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REKOMBINANTE HAARBEHANDLUNGSMITTEL - Dokument DE69922822T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69922822T2 10.11.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001121090
Titel REKOMBINANTE HAARBEHANDLUNGSMITTEL
Anmelder Matrix Design, New York, N.Y., US
Erfinder Ensley, Burt D., Newtown, US
Vertreter Luderschmidt, Schüler & Partner, 65189 Wiesbaden
DE-Aktenzeichen 69922822
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 18.10.1999
EP-Aktenzeichen 999705890
WO-Anmeldetag 18.10.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/24426
WO-Veröffentlichungsnummer 0000023039
WO-Veröffentlichungsdatum 27.04.2000
EP-Offenlegungsdatum 08.08.2001
EP date of grant 22.12.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.11.2005
IPC-Hauptklasse A61K 7/06
IPC-Nebenklasse A61K 7/047   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Menschliches Haar variiert in seiner Länge, Dicke und Farbe bei verschiedenen Individuen und unter verschiedenen Menschenrassen stark. Ein Haar besteht aus einer Wurzel, die der in die Haut implantierte Teil ist, und einem Schaft, der der Teil ist, welcher aus der Oberfläche herausragt. Der Haarschaft besteht von innen nach außen aus drei Teilen: dem Mark, der Rinde und der Cuticula. Jede Schicht ist von Natur aus multizellular. Das Mark, üblicherweise bei feinen Haaren schmaler, setzt sich aus zwei Reihen von polyetrischen Zellen zusammen. Die Rinde bildet den Hauptteil des Haarschafts; ihre Zellen sind länglich und unter Bildung von flachen, verjüngten Fasern vereint, die Pigmentgranalien bei dunklem Haar und Luft bei hellem Haar enthalten. Die Cuticula besteht aus einer einzigen Schicht von flachen Schuppen, welche einander überlappen. Beim Aussetzen des Haars der Sonne, dem Wind und modernen Haarstylingprodukten und -verfahren (wie z. B. Shampoonieren, Bleichen, Färben, Tönen und Formen des Haars mit Wellenpräparaten) verleiht eine wesentliche und unerwünschte Beschädigung der Cuticula und der Rinde des Haarschafts. Als Beschädigung bestimmter, in Haaransammlungen vorliegender Proteine ergibt sich ein Verlust am Körper, Glanz und einer glatten Textur. Eine derartige Beschädigung äußert sich auch in einer schlechten Feucht- und Trockenverträglichkeit, einem erhöhten elektrostatischen Aufladen, einer verringerten maximalen Zugfestigkeit, einem Brechen des Haars und in dem schlechten Aussehen von Haarstilen.

Die strukturelle Komponente von Haar besteht in einer sich Seite an Seite überlappenden Anordnung von Zwischenfäden, die als widerstandsfähig und haltbare Proteinfasern, die in den Cytoplasmen von Zellen vorliegen, klassifiziert werden, welche mechani Beanspruchung unterzogen werden. Zwischenfädenproteine bestehen aus einer großen Superfamilie von Proteinen, welche eine gemeinsame strukturelle Organisation teilen. Diese Proteine enthalten ein dünne a-spiralförmige Stabdomäne mit nicht-spiralförmigen Enden, die durch eine dimere gewundene Spirale zusammenkommen. Die Dimeren bilden oligomere Untereinheiten höherer Ordnung, welche sich unter Bildung mikroskopischer Stränge verdrillen und zusammenpacken, welche auf verschiedenen Wegen unter Bildung eines Netzwerks im Cytoplasma der Zelle zusammen verwoben sind. Dieses Netzwerk funktioniert zur gegenseitigen Verbindung der Zellen und ist eine strukturelle Hauptkomponente von Epithelgeweben. Bei Menschen sind mindestens ¾ sämtlicher Zwischenfädenproteine Keratine (Lane u.a., Curr. Op., in Genet. Dev. Bd. 4, S. 412-418, 1994). Keratine sind die am meisten komplexe Gruppe von Zwischenfädenproteinen. Es gibt mindestens 30 Keratinproteine, welche weiter in Hartkeratine (Haar- und Nagelkeratine) und Weichkeratine (Epidermkeratine) unterteilt werden können (Yu u.a. The Journal of Investigative Dermatology, Bd. 101, Nr. 1, Supplement, Juli 1993; und Fuchs, Ann. Rev. Biochem., Bd. 63, S. 345-382, 1994). Menschliche Haarkeratinproteine können von ihren epidermalen Ebenbildern durch einen verhältnismäßig höheren Cysteingehalt unterschieden werden, der die Verwendung von Disulfidbindungen bei der Herstellung einer zäheren, haltbareren Struktur widerspiegelt (Yu u.a., oben). Alle Keratine können ferner in Keratine vom sauren Typ I und Keratinproteine vom basischen Typ II unterteilt werden, welche unter Bildung der den Zwischenfäden gemeinsamen Struktur höherer Ordnung heterodimerisieren (Fuchs u.a., oben). Derzeit gibt es sieben bekannte Haarkeratine vom Typ I (hHa1, hHa2, hHa3-I, hHa3-II, hHa4, hHa5 und hHRa1); hair acidic (saure) Keratine (Winter u.a., Nature Genetics, Bd. 16, August, S. 372-374, 1997) und vier bekannte Haarkeratine vom Typ II (hHb1, hHb3, hHb5 und hHb6) (Roger u.a., Differentiation, Bd. 61, S. 187-194, 1997). Zusammen mit den sogenannten unbedeutenden Haarkeratinpaaren Hax/Hbx, umfasst die Familie der Haarkeratine 13 Mitglieder. Keratine werden in die Rinde des Haarschafts (z B. Hb1) und in die Cuticula (wie z. B. Ha1 und zwei Isoformen von Ha3) (Winter u.a. The Journal of Investigative Dermatology, Bd. 106, Nr. 3, März, S. 544-548, 1996) exprimiert.

Es gibt eine verblüffende Heterogenität bei Epithelkeratinproteinen, die in verschiedene Individuen exprimiert sind. Diese Heterogenität ergibt sich aus einem Polymorphismus der jeweiligen Epithelkeratingene (Mischke u.a. The Journal of Investigative Dermatology, Bd. 88, Nr. 2, Februar, S. 191-197, 1987; Lane u.a., oben). Ferner kann eine subtile Allelvariation zu starken phenotypischen Defekten im Epithelgewebe führen (Lane u.a., oben; Winter u.a., oben; Fuchs u.a., oben). Beispielsweise zeigen transgene Mäuse exprimierende mutierte menschliche epiderme Keratingene ein gestörtes Keratinnetzwerk zusammen mit Gewebeanomalitäten, welche den autosomalen dominanten menschlichen Hauterkrankungen, der Epidermolyse bullosa simplex oder einer epidermolytischen Hyperkeratose ähnlich sind (Winter u.a., oben). Ohne das richtige Zwischenfädennetzwerk werden Epidermzellen brüchig und neigen zum Brechen bei mechanischer Beanspruchung, was zu einem Blasigwerden der Haut führt.

Angesichts der Heterogenität epidermer Keratine und der Wirkung dieser Heterogenität auf das Aussehen der Haut war es nicht überraschend, dass auch gefunden wurde, dass ein Polymorphismus mit Haarkeratinproteinen verknüpft ist. In einem Beispiel wurden zwei polymorphe Genorte im cuticularen Gen hHa2 identifiziert, und es wurde gezeigt, dass sie als Mendel'sche Merkmale vererbt werden (Winter u.a., 1997 oben). Die Heterogenität bei Keratinproteinen kann direkte Wirkungen auf die Zugfestigkeit, Flexibilität und dynamischen Eigenschaften der Zwischenfäden haben, was bedeutet, dass sogar eine subtile Heterogenität in Zwischenfädenproteinen die äußeren Merkmale des Haars oder der Haut beeinflussen können.

Die Verwendung von Proteinmaterialien bei der Formulierung moderner Haarpflegeprodukte zur Bereitstellung von Glanz, Festigkeit, Weichheit, Geschmeidigkeit und gute Kombinationseigenschaften ist gut bekannt. Insbesondere wird oftmals Keratin benutzt. Weil das natürlich vorkommende Keratin immer vernetzt ist, und vernetzte Fasern unlöslich sind (d.h. in Wasser unlöslich, wird das Keratin zuerst unter Verwendung einer Vielzahl chemischer und enzymatischer Verfahren, welche das Protein hydrolysieren, löslich gemacht (U.S.-Patente Nrn. 4.439.417, 4.542.014, 5.612.024, 4.465.664; 4.906.460, 3.842.848, 4.495.173). Die Ausgangsmaterialien können z. B. menschliches Haar, tierisches Haar, Federn, Klauen, Horn, Hufe und Schuppen umfassen, unter denen Wolle und Federn bevorzugt verwendet werden.

Da die Keratinproteine von den verschiedensten natürlichen Quellen abstammen, geben sie nicht irgendeine besondere erwünschte Haarkeratinzusammensetzung wieder, und da das Keratinprotein zu seinen Bestandteilen bildenden Aminosäuren hydrolysiert wird, behält es nicht die Struktur des Keratinproteins bei, sondern ist lediglich ein einfaches Gemisch von Aminosäuren, das der Haarbehandlungszusammensetzung zugegeben wird. Ein besseres Haarbehandlungsprodukt vermeidet die Verwendung von vernetzten Keratinen und stellt vorzugsweise auch einen Mechanismus zum Maßschneidern der Produktzusammensetzung auf die Bedürfnisse oder Wünsche der speziellen Individuen bereit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Vorliegende Erfindung betrifft eine Haarbehandlungs- oder Schönheitszusammensetzung einschließlich eines nicht-natürlich vorkommenden Zwischenfaden-Proteins, formuliert als eine Haarbehandlungszusammensetzung. Die Zwischenfädenproteine sind vorzugsweise menschlichen Ursprungs und wurden nicht zuvor vernetzt. Das Protein ist am bevorzugtesten aus der Gruppe ausgewählt, die aus menschlichen Haarkeratinen besteht. Das Keratinprotein kann mindestens einen zusätzlichen, nicht natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzrest umfassen, wobei der Aminosäuresequenzrest vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer hydrophoben Sequenz, einer hydrophilen Sequenz, und einer cysteinreichen Sequenz besteht.

Bei bevorzugten Ausführungsformen vorliegender Erfindung wird die Haarbehandlungszusammensetzung formuliert, um einen oder mehrere Aspekte der im Haar eines ausgewählten Individuums gefundenen Keratinproteine wiederzugeben. Insbesondere bringt ein Aspekt vorliegender Erfindung die Erkenntnis mit sich, dass verschiedene Individuen unterschiedliche Allelvarianten oder Populationen von Allelvarianten von Keratinproteinen in ihrer Haut hervorbringen können. Wie im vorliegenden benutzt, bezieht sich der Begriff „Allelvarianten" auf verschiedene Versionen eines Proteins oder dieses Protein codierenden Gens, das in der menschlichen Population vorliegt. Proteinvarianten können sich voneinander durch Addition, Substitution oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden. Typiweise werden derartige Proteine von Genvarianten gebildet, die sich voneinander durch Addition, Substitution oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide unterscheiden. Alternativ oder zusätzlich können derartige Proteinvarianten durch ein alternatives Spleissen oder anderes Verarbeiten genetischer Sequenzen gebildet werden.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorliegender Erfindung wird ein spezielles Individuum auf Basis dessen ausgewählt, dass es attraktive Haareigenschaften besitzt. Die Allelzusammensetzung einer oder mehrerer Keratinproteine in dem Haar dieser Person wird identifiziert, und diese Zusammensetzung wird in einer Haarbehandlungszusammensetzung reproduziert. Der Fachmann erkennt, dass dasjenige, was ein „attraktives" Haar ausmacht, gemäß den Vorlieben des Herstellers der Haarbehandlungszusammensetzung oder der Person, für die die Haarbehandlungszusammensetzung benutzt wird, schwanken kann. Beispielsweise ist in manchen Zusammenhängen das Haar „attraktiv", wenn es Eigenschaften aufweist, die für das Haar einer berühmten Persönlichkeit charakteristisch sind. In anderen Zusammenhängen kann ein Haar „attraktiv sein", wenn es bestimmte erwünschte Eigenschaften besitzt. Einige nicht-begrenzende Beispiele sind Geschmeidigkeit, Glanz, Zugfestigkeit, Flexibilität, Körper und Weichheit. Andere nicht-begrenzende Beispiele umfassen Haareigenschaften wie Farbe, Geradheit und Kräuselbarkeit (curliness). In einem weiteren Zusammenhang ist Haar „attraktiv", wenn es Eigenschaften besitzt, die denjenigen der Person ähnlich oder gleich sind, auf die die Haarbehandlungszusammensetzung angewandt wird, so dass negative Immunreaktionen minimiert oder vermieden werden können.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DEFINITIONEN

Ein Aspekt vorliegender Erfindung ist eine Haarbehandlungszusammensetzung mit einem Gehalt an einer nicht natürlich vorkommenden Form eines Haarkeratinproteins. Folgende Definitionen stellen den Umfang dieses und anderer Aspekte der Erfindung klar.

Die im vorliegenden benutzten Begriffe „Formel", „Haarbehandlungsformel" oder „Haarbehandlungszusammensetzung" sollen eine beliebige Produktart umfassen, die auf irgendeine Weise direkt auf die Person angewandt wird.

Die Begriffe „Haarkeratinprotein" oder „Keratinprotein" beziehen sich auf diejenigen Makromoleküle, welche Zwischenfäden in Haarzellen bilden. Die beiden Hauptklassen von Keratinproteinen sind die als Hartkeratine bezeichneten Keratinproteine, umfassend z. B. Haar, Nagel und Zunge, und diejenigen, die als Weichkeratinproteine bezeichnet werden, umfassend Epithelkeratinproteine.

Unter dem auf die Keratinproteine vorliegender Erfindung angewandten Begriff „nicht natürlich vorkommend" werden Polypeptide verstanden, welche nicht zuvor vernetzt wurden. Derartige Keratinproteine können nach den dem Fachmann auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren hergestellt werden (welche in größeren Einzelheiten im vorliegenden beschrieben werden), wie z. B. bakterielle oder eukaryotische Wirtszellen.

Unter dem Begriff „nicht natürlich vorkommend", wenn er auf die Nukleotidsequenzen angewandt wird, welche die Keratinproteine vorliegender Erfindung codieren, wird ein Teil genomischer Nukleinsäure, cDNA, oder synthetische Nukleinsäure verstanden, welche dank ihres Ursprungs oder ihrer Behandlung: (i) nicht mit sämtlicher Nukleinsäure verbunden ist, mit der sie in der Natur verbunden ist; (ii) an eine Nukleinsäure oder an einen anderen chemischen Rest gebunden ist, der sich von demjenigen unterscheidet, an den sie in der Natur gebunden ist; oder (iii) in der Natur nicht auftritt.

