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Dokumentenidentifikation DE69827500T2 20.10.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001005536
Titel MIKROBIELLE XYLOGLUKANENDOTRANSGLYKOSILASE (XET)
Anmelder Novozymes A/S, Bagsvaerd, DK
Erfinder NIELSEN, Illum, Ruby, DK-3520 Farum, DK
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Bardehle, Pagenberg, Dost, Altenburg, Geissler, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69827500
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 26.02.1998
EP-Aktenzeichen 989040241
WO-Anmeldetag 26.02.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/DK98/00076
WO-Veröffentlichungsnummer 0098038288
WO-Veröffentlichungsdatum 03.09.1998
EP-Offenlegungsdatum 07.06.2000
EP date of grant 10.11.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 20.10.2005
IPC-Hauptklasse C12N 9/10
IPC-Nebenklasse C12N 9/24   C12N 9/42   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft mikrobielle Xyloglucanendotransglycosylasen (XETs) und ihre Herstellung und Verwendungen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Xyloglucanendotransglycosylase (XET) ist ein von Pflanzen bekanntes Enzym. XET aus Mikroorganismen wurde nach unserem besten Wissen noch nie beschrieben.

Stephen C. Fry et al. weisen in Biochem. J (1992) 282, S. 821–828 darauf hin, dass XET für das Abschneiden und Wiederverbinden von intermikrofibrillären Xyloglucanketten verantwortlich ist und XET folglich die zur Pflanzenzellvermehrung erforderliche Wandauflockerung verursacht.

XET wurde zur Verwendung beim Regulieren der Morphologie einer Pflanze empfohlen (siehe EP 562 836, Seite 21. 27–28).

Man nimmt an, dass XET in allen Pflanzen, insbesondere in allen Anbaupflanzen vorliegt. XET wurde aus Dicotyledonen, Monocotyledonen, insbesondere Grasmonocotyledonen und Lilienmonocotyledonen und auch aus Moos und einem Leberblümchen extrahiert, zur Bezugnahme siehe Biochem. J (1992) 282, S. 823.

In der gleichzeitig abhängigen Patentanmeldung PCT/DK 96/00538 (WO 97/23683) zeigten wir, dass ein Zellulosematerial nach Behandlung mit einem XET-Enzym verbesserte Stärkeeigenschaften und/oder verbesserte Formbeibehaltungseigenschaften und/oder verbesserte Antischrumpfeigenschaften erhalten kann.

Das XET-Enzym weist einige sehr interessante Anwendungen auf, so dass es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, mikrobiell abgeleitete Xyloglucanendotransglycosylasen bereitzustellen, die z. B. für die vorstehend beschriebenen Anwendungen nützlich sind. Die mikrobiell abgeleiteten Xyloglucanendotransglycosylasen würden den großen Vorteil dahingehend aufweisen, dass sie leicht in großen Mengen hergestellt werden könnten.

KURZE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Es wurde durch einen Screeningtest gefunden, dass XET-Aktivität durch eine überwältigende Anordnung von phylogenetisch verteilten Mikroorganismen hergestellt werden kann.

Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung ein Xyloglucanendotransglycosylasen-Präparat, umfassend eine XET von einem Mikroorganimus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus i) Pilzen und ii) Bacillusspezies; insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung:

ein Verfahren zur Herstellung eines Xyloglucanendotransglycosylaseenzyms (XET), umfassend

  • (a) Züchten eines Mikroorganismus, umfassend eine XFT von einem Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus i) Pilzen und ii) Bazillusspezies, der eine mikrobielle XET unter Bedingungen, die die Herstellung des XET-Enzyms leiten, exprimiert in einem geeigneten Nährmedium und
  • (b) Gewinnen des XET-Enzyms aus dem Nährmedium.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des XET-Präparats der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Zellulosematerial und mikrobielle XET-Präparate als solche.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in welchen

1 die pH-Profile der XET-Aktivität von Dichotomocladium hesseltinei, Tiarosporella phaseolina und Pseudoplectiania nigrella (&Dgr;: Tiarosporella phaseolina; ☐: Pseudoplectania nigrella; und ♦: Dichotomocladium hesseltinei), erhalten gemäß Beispiel 5 zeigt,

2 die pH-Profile der Xyloglucanaseaktivität von Dichotomocladium hesseltinei, Tiarosporella phaseolina und Pseudoplectania nigrella (&Dgr;: Tiarosporella phaseolina; ☐: Pseudoplectania nigrella; und ♦: Dichotomocladium hesseltinei), erhalten gemäß Beispiel 5 zeigt.

DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Xyloglucanendotransglycosylasepräparat, umfassend eine XET von einem Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus i) Pilzen und ii) Bazillusspezies.

Es zeigte sich in der vorliegenden Anmeldung, dass XET durch Pilze und Bazillusspezies hergestellt werden kann, und es wird erwogen, dass XET auch durch Hefen hergestellt werden kann.

Ein „XET-Papier" wurde zum Identifizieren von XET herstellenden Mikroorganismen verwendet. Das „XET-Papier" ist in der gleichzeitig abhängigen Patentanmeldung PCT/GB96/02351 (WO 97/11193) beschrieben; wobei es sich um ein mit Xyloglucan beschichtetes Papier handelt, das mit einem markierten Oligosaccharid getränkt ist.

Das markierte Oligosaccharid, das mit Xyloglucan imprägnierte Papier und der Punkt-Tupfen-Test für XET-Aktivität wurden in der folgenden Weise hergestellt:

Herstellung von markiertem Oligosaccharid

Das reduzierende Oligosaccharid 4-O-[4-O-[4-O-[6-O-&agr;-D-Xylopyranosyl-&bgr;-D-glycopyranosyl]-6-O-(2-O-&bgr;-D-galactopyranosyl)-&agr;-D-xylopyranosyl-&bgr;-D-glucopyranosyl]-6-O-(2-O-&bgr;-D-galactopyranosyl)-&agr;-D-xylopyranosyl-&bgr;-D-glucopyranosyl]-D-glucose („XLLG") (1 Gramm) wird in 25 ml einer gesättigten, wässrigen Lösung von Ammoniumhydrogencarbonat, enthaltend 1 Gramm Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH3), gelöst und im Dunklen bei 25°C für eine Dauer von 7 Tagen inkubiert, um eine reduktive Aminierung zu erlauben. Das Ammoniumhydrogencarbonat wird dann durch Trocknen entfernt und das (ninhydrinreaktive) aminierte Derivat von XLLG z. B. durch Gelpermeationschromatographie oder Kationenaustauschchromatographie gereinigt. Es ist anzunehmen, dass es sich bei dem Produkt um ein Oligosaccharidyl-1-amino-1-deoxyalditol, d. h. ein Derivat von XLLG handelt, in welchem die reduzierende terminale D-Glukoseeinheit durch 1-Amino-1-deoxy-D-glucitol ersetzt wurde.

Das Oligosaccharidyl-1-amino-1-deoxyalditol (50 mg) wird in 3 ml 3%igem Borax (Dinatriumtetraborat; pH=9,0–9,5) gelöst, und eine frisch hergestellte Lösung von 10 mg Lissaminrhodaminsulfonylchlorid [vertrieben von Molecular Probes Inc., USA] in 0,75 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) wird stufenweise unter Rühren zugesetzt und das Gemisch im Dunklen über Nacht inkubiert. Weitere 0,75 ml DMF, enthaltend 10 mg Lissaminrhodaminsulphonylchlorid, werden zugesetzt und das Gemisch wird für eine weitere Dauer von 8 Stunden inkubiert. Das leuchtend pinkfarbene Oligosaccharidyl-1-amino-1-deoxyalditol-Lissaminrhodamin-Konjugat (XLLGol-SR) wird durch Gelpermeationschromatographie, gefolgt von Umkehrphasenchromatographie über einer C18-Silicagelsäule gereinigt. Nach Waschen von letzterer Säule mit Wasser wird ein Methanolgradient aufgebracht, und das XLLGol-SR eluiert in etwa 50% Methanol.

Herstellung von mit Xyloglucan imprägniertem Papier

Ein Filterpapier des Typs Whatman Nr. 1 wird mit einer 1%igen, wässrigen Lösung von Xyloglucan befeuchtet und getrocknet. Das XLLGol-SR-Präparat wird in ausreichendem 75%igem wässrigem Aceton verdünnt, um eine Absorption bei 580 nm (A580) von 0,2 zu erhalten; das mit Xyloglucan beschichtete Blatt des Papiers des Typs Whatman Nr. 1 wird dann mit dieser Lösung getränkt und wieder getrocknet; das Produkt wird als „XET-Papier" bezeichnet. Geeignet bemessene Stücke (z. B. 72 × 108 mm) des XET-Papiers können dann mit einem nichtwässrigen Klebstoff auf ein nicht-absorbierendes Medium wie ein Blatt aus transparentem Acetat geklebt werden.

Punkt-Tupfen-Test für XET-Aktivität
  • i) Ein Tupfen der auf XET-Aktivität zu testenden Lösung wird auf eine markierte Position auf einem Stück XET-Papier pipettiert. Betragen die Tupfen 4 &mgr;l, kann der Abstand zwischen den Proben günstigerweise 9 mm (Mittelpunkt zu Mittelpunkt, das heißt in einem Standardtestplattenformat mit 96 Mulden) betragen.
  • ii) Das XET-Papier wird dann schnell (bevor die Tupfen getrocknet sind) zwischen zwei Kunststoffblätter (z. B. wie auf Overheadprojektoren verwendete Acetatblätter) geklemmt und z. B. bei 20°C für eine Dauer von 1 Stunde inkubiert.
  • iii) Das inkubierte XET-Papier und sein Kunststoffträger wird dann (mit der Papierseite nach unten) in eine Platte, enthaltend etwa 150 ml eines Lösungsmittels [z. B. frisch hergestelltes Ethanol/Ameisensäure/Wasser (1:1:1 in Bezug auf das Volumen)], gegeben, dass das nicht umgesetzte XLLGol-SR jedoch kein in das Xyloglucan infolge der XET-katalysierten Transglycosylierung eingebrachtes XLLGol-SR entfernt. Das Papier löst sich nun leicht vom Kunststoffträger ab.
  • iv) Das Papier wird dann für eine Dauer von 5 Minuten in Leitungswasser, dann für eine Dauer von 5 Minuten in etwa 100 ml Aceton gespült und dann gründlich getrocknet. Falls gewünscht, kann das Trocknen durch eine 5-minütige Behandlung in einem Ofen bei 80°C beschleunigt werden.
  • v) Das Papier wird dann unter einer Kurzwellenultraviolettlampe (z. B. emittierend bei 254 nm, ein geeigneter Augen- und Hautschutz sollte getragen werden) untersucht. Aktive XET wird dann durch einen pinkfarbigen (orange fluoreszierenden) Tupfen angezeigt, der z. B. durch die Verwendung eines Abtastspektrofluorimeters quantitativ bestimmt werden kann.
XET-Enzyme

Wir entdeckten, dass es sich bei mikrobiellen Enzyme mit XET-Aktivität entweder um Transglycosylasen handeln können (was bedeutet, dass ihnen Hydrolaseaktivität feht oder sie nur eine sehr geringe Hydrolaseaktivität aufweisen) oder sie sowohl Transglycosylierung als auch Hydrolyse von Xyloglucan katalysieren können.

