-Typ, direkt oder indirekt als aktiver Bestandteil angewendet wurde. Die direkte Anwendung der Toxinproteine auf das Saatgut oder die Pflanze kann durch Behandeln des Saatguts oder der Pflanzen mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung wie zuvor beschrieben erreicht werden. Alternativ können die aktiven Bestandteile auf das Saatgut oder die Pflanze, die geschützt werden sollen, indirekt angewendet werden, d. h. durch Exprimieren eines oder mehrerer Gene, die wenigstens ein Protein vom VIP-Typ oder ein Protein vom VIP-Typ und ein Protein vom Cry-Typ codieren, innerhalb des Samens oder der Pflanze, bevorzugt in einer synergistisch effektiven Menge.

Die direkte und indirekte Anwendung der erfindungsgemäßen aktiven Bestandteile kann so kombiniert werden, dass entweder ein Protein vom VIP-Typ oder vom Cry-Typ innerhalb der Pflanze exprimiert wird, während das andere Protein extern auf die Pflanze angewendet wird.

Die transgene Expression eines Proteins vom VIP-Typ oder eines Proteins vom VIP-Typ und eines Proteins vom Cry-Typ innerhalb der Pflanze kann ebenfalls mit einer chemischen Behandlung der Pflanze unter Verwendung jedes der üblicherweise eingesetzten Insektizide kombiniert werden.

Die Erfindung ist somit weiterhin auf ein landwirtschaftliches Verfahren zum Schutz von Pflanzen gegen durch Sesamia-Arten verursachte Schädigung gerichtet, umfassend eine Kombination aus den Schritten (2) und (3) mit einem beliebigen der Schritte (1) oder (4):

  • (1) Bekämpfung der Population der Winterruhe durch mechanisches Mahlen der Pflanzenreste nach der Ernte,
  • (2) Bekämpfung der ersten Generation von Sesamia-Arten durch eines der erfindungsgemäßen Verfahren,
  • (3) Bekämpfung der zweiten Generation von Sesamia-Arten durch eines der erfindungsgemäßen Verfahren,
  • (4) Bekämpfung der Population der Winterruhe, der ersten und/oder zweiten Generation durch deren Behandlung mit einem üblicherweise eingesetzten Insektizid.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von erfindungsgemäß transformierten Pflanzen in einem landwirtschaftlichen Verfahren zur Bekämpfung von Sesamia-Arten durch Reduzieren der Population der ersten Generation und bevorzugt ebenfalls der Population der zweiten Generation von Sesamia-Arten. Ebenfalls bevorzugt ist die Kombination von transgenen Pflanzen mit der Anwendung von Zusammensetzungen, die eine biologische Verbindung wie oben definiert umfassen, oder mit einem üblicherweise eingesetzten Insektizid.

Beispiele

Die folgenden Beispiele beschrieben die Materialien und Methoden weiter, die in der Durchführung der Erfindung verwendet werden. Sie werden zur Veranschaulichung angeboten und nicht zur Beschränkung.

Beispiel 1: Allgemeine Verfahren

DNA-Manipulationen erfolgten unter Verwendung von Verfahren, die Standard auf diesem Gebiet sind. Diese Verfahren können häufig ohne substantielle Veränderung des Ergebnisses modifiziert und/oder ersetzt werden. Außer wenn andere Literaturstellen identifiziert werden, werden die meisten dieser Verfahren in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Auflage, 1989, beschrieben.

