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Dokumentenidentifikation DE69633722T2 03.11.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000831877
Titel STOFFWECHSELEFFEKT VON BESTIMMTEN GLUTATION ANALOGEN
Anmelder TELIK, INC., Palo Alto, Calif., US
Erfinder KAUVAR, M., Lawrence, San Francisco, US;
LYTTLE, H., Matthew, Point Reyes Station, US;
MORGAN, S., Amy, Oakland, US;
BORCH, Richard F, Rochester, US
Vertreter Barz, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 80803 München
DE-Aktenzeichen 69633722
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.06.1996
EP-Aktenzeichen 969181569
WO-Anmeldetag 05.06.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/09057
WO-Veröffentlichungsnummer 0096040205
WO-Veröffentlichungsdatum 19.12.1996
EP-Offenlegungsdatum 01.04.1998
EP date of grant 27.10.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.11.2005
IPC-Hauptklasse A61K 38/06

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Stoffwechseleffekte einer Klasse von Glutathion-Analoga, die mit mindestens einer Glutathion S-Transferase-Klasse wechselwirken. Spezieller ist die Erfindung auf die Modulation der Hämatopoese in Knochenmark oder Blut und auf andere nützliche Antworten auf diese Klasse von Glutathion S-Transferase-Hemmern gerichtet.

Stand der Technik

Die Nebenwirkungen von chemotherapeutischen Mitteln, die bei der Behandlung von bösartigen Geschwulsten und anderen Indikationen verwendet werden, sind wohlbekannt. Unter diesen Nebenwirkungen befinden sich Veränderungen der Konzentrationen verschiedener Blutzellen, einschließlich Neutrophilen, Blutplättchen und Lymphozyten. Die Ergebnisse dieser Effekte können Neutropenie, Thrombozytopenie und allgemein Immunsuppression sein. Diese Nebenwirkungen sind nicht nur unangenehm, sondern sie können auch die Wirksamkeit einer Krebstherapie beschränken und den Patienten einem ernsthaften Risiko von Infektionen und unkontrolliertem Bluten aussetzen.

Derzeit scheint es wenig brauchbare Abhilfe für diese Effekte zu geben. Einige Ansätze sind lediglich palliativ, wie eine unterstützende Pflege. Andere weisen ihre eigenen Nebenwirkungen auf, wie große Dosen von Antibiotika. Noch andere sind teuer und invasiv, wie Transfusionen. Noch ein weiterer Ansatz, die Verabreichung von Wachstumsfaktoren, wie Granulozytenkolonie-stimulierendem Faktor (GCSF), Granulozytmakrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (GMCSF) und in jüngerer Zeit entwickelten Faktoren, wie dem Megakaryozyten-Wachstums- und Entwicklungsfaktor (MGDF) und Thrombopoetin (TPO), ist teuer, und sie müssen durch Injektion verabreicht werden. Sie weisen auch ihre eigenen zugehörigen negativen Nebenwirkungen auf.

Es gibt klar einen Bedarf an einem einfacheren Ansatz, z. B. einem Arzneistoff aus einem kleinen Molekül, das über den Mund verabreichbar ist, das Knochenmark schützen und wiederherstellen und die Produktion von Neutrophilen, Blutplättchen und Lymphozyten stimulieren kann, sowohl in Verbindung mit chemotherapeutischen Behandlungsschemata als auch als Antwort auf andere Faktoren, die eine hämatopoetische Suppression zur Folge haben, wie zyklische und idiopathische Neutropenien, Thrombozytopenien und die Auswirkungen von Allotransplantaten.

Die Probleme, die mit derzeitigen Ansätzen zur Handhabung der Nebenwirkungen einer Chemotherapie und zum sonstigen Umgang mit der Suppression der Hämatopoese verbunden sind, werden zumindest teilweise durch die biologische Aktivität gewisser einfacher Tripeptid-Verbindungen gelöst, die Hemmer der verschiedenen Isoenzyme von Glutathion S-Transferase sind.

Die PCT-Anmeldung WO 95/08563, veröffentlicht am 30. März 1995 und auf der PCT/US94/10797 beruhend, offenbart diese Tripeptid-Verbindungen, die Analoga von Glutathion sind. Sie sind allgemein Hemmer der Glutathion S-Transferase-Aktivität, und die verschiedenen Verbindungen, die in dieser Gruppe enthalten sind, zeigen verschiedene Spezifitäten bezüglich Glutathion S-Transferase-Isoenzymen.

Es wurde nun gefunden, dass eine Untergruppe dieser Analoga, welche die allgemeine Formel

aufweist, und die Amide und Ester derselben, worin YCO für &ggr;-Glu oder &bgr;-Asp steht; G* Phenylglycin oder Glycin ist; Z für CH2, O oder S steht; und X ein Kohlenwasserstoffrest mit 1–20 C ist, die Fähigkeit aufweist, die Hämatopoese in Knochenmark und in peripherem Blut zu modulieren und deshalb Schutzwirkungen auszuüben, wenn chemotherapeutische Mittel verabreicht werden, die für das hämatopoetische System zerstörerisch sind. Diese Verbindungen potenzieren auch die gewünschten Wirkungen von chemotherapeutischen Mitteln. Diese gleiche Untergruppe von Glutathion-Analoga zeigt die Hemmung der &pgr;-Klasse von Glutathion S-Transferase (GST) und in einigen Fällen auch von anderen Klassen.

Offenbarung der Erindung

Die Erfindung stellt Verbindungen bereit, die aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Schutzwirkung bezüglich toxischer Mittel, die ansonsten in der Chemotherapie nützlich sind, auf das hämatopoetische System auszuüben, bei der Modulierung der Hämatopoese allgemein und als Hilfsmittel bei einer chemotherapeutischen Behandlung von Tumoren nützlich sind. Die Verbindungen sind oral aktiv und können in jedem Zusammenhang verwendet werden, in dem es wünschenswert ist, die hämatopoetischen Prozesse in Knochenmark oder peripherem Blut zu modulieren oder andere Knochenmarksprozesse zu modulieren.

So ist die Erfindung in einem Aspekt auf die Verwendung einer Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Hämatopoese in Knochenmark oder peripherem Blut oder Fraktionen derselben gerichtet, wobei das Medikament oral zu verabreichen ist und die Verbindung die Formel

aufweist oder die Ester-, Amid-, Ester/Amid- oder Salzformen derselben ist,

worin YCO für für &ggr;-Glu oder &bgr;-Asp steht;

G* Phenylglycin oder Glycin ist;

Z für CH2, O oder S steht; und

X ein Kohlenwasserstoffrest mit 1–20 C ist.

In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf die Verwendung der oben identifizierten Verbindungen bei der Herstellung eines Medikaments zur Ausübung einer Schutzwirkung gegen die zerstörerischen Auswirkungen eines chemotherapeutischen Mittels, einschließlich Bestrahlung, gerichtet, das einem Patienten verabreicht wird. Dieser Schutz schließt die Wirkungsweise ein, durch welchen eine Beschleunigung der Erholung von derartigen Auswirkungen stattfindet. Die Verbindung der Formel (1) ist einem Patienten in einer Menge und über einen Zeitraum zu verabreichen, die wirksam sind, um diese Schutzwirkungen auszuüben.

In weiteren Aspekten ist die Erfindung auf Formulierungen zur Förderung der Produktion von Neutrophilen, Blutplättchen und Lymphozyten, zur Wiederherstellung von beschädigtem Knochenmark, zum Schutz von Knochenmark vor zytotoxischer Therapie und zum Ausüben einer Schutzwirkung wie gegen Neutropenie, Thrombozytopenie, Lymphozytopenie und Anämie, die durch Chemotherapie, Infektion oder hämatologische Krankheiten verursacht werden, und für die Expansion von Zellpopulationen im Verlauf einer Knochenmarkstransplantation gerichtet. Die Verbindungen können als Tumor-spezifische Chemo- oder Radiosensibilisatoren, wodurch sie die Wirkung der Behandlung potenzieren, und als generalisierte Chemoschutzmittel verwendet werden.

Die Erfindung schließt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Verbindungen der Erfindung als aktive Bestandteile enthalten, und Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen ein.

Ein Verfahren zur Modulation der Hämatopoese oder zur Ausübung einer Schutzwirkung gegen die zerstörerischen Auswirkungen eines chemotherapeutischen Mittels kann mittels eines Verfahrens durchgeführt werden, welches das In-Kontakt-Bringen von Knochenmark, peripherem Blut oder einer geeigneten Fraktion derselben mit einer Verbindung umfasst, welche Glutathion S-Transferase-Isoenzyme mindestens einer Klasse inhibiert und generell GST der &pgr;-Klasse bei einer vernünftigen Konzentration inhibiert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1a zeigt die Auswirkungen von TER199 auf das Überleben von Tumorzellen, die mit verschiedenen Konzentrationen an Chlorambucil behandelt wurden.

1b zeigt die toxische Wirkung von TER199 im Gegensatz zu seiner unveresterten Form bei HT4-1-Zellen.

2 ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkung für verschiedene Kombinationen von Chlorambucil entweder allein oder in Kombination mit Ethacrynsäure oder TER199 zeigt.

3 ist eine graphische Darstellung, welche die dosisabhängige Auswirkung von TER199 auf Maus-GM-CFU 24 Stunden nach Behandlung zeigt.

4a ist eine graphische Darstellung, welche den Vergleich von oraler gegenüber i. p.-Verabreichung von TER199 bei Knochenmark-GM-CFU zeigt.