XET-Enzyme mit sowohl transglycosylierenden als auch hydrolytischen Aktivitäten sind ebenso für von Pflanzen erhaltene XET-Enzyme beschrieben (siehe Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1995.46: Seite 509).

Taxonomische Klassifizierung

Die hier verwendete taxonomische Klassifizierung stützt sich primär auf das System, das in der NIH-Datenbank (Entrez, Version Spring 1996), erhältlich im World Wide Web: (http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX) verwendet wird.

In Bezug auf die Klassifizierung von in der Entrez-Datenbank nicht eingeschlossenen Organismen wurden die folgenden allgemein verfügbaren und weltweit akzeptierten Nachschlagewerke verwendet:

  • Für Ascomycetes: Eriksson, O.E. & Hawksworth, D.L.: Systema Ascomycetum Band 12 (1993).
  • Für Basidiomycetes, Jülich, W.: Higher Taxa of Basidiomycetes, Bibliotheca Mycologia 85, S. 485 (1981).
  • Für Zygomycetes: O'Donnell, K.: Zygomycetes in culture, University of Georgia, US, S. 257 (1979).

Allgemeine mycologische Referenzbücher:

  • Hawksworth, D.L., Kirk, P.M., Sutton, B.C. und Pegler, D.N.: Dictionary of the fungi, International Mycological Institute, S. 616 (1995);
  • Von Arx, J.A.: The genera of fungi sporulating in culture, S. 424 (1981).

Bevorzugte Pilze

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das XET-Präparat durch Züchten eines Pilzes, insbesondere eines Pilzes, der zu einem Basidiomycota-, Zygomycota-, Ascomycota-Pilz oder einem mitosporischen Pilz gehört, hergestellt.

Bei einem bevorzugten Basidiomycota-Stamm handelt es sich um einen Hymenomycetes-Stamm, der zu den Ordnungen Coriolales, Schizophyllales, Stereales oder Xenasmatales gehört, insbesondere einen Stamm, der zu einer der Familien Coriolaceae, Corticiaceae, Schizophyllaceae, Stereaceae oder Tubulicrinaceae gehört. Bei einer bevorzugten Gattung handelt es sich um eine der folgenden: Trametes, Corticium, Schizophyllum oder Tubulicrinis. Bei einer bevorzugten Spezies handelt es sich um eine der folgenden: Trametes hirsuta, Corticium roseum, Schizophyllum sp, Stereum hirsutum oder Tubulicrinis subulatus.

Bei bevorzugten Ascomycota handelt es sich um Stämme, die zu den Klassen Loculoascomycetes, Discomycetes, Pyrenomycetes und Plectomycetes gehören, vorzugsweise diejenigen, die zu den Ordnungen Dothidaeles, Rhytismatales, Pezizales, Leotiales, Xylariales, Hypocreales, Halosphaeriales, Phyllachorales, Diaporthales und Eurotiales gehören.

Bei bevorzugten Stämmen handelt es sich um Stämme, die zu den Familien Botryosphaeriaceae, Dothioraceae, Mycosphaerellaceae, Tubeufiaceae, Pleosporaceae, Leptosphaeriaceae, Rhytismataceae, Sarcosomataceae, Pyronemataceae, Ascoboloaceae, Sclerotiniaceae, Amphisphaeriaceae, Xylariaceae, Hypocreaceae, Halosphaeriaceae, Phyllachoraceae, Valseceae, Melanconidaceae und Trichocomataceae gehören; insbesondere die zu der Gattung Diplodia, Plowrightia, Phyllosticta, Septoria, Tubeufia, Alternaria, Coniothyrium, Phoma, Embellisia, Tiarioporella, Galiella, Pseudoplectania, Pyronema, Oedocephalum, Botrytis, Aposphaeria, Pestalotia, Pestalotiopsis, Poronia, Nodulisporium, Xylaria, Fusarium, Verticillium, Volutella, Chaetapiospora, Lulworthia, Colletotrichum, Cytospora, Discula, Phomospsis, Coryneum, Seimatosporioum, Aspergillus, Eurotium, Eupenicillium, Penicillium, Petromyces und Talaromyces gehören.

Bevorzugt sind die Spezies Diplodia gossypina, Plowrightia ribesia, Phyllosticta sp, Septoria sp, Tubeufia amazonensis, Alternaria sp, Embellisia hyacinthi, Phoma neoloba, Phoma tropica, Coniothyrium sp, Coniotlryrium olivaceoum, Coniothyrium dunckii, Tiarosporella phaseolina, Tiarosporella sp, Galiella celebica, Pseudoplectania nigrella, Pyronema domesticum, Oedocephalum sp, Botrytis cinerea, Aposphaeria sp, Pestalotia sp, Pestalotiopsis sp, Poronia punctata, Xylaria sp, Nodulisporium sp, Fusarium solani, Verticillium sp, Volutella buxi, Chaetapiospora rhododendri, Lulworthia uniseptata, Colletotrichum aculatum, Colletotrichum crassipes, Cytospora spp, Discula sp, Phomospsis ilicis, Phomopsis cirsii, Coryneum castaneicola, Seimatosporium lichenicola, Aspergillus tamarii, Eurotium chevalierei, Eupenicillium javanicum, Penicillium capsulatum, Penicillium olsonii, Penicillium pinophilum, Penicillium roqueforti, Penicillium italicum, Penicillium canascens, Penicillium verruculosum, Petromyces alliaceus und Talaromyces flavus.

Beispiele für nützliche Zygomycota sind Stämme, die zu der Ordnung Mucorales gehören, vorzugsweise Stämme, die zu den Familien Chaetocladiaceae und Mucoraceae gehören.

Bevorzugte Stämme gehören zu der Gattung Dichotomocladium, Actinomucor, Gongronella, Sporodiniella und Mucor, insbesondere Dichotomocladium hesseltinei, Actinomucor elegans, Gongronellla butleri, Sporodiniella umbellata und Mucor miehei var minor.

Ein Beispiel für einen Stamm von unbestimmter Taxonomie ist Vialaea insculpta.

Beispiele für Stämme, die zu den mitosporischen Pilzen gehören, sind Acrodontium crateriforme, Aureobasidium pullulans, Circinotrichum sp, Cryptocline sp, Ellisiopsis sp, Epicoccum nugrum, Gliocladium sp, Helicorhoidion irregulare, Hendersonia spp, Mariannaea sp, Microphaeropsis sp, Ramularia sp, Sarcopodium sp, Spadicoides sto, Speiropsis pedatospora, Sporotrichum exile, Stilbella sp, Trichothecium sp, Trimmatostroma abietes, Tubakia dryina, Wiesneriomyces sp und Zygosporium masonii.

Bevorzugte Bakterien

In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein neues XET-Präparat, das durch Züchten eines zur Gattung Bacillus gehörenden Stamms herstellbar ist.

Bevorzugte Stämme

Die folgenden Stämme wurden als XET-positiv befunden:

  • 1. Dichotomocladium hesseltinei. Zug.-Nr des Stamms: CBS 164.61. Klassifizierung: Zygomycota, Mucorales, Chaetocladiaceae.
  • 2. Actinomucor elegans. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 154.86. Klassifizierung: Zygomycota, Mucorales, Chaetocladiaceae.
  • 3. Mucor miehei var minor. Zug.-Nr des Stamms: ATCC 36018. Klassifizierung: Zygomycota, Mucorales, Mucoraceae.
  • 4. Gongronella butleri. Ein Stamm von Gongronella butleri wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 448.97 hinterlegt. Klassifizierung: Zygomycota, Mucorales, Chaetocladiaceae.
  • 5. Sporodiniella umbellata. Zug.-Nr des Stamms: CBS 195.77. Klassifizierung: Zygomycota, Mucorales, Mucoraceae.
  • 6. Phyllosticta sp. isoliert von einem Blatt von Pithecolobium sp aus China. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Mycosphaellaceae.
  • 7. Septoria sp. Ein Stamm von Septoria sp wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 2. Januar 1996 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 831.95 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Mycosphaellaceae.
  • 8. Diplodia gossypina. Ein Stamm von Diplodia gossypina wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 12. März 1996 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 274.96 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Botrysphaeriaceae.
  • 9. Plowrightia ribesia. Isoliert von Ribes sp., Dänemark. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Dothioraceae.
  • 10. Tubeufia amozonensis. Zug.-Nr des Stamms: ATCC 42524. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes. Dothidiales, Tubeufiaceae.
  • 11. Alternaria sp. Klassifizierung: Ascomycota, Loculociscomycetes, Dothidiales, Pleosporaceae.
  • 12. Embellisia hyacinthi. Zug.-Nr des Spezies IMI 211561. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Pleosporaceae.
  • 13. Phoma neoloba. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Pleosporaceae.
  • 14. Phoma tropica. Beispiel für eine Zug.-Nr der Spezies CBS 537.66. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Pleosporaceae.
  • 15. Coniothyrium sp. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Leptosphaeriaceae
  • 16. Coniothyrium olivaceoum. Beispiel für eine Zug.-Nr der Spezies: CBS 304.68. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Leptosphaeriaceae
  • 17. Coniothyrium dunckii. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Leptosphaeriaceae.
  • 18. Tiarosporella phaseolina. Ein Stamm von Tiarosporella phaseolina (Macrophomina sp) wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 446.97 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Rhytismatales, Rhytismataceae.
  • 19. Tiarosporella sp. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Rhytismatales, Rhytismataceae.
  • 20. Galiella celebica. Isoliert aus einer Probe, gesammelt in Japan. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Pezizales, Sarcosomataceae.
  • 21. Pseudoplectania nigrella. Ein Stamm von Pseudoplectania nigrella wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 444.97 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Pezizales, Sarcosomataceae.
  • 22. Pyronema domesticum. isoliert aus einer Probe von Norwegen. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Pezizales, Pyronemataceae.
  • 23. Oedocephalum sp. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Pezizales, Ascobolaceae.
  • 24. Botrytris cinerea. Ein Stamm von Botytris cinerea wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 447.97 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Leotiales, Sclerotiniaceae.
  • 25. Aposphaeria sp. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Leotiales, Sclerotiniaceae.
  • 26. Pestalotia sp. Ein Stamm von Pestalotia sp. wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 445.97 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Xylariales, Amphisphaeriaceae.
  • 27. Pestalotiopsis sp. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Xylariales, Amphisphaeriaceae.
  • 28. Poronia punctata. Isoliert aus einer Probe von Schweden. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Xylariales, Xylariaceae.
  • 29. Xylaria sp. isoliert aus einem Blatt der Palme, Sabal jamaicensis, die in Mona, Jamaica wächst. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Xylariales, Xylariaceae Xylariaceae.
  • 30. Nodulisporium sp. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Xylariales, Xylariaceae.
  • 31. Fusarium solani. Isoliert aus einer Probe von Maiskorn von Indien. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales, Hypocreaceae.
  • 32. Verticillizcm sp. Ein Stamm von Verticillium sp. wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 2. Januar 1996 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 830.95 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales, Hypocreaceae.
  • 33. Volutella buxi. Zug.-Nr des Stamms: IMI 049467. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales, Hypocreaceae.
  • 34. Chaetapiospora rhododendri. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Xylariales, Xylariaceae, Hyponectriaceae.
  • 35. Lulworthia uniseptata. Ein Stamm von Lusworthia uniseptata wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 442.97 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Halosphaeriales, Halosphaeriaceae.
  • 36. Colletotrichum aculatum. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Phyllachorales, Phyllachoraceae.
  • 37. Colletotrichum crassipes. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Phyllachorales, Phyllachoraceae.
  • 38. Cytospora sp. Ein Stamm von Cytospora sp. wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 23. Januar 1997 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 424.97 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Diaporthales, Valsaceae.
  • 39. Cytospora sp. Ein Stamm von Cytospora sp. wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 23. Januar 1997 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 425.97 hinterlegt. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Diaporthales, Valsaceae.
  • 40. Discula sp. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Diaporthales, Valsaceae.
  • 41. Phomopsis ilicis. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Diaporthales, Valsaceae.
  • 42. Phomopsis cirsii. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Diaporthales, Valsaceae.
  • 43. Coryneum castaneicola. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Diaporthales, Melanconidaceae.
  • 44. Seimatosporium lichenicola. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Diaporthales, Melanconidaceae.
  • 45. Aspergillus tamarii. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 821.72. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 46. Eurotium chevalieri. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 472.91. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 47. Penicillium capsulatum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 273.86. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 48. Penicillium olsonii. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 523.89. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 49. Penicillium pinophilum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 440.89. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 50. Penicillium roqueforti. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 167.91. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 51. Penicillium italicum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: IMI 078 681. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 52. Penicillium canescens. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 579.70. Isoliert von einer Salzmine in Ägypten. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 53. Eupenicillium javanicum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 448.74. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 54. Penicillium verruculosum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms: CBS 563.92. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 55. Talaromyces f1avus. Zug.-Nr des Stamms: ATCC 52201. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 56. Petromyces alliaceus. Zug.-Nr des Stamms: CBS 511.69. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
  • 57. Trametes hirsuta. Isoliert aus einer Probe, gesammelt in Dänemark. Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Coriolales, Coriolaceae.
  • 58. Schizophyllum sp. Ein Stamm von Schizophyllum sp. wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 443.97 hinterlegt. Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Schizophyllales, Schizophyllaceae.
  • 59. Corticium roseum. Isoliert aus einer Probe, gesammelt in Dänemark. Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Aleurodiscales, Cortiaceae.
  • 60. Tubulicrinis subulatus. Isoliert aus einer Probe, gesammelt in Dänemark. Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Xenasmatales, Tubulicrinaceae.
  • 61. Stereum hirsutum. Isoliert aus einer Probe, gesammelt in Dänemark. Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Stereales, Stereaceae.
  • 62. Acrodontium crateriforme. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 63. Aureobasidizim pullulans. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 64. Circinotrichum sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 65. Cryptocline sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 66. Ellisiopsis sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 67. Epicoccum nigrum. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 68. Gliocladium sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 69. Helicorhoidion irregulare. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 70. Hendersonia sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 71. Mariannaea sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 72. Micropsphaeropsis sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 73. Ramularia sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 74. Sarcopodium sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 75. Spadicoides sto. Zug.-Nr des Stamms IMI 203428. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 76. Speiropsis pedatospora. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 77. Sporotrichum exile. Zug.-Nr des Stamms CBS 350.47. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 78. Stilbella sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 79. Trichothecium sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 80. Trimmatostroma abietes. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 81. Tubakia dryina. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 82. Wiesneriomyces sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 83. Zygosporium masonii. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
  • 84. Vialaea insculpta. Klassifizierung: ungewiss.
  • 85. Bacillus alcalophilus. Ein Stamm von Bacillus alcalophilus wurde gemäß dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren am 12. Februar 1997 in Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Zugangsnummer DSM 11404 hinterlegt.

Herstellung von XET

Das XET-Enzym der Erfindung kann durch aerobes Züchten der vorstehend erwähnten Mikrobenstämme auf einem geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium wie auf dem Fachgebiet bekannten Medien hergestellt werden.

In einer anderen Ausführungsform kann das XET-Enzym der Erfindung durch aerobes Züchten eines transformierten Wirtsmikroorganismus hergestellt werden, der die geeignete genetische Information z. B. von einem der vorstehend erwähnten Stämme enthält. Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Xyloglucanendotransglycosylaseenzyms (XET) umfassend:

  • a) Züchten in einem geeigneten Nährmedium eines Wirtsorganismus, wobei der Wirtsorganismus mit einer DNA-Sequenz, die eine XET von einem Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) Pilzen und ii) Bazillusspezies, kodiert, transformiert ist und der die mikrobielle XET unter die Herstellung des XET-Enzyms leitenden Bedingungen exprimiert; und
  • b) Wiedergewinnen des XET-Enzyms aus dem Nährmedium.

Solche Transformanten können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt und gezüchtet werden:

Klonen einer XET kodierenden DNA-Sequenz

Die ein XET-Enzym der Erfindung kodierende DNA-Sequenz kann von einem beliebigen die fragliche XET herstellenden Mikroorganismus unter Verwendung von verschiedenen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert werden.

Zuerst sollte eine Genom-DNA- und/oder cDNA-Genbank unter Verwendung von Chromosomen-DNA oder Messenger-RNA von dem die zu untersuchende XET herstelltenden Organismus konstruiert werden. Dann können, wenn die Aminosäuresequenz der XET bekannt ist, homologe markierte Oligonukleotidsonden synthetisiert und zum Indentifizieren der XET kodierenden Klone von einer von dem fraglichen Organismus hergestellten Genomgenbank oder cDNA verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform könnte eine markierte Oligonukleotidsonde, enthaltend zu einem bekannten XET-Gen homologe Sequenzen als Sonde zum Identifizieren von XET-kodierenden Klonen unter Verwendung von Hybridisierungs- und Waschbedingungen von geringerer Strenge verwendet werden.

Noch ein anderes Verfahren zum Identifizieren von XET-kodierenden Klonen beinhaltet das Einfügen von Genom-DNA- oder cDNA-Fragmenten in einen Expressionsvektor wie ein Plasmid, Transformieren eines XET-negativen Wirtsorganismus mit der erhaltenen DNA-Genbank, dann Auftragen der transformierten Zellen auf Agarplatten und Exprimieren lassen der Klone die zu identifizierende XET unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Versuchs.

In einer anderen Ausführungsform kann die das Enzym kodierende DNA-Sequenz durch etablierte Standardverfahren z. B. das Phosphoamiditverfahren, beschrieben von S.L. Beaucage und M.H. Caruthers in Tetrahedron Letters 22, 1981, S. 1859–1869, oder das Verfahren, beschrieben von Matthes et al. in The EMBO J. 3, 1984, S. 801–805, synthetisch hergestellt werden. Im Phosphoamiditverfahren werden Oligonukleotide z. B. in einer automatischen DNA-Syntheseapparatur synthetisiert, gereinigt, ausgehärtet, gebunden und in geeignete Vektoren geklont.

Schließlich kann die DNA-Sequenz vom gemischten genomischen und synthetischen Ursprung, gemischtem synthetischen und cDNA-Ursprung oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprung durch Binden von Fragmenten des synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie geeignet, wobei die Fragmente verschiedenen Teilen der gesamten DNA-Sequenz entsprechen) gemäß Standardtechniken hergestellt werden. Die DNA-Sequenz kann auch durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von spezifischen Primern z. B. wie in US 4,683,202 oder R.K. Saiki et al. in Science 239, 1988, S. 487–491 beschrieben, hergestellt werden.

Expression von XET

Erfindungsgemäß kann eine XET kodierende DNA-Sequenz, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren oder durch ein beliebiges alternatives auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren hergestellt ist, unter Verwendung eines Expressionsvektors, der typischerweise Steuerungssequenzen einschließt, die einen Promoter, einen Operator, eine Ribosombindungsstelle, ein Translationsinitiierungssignal und gegebenenfalls ein Repressorgen und verschiedene Aktivatorgene kodieren, in Enzymform exprimiert werden.

Bei dem rekombinanten Expressionsvektor, der die ein XET-Enzym der Erfindung kodierende DNA-Sequenz trägt, kann es sich um einen beliebigen Vektor handeln, der günstigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen wird, und die Wahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen ist. Folglich kann es sich bei dem Vektor um einen autonom replizierenden Vektor, z. B. einen als extrachromosomale Einheit vorliegenden Vektor, wobei dessen Replikation von der Chromosomenreplikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid, einen Bakteriophagen oder ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom handeln. In einer anderen Ausführungsform kann es sich bei dem Vektor um einen handeln, der beim Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert ist und zusammen mit dem(n) Chromosom(en), in welche er integriert wurde, repliziert.

Im Vektor sollte die DNA-Sequenz funktionsfähig an eine geeignete Promotersequenz gebunden sein. Bei dem Promoter kann es sich um eine beliebige DNA-Sequenz handeln, die transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Proteine entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle kodierenden Genen abgeleitet sein. Beispiele für geeignete Promoter zum Leiten der Transkription der eine XET der Erfindung kodierenden DNA-Sequenz insbesondere in einen Bakterienwirt, sind Promoter des lac operons von E. coli, die Agarasegen-dagA-Promoter von Streptomyces coelicolor, die Promoter des &agr;-Amylasegens (amyL) von Bacillus licheniformis, die Promoter des maltogenen Amylasegens (amyM) von Bacillus stearothermophilus, die Promoter der &agr;-Amylase (amyQ) von Bacillus Amyloliquefaciens, die Promoter der xylA- und xylB-Gene von Bacillus subtilis usw. Zur Transkription in einen Pilzwirt sind Beispiele für nützliche Promoter diejenigen, die von Genen abgeleitet sind, die TAKA-Amylase von A. oryzae, Aspartamproteinase von Rhizomucor miehei, neutrale &agr;-Amylase von A. niger, säurestabile &agr;-Amylase von A. niger, Glucoamylase von A. niger, Lipase von Rhizomucor miehei, alkalische Protease von A. oryzae, Triosephosphatisomerase von A. oryzae oder Acetamidase von A. nidulans kodieren.