Beispiel 2: Pflanzentransformation 2.1 Transformationsvektor

Die Pflanzentransformation wird unter Verwendung der Pflanzentransformationsvektoren pCIB 4431 und pCIB 3064 erreicht, deren Konstruktion in WO 93/07278 und in Koziel et al. (1993) beschrieben wird [Biotechnology, Band 11, 194–200], deren Offenbarung hier durch Verweis eingeführt wird.

pCIB 4431 ist ein zur Transformation von Mais geschaffener Vektor. Er enthält zwei chimäre synthetische Bt cryIA(b)-Endotoxingene, die in Mais exprimierbar sind. Diese Gene sind der PEP-Carboxylasepromotor/synthetisches-cryIA(b) und ein Pollenpromotor/synthetisches-cryIA(b).

pCIB 4431, das das synthetische cryIA(b)-Gen enthält, bereitgestellt als SEQ ID NO: 1, wurde am 21. September 1992 beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA unter der Hinterlegungsnummer NRRL #B-18998 hinterlegt.

pCIB 3604 enthält ein pflanzenexprimierbares bar-Gen (615 bp), das ursprünglich aus Streptomyces hygroscopicus kloniert wurde [Thompson et al. (1987) EMBO J. 6, 2519–2523]. Es codiert eine Phosphinotricinacetyltransferase (PAT), die Toleranz gegenüber Phosphinotricin verleiht. Das bar-Gen steht unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors und -Terminators [OW et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4870–4874], um Resistenz gegen Phosphinotricin bereitzustellen.

Beispiel 3: Erzeugung von transgenen Maispflanzen, die das synthetische Mais-CryIA(b)-Gen enthalten

Das nachfolgende Beispiel verwendet eine Partikelkanone zur Einführung von DNA-überzogenen Partikeln in Maiszellen, aus denen transformierte Pflanzen erzeugt werden.

3.1 Gewebe

Unreife Maisembryos mit einer Länge von ca. 1,5–2,5 mm wurden aus einem Kolben des Genotyps 6N615 14–15 Tage nach der Bestäubung herausgeschnitten. Die Mutterpflanze wurde im Gewächshaus kultiviert. Vor dem Herausschneiden wurde der Kolben mit 20% Clorox für 20 Minuten oberflächensterilisiert und dreimal mit sterilem Wasser gespült. Individuelle Embryos wurden mit dem Scutellum nach oben in einer Fläche von 2 cm2, 36 Embryos pro Platte, auf dem Kalluseinleitungsmedium ausplattiert, 2DG4 + 5 Chloramben-Medium (N6 Hauptsalze, B5 Spurensalze, MS Eisen, 2% Saccharose mit 5 mg/l Chloramben, 20 mg/l Glucose) und 10 ml G4-Zugaben (Tabelle 1) nach dem Autklavieren hinzugegeben. Tabelle 1 – G4-Zugaben Bestandteil pro Liter Medium Caseinhydrolysat 0,5 g Prolin 1,38 g Nikotinsäure 0,2 mg Pyridoxin-HCl 0,2 mg Thiamin-HCl 0,5 mg Cholin-HCl 0,1 mg Riboflavin 0,05 mg Biotin 0,1 mg Folsäure 0,05 mg Ca-Pantothenat 0,1 mg p-Aminobenzoesäure 0,05 mg B12 0,136 &mgr;g

3.2 Herstellung von DNA zur Übertragung

Der Mikroträger wurde im wesentlichen gemäß den mit der Partikelkanone gelieferten Anweisungen vorbereitet. Während 50 &mgr;l 1,0 &mgr;m Gold-Mikroträger verwirbelt wurden, wurden 5 &mgr;l pCIB4431 (1,23 &mgr;g/&mgr;l) [#898] + 2 &mgr;l pCIB3064 (0,895 &mgr;g/&mgr;l) [#456] hinzugegeben, gefolgt von 50 &mgr;l 2,5 M CaCl2 und dann 20 &mgr;l 0,1 M Spermidin (freie Base, TC-Qualität). Die resultierende Mischung wurde für 3 min verwirbelt und für 10 s mikrozentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Mikroträger zweimal mit 250 &mgr;l 100%igem EtOH (HPLC-Qualität) durch kurzes Verwirbeln, Zentrifugieren und Entfernen des Überstands gewaschen. Die Mikroträger werden in 65 &mgr;l 100%igem EtOH resuspendiert.