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Haarbehandlungszusammensetzungen ist, dass die nicht natürlich vorkommenden Keratinproteine der Erfindung nicht zuvor vernetzt wurden. Unter dem Begriff „nicht zuvor vernetzt" wird verstanden, dass die Proteine der Haarbehandlungszusammensetzungen:

  • a. nicht innerhalb eines Körpers unter Bildung von Zwischenfäden vernetzt wurden;
  • b. nicht-in-vitro unter Bildung von Zwischenfäden vernetzt wurden.

Es wird darauf hingewiesen, dass Keratinproteine die Fähigkeit besitzen, sich in vitro selbst in Zwischenfäden zu versammeln.

Der Begriff „löslich" bezieht sich auf die Löslichkeit des Vorläufers in wässerigen Lösungen, wie z. B. in Wasser.

Der im vorliegenden benutzte Begriff „Allelvariante" bezieht sich auf verschiedene Versionen eines Proteins oder eines dieses Protein codierenden Gens, das in der menschlichen Population vorliegt. Proteinvarianten können sich voneinander durch Addition, Substitution oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden. Typischerweise werden derartige Proteine aus Genvarianten gebildet, welche sich voneinander durch Addition, Substitution oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide unterscheiden. Alternativ oder zusätzlich können solche Proteinvarianten durch alternatives Spleissen oder anderes Bearbeiten genetischer Sequenzen gebildet werden.

Der im vorliegenden benutzte Begriff „rekombinant" bezieht sich auf durch Expression in ein Wirtszellensystem hergestelltes Protein, in dem dieses Protein in der Natur nicht exprimiert ist und in dem das Protein nicht vernetzt wird. Die verschiedensten Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine sind gut bekannt und umfassen z. B. die Expression eines speziellen Gens in eine Wirtszelle durch Einführen exogener DNA-Sequenzen in die Zelle oder die Aktivierung des endogenen Gens (U.S.-Patent 5.641.670).

Gemäß vorliegender Erfindung ist, wenn man auf Aminosäuresubstitutionen Bezug nimmt, eine Aminosäuresequenz „funktionell äquivalent" im Vergleich zu den bekannten Sequenzen von Proteinen, wenn die Aminosäuresequenz einen oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz enthält, welche durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften substituiert werden kann, die auf einem funktionell äquivalenten Weg auf die ursprüngliche Aminosäure einwirkt. Ersatzstoffe für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können vorzugsweise unter anderen Verbindungen der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren umfassen Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren (hydrophilen) neutralen Aminosäuren umfassen Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Aspartinsäure und Glutaminsäure.

Keratinproteine und Polypeptide

Wie weiter oben diskutiert, stellt vorliegende Erfindung Haarbehandlungszusammensetzungen zur Verfügung, formuliert aus nicht natürlich vorkommenden Keratinproteinen. Diese Proteine können von Säugetieren wie Kühen, Schafen oder Schweinen abstammen. Vorzugsweise benutzen jedoch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen menschliche Keratinproteine. Besonders bevorzugte Proteine, welche bei der Erfindung verwendet werden, sind die „harten" Keratinproteine, exprimiert in menschliches Haar.

Keratine geben die Hauptstrukturkomponenten des wasserunlöslichen Zwischenfädensystems im Haar wieder. Keratine vom Typ I und II codierende Gene wurden geklont, und die Proteinsequenzen bestimmt (Fink u.a., Biochem. Biophys. Acta 1264:12-14, 1995; Rogers u.a., Differentiation, Bd. 61, S. 187-194, 1997; Winter u.a., 1997 oben, Yu u.a., oben). Wie bei allen Zwischenfäden-Untereinheitproteinen wird eine gemeinsame Sekundärstruktur gefunden: eine hoch konservierte, zentrale, &agr;-schraubenförmige Domäne, bestehend aus vier gewundenen Spiralsegmenten und Terminaldomänen mit nicht-spiralförmigem Ende verschiedener Sequenzen und Längen, welche die Kettenspezifizität eines individuellen Haarkeratins bestimmen. Haarkeratine liegen in der Regel in der Molekulargewichtsform im Bereich von 40 bis 62 kD. Es existiert ein hoher Grad der Aminosäurekonservierung in Haarkeratinen unter verschiedenen Gattungen (Maus, Schaaf und Mensch) (Yu u.a., oben). Der wesentlichste Unterschied zwischen den Haarkeratinen und anderen Keratinen ist der Gehalt an dem Cysteinrest, welcher im Mittel, 7,6% bei menschlichem Haarkeratin, im Vergleich zu lediglich 2,9% bei epidermalen Keratinen beträgt. Dies spiegelt die erhöhte Verwendung von Disulfidbindung in Haarkeratinen zur Bildung einer zäheren, haltbareren Struktur wider (Yu u.a., oben).

Die bei vorliegender Erfindung verwendeten Keratinproteine können nach irgendeinem der verschiedensten zur Verfügung stehenden Verfahren hergestellt werden, jedoch ist es wichtig, dass die Proteine nicht durch eine Vernetzungsstufe gehen, die umgekehrt werden muss, um die Proteine löslich zu machen, wie weiter oben diskutiert. Es wird bevorzugt, eine Vernetzung der Proteine während der Keratinproteinexpression und -reinigung zu vermeiden.

Bei manchen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die Proteine unter Anwendung zur Verfügung stehender chemischer Syntheseverfahren hergestellt. Beispielsweise können nicht natürlich vorkommende Keratinproteine unter Verwendung eines geeigneten Herstellungsverfahrens in festem Zustand hergestellt werden, (Steward und Young, „Solid Phase Peptide Synthesis"); Freemantle, San Francisco, Kalifornien, 1968). Ein bevorzugtes Verfahren ist das Merrifield-Verfahren, (Merrifield, Recent Prog. Hormone Res., 23:451, 1967).

Die Gene, die die Proteine codieren, können aber auch isoliert werden, und die Proteine können unter Anwendung von rekombinanten Verfahren hergestellt werden. „Rekombinante Verfahren" können als irgendein Verfahren der Proteinherstellung durch Expression in Wirtszellen definiert werden, in denen die Keratinproteine nicht vernetzt werden. Die verschiedensten Verfahren unter Bildung von rekombinanten Proteinen sind gut bekannt, welche eine Expression eines speziellen Gens in eine Witszelle durch Einführen von Exogenen DNA-Sequenzen in die Zelle oder die Aktivierung der endogenen Gene mit sich bringt (vgl. U.S.-Patent Nr. 5.641.670). „Rekombinante Verfahren" können auch bezüglich Verfahren einer Transkription in vitro und einer Translatation zur Herstellung der Keratinproteine angewandt werden.

Protokolle zur Isolierung von Genen, welche spezielle Proteine codieren, bringen in der Regel eine Isolierung der gesamten messenger-RNA aus Wirbeltiergeweben, wie z. B. menschlichem Haar, tierischem Haar, Wolle und Federn oder aus Zelllinien, wahrscheinlich, um das Protein von Interesse zu exprimieren, mit sich. Codierte Proteine können sodann in ein geeignetes Expressionssystem, das gut bekannt ist, exprimiert werden. Ein besonderer Vorteil der Verwendung eines rekombinanten Expressionssystems ist, dass jede Proteinuntereinheit, getrennt von seinem Partnerprotein exprimiert wird, mit dem es heterodimerisiert, weshalb es weniger wahrscheinlich ist, dass es vernetzt wird und Löslichkeit verliert.

Typischerweise wird die gesamte RNA aus einem Gewebe oder Zellen in Kultur unter Anwendung herkömmlicher Verfahren isoliert. Eine nachfolgende Isolierung von mRNA wird typischerweise durch Oligo-(dT)-chromatographie erreicht.

Messenger-RNA wird durch Elektrophorese nach der Größe fraktioniert, und die RNA-Transkripte werden z. B. gemäß Standardprotokollen (Sambrook, J. u.a., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.,) in z. B. Nitrocellulose überführt. Beispielsweise kann eine markierte Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-erzeugte Sonde, die der Hybridisierung mit menschlichen Keratinnukleotidsequenzen fähig ist, (Rogers u.a., Experimental ,Cell Research, 220:357-362, 1995) zur Identifizierung von RNA-Transkripten dienen, die zumindestens einem Teil des erwünschten Keratinproteingens komplementär sind. Wenn eine Northern-Analyse zeigt, die aus menschlichem Kopfhautgewebe isolierte RNA mit einer markierten Sonde eine Allelvariante von Keratin enthält, dann werden menschliche Kopfhautzellen zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek verwendet, um für das gewünschte Gen gescreent zu werden.

Zur Bestätigung der Anwesenheit in der Bibliothek von mRNA-Fragmenten, welche zu einer Sonde hybridisieren, welche dem gesamten relevanten Gen oder einem Teil desselben entsprechen, kann die Northem-Analyse verwendet werden. Die Northem-Analyse enthüllt die Anwesenheit und Größe des Transkripts. Dies ermöglicht zu bestimmen, ob ein gegebenes cDNA-Klon lang genug ist, um das gesamte Transkript zu umfassen, oder ob es notwendig ist, weitere Klone zu erhalten, um eine cDNA voller Länge zu erzeugen, d.h., wenn die Länge des cDNA-Klons weniger als die Länge der RNA-Transkripte, wie sie durch die Northern-Analyse gesehen werden. Wenn die cDNA nicht lang genug ist, ist es notwendig, verschiedene Stufen durchzuführen, wie z. B.: (i) die gleiche Bibliothek mit den längsten erhältlichen Sonden wieder zu screenen, um eine längere cDNA zu identifizieren; (ii) eine unterschiedliche cDNA-Bibliothek mit der längsten Sonde zu screenen; und (iii) eine primer-ausgedehnte cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines speziellen Nukleotidprimers herzustellen, der einem Bereich nahe bei, jedoch nicht an dem meist zugänglichen 5'-Bereich entspricht. Diese Nukleotidsequenz wird verwendet, um eine umgekehrte Transkription zu primen. Die primer-ausgedehnte Bibliothek wird sodann mit der Sonde gescreent, welche den verfügbaren Sequenzen, welche in der Stellung 5' zum primer liegen, entsprechen (vgl. z. B. Rupp, u.a., Neuron, 6:811, 1991).

Der zur Expression verwendete bevorzugte Klon hat eine vollständige Codierungssequenz, d.h., eine solche, die mit Methionin beginnt und mit einem Stoppcodon endet, und vorzugsweise hat sie ein anderes in-frame-Stoppcodon 5' zum ersten Methionin. Es ist auch erwünscht, dass es eine cDNA besitzt, die alle der 5'- und 3'-nicht-translatierten Sequenzen umfasst.

Selbstverständlich, wie vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gewürdigt wird, ist das zuvor beschriebene Screeningverfahren gerade ein Weg zur Isolierung von Genen, um eine rekombinante Expression von Proteinen zu ermöglichen. Um eine annehmbare Modifikation des Wegs zu nennen, kann anstelle einer PCR-erzeugten Sonde zum Screenen der Bibliothek eine Oligonukleotidsonde benutzt werden. Eine Oligodeoxynukleotidsonde hat typischerweise eine etwas längere Sequenz als diejenige, die für die PCR-primer verwendet wird. Für die Sonde wird eine längere Sequenz bevorzugt, und es ist wichtig, dass eine Codon-Degenerierung auf ein Minimum herabgesetzt wird. Ein repräsentatives Protokoll für die Herstellung einer Oligonukleotidsonde zum Screenen einer cDNA-Bibliothek ist in Sambrook u.a., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989 beschrieben. In der Regel wird die Sonde markiert, beispielsweise mit 32P, und zum Screenen von Klonen einer cDNA- oder genomischen Bibliothek benutzt.

Bei einer anderen Modifikation braucht die Bibliothek nicht durch Hybridisierung überhaupt gescreent werden, sondern kann vielmehr als eine Expressionsbibliothek hergestellt werden, welche unter Anwendung herkömmlicher Immunassay-Verfahren gescreent werden, wie z. B. derjenigen, welche in Harlow und Lane, D., Antibodies, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988 beschrieben sind. Antikörper, hergestellt unter Verwendung von gereinigtem Protein als Immunogen, werden vorzugsweise zuerst auf Kreuzreaktivität mit dem Homologen eines Proteins aus einer anderen Gattung getestet.

Bei einer noch anderen Version wird eine cDNA-Bibliothek unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) gescreent. Ein PCR-Screening erlaubt die Verwendung geringer Proben für eine Analyse. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, kleine Mengen von Haar-mRNA oder -DNA unter Anwendung von PCR zu amplifizieren und gründet sich auf Verfahren, die in Standardprotokollen dargelegt sind; (vgl. beispielsweise Sambrook, u.a., oben). Beispielsweise wird eine Probe zur Freisetzung von RNA extrahiert, welche so wenig wie 1.000 bis soviel wie 100.000 spezielle mRNAs umfasst. Die mRNA wird in cDNA unter Anwendung einer umgekehrten Transkriptase (vgl. Beispiel 2) übergeführt. Die gebildete cDNA wird im gleichen Reaktionsgemisch unter Anwendung von PCR amplifiziert. Primer für die PCR-Umsetzung sind vorzugsweise bestimmt, um die gegenüberliegenden Enden der relevanten messenger-RNA-Sequenz zu hybridisieren, womit so das gesamte mRNA-Segment amplifiziert wird.

Um eine maximale Spezifizität und Ausbeute bei der PCR zu erhalten, muss man die verschiedensten, dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannten Reaktionsparameter einstellen (vgl. z. B. McPherson, „PCR: A Pracital Approach", Oxford University Press, New York, 1991). Die primer sollten einen Gehalt an 40-60% G + C besitzen, keine langen Ausdehnungen irgendeiner Base und keinen interprimer, komplementär länger als zwei Basen, insbesondere an den Enden 3'. Wenn diese Konditionen gegeben sind, können die folgenden Stufen die Spezifizität der PCR erhöhen: die Umsetzung kann mit primer, Matrize und dNTP-Konzentrationen in der Mitte des empfohlenen Bereichs unter Verwendung von 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase unter Anwendung einer Abkühlungstemperatur von mindestens 10°C weniger als optimal durchgeführt werden. Wenn unspezifische Produkte beobachtet werden, kann man die Abkühlungstemperatur optimieren und den primer und die dNTP-Konzentrationen einstellen.