Der Expressionsvektor der Erfindung kann auch einen geeigneten Transkriptionsterminator und in Eukaryoten funktionsfähig an die das XET-Enzym der Erfindung kodierenden DNA-Sequenz gebundene Polyadenylierungssequenzen umfassen. Terminierungs- und Polyadenylierungssequenzen können geeigneterweise von denselben Quellen wie der Promoter abgeleitet sein.

Der Vektor kann ferner eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, dass er in die fragliche Wirtszelle repliziert. Beispiele für solche Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.

Der Vektor kann auch eine selektierbare Markierung, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ergänzt, wie die dal-Gene von B. subtilis oder B. licheniformis, oder eine, die Anstibiotikumresistenz wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz verleiht, umfassen. Weiterhin kann der Vektor Aspergillus-Selektionsmarkierungen wie amdS, argB, niaD und sC umfassen, wobei eine Markierung eine Zunahme der Hygromycinresistenz bereitstellt, oder die Selektion kann durch eine wie z. B. in WO 91/17243 beschriebene Kotransformation erzielt werden.

Während eine intrazelluläre Expression in einigen Gesichtspunkten, z. B. unter Verwendung von bestimmten Bakterien als Wirtszellen vorteilhaft sein kann, ist es allgemein bevorzugt, dass die Expression extrazellulär erfolgt.

Verfahren, die zum Konstruieren von Vektoren der Erfindung geeignet sind, die ein XET-Enzym kodieren und den Promoter, Terminator bzw. andere Elemente enthalten, sind dem Fachmann bekannt (vgl. z. B. Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, 1989).

Die entweder ein DNA-Konstrukt oder einen wie vorstehend definierten Expressionsvektor der Erfindung umfassende Zelle der Erfindung wird bei der rekombinanten Herstellung einer XET der Erfindung vorteilhaft als Wirtszelle verwendet. Die Zelle kann mit dem die XET kodierenden DNA-Konstrukt der Erfindung günstigerweise durch Integrieren des DNA-Konstrukts (in einer oder mehreren Kopien) in das Wirtschromosom transformiert werden. Es ist allgemein anzunehmen, dass diese Integration vorteilhaft ist, da die DNA-Sequenz in der Zelle wahrscheinlicher stabil beibehalten wird. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlichen Verfahren, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Zelle mit einem wie vorstehend beschriebenen Expressionsvektor in Verbindung mit verschiedenen Wirtszelltypen transformiert werden.

Bei der Zelle der Erfindung kann es sich um eine Zelle eines höheren Organismus wie eines Säugers oder eines Insekts handeln, ist jedoch vorzugsweise eine Mikrobenzelle, z. B. eine Bakterien- oder Pilz- (einschließlich Hefe-) Zelle.

Beispiele für geeignete Bakterien sind grampositive Bakterien wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulars, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien wie E. coli. Die Transformation der Bakterien kann z. B. durch Protoplasttransformation oder unter Verwendung von kompetenten Zellen in einer an sich bekannten Weise bewirkt werden.

Der Hefeorganismus kann vorteilhaft aus einer Spezies von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, z. B. Saccharomyces cerevisiae ausgewählt werden. Der Fadenpilz kann vorteilhaft zu einer Spezies von Aspergillus, z. B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger gehören. Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das Protoplastbildung und Transformation der Protoplaste, gefolgt von Regenerierung der Zellwand in einer an sich bekannten Weise beinhaltet. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen ist in EP 238 023 beschrieben.

In noch einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines XET-Enzyms der Erfindung, wobei das Verfahren das Züchten einer wie vorstehend beschriebenen Wirtszelle unter die Herstellung der XET leitenden Bedingungen und Gewinnen der XET von den Zellen und/oder aus dem Kulturmedium umfasst.

Bei dem zum Züchten der Zellen verwendeten Medium kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Medium handeln, das zum Wachsen der fraglichen Wirtszelle und Erhalt von Expression der XET der Erfindung geeignet ist. Geeignete Medien sind von kommerziellen Lieferanten verfügbar oder können gemäß veröffentlichten Rezepturen (z. B. wie beschrieben in den Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden.

Die aus den Wirtszellen sekretierte XET kann günstigerweise durch bekannte Verfahren, einschließlich Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, und Ausfällen von proteinhaltigen Komponenten des Mediums mittels eines Salzes wie Ammoniumsulfat, gefolgt von der Verwendung von chromatographischen Verfahren wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen, aus dem Kulturmedium gewonnen werden.

Industrielle Anwendungen

Erfindungsgemäß kann ein Zellulosematerial nach Behandlung mit einem XET-Enzym verbesserte Stärken und/oder verbesserte Formbewahrungseigenschaften und/oder verbesserte Antischrumpfungseigenschaften erhalten. Das XET-Enzym weist die Fähigkeit auf, die an Zellulosefasern wasserstoffgebundenen Xyloglucanmoleküle umzuordnen und zu binden, wodurch die vorstehend erwähnten Merkmale erzielt werden können.

Zur Verbesserung der Wirkung des XET-Enzyms kann es in manchen Fällen vorteilhaft sein, Xyloglucan dem Zellulosematerial zuzusetzen, wodurch die Enzyme mehr Zellulosematerial zusammenbinden können.

Die Behandlung des Zellulosematerials mit dem XET-Enzym kann in Wasser oder in Wasser in Gegenwart von bestimmten Komponenten wie eines Puffers und/oder eines Netzmittels und/oder eines Stabilisators und/oder eines Polymers und/oder eines die Wasseraktivität reduzierenden organischen Bestandteils wie DMSO durchgeführt werden.

Bei dem Puffer kann es sich geeigneterweise um einen Phosphat-, Borat-, Citrat-, Acetat-, Adipat-, Triethanolamin-, Monoethanolamin-, Diethanolamin-, Carbonat(insbesondere als Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-, insbesondere Natrium- oder Kaliumcarbonat-, Ammonium- und HCl-Salz), Diamin-, insbesondere Diaminoethan-, Imidazol-, Tris- oder Aminosäurepuffer handeln.

Das Netzmittel dient zur Verbesserung der Benetzungsfähigkeit des Zellulosematerials. Das Netzmittel ist vorzugsweise vom nichtionischen oberflächenaktiven Typ.

Bei dem Stabilisator kann es sich um ein das XET-Enzym stabilisierendes Mittel handeln.

Erfindungsgemäß kann die Konzentration von XET in wässrigem Medium 0,01–1000 &mgr;g Enzymprotein pro Gramm Zellulosematerial, vorzugsweise 0,05–100 &mgr;g Enzymprotein pro Gramm Zellulosematerial betragen.

Es ist allgemein geeignet, das Reaktionsmedium (enthaltend das Zellulosematerial und das XET-Enzym) für eine Dauer von mindestens wenigen Minuten zu inkubieren. Eine Inkubationszeit von 1 Minute bis 20 Stunden ist im allgemeinen geeignet, insbesondere ist häufig eine Inkubationszeit von 30 Minuten bis 10 Stunden bevorzugt.

Die Temperatur des Reaktionsmediums im Verfahren der Erfindung kann geeigneterweise im Bereich von 10–90°C, insbesondere im Bereich von 15–70°C, wie für das fragliche XET-Enzym geeignet, liegen.

Die Erfindung wird weiter in den folgenden, nicht beschränkenden Beispielen veranschaulicht.

Beispiel 1 Screenen nach positiven XET-Stämmen
  • Medien PD-Agar: 39 g Kartoffeldextroseagar, DIFCO 0013; Zusatz von deionisiertem Wasser auf 1000 ml

    Autoklavenbehandlung bei 121 °C für eine Dauer von 15–20 Min.
    YPG-Agar: 4 g Hefeextrakt (DIFCO 0127),

    1 g KH2PO4 (Merck 4873),

    0,5 g MgSO4 7H2O (Merck 5886)

    15 g Dextrose (Roquette 101–0441)

    20 g Agar (Merck 1614)

    deionisiertes Wasser auf 1000 ml

    Autoklavenbehandlung bei 121°C für eine Dauer von 15–20 Min.
    MEA: 20 g Malzextraktpulver (DIFCO 0186)

    1 g Pepton (DIFCO 0118)

    20 g Glucose (Roquette France 1010441)

    20 g Agar (Merck 1614)

    deionisiertes Wasser auf 1000 ml

    Autoklavenbehandlung bei 121 °C für eine Dauer von 15 Min.
    Medium A pro Kolben: 30 g Weizenflocken, 45 ml der folgenden Lösung: 10 g Rofec (Roquette 101–0441), 10 g NH4NO3 (Merck 1187), 10 g KH2PO4 (Merck 4873), 40 g Solcafloc (Dicacel hergestellt von Dicalite-Europe-Nord, 9000 Gent, Belgien), 0,75 g MgSO4 7H2O (Merck 5886), 15 g CaCO3, Leitungswasser bis 1000 ml, pH eingestellt auf 6,5.

    Autoklavenbehandlung für eine Dauer von 40 Min. bei 121 °C.
    Medium B: 20 g Sojabohnenmehl, 5 g Maltodex 01, (Roquette 101–7845), 15 g Weizenflocken, 3 g Pepton (DIFCO 0118), 10 g Zellulose avicel (Merck 2331), 0,2 ml Pluronic (PE-6100, 101–3068), 1 g Olivenöl, deionisiertes Wasser auf 1000 ml. 100 ml in einem Erlenmeyer-Kolben mit einem 500 ml und zwei Scheidewänden.

    Autoklavenbehandlung bei 121°C für eine Dauer von 40 Min.
    Medium C: 100 g Saccharose, 40 g Sojabohnenmehl, 10 g Na2HPO4 12H2O (Merck 6579), 0,1 ml Pluronic (PE 6100), Leitungswasser auf 1000 ml·0,5 g CaCO3 in einem Erlenmeyer Kolben mit zwei Scheidewänden mit 100 ml Medium. Autoklavenbehandlung bei 121°C für eine Dauer von 40 Min. Direkt vor der Verwendung Zugabe von 10 ml 1M NaHCO3 pH 9 pro 100 ml Medium.
FERMENTATIONSVERFAHREN

Die Pilzstämme wurden auf Agar in Petrischalen (9 cm) oder auf Schrägflächen mit PDA, YPG oder MEA (siehe Liste der Medien) gehalten. Eine Agarschrägfläche wurde mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser ausgewaschen, und 3 ml wurden zum Beimpfen eines Schüttelkolben verwendet.