4b ist eine graphische Darstellung, welche den Vergleich von oraler gegenüber i. v.-Verabreichung von TER199 bei Knochenmark-GM-CFU zeigt.

5 zeigt den Zeitverlauf der TER199-Stimulation von GM-CFU, i. p. verabreicht.

6 ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkung von TER199 auf die Zahl von Neutrophilen und roten Blutzellen zeigt.

7 ist eine graphische Darstellung, welche die Abhängigkeit von der veresterten oder amidierten Form der Tripeptide bezüglich der GM-CFU-Stimulation zeigt.

8 ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkung der Natur des Substituenten "X" in Formel 1 auf die GM-CFU-Stimulation zeigt.

9a ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkung von TER199 auf die 5-Fluoruracil-(5-FU-)GM-CFU-Suppression bei Mäusen zeigt.

9b ist eine graphische Darstellung, welche die Zeitverlaufs-Auswirkung einer i. p.-Verabreichung von TER199 24 Stunden nach Verabreichung von 5-FU auf die Erholung der Differenzierungsfähigkeit von Knochenmarkzellen zeigt.

9c ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkung einer Vorbehandlung von TER199 (i. p.) auf die 5-FU-induzierte GM-CFU-Suppression zeigt.

9d ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkungen einer oralen und einer i. p.-Verabreichung von TER199 24 Stunden nach Verabreichung von 5-FU auf die GM-CFU-Suppression bei Mäusen vergleicht.

10 ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkung von TER199 auf die Cisplatin (i. p.)-induzierte GM-CFU-Suppression bei Mäusen zeigt.

11 ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkung von oralem TER199 auf die Cisplatin-induzierte GM-CFU-Suppression bei Mäusen zeigt.

12 ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkung von TER199 auf die Carboplatin-induzierte GM-CFU-Suppression bei Mäusen zeigt.

13 ist eine graphische Darstellung, welche die Auswirkung von TER199 auf die Cyclophosphamid-induzierte GM-CFU-Suppression bei Mäusen zeigt.

14 ist eine Reihe von graphischen Darstellungen, welche zeigt, dass TER199 die Erholung von Knochenmarks- und Lymph-Linien bei Ratten nach Behandlung von 5-FU beschleunigt und dessen Toxizität gegenüber denselben verringert.

Die 15a15d zeigen Blutzählungen verschiedener Arten von Zellen nach der Verabreichung von 5-FU allein oder von 5-FU + TER199.

16 zeigt die Auswirkung von TER199 auf die Differenzierung von CD34+++-Zellen bezüglich CFU-GEMM und BFU-E.

17 zeigt ein bevorzugtes Verfahren zur Synthese von TER199.

Weisen zur Durchführung der Erfindung

Viele der Verbindungen, die in der Erfindung nützlich sind, inhibieren die Aktivität mindestens einer Isoenzym-Unterklasse der Glutathion S-Transferase-Isoenzyme. Diese Verbindungen modulieren auch die Hämatopoese in Knochenmark, selbst in Anwesenheit von Mitteln, die gewöhnlich einen großen Prozentsatz der Zellen zerstören, welche zur Aufrechterhaltung der Hämatopoese benötigt werden, ebenso wie sie andere hilfreiche Auswirkungen auf Knochenmark und Blutzellen zeigen. Diese Verbindungen weisen die Formel

auf, in der YCO, G*, Z und X wie oben definiert sind. Wenn sie in vivo oder in vitro für den Zweck der Beeinflussung von intakten Zellen verwendet werden, liegen die Verbindungen der Erfindung bevorzugt in der Amid-, Ester- oder hybriden Amid/Ester-Form vor.

Es wird ersichtlich werden, dass die in der Erfindung verwendeten Verbindungen als freie Säuren, Salze, Monoester, Diester, Monoamide, Diamide oder hybride Ester/Amid-Formen vorliegen können. Die Amide und Ester, die in der Erfindung nützlich sind, sind im Allgemeinen diejenigen mit (1–10 C)-Alkyl-; (1–10 C)-Alkenyl-; und (7–12 C)-Arylalkylalkoholen und -aminen. So umfassen typische Ester und Amide, die in der Erfindung nützlich sind, Dimethylester, Diethylester, gemischte Ethyl/Propylester, Dihexylester, gemischte Hexyl/Octylester, Dibutenylester, gemischte Butenyl/Vinylester, die entsprechenden Amide und dergleichen. Besonders bevorzugt sind die Diethylester-Formen der Verbindungen der Formel (1). Eine bevorzugte Ausführungsform von Z ist O oder S, insbesondere S; und eine bevorzugte Ausführungsform von YCO ist &ggr;-Glu.

Bevorzugte Ausführungsformen der (1–20 C)-Kohlenwasserstoffeinheit X umfassen Hexyl, Heptyl, Octyl, Benzyl und Naphthyl. Besonders bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind &ggr;E-C(Octyl)-&phgr;G; &ggr;E-C(Hx)-&phgr;G; &ggr;E-C(Naphthyl)-&phgr;G; &ggr;E-C(Bz)-&phgr;G; und &ggr;E-C(Octyl)-G; &ggr;E-C(Hx)-G und &ggr;E-C(Bz)-G; und insbesondere deren Diester und bevorzugter deren Diethylester. Besonders bevorzugt sind der &ggr;E-C(Bz)-&phgr;G-Diethylester (TER199) und der &ggr;E-C(Octyl)-G-diethylester (TER183).

Es ist offensichtlich, dass die in der Erfindung verwendeten Tripeptide ein oder zwei chirale Zentren enthalten. Die oben angegebenen Bezeichnungen richten sich auf die Gattung von Diastereomeren, die aus der Anwesenheit dieser chiralen Zentren resultieren. Besonders bevorzugt sind jedoch diejenigen Ausführungsformen, in denen die Aminosäure, die durch YCO dargestellt wird (&ggr;-Glu oder &bgr;-Asp), in der nativen L-Konfiguration vorliegt; der Cystein- oder Cystein-Analogon-Rest, der durch NHCH(CH2ZX)CO dargestellt wird, ebenfalls in der nativen L-Konfiguration vorliegt und, wenn G* Phenylglycin ist, das Phenylglycin bevorzugt in der D-Konfiguration vorliegt. So sind bevorzugte in der Erfindung verwendete Verbindungen, in denen G* Phenylglycin ist, die LLL- und LLD-Form, insbesondere die LLD-Form. Man erkennt, dass abhängig von der Natur von "X" zusätzliche chirale Zentren eingeschlossen sein können.

Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen weisen mehrere Eigenschaften auf, die sie als Hilfsmittel für die Chemotherapie und andere Indikationen nützlich machen. Erstens modulieren sie die Hämatopoese in Knochenmark, dessen Zerstörung eine übliche Nebenwirkung von chemotherapeutischen Mitteln ist. Zweitens inhibieren sie gewöhnlich mindestens eine Klasse der GST-Isoenzyme, einschließlich der &pgr;-Unterklasse, welche besonders in Tumorzellen sehr häufig vorliegt. Drittens potenzieren die Verbindungen der Formel (1) direkt die Wirkung von chemotherapeutischen Mitteln bei der Zerstörung von Tumorzellen. Diese Kombination von vorteilhaften Eigenschaften machen die Verbindungen sowohl als direkt die Hämatopoese potenzierende Mittel nützlich als auch, um die negativen Auswirkungen von chemotherapeutischen Behandlungsschemata zu verbessern sowie die toxische Wirkung auf die Zielzellen zu verstärken. Wenn sie zur Verwendung in vivo oder in Kontakt mit intakten Zellen formuliert werden, werden die Verbindungen der Formel (1) bevorzugt als die Ester, bevorzugt die Diester, bevorzugter die Diester von gesättigten Alkoholen, die 1–5 C, bevorzugter 1–3 C enthalten, und am bevorzugtesten als die Diethylester bereitgestellt.

Die Synthese der in der Erfindung verwendeten Tripeptide kann durch in der Technik wohlbekannte Standardverfahren bewerkstelligt werden. Spezielle Techniken zur Synthese der in der Erfindung verwendeten Tripeptide sind in der PCT-Anmeldung WO 95/08563 angegeben, auf die oben Bezug genommen wurde. Ein besonders bevorzugter Syntheseweg ist in der vorliegenden Anmeldung beschrieben.

Verabreichung und Verwendung

Mit "Modulierung der Hämatopoese in Knochenmark oder peripherem Blut" ist die Änderung der Rate der Blutzellenbildung gemeint, wie durch die Fähigkeit gemessen, Kolonien oder differenzierte Zellen zu bilden. Differenzierte Zellen schließen Neutrophile, Blutplättchen, rote Blutzellen, Lymphozyten, Makrophage, Granulozyten, Granulozytmakrophage und dergleichen ein. Es ist unklar, was der Mechanismus dieser Modulation ist; die Zellen selbst können durch die Verbindungen der Erfindung direkt stimuliert werden oder nicht; vielmehr kann die Änderung der Zahl und/oder Größe der Kolonien von differenzierten Zellen auf einem bevorzugten Überleben, einer Hemmung der Apoptose oder irgendeinem einer Anzahl von Faktoren beruhen. Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezeichnet "Modulierung der Hämatopoese in Knochenmark oder peripherem Blut" die Fähigkeit von Knochenmark oder Blut, das mit den Verbindungen der Erfindung behandelt wird, eine Kolonienbildung oder Erzeugung von differenzierten Zellen bei einem Niveau zu zeigen, das von demjenigen von unbehandeltem Knochenmark verschieden ist. Ähnlich zeigen Fraktionen des Knochenmarks oder peripheren Bluts, die geeignete Vorläuferzellen enthalten, diesen Effekt. Es sollte bemerkt werden, dass, wie hierin verwendet, "peripheres Blut" speziell Nabelschnurblut einschließt.