3.3 Bombardierung

Gewebe wurde unter Verwendung der PDS-1000He-Partikelkanone bombardiert. Das Gewebe wurde auf das Gestell 8 cm unterhalb des Stoppgittergestells plaziert. Das Gewebe wurde einmal mit der DNA/Goldmikroträger-Lösung, von der 10 &mgr;l auf dem Mikroträger getrocknet waren, beschossen. Das verwendete Stoppgitter war handgestanzt unter Verwendung von 10 × 10-rostfreiem Stahlnetz. Berstscheiben mit einem Wert von 1550 psi wurden verwendet. Nach der Bombardierung wurden die Embryos in der Dunkelheit bei 25°C kultiviert.

3.4 Kallusbildung

Embryos wurden auf das Kalluseinleitungsmedium mit 3 mg/l PPT 1 Tag nach der Bombardierung überführt. Die Embryos wurden auf Kalluseinleitung 2 und 3 Wochen nach der Bombardierung bewertet. Alle Reaktionen wurden auf Kallusaufrechterhaltungsmedium übertragen, 2DG4 + 0,5 2,4-D-Medium mit 3 mg/l PPT. Kallusaufrechterhaltungsmedium ist N6 Hauptsalze, B5 Spurensalze, MS Eisen, 2% Saccharose, wobei 0,5 mg/l 2,4-D, 20 mg/l Glucose und 10 ml G4-Zugaben nach dem Autoklavieren hinzugegeben werden. Embryogener Kallus wurde alle 2 Wochen auf frisches Aufrechterhaltungsmedium subkultiviert, das 3 mg/l PPT enthielt. Alle Kalli wurden im Dunklen bei 25°C inkubiert. Die Kallusbildungsreaktion vom Typ I betrug 15%. Jeder Embryo, der Kallus erzeugte, wurde als individuelles Ereignis kultiviert, das zu einer individuellen Linie führte.

3.5 Regeneration

Nach 12 Wochen Selektion wurde das Gewebe aus dem Kallusaufrechterhaltungsmedium mit PPT entfernt und auf Regenerationsmedium plaziert. Regenerationsmedium ist 0,25 MS3S5BA (0,25 mg/l 2,4-D, 5 mg/l BAP, MS-Salze, 3% Saccharose) für 2 Wochen gefolgt von Subkultur auf MS3S-Medium zur Regeneration von Pflanzen. Nach 9 bis 10 Wochen wurden die Pflanzen entfernt und in GA 7-Töpfe gesetzt.

3.6 Rückkreuzung

Regenerierte transgene Pflanzen werden in einen unterschiedlichen genetischen Hintergrund zurückgekreuzt [2N217AF; 6Y021], was zu den Ereignissen AB01 [2N217AF(Bt)] und AB10[6Y021(Bt)] resultiert, die hemizygot für das Bt-Merkmal sind. Nicht-transformierte Inzuchtlinien 2N217AF [CG01] und 6Y021 [CG10] werden als Kontrollen im nachfolgend in Beispiel 4 beschriebenen Sesamia-Assay verwendet.

Beispiel 4: Sesamia-Assay

Aufgezeichnete Parameter: 24/48 Stunden alte Larven von Sesamia nonagrioides [MCB] ließ man an Maisblättern fressen. Die Larven hatten zuvor nicht gefressen. 72 und 120/152 Stunden später wurden die Anzahl von lebenden Larven und die Entwicklung des Larvenstadiums für jede einzelne aufgezeichnet. Die Art der Fraßverletzungen an der Blattpflanze wurde in jedem Fall beobachtet.

Behandlungen: Vier verschiedene Mais-"Ereignisse" wurden verwendet (AB01, AB10, CG01, CG10). Die Blätter wurden ausgeschnitten und in den nachfolgend beschriebenen Fraßexperimenten verwendet.