Rekombinante Verfahren zur Herstellung der besonders bevorzugten, nicht natürlich vorkommenden menschlichen Keratinproteine der Erfindung sind leicht zugänglich. Ein Verfahren bringt die Konstruktion einer menschlichen cDNA-Bibliothek und ihr Screenen für Keratin-cDNAs mit sich. Die erhaltenen Klone können in ein Expressionsvektorsystem eingeführt werden, und Proteine können exprimiert und unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt werden; vgl. z. B. Ausubel u.a, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, New York, Bd. 1&2, 1996 und Sambrook u.a., oben.) Die derart hergestellten rekombinanten Proteine können z. B. durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(PAGE-)-Analyse und N-terminales Sequenzieren charakterisiert werden.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorliegender Erfindung wird eine menschliche cDNA-Bibliothek, entweder hergestellt aus einem ausgewählten Individuum, wie weiter unten beschrieben, oder von einer Quelle im Handel bezogen (wie z. B. Clontech, Palo Alto, Kalifornien) gescreent, um menschliche Keratin codierende cDNAs zu identifizieren. Positive Klone werden einem Sequenzieren unterzogen und können durch Restriktions-Endonuklease-Digerierung zum Isolieren und abermaligem Screenen der ursprünglichen cDNA-Bibliothek charakterisiert werden. Variationen bei der Sequenz unter identifizierten cDNAs zeigen die Anwesenheit von Allelvarianten des Proteins an (vgl. weiter unten).

Wenn auch das Gen von Interesse isoliert ist, können Proteine in irgendein gewünschtes Expressionssystem, einschließlich in vivo- oder in vitro-Systeme exprimiert werden. Gut bekannte in vivo-Expressionssysteme benutzen prokaryotische und/oder eukaryotische (d.h. Hefe-, Menschen-)Zellen, vgl. beispielsweise Current-Protocols in Molecular Biology, S. 16.0.1-16.21.0. oben, vgl. auch Gene Expression Technology Bd. 185, Methods in Enzymology, (Herausg. D.V. Goiddel), Academic Press Inc., 1990.

Eine große Anzahl von Vektoren wurde konstruiert, die wirksame Promotoren enthalten, welche große Mengen von m-RNA erzeugen, die zu geklonten Sequenzen von DNA komplementär sind, welche in den Vektor eingeführt wurden. Beispielsweise, ohne eine Beschränkung zu bedeuten, kann unter Verwendung von lac-, trp-, lamda- und recA-Promotoren eine Expression einer eukaryotischen Nukleotidsequenz in Eichia coli erreicht werden, vgl. beispielsweise „Expression in Eichia coli", Abschnitt II, S. 11-195, Bd. 185, Methods in Enzymology, oben, vgl. auch Hawley, D.K. und McClure, W.R., „Compilation and Analysis of Eichia coli promotor DNA-sequences", Nucl. Acids Res., 11:4891, 1983. Die Expression irgendeines erwünschten Keratinproteins (einschließlich z. B. eines menschlichen Haarkeratins) in ein rekombinantes bakterielles Expressionssystem kann leicht erreicht werden.

Zur Expression der Proteine gemäß der Erfindung geeignete Hefezellen umfassen die vielen Stämme von Saccharomyces cerevisiae sowie Pichia pastoris. Vgl. „Heterologous Gene Expression in Yeast", Abschnitt IV, S. 231-482, Bd. 185, Methods in Enzymology, oben. Überdies kann eine große Anzahl von bekannten Vektor-Säugetier-Wirtssystemen verwendet werden, vorausgesetzt, dass die gebildeten Keratinproteine in diesen Zellen nicht vernetzt werden. Vgl. Sambrook u.a., Bd. III, oben und "Expression of Heterologous Genes in Mammalian Cells ; Section V, S. 485-596, Bd.. 185, Methods in Enzymology, oben.

Geeignete Expressionssysteme umfassen diejenigen, welche vorübergehend oder stabil exprimierte DNA und diejenigen, welche virale Expressionsvektoren einschließen, die von Simianvirus 40 (SV40), Retroviren und Baculoviren abgeleitet sind. Diese Vektoren liefern gewöhnlich einen Promotor und andere Elemente wie Verstärker, einen Spleißakzeptor und/oder Donatorsequenzen sowie Polyadenylierungssignale. Welches Expressionssystem auch immer ausgewählt wird, ist es wichtig, dass keine der benutzten Wirtszellen vernetzte Keratinproteine bilden. Mögliche Vektoren umfassen, sind jedoch hierauf nicht beschränkt, Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren, jedoch muss das Vektorsystem mit der benutzten Wirtszelle verträglich sein. Virale Vektoren umfassen, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, das Vacciniavirus oder Lambdaderivate. Plasmide umfassen, sind nicht jedoch hierauf beschränkt, pBR322, pUC oder Bluescript®-(Stratagene)Plasmidderivate. Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen z. B. über eine Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation, Lipofektion usw. eingeführt werden (vgl. Current Protocols in Molecular Biology, S. 9.0.1-9.17.3, oben). In der Regel wird eine Einführung von Proteinmolekülen in einen Wirt unter Verwendung eines Vektors mit einem Gehalt an Protein-DNA unter Kontrolle von Regulationsbereichen der DNA erreicht, welche in der Wirtszelle funktionieren. Eine Expression kann aber auch durch Aktivierung des endogenen Keratingens erreicht werden (vgl. z. B. U.S.-Patent-Nr. 5.641.670).

Eine breite Auswahl von Expressionssystemen ist im Handel erhältlich und umfasst viele mögliche Vektoren und Wirtszellen. Bestimmte bevorzugte Expressionssysteme stellen eine Überproduktion rekombinanten Keratinproteins bereit. Vgl. z. B. die im U.S.-Patent 4.820.642 (Edman u.a., 11. April 1989 beschriebenen Überproduktionsverfahren). Vgl. auch Currrent Protocols in Molecular Biology, S. 16.0.1-16.21.9, oben).

Wenn die rekombinanten Proteine oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung exprimiert sind, können sie nach Standardverfahren isoliert und gereinigt werden, einschließlich durch Chromatographie (wie z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Sizing-Säulenchromatographie) zentrifugieren, Differenziallöslichkeits-Verfahren oder durch irgendein anderes Standardverfahren zur Reinigung von Proteinen; vgl. z. B. Scopes, „Protein Purification; principles and Practice", 2. Ausgabe Springer-Verlag, New York, 1987. Insbesondere für die Immunoaftinitäts-Chromatographie kann ein durch menschliche Nukleotidsequenzen codiertes Keratinprotein der Erfindung isoliert werden, indem man es an eine Affinitätssäule bindet, die Antikörper umfasst, welche gegen dieses Protein erhöht (raised) und an einem stationären Träger fixiert wurden. Alternativ können Affinitäts-tags wie Influenza coat-Sequenz und Glutathion-S-transferase an die Proteine der Erfindung gebunden werden, um eine leichte Reinigung durch Überleiten über eine geeignete Affinitätssäule zu ermöglichen.

FRAGMENTE

Die Haarbehandlungszusammensetzungen vorliegender Erfindung können Proteine voller Länge oder alternativ Proteinfragmente benutzen. Fragmente können z. B. durch Expression von lediglich partiellen Codierungssequenzen oder direkt aus dem intakten Protein erzeugt werden.

Proteine werden speziell durch proteolytische Enzyme einschließlich, ohne hierauf begrenzt zu sein, Trypsin, Chymotrypsin oder Pepsin, gespalten werden. Jedes dieser Enzyme ist für die Art der Peptidbindung, die es angreift, spezifisch. Trypsin katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen, deren Carbonylgruppe von einer basischen Aminosäure, üblicherweise Arginin oder Lysin, stammt. Pepsin und Hymotrypsin katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen von aromatischen Aminosäuren, insbesondere Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Abwechselnde Sätze von gespaltenen Polypeptidfragmenten werden erzeugt, indem man eine Spaltung an einer Stelle verhindert, die für ein proteolytisches Enzym empfindlich ist. Beispielsweise führt die Umsetzung der Aminogruppen von Lysin mit Ethyltrifluorthioacetat in einer milden basischen Lösung zu einem blockierten Aminosäurerest, dessen benachbarte Peptidbindung nicht mehr für eine Hydrolyse durch Trypsin empfindlich ist; Goldberger u.a. Biochem. 1:401, 1962. Die Behandlung eines derartigen Polypeptids mit Trypsin spaltet somit lediglich an den Arginylresten.

Eine bevorzugte Modifikation (s. weiter unten) von Keratinproteinen (oder Keratinprotein codierenden Genen) gemäß vorliegender Erfindung ist infolgedessen, die Proteine für eine durch proteolytisches Enzym katalysierte Hydrolyse empfindlich zu machen. Beispielsweise führt die Alkylierung von Cysteinresten mit &-Halogenethylaminen [sic!] zu Peptidbindungen, welche durch Trypsin hydrolysiert werden; Lindley, Nature, 178:647, 1956. Ferner können chemische Reagenzien verwendet werden, welche Polypeptidketten an speziellen Resten spalten; Withcop, Adv. Protein Chem. 16:221, 1961. Beispielsweise spaltet Cyanbromid Polypeptide an Methioninresten; Gross u.a., J. Am. Chem. Soc., 83:1510, 1961. So werden durch Behandlung der Proteine gemäß der Erfindung mit verschiedenen Kombinationen von Modifizierungsmitteln proteolytischen Enzymen und/oder chemischen Reagenzien zahlreiche diskrete, sich überlappende Peptide verschiedener Größen erzeugt. Diese Peptidfragmente können von solchen Digests durch chromatographische Verfahren isoliert und gereinigt werden.

MODIFIZIERUNGEN

Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen vorliegender Erfindung umfassen die nicht natürlich vorkommenden Keratinproteine, welche bei den erfindungsgemäßen Haarbehandlungs-Zusammensetzungen benutzt werden, einen Rest, der dazu bestimmt ist, die Funktion der Proteine zu verbessern oder zu erhöhen. Beispielsweise können die Proteine vorliegender Erfindung an einen Rest gebunden werden, der: (i) die Haardurchdringungs-Fähigkeit des Proteins erhöht; (ii) die Wasser- oder Öllöslichkeit des Proteins erhöht; und/oder (iii) die Fähigkeit des Proteins erhöht, als ein oberflächenaktives Mittel zu wirken. Diese zusätzlichen Reste können in dem natürlich vorkommenden (d.h., nativen) Protein vorliegen. Dessen ungeachtet sind die zusätzlichen Reste, wenn sie im nativen Protein vorliegen: (i) an die vorhandenen, nicht natürlich vorkommenden Keratinproteine der Erfindung an einer Stellung gebunden, die sich von denjenigen im nativen Protein unterscheiden; und/oder (ii) in den nicht natürlich vorkommenden Keratinproteinen der Erfindung in Mengen vorhanden, wenn sie sich von denjenigen unterscheiden, die im nativen Protein vorhanden sind.

Diese zusätzlichen Reste können die verschiedensten Substanzen und chemischen Verbindungen umfassen, einschließlich, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, Liposomen, Fettsäuren, Kohlenwasserstoffen, Lipiden, Proteinen und dergl.. Die am meisten bevorzugten Reste sind Peptidsequenzen. Die zusätzlichen Sequenzen können an irgendeiner Stelle in der Proteinkette liegen. Vorzugsweise liegen sie am aminoterminalen Ende des Proteins, dem carboxylterminalen Ende des Proteins oder sowohl an den Amino- als auch Carboxyltermini.

Zusätzliche Reste können in das Protein durch Bindung einer den Rest codierenden Nukleotidsequenz eingeführt werden, wobei eine Nukleotidsequenz das Protein codiert, um zu einer Expression von Fusionsproteinen zu führen. Derartige Fusionsproteine enthalten das Keratinprotein mit einem gebundenen speziellen erwünschten Aminosäurerest, um z. B. eine Expression oder Reinigung des Keratinproteins zu erleichtern.

An Nukleotidsequenzen codierendes Keratin können zusätzliche Nukleotidsequenzen gebunden werden, die Aminosäuresequenzreste, ausgewählt aus der Gruppe codieren, die aus hydrophilen Aminosäuresequenzen, hydrophoben Aminosäuresequenzen, cysteinreiche Aminosäuresequenzen und Kombinationen der zuvor genannten Sequenzen bestehen. Die zusätzlichen Nukleotidsequenzen können gebunden sein, so dass das Keratinprotein der Erfindung, wenn es in ein geeignetes Expressionssystem exprimiert wird, die zusätzlichen Aminosäurereste enthält, und zwar: (i) im Innern; (ii) am Aminoterminus, dem Carboxylterminus und/oder sowohl an den Amino- als auch Carboxyltermini des Proteins.

Insbesondere können bevorzugte zusätzliche Nukleotidsequenzen, welche aminoterminale Aminosäuren einführen, die Formel (I): ATG-(NNN)x-;(I) aufweisen, worin A = Adenylsäure, T = Thymidylsäure und G = Guanylsäure, wobei alle miteinander durch Phosphordiesterbindungen verbunden sind;

worin x = 1 bis 20;

N = eine Nukleotidbase, wie z. B. Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Uracil;

(NNN)x= eine Vielzahl von Codonen bedeuten.

Der Begriff „N" kann auch modifizierte Basen umfassen, wie z. B., ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, 4-Acetylcytidin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uridin, 2'-O-Methylcytidin, Dihydrouridin, die Methylpseudouridine, Inosin, 1-Methyladenosin, 1-Methylguanosin, N6-Methyladenosin u.a..

Nukleotidsequenzen dieser Formel können an die Nukleotidsequenz eines Keratinproteins der Erfindung so gebunden sein, dass das aminoterminale Ende des codierten Proteins einen hydrophoben Aminosäuresequenzrest enthält, der Aminosäuren aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus z. B. Phenylanalin (codiert durch die Tripletts UUU und UUC) Tryptophan (codiert durch das Triplett UGG), Prolin (codiert durch die Tripletts CCU, CCC, CCA und CCG), Glycin (codiert durch die Tripletts GGU, GGC, GGA und GGG), Valin (codiert durch die Tripletts GUU, GUC, GUA und GUG) und Kombinationen der zuvor genannten Aminosäuren besteht. Ebenfalls können zusätzliche Nukleotidsequenzen, welche für Aminosäuren codieren, welche an dem Aminoterminus zu binden sind, auch hydrophile Aminosäuresequenzreste mit Aminosäuren codieren, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die z. B. aus Aspartinsäure (codiert durch die Tripletts GAU und GAC), Glutaminsäure (codiert durch die Tripletts GAA und GAG) und Kombinationen der zuvor genannten Aminosäure bestehen. Ferner können Nukleotidsequenzen lysinreiche Aminosäuresequenzreste (codiert durch die Tripletts AAA und AAG) umfassen. Der Begriff „lysinreich" bedeutet Aminosäuresequenzen mit einem Gehalt an mindestens 30% Lysinresten.