Zusätzlich zur Modulierung der Hämatopoese beeinflussen die in der Erfindung verwendeten Verbindungen Knochenmarkzellen direkt und üben eine vorteilhafte Wirkung auf Knochenmarkzellen außer denjenigen hämatopoetischen Ursprungs aus. Beispielsweise verstärken diese Verbindungen auch die Bildung von Osteoblasten, um die Knochenregeneration zu unterstützen. So sind ihre vorteilhaften Auswirkungen auf Knochenmark nicht auf die Modulation der Hämatopoese als solcher beschränkt.

Wenn Mittel verwendet werden, die typisch zerstörerische Auswirkungen auf Knochenmark oder auf die Hämatopoese im Blut aufweisen, üben die in der Erfindung verwendeten Verbindungen allgemein eine Schutzwirkung aus. Mit "Schutzwirkung" ist gemeint, dass der resultierende Schaden für das Knochenmark oder Blut geringer ist, wenn die Verbindung verabreicht wird, als wenn sie es nicht wird. Die Nettoabnahme des Schadens kann auf einem Schutz als solchem beruhen – d. h. der Verhütung der zerstörerischen Auswirkungen, die normalerweise stattfinden würden, oder sie kann aus der Beschleunigung der Erholung von einer derartigen Zerstörung resultieren. So schließt die "Schutzwirkung" die Wirkung des Erzielens dieses wünschenswerten Ergebnisses ein, unabhängig vom Mechanismus, durch welchen es erzielt wird.

Es gibt eine Anzahl von Situationen, in denen die Schutzwirkung der in der Erfindung verwendeten Verbindungen nützlich ist. Diese umfassen Fälle, bei denen eine Strahlung negative Auswirkungen zum Ergebnis hatte oder voraussichtlich haben kann, Fälle, bei denen ein Patient aus irgendeinem Grund immungeschädigt ist, Fälle, bei denen ein Patient einen Nierenschaden zeigt, sowie Fälle, bei denen der Patient einer Chemotherapie unterzogen worden ist. Zusätzlich können die Verbindungen der Erfindung in Transplantationsverfahren verwendet werden, um die Zahl der Zellen im Knochenmark eines Donors zu erhöhen; typisch kann in diesem Fall die Verbindung in vivo oder ex vivo verabreicht werden. In diesem Verfahren fördern die in der Erfindung verwendeten Verbindungen ebenfalls die Bewegung von Vorläuferzellen in das periphere Blut des Donors, was so die Erholung der Zahlen von weißen Zellen im peripheren Blut bei diesem Donor verbessert; ähnlich können die in der Erfindung verwendeten Verbindungen die Erholung der Zahlen von peripheren weißen Blutzellen im Empfänger verbessern. Allgemein verbessern die Verbindungen die Expansion und fördern die letztendliche Einpflanzung von transplantierten Zellen nach Einwirkung der Verbindungen der Erfindung in vivo oder ex vivo. Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen können direkt im Empfänger verwendet werden, um die Erholung zu beschleunigen.

Zusätzlich werden Patienten, die einer Nierendialyse unterzogen werden, durch die in der Erfindung verwendeten Verbindungen beim Wiederaufbau von Blut unterstützt. Die Verbindungen sind auch allgemein zur Förderung des Knochenwachstums nützlich.

Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen können entweder in vitro oder in vivo verwendet werden. Beispielsweise können diese Verbindungen verwendet werden, um hämatopoetische Zellen in Knochenmark vor einer allogenen oder xenogenen Transplantation zu expandieren oder auf andere Weise zu modulieren. Die Behandlung von Subjekten unter Verwendung von Ex-vivo-Techniken, wodurch eine Expansion von relativ undifferenzierten Zellen aus dem Blutstrom stattfindet, kann ebenfalls verwendet werden. Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen können auch für eine In-vivo-Verabreichung formuliert werden.

Formulierungen für eine In-vivo-Verabreichung verwenden Standardverfahren, wie diejenigen, die Remington's Pharmaceutical Sciences, letzte Auflage, Mack Publishing Company, Easton, PA, beschrieben werden. Die Verbindungen sind für die orale Verabreichung zu formulieren. Wie nachstehend gezeigt, sind die Verbindungen wirksam, wenn sie oral verabreicht werden.

Da die orale Verabreichung besonders bequem ist und da die Verbindungen aktiv sind, wenn sie oral verabreicht werden, sind Formulierungen zu verwenden, die für die Verabreichung durch den Mund geeignet sind. Derartige Formulierungen umfassen, wie man es gut versteht, Pillen, Tabletten, Kapseln, Sirupe, Pulver oder mit Geschmacksstoff versetzte Flüssigkeiten. Die verschiedenen Formulierungen können in Dosierungeinheitsform hergestellt werden und können, falls gewünscht, durch den Patienten selbst verabreicht werden. Der Prozentsatz an Wirkstoff-Verbindung (oder Mischung von Verbindungen) in der Formulierung kann über einen großen Bereich von etwa 0,5% Gew./Gew. bis etwa 95% Gew./Gew. variieren. Der bevorzugte Prozentsatz an Wirkstoff hängt von der Natur der Formulierung als solcher ab. Geeignete Hilfsstoffe, die in diese Formulierungen eingeschlossen werden, umfassen Füllstoffe, Puffermittel, Stabilisatoren und dergleichen.

Geeignete Subjekte, die von der Verabreichung der Verbindungen, entweder einer einzigen Verbindung oder von Mischungen derselben, profitieren, umfassen Wirbelsubjekte, insbesondere Säuger- oder menschliche Subjekte, deren Knochenmark-Vorläuferzellen eine unzureichende Zahl oder einen unzureichenden physiologischen Status aufweisen, um eine Differenzierung aufrecht zu erhalten, die nicht auf geeignete Weise differenzieren. Ein Versagen der Vorläuferzellen, die erforderliche Zahl von Effektorzellen zum Ergebnis zu haben, findet insbesondere statt, wenn das Subjekt Knochenmark zerstörenden Mitteln, wie chemotherapeutischen Mitteln, Strahlung, Einwirkung von Toxinen in der Umgebung und dergleichen, ausgesetzt worden ist. Ebenfalls eingeschlossen sind diejenigen mit Knochenmark degenerierenden Krankheiten und Zuständen. So umfassen geeignete Subjekte für die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen Patienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen; immungeschädigte Patienten, Patienten, die Symptome von Anämie, Neutropenie, Thrombozytopenie oder einen Mangel an ausreichenden Blutplättchen-Konzentrationen zeigen, und zukünftige Subjekte für eine Behandlung von zytotoxischen Mitteln. Da die in der Erfindung verwendeten Verbindungen auch spezifisch die Zytotoxizität von chemotherapeutischen Mitteln bezüglich maligner Zellen potenzieren, können Subjekte von einer Behandlung mit den Verbindungen profitieren, obwohl das hämatopoetische System nicht notwendigerweise durch die chemotherapeutische Behandlung beeinträchtigt ist.

Wie oben angemerkt, kann eine einzige in der Erfindung verwendete Verbindung als Wirkstoff eingeschlossen werden, oder die Behandlung kann die Verwendung von Mischungen dieser Verbindungen umfassen. Zusätzlich können die Verbindungen mit anderen vorteilhaften Mitteln, wie Immunstimulantien oder Wachstumsfaktoren, gemischt oder zusätzlich zu diesen verwendet werden.

Die erforderliche Dosis hängt von der Natur des Subjekts, der Natur des Zustands, der Weise der Verabreichung und der Beurteilung des behandelten Arztes oder Tierarztes ab. Geeignete Dosisbereiche werden gemäß diesen Parametern festgelegt. Im Allgemeinen liegen typische Dosen pro Patient im Bereich von 0,1–100 mg/kg pro Tag über 10–40 Tage, bevorzugter 1–10 mg/kg pro Tag über 14–28 Tage. Diese Bereiche sind lediglich erläuternd, und die korrekte Dosisoptimierung kann durch Routineverfahren vorgenommen werden.

Wenn die Verbindungen als Schutzmittel mit Bezug auf eine chemotherapeutische Behandlung verabreicht werden, kann der Zeitpunkt der Verabreichung ebenfalls relevant sein. Der Zeitpunkt hängt jedoch von der Natur des verwendeten chemotherapeutischen Mittels ab. Wie nachstehend gezeigt, scheint zum Beispiel, wenn 5-FU für die Chemotherapie verwendet wird, eine Verabreichung etwa 24 Stunden nach der Verabreichung des 5-FU vorteilhaft zu sein. Andererseits ist, obwohl dieser Zeitpunkt der Verabreichung auch wirksam ist, wenn Cisplatin das chemotherapeutische Mittel ist, eine Verabreichung etwa 24 Stunden vor der Cisplatin-Verabreichung wirksamer. Es liegt klar innerhalb des üblichen Fachwissens, einen geeigneten Zeitpunkt für das spezielle verwendete chemotherapeutische Mittel zu bestimmen.

Erläuternde Verbindungen

Als erläuternde Verbindungen, die als GST-Isoenzym-Hemmer nützlich sind, wurden die folgenden hergestellt:

&ggr;-E-C(Bz)-&phgr;G (TER117);

&ggr;-E-C(Hexyl)-&phgr;G (TER102);

&ggr;-E-C(Naphthyl)-G (TER211); und

&ggr;-E-C(Octyl)-G (TER143).

