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Dokumentenidentifikation DE69731287T2 13.10.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000891223
Titel METHODE ZUR HERSTELLUNG VON HARZEN MIT DARAN BEFESTIGTEN LIGANDEN, WOBEI DIE VERBINDENDE FUNKTIONELLE GRUPPE SULFID, SULFOXID ODER SULFON UMFASST
Anmelder Massey University, Palmerston North, NZ
Erfinder BURTON, C., Simon, Palmerston North, NZ;
HARDING, R., David, Palmerston North, NZ
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69731287
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.01.1997
EP-Aktenzeichen 979012788
WO-Anmeldetag 10.01.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/NZ97/00002
WO-Veröffentlichungsnummer 0097025139
WO-Veröffentlichungsdatum 17.07.1997
EP-Offenlegungsdatum 20.01.1999
EP date of grant 20.10.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.10.2005
IPC-Hauptklasse B01J 20/26
IPC-Nebenklasse B01J 20/32   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung richtet sich zum Teil auf Verfahren zur Herstellung von Harzen, die eine feste Trägermatrix umfassen, welche Liganden, die zur Bindung einer Zielverbindung fähig sind, kovalent daran über eine Verbindungsgruppe, die Sulfid-, Sulfoxid- oder Sulfonfunktionalität umfaßt, gebunden hat. Spezifischer ausgedrückt, in solchen Verfahren wird eine Trägermatrix, die eine ethylenisch ungesättigte Funktionalität umfaßt, durch Kontakt mit einer Thiol-Gruppe unter freien Radikalreaktionsbedingungen in eine Sulfidbindung umgewandelt, und anschließend wird das Sulfid durch fakultative Oxidation zur Sulfon- oder Sulfoxidfunktionalität umgewandelt.

LITERATURSTELLEN

Die folgenden Publikationen, Patente und Patentanmeldungen werden in dieser Anmeldung als hochgestellte Zahlen zitiert: Burton et al., US-Patentanmeldung, Serial Nr. 08/268 178, eingereicht am 29. Juni 1994 für "Chromatographic Resins and Methods for Their Use" Burton et al., US-Patentanmeldung, Serial Nr. 08/311 100, eingereicht am 23. September 1994 für "Chromatographic Resins and Methods for Their Use" Axen et al., Acta Chem. Scand. B, 29:471-474 (1975) Sundberg und Porath, J. Chromatogr., 90:87-98 (1974) Lindgren, US-Patent Nr. 4 973 683, für "Method of Cross-Linking a Porous Polysaccharide", erteilt am 27. November 1990 Lindgren, internationale Patentanmeldung Nr. WO 94/04192 für "Method for Binding to Polymers", veröffentlicht am 3. März 1994 Hjerten et al., Chromatographia, 31(1-2):85-94 (1991) Nochumson, US-Patent Nr. 4 415 428, für "Support for Electrophoresis", erteilt am 15. November 1983 Sawato und Yagi, Japan. Patentanmeldung Nr. 4-76001 Kharasch et al., Chemistry and Industry, 57:744-755 (1938) Kharasch et al., Chemistry and Industry, 57:752 (1938) Walling, Free Radicals in Solution, S. 314-328, Wiley Publisher (1957) Reid, The Organic Chemistry of Bivalent Sulfur, Bd. 1, Chemical Publishing Co., New York, S. 18-40 (1958) Vinton, US-Patent Nr. 2 607 776 (1952) Bauer und Gardella, J. Org. Chem., 26:82-85 (1961) Kharasch und Langford, J. Org. Chem., 28:1901-1903 (1963) Ivanovics und Vargha, Z. Physiol. Chem., 281:156-162 (1944) McMurray, Organic Chemistry, 2. Ausgabe, Brooks/Cole Publishing Co., S. 683 (1988) Knight et al., J. Am. Chem. Soc., 75:6212-6215 (1953) Cadogan und Perkins, in The Chemistry of Alkenes, Patai (Herausgeber), John Wiley and Sons, Ltd., Herausgeber, S. 600 (1964) Pesek und Swedberg, U.S. Patent Nr. 4 904 632 für "Surface-Modified Chromatographic Separation Material" Pesek und Guiochon, J. Chromatogr., 395:1-7 (1987) Schwarz und Wilchek, Internationale Patentanmeldung Pub.-Nr. WO 95/31279 für "Chromatography Adsorbens utilizing Mercapto Heterocyclic Ligands", veröffentlicht am 23. November 1995 Porath, europäisches Patent Nr. 0 165 912 für "Thioether adsorbent intended for the separation of proteins and the like". Burton et al., InternationalE Patent Application Pub. Nr. WO 96/00735, für "Hydrophobic Chromatographic Resins with Ionisable Groups", veröffentlicht am 11. Januar 1996.

STAND DER TECHNIK

In der chromatographischen Trennung von Verbindungen wird ein Zweiphasensystem verwendet, die eine Phase mobil und die andere stationär. Eine Trennung erfolgt durch wiederholte Sorptions- und Desorptionsprozesse der Verbindungen während des Durchgangs der mobilen Phase durch die stationäre Phase. Verbindungen werden entsprechend ihrem Verteilungskoeffizienten getrennt. Je stärker eine Verbindung adsorbiert wird, desto mehr trägt sie zur stationären Phase bei und desto langsamer bewegt sie sich bezüglich der mobilen Phase.

In einer Ausführungsform umfaßt die stationäre Phase eine Festphasenmatrix. Die Festphasenmatrix kann entweder anorganische Materialien wie Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Zeolithe, usw., oder organische Materialien wie Cellulose, Agarose, Dextran, Polyacrylate, Polystyrol, Polyacrylamid, usw. umfassen. Um die Trennungskapazität der Festphasenmatrix für eine Zielverbindung oder Zielverbindungen zu erhöhen ist es üblich, die Matrix chemisch zu modifizieren. Solche Modifikationen umfassen die kovalente Bindung bzw. Anheftung von Liganden an die Oberfläche der Matrix, wobei die Liganden so gewählt werden, daß sie Sorption von Zielverbindungen an der festen stationären Matrix während der Sorptionsstufe verstärken. Eine Sorption der Zielverbindung an der modifizierten Matrix kann so stark werden, daß eine Desorption dieser Verbindung von der modifizierten Matrix Desorptionsbedingungen erfordert, die sich von den Sorptionsbedingungen unterscheiden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Liganden, die zum Modifizieren der Matrix eingesetzt werden, außerdem so gewählt, daß die Desorption von Zielverbindungen von der festen stationären Matrix während der Desorptionsstufe verstärkt wird12.

Eine kovalente Ligandenbindung wird typischerweise durch Verwendung von reaktiven Funktionalitäten an der festen Trägermatrix, z.B. Hydroxyl-, Carboxy-, Thiol-, Amino-Gruppen und dgl. erreicht. Eine herkömmliche Chemie erlaubt die Bildung kovalenter Amin-, Ether-, Thioether-, Amid-, Carbamat-, Harnstoff-, Carboxyester-Bindungen mit solchen Funktionalitäten.

Um die Sorptionskapazität des Liganden bezüglich der Zielverbindung zu erhöhen, ist es gängige Praxis, einen Linkerarm bzw. Verbindungsarm zwischen dem Liganden und der festen Trägermatrix zu verwenden. Solche Linkerarme haben vorzugsweise eine Länge von drei oder mehr Atomen, damit der Linkerarm den Liganden physikalisch von der Matrix entfernen kann, wodurch ermöglicht wird, daß die Zielverbindung mit minimaler Interferenz von der Matrix aus mit dem Liganden in Wechselwirkung tritt. Die Verwendung solcher Linkerarme in der Harzsynthese erfordert allerdings die Verwendung eines bifunktionellen oder höherfunktionellen Reagenzes, das mindestens eine funktionelle Gruppe hat, die fähig ist, mit einer funktionellen Gruppe an der Oberfläche der Matrix zu reagieren, um ein kovalente Bindung damit zu bilden, und mindestens eine funktionelle Gruppe, die fähig ist, mit einer funktionellen Gruppe am Liganden unter Bildung einer kovalenten Bindung damit zu reagieren. Beispiele für die Verwendung solcher bifunktioneller Reagenzien in der Synthese von Harzen, die eine feste Trägermatrix umfassen, welche Liganden durch einen Linkerarm kovalent darin gebunden haben, werden von Axen et al.3 und von Sundberg und Porath4 beschrieben.

Die Verwendung von solchen bifunktionellen Reagenzien erfolgt allerdings nicht ohne Schwierigkeiten. Während einer kovalenten Kupplung der ersten funktionellen Gruppe mit der Matrix können beispielsweise Nebenreaktionen der anderen funktionellen Gruppe den Aktivierungslevel (d.h. die Anzahl reaktiver Gruppen pro Gramm Matrix) reduzieren, da diese Nebenreaktionen die Fähigkeit der anderen funktionellen Gruppe zur Reaktion mit dem Liganden reduzieren oder eliminieren können. Ein Beispiel für dieses Phänomen ist die unbeabsichtigte Reaktion der zweiten funktionellen Gruppe mit einer komplementären funktionellen Gruppe an der Matrix, welche nicht nur die Fähigkeit des Liganden, daran zu binden, eliminiert, sondern auch zu einer Vernetzung der Matrices führt. Zusätzlich können diese Nebenreaktionen eine schädliche Wirkung auf die chromatographischen Eigenschaften des Harzes, z.B. reduzierte Porosität des Harzes, haben.

Ein Verfahren zur Minimierung dieses Problems ist eine Verwendung bifunktioneller Reagenzien, wobei eine der funktionellen Gruppen entweder maskiert ist oder eine Aktivierung in ihre reaktive Form erfordert, wobei die Demaskierung oder Aktivierung erst nach kovalenter Bindung der ersten funktionellen Gruppe an die feste Trägermatrix erfolgt. Beispiele für diesen Ansatz umfassen die Reaktion von Allylbromid mit einer festen Trägermatrix, um die Allyl-Gruppen kovalent an die Matrix zu binden, worauf eine Aktivierung der Allyl-Gruppe, z.B. durch Brom/Wasser unter Bildung einer reaktiven Bromhydrin-, Oxiran- oder benachbarten Dibromid-Gruppe als funktionelle Gruppe folgt569. Andere genannte Aktivierungsverfahren umfassen eine Halogenid-Aktivierung über Chlor/Wasser, Iod/Wasser, Cl2, Br2 oder I2.

Spezifische Beispiele für die Verwendung von bifunktionellen Reagenzien werden bei Pesek und Swedberg21 gefunden, welche die Halogenierung von Oberflächenhydroxyl-Gruppen und eine Umsetzung der halogenierten Oberfläche mit einem Alkylierungsreagens, ausgewählt aus Grignard-Reagenzien und Organolithium-Reagenzien, beschreiben. Ein ähnliches Verfahren wird bei Pesek und Guiochon22 beschrieben, wobei eine Allyl-gebundene stationäre Phase durch ein Chlorierungs-Grignard-Reaktionsschema unter weiterer Zugabe eines Bisulfitsalzes produziert wird. Porath24 offenbart eine Alkylierungs-Reaktion unter Verwendung des bifunktionellen Reagenzes Vinyl-&bgr;-halogenethylsulfon; und das von Burton et al.25 beschriebene Thioetherharz wird unter Verwendung einer deaktivierten bifunktionellen Gruppe, die anschließend durch Zugabe von Brom/Wasser aktiviert wird, hergestellt. Andere angegebene Aktivierungsverfahren umfassen eine Halogenid-Aktivierung über Chlor/Wasser, Iod/Wasser, Cl2, Br2 oder I2.

Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorbenzien, die heterocyclische Mercapto-Liganden verwenden, wie es von Schwarz und Wilchek23 offenbart ist, eliminieren viele der Probleme, die mit Pseudobioaffinitätsliganden verbunden sind; allerdings erforderte eine Herstellung dieses Adsorbens noch die Verwendung eines bifunktionellen Aktivierungsagenzes.

Trotz der Vorteile dieses Ansatzes sorgt die Verwendung von Halogenid-Aktivierungsbedingungen für Zwischenprodukte, denen Spezifität bezüglich der chemischen Reaktion fehlt. Das heißt das resultierende Halogenhydrin, Oxiran oder das vicinale Dihalogenid sind nur mit limitierten Reagenzien nicht selektiv reaktiv. Statt dessen weisen diese funktionellen Gruppen breite Reaktivitäten mit z.B. Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Hydroxy-Gruppen, usw. auf. Darüber hinaus besitzt Bromwasser eine signifikante Toxizität, was seine ausgedehnte kommerzielle Verwendung inhibiert.

In Anbetracht der obigen Ausführungen besteht ein anhaltender Bedarf an der Bereitstellung von Harzsyntheseverfahren, die leicht durchzuführen sind, für die beabsichtigten Reaktionen spezifisch sind und die für hohe Aktivierungslevel an einer Vielzahl von Trägermatrices sorgen können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung richtet sich teilweise auf die Entdeckung, daß eine ethylenisch ungesättigte Funktionalität, die an einer Trägermatrix hängt, kovalent an eine Thiol-Gruppe gebunden werden kann, und zwar ohne die Notwendigkeit für eine Aktivierung der ethylenisch ungesättigten Gruppe. In der vorliegenden Erfindung wird eine direkte kovalente Bindung der Thiol-Gruppe an die ethylenisch ungesättigte Gruppe unter freien Radikalbedingungen erreicht. In einer Ausführungsform wird eine kovalente Bindung unter Verwendung eines RSH-Thiolreagenzes erreicht, worin R ein Ligand ist, der fähig ist, eine Zielverbindung zu binden, wodurch eine Sulfid-Verknüpfung des Liganden an die Trägermatrix durch einen Linkerarm bereitgestellt wird. Gegebenenfalls kann eine Oxidation der Sulfid-Verknüpfung durchgeführt werden, um für Sulfon- und Sulfoxid-Bindungsgruppen zu sorgen.