Alternativ oder zusätzlich zugefügte Nukleotidsequenzen können Aminosäurereste codieren, die an den Carboxylterminus des Keratinproteins gebunden werden können. In diesem Fall besitzen die zugefügten Nukleotide die Formel (II) -(NNN)x-TGA;(II) worin A = Adenylsäure, T = Thymidylsäure und G = Guanylsäure sind, welche alle miteinander durch Phosphordiesterbindungen verbunden sind,

worin x = 1-20;

N = eine Nukleotidbase, wie z. B. Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Uracil; und

NNNx = eine Vielzahl von Codonen bedeuten.

Der Begriff „N" kann auch modifizierte Basen umfassen, wie z. B., ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein: 4-Acetylcytidin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uridin, 2'-O-Methylcytidin, Dihydrouridin, die Methylpseudouridine, Inosin, 1-Methyladenosin, 1-Methylguanosin, N6-Methyladenosin u.a..

Die Codonen können einen hydrophoben Aminosäuresequenzrest mit Aminosäuren codieren, ausgewählt aus der Gruppe, die z. B. besteht aus: Phenylalanin, Trypthophan, Prolin, Glycin, Valin und Kombinationen der zuvor genannten Aminosäuren. Ebenfalls können am Carboxylterminus des Proteins der Erfindung unter Verwendung von Nukleotiden, die Aminosäuresequenzen codieren, wie zuvor beschrieben, hydrophile und lysinreiche Aminosäurereste zugefügt werden. Hydrophobe Aminosäuresequenzen neigen zur Erhöhung der Lipidlöslichkeit des Proteins der Erfindung. Hydrophile Aminosäuren dienen zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit des Proteins. Cysteinreiche Aminosäuresequenzen erhöhen die Vernetzung des Keratinproteins.

Positionierungssequenzreste am sowohl Amino- als auch Carboxylterminus der Proteine der Erfindung können die amphipathischen Eigenschaften des Keratinproteins erhöhen. Der Begriff „amphipathisch" bezieht sich auf ein Molekül, das sowohl hydrophile als auch hydrophobe Gruppen besitzt. Amphipathische Moleküle sind typischerweise gute Emulgatoren, (d.h., sie können eine Flüssigkeit in eine zweite, unmischbare Flüssigkeit dispergieren) und oberflächenaktive Mittel (d.h., sie können die Oberflächenspannung von Flüssigkeiten verringern oder die Grenzflächenspannung zwischen zwei Flüssigkeiten oder einer Flüssigkeit oder eines Feststoffs vermindern).

Zusätzliche Reste können auch in die Proteine der Erfindung durch Konjugation der Reste an das exprimierte Keratinprotein unter Verwendung der verschiedensten gut charakterisierten Linkermoleküle eingeführt werden. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass eine große Verschiedenheit möglicher Linker mit den Proteinen der Erfindung verwendet werden können. Vgl. z. B. (Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse und R. E. Lewis, Jr. (Herausg.) Carger Press, New York (1989). Die Konjugation der Proteine der Erfindung an einen anderen Rest (wie z. B. hydrophile Aminosäuresequenzen) kann durch irgendeine chemische Reaktion erreicht werden, welche die beiden Moleküle bindet, solange beide Moleküle ihre jeweilige Wirksamkeit beibehalten. Diese Bindung kann viele chemische Mechanismen umfassen, beispielsweise eine kovalente Bindung, Affinitätsbindung, Interkalation, Koordinationsbindung und Komplexierung.

Die bevorzugte Bindung ist jedoch die kovalente Bindung. Die kovalente Bindung kann entweder durch direkte Kondensation vorhandener Seitenketten oder durch Einarbeitung externer Überbrückungsmoleküle erreicht werden. Viele bivalente oder polyvalente Bindungsmittel sind beim Koppeln von Proteinmolekülen an andere Moleküle brauchbar. Beispielsweise können repräsentative Kopplungsmittel organische Verbindungen wie Thioester, Carbodiimide, Succinimidester, Diisocyanate, Glutaraldehyde, Diazobenzole und Hexamethylendiamine umfassen. Diese Auflistung soll nicht für die verschiedenen Klassen bekannter Kopplungsmittel erschöpfend sein, sondern ist vielmehr für die üblicheren Kopplungsmittel beispielhaft (vgl. Killen u.a., J. Immunol. 133:1335, 1984; Jansen u.a., Immuno. Rev. 62:185, 1982 und Vitetta u.a., oben).

Bevorzugte Linker zum Koppeln eines Rests an die Proteine der Erfindung sind in der Literatur beschrieben. Vgl. z. B. Ramakrishnan u.a., Cancer Res. 44:201, 1984; diese Publikation beschreibt die Verwendung von MBS (M-Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester). Vgl. auch Umemoto u.a. U.S.-Patent Nr. 5.030.719; dieser Autor beschreibt die Verwendung eines halogenierten Acetylhydrazidderivats, gekoppelt an einen Antikörper mittels eines Oligopeptidlinkers. Besonders bevorzugte Linker umfassen: (i) EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (vgl. Bsp. 4); (ii) SMPT (4-Succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyldithio)toluol (Pierce Chem. Co., Cat.# 21558G); (iii) SPDP (Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoat (Pierce Chem. Co., Cat # 21651 G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propianamid]hexanoat (Pierce Chem. Co. Cat. # 21650G); und (v) Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid: Pierce Chem. Co., Cat. # 24510) konjugiert an EDC.

Die zuvor beschriebenen Linker enthalten Komponenten, die verschiedene Eigenschaften besitzen, und somit zu Molekülen mit unterschiedlichen physiochemischen Eigenschaften führen. Beispielsweise sind Sulfo-NHS-ester von Alkylcarboxylaten stabiler als Sulfo-NHS-ester aromati Carboxylate. Linker enthaltende NHS-ester sind weniger löslich als Sulfo-NHS-ester. Ferner enthält der Linker SMPT eine sterisch gehinderte Disulfidbindung und kann Moleküle erhöhter Stabilität bilden. Disulfidbindungen sind in der Regel weniger stabil als andere Bindungen, weil die Disulfidbindung in vivo gespalten wird und zu weniger zugänglichem Konjugat führt. Insbesondere kann Sulfo-NHS die Stabilität von Carbodiimidkopplungen erhöhen. Carbodiimidkopplungen (wie z. B. EDC) bilden, wenn sie zusammen mit Sulfo-NHS benutzt werden, Ester, welche gegenüber Hydrolyse beständiger als der Carbodiimidkopplungsreaktion allein sind. Die Modifizierung der Keratinproteine zur Verwendung bei vorliegender Erfindung kann durch Auswertung der Verarbeitungsaktivität in vivo einer Wirtszelle oder durch chemische Mittel in vitro erreicht werden, wie z. B. durch Phosphorylierung, Glycosylierung, Vernetzung, Acylierung, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül, Membranmolekül oder einen anderen Liganden erreicht werden (Ferguson u.a., Ann. Rev. Biochem. 57:285, 1988).

Ferner können die Proteine der Erfindung codierenden Nukleinsäuresequenzen so konstruiert werden, um die Verarbeitung oder Expression zu modifizieren. Beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, kann eine Nukleotidsequenz oder können mehrere Nukleotidsequenzen, welche die nicht natürlich auftretenden Keratinproteine codieren, mit einer Promotorsequenz und/oder einer Ribosombindungsstelle unter Anwendung gut gekennzeichneter Verfahren kombiniert werden und hierdurch ein Ernten oder eine Biozugänglichkeit erleichtern.

Zusätzlich kann eine gegebene Nukleotidsequenz in vitro oder in vivo mutiert werden, um Variierungen in Codierungsbereichen zu schaffen und/oder neue Restriktions-Endonukleasestellen zu bilden oder zuvor existierende zu zerstören, um eine Modifikation in vitro weiter zu erleichtern. Es kann irgendein Verfahren zur Mutagenese, das bekannt ist, angewandt werden, einschließlich, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, eine in vitro stellengerichtete Mutagenese (Hutchinson u.a., J Biol. Chem. 253:6551, 1978), die Verwendung von Linkern TAB® (Pharmacia), PCR-gerichtete Mutagenese und dergl. umfasst.

Bestimmte bevorzugte Modifikationen der Keratinproteine, die in Übereinstimmung mit vorliegender Erfindung angewandt werden, umfassen Veränderungen, welche die wahrscheinliche Antigenizität der Proteine verringern. Wie zuvor erwähnt, verringert schon die bloße Tatsache, das vorliegende Erfindung lösliche Proteine benutzt, die Wahrscheinlichkeit, dass diese Proteine eine Immunreaktion verursachen; alternativ oder zusätzlich kann die Aminosäuresequenz des bzw. des nicht natürlich vorkommenden Keratinproteins bzw. der -proteine, deren Verwendung bei den Haarbehandlungszusammensetzungen beabsichtigt ist, analysiert werden, um Teile des Moleküls zu identifizieren, die mit einer herabgesetzten Immunogenizität verbunden sein können.

Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz einer Computeranalyse unterzogen werden, um Oberflächenepitope zu identifizieren, welche Computer erzeugte Diagramme des Antigenindex, einer amphophilen Helix, einer amphophilen Folie (sheet) Hydrophilizität und dergl. darstellen.

ALLELVARIANTEN

Wie vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gewürdigt wird, können innerhalb von Populationen mehrfache Versionen oder Allelvarianten der Proteine existieren. Derartige Allelvarianten unterscheiden sich voneinander in der Substitution, Addition oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren. Oftmals spiegeln diese Proteinsequenzunterschiede Unterschiede in der Genomsequenz der die Proteine codierenden genetischen Allele wider. In anderen Fällen codiert die gleiche Genomsequenz mehr als ein Allelvarianten-Protein aufgrund der Unterschiede beim RNA-Spleißen, RNA-editing, bei einer anderen RNA-Verarbeitung oder bei translationalen oder post-translationalen Ereignissen. Beispielsweise besitzt menschliches Ha3 zwei Isoformen, Ha3-I und Ha3-II (Rogers u.a., Mol. Biol. Rep. 20:155-161, 1995).

Ein Aspekt vorliegender Erfindung ist die Erkenntnis, dass Individuen innerhalb der Population verschiedene Ansammlungen von Keratinprotein-Allelvarianten in ihrem Haar exprimieren. Jedes Individuum kann sogar eine einmalige Konstellation derartiger Varianten besitzen, weshalb die besondere Ansammlung, die in einem gegebenen Haar eines Individuums vorliegt, als ein „Keratin-Fingerabdruck" angesehen werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform vorliegender Erfindung werden die Haarbehandlungszusammensetzungen formuliert, um ein Teil des Keratin-Fingerabdrucks oder den gesamten Keratin-Fingerabdruck eines ausgewählten Individuums neu zu erschaffen (siehe die weitere Diskussion unten).

Es wurde gezeigt, dass Keratinaminosäure und cDNA-Sequenz, einschließlich Haarkeratine, eine beträchtliche Variabilität erkennen lassen, wahrscheinlich infolge Punktmutationen oder anderer Sequenzumlagerungen, wie z. B. Nukleotidadditionen-deletionen und -insertionen; vgl. z. B. Mischke u.a., The Journal of Investigative Dermatology, Bd. 88 Nr. 2, 2. Februar, S. 191-197, 1987 und Winter u.a., The Journal of Investigative Dermatology, Bd. 106, Nr. 3, 2. März, S. 544-548, 1996. Spontane Mutationen können z. B. als Ergebnis von Fehlern, gemacht von DNA-Polymerase während des Verfahrens einer DNA-Replikation, auftreten.

Proteinallelvarianten, gebildet durch alternatives Spleißen, werden im Vorliegenden als Protein-„Isoformen" oder -„Isomorphe" bezeichnet. Es ist möglich, dass manche Allelvarianten Isoformen sind, welche sich aus einem alternativen Spleißen ergeben, obgleich keine derartigen Beispiele schon identifiziert wurden. Kurz gesagt, enthält das meiste, Gene codierende eukaryotische DNA-Protein Sequenzen, die in der entsprechenden voll entwickelten mRNA in diskontinuierlichen genomischen DNA-Segmenten (Exonen), eingestreut unter Sequenzen (Intronen) vorliegen, die keinen Teil der voll entwickelten mRNA bilden. Diese Intronsequenzen werden nach einem mehrstufigen Verfahren genau herausgeschnitten. In der Mehrzahl der bisher untersuchten Fälle sind jedes und jedes einzelne der in einem Gen vorhandenen Exonen durch die Invariante Legierung aufeinanderfolgender Paare von Donor- und Akzeptor-Spleißstellen unter Entfernung jedes Introns in eine voll entwickelte mRNA einverleibt. Diese Art eines „konstitutiven Spleißens" führt von jeder transkriptionalen Einheit, wenn ihre Codierungssequenz in viele Exonen gespalten ist, zu einem einzigen Genprodukt.

Es gibt jedoch auch Fälle, bei denen nicht-aufeinanderfolgende Exonen bei der Bearbeitung einiger, jedoch nicht sämtlicher, Transkripte aus einem einzigen Gen vereint werden. Dieses „alternative" Spleißmuster kann einzelne Exonsequenzen aus der voll entwickelten mRNA in einigen Transkripten ausschließen, aber sie in andere einschließen. Die Anwendung derartiger alternativer Spleißmuster in Transkripten aus einem einzigen Gen führt zu mRNA's mit verschiedenen Primärstrukturen. Wenn die beteiligten Exonen translatierte Sequenzen enthalten, codieren diese alternativ gespleißten mRNA's verwandte, jedoch unterschiedliche Proteine, welche im Folgenden als „Isomorphe" bezeichnet werden. Die Fähigkeit, unterschiedliche, jedoch nahe verwandte Proteinisomorphe durch alternatives Spleißen zu erzeugen, erhöht wesentlich die phenotypische Variabilität, die aus einzelnen Genen, wie z. B. Keratin, erhalten werden können.