Unter diesen Verbindungen zeigte TER117 die höchste Spezifität für GST P1-1. TER102 war ebenfalls ziemlich spezifisch. Deshalb wurden verschiedene Derivate von TER117 synthetisiert. Bei allen vorangehenden Verbindungen liegen der &ggr;-Glutamyl- und Cysteinyl-Rest in seiner nativen L-Konfiguration vor. In TER117 und TER102 liegt Phenylglycin in der D-Konfiguration vor.

Die folgenden Ester und Amide von TER117 wurden hergestellt:

TER199: &ggr;E-Ethylester-C(Bz)-R-(–)-&phgr;G-ethylester;

TER278: &ggr;E-Ethylamid-C(Bz)-R-(–)-&phgr;G-ethylamid;

TER300: &ggr;E-Ethylamid-C(Bz)-R-(–)-&phgr;G-ethylester.

Die In-vitro-Halbwertszeit von TER199 in Mäuseblut beträgt weniger als 1 Minute, während die Halbwertszeit in menschlichem Blut etwa 90 Minuten beträgt.

In-vitro-Untersuchungen dieser Verbindungen zeigten, dass TER278 und TER300 in Mäuseblut und in HT-29-Zellkultur längere Halbwertszeiten als TER199 aufweisen; jedoch ist die Halbwertszeit in menschlichem Blut bei allen drei Verbindungen etwa die gleiche.

TER278 ist weniger toxisch und weniger in der Lage, Chlorambucil zu potenzieren, als TER199.

TER300 wird mit einer Geschwindigkeit metabolisiert, die in Mäuseblut und in HT-29-Zellkultur zwischen derjenigen von TER199 und TER278 liegt. Viermal soviel TER300 wie TER199 ist erforderlich, um eine äquivalente Potenzierung von Chlorambucil zu erzielen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, aber nicht beschränken. Diejenigen Beispiele (oder diejenigen Teile der Beispiele), in denen eine peritoneale Verabreichung verwendet wird, sind lediglich erläuternd und sind nicht Teil des Schutzbereiches.

Beispiel 1 Verwendung der Verbindungen der Erfindung bei der Potenzierung von zytotoxischen Mitteln in Human-Zellen

Dieses Beispiel beschreibt: 1) die Potenzierung eines zytotoxischen Mittels, das derzeit in der Krebs-Chemotherapie verwendet wird, in Human-Tumorzellen durch GST-Hemmer, welche Verbindungen der vorliegenden Erfindung einschließen, sowie 2) eine erhöhte intrazelluläre Wirksamkeit von veresterten Formen dieser Verbindungen.

HT-29-(Human-Kolon-Adenokarzinom-)Zellen wurden von Dr. Roberto Ceriani (Cancer Research Fund of Contra Costa County, Walnut Creek, CA) erhalten und wurden in der Phase logarithmischen Wachstums verwendet, falls nicht anders angegeben. Chlorambucil (CMB) wurden von Sigma (St. Louis, MO) erhalten und wurde in 100%-igem Ethanol gelöst. Alle GST-Hemmer wurden unmittelbar vor der Verwendung in Ethanol, DMSO oder Wasser gelöst. Die gleiche Menge an Lösungsmittel, die zu dem Kulturmedium gegeben wurde, diente als Vehikelkontrolle.

In einem modifizierten klonogenen Assay für die Zytotoxizität wurden Zellen 2 × 105 Zellen/ml in serumfreiem Medium in Anwesenheit von Vehikel oder Hemmer suspendiert. Die Hemmer wurden bei Konzentrationen verwendet, die ein Überleben von ≥ 90% in Anwesenheit von Hemmer allein zum Ergebnis hatten, wenn sie mit den Vehikel-behandelten Zellen verglichen wurden. Die Zellen wurden 2 Stunden inkubiert, dann wurden variierende Dosen an CMB dazugegeben. Am Ende einer zweiten 2-stündigen Inkubation wurden die Zellen in Serum-haltigem Medium auf 7,5–10 × 103/ml verdünnt und vierfach mit 200 &mgr;l/Vertiefung in Microtest 111-Mikrotiterplatten plattiert.

Die Platten wurden 6 Tage inkubiert und mittels eines modifizierten Methylenblau-Verfahrens getestet. Kurz gesagt, wurden die Zellen mit 1,25% Glutaraldehyd in PBS fixiert, dann mit 0,05% Methylenblau in destilliertem Wasser gefärbt. Die Platten wurden mehrere Male in destilliertem Wasser gewaschen, um nicht zurückgehaltenen Farbstoff zu entfernen, und der zurückgehaltene Farbstoff wurde wieder in 0,03 N HCl gelöst. Die Platten wurden in einem Molecular Devices Vmax-Plattenablesegerät (Molecular Devices, Redwood City, CA) bei 650 nm abgelesen. Die IC50-Werte (Hemmkonzentration, die eine 50%-ige Verringerung der Zellenlebensfähigkeit bewirkt) wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitor aus Dosis-Antwort-Kurven für den Arzneistoff bestimmt. Ein Dosismodifikationsfaktor (DMF), ein Maß für die Potenzierung der Zytotoxizität, wurde für jeden Hemmer berechnet, indem man den IC50-Wert von CMB ohne Behandlung mit dem Hemmer durch den IC50-Wert von CMB mit Behandlung mit dem Hemmer dividierte.

Die Ergebnisse in den Tabellen 1–3 zeigen, dass mehrere GSH-Analoga, von denen man fand, dass sie Hemmer von GSH waren, auch das Abtöten von Human-Tumorzellen in Kultur durch CMB potenzieren, das ein Substrat für verschiedene GSTs ist. Die Ergebnisse der Potenzierungstests mit mehreren GST-Hemmern in HT-29-Zellkulturen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1

Potenzierung der Chlorambucil-Zytotoxizität in Human-Zellen durch GST-Hemmer und deren Ester
Die Testdosis wurde aus der Toxizitätskurve bestimmt, und die Analoga wurden mit der Dosis verwendet, bei der ein Überleben ≥ 90% in Anwesenheit von Analogon allein stattfand. Dosismodifikationsfaktor. Die Werte sind das Mittel ± S. A. von 2–3 Experimenten.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, wird diese Potenzierung durch Veresterung in großem Maße verstärkt, welche so ausgelegt ist, dass sie die Aufnahme der GST-Hemmer erhöht. So verstärkte &ggr;E-C(Bz)-&phgr;G bei 100 &mgr;M die Zellenabtötung durch CMB nicht, wobei es die Konzentration an CMB, die für eine 50%-ige Zellenabtötung erforderlich war, um einen DMF von 1,08 erniedrigte. Im Gegensatz dazu verstärkte der Diethylester von &ggr;E-C(Bz)-&phgr;G (TER199) bei nur 12,5 &mgr;M die CMB-Zytotoxizität um einen Faktor von 1,65.

Die bevorzugte Expression des GST-Isoenzyms P1-1 ist in einem Bereich von Human-Tumoren mitgeteilt worden. In der vorliegenden Studie korrelierte die Wirksamkeit der CMB-Potenzierung der mehreren getesteten GST-Hemmer direkt mit ihren Potenzen als Hemmer der &pgr;-Klasse des Human-GST-Isoenzyms, P1-1, wie in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Rangkorrelation von Chlorambucil-Dosismodifikationsfaktoren (DMFs) von GST-Hemmern mit Ki-Wert für die Hemmung von Human-GST-P1-1
Dosismodifikationsfaktor von Diethylester. Werte sind Mittel ±S. A. von 2–3 Experimenten.

Die Auswirkung der Veresterung oder Amidierung der Verbindungen der Formel (1) auf ihre Potenzierung der Chlorambucil-Zytotoxizität in HT-29-Zellen wurde ebenfalls bestimmt. Der DMF wurde für den Diethylester, das Diamid und das Ester/Amid von &ggr;E-C(Bz)-&phgr;G bei relevanten Konzentrationen bestimmt. Die Diester zeigten einen DMF von 1,65 ± 0,04 für die Chlorambucil-Toxizität bei 12,5 &mgr;M; das Diamid zeigte einen DMF von 1,0 in einem einzigen Experiment bei 200 &mgr;M; das Ester/Amid-Hybrid zeigte einen DMF von 1,45 ± 0,16 bei 50 &mgr;M Konzentration. Die Ergebnisse für den Diethylester und das Ester/Amid-Hybrid sind als das Mittel ±S. A. von drei Experimenten angegeben.