Entsprechend stellt diese Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chromatographieharzen bereit, die eine Trägermatrix umfassen, welche Liganden, die zur Bindung einer Zielverbindung fähig sind, kovalent daran über eine Verbindungsgruppe, die Sulfid-, Sulfoxid- oder Sulfon-Funktionalität umfaßt, gebunden hat, wobei das Verfahren umfaßt:

  • (a) Bereitstellen einer Trägermatrix, die ethylenisch ungesättigte Funktionalität daran hängend hat, die ein terminales Olefin hat, welches eine Allyl-Gruppe ist;
  • (b) Inkontaktbringen der Matrix von (a) oben mit einer reaktiven Thiol-Verbindung der Formel R-SH unter freien Radikalbedingungen, die ausreichen, um für eine kovalente -SR-Bindung an die Matrix zu sorgen, wobei R ein Ligand ist, der zur Bindung einer Zielverbindung fähig ist; und
  • (c) fakultativ Oxidieren der Sulfidbindung zu einem Sulfoxid oder Sulfon.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 erläutert bekannte Reaktionen, die verwendet werden, um eine ethylenisch ungesättigte Gruppierung, die an der Trägermatrix hängt, einzuführen.

2 erläutert die Reaktionsprodukte, die durch Verwendung herkömmlicher Bromwasserchemie mit einer ethylenisch ungesättigten Gruppierung von 1 erhalten werden.

3 veranschaulicht die Reaktionsprodukte, die durch freie Radikaladditionschemie, welche Thiol-enthaltende Liganden verwendet, erhältlich sind.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Verfahren zur Herstellung von Harzen, die eine feste Trägermatrix umfassen, welche Liganden, die zur Bindung einer Zielverbindung fähig sind, kovalent daran über eine Verbindungsgruppe, die Sulfid-, Sulfoxid- oder Sulfonyl-Funktionalität umfaßt gebunden hat, oder wobei die Liganden in einer Sulfonat-Funktionalität enden.

Vor einer detaillierteren Diskussion der vorliegenden Erfindung werden zuerst die folgenden Ausdrücke definiert:

Der Ausdruck "Harz" oder "Chromatographieharz" bezieht sich auf ein Material, das fähig ist, eine Zielverbindung aus einem Gemisch von Verbindungen chromatographisch zu trennen, wobei das Harz eine Trägermatrix, einen Liganden, der zur Bindung einer Zielverbindung fähig ist, wenn dieser an die Matrix gebunden ist, und einen Linkerarm zur kovalenten Befestigung des Liganden an die Trägermatrix umfaßt. An der Trägermatrix werden mehrere Kopien des Liganden/Linkerarms gefunden und das Harz kann durch die folgende Formel dargestellt werden: Trägermatrix-[Linkerarm-Ligand]m worin die Ausdrücke Trägermatrix, Linkerarm und Ligand wie unten definiert sind, m die Ligandendichte an der Matrix ist, n der Aktivierungsgrad der Trägermatrix ist (d.h. die Anzahl ethylenisch ungesättigter Gruppen im Harz) und m ≤ n. Diesbezüglich kann die Ligandendichte m infolge einer unvollständigen Reaktion kleiner als der Aktivierungslevel n sein.

Der Ausdruck "Trägermatrix" oder "Träger" bezieht sich auf ein Hauptkettenmaterial des Harzes, wobei das Material eine reaktive Funktionalität enthält, die die kovalente Befestigung eines Linkerarms/Liganden daran hängend erlaubt. Das Hauptkettenmaterial kann anorganisch (z.B. Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, usw.) oder organisch sein. Wenn das Hauptkettenmaterial organisch ist, ist es vorzugsweise ein Polymer, und geeignete organische Polymere sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die Trägermatrix ist vorzugsweise ein polymeres Material, das in der mobilen Phase entweder unlöslich oder löslich sein kann, und hierin wird es manchmal als feste Trägermatrix bezeichnet. Die Trägermatrix ist vorzugsweise ein festes, unlösliches Material.

Feste Trägermatrices, die zur Verwendung in den hierin beschriebenen Harzen geeignet sind, umfassen z.B. Cellulose, regenerierte Cellulose, Agarose, Siliciumdioxid, beschichtetes Siliciumdioxid, Dextran, Polymere (z.B. Polyacrylate, Polystyrol, Polyacrylamid, Polymethacrylamid, einschließlich im Handel verfügbarer Polymere wie Fractogel), Copolymere wie z.B. Copolymere von Styrol und Divinylbenzol, Gemische davon und dgl. Es können auch Co-, Ter- und höhere Polymere verwendet werden, vorausgesetzt, daß mindestens eines der Monomere eine reaktive Funktionalität enthält oder derivatisiert werden kann, so daß im resultierenden Polymer eine reaktive Funktionalität enthalten ist. Geeignete Trägermatrices zur Verwendung in den hierin beschriebenen Harzen umfassen z.B. Polyethylenglykol.

Reaktive Funktionalitäten der Trägermatrix, die eine kovalente Bindung des Liganden ermöglichen, sind auf dem Fachgebiet gutbekannt. Solche Gruppen umfassen Hydroxyl, Thiol, Amino und dgl. Eine herkömmliche Chemie erlaubt die Verwendung dieser funktionellen Gruppen, um Liganden kovalent daran zu binden. Außerdem erlaubt die herkömmliche Chemie die Einführung dieser Gruppen an die Trägermatrix.

Der Ausdruck "Linkerarm" bzw. "Verbindungsarm" bezieht sich auf die Gruppe, die den Liganden kovalent an die Trägermatrix bindet. Im vorliegenden Fall ist der Linkerarm die gesättigte Form der ethylenisch ungesättigten Einheit, die in der freien Radikalreaktion mit dem Thiol-enthaltenden Liganden verwendet wird. Wenn die Vinyl-enthaltende Einheit eine Allyl-Gruppe ist, liefert eine kovalente Bindung des Liganden an die Trägermatrix einen -CH2CH2CH2-Linkerarm. Trägermatrices, die ethylenisch ungesättigte Gruppen daran hängend enthalten, sind auf dem Fachgebiet gutbekannt und werden z.B. von Lindgren56, Hjerten et al.7 und Nochumson8 beschrieben.

Der Linkerarm enthält vorzugsweise mindestens etwa 3 Atome in der Länge und bevorzugter etwa 3 bis 15 Atome in der Länge.

Der Ausdruck "Ligand" oder "Thiol enthaltender Ligand" bezieht sich auf eine Verbindung, die eine mit einer ethylenisch ungesättigten Gruppe, die an der Trägermatrix hängt, unter freien Radikalbedingungen reaktive Thiol-Funktionalität umfaßt, wobei dieser Ligand, wenn er an die Trägermatrix gebunden ist, zur Bindung von Zielverbindungen während der Sorptionsstufe der Chromatographie fähig ist. Eine Bindung der Zielverbindung durch den Liganden, der an die Trägermatrix gebunden ist, kann durch eines der herkömmlichen Mittel, die auf dem Fachgebiet gut dokumentiert sind, erreicht werden; diese umfassen zum Beispiel hydrophobe Wechselwirkungen, hydrophile Wechselwirkungen, ionische Wechselwirkungen, Bioaffinität (z.B. Enzym/Substrat), usw. Der besondere Ligand wird bezüglich des gewünschten Bindungsmittels und der Fähigkeit des Liganden, mit ethylenisch ungesättigten Gruppen unter freien Radikalbedingungen zu reagieren, ausgewählt; beide Kriterien sind dem Fachmann geläufig. Erforderlich ist, daß der ausgewählte Ligand eine Thiol-Gruppe umfaßt, die mit einer ethylenisch ungesättigten Gruppe, die an der Trägermatrix hängt, reaktiv ist. Die Fähigkeit der Thiol-Gruppe eines Liganden an die ethylenisch ungesättigte Gruppe der Trägermatrix zu binden, kann in einfacher Weise ermittelt werden, indem die Reagenzien unter freien Radikalbedingungen einfach vermischt werden und bestimmt wird, ob eine Kupplung auftritt.

Thiol-enthaltende Liganden, die mit einer ethylenisch ungesättigten Gruppe, die an der Trägermatrix hängt, unter freien Radikalbedingungen. reaktiv sind, werden als "reaktive Thiol-enthaltende Liganden" bezeichnet.

In einer Ausführungsform umfaßt der Thiol-enthaltende Ligand eine oder mehrere zusätzliche funktionelle Gruppen, die aus der Gruppe bestehend aus Amin-, Hydrocarbylamino-, Dihydrocarbylamino-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Sulfat-, Phosphat-, heterocyclischer und Carbamidin-Funktionalität ausgewählt sind. In einer anderen Ausführungsform umfaßt der Thiol-enthaltende Ligand nur eine Hydrocarbyl-Gruppe, d.h. R'-SH, worin R' Hydrocarbyl ist.

Beispiele der Thiol-enthaltenden Liganden, die zur Verwendung hier geeignet sind, umfassen zum Beispiel Mercaptoessigsäure, Mercaptoethylpyridin, Glutathion, Cysteamin, Mercaptobuttersäure, Dithiothreitol, 2-Mercaptoethansulfonsäure, 2-Mercaptoethanol, 4-Mercaptophenol, 3-Mercapto-1-propansulfonsäure, 2-Mercaptopropionsäure, Cystein, 3-Mercaptopropionsäure, Mercaptobernsteinsäure, 2-Naphthalinthiol, usw. Andere Thiol-enthaltende Verbindungen, die in den hierin beschriebenen Verfahren einsetzbar sind, werden z.B. von Reid13 beschrieben.

Beispiele für Thiol-enthaltende Liganden, die unter milden freien Radikalbedingungen mit einer ethylenisch ungesättigten Gruppe, die an der Trägermatrix hängt, nicht speziell reaktiv sind, umfassen Propanthiol, 4-Mercaptopyridin, Mercaptobenzimidazol und das Ethylamid-Derivat von Mercaptopropionsäure. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung sind solchen Verbindungen nicht-reaktive, Thiol-enthaltende Liganden.

Der hierin verwendete Ausdruck "Hydrocarbyl" bezeichnet einen organischen Rest, der aus Kohlenstoff und Wasserstoff besteht, der aliphatisch, alicyclisch, aromatisch oder Kombinationen daraus (z.B. Arylalkyl) sein kann. Vorzugsweise ist die Hydrocarbyl-Gruppe von einer aliphatischen Unsättigung frei, d.h. frei von einer Ethylen- und Acetylen-Unsättigung.

Der Ausdruck "heterocyclisch", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine carbocyclische Gruppe mit einem einzelnen Ring oder mehreren kondensierten Ringen die entweder aromatisch (z.B. Pyridyl, Furyl, Naphthpyridinyl, Chinoxalyl, Chinolinyl, Indolizinyl oder Benzo[b]thienyl) oder nicht-aromatisch (Morpholin, Piperidin, usw.) sein können und die mindestens ein Heteroatom, z.B. N, O oder S, in mindestens einem Ring haben. Vorzugsweise werden solche heterocyclischen Gruppen 4 bis 20 Kohlenstoffatome und 1 bis 3 Heteroatome umfassen.

Der hierin verwendete Ausdruck "Carbamidin" bezieht sich auf die funktionelle Gruppe:

Der Ausdruck "Zielverbindung" bezieht sich auf die besondere Verbindung oder besondere Verbindungen, die man aus einer wäßrigen Lösung isolieren möchte. Die Zielverbindung kann ein Protein, ein Peptid, ein Nukleotid, ein Oligonukleotid, ein Saccharid, ein Oligosaccharid, ein Kohlenhydrat, ein Steroid, eine cyclische aromatische Verbindung, ein Diol, ein Indol-Derivat, eine pharmazeutische chemische Verbindung oder ein Zwischenprodukt davon, ein primärer oder sekundärer zellulärer Metabolit oder dgl. sein. Die besondere Zielverbindung ist nicht kritisch. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zielverbindung aus der Gruppe bestehend aus einem Protein oder einem Peptid, einem primären oder sekundären Zellmetaboliten und einem pharmazeutisch chemischen Zwischenprodukt ausgewählt.

Der Ausdruck "ethylenisch ungesättigte Gruppe" bezieht sich auf Vinyl (>C=C<) oder acetylenische Gruppen (-C≡C)-). Die ethylenisch ungesättigte Gruppe ist eine terminale Vinyl-Gruppe (d.h. >C=CH2), welche eine Allyl-Gruppe ist.

Der Ausdruck "freie Radikalbedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, bei denen ein Radikalreaktion ablaufen kann. Solche Bedingungen beinhalten keine Verwendung von Antioxidansmaterialien, von denen bekannt ist, daß sie Radikalreaktionen inhibieren oder beenden. Statt dessen werden herkömmliche Reaktionsbedingungen verwendet, wobei diese Bedingungen die Verwendung eines oder mehrer Radikalinitiatoren, wie z.B. Sauerstoff, Strahlung (z.B. ultraviolettes Licht, radioaktive Elemente (z.B. 60Co) usw.), chemische Initiatoren wie Peroxide usw., umfassen können. Zusätzlich können saure Bedingungen angewendet werden. Radikalbedingungen umfassen auch Reaktionssysteme, denen keine freien Radikalkatalysatoren zugesetzt werden, in denen aber ausreichend gelöster Sauerstoff, Spuren an Peroxiden usw. im Reaktionssystem vorliegen, so daß eine Radikalreaktion ablaufen wird.

Vorzugsweise umfassen Radikalbedingungen die Verwendung einer wäßrigen oder zumindest teilweise wäßrigen Lösung.

Der Ausdruck "Halogen" bezieht sich auf Chlor, Brom und Iod.

METHODOLOGIE

Die Synthese einer Trägermatrix, welche Liganden, die zur Bindung einer Zielverbindung fähig sind, kovalent daran über eine Verbindungsgruppe, die Sulfidfunktionalität umfaßt, gebunden hat, erfolgt durch Reaktion einer ethylenisch ungesättigten Funktionalität, die an der Trägermatrix hängt, mit einem reaktives Thiol enthaltenden Liganden unter freien Radikalbedingungen. Die Reaktion von Thiolen mit ethylenisch ungesättigten Gruppen ist als Lösungsphasenchemie10-12 gut dokumentiert. Überraschenderweise wurden festgestellt, daß diese bekannten Verfahren an Trägern durchgeführt werden können, wobei der ethylenisch ungesättigte Träger kovalent an den Träger gebunden ist, wodurch Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Harze bereitgestellt werden.