Man ließ die Pilzstämme in Schüttelkolben unter den folgenden Wachsbedingungen wachsen: Medien: A und B (siehe Liste der Medien) Temperatur: 26°C RPM: A: stationär

B:125–200
Inkubationszeit: A: 6 bis 30 Tage

B: 2 bis 21 Tage:

Das Bakterienisolat wurde auf Agarschrägflächen mit TY-Agar, pH 9, gehalten, das aus Folgendem bestand:

20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,7 ml einer 1%igen Lösung von FeCl2·4H2O, 0,1 ml einer 1%igen Lösung von MnCl2·4H2O, 1,5 ml einer 1%igen Lösung von MgSO4·7H2O, 20 g Agar und deionisiertes Wasser auf 1000 ml. Autoklavenbehandlung bei 121°C für eine Dauer von 20 Min. Vor Gießen in die Platten Zugabe von 10 ml steriler 1M NaHCO3, pH 9, auf 100 ml Agar.

Die Schrägflächen wurden bei 30°C für eine Dauer von 4 Tagen inkubiert. Eine Schrägfläche wurde mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser ausgewaschen, und 3 ml wurden zum Beimpfen jedes Kolbens verwendet.

Man ließ das Bakterium im Medium C enthaltenden Schüttelkolben bei 30°C für eine Dauer von 4 Tagen bei 300 UpM wachsen.

AKTIVITÄTSTEST:

Die in B und C hergestellten Kulturbrühen wurden bei 10.000 UpM für eine Dauer von 10 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden auf XET-Aktivität getestet.

Jedem Kolben mit Weizenflocken und vollständig gewachsener Kultur wurden 200 ml Leitungswasser zugesetzt und dies bei 200 UpM für eine Dauer von 2 Stunden geschüttelt. Die Kulturbrühe wurde dann zentrifugiert und der Überstand auf XET getestet.

XET-ANALYSE

Die Proben wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen „Punkt-Tupfen-Tests" analysiert.

ERGEBNISSE

Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde 1 Bacillus sp. und mehrere zu verschiedenen taxonomischen Gruppen gehörende Pilze als positiv befunden. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt.

Der Bacillus alcalophilus war positiv, als er auf Medium C, pH 9 (siehe Liste der Medien) für eine Dauer von 4 Tagen bei 30°C bei 300 UpM wuchs.

Beispiel 2 Reinigung und Charakterisierung der XET von Dichotomocladium hesseltinei.

15 PDA-Agarschrägflächen wurden mit Dichotomocladium hesseltinei (CBS 164.61) beimpft und bei 26°C für eine Dauer von 7 Tagen inkubiert. Sie wurden mit etwa 250 ml sterilem destilliertem Wasser mit 0,1% Tween 80 ausgewaschen und zum Beimpfen von 80 Medium B (2–3 ml/Kolben) enthaltenden Schüttelkolben verwendet. Die Kolben wurden bei 200 UpM, 26°C für eine Dauer von 5 Tagen geschüttelt, wonach die Kulturbrühe bei 4000 UpM für eine Dauer von 15 Minuten zentrifugiert wurde.

Der Xyloglucanendotransglucosylase (XET) enthaltende Überstand wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens gereinigt:

Eine Filterhilfe wurde der Kulturbrühe zugesetzt, die durch ein Filtergewebe filtriert wurde. Diese Lösung wurde weiter durch eine Seitz-Tiefen-Filterplatte filtriert, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Der pH-Wert des Filtrats wurde auf pH 8,0 eingestellt und das Filtrat mit deionisiertem Wasser verdünnt, um dieselbe Leitfähigkeit wie 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, zu erhalten.

Das XET-Enzym wurde auf eine Säule des Typs Q-Sepharose FF, äquilibriert in 20mM Tris/HCl, pH 8,0, aufgebracht und das Enzym mit einem zunehmenden linearen NaCl-gradierenden (0→ 0,5M) eluiert. Die XET-Aktivität eluierte als einzelner Peak. Das gepoolte XET wurde in 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, auf eine Säule des Typs Sephadex G25 überführt und wieder auf einer Säule des Typs Q-Sepharose FF, äquilibriert in 20mM Tris/HCl, pH 8,0, chromatographiert. Die Säule wurde mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,2 M) eluiert. XET-enthaltende Fraktionen wurden gepoolt, und (NH4)2SO4 wurde auf eine Endkonzentration von 1,4 M zugesetzt. Eine Säule des Typs Phenyl Toyopearl 6505 wurde in 1,4 M (NH4)2SO4, 10 mM Bernsteinsäure, pH 7,0, äquilibriert, und das XET-Enzym wurde auf diese Säule aufgebracht und mit einem abnehmenden linearen (NH4)2SO4-Gradienten (1,4→ 0 M) eluiert. XET-enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und auf einer Ultrafiltrationszelle mit einem Abschnitt von 10 kDa einer regenerierten Zellulosemembran eingeengt. Das eingeengte Enzym wurde auf eine Größenausschlusssäule des Typs Superdex 200, äguilibriert in 100 mM H3BO3, 10 mM Dimethylglutarsäure, 2 mM CaCl2, pH 7,0, aufgebracht. Die von der Säule des Typs Superdex 200 eluierten Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und reine XET Fraktionen gepoolt.

Die XET von Dichotomocladium hesseltinei durchlief die SDS-PAGE als Bande mit Mr = 24 kDa. N-terminale Aminosäuresequenzen der Komponente mit 24 kDa wurden durch Verfolgen von SDS-PAGE und Elektroblotten auf PVDF-Membran durchgeführt. Die folgende N-terminale Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 1) konnte gefolgert werden:

Ala-Glu-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Thr-Gln-Thr-Val-Gly-Asn-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ala.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein die in SEQ-ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz umfassendes mikrobielles XET-Enzym oder ein XET, das zumindest zu 80% homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ-ID Nr. 1 ist, vorzugsweise mindestens zu 85% homolog zu SEQ-ID Nr. 1, stärker bevorzugt mindestens zu 90% homolog zu SEQ-ID Nr. 1, noch stärker bevorzugt mindestens zu 95% homolog zu SEQ-ID Nr. 1, insbesondere mindestens zu 98% homolog zu SEQ-ID Nr. 1 ist.

Ein Polypeptid wird als X% homolog zu der Stamm-XET erachtet, wenn ein Vergleich der entsprechenden Aminosäuresequenz, der über bekannte Algorithmen, wie denjenigen, beschrieben durch Lipman und Pearson in Science 227, 1985, S. 1435, durchgeführt wird, eine Identität von X% zeigt.

Zudem ergaben Massenspektrometrieanalysen der XET von Dichotomocladium hesseltinei einen Wert von 23 006 Da.

Beispiel 3 Reinigung und Charakterisierung von XET von Tiarosporella phaseolina

15 PDA-Agarschrägflächen wurden mit Tiarosporella phaseolina (CBS 446.97) beimpft und bei 26°C für eine Dauer von 7 Tagen inkubiert. Sie wurden mit etwa 250 ml sterilem destilliertem Wasser mit 0,1% Tween 80 ausgewaschen und zum Beimpfen von 80 Medium B (2–3 ml/Kolben) enthaltenden Schüttelkolben verwendet. Die Kolben wurden bei 200 UpM, 26°C für eine Dauer von 7 Tagen geschüttelt, wonach die Kulturbrühe bei 4000 UpM für eine Dauer von 15 Minuten zentrifugiert wurde.

Der Xyloglucanendotransglucosylase (XET) enthaltende Überstand wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens gereinigt.

Eine Filterhilfe wurde der Kulturbrühe zugesetzt, die durch ein Filtrationsgewebe filtriert wurde. Diese Lösung wurde weiter durch eine Seitz-Tiefenfilter-Platte filtriert, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Das Filtrat wurde durch Ultrafiltration auf Polyethersulfonmembranen mit einem Abschnitt von 3 kDa, gefolgt von Dialfiltration mit destilliertem Wasser zum Reduzieren der Leitfähigkeit eingeengt. Der pH-Wert des eingeengten Enzyms wurde auf pH 5,0 eingestellt. Die Leitfähigkeit des eingeengten Enzyms betrug 1,7 mS/cm.

Das XET-Enzym wurde auf eine Säule des Typs S-Sepharose FF, äquilibriert in 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5,0, aufgebracht, und das Enzym mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,5 M) eluiert. Die XET-Aktivität eluierte als einzelner Peak. Die gepoolte XET wurde in 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 4,0, durch Dialyse überführt. Das dialysierte Enzym wurde auf eine Säule des Typs SOURCE 305, äquilibriert in 20mM CH3COOH/NaOH, pH 4,0, aufgebracht. Nach Waschen der Säule wurde die XET-Aktivität mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,5 M) eluiert. Fraktionen mit XET-Aktivität wurden gepoolt und gegen 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, dialysiert. Das dialysierte Enzym wurde auf eine Säule des Typs SOURCE 30Q, äquilibriert in 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, aufgebracht. Nach Waschen der Säule wurde die XET-Aktivität mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,5 M) eluiert. Fraktionen mit XET-Aktivität wurden gepoolt und auf einer Ultrafiltrationszelle mit einer regenerierten Zellulosemembran mit einem 10kDa-Abschnitt eingeengt. Das eingeengte Enzym wurde auf eine Größenausschlusssäule des Typs Superdex 200, äquilibriert in 100 mM H3BO3, 10 mM Dimethylglutarsäure, 2 mM CaCl2, pH 7,0, aufgebracht. Die Fraktionen, die von der Säule des Typs Superdex 200 eluierten, wurden durch SDS-PAGE analysiert und reine XET-Fraktionen gepoolt.

Die XET von Tiarosporella phaseolina durchlief die SDS-PAGE als Bande mit Mr = 24 kDa. Ein Sequenzieren der N-terminalen Aminosäure der Komponente mit 24 kDa wurde durch Verfolgen von SDS-PAGE und Elektroblotten auf einer PVDF-Membran durchgeführt. Die folgende N-terminale Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) konnte gefolgert werden:

Xaa-Asp-Fhe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Asn-val-Lys-Asn-Gly-Pro-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Asn-Asn-Leu-Gly-Gly-Lys

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein die in SEQ-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfassendes mikrobielles XET-Enzym oder ein XET, das zumindest zu 80% homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ-ID Nr. 2 ist, vorzugsweise mindestens zu 85% homolog zu SEQ-ID Nr. 2, stärker bevorzugt mindestens zu 90% homolog zu SEQ-ID Nr. 2, noch stärker bevorzugt mindestens zu 95% homolog zu SEQ-ID Nr. 2, insbesondere mindestens zu 98% homolog zu SEQ-ID Nr. 2 ist.