Anzahl der untersuchten Larven: Gruppen von 5 Larven wurden in durchsichtige Kunststoffbehälter mit verschiedenen Stücken von Maisblättern gegeben. Die Behälter waren zylindrisch mit einem Durchmesser von 5,4 cm und einer Höhe von 3 cm. 16 Gruppen von jeweils 5 Larven (80 Larven) wurden für jedes "Ereignis" verwendet. Somit wurden insgesamt 320 MCB-Larven für die gesamte Auswertung verwendet. Diese wurde in zwei Schritten durchgeführt. Im ersten Schritt wurden 24 Stunden alte Larven verwendet; im zweiten Schritt 48 Stunden alte Larven.

Experimentelle Bedingungen: Temperatur 25 ± 1°C, Photoperiode: 16L/8D Zusammenfassung der Ergebnisse:

Prozentwert der Mortalität nach 72 Stunden (Mittelwert ± Standardfehler):

AB01: 84 ± 8% (n = 15, n ist die Anzahl von Behältern mit 5 Larven)

AB10: 87 ± 7% (n = 15, n ist die Anzahl von Behältern mit 5 Larven)

CG10: 2,5 ± 1,7% (n = 16, n ist die Anzahl von Behältern mit 5 Larven)

CG01: 3,8 ± 2,7% (n = 16, n ist die Anzahl von Behältern mit 5 Larven)

Prozentwert der Mortalität nach 120/152 Stunden (Mittelwert ± Standardfehler):

AB01: 100% (n = 15, n ist die Anzahl von Behältern mit 5 Larven)

AB10: 100% (n = 15, n ist die Anzahl von Behältern mit 5 Larven)

CG10: 19 ± 3% (n = 16, n ist die Anzahl von Behältern mit 5 Larven)

CG01: 14 ± 5% (n = 16, n ist die Anzahl von Behältern mit 5 Larven)

Entwicklung

Da die meisten Larven an AB01 und AB10 vor der ersten Beobachtung (72 h) starben, konnte kein Wirteeffekt auf die Larvenentwicklung beobachtet werden. Jedoch gab es einige Anzeichen für eine Verzögerung der Larven-entwicklung in AB01 und AB10.

Verletzungen an ausgeschnittenen Maisblättern: Zwei Arten von Verletzungen wurden deutlich bei den Maisblättern unterschieden. Als AB01 und AB10 codierte Blattstücke zeigten kleine Löcher in der oberen Epidermis, wohingegen die als CG10 und CG01 codierten Blattstücke weite Bereiche ohne obere Epidermis zeigten. Larven an AB01 und AB10 fraßen kaum, und keine Exkremente wurden in den Isolationsbehältern beobachtet. Im Gegenteil fraßen die Larven an CG01 und CG10 große Bereiche der oberen Epidermis, und zahlreiche Exkremente wurden im Isolationsbehälter beobachtet.

Schlussfolgerung: Die Ergebnisse des Sesamia-Assay zeigen einen starken Effekt von AB01 und AB10 auf die Larvensterblichkeit und den Larvenfraß. Mit der in den vorliegenden Versuchen verwendeten Methodik wurden keine Unterschiede zwischen AB01 und AB10 nachgewiesen. Verletzungen bei AB01 und AB10 waren viel geringer als bei CG01 und CG10.

Beispiel 5: Wirkungen von Vip3A auf neugeborene Larven von Sesamia nonagrioides
Wirkungen von Vip3A auf neugeborene Larven des Maiszünslers Sesamia nonagrioides

CG00526 ist der als Negativkontrolle verwendete Mais-Genotyp. Es ist eine Inzuchtlinie, die von Koziel et al. (1993) beschrieben wurde, Bio/Technology 11, S. 194–200.