Die Bildung einer Trägermatrix, die ethylenisch ungesättigte Gruppen umfaßt, welche an diesem Träger hängen, ist auf dem Fachgebiet gut dokumentiert5-8, dabei ist der besondere angewendete Weg nicht kritisch. Die Reaktion kann z.B. Allylglycidylether, Allylhalogenid oder Propargylhalogenid in herkömmlichen Verfahren in Gegenwart einer Base verwenden, um so eine Trägermatrix mit einer ethylenisch ungesättigten Einheit, die daran hängt, bereitzustellen. Spezifischer formuliert, die Halogenid- oder Glycidyl-Gruppe reagiert, wie es in 1 dargestellt ist, mit Matrixhydroxyl-Gruppen bei alkalischem pH. Es wird erwartet, daß unter diesen Bedingungen die Allyl-Gruppe eine begrenzte Reaktivität mit der Matrix oder dem Wasser, das in der Reaktionslösung verwendet wird, hat. Daher sind hohe Aktivierungslevel ohne Bildung von Vernetzungen und/oder Hydrolyse kovalent gebundener aktiver Gruppen möglich.

Die ethylenisch ungesättigte Gruppe wird dann unter freien Radikalbedingungen mit dem Thiol-enthaltenden Ligand unter Bereitstellung einer kovalenten Bindung des Liganden umgesetzt. Die Reaktion ist in der Reaktion (1) unten dargestellt, welche zu Erläuterungszwecken eine Allyl-Gruppe als die ethylenisch ungesättigte Gruppe verwendet: Träger (CH2CH=CH2)n + RSH → Träger-(CH2CH2CH2-SR)n(1) worin R ein Thiol-enthaltender Ligand ist und worin "Träger" und n wie oben definiert sind.

Die Reaktion wird vorzugsweise in Wasser durchgeführt. Allerdings kann auch eine wäßrige Lösung, die eine geringe Menge eines mischbaren organischen Lösungsmittels, zum Beispiel Dimethylsulfoxid (DMSO), Methanol, Ethanol, Aceton und dgl. umfaßt, verwendet werden. Vorzugsweise ist das mischbare organische Lösungsmittel DMSO und bevorzugter wird das DMSO mit über 0 bis 50 % (V/V), bezogen auf den verwendete Gesamtwassermenge, eingesetzt.

In dieser Reaktion werden freie Radikalbedingungen typischerweise durch gelösten Sauerstoff, Belichtung und/oder Spuren an Peroxid-Verunreinigungen im Reaktionssystem initiiert. Wenn es gewünscht wird, kann allerdings ein freie Radikale initiierender Katalysator eingesetzt werden. Solche Katalysatoren umfassen wasserlösliche Verbindungen, z.B. Ammoniumpersulfat oder in Alkohol lösliche Katalysatoren wie z.B. Azobisisobutyronitril (AIBN). Solche Katalysatoren werden typischerweise mit etwa 0,1 bis etwa 5 mol%, bezogen auf die größere Molzahl der Gesamtmole an Thiol oder ethylenischen Gruppen im Reaktionsgemisch, verwendet.

Die Reaktion wird vorzugsweise bei 15° bis etwa 80°C durchgeführt, bevorzugter bei 20°C bis 70°C. Die spezifische Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit werden durch die Reagenzien, ob ein Radikalkatalysator verwendet wird usw. diktiert und kann in einfacher Weise vom Fachmann auf diesem Gebiet ermittelt werden.

Die Reaktionen werden vorzugsweise bei moderaten sauren pH-Werten, z.B. von etwa 2,5 bis etwa 6,2, durchgeführt. In einigen Fällen sollte der pH der Reaktion überwacht werden, um eine adäquate Reaktivität des Thiolenthaltenden Liganden mit der ethylenisch ungesättigten funktionellen Gruppe sicherzustellen. Bei pH 3 bis 4 ist 4-Mercaptoethylpyridin zum Beispiel mit ethylenisch ungesättigten funktionellen Gruppen sehr reaktiv, wohingegen die Reaktion bei pH 2 nicht abläuft. Die Verwendung von mildsauren pH-Werten ist für Trägermatrices, z.B. Siliciumdioxid, das in Alkali instabil ist, besonders vorteilhaft.

Die resultierenden Träger können durch herkömmliche Verfahren, einschließlich z.B. Filtration, Zentrifugation, usw. isoliert werden.

Wenn R ein Thiol-enthaltender Ligand ist, kann das resultierende Sulfid gegebenenfalls durch eine herkömmliche Oxidation unter Verwendung von zum Beispiel Oxidationsmitteln wie Wasserstoffperoxid, meta-Chlorperbenzoesäure, Bromwasser und dgl. zu dem Sulfoxid oder dem Sulfon oxidiert werden.

VERWENDBARKEIT

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen Harze bereit, die für die chromatographische Trennung einer Zielverbindung oder eines Satzes von Zielverbindungen aus einem Gemisch, das die Zielverbindung oder -verbindungen umfaßt, geeignet sind. Eine Trennung der Zielverbindung oder -verbindungen wird durch Sorptionsprozesse erreicht, wobei die Zielverbindung oder -verbindungen im Vergleich zu mindestens einer der anderen Komponente, die im Gemisch gefunden werden, eine andere Bindungsaffinität zum Harz hat.

Durch Selektion geeigneter Liganden können die hier beschriebenen Harze auch bei der Gewinnung der Zielverbindung oder -verbindungen verwendet werden. Spezifisch ausgedrückt, in jeder Ausführungsform werden die Liganden, die an dem Harz verwendet werden, so ausgewählt, daß eine Bindung der Zielverbindung oder -verbindungen entweder unter den Bedingungen, die während des Sorptionsprozesse verwendet werden, oder unter Veränderung der Sorptionsprozeßbedingungen derart, daß die Zielverbindung oder -verbindungen nicht länger mit derselben Affinität an das Harz binden, reversibel ist. Beispiele für den zuletzt genannten Prozeß werden von Burton et al.12 beschrieben, der die Verwendung von Liganden offenbart, wobei eine Ladung am Liganden durch pH-Änderung induziert werden kann und wobei die induzierbare Ladung verwendet werden kann, um die Sorptions/Desorptionseigenschaften des Harzes zu beeinflussen.

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen gegenüber herkömmlichen Kupplungsreaktionen ethylenisch ungesättigte Funktionalität zahlreiche Vorteile bereit, indem zum Beispiel Brom/Wasser, gefolgt von einer Ligandenanheftung durch Bromidchemie, verwendet wird. Ein signifikanter Vorteil, der bei den hierin beschriebenen Verfahren gefunden wird, ist der, daß die freie Radikaladdition für Thiol-enthaltende Verbindungen ohne Kreuzreaktivität mit Amin-, Carboxyl- und Hydroxyl-Gruppen spezifisch ist. Dementsprechend können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Liganden Hydroxyl-, Amin-, Carboxyl-Gruppen enthalten, ohne daß dies zu nicht-spezifischen Bindungsreaktionen an der Matrix oder zu einer Vernetzung führt.

Ein weiterer Vorteil ist der, daß eine Ligandenkupplung mit einem Schritt weniger als bei herkömmlichen Verfahren sowie im wesentlichen ohne Verwendung von exogenen Katalysatoren, obgleich solche Katalysatoren verwendet werden können. Außerdem ist die Verwendung von Brom oder Brom/Wasser elimiert. Dieser letztgenannte Aspekt ist in sofern signifikant, als 2 erläutert, daß Nebenreaktionen mit Brom oder Brom/Wasser (oder anderen Halogeniden) zu einem gewissen Grad eines Halogenideinbaus in die Matrix führen werden, wohingegen dies in den hierin beschriebenen Verfahren nicht der Fall sein wird. Dementsprechend sorgen die hierin beschriebenen Verfahren für eine Halogenid-Konzentration im resultierenden Harz von kleiner als etwa 0,2 % (pro Gramm Trockengewicht).

Noch ein weiterer Vorteil, der mit den hierin beschriebenen Verfahren erreicht wird, ist der, daß eine kovalente Bindung verschiedener Liganden über das hierin beschriebene Verfahren mit freien Radikalen im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren effizienter ist, während noch sehr hohe Ligandendichten erreicht werden.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele werden angeführt, um die beanspruchte Erfindung zu erläutern und sollen keine Beschränkung darstellen.

Wenn nichts anderes angegeben, ist, sind alle Temperaturen in Grad Celsius. In diesen Beispielen haben, wenn nichts anderes nachfolgend definiert ist, die verwendeten Abkürzungen ihre allgemein akzeptierte Bedeutung:

AB
= Allylbromid
AGE
= Allylglycidylether
APS
= Ammoniumperslfat
BME
= 2-Mercaptoethanol
DMSO
= Dimethylsulfoxid
ECH
= Epichlorhydrin
g
= Gramm
GSH
= Glutathion
M
= molar
MAA
= Mercaptoessigsäure
mäq
= Milliäquivalente
ml
= Milliliter
mmol
= Millimol
mM
= Millimolar
MPA
= Mercaptopropionsäure
MSA
= Mercaptobernsteinsäure
nm
= Nanometer
TCA
= Trichloressigsäure
&mgr;l
= Mikroliter

In den folgenden Beispielen wurden Allylglycidylether, Thiolessigsäure, Mercaptoessigsäure, Thiosalicylsäure, Cysteamin·HCl und 3-Mercaptopropionsäure von Janssen Chimica, Geel, Belgien erhalten; 4-Mercaptopyridin, Mercaptobernsteinsäure und Thiophenol wurden von Aldrich-Chemie, Steinheim, Deutschland oder Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA, erhalten; Glutathion und Butyrolacton wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA, erhalten; Allylbromid, Cystein, Benzoylperoxid, Ammoniumpersulfat, Calciumhydroxid und 4-Methoxyphenol wurden von BDH, Dorset, England erhalten; 2-Mercaptoethanol, Bariumhydroxidoctahydrat und Cystein·HCl wurden von Riedel-de Hahn, Selze, Deutschland, erhalten; Natriumsulfit wurde von May and Baker, Manchester, England, erhalten; Natriummetabisulfit wurde von Ajax Chemicals Ltd., Auburn, NSW, Australien erhalten und Thioharnstoff wurde von Merck, München, Deutschland, erhalten. 4-Mercaptobuttersäure wurde aus Butyrolacton und Thioharnstoff durch das Verfahren von Kharasch und Langford16 hergestellt. 6-Mercaptohexansäure wurde das Verfahren von Ivanovics und Vargha17 aus 6-Bromhexansäure und Natriumbisulfid hergestellt.

Perlozaharze war von Tessek, Ltd., Prag, Tschechische Republik oder von ICS, Prag, Tschechische Republik. Sepharoseharze waren von Pharmacia, Uppsala, Schweden. Perlozaharze können auch von Lovochemie, Lovosice, Teschechische Republik erhalten werden.

In den folgenden Beispielen bedeutet DMSO% = verwendetes DMSO (ml)/g Harz. Entsprechend beziehen sich die in Gramm angegebenen Matrixgewichte auf Saugtrockengewichte, wohingegen sich Gewichte, die in Gramm (trocken) angegeben sind, auf ofengetrocknete Gewichte beziehen (–110°C für 1 bis 2 Stunden, gekühlt in einer trockenen Umgebung). Es ist einzusehen, daß Saugtrockengewichte noch wassersolvatisierte Materialien sind.

BEISPIEL 1 – Synthese von 4-Mercaptoethylpyridin·HCl

4-Mercaptoethylpyridin·HCl wurde aus 4-Vinylpyridin und Thiolessigsäure durch Anpassung des Verfahrens, das von Vinton14 zur Herstellung von 2-Mercaptoethylpyridin beschrieben wurde, hergestellt. Unter Rühren wurde 4-Vinylpyridin (95 %, 250 ml) auf –30°C (Methanol/Eisbad) vorgekühlt und Thiolessigsäure (170 ml) wurden über einen Zeitraum von etwa einer Stunde tropfenweise zugegeben. Die Lösung fror nach 5 bis 10 Minuten und die Zusatzrate wurde erhöht, um die Temperatur auf 15-25°C zu erhöhen und ein effizientes Rühren zu ermöglichen. Eine weitere Zugabe wurde so gesteuert, daß die Reaktionstemperatur zwischen 15 bis 25°C gehalten wurde und 30°C nicht überstieg. Die Reaktion wurde für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur und danach über Nacht gerührt.

Das Produkt wurde mit Ether vermischt und 3-mal mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung extrahiert (bei der dritten Extraktion entwickelte sich kein Gas). Die Etherschicht wurde einmal mit gesättigter Salzlösung gewaschen, mit Aktivkohle behandelt, um die Farbe zu reduzieren, und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Es wurde dann filtriert und unter Vakuum bei einer Badtemperatur von etwa 30°C eingeengt. Das resultierende Öl wurde für mindestens 4 Stunden mit 800 ml 6 M HCl gerührt und dann wurde die Säureschicht unter Vakuum eingeengt. Der getrocknete Feststoff wurde mit Isopropanol aufgeschlämmt, filtriert und getrocknet, wodurch 328 g (theoretisch 387 g) cremigweißes 4-Mercaptoethylpyridinhydrochlorid (85 %) erhalten wurden; Schmelzpunkt 190-191°C (Lit. 189°C, Bauer und Gardella15). Eine Wiederholungsherstellung unter Verwendung von 206 ml Vinylpyridin, 140 ml Thiolessigsäure und einer effizienteren HCl-Entfernung lieferte 308 g (theoretisch 318 g, Ausbeute 97 %) eines cremefarbenen Feststoff, Schmelzpunkt 189-190°C.

BEISPIEL 2 – Herstellung ethylenisch ungesättigter Gruppen, die an einer Trägermatrix hängen

Dieses Beispiel führt lediglich zu erläuternden Zwecken verschiedene Verfahren aus, die zur Herstellung ethylenisch ungesättigter Gruppen, die an einer Trägermatrix hängen, verwendet werden. Es beschreibt zum Beispiel die Aktivierung von zwei verschiedenen Trägermatrices mit zwei verschiedenen Allylreagenzien unter variierenden Reaktionsbedingungen. Die Effekte der Allylreagens-Konzentration, des Lösungsmitteltyps, der Reaktionstemperaturen und -zeit werden ebenfalls untersucht und die resultierenden Ligandendichten werden unter Anwendung verschiedener Titrationsverfahren verglichen.