Ein Polypeptid wird als X% homolog zu der Stamm-XET erachtet, wenn ein Vergleich der entsprechenden Aminosäuresequenz, der über bekannte Algorithmen, wie denjenigen, beschrieben durch Lipman and Pearson in Science 227, 1985, Seite 1435, durchgeführt wird, eine Identität von X% zeigt.

Beispiel 4 Reinigung und Charakterisierung von XET von Pseudoplectania nigrella

15 PDA-Agarschrägflächen wurden mit Pseudoplectania nigrella (CBS 444.97) beimpft und bei 26°C für eine Dauer von 7 Tagen inkubiert. Sie wurden mit etwa 250 ml sterilem destilliertem Wasser mit 0,1% Tween 80 ausgewaschen und zum Beimpfen von 80 Medium B (2–3 ml/Kolben) enthaltenden Schüttelkolben verwendet. Die Kolben wurden bei 200 UpM, 26°C für eine Dauer von 7 Tagen geschüttelt, wonach die Kulturbrühe bei 4000 UpM für eine Dauer von 15 Minuten zentrifugiert wurde.

Der Xyloglucanendotransglucosylase (XET) enthaltende Überstand wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens gereinigt.

Eine Filterhilfe wurde der Kulturbrühe zugesetzt, die durch ein Filtrationsgewebe filtriert wurde. Diese Lösung wurde weiter durch eine Seitz-Tiefenfilter-Platte filtriert, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Der pH-Wert des Filtrats wurde auf pH 5,0 eingestellt und das Filtrat mit deionisiertem Wasser verdünnt, um dieselbe Leitfähigkeit wie 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5,0 zu erhalten.

Das XET-Enzym wurde auf eine Säule des Typs S-Sepharose FF, äquilibriert in 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5,0, aufgebracht, und das Enzym mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,25 M) eluiert. Die XET-Aktivität eluierte als einzelner Peak. Die gepoolte XET wurde in 20 mM Hepes/NaOH, pH 7,0, auf eine Säule des Typs Sephadex G25 überführt und auf eine Säule des Typs Q-Sepharose FF, äquilibriert in 20 mM Hepes/NaOH, pH 7,0, aufgebracht. Die Säule wurde mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,5 M) eluiert. Fraktionen mit XET-Aktivität wurden gepoolt und gegen 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5,0, dialysiert. Eine Säule des Typs SOURCE 15S wurde in 20mM CH3COOH/NaOH, pH 5,0, äquilibriert und das dialysierte Enzym aufgebracht. Nach Waschen der Säule wurde die XET-Aktivität mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,2 M) eluiert. Fraktionen mit XET-Aktivität wurden gepoolt und auf einer Ultrafiltrationszelle mit einer regenerierten Zellulosemembran mit einem Abschnitt von 10kDa eingeengt. Das eingeengt Enzym wurde auf eine Größenausschlusssäule des Typs Superdex 200, äquilibriert in 20 mM CH3COOH/NaOH, 100 mM NaCl, pH 5,0, aufgebracht. Die Fraktionen, die von der Säule des Typs Superdex 200 eluierten, wurden durch SDS-PAGE analysiert und reine XET-Fraktionen gepoolt.

Die XET von Pseudoplectania nigrella durchlief die SDS-PAGE als Bande mit Mr = 58 kDa. Nach SDS-PAGE und Elektroblotten auf einer PVDF-Membran wurde gefunden, dass die Komponente mit 58 kDa einen gesperrten N-Terminus aufwies.

Ein hochreines Präparat der XET von Pseudoplectania nigrella wurde reduziert und alkyliert. Eine Probe des Enzyms wurde dann mit Lys-C zersetzt. Peptide wurden durch RP-HPLC auf einer langen Vydac C18 in einem SMART-System unter Verwendung von TFA/AN isoliert und wieder in TFA/Isopropanol gereinigt. Selektierte Peptide wurden durch Edman-Zersetzung analysiert.

In Tabelle 1 sind die von 8 Peptiden erhaltenen Sequenzen dargestellt. Zwei Peptide wurden als zu Glucanase- und Xylanaseähnlichen Enzymen homolog befunden, jedoch zeigte der Hauptteil keine oder nur irrelevante Homologie zu bekannten Sequenzen.

Tabelle 1. Sequenz von Lys-C-Peptiden von XET von P.nigrella
Beispiel 5 pH-Profil der XET von Dichotomocladium hesseltinei, Tiarosporella phaseolina und Pseudoplectania nigrella und Xyloglucanase

Die Xyloglucanendotransglycosylase von Dichotomocladium hesseltinei, Tiarosporella phaseolina und Pseudoplectania nigrella wurden auf ihr pH-Profil überprüft. Die reinen Enzyme wurden in Puffer im Bereich von pH 3,0 bis 11,0 verdünnt, so dass es sich bei der Proteinkonzentration um dieselbe Endkonzentration, d. h. A280 = 0,004 handelte. Die Beispiele wurden dann unter Verwendung des XET-Punkt-Tupfen-Tests (früher beschrieben) auf XET getestet. Die fluoreszierenden Tupfen wurden visuell bewertet und von 0 bis 10 unterteilt. Bei den in 1 verwendeten Einheiten handelt es sich deshalb um willkürliche Einheiten.

Es ist aus 1 ersichtlich, dass die XET zwischen pH 3 und pH 11, insbesondere zwischen pH 4 und pH 9 aktiv ist.

Alle der Isolate mit XET-Aktivität wurden ebenso auf Xyloglucanase-Aktivität getestet. Das Verhältnis zwischen den 2 Enzymen variierte von Isolat zu Isolat. Die Enzyme wurden in denselben Puffern wie für die pH-Profil-Aktivität der XET verdünnt, bis die Endproteinkonzentration dieselbe war, und auf Xyloglucanaseaktivität getestet. AZCL-Xyloglucan wurde verwendet. Das verwendete Xyloglucanase-Verfahren lautete wie folgt:

Substrat: 0,4% AZCL-Xyloglucan, suspendiert in entmineralisiertem Wasser

Puffer: 100 mM H3BO3, 10 mM Dimethylglutarsäure, 2 mM CaCl2, pH 7

Analyse:

  • – Ein Eppendorf-Thermomischer wird bei 40°C eingeschaltet.
  • – 500 &mgr;l 0,4%iges AZCL-Xyloglucan werden mit 500 &mgr;l Puffer gemischt und auf Eis gegeben.
  • – 20 &mgr;l Enzym werden zugesetzt und in den Eppendorf-Thermomischer bis zum Erreichen einer stabilen Farbe inkubiert.
  • – Die Proben werden zurück auf das Eisbad gegeben, um eine weitere Reaktion während des Zentrifugierens der Proben bei 0° C zu vermeiden.
  • – Proben mit 200 &mgr;l werden auf Mikrotiterplatten überführt und die blaue Farbe bei 650 nm gemessen.

Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.

Beispiel 6 Klonen und Expression eines Xyloglucanendotransglycosylase-Enzyms (XET) von Tiarosporella phaseolina CBS Nr. 446.97 Hinterletge Organismen:
  • Tiarosporella phaseolina CBS Nr. 446.97
Andere Stämme:

Hefestamm: Bei dem verwendeten Stamm von Saccharomyces cerevisiae handelte es sich um W 3124 (van den Hazel, H.B; Kielland-Brandt, M.C.; Winther, J.R. in Eur. J. Biochem., 207, 207–283, 1992; (MATa; ura 3–52; leu 2–3, 112; his 3-D200; pep 4–1137; prcl::HIS3; prbl::LEU2; cir+).

E. coli Stamm: DH10B (Life Technologies)

Plasmide:

Bei dem Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 handelt es sich um ein Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in EP 238 023). Die Konstruktion von pHD414 ist ferner in WO 93/11249 beschrieben.

pYES 2,0 (Invitrogen)

Medien:
  • YPD:

    10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H2O auf 900 ml. Im Autoklaven behandelt, Zugabe von 100 ml 20%iger Glukose (steril filtriert).
  • YPM:

    10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H2O auf 900 ml. Im Autoklaven behandelt, Zugabe von 100 ml 20%igen Maltodextrin (steril filtriert).
  • 10 × Basalsalz:

    75 g Hefestickstoffbase, 113 g Bernsteinsäure, 68 g NaOH, H2O auf 1000 ml, steril filtrert.
  • SC-URA:

    100 ml 10 × Basalsalz, 28 ml 20%ige Casaminosäuren ohne Vitamine, 10 ml 1%iges Tryptophan, H2O auf 900 ml, im Autoklaven behandelt, Zugabe von 3,6 ml 5%igem Threonin und 100 ml 20%iger Glukose oder 20%iger Galactose.
  • SC-Agar:

    SC-URA, Zugabe von 20 g/l Agar.
  • AZCL Xyloglucan (Megazyme, Australien)
Expressionsklonen in Hefe

Das Expressionsklonen in Hefe wurde wie von H. Dalboege et al. (H. Dalboege et al Mol. Gen. Genet (1994) 243:253–260; WO 93/11249; WO 94/14953), die hier unter Bezugnahme eingebracht sind, beschrieben durchgeführt. Alle einzelnen Schritte der Extraktion der Gesamt-RNA-, cDNA-Synthese, Mungobohnennukleasebehandlung, Endenabstumpfung mit T4-DNA-Polymerase und Konstruktion von Genbanken wurden gemäß den vorstehend erwähnten Literaturangaben durchgeführt.

Fermentationsverfahren von Tiarosporella phaseolina CBS Nr. 446.97 zur mRNA-Isolation:

Tiarosporella phaseolina CBS Nr. 446.97 wurde von einer Platte mit ausgewachsenem Mycelium in einen 100 ml Medium B (siehe Medien) enthaltenden Schüttelkolben beimpft. Die Kultur wurde bei 26°C und 200 UpM für eine Dauer von 7 Tagen inkubiert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde durch Miracloth filtriert und das Mycelium in flüssigem Stickstoff eingefroren.

mRNA wurde von Mycelium aus dieser Kultur wie in (H. Dalboege et al Mol. Gen. Genet (1994) 243:253–260; WO 93/11249; WO 94/14953) beschrieben isoliert.