Die Diethylester von &ggr;E-C(Octyl)-G (TER183) und &ggr;E-C(Bz)-&phgr;G (TER199) wurden in einem klonogenen Standardassay unter Verwendung von drei Zelllinien getestet: HT4-1, einem Subklon von HT-29; SKOV-3, einem Eierstockkarzinom, und VLB, einer Vinblastin-resistente Variante von SKOV-3. Vier chemotherapeutische Arzneistoffe, Chlorambucil, Adriamycin, Mitomycin C und Doxorubicin, wurden als die toxischen Mittel verwendet. In diesen Assays wurden die Zellen mit 300 Zellen/Vertiefung in 2 ml Medium in Platten mit 6 Vertiefungen in Anwesenheit der in der Erfindung verwendeten Verbindungen als Diethylester gesät. Die Verbindungen wurden bei solchen Konzentrationen verwendet, die ein mehr als 85%-iges Überleben im Vergleich zu Kontrollen zum Ergebnis hatten. Nach Inkubation über 1–2 Stunden, um die Zellen anhaften zu lassen, wurden variierende Dosen der chemotherapeutischen Mittel dazugegeben. Mindestens drei gleiche Vertiefungen wurden bei jeder Testbedingung plattiert, und die Platten wurden zwei Wochen inkubiert. Die Kolonien wurden in 95%-igem Ethanol fixiert und mit Kristallviolett für die Kolonienzählung gefärbt. Die IC50-Werte wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit der in der Erfindung verwendeten Verbindung für das chemotherapeutische Mittel bestimmt, und die Dosismodifikationsfaktoren wurden berechnet, indem man den IC50-Wert des Arzneistoffs ohne die Verbindung durch den IC50-Wert des Arzneistoffs mit der Verbindung dividierte. Die in jedem Protokoll erhaltenen Modifikationsfaktoren sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Fähigkeit von ausgewählten GSH-Analoga, die Arzneistofftoxizität zu potenzieren, wie in einem klonogenen Assay demonstriert
Dosismodifikationsfaktor. Keine Daten aufgrund von Toxizität von Analogon. Testdosis war von der links angegebenen verschieden. Nicht bestimmt.

Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurde eine signifikante Modifikation erhalten, als Chlorambucil in Anwesenheit von 25 &mgr;M TER199 als Arzneistoff gegen HT4-1-Zellen verwendet wurde. Eine signifikante Modifikation wurde auch in VLB-Zellen erzielt, als sie mit Adriamycin oder Doxorubicin in Anwesenheit von 25 &mgr;M derselben Verbindung behandelt wurden.

1a veranschaulicht die Ergebnisse für variierende Dosen von Chlorambucil und die modifizierende Wirkung von 25 &mgr;M des Diethylesters von &ggr;E-C(Bz)-&phgr;G (TER199). Die offenen Quadrate (☐) stellen Chlorambucil allein dar, die geschlossenen Kreise (•) Chlorambucil in Anwesenheit der Verbindung. Wie aus 1a ersichtlich ist, ist die Überlebensrate deutlich verringert, wenn die Verbindung zugesetzt wird. 1b bestätigt, dass der Diethylester erforderlich ist, um die Zellen zu penetrieren. HT4-1-Zellen wurden in Anwesenheit entweder von &ggr;E-C(Bz)-&phgr;G (TER117) (geschlossene Quadrate,

) oder von dessen Diethylester (TER199) (geschlossene Kreise, •) bezüglich des Überlebens getestet. Die unveresterte Form, TER177, weist bei diesen Zellen im Wesentlichen keine Wirkung auf, während der Diethylester (TER199) klar toxisch ist.

Beispiel 2 Potenzierung der Melphalan-Toxizität in vivo

Männlichen scid-Mäusen wurden subkutan HT4-1-Tumoren aus Donormäusen implantiert. HT4-1 ist ein Subklon von HT-29, einem Human-Kolonkrebs. Als die Tumoren etwa 100 mm3 erreicht hatten, wurden die Mäuse statistisch in sechs Behandlungsgruppen eingeteilt und sieben Tage lang wie folgt behandelt:

  • 1. 5 mg/kg Melphalan;
  • 2. 10 mg/kg Ethacrynsäure;
  • 3. 60 mg/kg TER199;
  • 4. 5 mg/kg Melphalan + 10 mg/kg Ethacrynsäure;
  • 5. 5 mg/kg Melphalan + 60 mg/kg TER199;
  • 6. nur Vehikel.

Die Mäuse wurden bezüglich Gewichtsänderungen überwacht, und die Tumorvolumina wurden durch Messung mit Tastern bestimmt. Das Tumorwachstum wurde überwacht, bis die durchschnittliche Tumorgröße bei allen Gruppen außer Melphalan mit Ethacrynsäure 1500 mm3 erreicht hatte. Diese Gruppe erreichte dieses Volumen selbst nach 72 Tagen nicht.

Die Ergebnisse wurden als Tumorvolumen bei den mit Arzneistoff behandelten Mäusen als Prozentsatz des Kontroll-Tumorvolumens (d. h. in der Gruppe, der nur Vehikel verabreicht wurde) berechnet. In der Gruppe 1, der nur Melphalan verabreicht wurde, betrugen die Tumoren etwa 75% des Volumens der Kontrollen. In der Gruppe 5, in der TER199 zusammen mit dem Melphalan verabreicht wurde, betrug das Tumorvolumen-Mittel etwa 55% der Kontrolle. Bei der Gruppe 4, der eine Kombination von Melphalan und Ethacrynsäure verabreicht wurde, betrugen die Volumina etwa 35% der Kontrolle. Demgemäß potenzieren sowohl Ethacrynsäure als auch TER199 diese Wirkungen von Melphalan. (Die Volumenmessungen wurden zu dem Zeitpunkt vorgenommen, an dem die Kontrolltumoren 1500 mm3 erreicht hatten.)

Beispiel 3 Metabolische Wirkungen der Verbindungen

Die metabolischen Wirkungen, die mit der Toxizität der Verbindungen der Erfindung in Beziehung stehen, wurden bei HT-29-Zellen unter Verwendung eines Cytosensor Microphysiometer getestet, das von Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA hergestellt wird und in McConnell, H. M. et al., Science (1992) 257: 1906–1912 und von Wada, H. G. et al., AATEX (1992) 1: 154–164 beschrieben ist. Änderungen des pH des Kulturmediums werden als Funktion des zellulären Metabolismus gemessen. Die Ansäuerungsraten des kleinen Flüssigkeitsvolumens, das über die Zellen fließt, korrelieren mit der Zahl von lebenden Zellen in der Reaktionskammer; eine Verringerung der Ansäuerungsrate spiegelt eine verringerte Zahl von überlebenden Zellen wieder.

In dieser Veranschaulichung wurden HT-29-Zellen mit 4 × 105 Zellen/Kammer in einem Medium plattiert, das 10% fetales Kälberserum enthielt. Nach 16–18 Stunden wurde die Serumkonzentration auf 1% verringert, und die Zellen wurden weitere 18 Stunden gehalten. Die Zellen wurden dann 4 Stunden lang entweder Ethacrynsäure (50 &mgr;M), TER199 (20 &mgr;M) oder einem Vehikel (0,1%-igem Ethanol) ausgesetzt. Das Medium wurde dann durch ein serumfreies Medium mit niedriger Pufferkapazität ersetzt, und man begann mit der Mikrophysiometer-Analyse. Die Hälfte der Kammer wurde 100 &mgr;M Chlorambucil ausgesetzt, und die andere Hälfte Vehikel (0,1%-igem Ethanol). Die Ansäuerungsraten wurden 16 Stunden lang überwacht, und die Daten sind als Prozentsatz der Grundlinien(100%)-Ansäuerungsraten ausgedrückt.

Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Weder der &ggr;E-C(Bz)-&phgr;G-Diethylester (TER199) noch Ethacrynsäure allein hatten eine merkliche Auswirkung auf die Ansäuerungsraten; jedoch potenzierten sowohl die Ethacrynsäure-Vorbehandlung als auch die Vorbehandlung mit TER199 die Wirkung von Chlorambucil. In der Figur geben die offenen Symbole keine Zugabe von Chlorambucil wieder; geben die geschlossenen Symbole die Zugabe von Chlorambucil wieder; geben die Quadrate die Vorbehandlung mit Vehikeln, die Dreiecke die Vorbehandlung mit Ethacrynsäure und die Kreise die Vorbehandlung mit TER199 wieder.

Beispiel 4 Stimulation von Knochenmark-Granulozytmakrophage-(GM-)Vorläuferzellen

Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen stimulieren, wenn sie verestert sind, so dass sie Zellen penetrieren können, auch die Produktion von GM-Vorläuferzellen in Knochenmark, wenn sie Säugersubjekten verabreicht werden. In einem erläuternde Assay wurden drei B6D2F1-Mäuse intraperitoneal mit verschiedenen Dosen von Benzyl-PG behandelt. Oberschenkel-Knochenmark wurde 24 Stunden später geerntet und mittels des Verfahrens von East, C. J. et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1992) 31: 123–126, bezüglich GM-CFU getestet. Eine Zunahme der Kolonien-Zahl auf Dosisabhängige Weise bis zu einer Dosis von 90 mg/kg TER199 wurde erhalten. Diese Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Bei 90 mg/kg wurden etwa 275 Kolonien/104 kernhaltige Zellen erhalten, verglichen mit etwa 140 Kolonien/104 kernhaltige Zellen bei Kontrollen.