Allgemeine Reaktionsverfahren:

Reaktionen bei Raumtemperatur wurden mechanisch unter Zusatz des Harzes in einen Ika-Vibra-Mix-Schüttler vermischt, wenn nichts anderes angegeben ist. Reaktionen bei erhöhter Temperatur wurden in einem Wasserbad ohne externes Mischen inkubiert. Glasphiolen (25 ml) wurden für Matrixproben bis zu 15 g routinemäßig verwendet. Glaskolben mit einem Fassungsvermögen bis zu 1250 ml wurden für größere Reaktionsgemische eingesetzt. Perloza 100, fein, wurde für Aktivierungsreaktionen verwendet, wenn nichts anderes angegeben ist. Perloza wurde mit Wasser oder Lösungsmittel gewaschen, es wurde zu dem Lösungsmittelgemisch gewechselt, welches zur Aktivierung verwendet wurde, und es wurde in einem Sinterglastrichter sauggetrocknet. Aktivierungsgemische wurden durch das Volumen an Allylreagens (ml) pro 100 g sauggetrockneter Matrix, ausgedrückt als Prozentgehalt, identifiziert.

A. Allylbromid-Aktivierung von Perloza

Für jedes verwendetes Mol an Allylreagens wurden 1 bis 1,1 mol Hydroxid-Ionen verwendet. Die angewendeten Anfangsbedingungen waren 60°C unter Verwendung von 75 % DMSO-solvatisiertem Perloza. Bei Änderung der Reaktionstemperatur auf Raumtemperatur wurde kein Nachteil festgestellt. Die Effizienz der Reagenzverwendung war unter Verwendung organischer Lösungsmittel höher, allerdings wurden unter Verwendung wäßriger Medien noch hohe Aktivierungslevel erzielt. Wenn hohe Level an organischem Lösungsmittel verwendet wurden, war Ba(OH)2 das bevorzugte Alkali, ansonsten wurden NaOH verwendet. Bei Erhöhung des Reagenzanteils wurde eine beständige Zunahme beim Aktivierungslevel festgestellt (Tabelle 1). Da zwischen einem wäßrigen Gemisch und einem 15 % DMSO-Gemisch nur ein geringer Unterschied bei der Aktivierung festgestellt wurde, wurde eine wäßrige Aktivierung als das Standardverfahren gewählt.

Ein spezifisches Beispiel für eine Allylbromid-Aktivierung ist wie folgt. Perloza-Cellulose (MT 100 fein) wurde mit 5 Volumina Wasser (MilliQ-Qualität) gewaschen und sauggetrocknet. Eine 10 g-Menge der Matrix wurde mit 0,8 ml Allylbromid (nochmals destilliert), 0,8 g Bariumhydroxidoctahydrat, 2 ml DMSO und 1 ml Wasser für 48 Stunden bei Raumtemperatur gemischt. Die aktivierte Matrix wurde mit 5 Volumina eines 10 % DMSO/90 % Wasser-Gemisches, 5 Volumina 0,1 M HCl und 10 Volumina Wasser gewaschen. Die Allylgruppenkonzentration wurde durch das im späteren Beispiel III beschriebene Bromwasserverfahren bestimmt. Ein unabhängiges Maß für Allyl-Gruppen wurde erhalten, indem 1 g des aktivierten Harzes mit 3 ml Wasser und 100 &mgr;l 3-Mercaptopropionsäure (MPA) bei 60°C für 4 Stunden vermischt wurde. Dieses derivatisierte Harz wurde mit 20 Volumina Wasser, 20 Volumina 0,1 M NaOH, 50 Volumina Wasser, 20 Volumina 0,1 M HCl und 100 Volumina Wasser gewaschen und mit 0,1 M NaOH titriert. Dieses MPA-Titrationsverfahren kann auch auf die oben beschriebenen aktivierten Matrizes angewendet werden und wird auch in Beispiel III beschrieben.

Zusätzliche Beispiele einer Allylbromid-Aktivierung von Perloza

In einigen (6 %) Aktivierungen wurden Natriumhydroxid-Lösungen durch Bariumhydroxid (2 g), Calciumhydroxid (0,5 g) oder Kaliumphosphat (3 g) pro ml verwendetes Allylbromid ersetzt. Bariumhydroxid wurde auch für eine 10 % Aktivierung von 75 % DMSO-solvatisiertem Perloza und eine 25%ige Aktivierung von Wasser-solvatisiertem Perloza, beide bei Raumtemperatur für 24 Stunden, verwendet.

Wasser-solvatisiertes Perloza (5 g), 0,5 ml Wasser und 1 ml DMSO wurden mit 0,25 ml, 0,5 ml oder 0,75 ml Allylbromid (+0,5 g, 1 g oder 1,5 g Ba(OH)2) vermischt. Weitere Gemische verwendeten 10 g Perloza, 2 ml DMSO und 0,8, 1 oder 1,2 ml Allylbromid (1,6, 2 oder 2,4 g (Ba(OH)2).

Wasser-solvatisiertes Perloza (5 g), 0,5 ml Allylbromid und 1 g Ba(OH)2 wurden mit 3 ml Wasser oder 2 ml 12,5, 50 oder 100 % DMSO vermischt.

Das Standardreaktions-(24 Stunden)-Gemisch war 10 g Wasser-solvatisiertes Perloza, 1,5 ml Lösungsmittel, 0,7 ml Allylbromid und 2,4 ml 3,75 M NaOH. Die verwendeten Lösungsmitteln waren: DMSO, Dioxan, Aceton, Ethanol und Wasser. Eine zweite DMSO-Probe wurde für 7 Stunden umgesetzt. Eine weitere DMSO-Reaktion verwendete 1,4 g Ba(OH)2 und 2 ml Wasser anstelle einer NaOH-Lösung.

Bevorzugte Bedingungen für die Allylbromid-Aktivierung von Perloza

Wasser-solvatisiertes Perloza (10 g), mit oder ohne 1,5 ml DMSO, wurde mit 0,7 ml Allylbromid und 3 ml 3 M NaOH, 4,5 ml 2 M NaOH oder 5 ml 2 M NaOH vermischt. Die bevorzugten Bedingungen für eine 7 %-Aktivierung verwendeten 4,5 ml 2 M NaOH (kein DMSO). Ein "7 %-aktiviertes Ausgangsmaterial-Perloza" wurde durch Reaktion von 100 g Perloza mit 7 ml Allylbromid und 45 ml 2 M NaOH hergestellt. Für andere Allylbromid-Prozentgehalte wurde das verwendete Volumen an NaOH zwischen 0,4 und 0,45 ml Lösung pro Gramm Perloza gehalten. Allerdings wurde die NaOH-Molarität so verändert, daß 12,5 bis 13 mmol Hydroxid pro ml (etwa 12 mmol) Allylbromid verwendet wurden.

Eine 2 % Allylbromid-Aktivierung von 10 g Perloza verwendete (4,5 ml) 0,6 M NaOH. Eine 6 % Aktivierung von 50 g Perloza verwendete 20 ml 2 M NaOH. Für eine 7,5 % Aktivierung von 400 g Perloza wurden 30 ml Allylbromid und 180 ml 2,1 M NaOH verwendet. Eine "8 %-Aktivierung von 80 g Ausgangsmaterial-Perloza" verwendete 6,4 ml Allylbromid und 35 ml 2,3 M NaOH. Für eine "10 %-Aktivierung von 1 % vernetztem und unvernetztem Perloza-Ausgangsmaterial" (50 g) wurden 5 ml Allylbromid und 21,5 ml 3 M NaOH verwendet. Eine zweite "10 % Aktivierung von unvernetztem Ausgangsmaterial-Perloza" (75 g) verwendete 7,5 ml Allylbromid und 32 ml 3 M NaOH. Eine 7,5 % Aktivierung von 700 g Perloza 100, medium, verwendete 52,5 ml Allylbromid und 300 ml 2,2 M NaOH.

Allylbromid-Aktivierung von Sepharose

Sepharose 6B (10 g) wurde mit 0,5 ml Allylbromid, 0,1 ml ECH (Vernetzungsmittel) und 6 ml 1,7 M NaOH für 48 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Eine weitere Sepharose 6B-Probe wurde entsprechend umgesetzt, außer daß 1 ml Allylbromid und 6 ml 2,5 M NaOH verwendet wurden. Sepharose CL6B wurde mit 0,1 ml Allylbromid und 4,5 ml 2 M NaOH für 18 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt.

B. Allylglycidylether-Aktivierung von Perloza

Ein spezifisches Beispiel der Allylglycidylether-Aktivierung ist wie folgt. Perlozacellulose (Perloza MT 100 fein, perlenförmige Cellulose) wurden mit 5 Volumina Wasser (Wasser mit MilliQ-Qualität) und 3 Volumina 0,3 M NaOH gewaschen und unter Absaugen getrocknet. Eine 40 g-Menge der Matrix wurde mit 12 ml 99+% Allylglycidylether durch kräftiges Schütteln vermischt. Das Gemisch wurde für 48 Stunden unter gelegentlichem Rütteln bei Raumtemperatur belassen. Die aktivierte Matrix wurde mit 10 Volumina Wasser gewaschen und 3 Volumina Wasser suspendiert. Bromwasser (1 %) wurde im Verlauf von 5 Minuten langsam zugegeben, bis sich das Gemisch mit Bromwasser nicht länger entfärbte. Das bromierte Harz wurde mit 10 Volumina Wasser gewaschen. Die Allylgruppenkonzentration an den Harzen wurde durch die Menge an entfärbten Bromwasser bestimmt. Die Konzentration an reaktiven Brom-Gruppen am Harz (1 g Probe, suspendiert in 9 ml Wasser) wurde durch Substitution mit 0,5 g Natriumsulfit (4 Stunden, 60°C, gefolgt von einer Titration mit 0,1 M NaOH bis pH 8, bestimmt. Ähnliche Reaktionen wurden unter Verwendung verschiedener Reaktionszeiten, -temperaturen und Reagenzprozentgehalte durchgeführt.

Andere Alternativen umfassen die folgenden:

Reaktionsgemische, die ein organisches Lösungsmittel enthalten, wurden in entsprechender Weise hergestellt, außer daß Perloza (10 g) mit einem Gemisch aus 0,3 M NaOH und Lösungsmittel vorbehandelt wurde. Die verwendeten Lösungsmittelgemische waren 1:2 (Aceton/0,3 M NaOH) und 1:1 (DMSO/0,3 M NaOH). Diese Reaktionsgemische hatten "Fluid"-Eigenschaften, die den wäßrigen überlegen waren und wurden durch mechanisches Schütteln vermischt.

Eine andere wäßrige Aktivierung wurde ohne Vorbehandlung durch Mischen von Wasser-solvatisiertem Perloza (8 g) mit 2 ml 1,5 M NaOH und 1,2 ml Allylglycidylether hergestellt. Dieses Produkt war eine Aufschlämmung mit stärkerem "Fluid"-Charakter. Ein Ausgangs-Allylglycidylether-Perloza wurde in analoger Weise hergestellt, indem die wäßrige Aufschlämmungsaktivierung von 50 g Cellulose unter Verwendung von 15 % Allylglycidylether gefolgt von 12 % Allylglycidylether (und jeweils 10 ml 2 M NaOH) wiederholt wurde. Reagenzien und Produkte der ersten Reaktion wurden (in einem Glastrichter mit Sintereinsatz) mit Wasser ausgewaschen, bevor die zweite Zugabe an Reagens und NaOH erfolgte.

Resultate A. Allylbromid-Resultate

Eine Allylbromid-Reaktion mit Perloza zeigte signifikant höhere Aktivierungslevel als sie unter Verwendung einer Epichlorhydrin-Aktivierung erhalten werden konnten. Diese Resultate wurden unter Verwendung von 0,3 ml Allybromid pro 10 g 75 % DMSO-solvatisiertem Perloza erhalten.

Diese Aktivierungsbedingungen wurden gewählt, um den Wassergehalt zu minimieren und einen leichten (etwa 1,05) molaren Überschuß an Hydroxid gegenüber Allylbromid bereitzustellen. Eine signifikante Reduktion beim gequollenen Matrixvolumen (10-15 % weniger Gewicht der unter Saugen getrockneten Matrix nach Aktivierung) wurde für stark aktivierte Proben festgestellt. Die Proben erlangten nach Ligandensubstitution ihre ursprüngliches gequollenes Volumen nicht zurück. Es wurde davon ausgegangen, daß ein reduziertes gequollenes Volumen durch eine übermäßige Vernetzung oder durch hydrophobe Effekte der Allyl-Gruppen verursacht werden könnte. Allylbromid sollte selbst keine Vernetzung verursachen (Lindgren, 1994) allerdings könnten Verunreinigungen dies tun. Das verwendete Allylbromid war leicht braungefärbt, obgleich es farblos sein sollte. Ein farbloses Reagens wurde durch Destillation erhalten und in anschließenden Experimenten eingesetzt.

Zur Aktivierung war Raumtemperatur offensichtlich adäquat, da nach einstündiger Reaktion ein hoher Level (0,15 mmol/g) erhalten wurde, wenn das 6 % Allylbromid-Gemisch, das beschrieben wurde, für die 60°C-Reaktion eingesetzt wurde. Alle anschließenden Allylbromid-Aktivierungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, allerdings wurde die Reaktionszeit auf 24 Stunden erhöht.