Die Extraktion von Gesamt-RNA wurde mit Guanidinium-Thiocyanat, gefolgt von Ultrazentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen durchgeführt, und die Isolation von Poly(A)+RNA wurde durch Oligo(dT)-Zellulose-Affinitätschromatographie unter Verwendung der in WO 94/14953 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

cDNA-Synthese:

Doppelstrang-cDNA wurde aus 5 mg Poly(A)+RNA durch das RNase-H-Verfahren (Gubler und Hoffman (1983) Gene 25:263–269, Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) synthetisiert. Die Poly(A)+RNA (5 &mgr;g in 5 &mgr;l DEPC-behandeltem Wasser) wurde bei 70°C für eine Dauer von 8 Minuten in einem vorsilikonisierten RNase-freien Eppendorphröhrchen erwärmt, auf Eis abgeschreckt und in einem Endvolumen von 50 &mgr;l mit Umkehrtranskriptasepuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, Bethesda Research Laboratories), enthaltend 1 mM dATP, dGTP und dTTP und 0,5 mM 5-Methyl-dCTP (Pharmacia), 40 Einheiten menschliche Placentaribonukleasehemmer (RNasin, Promega), 1,45 &mgr;g Oligo(dT)18-Not-1-Primer (Pharmacia) und 1000 Einheiten SuperScript-II-RNase-H-Umkehrtranskriptase (Bethesda Research Laboratories) kombiniert. Einzelstrang-cDNA wurde durch Inkubieren des Reaktionsgemischs bei 45°C für eine Dauer von 1 Stunde synthetisiert. Nach der Synthese wurde das mRNA:cDNA-Hybridgemisch durch eine Spin-Säule des Typs MicroSpin 5–400 HR (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers gelfiltriert.

Nach der Gelfiltration wurden die Hybride in 250 &mgr;l Doppelstrangpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 0,16 mM bNAD+), enthaltend 200 &mgr;l jedes dNTP, 60 Einheiten DNA-Polymerase I von E. coli (Pharmacia), 5,25 Einheiten RNase-H (Promega) und 15 Einheiten DNA-Ligase von E. coli (Boehringer Mannheim) verdünnt. Die Doppelstrang-cDNA-Synthese wurde durch Inkubieren des Reaktionsröhrchens bei 16°C für eine Dauer von 2 Stunden und zusätzlichen 15 Minuten bei 25°C durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM gestoppt, gefolgt von Phenol- und Chloroformextraktionen.

Mungobohnennukleasebehandlung:

Die Doppelstrang-cDNA wurde bei –20°C für eine Dauer von 12 Stunden durch Zugabe von 2 Volumen 96%igen EtOH, 0,2 Volumen 10 M NH4Ac, gefällt, durch Zentrifugation gewonnen, in 70%igem EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 &mgr;l Mungobohnennukleasepuffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO4, 0,35 mM DTT, 2% Glycerin), enthaltend 25 Einheiten Mungobohnennuklease (Pharmacia) resuspendiert. Die Einzelstrang-Haarnadel-DNA wurde durch Inkubieren der Reaktion bei 30°C für eine Dauer von 30 Minuten, gefolgt von Zugabe von 70 &mgr;l 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Ausfällung mit 2 Volumen 96%igen EtOH und 0,1 Volumen 3 M NaAc, pH 5,2 auf Eis für eine Dauer von 30 Minuten abgeschnitten.

Endenabstumpfung mit T4-DNA-Polyrmerase:

Doppelstrang-cDNAs wurden durch Zentrifugation gebunden und die Enden in 30 ml T4-DNA-Polymerasepuffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT), enthaltend 0,5 mM jedes dNTP und 5 Einheiten T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs) durch Inkubieren des Reaktionsgemischs bei 16°C für eine Dauer von 1 Stunde abgestumpft. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM gestoppt, gefolgt von Phenol- und Chloroformextraktionen und Ausfällung für eine Dauer von 12 Stunden bei –20°C durch Zugabe von 2 Volumen 96%igen EtOH und 0,1 Volumen 3 M NaAc pH 5,2.

Adaptorbindung, NotI-Aufschluß und Größenselektion:

Nach der Einfüllreaktion wurden die cDNAs durch Zentrifugation gewonnen, in 70%igem EtOH gewaschen und getrocknet. Das cDNA-Pellet wurde in 25 &mgr;l Bindungspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP), enthaltend 2,5 &mgr;g nichtpalindrome BstXI-Adaptoren (Invitrogen) und 30 Einheiten T4-Ligase (Promega) resuspendiert und bei 16°C für eine Dauer von 12 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf 65°C für eine Dauer von 20 Minuten und dann Abkühlen auf Eis für eine Dauer von 5 Minuten gestoppt. Die adaptierte cDNA wurde mit NotI-Restriktionsenzym durch Zugabe von 20 &mgr;l Wasser, 5 &mgr;l 10 × NotI-Restriktionsenzympuffer (New England Biolabs) und 50 Einheiten NotI (New England Biolabs) aufgeschlossen, gefolgt von Inkubation für eine Dauer von 2,5 Stunden bei 37°C. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf 65°C für eine Dauer von 10 Minuten gestoppt. Die cDNAs wurden durch Gelelektrophorese auf einem 0,8%igen, bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegel des Typs SeaPlaque GTG (FMC) in 1 × TBE größenfraktioniert, um ungebundene Adaptoren und kleine cDNAs abzutrennen. Die cDNAs wurden mit einem Abschnitt von 0,7 kb größenselektiert und unter Verwendung von &bgr;-Agarase (New England Biolabs) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus dem Gel befreit und für eine Dauer von 12 Stunden bei –20°C durch Zugabe von 2 Volumen 96%igen EtOH und 0,1 Volumen 3 M NaAc, pH 5,2 ausgefällt.

Genbankkonstruktion:

Die gerichteten, größenselektierten cDNAs wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 70%igem EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 &mgr;l 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, resuspendiert. Die cDNAs wurden durch Gelfiltration durch eine Spin-Säule des Typs MicroSpin 5–300 HR (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers entsalzt. Drei Testbindungen wurden in 10 &mgr;l Bindungspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP), enthaltend 5 &mgr;l Doppelstrang-cDNA (Reaktionsröhrchen #1 und #2), 15 Einheiten T4-Ligase (Promega) und 30 ng (Röhrchen #1), 40 ng (Röhrchen #2) und 40 ng (Röhrchen #3, die Vektorhintergrundkontrolle) von BstXI-NotI-gespaltenem pYES-2,0-Vektor durchgeführt. Die Bindungsreaktionen wurden durch Inkubation bei 16°C für eine Dauer von 12 Stunden, Erwärmen bei 70°C für eine Dauer von 20 Minuten und Zugabe von 10 &mgr;l Wasser zu jedem Röhrchen, durchgeführt. 1 &mgr;l jedes Bindungsgemischs wurde in 40 &mgr;l elektrokompetente Zellen DH10B von E. coli (Bethesda research Laboratories) wie beschrieben (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) elektroporiert. Unter Verwendung der optimalen Bedingungen wurde eine aus Pools bestehende Genbank in E. coli aufgebaut. Jeder Pool wurde durch Verteilung von transformiertem E. coli auf LB+Ampicillin-Agarplatten aufgebaut, wodurch nach Inkubation bei 37°C für eine Dauer von 24 Stunden 15.000–30.000 Kolonien/Platte erhalten wurden. 20 ml LB+Ampicillin wurden der Platte zugesetzt und die Zellen darin suspendiert. Die Zellsuspension wurde in einem Röhrchen mit einem Volumen von 50 ml bei 37°C für eine Dauer von 1 Stunde geschüttelt. Plasmid-DNA wurde aus den Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines QIAGEN-Plasmid-Bausatzes isoliert und bei –20°C gelagert.

Aliquote mit 1 &mgr;l von gereinigter Plasmid-DNA (100 ng/ml) von einzelnen Pools wurden in S. cerevisiae W3124 durch Elektroporation (Becker and Guarante (1991) Methods Enzymol. 194:182–187) transformiert und die Transformanten auf 2% Glukose enthaltendem SC-Agar aufgetragen und bei 30°C inkubier.

Identifikation von positiven Kolonien:

Kolonien wurden indirekt auf XET durch Finden von Xyloglucanase-positiven Kolonien gescreent.

Nach 3-5-tägigem Wachstum wurden die Agarplatten auf einem Satz von SC-URA-Agaplatten (unter Zugabe von 20% Galactose), enthaltend 0,1% AZCL-Xyloglucan, replikationsbeschichtet. Diese Platten wurden für eine Dauer von 3–7 Tagen bei 30°C inkubiert. Xyloglanase-positive Kolonien wurden als von einem blauen Halo umgebene Kolonien identifiziert.

Zellen von Enzym-positiven Kolonien wurden zur Einzelkolonieisolierung auf Agar verteilt und eine Enzym herstellende Einzelkolonie wurde für jede der identifizierten Xyloglucanase herstellenden Kolonien selektiert.

Alle Xyloglucanase-positiven Kolonien wurden auf XET getestet und als positiv befunden.

Isolierung eines cDNA-Gens zur Expression in Aspergillus:

Eine XET herstellende Hefekolonie wurde in 20 ml YPD-Brühe in ein Glasteströhrchen mit einem Volumen von 50 ml geimpft. Das Röhrchen wurde für eine Dauer von 2 Tagen bei 30°C geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für eine Dauer von 10 Minuten bei 3000 UpM geerntet.

DNA wurde gemäß WO 94/14953 isoliert und in 50 ml Wasser gelöst. Die DNA wurde durch Standardverfahren in E. coli transformiert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren von E. coli isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Die cDNA-Einfügung wurde unter Verwendung des Restriktionsenzyms BamH I und Xba I exzidiert und in den Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 gebunden, wodurch das Plasmid pA2XG80 erhalten wurde.

Die cDNA-Einfügung der mit gereinigten Qiagen-Plasmid-DNA von pA2XG80 (Qiagen, USA) wurde mit dem Taq-Deoxy-Terminalzyklus-Sequenzierbausatz (Perkin Elmer, USA) und synthetischen Oligonukleotidprimern unter Verwendung einer DNA-Sequenzapparatur des Typs Applied Biosystems ABI PRISMTM 377 DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert.

Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus nieger

Protoplaste werden wie in WO 95/02043, Seite 16, Zeile 21 bis Seite 17, Zeile 12, die hier unter Bezugnahme eingebracht ist, beschrieben hergestellt.