Das Gen, das das Vip3A-Protein codiert, wurde in den CG00526-Genotyp durch Partikelbeschuss transformiert. Die Kreuzungen CG00526 × 891 und 892 bezeichnen Kreuzungen von Transformationsereignissen (891 und 892) mit der Elternlinie 0000526. Zwei der erhaltenen Ereignisse, die das Vip3A-Protein exprimieren, wurden für den Insektenbioassay verwendet (positive Segreganten). Positive Segreganten sind Pflanzen, die das vip3A-Gen erbten. Negative Segreganten sind T1-Pflanzen, die nicht das vip3A-Gen erbten und deshalb nicht das Vip3A-Protein exprimieren.

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Verfahren zum Schutz von Pflanzen, einschliesslich deren Nachkommenschaft, gegen Schädigung, die durch Sesamia-Arten verursacht wird, umfassend das direkte oder indirekte Ausbringen eines Toxinproteins einer Bacillus-Art als aktiver Bestandteil auf die Pflanze oder den Pflanzensamen oder auf das Anbaugebiet der Pflanze, worin das Toxinprotein ein Protein vom VIP3-Typ ist.
  2. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Protein vom VIP3-Typ ein VIP3A(a)-Protein oder ein VIP3A(b)-Protein ist.
  3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Toxinprotein ein Protein vom VIP3-Typ gemäss SEQ ID NOS: 28–32, 51 oder 52 ist.
  4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Toxinprotein auf die Pflanze in Form einer insektiziden Zusammensetzung ausgebracht wird.
  5. Verfahren gemäss Anspruch 4, worin die insektizide Zusammensetzung einen Mikroorganismus, aber speziell einen Bacillus thuringiensis- und/oder einen Bacillus cereus-Stamm, der wenigstens ein Toxingen enthält, das das Toxinprotein codiert, zusammen mit einem geeigneten Träger umfasst.
  6. Verfahren gemäss Anspruch 5, worin der Mikroorganismus wenigstens ein Gen für ein Protein vom VIP3-Typ enthält, wie ein Gen für ein VIP3A(a)-Protein oder ein VIP3A(b)-Protein, das das Toxinprotein codiert.
  7. Verfahren gemäss Anspruch 5 oder 6, worin das Toxinprotein ein Protein von VIP3-Typ gemäss SEQ ID NOS: 28–32, 51 oder 52 ist.
  8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 4 bis 7, worin die Zusammensetzung ein weiteres Toxinprotein, worin das weitere Protein ein Protein vom Cry-Typ ist, bevorzugt ein Protein vom CryI-Typ, besonders bevorzugt ein Protein vom CryIA-Typ und am meisten bevorzugt ein CryIA(b)-Protein ist, oder einen Mikroorganismus, der das Toxinprotein exprimiert, umfasst.
  9. Verfahren gemäss Anspruch 6 oder 7, worin der Mikroorganismus ein rekombinanter Organismus ist.
  10. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Toxinprotein indirekt auf die Pflanze ausgebracht wird, indem innerhalb der Pflanze und ihrer Nachkommenschaft ein Toxingen exprimiert wird, das ein Toxinprotein einer Bacillus-Art codiert, um das Toxinprotein in einer ausreichenden Menge zu erzeugen, um eine Bekämpfung gegen Sesamia-Arten bei Pflanzung der so transformierten Pflanze innerhalb eines Gebiets bereitzustellen, in dem der Insektenschädling auftreten kann, worin das Toxingen ein Toxinprotein vom VIP3-Typ codiert.
  11. Verfahren gemäss Anspruch 10, worin das Protein vom VIP3-Typ ein VIP3A(a)-Protein oder ein VIP3A(b)-Protein ist.
  12. Verfahren gemäss Anspruch 10 oder 11, worin das Toxingen ein synthetisches Gen ist, dessen Codonverwendung durch Verwendung der Codonen optimiert ist, die in Pflanzen am meisten bevorzugt sind.
  13. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 10 bis 12, worin das Toxingen ein Protein vom VIP3-Typ gemäss SEQ ID NOS: 28–32, 51 oder 52 codiert.
  14. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die zu schützende Pflanze eine Getreidepflanze ist.