Der Anfangs-pH der oben beschriebenen Reaktionsgemische wäre sehr hoch (geschätzt auf >14) und der Effekt niedrigerer pH-Werte auf die Reaktion wurde untersucht. Spezifischer ausgedrückt, die zwei ml 3,75 M NaOH-Lösung, die für 6 % Allylbromid-Aktivierung eingesetzt wurden, wurden durch Barium/Calciumhydroxid oder Kaliumphosphat (Feststoffe) und 2 ml Wasser ersetzt. Hohe Aktivierungslevel wurden unter Verwendung von Ba(OH)2 (0,46 mmol/g) erreicht, unter Verwendung von Ca(OH)2 und K3PO4 (jeweils 0,1 mmol/g) wurden allerdings geringere Level erreicht. Ca(OH)2 hat eine geringere Löslichkeit als Ba(OH)2 und es wurden gesättigte Hydroxid-Konzentrationen bezüglich Wasser mit etwa 0,01 M bzw. 0,2 M erwartet. Der pH einer 1 M K3PO4-Lösung war 13, allerdings wurde der Ausgangs-pH wegen der Pufferungseffekte während der Reaktion nicht gehalten. Daher ist anscheinend eine Base mit ausreichender Stärke, um den Reaktions-pH bei etwa 13 bis 13,5 zu halten, für eine optimale Aktivierung erforderlich, während ein höherer pH allerdings die Aktivierungseffizienz verringert. Die Quellvolumina der weniger aktivierten Matrizes, die unter Verwendung der schwächeren Basen produziert wurden, waren nicht deutlich verändert, was anzeigt, daß hohe Aktivierungslevel für eine Matrixschrumpfung verantwortlich waren. Eine sehr stark aktivierte Matrix (0,71 mmol/g) wurde produziert, indem der Verhältnisanteil an Allylbromid auf 1 ml pro 10 g durch Saugen getrocknetes /75 % DMSO) Perloza erhöht wurde.

Eine andere in hohem Maße substituierte Matrix (0,43 mmol/g) wurde unter Verwendung von (10 g) Wasser-solvatisiertem Perloza und 25 % Allylbromid produziert. Obgleich der Reagenzverbrauch viel höher war, zeigte diese Reaktion, daß hohe Aktivierungslevel in wäßrigem Medium erhalten werden konnten. Eine wirksame Reaktion trat trotz der begrenzten Löslichkeit von Allylbromid in Wasser auf.

Die Beziehung zwischen dem Verhältnis von Reagens zu Cellulose und dem resultierenden Aktivierungslevel für 1:6 DMSO:Wasser-solvatisierter Cellulose wurde unter Verwendung 5, 10 und 15 % Allylbromid und Ba(OH)2 bestimmt. Die Aktivierungslevel waren 0,99, 1,42 und 1,97 mmol/g (trocken). Die Titrationswerte stiegen in grob linearer Art an. Siehe zum Beispiel Tabelle 1 unten. Es gab keinen Hinweis für eine reduzierte Reaktivität von Cellulose bei ansteigenden Aktivierungsleveln. Dies stand mit der früher erhaltenen extrem hohen Aktivierungsleveln in Übereinstimmung.

TABELLE 1 Vergleich der Titrationsmethoden für variierende (Aktivierungs)-Level von Allylbromid

Die oben beschriebenen 5 bis 15 % Allylbromid-Aktivierungslevel (mmol/g trocken) wurden durch Mercaptopropionsäure-Addition und -Titration bestimmt (die unten beschriebenen Titrationsverfahren). Die Korrelation mit den Bromwasser-Titrationswerten (Tabelle 1) war vernünftig und die Variationen infolge einer visuellen Bestimmung des Titrationsendpunkts und des Abfallens des Brom-Gehalts im Laufe der Zeit wurden vernachlässigt. Sulfonattirationswerte lieferten dagegen eine geringe Schätzung der Aktivierungslevel, speziell bei hohen Allylbromid-Prozentwerten. Das Mercaptopropionsäure-Titrationsverfahren wurde dann für einen Routineassay der Aktivierungslevel verwendet, bis Mercaptopropionsäure durch Mercaptoessigsäure ersetzt wurde.

Eine Allylbromid (10 %)-Aktivierung von Wasser-solvatisiertem Perloza führt zu einem Aktivierungslevel von 0,79 mmol/g, was nahelegt, daß ein geringer Prozentgehalt an DMSO im Reaktionsgemisch die Wirksamkeit deutlich verstärkt. Dieser Unterschied wurde einem verbesserten Reagensvermischen zugeschrieben. Der Effekt der Erhöhung des Verhältnisses von DMSO zu Cellulose bei Verwendung einer konstanten Menge an Wasser und Allylbromid (10 %) bestand in einer anfänglichen Erhöhung des Aktivierungslevels, allerdings wurde keine Verbesserung über 20 % DMSO (Tabelle 2) gefunden. Die Sulfonattitrationswerte waren erneut niedrig.

TABELLE 2 Titrationswerte für Variationen von Reagens- und Co-Lösungsmittel-Verhältnis2

Da der Wassergehalt von Reaktionsgemischen stark erhöht worden war, konnte Natriumhydroxid verwendet werden, ohne daß der Anfangs-pH 14 überstieg. Eine 7 % Allylbromid-Aktivierung (24 Stunden) mit Ba(OH)2, Wasser und 15 % DMSO führt zu einem Level von 0,183 mmol/g. Ein größerer Aktivierungslevel wurde unter Verwendung von 2,4 ml 3,75 M NaOH anstelle von Ba(OH)2/Wasser erreicht. Der Effekt einer Veränderung beim Lösungsmitteltyp anstelle des Prozentgehalts wurde unter Verwendung des NaOH-Verfahrens untersucht und die Resultate sind in Tabelle 3 aufgezeichnet. Eine äquivalente Aktivierung wurde unter Verwendung von Aceton anstelle von DMSO erreicht. Leicht niedrigere Aktivierungslevel wurden mit Dioxan und Wasser erhalten und viel niedrigere wurden mit Ethanol erhalten. Eine 7-Stunden-Reaktionsprobe (DMSO) hatte einen Aktivierungslevel von etwa 70 % der 24-Stunden-Reaktionsprobe. Da für die wäßrige Probe zusätzliche 1,5 ml Wasser verwendet wurden, kann der Unterschied zwischen dem wäßrigen und dem DMSO/ Aceton-Aktivierungslevel in einfacher Weise eher dem erhöhten Wasser:Cellulose-Verhältnis zugeordnet werden, als daß die Reaktion durch organische Lösungsmittel verstärkt würde.

TABELLE 3 Aktivierungslevel mit Lösungsmittel- und Basen-Variationen

In Tabelle 3 wurde nicht-geeichtes Bromwasser, etwa 0,1 mmol/ml, verwendet. Die Resultate dieser Tabelle zeigen erneut eine gute Korrelation zu den Titrationsresultaten, die unter Verwendung von Mercaptopropionsäure erhalten wurden, wohingegen die Sulfonattitrations-Resultate weniger konsistent waren. Eine höhere Substitution kann durch Verwendung konzentrierter Natriumsulfat-Lösungen erzielt werden.

Beispiele für Sepharose-Aktivierung

Eine Reaktion von Sepharose 6B (10 g) mit 5 und 10 % Allylbromid führte zu (Mercaptopropionsäure) Titrationen von 0,088 und 0,139 mmol/g (1,60 und 1,97 mmol/g trocken). Von den Epoxid-Gruppen, die durch ECH (enthalten zur Vernetzung von Sepharose) eingeführt worden waren, wurde nicht erwartet, daß sie signifikant zum Aktivierungslevel beitragen. Das Verhältnis von ECH:Allylbromid war niedrig und die Mehrheit der Epoxid-Gruppen sollte unter verwendeten Aktivierungsbedingungen umgesetzt werden. Eine Reaktion von Sepharose CL6B (10 g) mit 6 % Allybromid produzierte auch eine hochgradig aktivierte Matrix (1,42 mmol/g trocken).

Bevorzugte Bedingungen für eine wäßrige Aktivierung von Perloza

Für anschließende Allylbromid-Aktivierungen war eine wäßrige Solvatisierung Standard, Um ein optimales Mischen durch "äußere" Verfahren (z.B. eher ein Rotationsrührer als ein Paddelrührer) bereitzustellen, waren 4 bis 5 ml NaOH-Lösung pro 10 g Cellulose erforderlich. Dies produzierte eine freifließende Aufschlämmung. Daher wurde eher die Molarität als das Volumen der NaOH-Lösung für unterschiedliche Allylbromid-Verhältnisse variiert. Eine ähnliche Aktivierung (0,163-0,169 mmol/g) Perloza (10 g) mit 0,7 ml Allylbromid wurde unter Verwendung von 3 ml 3 M NaOH oder 4,5 m 2 M NaOH (+/– 1,5 ml DMSO) erhalten. Von einer Aktivierung unter Verwendung von 3 M NaOH wurde erwartet, daß sie ein höheres Resultat liefert, allerdings war das Mischen nicht zufriedenstellend. Wenn 1,5 ml DMSO zur Verbesserung des Vermischens enthalten waren, wurde ein höherer Aktivierungslevel erhalten (0,199 mmol/g). Ein viel höherer Level (0,11 mmol/g) wurde erhalten, wenn ein etwas größerer Anteil (5 ml) an 2 M NaOH verwendet wurde. Beim 10 g (Cellulose)-Reaktionslevel erhöhte sich eine typische Aktivierung um 0,023 bis 0,025 mmol/g für jede Prozentwerterhöhung an Allylbromid. Etwas höhere Level wurden beim 100 bis 400 g-Reaktionslevel festgestellt. Diese Resultate sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. In Tabelle 4 wurden 10 g Cellulose verwendet, wenn nichts anderes unter "Reaktionsgemisch" angegeben ist.

TABELLE 4 Titrationswerte für verschiedene Allylbromid% und 10 bis 700 g Cellulose-Ansätze
B. Allylglycidylether-Aktivierungsresultate

Allylglycidylether wurde zu Beginn mit Perloza, das mit 0,3 M NaOH in Analogie zu der optimalen Hydroxid-Konzentration, die von Sundberg und Porath4 für die Bisepoxid-Aktivierung beschrieben worden war, solvatisiert war, umgesetzt. Reaktionsgemische wurden als dicke Suspensionen hergestellt, indem Allylglycidylether mit unter Saugen getrockneter (NaOH-solvatisierter) Cellulose vermischt wurde. Die Standardmenge an Allylglycidylether, die verwendet wurde, war 0,3 ml/g (30 %). Nach 5 Stunden war die Reaktion bei 60°C vollständig. Die Titration mit (nicht getestetem) Bromwasser von 1,7 ml/g für unter Saugen getrocknetem Perloza war nach einer weiteren 19-stündigen Reaktion unverändert. Leicht höhere Aktivierungslevel wurden bei 40°C (1,8 ml/g nach 24 Stunden) und Raumtemperatur (1,5 und 2 ml/g bei 24 und 48 Stunden) unter Verwendung derselben Bromwasser-Lösung erhalten. Der 48-Stunden-Raumtemperatur-Aktivierungslevel war 0,183 mmol/g (unter Verwendung getesteten Bromwassers). Diese aktivierte Cellulose hatte ein ähnliches Naßgewicht wie die ursprüngliche Cellulose. Es wurde daher angenommen, daß das gequollene Matrixvolumen durch Aktivierung nicht signifikant verändert wurde.

Ein Vergleich der Aktivierungslevel für 10 %, 20 % und 40 % Allylglycidylether-Gemische zeigte eine geringere Wirksamkeit der Reagensverwendung wenn der verwendete der Prozentgehalt erhöht war (Tabelle 5). Allerdings wurde ein sehr hoher Aktivierungslevel (0,315 mmol/g im Bromwasserassay) durch wiederholte Aktivierung unter Verwendung von 30 % Allylglycidylether erhalten.

TABELLE 5 AGE % gegenüber Aktivierungslevel

Die Effizienz einer Allylglycidylether (15 %)-Aktivierung (72 Stunden bei Raumtemperatur) wurde für Perloza (10 g), das mit 0,3 M NaOH oder einem 50:50 DMSO/0,3 M NaOH-Gemisch solvatisiert war, verglichen. Die Reaktion erfolgte für 72 Stunden bei Raumtemperatur. Die Aktivierungslevel (Mercaptopropionsäure-Titration) waren 0,109 bzw. 0,194 mmol/g. Der höhere Aktivierungslevel wurde einer niedrigeren Hydrolyserate zugeschrieben. Die Aktivierungsrate wurde für eine 33%ige Aceton-solvatisierte Suspension, eine 15 % Allylglycidylether-Aufschlämmung und eine wäßrige solvatisierte 12 % Suspension verglichen. Die entsprechenden Titrationen nach 96 Stunden waren 1,05 und 0,703 mmol/g trocken. Es wurde keine Erhöhung des Aktivierungslevels nach 48 Stunden für das wäßrige Verfahren gefunden, allerdings erforderten die 33 % Aceton-Matrices 72 Stunden für eine vollständige Reaktion. Diese Resultate sind in Tabelle 6 zusammengefaßt.

TABELLE 6 MPA-Titrationen für variierende AGE-Reaktionszeit und Solvation

Ohne eine Bindung an irgendeine Theorie eingehen zu wollen, wird davon ausgegangen, daß die Verwendung von Aceton oder DMSO die "Fluidität" des Reaktionsgemisches verbessert, was ein effizientes Mischen durch Drehen oder Schütteln ermöglicht. Es wurden zusätzlich 0,3 M NaOH (2 ml pro 8 g Perloza) für ein entsprechendes Mischen von 100 % wäßrigen Proben benötigt. Eine 48-stündige Aktivierung durch dieses Verfahren mit 15 % Allylglycidylether resultierte in einem Aktivierungslevel von 0,113 mmol/g. Ein Stamm-Allylglycidylether (27 %) wurde durch dieses wäßrige Aufschlämmungsverfahren hergestellt, indem 15 % Allylglycidylether, gefolgt von einem zweiten Aktivierungsschritt mit 12 % Allylglycidylether, verwendet wurden. Der Aktivierungslevel war 0,153 mmol/g.

BEISPIEL 3 – Titrationsverfahren

Das Ausmaß eines Allyl-Einbaus in die Matrix wurde ursprünglich unter Verwendung einer 2 % Brom-Wasser-Titration quantitativ bestimmt und anschließend wurde eine Mercaptosäure-Titration der Allyl-Gruppen eingeführt.