Die Folgerungen von Mutationen in der strukturelle Keratinproteine codierenden DNA sind signifikant. Beispielsweise ist Monilethrix ein seltener autosomaler dominanter Haardefekt. Haare von befallenen Individuen zeigen eine Struktur, die einer Perlenkette gleicht. Dieser Haardefekt wird durch eine Aminosäuresubstitution eines konservierten Glutaminsäurerests durch einen Lysin- oder Argininrest bei der Stellung 410 im Helixterminierungsmotivs des Typs 11-Haarkeratins hHb6 verursacht (Winter u.a., Hum. Genet, Dec.; 101 (2):165-169, 1997; und Winter u.a., Nat. Genet., Aug., 16 (4): 372-374, 1997). Eine zweite Pumpmutation wurde bei Individuen identifiziert, die von Monilethrix befallen waren, das den Glutaminsäurerest 403 im Haarkeratin vom Typ II hHb1 durch den Lysinrest ersetzt (Winter u.a., oben). Sowohl hHb1 als auch hHb6 werden in der Rinde des Haarschafts coexprimiert. Dies zeigt, dass Monilethrix eine Erkrankung der Haarrinde ist und belegt, dass geringfügige Veränderungen der Haarkeratinproteine codierenden DNA-Sequenz einen schwerwiegenden Einfluss auf das äußere Aussehen von Haar ausüben kann.

Im Licht obigen Beispiels ist es möglich, dass die verschiedenen Allelvarianten von Keratinproteinen auf Basis von Unterschieden in den Codierungsbereichen von Keratin-messenger-RNA auch veränderte biologische Eigenschaften besitzen. Wir bemerken, dass ein wichtiges Merkmal, welches die Haarkeratine von den weichen Keratinen unterscheidet, ist, dass die terminalen Domänen von Haarkeratinen eine unterschiedlichere Anzahl von Cysteinresten pro Molekül als die weichen Keratine enthalten. Da die terminalen Bereiche an der Oberfläche des gebildeten Faden sind, werden die meisten dieser Cysteinreste erachtet, in die Bildung von intermolekularen Disulfidbindungen zwischen Keratin und entweder einem anderen Keratin oder Matrixmolekülen einbezogen zu sein. Somit können kovalente intermolekulare Vernetzungen zwischen Keratinpolypeptiden durch Mutationen, welche konservierte Cysteinreste beeinflussen, beeinflusst sein.

Die Herstellung von Allelvarianten von Keratinproteinen ist verhältnismäßig unkompliziert, wenn die Botschaft, welche das Protein codiert, isoliert wurde. Beispielsweise sind, wenn die bekannte Keratin-messenger-RNA nach dem PCR-Verfahren amplifiziert wurde, eine oder mehrere Formen der Keratin-messenger-RNA-Sequenz in einer für eine Analyse ausreichende Menge vorhanden. Die Addition, Deletion oder Substitution irgendeines Nukleotids oder irgendwelcher Nukleotide in der amplifizierten Sequenz kann durch Klonen der amplifzierten cDNA und Bestimmen der tatsächlichen Nukleotidsequenz des geklonten Gens bestimmt werden.

Die Anwesenheit oder Abwesenheit irgendeines speziellen Exons in der amplifizierten Sequenz kann aber auch durch Herstellung eine Reihe von DNA-Sonden unter Zugrundelegung bekannter Exonsequenzen bestimmt werden (s. Tabelle 3 und hierin angegebene Referenzen). Die amplifizierte DNA kann durch Hybridisierung auf die Anwesenheit oder Abwesenheit jedes Exons, ohne die DNA direkt zu sequenzieren, sondiert werden. Dieses Verfahren wird in der Regel dem unmittelbar weiter oben beschriebenen Verfahren zur Identifizierung isomorpher Formen von Keratinproteinen bevorzugt, indem es weniger zeitaufwändig und kostspielig ist. Die DNA-Hybridisierungssonden identifizieren jegliche fehlende Exonen und beschreiben die Sequenz der messenger-RNA genau genug, so dass sie in ein Expressionssystem für eine schließliche Expression dieses genauen Keratin-Isomorphen konstruiert werden kann.

Die Herstellung nicht-isomorpher Allelvarianten ist gleichfalls im Licht der vorliegenden Lehren unkompliziert. Wenn Unterschiede in der Proteinsequenz Unterschiede in genomische DNA, pre-nRNA, mRNA und/oder editierten oder verarbeiteten Nukleinsäuren widerspiegeln, können die Varianten wie weiter oben beschrieben, hergestellt werden, durch Bildung einer cDNA-Bibliothek aus den Zellen, in denen die Varianten natürlich gebildet sind.

Wenn Unterschiede in der Proteinsequenz keine Nukleinsäuresequenz-Unterschiede zeigen, können sie dessen ungeachtet durch Isolierung des Proteins aus Zellen, in denen die Variantproteine gebildet sind, identifiziert werden. Die isolierten Proteine können sodann einem der verschiedenen analytischen Verfahren unterzogen werden, einschließlich, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, immunologische Tests wie Western Blots oder andere Bindungsstudien, Fragmentierungstudien, Proteinsequenzierung usw., wie es bekannt ist, so dass die genaue chemische Struktur der Varianten bestimmt wird. Wenn die chemische Struktur bekannt ist, können die diese Struktur codierende cDNAs gebildet werden (beispielsweise synthetisch, durch PCR oder unter Anwendung einer rekombinanten DNA-Technologie), um eine leichte Herstellung großer Mengen jeder einzelnen Variante zu ermöglichen.

Es wird darauf hingewiesen, dass die Analyse von im Haar eines Individuums vorliegender Proteine notwendigerweise eine Analyse der bearbeiteten, vernetzten, unlöslichen Formen dieser Proteine mit sich bringt. Die aus einer derartigen Analyse heraus gefundene Information ermöglicht jedoch die Herstellung analoger löslicher Proteine, wie im Vorliegenden beschrieben. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Haarbehandlungszusammensetzungen formuliert, um mehr als eine Allelvariante des gleichen Proteins zu enthalten; andere bevorzugte Ausführungsformen enthalten zwei oder mehrere unterschiedliche Proteine, von denen jedes in mehr als einer Allelform vorliegen kann. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen werden die besonderen Proteine und Allelvarianten ausgewählt, und die Zusammensetzung wird formuliert, um die relativen Mengen der Proteine und/oder Allelvarianten, welche im Haar eines ausgewählten Individuums vorhanden sind, wiederzugeben (vgl. weiter unten).

Vorzugsweise wird ein Individuum ausgewählt, dessen Haareigenschaften nachgeeifert werden sollen, die relativen Mengen des einen oder der mehreren Keratinproteine oder Allelvarianten werden, wie im Vorliegenden beschrieben, bestimmt, wonach jedes Keratinprotein oder jede Allelvariante getrennt gebildet wird, vorzugsweise entweder synthetisch oder durch Expression eines konstruierten Gens in einer Wirtszelle, und die getrennt gebildeten Proteine und/oder Varianten, welche niemals vernetzt wurden, werden zusammen in Verhältnissen rekombiniert, welche sich denjenigen nähern, bei denen sie im Haar des ausgewählten Individuums beobachtet werden. Am bevorzugtesten ist das Individuum Mensch.

FUNKTIONELLE ÄQUIVALENTE

Haarbehandlungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit einem Gehalt an nicht natürlich vorkommenden Keratinproteinen umfassen, ohne hierauf begrenzt zu sein, diejenigen mit einem Gehalt an der primären Aminosäuresequenz von Keratin, deren Protein Allelvarianten und dergl.. Die nicht natürlich vorkommenden Keratinproteine können veränderte Sequenzen umfassen, bei denen Reste innerhalb der Sequenz durch funktionelle äquivalente Aminosäurereste ersetzt werden, was zu einer latenten Veränderung führt.

Gemäß vorliegender Erfindung ist eine Aminosäuresequenz "funktionell äquivalent", im Vergleich zu den bekannten Sequenzen von Proteinen, wenn die Aminosäuresequenz einen oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz enthält, welche durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt werden kann, welche auf eine der ursprünglich aminosäureäquivalente Weise funktionell wirkt. Ersatzmittel für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren umfassen Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren (hydrophilen) neutralen Aminosäuren umfassen Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Aspartinsäure und Glutaminsäure.

Substitutionen werden hinsichtlich ihrer Wirkung ausgewählt auf: (i) eine Aufrechterhaltung der Struktur der Peptid-Hauptkette im Bereich der Substitution beispielsweise als eine Blatt-(sheet) oder Spiralkonformation; (ii) Aufrechterhaltung der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls; oder (iii) Aufrechterhalten der Masse der Seitenkette. Die Substitutionen, die in der Regel zu erwarten sind, um größere Veränderungen zu bewirken, und die vermieden werden sollten, sind diejenigen, bei denen: (a) Glycin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure substituiert oder deletiert oder insertiert wird; (b) ein hydrophiler Rest, wie z. B. Ceryl oder Threonyl anstelle eines (oder durch) einen hydrophoben Rest(s), wie z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl oder Alanyl ersetzt wird; (c) ein Cysteinrest anstelle eines anderen Rests (oder durch einen anderen Rest) ersetzt wird; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, wie z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, anstelle eines Restes mit einer elektronegativen Ladung, wie z. B. Glutamyl oder Aspartyl, (oder durch einen derartigen Rest) ersetzt wird, oder (e) ein Rest mit einer voluminösen Seitenkette, wie z. B. Phenylalanin, anstelle eines solchen, der keine derartige Seitenkette, wie z. B. Glycin, besitzt oder durch einen solchen ersetzt wird.

Es wird jedoch nicht erwartet, dass die meisten Deletionen und Insertionen in den Proteinen radikale Veränderungen in den Eigenschaften des Proteins herbeiführen. Dessen ungeachtet wird der Fachmann auf dem Gebiet würdigen, dass, wenn es schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion bei deren Durchführung vorab vorauszusagen, dass die Wirkung Anwendung von Routinescreening-Tests, wie im Vorliegenden beschrieben, abgeschätzt wird.

AUSWAHLKRITERIEN

Mehrere der Auswahlkriterien, die wünschenswerterweise zur Formulierung der Haarbehandlungszusammensetzung vorliegender Erfindung angewandt werden, wurden schon diskutiert, und sie schwanken auf der Grundlage der beabsichtigten Anwendung der Haarbehandlungsformel.

Vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Formulierung von Haarbehandlungszusammensetzungen zur Verfügung, welche die Keratinproteinzusammensetzung eines Individuums mit bestimmten erwünschten Haareigenschaften nachahmt. Beispielsweise ist es in der Industrie von Haarbehandlungsprodukten gut bekannt, dass Benutzer von Haarbehandlungsprodukten wünschen, ein attraktives Haar zu besitzen. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorliegender Erfindung wird das Haar menschlicher Subjekte visuell überprüft, um diejenigen Objekte auszuwählen, welche das attraktivste Haar besitzen. Sodann werden eine oder mehrere, vorzugsweise mindestens zwei Keratin-Protein-Allelvarianten identifiziert, als gebildet durch die Zellen des Subjekts, und eine Haarbehandlungszusammensetzung mit einem Gehalt an löslichen Formen dieser Allelvarianten wird hergestellt, wie im vorliegenden beschrieben.

Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet erkennt, dass es keinen universell akzeptierten Standard davon gibt, was ein „attraktives Haar" ausmacht. In der Regel wird, wenn eine vernünftige Person das Haar eines Subjekts erachtet, Aspekte zu besitzen, die typischerweise ein attraktives Haar charakterisieren (wie z. B. Glätte, Glanz, Flexibilität, Körper und Weichheit), wird das Subjekt angesehen, dass es ein attraktives Haar besitzt. Jedoch stellt vorliegende Erfindung die Vorzüge einer individuellen Haarbehandlungszusammensetzung zur Verfügung, die vom Verbraucher oder Hersteller in Betracht gezogen werden. Ein „Designer-Kosmetikum" kann wie zuvor beschrieben, formuliert werden, um einen oder mehrere Aspekte der Keratinproteinzusammensetzung irgendeines Individuums zu reproduzieren. Der Verbraucher oder Formulierer kann auf irgendeiner Basis (wie z. B. einer berühmten Persönlichkeit oder einer solchen mit besonders erwünschten Haareigenschaften) irgendeine Person auswählen, deren Keratinzusammensetzung nachzuahmen ist. Bevorzugte Haarbehandlungszusammensetzungen vorliegender Erfindung können infolgedessen als „rekombinante Haarbehandlungszusammensetzungen" erachtet werden und auf das individuelle Subjekt maßgeschneiderte Haarbehandlungspräparate bereitstellen.

Formulierungen

Keratinprotein gemäß vorliegender Erfindung kann irgendeiner der verschiedensten Haarbehandlungszusammensetzungen zugegeben werden. Die verschiedensten Haarbehandlungszusammensetzungen stehen auf dem Fachgebiet zur Verfügung (vgl. Beispiel 1).

Bei einer Ausführungsform kann das Keratin gemäß vorliegender Erfindung zu einer Haarreinigungszusammensetzung wie einem Vorshampoo, einem Shampoo oder einer Konditionierungsspülung zugegeben werden. Bei einer anderen Ausführungsform wird das nicht natürlich vorkommende Keratin vorliegender Erfindung zu einer Haarstyling- oder Formgebungszusammensetzung, beispielsweise einem Gel, Spray oder Schaum zugegeben. Bei einer alternativen Ausführungsform wird das im vorliegenden beschriebene Keratin zwecks Haarfestigung zu einer Dauerwellenvor- oder -nachzusammensetzung gegeben. In einer noch anderen Ausführungsform wird die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Haar Bleich-, Färbe- oder Tönungszusammensetzungen verwendet.

In einem anderen Aspekt kann das Keratin vorliegender Erfindung zu Nagelpflegeprodukten zugegeben werden. Es ist bekannt, dass Fingernägel und Zehennägel einen hohen Prozentsatz von Keratinprotein aufweisen und somit in den Bereich vorliegender Erfindung fallen. Beispielsweise kann Keratinprotein zu Nagellack oder Nagellackentferner zugegeben werden. Diese Haar- und Nagelbehandlungszusammensetzungen umfassen nicht sämtliche Zusammensetzungen, zu denen Keratinproteine vorliegender Erfindung zugegeben werden können, und sie sollen nicht den im vorliegenden beschriebenen Erfindungsumfang beschränken. Der Fachmann auf dem Gebiet wird würdigen, dass nicht natürlich vorkommendes Keratin gemäß vorliegender Erfindung zu irgendeiner Haar- oder Schönheitsbehandlungszusammensetzung zugegeben werden kann, solange das Keratin nicht vernetzt wurde.

TESTS

Wünschenswerterweise können irgendwelche der verschiedensten Tests and den Haarbehandlungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung oder Komponenten derselben durchgeführt werden, um zu gewährleisten, dass sie einschlägige Formulierungskriterien erfüllen.