  15. Verfahren gemäss Anspruch 14, worin die zu schützende Pflanze eine Maispflanze ist.
  16. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 10 bis 15, worin wenigstens ein Toxinprotein vom VIP3-Typ in der zu schützenden Pflanze in Kombination mit einem Toxinprotein vom Cry-Typ in einer ausreichenden Menge zur Bereitstellung einer Bekämpfung gegen Sesamia-Schädlinge exprimiert wird.
  17. Zusammensetzung, die als Wirkstoff wenigstens ein Protein vom VIP3-Typ und ein Toxinprotein vom Cry-Typ in einer insektizid wirksamen Menge zusammen mit einem agronomisch akzeptablen Träger umfasst.
  18. Verwendung eines Wirkstoffs wie in den vorhergehenden Ansprüchen definiert zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Anbaupflanzen.
  19. Verwendung einer Zusammensetzung gemäss Anspruch 17 zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Anbaupflanzen.
  20. Verwendung einer transgenen Pflanze wie in Anspruch 10 definiert zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Anbaupflanzen.
  21. Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen oder transgenen Pflanzen wie in den vorhergehenden Ansprüchen definiert, die ein DNA-Molekül umfassen, das mit dem Komplement eines Gens vom VIP3-Typ, das das entsprechende Toxinprotein codiert, unter moderaten stringenten Bedingungen hybridisiert, zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Anbaupflanzen.
  22. Gewerbliche Tüte, die Saatgut einer transgenen Pflanze oder einen Mikroorganismus umfasst, aber speziell einen Bacillus thuringiensis- und/oder einen Bacillus cereus-Stamm, umfassend wenigstens ein Toxingen, das ein Toxinprotein wie in den vorhergehenden Ansprüchen definiert codiert, und das das Toxinprotein in einer ausreichenden Menge exprimiert, um eine Bekämpfung gegen Sesamia-Arten bereitzustellen, zusammen mit Etikettanweisungen für dessen Verwendung zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Anbaupflanzen.
  23. Gewerbliche Tüte, die Saatgut einer transgenen Pflanze oder einen Mikroorganismus umfasst, aber speziell einen Bacillus thuringiensis- und/oder einen Bacillus cereus-Stamm, enthaltend wenigstens ein Protein vom VIP3-Typ oder ein Protein vom VIP3-Typ und ein Toxinprotein vom CryI-Typ wie hier zuvor definiert zusammen mit einem geeigneten Träger in einer ausreichenden Menge, um eine Bekämpfung gegen Sesamia-Arten bereitzustellen, zusammen mit Etikettanweisungen für dessen Verwendung zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Anbaupflanzen.
  24. Gewerbliche Tüte, die eine insektizide Zusammensetzung gemäss Anspruch 17 zusammen mit Etikettanweisungen zu ihrer Verwendung zur Bekämpfung von Sesamia-Schädlingen in Anbaupflanzen umfasst.
  25. Landwirtschaftliches Verfahren, worin eine transgene Pflanze oder deren Nachkommenschaft verwendet wird, umfassend ein Toxingen, das ein Toxinprotein einer Bacillus-Art codiert, und Exprimieren des Toxinproteins in einer ausreichenden Menge, um eine Bekämpfung gegen Sesamia-Arten bereitzustellen, oder transgenes Saatgut davon wie hier zuvor definiert.
  26. Transgene Pflanze, die wenigstens ein Protein vom VIP3-Typ in Kombination mit wenigstens einem Toxinprotein vom CryI-Typ wie hier zuvor definiert in einer ausreichenden Menge exprimiert, um eine Bekämpfung gegen Sesamia-Schädlinge bereitzustellen.
  27. Transgene Pflanze gemäss Anspruch 26, worin das Protein vom Cry-Typ ein CryIA(b)-Toxinprotein ist.
  28. Transgene Pflanze gemäss Anspruch 26 oder 27, die eine Maispflanze ist.
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