Beispiel 5 Vergleich von intraperitonealer und oraler Verabreichung von TER199 bei Maus-GM-CFU

Fünf Wochen alte männliche B6D2F1-Mäuse mit 20–24 Gramm wurden in Gruppen von drei Mäusen aufgeteilt, und es wurden ihnen verschiedene Dosen von TER199 entweder oral oder intraperitoneal verabreicht. Das TER199 wurde in sterilem Nanopore-Wasser hergestellt und oral unter Verwendung einer Magensonde und einer 1 cm3-Spritze oder intraperitoneal in Kochsalzlösung unter Verwendung einer 1 cm3-Spritze mit einer 28 Kaliber-Nadel verabreicht. Mäusen in der Kontrollgruppe wurde Wasser oder Kochsalzlösung injiziert. Knochenmarkzellen wurden 24 Stunden nach der Arzneistoffbehandlung geerntet und zu alpha Minimum Essential Medium (alpha MEM) gegeben, das mit Methylcellulose (0,8% Gew./Vol.) fetalem Rinderserum (20% Vol./Vol.), deionisiertem BSA (1% Gew./Vol.), Pokeweed-Mitogen-stimuliertem Milzzellen-konditioniertem Medium (PWM-SCCM)1 Pokeweed-Mitogen-stimuliertes Milzzellen-konditioniertes Medium (PWM-SCCM) wurde gemäß dem Verfahren von Gringeri et al., 1988, hergestellt. Die Milz wurde aseptisch aus vier männlichen B6D2F-Mäusen entfernt und durch ein 200 Tm-Drahtmaschensieb gezwängt, um eine Einzelzellen-Suspension zu erhalten. 10 ml der Suspension (2–4 × 10 Zellen/ml) wurden zu 90 ml alpha-MEM gegeben, das mit 1% deionisiertem BSA, 50 Tg/ml Gentamicin, 0,3% frisch aufbereitetem Pokeweed-Antigen, 10 &mgr;M 2-Mercaptoethanol ergänzt war. Die Mischung wurde 5 Tage bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO inkubiert, und das resultierende konditionierte Medium wurde zehn Minuten bei 800 g zentrifugiert und durch ein 0,22 Tm-Filter filtriert. Aliquoten wurden bei –200°C bis zur Verwendung gefroren gehalten. (10% Vol./Vol.) und Gentamycin (50 Tg/ml) ergänzt war. 1 ml-Aliquoten wurden plattiert (vier identische Platten) und sieben Tage bei 37°C inkubiert. Ein Präpariermikroskop wurde verwendet, um die Granulozytmakrophagen-Kolonien mit mehr als 50 Zellen pro Kolonie (GM-CFU) zu zählen.

4a zeigt die Auswirkung der oralen gegenüber der i. p.-Verabreichung von TER199 auf die Knochenmarks-GM-CFU in einer einzigen Behandlung. Die Daten sind das Mittel ±SFM bei drei Mäusen pro Gruppe. Der Stern zeigt an, dass der Wert statistisch signifikant von der Kontrolle abweicht, P < 0,05. Wie in 4a gezeigt, ist die i. p.-Verabreichung (geschlossene Quadrate,

) bei 60–90 mg/kg am wirksamsten; die orale Verabreichung (geschlossene Kreise (•)) ist bei 120–180 mg/kg am wirksamsten. Die Ergebnisse zeigen, dass die in der Erfindung verwendeten Verbindungen oral wie auch i. p. verabreicht werden können, obwohl für die orale Verabreichung höhere Dosierungsniveaus erforderlich sein können.

4b zeigt die Ergebnisse eines zusätzlichen Experiments und schließt eine i. v.-Verabreichung ein. Es werden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Beispiel 6 Zeitverlauf der TER199-Stimulation von Knochenmark-Makrophagen-(GM-)Vorläuferzellen

Die Verfahren von Beispiel 5 wurden wiederholt, wobei eine einzige 60 mg/kg-Dosis von TER199, die am Tag 0 i. p. verabreicht wurde, verwendet wurde und die Knochenmarkzellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung geerntet wurden. Die GM-CFU bei den Mäusen, denen TER199 verabreicht worden war, wurde mit Kontrollen verglichen, und die Ergebnisse sind als Funktion des Tags nach Verabreichung in 5 gezeigt. Eine maximale Stimulation schien am Tag 2 und am Tag 5 stattzufinden.

Beispiel 7 TER199-Auswirkung auf Maus- und Human-Knochenmark-Kolonienbildung

Die Auswirkung von TER199 auf die Kolonienbildung durch Granulozytmakrophage (CFU-GM), Zellen der erythrozytären Reihe (BFU-E) und multipotente Vorläuferzellen (CFU-GEMM) wurde ausgewertet. TER199 verstärkt die Proliferation von Human- und Mäuse-Knochenmark-Vorläuferzellen in vitro. Diese Wirkungen sind Dosis-abhängig, gewöhnlich im Bereich von 1,0 bis 10,0 &mgr;M, und in den meisten Fällen bei Zellen, die durch GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Flt3/Flk-2 und den Steel-Faktor (Stammzellenfaktor/c-Kit-Ligand) stimuliert werden. Von besonderem Interesse war der Befund, dass TER199 die Kolonienbildung verstärkt, die durch Kombinationen von Cytokinen stimuliert wird. Zusätzlich ist die Verstärkungswirkung bei Human-Knochenmark ausgeprägter als bei Mäuse-Knochenmark. Diese Ergebnisse legen nahe, dass TER199 auf mehrere Linien von Knochenmark-Stammzellen und -Vorläuferzellen verstärkende Auswirkungen aufweist. Dass eine größere Wirkung bei Human-Mark auftritt, steht mit der Spezifität von TER199 für das Human-GST-Isozym P1-1 in Einklang. Ergebnisse aus einer repräsentativen Gruppe dieser Experimente sind in den Tabellen 4–9 wiedergegeben.

Tabelle 4: Einfluss von TER199 auf die Kolonienbildung durch normale Human-Knochenmark-GM-Vorläuferzellen, die durch einzelne Cytokine stimuliert werden
Tabelle 5: Einfluss von TER199 auf die Kolonienbildung durch normale Human-Knochenmark-GM-Vorläuferzellen, die durch Kombinationen von Cytokinen stimuliert werden

Nur Kolonien, die gebildet wurden, als Flt3-L oder SLF zusammen oder mit GM-CSF, G-CSF oder IL-3 zugesetzt wurden.

Tabelle 6: Einfluss von TER199 auf die Kolonienbildung durch normale Human-Knochenmark-Zellen der erythrozytären Reihe (BFU-E) und multipotente (CFU-GEMM) Human-Knochenmark-Vorläuferzellen
Tabelle 7: Einfluss von TER199 auf die Kolonien- und Clusterbildung durch normale BDF1-Maus-Knochenmark-Granulozytmakrophage-(CFU-GM-)Vorläuferzellen

Die Tabellen 8 und 9 zeigen die Ergebnisse eines Experiments, das ausgelegt war, um die Ergebnisse zu vergleichen, die erhalten wurden, als TER199 mit Human-Knochenmark-Zellen der erythrozytären Reihe und mit multipotenten Human-Knochenmark-Vorläuferzellen in Gegenüberstellung mit ihren Mäuse-Gegenstücken in Kontakt gebracht wurde. Wie in diesen Tabellen gezeigt, sind die Ex-vivo-Auswirkungen beim Menschen (Tabelle 8) wesentlich größer als diejenigen, die bei ihren Mäuse-Gegenstücken gezeigt werden (Tabelle 9).

Tabelle 8: Einfluss von TER199 auf die Kolonienbildung durch normale Human-Knochenmark-Zellen der erythrozytären Reihe (BFU-E) und multipotente Human-Knochenmark-(CFU-GEMM-)Vorläuferzellen Signifikante Zunahme im Vergleich zu Kontrolle, p < 0,05
Tabelle 9: Einfluss von TER199 auf die Kolonienbildung durch normale BDF1-Maus-Knochenmark-Zellen der erythrozytären Reihe (BFU-E) und multipotente Human-Knochenmark- (CFU-GEMM-) Vorläuferzellen
Beispiel 8 Auswirkung von TER199 auf periphere Blutzellen

Die Auswirkung von TER199 (90 mg/kg/Tag × 5, i. p.) auf periphere Blutzählungen wurde bei von Sprague-Dawley abstammenden Ratten bewertet. Die Ratten wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, und man entnahm jeder Gruppe an abwechselnden Tagen Blut. Die mittlere Gesamt-Leukozyten-, absolute Lymphozyten- und absolute Neutrophilen-Zahlen nahmen im Verlauf des Untersuchungszeitraums zu. Repräsentative Daten sind in 6 wiedergegeben. TER199 verursacht eine zweifache Zunahme der Konzentrationen an zirkulierenden weißen Blutzellen bei Ratten. Es gab keine signifikante Änderung bei den Zahlen der roten Blutzellen oder der Blutplättchen, mit Ausnahme einer mittleren Abnahme der Blutplättchen-Zahl am Tag 9 (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich schien TER199 keinerlei schädliche Auswirkungen auf diese Tiere aufzuweisen.

Beispiel 9 Strukturelle Anforderungen

Die Auswirkung auf die Knochenmarkdifferenzierung durch verschiedene Derivate und Struktur-Analoga von TER199 als Funktion des Dosierungsniveaus wurde ebenfalls bestimmt. Knochenmark wurde 24 Stunden nach Verabreichung der Verbindungen geerntet, und die GM-CFU-Niveaus wurden wie oben beschrieben gemessen. 7 zeigt, dass der Diethylester (TER199) signifikant wirksamer ist als das gemischte Esteramid (TER300) und dass die entsprechende unveresterte Verbindung nicht wirksam ist. In 7 stellen die offenen Dreiecke (&Dgr;) die unveresterte Verbindung (TER117) dar; die offenen Kreise (O) stellen das gemischte Esteramid (TER300) dar. Die offenen Quadrate (&#9744;) stellen die Ergebnisse mit dem Diethylester, TER199, dar. Es ist bekannt, dass das gemischte Esteramid (TER300) langsamer metabolisiert wird als TER199. Der Metabolismus von TER300 erzeugt TER117. Die Ergebnisse in 7 stehen mit der Unfähigkeit von TER117, in die Zellen einzutreten, und dem langsameren Metabolismus von TER300 in Einklang.