Beispielsweise werden bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen benutzte Keratinproteine vorzugsweise hoch gereinigt. Die Reinheit der in den Kosmetika vorliegender Erfindung enthaltenen Proteine kann getestet werden, indem man unter Anwendung herkömmlicher Verfahren, wie z. B. SDS-Gelelektrophorese reinigt und willkürlich einen Reinheitsstandard (z. B. 95%ige Reinheit) festlegt, der die zum Bestehen der im Vorliegenden beschriebenen herkömmlichen Hauttests erforderliche Reinheit erfüllt oder überschreitet.

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Haarbehandlungszusammensetzungen, gegen UV-Strahlung zu schützen, kann auch unter Anwendung bekannter Verfahren getestet werden. Beispielsweise wird eine Testreihe mit Ratten durchgeführt, bei denen der Rücken der Ratte enthaart und dann einer Ultraviolettstrahlung ausgesetzt wird. Eine Schaumzusammensetzung, beispielsweise wie im Beispiel 1 gelehrt, wird auf die bestrahlte Haut der behandelten Ratten und auf die nicht-bestrahlte Haut von Kontrollratten aufgebracht. Die Haut der behandelten Tiere wird auf Abhäuten beobachtet. Die Fähigkeit der Haarbehandlungszusammensetzung, Haareigenschaften zu verändern, kann nach den verschiedensten Verfahren gemessen werden. Beispielsweise führt die Behandlung menschlichen Haars oder Wolle mit einem Reduktionsmittel, verwendet in Dauerwellenzusammensetzungen, immer zu einem Gewichtsverlust der Haarprobe, jedoch in Gegenwart von Keratinpolypeptiden gibt es einen Gewichtszuwachs oder höchstens einen geringeren Gewichtsverlust, als wenn Reduktionsmittel allein ohne Keratinpeptide benutzt werden (vgl. U.S.-Patent-Nr. 3.842.848). Infolgedessen kann das Gewicht der Haarprobe vor und nach Behandlung mit der Haarbehandlungszusammensetzung ein Maß für die Fähigkeit der Haarbehandlungszusammensetzung sein, die Haareigenschaften zu verändern. Die Fähigkeit des Keratinmaterials, die Haarproben zu überziehen und zu schützen, kann auch durch die Probe getestet werden, unter Aufrechterhaltung eines glatten, weichen und seidigen Gefühls, sehr ähnlich den Proben vor der Behandlung mit dem Reduktionsmittel. Es gibt verschiedene andere Verfahren, die zum Abschätzen der Wirkung der Haarbehandlungszusammensetzung auf das Haar zur Verfügung stehen (s. Beispiel 5).

BEISPIELE

Vorliegende Erfindung wird nunmehr durch nachfolgende, nicht-begrenzende Beispiele veranschaulicht, in denen alle Prozentsätze Gewichtsprozentsätze sind.

BEISPIEL 1 Herstellung von Haarbehandlungszusammensetzungen

Die folgenden sind Beispiele für Haarpflegezusammensetzungen, denen Keratinprotein der vorliegenden Erfindung zugesetzt werden kann. Die Beispiele sind allein zwecks Veranschaulichung gegeben und sind nicht als Begrenzungen vorliegender Erfindung auszulegen, da viele Variationen der Haarbehandlungszusammensetzungen möglich sind, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

  • (i) Folgendes Shampoo wird vom U.S.-Patent-Nr. 4.439.417 übernommen und hergestellt:
  • (ii) Folgendes anionisches Shampoo wird vom U.S.-Patent-Nr. 4.444.749 übernommen und hergestellt:

In 250 cm3 einer 2%igen Lösung von N,N-Dimethylethylendiamin in Wasser wurden in kleinen aufeinanderfolgenden Teilen und unter heftigem Rühren 8,85 g eines Copolymeren von Vinylmethylether und Maleinsäureanhydrid im Verhältnis von 1:1 mit einer spezifischen Viskosität von 0,1 bis 0,5 in einer 1%igen Lösung des Kunstharzes in Dimethylformamid bei 25°C eingeführt, wobei Sorge getragen wurde, dass jeder aufeinanderfolgende Teil des Copolymeren nur eingeführt wurde, wenn der vorhergehende Teil sich vollständig in der Aminlösung gelöst hat. Die erhaltene Viskoselösung wurde mit einem Gemisch gleicher Teile von Ethylalkohol und Ethylacetat versetzt, welche ein festes Polymerprodukt ausfällen.

Dieses Reaktionsprodukt kann als Weichmachungsmittel durch seine Einführung in ein Shampoo in einem Anteil von 0,5% eingeführt werden. Das derart behandelte Shampoo stellt einen Schaum zur Verfügung, der bei Berührung besonders weich ist und dem Haar einen hohen Glanz und eine hohe Geschmeidigkeit verleiht.

Das Produkt dieses Beispiels kann auch als Verdickungsmittel für Kosmetika, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 2%, oder als Haarweichmachungsmittel bei Konzentrationen von 0,5 bis 2 Gew.% verwendet werden.

  • (iii) Folgendes amphoteres Shampoo wird vom U.S.-Patent-Nr. 4.444.749 übernommen und hergestellt:
  • (iv) Folgendes Vorgemisch aus Silikongummi und feinteiligem Copolymeren wird aus dem U.S.-Patent-Nr. 4.983.383 übernommen und hergestellt:
    Vorgemisch A

Vorgemisch B

Unter Verwendung einer Mischvorrichtung, wie z. B. einem Mischer vom Bandtyp, werden die Komponenten des Vorgemischs A vereint und, bis sie dispergiert sind, und bis der feinteilige Stoff AMPHOMER zu Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,15 bis 2,0 Mikron pulverisiert war, vermischt. Unter Verwendung eines getrennten Mischgefäßes werden die Komponenten des Vorgemischs B bis zur Homogenität vermischt. Zusammen werden das Vorgemisch A und das Vorgemisch B in einem Verhältnis von 57%A zu 43% B vereint und bis zur Homogenität vermischt.

Die Vorgemischlösung wird sodann wie folgt unter Verwendung eines Mischgefäßes mit einem Hochgeschwindigkeits-Drehmoment-Bewegungssystem verdünnt. Die Vorgemischlösung wird mit weiterem Vorgemisch B bei einem Verhältnis von 70,175% Vorgemischlösung zu 29,825 Vorgemisch B bis zur Homogenität vermischt. Die gebildete Vorgemischlösung wird mit weiterem Vorgemisch B bei einem Verhältnis von 50% Vorgemischlösung zu 50% Vorgemisch B bis zur Homogenität vermischt. Dieses Vorgemisch aus Silikongummi/feinteiligem Stoff kann zur Herstellung einer Vielzahl von Haarpflegeprodukten benutzt werden, wie in den nachfolgenden Beispielen erläutert.

In den Beispielen (v, vi, ix und x) für den Dimethicongummi ist dieser ein Silikongummi hoher Viskosität (> 1.000.000 Centistokes), erhältlich von G.E. Silicones und das Octylacrylamit/Acrylat/Butylaminoethyl-Methacrylat-Copolymer als feinteiliger Stoff ist das feinteilige Polymer AMPHOMER mit einem ursprünglichen Teilchengrößenbereich von 75-250 Mikron, erhältlich von National Starch, das bei seiner Dispergierung im Silikongummi derart dispergiert wird, dass der Teilchengrößenbereich auf etwa 0,15 bis 2,0 Mikron verringert wird.

  • (v) Nachfolgendes Nichtaerosol-Haartonikum wird aus dem U.S.-Patent-Nr. 4.983.383, dessen Inhalt in vorliegende Beschreibung durch Bezugnahme einbezogen wird, übernommen und hergestellt:
    geliefert von G.E. Silicones Diese werden in ein Silikonvorgemisch, das z. B. unter iv)beschriebene, kombiniert. soviel wie ausreichend.

Shampoo-Verarbeitung

Zu dem destillierten Wasser werden bei etwa 15°C das Ammoniumlaurylsulfat, die Zitronensäure, das Natriumzitrat und Natriumhydroxid zugegeben. Das Gemisch wird auf 70° bis 80°C erwärmt. An diesem Punkt werden das Cocamid-MEA und Glycoldistearat zugegeben. Das Ammoniumlaureth-3-sulfat, der Cetearylalkohol und das Silikonvorgemisch werden bei 70° bis 90°C vermischt. Dieses Gemisch wird zum Ansatz, nach dem Glycoldistearat zugegeben. Das Konservierungsmittel und der Duftstoff werden sodann zugegeben. Der Ansatz wird 5 Minuten vermischt, sodann unter hoher Scherkraft unter Verwendung einer herkömmlichen Mahlvorrichtung vermahlen und sodann auf Raumtemperatur (15° bis 25°C) abgekühlt. Erforderlichenfalls werden zur Viskositätsregulierung Natriumchlorid und Ammoniumxylolsulfonat zugegeben. Die Endzusammensetzungen haben einen pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 6,0.

Diese Zusammensetzungen werden auf dem gleichen Weg wie man ein Standardshampoo benutzt, verwendet. Das Haar wird sodann getrocknet und auf üblichem Weg gestylt. Bei Verwendung auf diese Weise stellen die Zusammensetzungen Haar mit wirksamem Waschen, Konditionieren und Legen zur Verfügung, sowie ein Aussehen von erhöhtem Volumen.

  • (vi) Folgender Konditionierer wurde aus dem U.S.-Patent-Nr. 4.983.383 übernommen und hergestellt:

Konditionierer-Verarbeitung

Die Hydroxyethylcellulose wird dem destillierten Wasser bei einer Temperatur von 15° bis 40°C zugegeben. Dieses Gemisch wird gut dispergiert und sodann auf eine Temperatur von 60° bis 90°C erwärmt. Die Materialien 2 bis 8 werden zum Ansatz zugegeben, während die Temperatur in diesem Bereich gehalten wird. Das Gemisch wird etwa 10 Minuten gerührt und sodann auf etwa 50°C abgekühlt. Die restlichen Materialien werden bei dieser Temperatur zugegeben. Das Gemisch wird unter hoher kraft etwa 2 Minuten unter Verwendung einer herkömmlichen Mahlvorrichtung vermahlen und sodann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Endzusammensetzungen haben einen pH-Wert von etwa 3,5 bis etwa 4,5.

Diese Zusammensetzungen werden, wie wenn man Standardkonditionierungsprodukte vom Standardspültyp verwendet, d.h., nach dem Shampoonieren wird der Konditionierer auf das Haar aufgebracht, wo man ihn zumindest etwa 1 Minute auf dem Haar verweilen lässt und sodann aus dem Haar ausspült. Das Haar wird sodann getrocknet und auf übliche Weise gelegt. Bei einer derartigen Verwendung stellen diese Zusammensetzungen ein Haar mit einer wirksamen Konditionierung, einem wirksamen Styling und einem Aussehen eines erhöhten Volumens bereit.

  • (vii) Folgende Lotion zum Legen (setting) von Haar wird aus dem U.S.-Patent Nr. 4.444.749 übernommen und hergestellt:
  • (viii) Folgendes Nichtaerosol-Haartonikum wird aus dem U.S. Patent Nr. 4.983.383 übernommen und hergestellt:

Ein Nichtaerosol-Haartonikum-Spray, wird wie folgt hergestellt: Das Lauramidoxid wird mit einem Teil des Wassers bei einem Verhältnis von 4:1 mit z. B. einer Mischvorrichtung vom Bandmischtyp bis zur Homogenität vermischt. Cocamid-DEA wird zugegeben und bis zur Homogenität eingemischt. Das Vorgemisch aus (iv) wird zugegeben und bis zur Homogenität eingemischt.

Der Rest des Wassers wird in ein Mischgefäß aus rostfreiem Stahl gefüllt. Das Produkt Carbomer 956 wird in das Wasser unter Verwendung von z. B. einer Mischvorrichtung vom Typ „Triblender" oder „Eeductor" eingemischt. Das Mischen wird fortgesetzt, bis das Carbomer vollständig gelöst ist. Das Kaliumhydroxid wird unter Vermischen zugegeben. Das Vorgemisch wird unter Mischen bis zur Homogenität zugegeben. PVP/VA wird sodann zugegeben, und das Mischen wird fortgesetzt, bis der Ansatz homogen ist. Das Konservierungsmittel wird zugegeben und das Vermischen wird bis zur Homogenität fortgesetzt. Das Parfum wird zugegeben, und das Mischen wird weitere 10 Minuten fortgesetzt. Unter Anwendung einer herkömmlichen Vorrichtung wird, wenn der Ansatz gut vermischt ist, die Homogenisierung des Ansatzes durchgeführt. Das Endprodukt ist eine opake Flüssigkeit mit einem pH-Wert von etwa 6 und 7.

Das Haartonikum wird auf das feuchte Haar gesprüht, und das Haar wird sodann gestylt/getrocknet. Die benutzte Menge des Tonikums hängt von den Volumen/Haltevorteilen ab, welche gewünscht sind, sowie von der Menge des Haares, welche behandelt wird, und der Textur des Haares. Die Verwendung dieses Produkts auf dem Haar führt zu einem Aussehen eines erhöhten Haarvolumens. Das Anfühlen des Haares ist in erwünschter Weise weich und leicht zu handhaben, nicht steif und klebrig, wie es mit den meisten Haarstylingsprodukten das Ergebnis ist. Das Halten des Haarstils ist ebenfalls lang anhaltend.

  • (ix) Folgende Schaumzusammensetzungen werden aus dem U.S.-Patent Nr. 4.983.383 übernommen und hergestellt:

Die Gelzusammensetzungen vorliegender Erfindung werden unter Anwendung des in (viii) für das Haartonikum skizzierten Verfahrens hergestellt mit der Ausnahme, dass das Produkt Carbomer 956 durch Carbomer 940 ersetzt wird, und dass das Triethanolamin vor dem Konservierungsmittel zugegeben und bis zur Homogenität eingemischt wird. Diese Zusammensetzungen haben einen pH-Wert von etwa 6 bis 7.

Diese Zusammensetzungen werden auf dem gleichen Weg wie die Schaumzusammensetzungen von (ix) verwendet. Wenn sie auf diesem Weg benutzt werden, stellen diese Gelzusammensetzungen eine wirksame Konditionierung, ein wirksames Styling und ein Aussehen eines erhöhten Haarvolumens bereit.