A. Bromwasser-Titration von Matrix-Allylgruppen

Die Bromwasser-Titration erfolgte durch steigende Zugabe (unter Verwendung von 100 &mgr;l-, 200 &mgr;l- oder 1 ml-Gilson-Pipetten) geeichten (etwa 2 %) Bromwassers zu einer 0,5 bis 2 g-Probe aktivierter Matrix. Die kleinsten Zugaben (50 &mgr;l) wurden verwendet, sobald der Grad der Brom-Entfärbung langsam erkennbar wurde, üblicherweise nach 60 bis 75 % der Gesamtzugabe. Der Endpunkt wurde visuell bestimmt. Die Titration war üblicherweise in 2 bis 5 Minuten beendet.

Bromwasser wurde nach zwei Verfahren geeicht:

  • I) Bromwasser mit 1,5 bis 2,5 (% wurde möglichst genau hergestellt, indem Brom (1,5 bis 2,5 g) in einen (100 ml) Meßkolben abgewogen wurde und das Volumen mit Wasser (schnell) auf 100 ml gebracht wurde. Die Molarität des Bromwassers wurde unter der Annahme errechnet, daß die Anfangs-Br2-Konzentration zur Zeit der Titration aufrechterhalten wurde (kein Verdampfungsverlust).
  • (II) Bromwasser mit einem ähnlichen Konzentrationsbereich wie im vorherigen Verfahren wurde als Stammlösung hergestellt und unmittelbar vor Verwendung getestet. Bromwasser (0,5 ml) wurde mit Wasser auf 25 ml verdünnt und seine Extinktion wurde bei 410 nm gemessen. Der Brom-Gehalt wurde durch Vergleich mit den Werten von Standards, die frisch durch das Verfahren (I) hergestellt worden waren errechnet.

Eine Reiche von Verdünnungen einer 2%igen Bromwasser-Stammlösung (1:99, 2:98, 3:97, 4:96 und 5:95) hatten Extinktionen von 0,154, 0,327, 0,500, 0,698 bzw. 0,910. Bis zu 0,5 wurde eine vernünftige lineare Zunahme bei der Extinktion festgestellt. Daher wurden Messungen unter Anwendung einer geeigneten Verdünnung auf diesen Bereich beschränkt. Die Extinktion eines frisch hergestellten Bromwassers bei 410 nm war 0,117 für eine 0,014%ige Lösung und 0,305 für eine 0,036%ige Lösung. Diese Werte werden gleichgesetzt: Extinktion (x Verdünnung) x 0,12 = Bromwasser . Diese Umwandlung wurde für die anschließende quantitative Bromierungstitration" verwendet. Die Bromwasser-Quantifizierung wurde durch Verwendung des spektralphotometrischen Assays für das Bromwasser unmittelbar vor der Titration verbessert. Diese Bromwassertitration war immer noch weniger als ideal für einen Routinelaborassay, und zwar wegen der Genauigkeitsgrenzen und schädlicher Dämpfe, die mit einer Verwendung von Bromwasser verbunden sind.

B. Mercaptosäure-Titration von Allyl-Gruppen

Aktivierte Matrix (1 g) wurde mit 100 &mgr;l Mercaptoessigsäure (MAA) oder Mercaptopropionsäure (MPA) und 1 bis 5 ml Wasser vermischt. Das Gemisch wurde für 4 bis 16 Stunden bei 60°C oder für 24 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur (nur MAA) inkubiert. Proben wurden in einen Flasfiltertrichter transferiert und überschüssiges Reagens wurde mit 20 ml Wasser, 20 ml 0,1 M NaOH und 10 × 20 ml Wasser ausgewaschen. Eine Titration von Carbonsäure-Gruppen lieferte den Level des Allyl-Einbaus in die Matrix.

Eine quantitative Allygruppenbestimmung mittels dieser unterschiedlichen Verfahren ist in Tabelle 1 oben erläutert.

In den folgenden Beispielen 7 und 10 wurden alle Proben mit dem Mercaptoessigsäure-Verfahren "zurücktitriert". Proben vor Addition und Proben nach Addition wurden mit Mercaptoessigsäure titriert. Der Additionslevel wurde durch die Differenz bestimmt (Mercaptoessigsäure-Titration vor Addition – Titration nach Addition).

In den Beispielen unten bezeichnen Allyl-Perloza und Allylglycidylether-Perloza Wasser-solvatisiertes, unter Wirkung von Saugen getrocknetes Perloza, wenn nichts anderes angegeben ist.

Die Beispiel 4 bis 10 demonstrieren eine leichte Bindung eines weiten Bereichs von Thiolen und Bisulfid-Ionen an Allyl-Matrices durch spezifische freie Radikaladdition, wodurch es möglich wird, einen weiten Bereich unterschiedlicher Liganden an diese Matrices zu binden, welche wiederum für eine einfache Zielverbindungsabtrennung sorgen. Im Gegensatz zu Verfahren des Standes der Technik wurde außerdem die Spezifität der freien Radikaladdition durch Abwesenheit einer Reaktion mit einem Amin (Ethanolamin) unter diesen Bedingungen bewiesen.

BEISPIEL 4 – Mercaptopropionsäure- und Mercaptoessigsäure-Additionsverfahren an die Allyl-Gruppen

Eine Anfangsaddition von Mercaptopropionsäure an Allyl-Perloza (wie oben hergestellt) verwendete 75 &mgr;l/g nasser Matrix und enthielt 2,5 mg Ammoniumpersulfat. Nachfolgende Zugaben verwendeten 100 &mgr;l/g. Die Reaktion erfolgte für 3 bis 4 Stunden bei 60°C. Variationen waren Raumtemperaturreaktion für 16 Stunden, Einschluß von 4-Methoxyphenol (20 mg) und Ausschluß von Ammoniumpersulfat. Eine Reaktion bei 60°C für mindestens 4 Stunden ohne Ammoniumpersulfat wurde als Standardverfahren eingeführt. Wasser (1 bis 5 ml) war enthalten, um ein adäquates Vermischen sicherzustellen.

Dieselben Reagenzproportionen und Reaktionsbedingungen waren für die Mercaptoessigsäure-Zugabe Standard. Getestete Variationen waren Reagenzproportion (30 und 60 &mgr;l/g), Raumtemperatur (24 oder 48 Stunden) und pH-Einstellung auf 6.

Nicht-modifiziertes Perloza wurde ebenfalls mit Mercaptopropionsäure und Mercaptoessigsäure durch dieses Verfahren umgesetzt und diente als Kontrolle.

Resultate

Eine Reaktion von Mercaptopropionsäure (100 &mgr;l) mit 30 % Allylglycidylether-Perloza (1 g) bei 60°C für 4 Stunden mit katalytischem Ammonium persulfat (2 g) resultierte in einem Zugabelevel von 0,198 mmol/g. Dasselbe Allylglycidylether-aktivierte Perloza, das mit Bromwasser umgesetzt wurde, worauf eine Substitution mit Natriumsulfit folgte, lieferte eine Titration von 0,177 mmol/g. Eine Zugabe bei 60°C war ohne Ammoniumpersulfat ähnlich wirksam (0,186 mmol/g), wurde aber durch 20 mg 4-Methoxyphenol (0,044 mmol/g) stark inhibiert. Eine 16-Stunden-Zugabe bei Raumtemperatur führte zu einem Zwischentitrationswert (0,136 mmol/g). Es wurden keine Anstrengungen unternommen, um Sauerstoff aus dem Reaktionsgemisch auszuschließen, und es wurde angenommen, daß Licht, gelöster Sauerstoff und/oder Spurenmengen an Peroxiden die Reaktion wirksam initiierten, und zwar ohne daß gesonderter Katalysator benötigt wurde. Daher wurden für nachfolgende Mercaptosäure-Zugaben keine Peroxid-Katalysatoren eingesetzt. Der inhibitorische Effekt von 4-Methoxyphenol war ein Hinweis für den angenommen Radikalmechanismus. Die Resultate sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.

In Tabelle 7 wurde Allylglycidylether (30 %)-Perloza, außer für die Kontrollprobe (Perloza + MPA), verwendet. MPA war der verwendete Ligand, wenn nichts anderes angegeben ist. Der freie Radikal-Inhibitor, der verwendet wurde, war Methoxyphenol. Die Effizienz wurde durch Korrektur um den Kontrolltitrationswert und den Vergleich mit dem "möglichen" Additionslevel, der mit MAA gefunden wird (umgesetzt bei 60°C für 4 Stunden, ohne Katalysator), berechnet.

TABELLE 7 Effekte von Temperatur, Katalysator und Inhibitor auf Mercaptosäure-Addition

Mercaptopropionsäure- oder Mercaptoessigsäure-Addition (60°C) an nicht-modifiziertes Perloza lieferte eine Titration von 0,004 mmol/g, was die Notwendigkeit für Allyl-Gruppen für die Reaktion beweist. Die kleine erhaltene Titration könnte durch eine Kombination von Verunreinigungen, Verdünnungseffekten, geladenen Gruppen an Original-Perloza und Spurenmengen von Aldehyd an der Matrix, die eine nukleophile Addition des Thiols durchmachen könnten (McMurray18), erklärt werden. Die Titration von unmodifiziertem Perloza lieferte einen ähnlichen Wert (0,005 mmol/g), was nahelegt, daß die geringen Konzentrationen geladener Gruppen nicht auf die Reaktion von nicht-modifizierten Perloza mit Mercaptopropionsäure zurückzuführen war.

Ein 5-molarer Überschuß oder noch mehr wurde für eine quantitative Mercaptoessigsäure-Addition als vorteilhaft angesehen und Raumtemperatur war für eine vollständige Reaktion ausreichend.

Eine Addition (bei 60°C) von Mercaptoessigsäure wurde auch unter Verwendung von 30 % Allylglycidylether-Perloza bewiesen. Die Titration von 0,204 mmol/g war sogar noch höher als die mit Mercaptopropionsäure erreichte, was eine überlegene Reaktivität und/oder eine vollständigere Titration durch pH 8 nahelegt. Die Titration zeigt, daß in 1 M NaCl der pKa-Wert von Mercaptoessigsäure-Perloza deutlich niedriger war als die von Mercaptopropionsäure-Perloza (3,9 im Vergleich zu 4,9). Oberhalt pH 7 titriert allerdings kein Harz merklich. Es wurde daher eine ausgezeichnete Reaktivität angenommen und Mercaptoessigsäure ersetzte die Mercaptopropionsäure-Addition für eine Allylgruppen-Titration.

Äquivalente einer Addition zu einer Allylglycidylether-Perloza-Probe wurden für ein 48-stündige Reaktion bei Raumtemperatur und eine Reaktion bei 60°C für 4 Stunden (beide 0,135 mmol/g) festgestellt. Der Additionslevel an eine andere Allylglycidylether-Matrix war 0,191 mmol/g nach 24 Stunden bei Raumtemperatur (im Vergleich zu 0,194 mmol/g bei 60°C). Die verwendete Standardmenge an Mercaptoessigsäure war 100 &mgr;l/g Allyl-Perloza. Dies stellt einen 5 molaren Überschuß oder mehr gegenüber Allyl-Gruppe für aktivierte Matrizes mit 0,28 mmol/g oder weniger dar. Eine Addition geringerer Mengen an die stärker aktivierte Allylglycidylether-Matrix führte zu Titrationen von 0,119 mmol/g (2 molarer Überschuß an Mercaptoessigsäure) und 0,184 mmol/g (4 molarer Überschuß). Diese Level wurden 61 bzw. 95 % der Standardtitration gleichgesetzt. Daher wurde ein 5 molarer Überschuß oder höher für eine quantitative Mercaptoessigsäure-Addition als vorteilhaft angesehen und Raumtemperatur war für eine vollständige Reaktion ausreichend).

BEISPIEL 5 – Verfahren für die Mercaptobernsteinsäure-Addition an die Allyl-Gruppen

Nach den oben aufgeführten Verfahren wurde Mercaptobernsteinsäure mit Allyl-Perloza (hergestellt wie oben) und Wasser (1:1) für 16 Stunden bei 60°C oder für 64 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Mercaptobernsteinsäure (0,15 g/g Matrix) wurde im Reaktionsgemisch gelöst.

Addition von Mercaptobernsteinsäure (0,15 g) an eine Allylglycidylether-Matrix (0,134 mmol/g, 1 g) führte zu einer Titration von 0,189 mäq/g bis pH 10. Da Mercaptobernsteinsäure zwei Carboxyl-Gruppe hat, entsprach dies 0,095 mmol/g. Das Mercaptobernsteinsäureharz wurde zu einem höheren pH titriert als das Mercaptoessigsäureharz, das schien, daß eine Titration bei pH auftrat. Verdünnungseffekte waren für den pH 10-Endpunkt unbedeutend. Der scheinbare Additionslevel von Mercaptobernsteinsäure war etwa 70 % des Möglichen (Mercaptoessigsäure-Level).

Die Effizienz der Mercaptobernsteinsäure-Additon wurde durch Reaktion bei Raumtemperatur für 60 Stunden verbessert. 7 % Allylbromnid-aktiviertes Vorratsperloza (Mercaptoessigsäure-Titration 0,174/g) wurde verwendet. Der Titrationswert für Mercaptobernsteinsäure war bis pH 8 0,313 mäq/g (0,157 mmol/g, 90 %). Obgleich die Thiol-Gruppe von Mercaptobernsteinsäure sekundär ist (sterische Beschränkung wahrscheinlicher) wurde auf diese Weise ein sehr hoher Additionslevel erreicht. Im Gegensatz zu früheren Resultaten wurde nicht festgestallt, daß sich der Titrationswert über pH 8 signifikant erhöht (0,317 mäq/g bis pH 9). Das Mercaptobernsteinsäure-Derivat könnte zur Ionenaustauschchromatographie verwendet werden. Spezifische ionische Wechselwirkungen können mit der Dicarbonsäure-Gruppierung erfolgen.

BEISPIEL 6 – Additionen von anderen Mercaptosäuren an die Allyl-Gruppen

Nach den oben ausgeführten Verfahren, allerdings mit den unten beschriebenen Modifikationen, wurden Glutathion, Mercaptobuttersäure, Thiosalicylsäure und Mercaptohexansäure an Allyl-Perloza, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, gekoppelt.