8 zeigt Ergebnisse von ähnlichen Experimenten für TER199 und dessen Analoga. Die offenen Quadrate (&#9744;) stellen TER199 dar; die offenen Kreise (O) stellen TER183 dar, worin die Benzylgruppe im TER199 durch Octyl und &phgr;G durch G ersetzt ist. Die offenen Rauten (&#9826;) und offenen Dreiecke (&Dgr;) stellen die inaktiven Verbindungen TER317 bzw. TER206 dar; in TER317 ist Phenylglycin von TER199 durch (S+)-Phenylalanin ersetzt; in TER206 ist das Benzyl von TER199 durch Naphthyl und Phenylglycin durch Glycin ersetzt. Diese Ergebnisse korrelieren mit der Wechselwirkung von TER199 und TER183 mit P1-1-GST-Isoenzym, wie in Tabelle 10 gezeigt, obwohl TER183 ein besserer Hemmer von A1-1 als von P1-1 ist.

Tabelle 10

Struktur, GST-Ki-Werte und Knochenmarkdifferenzierungs-Verstärkungswirkung von Glutathion-Analoga
bestimmt bei unveresterter Form Knochenmarkdifferenzierungs-Verstärkung
Beispiel 10 TER199-Verbesserung der Auswirkung von chemotherapeutischen Mitteln a) Auswirkung einer einzigen i. p.-Dosis von TER199 auf die GM-CFU-Suppression, die von 5-Fluoruracil verursacht wird.

Den in Beispiel 5 beschriebenen männlichen B62F1-Mäusen wurden 75 mg/kg 5-Fluoruracil (5-FU) verabreicht, das in 0,9%-iger steriler Kochsalzlösung präpariert und i. p. verabreicht wurde. Mäusen in Gruppen von drei wurden 60 mg/kg TER199 in sterilem Wasser entweder gleichzeitig mit der 5-FU-Verabreichung, 24 Stunden vor, 1 Stunde vor oder 24 Stunden nach der 5-FU-Verabreichung i. p. injiziert. Die Kontrollgruppe wurde mit keinem der Arzneistoffe behandelt. Das Knochenmark wurde geerntet, und die GM-CFUs wurden 24 Stunden nach der letzten Injektion bestimmt. Die Consensus-Ergebnisse sind in 9a gezeigt. TER199 bei –24 h; bei –1 h; und bei +24 h bedeutet, dass TER199 wurde 24 Stunden vor, eine Stunde vor bzw. 24 Stunden nach 5-FU verabreicht wurde. Die 5-FU-Behandlung allein verringert die GM-CFU auf 15% der Kontrollmäuse. TER199 verringert signifikant die 5-FU-induzierte GM-CFU-Suppression. Die gleichzeitige Injektion von TER199 mit Fluoruracil hat eine vierfache Zunahme der Zahl der GM-CFUs pro Oberschenkelknochen im Vergleich zur Injektion von Fluoruracil allein zum Ergebnis. Die Injektion von TER199 24 Stunden nach Fluoruracil hat größere als Kontrollwerte von GM-CFU-Zahlen pro Oberschenkelknochen zum Ergebnis.

Die Verabreichung von TER199, wie oben beschrieben, 24 Stunden nach Verabreichung von 5-FU beschleunigte die Erholung der Knochenmarkzellen und hatte letztendlich eine Stimulierung dieser Fähigkeit über Kontrollen hinaus, denen kein 5-FU verabreicht wurde, zum Ergebnis. Diese Ergebnisse sind in 9b zusammengefasst, welche zeigt, dass am Tag 4 nach der 5-FU-Verabreichung Mäuse, denen nur 5-FU verabreicht wurde (geschlossener Balken, &#8718;) GM-CFU etwa gleich der Kontrolle zeigten, während diejenigen, die zusätzlich zu 5-FU TER199 empfangen hatten (gestreifter Balken, X), GM-CFU etwa vom Zweifachen derjenigen der Kontrolle zeigten. Ähnliche Experimente, aber unter Verabreichung von TER199 24 Stunden vor 5-FU, hatten im Wesentlichen keine Auswirkung auf GM-CFU, wie in 9c gezeigt.

b) Auswirkung einer einzigen oralen Dosis von TER199 auf die GM-CFU-Suppression, die durch 5-Fluoruracil verursacht wird

Die Auswirkungen von TER199, das 24 Stunden nach Injektion von 5-FU durch den i. p.-Weg verabreicht wurde, waren auch erhältlich, als das TER199 oral verabreicht wurde. Knochenmark wurde 48 Stunden nach i. p.-Verabreichung von 75 oder 150 mg/kg 5-FU geerntet. Wenn es 24 Stunden nach 5-FU (75 oder 150 mg/kg i. p.) verabreicht wird, verursacht TER199 (150 mg/kg p. o.) eine zweifache Zunahme von GM-CFU bei der niedrigeren Dosis von 5-FU (90% gegenüber 47% der Kontrolle) und eine neunfache Zunahme bei der höheren Dosis (71% gegenüber 8%); siehe 9d. Die Werte sind der Mittelwert ±SF von drei Mäusen pro Punkt.

c) Auswirkung von TER199 auf die GM-CFU-Suppression, die von Cisplatin verursacht wird

Die Auswirkung einer einzigen p. o.- oder i. p.-Dosis von TER199 wurde bezüglich ihrer Fähigkeit bewertet, die Cisplatin-induzierte GM-CFU-Suppression bei Mäusen zu verringern. TER199 (60 mg/kg i. p.) wurde 24 Stunden vor, eine Stunde vor oder gleichzeitig mit Cisplatin (15 mg/kg i. p.) verabreicht. Knochenmark wurde 24 Stunden nach der Cisplatin-Verabreichung geerntet. Die GM-CFU-Werte sind der Mittelwert ±SF von drei Mäusen pro Punkt. 10 zeigt, dass eine vorherige Verabreichung von TER199 GM-CFUs erhöht, verglichen mit der Verabreichung von Cisplatin allein (10). Die Injektion von TER199 24 Stunden vor Cisplatin hat eine zweifache Zunahme der Zahl der GM-CFUs pro Oberschenkelknochen im Vergleich zur Injektion von Cisplatin allein zum Ergebnis (62% gegenüber 31% der Kontrolle).

Das in 11 wiedergegebene Experiment zeigt die Auswirkung einer oralen Verabreichung von TER199 24 Stunden vor der Behandlung oder 24 Stunden nach der Behandlung auf die Cisplatin-induzierte GM-CFU-Suppression. Knochenmark wurde 24 Stunden nach Verabreichung des zweiten Arzneistoffs geerntet. Die Werte sind der Mittelwert ± SF von drei Mäusen pro Punkt. Wenn es oral 24 Stunden vor Cisplatin (20 mg/kg i. p.) verabreicht wird, hat TER199 (150 mg/kg p. o.) eine nahezu vierfache Zunahme der GM-CFU zum Ergebnis (52% gegenüber 14% der Kontrolle). Die Verabreichung von TER199 24 Stunden nach Cisplatin hat eine 2,5-fache Zunahme der GM-CFU zum Ergebnis (40% gegenüber 14%). Diese Ergebnisse zeigen, dass TER199 bei der Verhütung oder Behandlung von Cisplatin-induzierter Neutropenie nützlich sein kann.

d) Auswirkung von TER199 auf die Carboplatin-induzierte GM-CFU-Suppression bei Mäusen

Die Auswirkung von TER199 auf die Verringerung der Carboplatin-induzierten GM-CFU-Suppression wurde in Experimenten bestimmt, die den oben beschriebenen ähnlich waren. TER199 (120 mg/kg, i. p.) wurde 24 Stunden vor, 24 Stunden nach oder gleichzeitig mit Carboplatin (90 mg/kg, i. p.) verabreicht. Knochenmark wurde 24 Stunden nach Verabreichung des zweiten Arzneistoffs geerntet. 12, Schaubild A, zeigt, dass TER199 die Carboplatin-induzierte GM-CFU-Suppression bei Mäusen verringert. Die gezeigten Werte sind der Mittelwert ±SF von drei Mäusen pro Punkt. 12, Schaubild B, zeigt, dass die orale Verabreichung von TER199 (150 mg/kg p. o.) sogar noch wirksamer ist.

e) Auswirkung von TER199 auf die Cyclophosphamid-induzierte GM-CFU-Suppression bei Mäusen

13, Schaubild A, zeigt, dass die Verabreichung von TER199 (120 mg/kg, i. p.) 24 Stunden nach Cyclophosphamid (200 mg/kg, i. p.) die GM-CFU-Suppression bei Mäusen verringert. Die orale Verabreichung von TER199 (150 mg/kg, p. o.) ist ähnlich wirksam (siehe 13, Schaubild B). Die gezeigten Werte sind der Mittelwert ± SF von drei Mäusen pro Punkt.

f) Auswirkung von TER199 auf die Melphalan-induzierte GM-CFU-Suppression bei Mäusen

Die Auswirkung von TER199 auf die Verringerung der Melphalan-induzierten GM-CFU-Suppression wurde in Experimenten bestimmt, die den oben beschriebenen ähnlich waren. Die Injektion mit Melphalan (10 mg/kg i. p.) allein hatte zum Ergebnis, dass nur 2% der GM-CFU verblieben. Der Zusatz von TER199 (90 mg/kg i. p.), das eine Stunde vor Melphalan verabreicht wurde, erhöhte die GM-CFU vierfach auf 8% des Kontrollwerts (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 11 Antwort von peripherem Blut auf 5-FU-Behandlung ±TER199 a) 5-FU-Behandlung ± i. p.-Verabreichung von TER199

Die Auswirkung von TER199 wurde bezüglich dessen Fähigkeit bewertet, den Grad der hämatologischen Suppression, die von 5-FU verursacht wird, zu verringern und deren Dauer zu verkürzen. Von Sprague-Dawley abstammende Ratten wurden gemäß dem nachstehenden Schema behandelt (Tabelle 11). Die Ergebnisse dieser Studie sind in 14 wiedergegeben.