100 &mgr;l Protoplastsuspension wird mit 5–25 &mgr;g der entsprechenden DNA in 10 &mgr;l STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl2) gemischt. Protoplaste werden mit p3SR2 (einem amdS-Gen tragenden Plasmid von A. nidulans) (Tove Christensen et al. Bio/Technology, S. 1419–1422, Band 6, Dezember 1988) gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für eine Dauer von 25 Minuten stehen gelassen. 0,2 ml 60%iger PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl2 und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 werden zugesetzt und vorsichtig gemischt (zweimal), und schließlich werden 0,85 ml derselben Lösung zugesetzt und vorsichtig gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für eine Dauer von 25 Minuten stehen gelassen, bei 2500 g für eine Dauer von 15 Minuten gedreht und das Pellet in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation der Protoplaste werden die Protoplaste auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56), enthaltend 1,0 M Saccharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl zum Hemmen von Hintergrundwachstum verteilt. Nach Inkubation für eine Dauer von 4–7 Tagen bei 37°C werden Sporen aufgenommen und auf einzelne Kolonien verteilt. Dieses Verfahren wird wiederholt, und die Sporen einer einzelnen Kolonie nach der zweiten Reisolation werden als definierter Transformant aufbewahrt.

Tests von Transformanten von A. oryzae

Jeder der Tranformanten von A. oryzae wird in 10 ml YPM (vergleiche nachstehend) geimpft und vermehrt. Nach 2-5-tägiger Inkubation bei 30°C wird der Überstand entfernt.

Die XET-Aktivität wird unter Verwendung des früher beschriebenen XET-Punkt-Tupfen-Tests identifiziert.

Bei der folgenden Sequenz (SEQ ID Nr. 3) handelt es sich um die cDNA-Einfügung in pYES2,0 von XG80 (XET von Tiarosporella phaseolina), einschließlich der BamHI- und NotI-Erkennungsstellen, die zum Klonen verwendet werden:

Bei der folgenden Sequenz (SEQ ID Nr. 4) handelt es sich um die Aminosäuresequenz der Kodierungsregion von XG80:

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein die in SEQ-ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz umfassendes mikrobielles XET-Enzym oder eine XET, die zumindest zu 80% homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ-ID Nr. 4 ist, vorzugsweise mindestens zu 85% homolog zu SEQ-ID Nr. 4, stärker bevorzugt mindestens zu 90% homolog zu SEQ-ID Nr. 4, noch stärker bevorzugt mindestens zu 95% homolog zu SEQ-ID Nr. 4, insbesondere mindestens zu 98% homolog zu SEQ-ID Nr. 4 ist.

Ein Polypeptid wird als X% homolog zu der Stamm-XET erachtet, wenn ein Vergleich der entsprechenden Aminosäuresequenz, der über bekannte Algorithmen, wie denjenigen beschrieben durch Lipman and Pearson in Science 227, 1985, Seite 1435, durchgeführt wird, eine Identität von X% zeigt.

Ein Klon Cl.XG80 wurde bei DSMZ am 24. Februar 1998 unter der Zugangsnummer DSM 12032 hinterlegt.

Sequenzprotokoll
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)
Indikationen betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT Regel 13bis)

Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Herstellung eines Xyloglucanendotransglycosylase-Enzyms (XET), umfassend

    (a) Züchten eines Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus i) Pilzen und ii) Bazillus-Spezies in einem geeignetem Nährmedium, wobei der Mikroorganismus eine mikrobielle XET unter Bedingungen, die zur Herstellung des XET-Enzyms beitragen, exprimiert wird, und

    (b) Gewinnen des XET-Enzyms aus dem Nährmedium.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Pilz ein Basidiomycota, ein Ascomycota, ein Zygomycota oder ein mitosporischer Pilz ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Pilz ein Basidiomycotinum-Stamm der Ordnung Coriolales, Schizophyllales, Stereales oder Xenasmatales ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Pilz ein Basidiomycotinum, ausgewählt aus dem Stamm, gehörend zur Gruppe, bestehend aus den Familien Coriolaceae, Corticiaceae, Schizophyllaceae, Stereaceae und Tubulicrinaceae, ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Pilz ein Basidiomycotinum, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zur Gruppe, bestehend aus den Gattungen Trametes, Corticium, Schizophyllum, Stereum und Tubulicrinis, ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Pilz ein Basidiomycotinum ist, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zur Gruppe, bestehend aus den Spezies Trametes hirsuta, Corticium roseum, Schizophyllum sp, Stereum hirsutum und Tubulicrinis subulatus.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Pilz ein Schizophyllum sp, Hinterlegungsnummer CBS 443.97, ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Ascomycetes, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zur Gruppe, bestehend aus den Klassen Loculoascomycetes, Discomycetes, Pyrenomycetes und Plectomycetes, ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Ascomycetes, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zu der Gruppe, bestehend aus den Ordnungen Dothideales, Rhytismatales, Pezizales, Leotiales, Xylariales, Hypocreales, Halosphaeriales, Eurotiales, Phyllachorales und Diaporthales, ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Ascomycetes, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zur Gruppe, bestehend aus den Familien Leptosphaeriaceae, Botryosphaeriaceae, Dothioraceae, Mycosphaerellaceae, Tubeufiaceae, Rhytismataceae, Sarcosomataceae, Pyronemataceae, Sclerotiniaceae, Amphisphaeriaceae, Hyponectriaceae, Xylariaceae, Valsaceae, Melanconidaceae, Hypocreaceae, Halospheriaceae, Phyllachoraceae und Trichocomataceae, ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Ascomycetes, ausgewählt aus einen Stamm, gehörend zur Gruppe, bestehend aus den Gattungen Coniothyrium, Phoma, Diplodia, Plowrightia, Phyllosticta, Septoria, Tubeufia, Alternaria, Embellisia, Tiarosporella, Galiella, Oedocephalum, Pseudoplectania, Pyronema, Botrytis, Aposphaeria, Pestalotia, Pestalotiopsis, Chaetapiospora, Poronia, Nodulisporium, Xylaria, Cytospora, Discula, Phomopsis, Coryneum, Seimatosporium, Fusarium, Verticillium, Volutella, Lulworthia, Colletotrichum, Aspergillus, Eurotium, Eupenicillium, Penicillium, Petromyces und Talaromyces, ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Ascomycetes, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zu der Gruppe, bestehend aus der Spezies Diplodia gossypina, Plowrightia ribesia, Phyllosticta sp, Septoria sp, Tubeufia amazonensis, Alternaria sp, Embellisia hyacinthi, Phoma neoloba, Phoma tropica, Coniothyrium sp, Coniothyrium olivaceoum, Coniothyrium dunckii, Tiarosporella sp, Tiarosporella phaseolina, Galiella celebica, Pseudoplectania nigrella, Pyronema domesticum, Oedocephalum sp, Botrytis cinerea, Aposphaeria sp, Pestalotia sp, Pestalotiopsis sp, Poronia punctata, Xylaria sp, Nodulisporium sp, Fusarium solani, Verticillium sp, Volutella buxi, Chaetapiospora rhododendri, Lulworthia uniseptata, Colletotrichum aculatum, Colletotrichum crassipes, Cytospora spp, Discula sp, Phomopsis sp, Phomopsis cirsii, Coryneum castaneicola, Seimatosporium lichenicola, Aspergillus tamarii, Eurotium chevalieri, Eupenicillium javanicum, Penicillium capsulatum, Penicillium olsonii, Penicillium pinophilum, Penicillium roqueforti, Penicillium italicum, Penicillium verrruculosum, Penicillium canescens, Petromyces alliaceus und Talaromyces flavus, ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Ascomycetes, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zur Gruppe, bestehend aus den Spezies Botrytis cinerea Hinterlegungsnummer CBS 447.97, Pseudoplectania nigrella Hinterlegungsnummer CBS 444.97, Tiarosporella phaseolina Hinterlegungsnummer CBS 446.97, Pestalotia sp Hinterlegungsnummer CBS 445.97 und Lulworthia uniseptata Hinterlegungsnummer CBS 442.97. ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Zygomycota ausgewählt ist aus einem Stamm, gehörend zu der Ordnung Mucorales.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Pilz ein Zygomycotum, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zu der Gruppe, bestehend aus den Familien Chaetocladiaceae und Mucoraceae, ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Pilz ein Zygomycotum, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zu der Gruppe, bestehend aus den Gattungen Dichotomocladium, Actinomucor, Gongronella, Sporodiniella und Mucor, ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Pilz ein Zygomycota, ausgewählt aus einem Stamm, gehörend zu der Gruppe, bestehend aus den Spezies Dichotomocladium hesseltinei, Actinomucor elegans, Gongronella butleri, Mucor miehei var minor und Sporodiniella umbellata, ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Pilz ein Gongronella butleri Hinterlegungsnummer CBS 448.97 ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Vialaea insculpta ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bazillus ein Bacillus alcalophilus der Hinterlegungsnummer DSM 11404 ist.
  21. Verwendung eines gemäß einem der Ansprüche 1–20 erhaltenen XET-Enzyms zur Behandlung eines Zellulosematerials.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Behandlung verbesserte Stärke und/oder verbesserte Formbewahrung und/oder verbesserte Antischrumpfungseigenschaften des Zellulosematerials bereitstellt.
  23. Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Zellulosematerial ein Zellulosestoff oder ein Papier- und Zellstoffprodukt ist.
  24. Xyloglucanendotransglycosylase-Präparat, umfassend eine XET von einem Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus i) Pilzen und ii) Bazillus-Spezies.
  25. Präparat nach Anspruch 24, wobei die XET die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist oder die Aminosäuresequenz des XET mindestens zu 80% homolog zu der SEQ ID Nr. 1 ist.
  26. Präparat nach Anspruch 24, wobei die XET die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist oder die Aminosäuresequenz des XET mindestens zu 80% homolog zu der SEQ ID Nr. 2 ist.
  27. Präparat nach Anspruch 24, wobei die XET die in SEQ ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist oder die Aminosäuresequenz des XET mindestens zu 80% homolog zu der SEQ ID Nr. 4 ist.
  28. Präparat nach Anspruch 24, wobei die XET zwischen pH 3 und pH 11, insbesondere zwischen pH 4 und pH 9 aktiv ist.
  29. Verfahren zur Herstellung eines Xyloglucanendotransglycosylase-Enzyms (XET), umfassend

    (a) Züchten eines Wirtsorganismus in einem geeignetem Nährmedium, wobei der Wirtsorganismus mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die XET von einem Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus i) Pilzen und ii) Bazillus-Spezies, kodiert und die mikrobielle XET unter Bedingungen, die zur Herstellung des XET-Enzyms beitragen, exprimiert, und

    (b) Gewinnen des XET-Enzyms aus dem Nährmedium.
Es folgen 2 Blatt Zeichnungen






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