Spezifischer ausgedrückt, Glutathion (freie Säureform) wurde unter denselben Bedingungen umgesetzt, allerdings wurden 0,2 g/g Matrix verwendet. Glutathion wurde ebenfalls mit Perloza (bei 60°C) umgesetzt, wobei 0,2 M H3PO4 anstelle von Wasser verwendet wurde.

Mercaptohexansäure (0,2 ml), Mercaptobuttersäure (0,5 g) und Thiosalicylsäure (0,2 ml) wurden mit Allyl-Perloza (1 g) für 48 Stunden bei 60°C umgesetzt. Ethanol (1 ml) wurde zur Erleichterung der Auflösung der Liganden eingeschlossen.

Eine signifikante Addition von Glutathion (0,2 g) an eine Allylglycidylether-Matrix (1 g, 0,134 mmol/g) wurde auch durch Reaktion bei 60°C für 16 Stunden erreicht. Die Titration von 0,115 mmol/g bis pH 7 zeigte, daß, obgleich eine Addition auftrat, diese weniger effizient war als eine Mercaptopropionsäure- oder Mercaptoessigsäure-Addition. Allerdings war der verwendete molare Überschuß an Glutathion geringer als für die anderen Thiole.

Eine Addition von Glutathion an eine andere Allylglycidylether-Matrix resultierte in einer Titration von 0,098 mmol/g bis pH 8 und 0,203 mmol/g bis pH 11 (Mercaptoessigsäure-Titration 0,135 mmol/g). Dieses Glutathionharz wurde durch Addition der reduzierten freien Form von Glutathion hergestellt. Eine Addition von Glutathion in verdünnter Phosphorsäure führte zu einem viel niedrigerem Titrationswert (0,046 mmol/g bis pH 11). Für Glutathionharze wird angenommen, daß eine Titration bis pH 7 eine Carboxyl-Gruppe pro immobilisiertem Glutathion darstellen würde. Eine Titration bis pH 11 würde auch die Amino-Gruppe von Glutathion umfassen. Dies führt zu der Annahme, daß die zweite Carboxyl-Gruppe von Glutathion mit der Amino-Gruppe in Carboxylationenform zu Beginn der Titration assoziiert wäre. Unter Berücksichtigung von Verdünnungseffekten (eine Blindtitration bis pH 11 war 0,017 mmol/g) bei Titration zwischen pH 10 und 11 wurde ein Additionslevel von 0,093 mmol/g (70 % Mercaptoessigsäure) errechnet.

Die Effizienz der Glutathion-Addition wurde durch Reaktion bei Raumtemperatur für 60 Stunden verbessert. 7 % Allylbromid-aktiviertes Ausgangsmaterial-Perloza (Mercaptoessigsäure-Titration 0,174/g) wurde verwendet. Die Titration für das Glutathionharz war 0,136 und 0,300 mäq/g bis pH 7 bzw. 11. Der Additionslevel wurde nach Substraktion des Blindprobentitrationswerts als 0,142 mmol/g /(82 %) errechnet. Die hohe Effizienz der Glutathion-Addition bei Raumtemperatur legt nahe, daß dieses Verfahren zur Immobilisierung von anderen Thiol-enthaltenden Peptiden und möglicherweise Proteinen ohne die Notwendigkeit einer erhöhten Temperatur verwendet werden könnte. Eine freie Radikaladdition von Glutathion stellt ein sehr einfaches Verfahren zur Produktion von Glutathion-Affinitätsharzen dar. Nichtumgesetzte Allyl-Gruppen werden in einfacher Weise unter Verwendung von Mercaptoethanol blockiert.

Der Additionslevel von Glutathion könnte erhöht werden, wenn ein höherer molarer Überschuß (als 3) verwendet würde.

Nach einer 48-Stunden-Reaktion bei 60°C (Titration 0,002 mmol/g) wurde kein Beweis für eine Addition von Thiosalicylsäure (0,2 ml/g Allyl-Perloza) erhalten. Eine Addition von Mercaptobuttersäure (0,5 g) und speziell Mercaptohexansäure (0,2 ml) war weniger effizient als die von Mercaptopropionsäure und Mercaptoessigsäure, trotz einer 96-stündigen Reaktion bei 60°C. Die Titrationswerte waren 0,131 bzw. 0,026 mmol/g (MMA-Titration war 0,180 mmol/g für dasselbe Harz).

Zu dem Grad, in dem sich ein Thioligand nicht an eine ethylenische Unsättigung, für die eine Allyl-Gruppe ein Beispiel ist, addiert, ist er kein reaktiver Thiol-Ligand zu Zwecken der vorliegenden Erfindung.

Daten für die Beispiele 5 und 6 werden in der folgenden Tabelle 8 angegeben:

TABELLE 8 Effizienz von MSA- und Glutathion-Additon im Vergleich zu MAA

Der leicht niedrigere Additionslevel von Glutathion und Mercaptobernsteinsäure im Vergleich zu Mercaptoessigsäure könnte auf der Inhibierung durch die Amin-Gruppe (GSH), einer größeren Ionisierung der Disäure-Liganden (im Vergleich zu Mercaptoessigsäure), sterischen Effekten oder einfach schlechterer Reaktivität basieren. Der Additionslevel von Glutathion könnte auch erhöht werden, wenn ein höherer molarer Überschuß (als 3) verwendet würde.

BEISPIEL 7 – Verfahren zur Mercaptoethanol- und Dithiothreitol-Addition an die Allyl-Gruppen

Nach den oben ausgeführten Verfahren wurden Mercaptoethanol und Dithiothreitol an das Allyl-Perloza, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, gekoppelt.

Eine Addition von Mercaptoethanol (100 &mgr;l) wurde in spezifischer Weise bei 60°C (16 Stunden) oder Raumtemperatur (24 oder 48 Stunden) durchgeführt.

Eine Dithiotheritol-Addition wurde durchgeführt, indem Allyl-Perloza (2 g, 0,16 mmol/g) mit einem 4-molaren Überschuß (0,17 g) Dithiothreitol für 48 Stunden bei Raumtemperatur gemischt wurde.

Das Mercaptoessigsäure-Rücktitrationsresultat für die Dithiothreitol-Addition war 0,062 mmol/g, was etwa 0,1 mmol/g Dithiotheritol, das an das Harz gebunden ist, entspricht.

Die Addition von 2-Mercaptoethanol (100 &mgr;l) an Allylglycidyletheraktiviertes Perloza (1 g) (Mercaptoessigsäure-Titration 0,144 mmol/g) bei 60°C (16 Stunden) war anscheinend quantitativ. Die 2-Mercaptoethanol-Addition an ein anderes Allylglycidylether-Perloza (Mercaptoessigsäure-Titration 0,191 mmol/g; 1,35 mmol/g trocken) bei Raumtemperatur (24 Stunden) war in gleichem Maße effektiv, was eine vollständige Reaktion von Allyl-Gruppen (mit Mercaptoethanol) anzeigt. Die "Rück"-Titration beider Harze mit Mercaptoessigsäure war 0,001 mmol/g. Die Schwefel-Elementaranalyse der zuletztgenannten Probe ergab 4,45 % (1,39 mmol/g trocken), was in Übereinstimmung mit der durch Titration für das Mercaptoessisäure-Derivat erhaltenen Figur steht; die 2-Mercaptoethanol-Addition bei Raumtemperatur stellt somit einfaches und wirksames Verfahren zur Blockierung nicht-umgesetzter Allyl-Gruppen nach Addition eines anderen Liganden dar (Bereitstellung der anderen Liganden-Gruppen verursacht keine sterische Beschränkung).

BEISPIEL 8 – Verfahren zur Addition von Cystein, Cysteamin und MEP an die Allyl-Gruppen

Die ersten Additionsreaktionen verwendeten ungepuffertes Cysteinhydrochlorid. Die Reaktion wurde für 16 Stunden bei 60°C unter Verwendung von Allylglycidylether-aktivierten Perloza (1 g), 0,08 g Cystein·HCl und 5 ml Wasser durchgeführt. Anschließend wurden Cystein (5 molarer Überschuß, +/– 50 &mgr;l Ameisensäure) anstelle seines Hydrochlorids verwendet. Anstelle von Ameisensäure wurden Trichloressigsäure, Oxalsäure oder Essigsäure verwendet (1 mol/mol Cystein). Essigsäure und Ameisensäure wurden auch in größeren Mengen (5 oder 10 Moläquivalente) verwendet. Cysteamin- und 4-Mercaptoethylpyridinhydrochlorid (5 molarer Überschuß) wurden mit 1 Moläquivalent (7,5 M) NaOH neutralisiert und mit einem 2 bis 5 molaren Überschuß einer organischen Säure wieder angesäuert. Für die anfänglichen Additionsreaktionen wurden Essigsäure verwendet und die Lösungen wurden mit Allylglycidylether-Perloza für 16 Stunden bei 60°C umgesetzt. Diese werden als Cysteamin/Acetat- und 4-Mercaptoethylpyridin/Acetat-Additionsgemische bezeichnet. Ameisensäure wurde für anschießende Additionen (Cysteamin/ Formiat- und 4-Mercaptoethylpyridin/Formiat-Gemische) verwendet.

Die anfängliche Addition von Cysteamin/Formiat (5 molarer Überschuß) an 7 % Allylbromid-aktiviertes Ausgangsmaterial-Perloza erfolgte 48 Stunden bei 60°C +/– Ammoniumpersulfat (2,5 mg) oder Benzoylperoxid (3,6 mg). Eine weitere (nicht-katalysierte) Probe wurde für 96 Stunden bei 60°C umgesetzt. Ähnliche Additionen (zu 10 % Allylbromid-Stamm-Perloza) wurden für 24, 48, 96 und 144 Stunden bei 70 bis 75°C unter Verwendung eines 10 molaren Überschusses an Cysteamin/Formiat durchgeführt. Allyl-Perloza (6 % Allylbromid-Ausgangsmaterial) wurde entsprechend mit Cysteamin/Formiat umgesetzt. Eine Kontrollprobe aus 10 % Allylbromid-Perloza-Ausgangsmaterial und Cysteamin·HCl wurde für 144 Stunden bei 70°C umgesetzt. Dieselbe Temperatur wurde zur Addition (96 Stunden) eines 10-molaren Überschusses von Cystein/ Ameisensäure an 10 %-Allylbromid-Perloza-Ausgangsmaterial (1,7 g) verwendet. Kontrollreaktionen (96 Stunden, 60°C) mit Allyl-Perloza verwendeten Ethanolamin (+/– 1 Moläquivalent Ameisensäure). Es wurde auch eine Kontrollreaktion unter Verwendung von nicht-modifizierten Perloza und Cysteamin/Formiat durchgeführt.

Zusätzlich zu den obigen Reaktionen, die bei 60-70°C durchgeführt wurden, wurde eine Addition von MEP, Cystein und Cysteamin auch unter Verwendung einer "Heiz"-Lampe (Tungsram 250 Watt, Infrasatin IR 2) durchgeführt, wobei diese nicht der ideale Katalysator für Radikalreaktionen (bezüglich der Wellenlänge) ist und daher als milde Katalyse angesehen wird. Spezifischer ausgedrückt, Mercaptoethylpyridin (MEP)-Hydrochlorid (MEP, 0,52 g) wurde in 0,5 ml Wasser gelöst und mit 0,3 ml 10 M NaOH und 0,6 ml Eisessig vermischt. Die MEP-Acetat-Lösung wurde mit 3 g Allyl-Perloza (0,203 mmol/g, 1,45 mmol/g trocken) in einem 30 ml-Becher vermischt, mit Kunststoffolie dicht verschlossen und für 3 Stunden bestrahlt (Lampe bei 15 bis 20 cm von oben). Es trat ein Erwärmen des Reaktionsgemisches auf, es wurde aber geschätzt, daß dies zwischen 30 und 40°C lag. Das resultierende Harz einen Pyridyl-Titrationslevel von 0,24 mmol/g (1,36 mmol/g trocken).

Resultate

Die Addition von Cystein·HCl (0,08 g) an eine Allylglycidylether-Perloza-Matrix (1 g) wurde limitiert (0,013 mmol/g, Mercaptoessigsäure-Titration 0,134 mmol/g), wobei Bedingungen (16 Stunden, 60°C) angewendet wurden, die für die vorstehend beschriebenen Thiole wirksam waren. Ein noch niedrigerer Additionslevel wurde für Cysteamin·HCl (0,006 mmol/g) (ein 5 molarer Überschuß, 0,12 g) bei einer anderen Allylglycidylether-Perloza-Probe (1 g) (Mercaptoessigsäure-Titration 0,204 mmol/g) gefunden. Da die Addition von Glutathion in Gegenwart von Phosphorsäure begrenzt war, wurden Cystein·HCl durch Cystein (5 molarer Überschuß, 0,1 g), das mit oder ohne molares Überschuß an Ameisensäure verwendet wurde, ersetzt. Die Addition in Gegenwart von Ameisensäure war erfolgreicher (0,063 im Vergleich zu 0,012 mmol/g). Eine Cysteamin/Ameisensäure-Addition resultierte in einer Titration von 0,035 mmol/g bei einer anderen Allylglycidylether-Matrix (0,082 mmol/g bei Mercaptoessigsäure-Titration). Ameisensäure wurde ohne signifikante Veränderung (0,033 mmol/g) durch Essigsäure ersetzt, aber TCA und Oxalsäure waren weniger wirksam (0,025 und 0,007 mmol/g). Diese Resultate könnten einen Effekt der Säurestärke anzeigen, da die letzteren stärkere Säuren sind (als Ameisensäure und Essigsäure). Eine Oxalsäure-Zersetzung in Wasser und ihrer zweite Carboxyl-Gruppe könnte eine negative Wirkung auf die Reaktion haben. Ein geringer Unterschied resultierte aus der Verwendung eines ein- oder zehnmolaren Überschusses am Ameisensäure oder Essigsäure (Bereich von 0,033 bis 0,035 mmol/g). Eine wiederholte Addition bei 60°C erhöhte den Titrationslevel auf 0,055 mmol/g, wohingegen eine Addition bei Raumtemperatur keine Erhöhung bei der Titration lieferte. Ähnliche Resultate wurden unter Verwendung von Cysteamin/Acetat (Titration 0,032 mmol/g) (einfache Addition) und 4-Mercaptoethylpyridin/Acetat (0,043 mmol/g) erzielt.