Das Ansprechen der Konzentrationen an weißen Blutzellen, Neutrophilen und Lymphozyten in den mit TER199 behandelten Gruppen erreichte früher die Konzentrationen vor dem Test als in der mit 5-FU behandelten Gruppe und überschritt am Tag 12 die Konzentrationen vor dem Test. Die Musterunterschiede bei diesem Ansprechen von jeder dieser Zellpopulationen bei den mit TER199 behandelten Gruppen waren von der mit 5-FU behandelten Kontrollgruppe signifikant verschieden (p < 0,05). Diese Daten demonstrieren, dass bei Ratten Populationskonzentrationen von weißen Blutzellen, Neutrophilen und Lymphozyten im peripheren Blutvorrat, die von 5-FU unterdrückt werden, nach der Behandlung mit TER199 im Vergleich zu mit Placebo behandelten Tieren sich schneller erholten und Konzentrationen vor dem Test erreichten.

Bei den mit TER199 behandelten Tieren erholten sich die Blutplättchen-Konzentrationen am Studientag 12 auf normale Konzentrationen. Im Gegensatz dazu verblieben die Blutplättchen-Konzentrationen der 5-FU-Kontrolltiere stark supprimiert. Dieses Ansprechen bezüglich der Blutplättchen bei den mit TER199 behandelten Gruppen war von der mit 5-FU behandelten Kontrollgruppe signifikant verschieden (p < 0,05).

Die Zahlen der roten Blutzellen nahmen im Verlauf dieser Studie bei allen Gruppen fortwährend ab. Obwohl die beobachtete Abnahme bei mit TER199 behandelten Tieren im Vergleich zu den 5-FU-Kontrolltieren verringert ist, wurde die Studie zu früh beendet, um zu bestimmen, ob die verringerte Abnahme eine Verzögerung oder eine tatsächliche Verringerung des Nadirs ist.

b) 5-FU-Behandlung ± orale Verabreichung von TER199

Das Behandlungsprotokoll der Verabreichung von 150 mg/kg 5-FU i. p., 24 Stunden später gefolgt von einer oralen Dosis von 150 mg/kg TER199 oder Vehikel bei Kontrollen, gefolgt 48 Stunden nach 5-FU-Verabreichung, wurde mit zusätzlichen Gruppen von jeweils sechs Mäusen wiederholt. Man entnahm den Mäusen Blut durch den retroorbitalen Plexus, und die Blutproben wurden bezüglich Änderungen der Blutzählergebnisse analysiert. Die Ergebnisse in den 15a15d zeigen die Blutzählergebnisse von verschiedenen Arten von Zellen für die Verabreichung von 5-FU allein (offene Kreise, O) oder 5-FU plus TER199 (massive Kreise •). 15a zeigt die Ergebnisse der Zahlen der gesamten weißen Zellen; es wurde im Wesentlichen kein signifikanter Unterschied gefunden. 15b zeigt die Ergebnisse für die Neutrophilen; ein statistisch signifikanter Unterschied wurde nur am Tag 9 erhalten. 15c zeigt die Ergebnisse für Lymphozyten; es wurden keine Unterschiede gefunden. 15g zeigt die Ergebnisse für Monozyten; es gab nur am Tag 9 einen statistisch signifikanten Unterschied.

Beispiel 12 Stimulation der Cytokin-Produktion

Human-Stroma-Zellkulturen wurden aus frisch erhaltenem Human-Knochenmark erstellt, wie von East, C. J. et al., Blood 5: 1172 (1992), beschrieben. Am Tag 2 wurden die Zellen eine Stunde lang 100 &mgr;M TER199 ausgesetzt; das Kulturmedium wurde entfernt und durch frisches Medium ersetzt, und 24 und 48 Stunden später wurden die Kulturüberstände gesammelt und bezüglich der Anwesenheit von Interleukin-1 (IL-1) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt. Die IL-1-Konzentrationen waren mehr als das Doppelte derjenigen von Kontrollen sowohl bei den 24 als auch bei den 48 Stunden-Zeitpunkten.

Beispiel 13 Auswirkungen von TER199 auf die CD34+++-Differenzierung in Anwesenheit von verschiedenen Cytokinen

Hoch gereinigte CD34+++-Zellen aus menschlichem Nabelschnurblut oder Knochenmark, die mit 300 Zellen/ml plattiert wurden, wurden mit verschiedenen TER199-Konzentrationen in Anwesenheit verschiedener Cytokine behandelt. 16 zeigt die Auswirkung von Konzentrationen von 0,1 &mgr;M–10 &mgr;M TER199 auf die Granulozyten-Erythrozyten-Makrophagen-Megakaryozyten-Kolonienbildung (CFU-GEMM) in Anwesenheit von 1 Einheit/ml rekombinantem Erythropoietin, 100 Einheiten/ml rekombinantem IL-3 und 50 mg/ml rekombinantem Steel-Faktor. 16 zeigt auch die Auswirkung dieser Konzentrationen an TER199 auf Erythrozyten-Vorläuferzellen (BFU-E) in Anwesenheit von 1 Einheit/ml rekombinantem Erythropoietin und 100 Einheiten/ml rekombinantem IL-3. Wie gezeigt, weisen diese Konzentrationen bei selbst der geringsten Konzentration (0,1 &mgr;M) von TER199 mäßig positive Auswirkungen sowohl auf CFU-GEMM als auch BFU-E auf. Diese Ergebnisse erscheinen übereinstimmend mit Bezug auf zwei individuelle Donoren.

Beispiel 14 Bevorzugtes Verfahren zur Synthese von TER199

Das Gesamtschema für die Synthese von TER199 ist in 17 gezeigt.

TER199 ist ein flaumiges weißes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 145–150°C, das die native L-Konfiguration sowohl am Cystein- als auch am &ggr;-Glutamylrest und die D-Form am Phenylglycin aufweist. Wenn es durch das in 17 gezeigte Verfahren synthetisiert wird, wird das erhaltene Produkt unter Verwendung von Standardtechniken analysiert, um seine Identität zu bestätigen.


Anspruch[de]
  1. Verwendung einer Verbindung der Formel
    oder einer Ester-, Amid-, Ester/Amid- oder Salzform derselben, worin

    YCO &ggr;-Glu oder &bgr;-Asp ist;

    G* Phenylglycin oder Glycin ist;

    Z für CH2, O oder S steht; und

    X ein C1-20-Kohlenwasserstoffrest ist;

    für die Herstellung eines Medikaments zur Regulierung der Hämatopoese in Knochenmark, peripherem Blut oder einem Teil desselben, wobei das Medikament oral zu verabreichen ist.
  2. Verwendung einer Verbindung der Formel
    oder einer Ester-, Amid-, Ester/Amid- oder Salzform derselben, worin

    YCO &ggr;-Glu oder &bgr;-Asp ist;

    G* Phenylglycin oder Glycin ist;

    Z für CH2, O oder S steht; und

    X ein C1-20-Kohlenwasserstoffrest ist;

    oder eines Medikaments, das die Verbindung umfasst, für die Herstellung eines Medikaments zum Ausüben einer Schutzwirkung gegen die zerstörenden Auswirkungen eines chemotherapeutischen Mittels oder von Bestrahlung, das bzw. die einem Subjekt verabreicht wird, wobei das Medikament oral zu verabreichen ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, in der der Ester, das Amid oder das Ester/Amid ein (1–10C)-Alkyl-, (1–10C)-Alkenyl- oder (7–12C)-Arylalkylmonoester, -diester, -monoamid, -diamid oder -hybridester/amid ist.
  4. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, in der der YCO-Aminosäurerest in der Verbindung der Formel (1) in der L-Konfiguration vorliegt, der Rest NHCH(CH2ZX)CO in der L-Konfiguration vorliegt und das Phenylglycin in der D-Konfiguration vorliegt.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, in der die Verbindung &ggr;E-C(Bz)-R-(–)&phgr;G oder eine Ester-, Amid-, Ester/Amid- oder Salzform desselben ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, in der die Verbindung &ggr;E-Ethylester-C(Bz)-R-(–)-&phgr;G-ethylester oder eine Salzform desselben ist.
  7. Pharmazeutische Zusammensetzung in Dosierungseinheitsform, die als aktiven Bestandteil eine wirksame Menge der Verbindung der Formel (1), wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff enthält, die in Form einer Tablette, einer Pille, einer Kapsel, eines Sirups, eines Pulvers oder einer schmackhaften Flüssigkeit vorliegt.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der der YCO-Aminosäurerest in der Verbindung der Formel (1) in der L-Konfiguration vorliegt, der Rest NHCH(CH2ZX)CO in der L-Konfiguration vorliegt und das Phenylglycin in der D-Konfiguration vorliegt.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, in der die Verbindung der Formel (1) &ggr;E-C(Bz)-R-(–)-&phgr;G oder eine Ester-, Amid-, Ester/Amid- oder Salzform desselben ist.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, in der die Verbindung der Formel (1) &ggr;E-Ethylester-C(Bz)-R-(–)-&phgr;G-ethylester oder eine Salzform desselben ist.
Es folgen 19 Blatt Zeichnungen






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