Die Aerosolschäume vorliegender Erfindung werden hergestellt, indem man alle Bestandteile mit Ausnahme des Aerosoltreibmittels in einen, Konzentrat genannten Ansatz vereint. Dieses Konzentrat wird durch Vereinen unter Rühren sämtlicher Bestandteile mit Ausnahme des Konservierungsmittels und des, wie in (iv) hergestellten Vorgemischs und Vermischen, bis sie gut dispergiert sind, hergestellt. Das Konservierungsmittel und Vorgemisch wird schließlich zugegeben, und das Mischen wird fortgesetzt, bis diese völlig dispergiert sind. Das erhaltene Gemisch wird sodann unter Verwendung einer herkömmlichen Vorrichtung homogenisiert. Das erhaltene Konzentrat hat einen pH-Wert von 6 bis 7. Aerosolschaumdosen werden hergestellt, indem man 135 g des Konzentrats in mit Epoxyharz ausgekleidete Aluminiumdosen von 5 Unzen füllt, Schaumventile auf die Dosenoberseiten aufbringt, ein Vakuum anlegt, um den Kopfraum der Dose zu evakuieren (zur Entfernung von Luft) und Einbördeln der Ventile. Das Treibmittel (15 g) wird durch Einfüllen durch den Ventilschaft unter Druck zugegeben.

Diese Zusammensetzungen werden in ein sauberes/feuchtes Haar einmassiert, und das Haar wird sodann getrocknet und gestylt. Die benutzte Schaummenge hängt von den gewünschten Volumen-/Halteeigenschaften ab sowie der behandelten Haarmenge sowie der Textur des Haares. Wenn sie auf diese Weise benutzt werden, stellen diese Schaumzusammensetzungen eine wirksame Konditionierung, ein wirksames Styling und ein Aussehen eines erhöhten Haarvolumens bereit.

  • (x) Folgende Gelzusammensetzungen werden aus dem U.S.-Patent-Nr. 4.983.383 übernommen und hergestellt:
  • (x) Folgendes Nichtaerosol-Silikon-Haarspray wird aus dem U.S. Patent-Nr. 4.983.383 übernommen und hergestellt:

Das feinteilige Amphomer® wird zuerst in dem Polydimethylsiloxangummi unter Verwendung einer Teigknetvorrichtung bei niederer Geschwindigkeit während etwa 4 Stunden dispergiert. Das Amphomer®/Gummi-Gemisch wird sodann zum Cyclomethicon zugegeben und unter Verwendung einer Teigknetvorrichtung etwa 8 Stunden bis zum Lösen eingemischt. Das Dimethicon-Copolyol wird zugegeben, und die Zusammensetzung wird unter Verwendung der Teigknetvorrichtung bis zur Homogenität gemischt. Sodann wird das Tixogel® zugegeben und unter Verwendung der Teigknetvorrichtung eingemischt, bis das Gemisch homogen ist. Unter Verwendung einer Mühle Tek Mar® wird die Zusammensetzung langsam mit dem Ethanol bis zur Homogenität vermischt. Unter Anwendung eines herkömmlichen Vermischens wird das Copolymer PVP/VA zugegeben. Das Octylsalicylat, die Keratinaminosäuren und der Duftstoff werden in dieser Reihenfolge in die Zusammensetzung eingemischt. Das erhaltene Haarspray stellt die Vorteile einer verbesserten Haarkonditionierung- und Volumengebung mit einem sich weicher anfühlenden Haargriff (hair hold) bereit. Im wesentlichen ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn eine äquivalente Menge von Quaternium-18-hectorit (z. B. das unter dem Warenzeichen Bentene-38® von der Firma NL Chemicals verkaufte Material), ein Stearalkoniumbentonit (z. B. das unter dem Warenzeichen Tixogel VZ® von der Fa. United Catalysts verkaufte Material) oder eines Stearaldoniumhectorits (z. B. das unter dem Warenzeichen Bentone-27® von der Fa. NL Chemicals verkaufte Material) anstelle des Tons Tixogel VP® verwendet wird.

  • (xi) Das folgende Aerosol-Siliconhaarspray wird aus dem U.S. Patent-Nr. 4.983.383, das durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen wird, übernommen und hergestellt:

Aerosol-Siliconhaarsaray

Ein Aerosol-Siliconhaarspray kann durch Kombination der Zusammensetzung (iv) mit einem Treibmittel, wie z. B. dem Treibmittel A-31, das ein Isobutan-Treibmittel, erhältlich von Phillips-Petroleum, Inc. ist, bei einem Verhältnis von 3 Teilen Haarspray Zusammensetzung zu einem Teil Treibmittel erhalten werden kann.

  • (xiii) Folgende Haarspray-Zusammensetzung wird aus dem U.S. Patent-Nr. 4.983.383 übernommen und hergestellt:
Haarsprayzusammensetzung
Vorgemisch 1 FF400 Dimethiconcopolyol, erhältlich von Dow Corning Cyclomethicon mit einer D5-Struktur, erhältlich von G.E. Silicones GE SR545, erhältlich von G.E. Silicones SE-76 Gummi, erhältlich von General Electric Co. Octylacrylamid/Acrylat/Butylaminoethylmethacrylat-Copolymer mit einer ursprünglichen Teilchengröße (vor dem Vermahlen) von 75-200 Mikron, erhältlich von National Starch

Das Amphomer® wird zuerst in den Polydimethylsiloxangummi unter Verwendung einer Teigknetvorrichtung bei einer geringen Schergeschwindigkeit während etwa 4 Stunden dispergiert. Das Gemisch Amphomer®/Gummi wird sodann zum Cyclomethicon und Siloxanharz gegeben und bis zur Auflösung vermischt, unter Verwendung einer Teigknetmischvorrichtung während etwa 8 Stunden. Das DRO-Wasser wird zugegeben und bis zur Homogenität eingemischt. Das Lauraminoxid wird zugegeben und bis zur Homogenität eingemischt. Sodann wird Cocamid-DEA zugegeben und bis zur Homogenität eingemischt. Der SD 40-Alkohol wird sodann mit dem obigen Gemisch bis zur Homogenität vermahlen. Sodann werden in die Zusammensetzung das PVP/VA-Polymer, Dimethiconcopolyol, Octylsalicylat, die Keratinaminosäuren und das Parfum jeweils der Reihe nach eingemischt. Das erhaltene Haarspray stellt die Vorteile einer verbesserten Haarkonditionierung und einer Volumengebung mit einem sich weicher anfühlenden Haargriff zur Verfügung.

  • (xiv) Folgender Nagellackentferner wird aus dem U.S. Patent Nr. 5.173.288 übernommen und hergestellt:
    Crotein ASK 10-15%ige Lösung in Alkohol (von Croda) EMCOL t655 (von Croda) CROTEIN AD (von Croda)

Andere Beispiele für Haarpflegeprodukte können in den U.S.-Patenten Nrn. 4.495.173, 4.542.014 und 5.612.014 gefunden werden.

BEISPIEL 2 PCR-Amplifikation von Haarkeratin cDNA Für die Amplifikation verwendete Oligonukleotide

Auf einer Biosearch DNA-Synthesevorrichtung werden Oligonukleotide synthetisiert. Die meisten der primer sind mRNA-spezifische primer. Die 5'- und 3'- primer sind bestimmt, um einander gegenüberliegende Extreme der besonderen Elastin-mRNA-Sequenz zu hybridisieren.

Amplifikationsverfahren

RNA wird unter Anwendung herkömmlicher Verfahren in cDNA revers transkribiert. Kurz gesagt wird ein 10-:1 reverses Trankskriptions-Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an 1 :g gesamter cellularer RNA, 1 × PCR-Puffer (20 mM Tris HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM KCl; 2,5 mM MgCl2/100 : g Rinderserum Albumin pro ml), 1 mM Dithiothreit, 0,5 mM dNTP, 10 Einheiten RNasin (Promega Biotec), 0,1 : g Oligo (dT) und 100 Einheiten BRL-Moloney-Mäuseleukämie-Virus-reverse Transkriptase (Bethesda Research Laboratories) bei 37°C 60 Minuten inkubiert, auf 95°C während 5-10 Minuten erwärmt und sodann auf Eis schnell abgeschreckt. PCR wird bei einer Endkonzentration von einmal PCR-Puffer/50 :M dNTPs/0,1 :M jeder 5'- und 3'- primer/ 1 × 106 cpm [32P-]endmarkierter primer/ Liter Einheit Thermus aquaticus DNA-Polymerase (Taq Polymerase) (Perkin-Elmer/Cetus) in einem Gesamtvolumen von 50 :1. Das Gemisch wird mit Mineralöl überschichtet und sodann mit dem thermischen Cycler Cetus von Perkin-Elmer amplifiziert. Das Amplifikationsprofil beinhaltet eine Denaturierung bei 95°C während 30 Sekunden, eine Wärmebehandlung (annealing) des primers bei 55°C während 30 Sekunden und Extension bei 72°C während 1 Minute.

BEISPIEL 3 Konstruktion und Screenen einer menschlichen Kopfhaut-cDNA-Bibliothek

Dieses Verfahren wird von Rogers u.a. Differentiation, Bd. 61, S. 187-194, 1997 und Rogers u.a., Experimental Cell research, Bd. 220, S. 357-362, 1995 übernommen.

Die gesamte mRNA wird aus einem 3 cm3-Stück einer chirurgisch entfernten menschlichen Kopfhaut isoliert (Winter u.a., Exp. Cell res., Bd. 212, S. 190-200, 1994). 5 Mikrogramm Poly(A)+ RNA wird zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek im Lambda Zapp II gemäß den Instruktionen des Herstellers (cDNA Cloning Systems, Stratagene) verwendet.

Die Bibliothek wird mit einem 700-bp Styl/Sryl-Fragment des Haarkeratinklons mHa2 vom Mäusetyp I (vgl. Winter u.a., Exp. Cell Res., Bd. 212, S. 190-200, 1994) gescreent, das sowohl Sequenzen, die für eine a-spiralförmige Subdomäne und den Carboxyterminus codiert, sowie 3'-nicht-codierende Sequenzen enthält. Ein zweites Screenen kann mit einem 570-bp Styl/Pstl-Fragment des Mäusetyps-II-Haarkeratin-Klons mHb4 (vgl. Yu u.a., J. Invest. Dermatol., Bd. 97, S. 354-363, 1991; und Tobiasch u.a., Mol. Biol. Rep. Bd. 16, S. 39-47, 1992, durchgeführt werden, das ausschließlich a-Helix-codierende Sequenzen umfasst. Die Sonden können durch nick translation mit [32P]dCTP markiert werden.

Die Screening-Sonden können aber auch durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) synthetisiert werden. Ein 182-bp-Segment des Bereichs der für den Aminoterminus des Mäusetyps-II-Haarkeratins mHb4 (Nukleotidstellungen 197-379) des Klons MHKB2 codiert (Yu u.a., J. Invest. Dermato.l, Bd. 97 S. 354-363, 1991) wird aus genomischer Mäuse-DNA unter Verwendung der primer 5'CCTGCTACCGAGGACTCTCAGG-3' (Vorwärtsprimer) und 5'-CGATCTCCAGGTTCAGGGGTGT-3' (reverser primer] amplifiziert. In ähnlicher Weise wird ein 284-bp-Segment des Bereichs, der für den Carboxyterminus codiert, und der 3'-nicht-codierende Bereich eines Mäusetyps II-Haarkeratinklons pmKII-6 (vgl. Tobiasch u.a., Mol. Biol. Rep., Bd. 16, S. 39-47, 1992) amplifiziert, und zwar unter Verwendung der primer 5'-TGCAGCGGAAACGTGGTGG-3' (Vorwärtsprimer) und 5'-CTGGGGCAGCGGATCCTCCAG-3' (reverser primer). Das amplifizierte DNA-Fragment kann als Sonde verwendet werden, um die menschliche Kopfhaut-cDNA-Bibliothek zu screenen (vgl. Rogers u.a., Differentiation 61, 187-194, 1997). Eine menschliche Cosmid-Bibliothek (beispielsweise pWE15: Clontech. Palo Alto. CA, USA) kann mit PCR-geklonter genomischer Haarkeratin-DNA (ghHKb2-1), markiert durch nick translation mit g[32P]-dCTP gescreent werden (vgl. Bowden u.a., The Journal of Investigative Dennatology, Bd. 110, Nr. 2, Februar 1998). Ähnliche primer können vom Fachmann auf dem Gebiet aus bekannten mRNA-Sequenzen anderer Proteine erzeugt werden. Wenn die geeigneten Klone isoliert wurden, können die Keratinproteine exprimiert und gereinigt werden.

Die PCR wird in 1X PCR-Puffer durchgeführt, der besteht aus: 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,85, 25 mM KCl, 5 mM (NH4)2SO4, 2,0 mM MgSO4 mit 200 mM dNTP', 50 pMol primer und 2,5 Einheiten Taq Polymerase bei 94°C für 30 Sekunden; 56°C für 40 Sekunden; 72°C für 50 Sekunden, für 30 Zyklen. Die PCR-Produkte werden an einem 3,5%igen niederschmelzenden Agarosegel getrennt und durch Gelase-Verdauung (Biozym, Oldendorf, Deutschland) gereinigt und mit Ethanol ausgefällt.

Jedoch werden die Sonden erzeugt, und die Sonden werden in einem plake-Hybridisierungsschema geringer Härte (low-stringency) verwendet (Vorhybridisierung und Hybridisierung mit 6X SSC, 0,1 % SDS, 5X Denhardt's-Lösung bei 50°C während 24 Stunden; die Filter wurden 3X 30 Minuten mit 2X SSC, 1 % SDS bei 55°C gewaschen) (Rogers u.a., Exp. Cell Res., oben).

Charakterisierung von Keratin cDNA's

Positive Bakteriophagenklone werden gereinigt und durch automatische Exzision gemäß den Instruktionen des Herstellers (Stratagene) in Bluescript-Phagemide übergeführt und von beiden Enden sequenziert. Die partiellen Sequenzen werden unter Anwendung der EMBL-Nucleotide-Data-Base analysiert, um Klone, die für bekannte Keratine (am wahrscheinlichsten epidermale Keratine) codieren, zu eliminieren. Das Sequenzieren der restlichen möglicherweise unique Klone durch das Dideoxy-Kettenterminierungsverfahren (vgl. Sanger u.a., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 75, S. 5463-5467, 1977) unter anfänglicher Verwendung der universellen M13- und T3-primer, gefolgt von 17-mer Oligonukleotid-walking primers durchgeführt, welche für die neu geklonte Sequenz spezifisch sind.