Eine Reaktion von Cysteamin/Formiat mit Allylbromid-Perloza (0,180 mmol/g Mercaptoessigsäure-Titration) für 48 Stunden bei 60°C lieferte höhere Resultate, allerdings wurden diese durch Einschluß von Ammoniumpersulfat oder Benzoylperoxid nicht erhöht (Tabelle 9). Die Titration einer nicht-katalysierten Probe, die für 96 Stunden bei derselben Temperatur umgesetzt worden war, war 0,103 mmol/g. Eine Grenze für die Addition (0,128 mmol/g) wurden bei einem hochaktivierten Allylbromid-Perloza (Mercaptoessigsäure-Titration, 0,249 mmol/g) nach einer verlängerten (96 Stunden) Reaktion mit Cysteamin/Formiat bei 70°C festgestellt. Weitere Titrationen waren 0,054, 0,098 und 0,129 mmol/g nach 24, 48 bzw. 144 Stunden. Eine geringe Zunahme wurde festgestellt, als die Reaktion mit frischen Cysteamin/Formiat (0,135 mmol/g) wiederholt wurde. Allerdings könnte dieser Additionslevel durch Verwendung kleinerer Reaktionsvolumina verbessert werden. Eine Verwendung von Cysteamin·HCl (keine Ameisensäure) lieferte ein viel niedrigeres Resultat. Die Addition von Cystein (10 molarer Überschuß)/ Ameisensäure bei 70°C lieferte ein ähnliches Resultat (0,114 mmol/g) mit Cysteamin. Die Addition von Cysteamin/Ameisensäure zu einem geringer substituiertem Allylbromidharz (0,139 mmol/g Mercaptoessigsäure-Titration) ergab eine Titration von 0,110 mmol/g (79 % Effizienz). Diese Resultate sind in Tabelle 9 zusammengefaßt,

In Tabelle 9 bezieht sich Cysteamin auf Cysteamin/Formiat-Gemische, außer bei einer Probe, die Cysteamin·HCl verwendet. 7 % Allylbromid-Perloza-Ausgangsmaterial wurde für Cysteamin-Additionen bei 60°C, 10 % Allylbromid-Perloza wurde für eine Addition bei 70°C verwendet, wenn nichts anderes angegeben ist.

TABELLE 9 Additionslevel für Cysteamin und Cystein an Allyl-Perloza

Obgleich eine Addition von Cystein und Cysteamin auftrat, war ihre Reaktivität viel schlechter als die eines anderen Amin-enthaltenden Liganden, Glutathion. Ohne eine Bindung an eine Theorie eingehen zu wollen wird betont, daß Glutation einen Überschuß an sauren gegenüber Amin-Gruppen hat (verwendete Lösungen hatten einen pH von 2) und daß der Stickstoff, das der Thiol-Gruppe am nächsten ist, Teil einer neutralen Amid-Bindung ist.

Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung von Cysteamin·HCl anstelle von MEP durchgeführt. Der Amin-Titrationslevel war 0,134 mmol/g (1,04 mmol/g trocken). Eine entsprechende Reaktion von MEP-Hydrochlorid ohne NaOH/Essigsäure ergab keine Addition. Der pH der Lösung ohne Acetatpuffer liegt unter 2. Keine Addition wurde für Thiole, die direkt an den aromatischen Ring gebunden sind (Mercaptobenzimidazol und 4-Mercaptopyridin) oder für Propylmercaptan unter Verwendung des Acetat-gepufferten "Bestrahlungs"-Verfahrens festgestellt. Nach diesem Verfahren war eine Addition von Cystein (0,12 g), vermischt mit Wasser (1 ml) und Ameisensäure (0,2 ml), an Allyl-Perloza (0,054 mmol/g, 4 g) erfolgreich. Der titrierte Additionslevel war 0,053 mmol/g (nach Korrektur für eine Blindprobentitration bis pH 11).

Obgleich eine Reaktion von Ameisensäure mit Doppelbindungen beschrieben wurde (Knight es al.19) gibt es aus der beobachteten Titration keinen Zweifel, daß Amin-Gruppen an Perloza gebunden wurden. Es wurde kein Beweis für eine Reaktion zwischen Allyl-Perloza und Amin-Gruppen unter Verwendung von Ethanolamin +/– Ameisensäure (60°C, 96 Stunden) oder zwischen Cysteamin/Formiat und nicht-modifiziertem Perloza gefunden. Die Titrationswerte waren alle 0,001 mmol/g und der Ausgangs-pH variierte zwischen 4,88 und 4,96. Die entsprechende Titration für eine Cysteamin/Formiat-Addition an Allyl-Perloza war 0,080 mmol/g und der Ausgangs-pH war 10,20. Für die Addition waren sowohl Ligandenthiolgruppen als auch Matrixallylgruppen notwendig. Eine freie Radikaladdition eines Amins an Allyl-Gruppen wurde nicht erwartet (Cadogan und Perkins20) und die Resultate mit Ethanolamin unterstützen dies. Die Wirkung von Ameisensäure/Essigsäure kann katalytisch sein oder in einer "Masierung" von Amin-Gruppen begründet sein.

Für diese Experimente wurden einfache Katalyseverfahren ohne Versuche, Sauerstoff auszuschließen, angewendet. Unter diesen Bedingungen wurde für eine Verwendung chemischer Katalysatoren kein Vorteil erkannt. Reaktionstemperaturen über 70°C können die Reaktionsausbeuten verbessern. Es wird davon ausgegangen, daß bessere Resultate durch Verwendung einer geeigneteren Strahlungskatalyse erzielt werden. Obgleich diese Reaktionen viel weniger effizient als die von Mercaptoethanol und Mercaptosäuren sind, sind sie speziell mit überlegenen katalytischen Techniken wirtschaftlich lebensfähig. Die Reaktionsspezifität durch die Thiol-Gruppe ist gegenüber herkömmlichen Verfahren einer Thiol-Anheftung ein Vorteil.

BEISPIEL 9 – Verfahren zur Addition von Thiolessigsäure und Thiophenol an die Allyl-Gruppen

Allylglycidylether-aktiviertes Perloza wurde mit Thiolessigsäure (100 &mgr;l) und 5 ml Wasser für 24 Stunden bei Raumtemperatur oder 16 Stunden bei 60°C umgesetzt. Eine andere Reaktion bei Raumtemperatur verwendete eine Solvatation mit Ethanol anstatt mit Wasser. Das Allylglycidylether-aktivierte Perloza wurde mit je 5 Volumina 50 % und 100 % Ethanol gewaschen, unter Absaugen getrocknet und mit Thiolessigsäure und 5 ml Ethanol vermischt. Mit Wasser solvatisiertes Allylbromid-Perloza (7 % Ausgangsmaterial) wurde zur Addition von Thiolessigsäure (0,2 ml) zusammen mit je 2 ml Wasser und Ethanol für 90 Stunden bei Raumtemperatur verwendet.

Thiophenol (0,2 ml) wurde mit 7 % Allylbromid-Perloza-Ausgangsmaterial (1 g), 2 ml Wasser und 3 ml Aceton oder Ethanol für 90 Stunden bei Raumtemperatur vermischt. Thiolacetatharze wurden mit 20 Volumina Wasser gewaschen.

Thiophenolharze wurden mit je 20 Volumina Ethanol, 0,1 M NaOH und Wasser gewaschen. Nicht-umgesetzte Allyl-Gruppen wurden durch Mercaptoessigsäure-"Rück"-Titration bestimmt.

Resultate

Resultate mit Thiolessigsäure (100 &mgr;l) zeigten, daß eine gewisse Reaktion aufgetreten war, daß sie aber kurz vor der Vollendung war. Eine Analyse durch "Rück"-Titration mit Mercaptoessigsäure, die den Thiolester hydrolysieren kann und/oder die Thiol-Gruppe oxidieren kann, wurde durchgeführt. Die Rücktitrationen wäßriger Reaktionsproben waren 0,105 (60°C) und 0,112 (Raumtemperatur) mmol/g im Vergleich zu der ursprünglichen Mercaptoessigsäure-Titration von 0,135 mmol/g. Dies entsprach 0,029 und 0,23 mmol/g Thiolacetat-Gruppen. Ein ähnliches Resultat wurde für eine Addition mit einem Ethanol/Wassergemisch (0,023 mmol/g Thioacetat) erhalten. Kein Vorteil wurde unter Verwendung einer 100 % Ethanol-Solvatation erzielt. Diese niedrigen Additionslevel können auf der hohen Azidität von Thioessigsäure (der pH einer 1%igen Lösung war 1,95) basieren, der durch eine Lösungsmittelverwendung entgegengewirkt werden könnte. Stärkere katalytische Maßnahmen könnten erforderlich sein.

Es tritt offensichtlich eine Addition von Thiophenol an 7 % Allyl-Perloza auf, obgleich dies nur 20 bis 25 % des möglichen (MAA)-Levels war. Die Rücktitrationen waren 0,137 und 0,128 mmol/g für Aceton- bzw. Ethanolsolvatisierte Proben. Die ursprüngliche Mercaptoessigsäure-Titration war 0,174 mmol/g, daher waren die Thiophenol-Additionslevel 0,037 und 0,046 mmol/g. Außerdem ist es möglich, daß die Anwendung einer ultravioletten Strahlung und ähnlicher Verfahren die Additionseffizienz von Thiophenol an Allyl-Perloza verstärken kann.

BEISPIEL 10 – Affinitätschromatographie unter Verwendung von Harzen, die Thiol-Liganden enthalten

Mercaptoessigsäure-Perloza (0,054 mmol/g, 3 g), hergestellt durch Mercaptoessigsäure-Addition an 2 % Allyl-Perloza (hergestellt wie oben aus Allylbromid), wurde mit Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid (EDC, 0,15 g), p-Aminobenzamidindihydrochlorid (0,15 g) bei einem pH, der auf 4,7 eingestellt war für 24. Stunden umgesetzt (pH-Kontrolle für die ersten 2 Stunden). Frisches EDC (0,1 g) wurde zugesetzt und die Reaktion wurde wiederholt. Dieses Harz wurde zur Affinitätschromatographie von rohem Trypsin (Typ II, Sigma Chemical Co.), wie von Hixson et al., Arch. Biochem. Biophys., 154:501-509 (1973) beschrieben, verwendet. Eine typische starke Adsorption wurde bei pH 8,2 (+/– 0,5 M NaCl) und Elution bei pH 2,5 (50 mM Ameisensäure) festgestellt. Eine signifikante Reinigung wurde erzielt was durch Entfernung von Material, das bei 280 nm absorbiert, in der Beladung und Waschflüssigkeiten mit hoher Ionenstärke und elektrophoretische Reinheit (Äquivalent-Typ IX-Trpysin) bestimmt wurde.

BEISPIEL 11 – Chromatographie unter Verwendung von Harzen, die Thiol-Liganden enthalten

Mercaptoethylpyridin (MEP)-Perloza, das wie oben hergestellt worden war (mit einer normalen Pyridyl-Titrationskurve, Anfangs-pH 6,8) wurde nach dem Verfahren von Burton et al.1 zur Adsorption von rohem Subtilisin und Amylase und Elution durch pH-Änderung verwendet. Beide Enzyme wurden bei pH 7,5 (20 mM HEPES + 0,5 M NaCl) aufgebracht und bei pH 5,2 (20 mM Acetat) eluiert.

Die chromatographischen Eigenschaften waren von denen der MEP-Harze, die durch Allyl-Aktivierung, Bromierung und nukleophile Substitution produziert wurden, nicht zu unterscheiden.

Obgleich die vorstehende Erfindung in gewissem Detail durch Erläuterung und Beispiele zu Zwecken der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, wird es klar sein, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angefügten Ansprüche vorgenommen werden können.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Herstellung von Chromatographieharzen, die eine feste Trägermatrix umfassen, welche Liganden, die zur Bindung einer Zielverbindung fähig sind, kovalent daran über eine Verbindungsgruppe, die Sulfid-, Sulfoxid- oder Sulfonfunktionalität umfaßt, gebunden hat, wobei das Verfahren umfaßt:

    (a) Bereitstellen einer Trägermatrix, die ethylenisch ungesättigte Funktionalität daran gebunden umfaßt, die ein terminales Olefin hat, welches eine Allyl-Gruppe ist;

    (b) Inkontaktbringen der Matrix von (a) oben mit einer reaktiven Diol-Verbindung der Formel R-SH unter freien Radikalbedingungen, die ausreichen, um für eine kovalente -SR-Bindung an die Matrix zu sorgen, wobei R ein Ligand ist, der zur Bindung einer Zielverbindung fähig ist; und

    (c) fakultativ Oxidieren der Sulfidbindung zu einem Sulfoxid oder Sulfon.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Matrix ein anorganischer fester Träger ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der anorganische feste Träger aus der Gruppe bestehend Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und Zeolithen ausgewählt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Matrix ein organischer fester Träger ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der organische feste Träger aus der Gruppe bestehend aus Cellulose, Agarose, Dextran, Polyacrylaten, Polystyrol und Polyacrylamid ausgewählt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Allyl-Gruppe von einer reaktiven Allyl-Gruppe stammt, die aus der Gruppe bestehend aus Allyhalogenid und Allylglycidylether ausgewählt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ligand über eine Sulfidbindung kovalent an die Matrix gebunden ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ligand durch eine Sulfoxidbindung kovalent an die Matrix gebunden ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ligand durch eine Sulfonbindung kovalent an die Matrix gebunden ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ligand eine oder mehrere funktionelle Gruppen umfaßt, die aus der Gruppe bestehend aus Amino-, Hydrocarbylamino-, Dihydrocarbylamino-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Sulfat-, Phosphat-, Heteroaryl- und Carbamidin-Funktionalität ausgewählt werden.
Es folgen 3 Blatt Zeichnungen






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