Hybridisierung mit Exon-spezifischen Sonden

Oligonukleotidsequenzen, die für einzelne Exonen spezifisch sind, werden nach Verfahren ausgewählt, die im Vorliegenden beschrieben sind. Die Exon-spezifischen Oligonukleotide werden unter Anwendung einer Modifizierung des Phosphit-Verfahrens von Mateeucci (J. Am. Chem. Soc., 103:3185, 1981) unter Benutzung eines programmierbaren Synthesizers MilliGen (Bedford, MA, USA) synthetisiert. Die synthetischen Oligonukleotide werden durch den Umkehrphasen-Hochdruck Flüssigkeitschromatographen (Varian 5000) gereinigt.

Exon-spezifische synthetische Oligonukleotide werden am 5'-Ende mit [32P]dATP durch eine durch T4-Polynukleotidkinase katalysierte Phosphataustauschreaktion radioaktiv markiert. Zur Aufklärung der An- oder Abwesenheit einer spezifischen Exonsequenz innerhalb der identifizierten menschlichen Kopfhautklone werden 100 ng die insert-cDNA denaturiert, auf Nitrozellulosefilter aufgetupft und mit 10 ng der radiomarkierten Exon-spezifischen Oligonukleotidsonde hybridisiert. Eine Filtervorhybridisierung wird in einer Lösung durchgeführt, die aus 0,9 M NaCl, 90 mM Natriumzitrat (pH-Wert 7,0), 0,5% Natriumdodecylsulfat, 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, 0,1 % Polyvinylpyrrolidin, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Ficoll besteht, und zwar bei 42°C während 2 Stunden. Die Hybridisierung wird nach Zugabe der markierten synthetischen Oligonukleotidsonde 16 Stunden in der gleichen Lösung durchgeführt. Die Filter werden bei einer Endhärte (stringency) von 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumzitrat bei 55°C 60 Minuten gewaschen.

BEISPIEL 4 Herstellung eines rekombinanten menschlichen Keratins

Folgende Verfahren wurden von denjenigen von Manabe u.a., Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 229, S. 965-973, 1996, übernommen.

Konstruktion eines Expressionsvektors und Expression von Keratin

Keratin-cDNA, revers transkribiert aus der mRNA menschlicher Kopfhautzellen (vgl. Beispiel 3) wird in einen Expressionsvektor, wie z. B. PECE, geklont. Vorzugsweise wird eine cDNA voller Länge entweder menschlicher saurer oder basischer Haarkeratingene in die Eco RI-Klonstelle von PECE unter Kontrolle des früheren Promotors SV40 insertiert. PtK2-Zellen (bezogen von der American Type Culture Collection) und epidermale Rattenkeratinozyten (Dr. Howard P. Baden Harvard University, Boston) werden in DMEM (Gibco) ergänzt mit 10%igem fetalem Kälberserum (Gibco) wachsen gelassen. Alle Kulturen wurden in einer 5%gen Kohlendioxidatmosphäre bei 37°C wachsen gelassen. Die Transfektionen in PtK2-Zellen und epidermalen Rattenkeratinozyten werden nach dem Lipofektionsverfahren unter Verwendung von LipofectAMINE bzw. LipofectACE-Reagenz (Gibco) gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt.

Zur Bestimmung der Anwesenheit und des Status der transfektierten Proteine werden Zellen 48 Stunden nach Transfektion Zellen zerrissen, und ein unlösliches Keratinpellet wird durch sequenzielle Extraktion in nicht-ionischem Detergens mit niederen und hohen Salzpuffern (vgl. Schweizer u.a., Exp. Cell. Rest. Bd. 184, S. 193-206, 1993) erhalten. Das Pellet wird im Probenpuffer wieder suspendiert und durch SDS-PAGE getrennt. Proben werden sodann unter Verwendung einer Bio-Rad-Transfer-Vorrichtung auf eine Nitrozellulose-Membran übergeführt, und die Membranen werden durch Inkubation über Nacht in MT-Puffer (5% Trockenmilch ohne Fett, 0,2% Tween 20 in PBS während 2 Stunden bei Raumtemperatur (vgl. Schweizer u.a., Exp. Cell. Res., oben) blockiert. Die Membran wird mit Antikörpern zu den gewünschten Keratinproteinen sondiert (vgl. z. B. Westgate u.a., Br. J. Dermatol., Juli 197(1): 24-30, 1997). Die Anwesenheit gebundener Antikörper wird durch Inkubation mit biotinyliertem Ziegen-Antimaus-Antiserum und Avidin-Peroxidase-Komplex (SensiTek, Sytek), gefolgt durch nachfolgende Entwicklung unter Verwendung erhöhter Chemolumineszenz (ECL, Amersham) gemäß den Empfehlungen des Herstellers bestimmt.

BEISPIEL 5 Bewertung von Haareigenschaften
  • (i) Haareigenschaften können auch nach folgenden Verfahren bewertet werden (vgl. U.S.-Patent-Nr. 5.612.024)
a) Längenmessungen an behandeltem Haar

Zur Messung wurden Haarschnitte Alkinco Typ 6621 (Schnittlänge: 12 cm) verwendet.

Die Schnitte wurden 20 Minuten mit dem Testshampoo behandelt, dann etwa 30 Sekunden gespült und mit einem Fön etwa 1,5 Stunden bei 38°C getrocknet. Die Schnitte werden sodann 20 Minuten ultragebleicht (Zusammensetzung der Ultrableiche: 6 Gew.% Wasserstoffperoxid, 15 Gew.% Ammoniumperoxydisulfat, konzentrierter Ammoniak bis zum pH-Wert 9,4, Rest Wasser) und etwa 1 Minute mit Wasser gespült. Die nassen Schnitte wurden sodann shampooniert, gespült und wie oben beschrieben, getrocknet. Die Schnitte wurden sodann kalt gewellt, Wellenlösung 7 Gew.% Thioglycolsäure, konz. Ammoniak bis zum pH-Wert 9,0, Rest Wasser), mit Wasser (38°C) etwa 1 Minute gespült und mit einer Fixierungslösung (2 Gew.% Wasserstoffperoxid, Zitronensäure bis zum pH-Wert 4,0, Rest Wasser), behandelt, shampooniert, gespült und wie oben beschrieben, getrocknet. Der Zyklus des Ultrableichens, Spülens, Shampoonierens, Spülens, Trocknens, kalten Wellens, Spülens, Fixierens, Spülens, Shampoonierens, Spülens und Trocknens wird sodann weitere zwei Male wiederholt. Für die trockene Messung werden die Schnitte in Luft bei 38°C erwärmt. Für die nassen Messungen werden die Schnitte bis kurz vor der Messung gelagert. Folgende Werte können bestimmt werden: maximale Bruchbeanspruchung (Zugkraft, bei der das Haar bricht);

Wert der 15%igen Dehnung (Zugkraft, bei der das Haar um 15% gedehnt wird); Bruchdehnung (% Dehnung, bei der das Haar bricht).

Sprödigkeit

Einzelheiten des Messverfahrens können in der Literatur (ärztl. Kosmetologie 15, 347-355 (1985) und Parfümerie & Kosmetik 72, 74-81 (1991)) gefunden werden.

Die Sprödigkeit wird als der Prozentsatz von Haaren bestimmt, welche bei einer 20%igen Dehnung und weniger einen Bruch zeigen.

b) Bestimmung der Trockenauskämmarbeit

Die Trockenauskämmarbeit kann z. B. an braunem Haar (Alkinco 6634, Schnittlänge 12 cm, Schnittgewicht 1 g) in Form eines Vergleichs von gepaarten Mittelwerten bestimmt werden. Zur Bestimmung des Nullwerts werden die Schnitte mit Wasser 1 l/Min, 38°C) 1,5 Minuten gespült und ausgekämmt. Die Schnitte werden sodann mit einem Fön 40 Minuten bei 45°C getrocknet. Nach Konditionieren während 12 Stunden bei 30°C/40% relative Luftfeuchtigkeit wird die Kämmbarbeit bestimmt. Die Schnitte werden mit 100 g der Formulierung 5 Minuten behandelt und sodann gespült, getrocknet, und wie zuvor beschrieben, konditioniert. Sodann wird die Trockenauskämmbarbeit bestimmt. Einzelheiten des Messverfahrens können in der Literatur (Ärztl. Kosmetologie, 20, 498-502 (1990)) gefunden werden. Die Bedingungen werden aufrecht erhalten, so dass keine Vernetzung von Keratinproteinen während der Expression auftritt, was möglicherweise die Expression eines einzigen Keratinpolypeptids in eine einzelne Zelle erfordert.

  • (ii) Bewertungsverfahren für eine Vorshampoobehandlung (vgl. U.S.-Patent-Nr. 4.495.173)

a) Anfühlen des Haares während des Waschens

Auf Schnitte eines Haares einer Japanerin mit einer Länge von 20 cm und einem Gewicht von 20 g wurden jeweils 2 g eines jeden Vorshampoos aufgebracht. Nach 5minütigen Einwirkenlassen wurden auf das Haar 2 g eines im Handel erhältlichen einfachen Shampoos angewandt und wie üblich 1 Minute lang eingeseift, wonach das Anfühlen des Haars bewertet wird. Die Bewertung wird durch einen gepaarten Vergleichstest vorgenommen, bei dem ein mit einem im Handel erhältlichen Haar-Vorshampoo, das hauptsächlich aus Lanolin und als Kontrolle verwendet wird, ein Schnitt behandelt wird.

b) Anfühlen des Haares im feuchten Zustand

Nach Abschluss der Bewertung des Anfühlens des Haares während des Waschens wird es mit laufendem Wasser von 40°C 1 Minute gewaschen und mit einem Handtuch getrocknet, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Der Schnitt wird in ähnlicher Weise zu dem Schnitt während des Waschens bewertet, um das Anfühlen in einem feuchten Zustand zu kennen.

c) Anfühlen und Leichtigkeit des Auskämmens nach dem Trocknen

Nach der Bewertung gemäß (b) werden die feuchten Haarschnitte jeweils an der Luft getrocknet, und ihr Anfühlen gemäß dem Verfahren von (b) bewertet. Sodann wird die Leichtigkeit des Auskämmens in ähnlicher Weise zum Verfahren (a) unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Nylonkamms bewertet.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zum formulieren einer Haarbehandlungszusammensetzung, wobei das Verfahren Schritte aufweist, bei denen man:

    eine menschliches Individuum auf der Basis, dass das Individuum attraktive Haarmerkmale hat, auswählt;

    zumindest eine Nukleinsäure erlangt, wobei jede dieser eine unterschiedliche keratinallele Variante, die im Haar des menschlichen Individuums vorkommt, kodiert;

    jede der identifizierten Nukleinsäuren in einen Expressionsüberträger einfügt, so dass eine Population an Expressionskonstrukten, von denen jedes eine keratinallele Variante kodiert, hergestellt wird, wobei die Population Überträger einschließt, die zumindest eine keratinallele Variante kodieren;

    jedes Expressionskonstrukt in eine Wirtszelle einfügt, so dass eine Population an Wirtszellen hergestellt wird, von denen jede ein individuelles Expressionskonstrukt aufgenommen hat und eine nicht vernetzte, keratinallele Variante davon ausbildet;

    die Wirtszellen in der Population an Wirtszellen identifiziert, die eine von zumindest einer keratinallelen Variante in einer Weise ausbilden, die nicht zur Vernetzung der zumindest einen hergestellten keratinallelen Varianten führt;

    jede der zumindest einen keratinallelen Varianten von der Wirtszelle, die diese herstellt, reinigt; und

    die zumindest eine, gereinigte keratinallele Variante mit einer anderen und auch mit Komponenten von einer Haarbehandlungszusammensetzung vereint, um eine Haarbehandlungszusammensetzung zu bilden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man bei dem Schritt, bei dem man erlangt, man entweder (a) zumindest zwei Nukleinsäuren erlangt; oder (b) zumindest eine oder vorzugsweise zwei Nukleinsäuren erlangt, wobei jede eine keratinallele Variante kodiert, die ein Protein ist, ausgewählt aus den Keratinproteinen hHa1, hHa2, hHa3-I, hHa3-II, hHa4, hHa5, hHRa1, hHb1, hHb3, hHb5, hHb6, Hax und Hbx.
  3. Verfahren zur Herstellung einer Haarbehandlungszusammensetzung, die Keratin aufweist, wobei man bei dem Verfahren:

    eine menschliches Individuum auf der Basis, dass das Individuum attraktive Haarmerkmale hat, auswählt;

    zumindest eine Nukleinsäure erlangt, wobei jede dieser eine unterschiedliche von zumindest einer keratinallelen Variante, die im Haar des ausgewählten menschlichen Individuums natürlich hergestellt wird, kodiert;

    jede der zumindest einen Nukleinsäuren in einen Expressionsüberträger einfügt;

    jeden der Expressionsüberträger in seine eigene Wirtszelle einfügt, so dass jede der keratinallelen Varianten in einer Wirtszelle hergestellt wird;

    jede der rekombinant hergestellten, keratinallelen Varianten reinigt;

    die zumindest eine, gereinigte keratinallele Variante miteinander und auch mit einer Haarbehandlungszusammensetzung vereint.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man beim Schritt, bei dem man jede der zumindest einen Nukleinsäuren in einen Überträger einfügt, zumindest zwei Nukleinsäuren einfügt.
  5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man:

    (a) Bei dem Schritt, bei dem man vereint, zumindest eine oder vorzugsweise zumindest zwei gereinigte keratinallele Varianten miteinander in Verhältnissen vereint, die in etwa denen entsprechen, die in der Epidermis des ausgewählten Individuums gefunden werden;

    (b) bei dem Schritt, bei dem man auswählt, ein menschliches Individuum auswählt, an dem die Haarbehandlung angewandt werden soll;

    (c) bei dem Schritt, bei dem man auswählt, ein menschliches Individuum auswählt, das von dem verschieden ist, an dem die Haarbehandlung angewandt werden soll;

    (d) bei dem Schritt, bei dem man auswählt, ein menschliches Individuum auswählt, dessen Haarmerkmale einem Individuum gefallen, an dem die Harrbehandlung durchgeführt werden soll;

    (e) bei dem Schritt, bei dem man auswählt, ein menschliches Individuum auf der Basis von vorbestimmten Kriterien auswählt, die vom Hersteller der Zusammensetzung festgelegt werden;

    (f) bei dem Schritt, bei dem man auswählt, ein menschliches Individuum auf der Basis von vorbestimmten Kriterien auswählt, die vom Träger der Zusammensetzung festgelegt werden;

    (g) bei dem Schritt, bei dem man auswählt, ein menschliches Individuum auf der Basis des Individuums, das der Träger der Zusammensetzung ist, auswählt;

    (h) jedes der zumindest einen oder vorzugsweise der zumindest zwei keratinallelen Varianten ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Keratin mit voller Länge;

    (i) jedes der zumindest einen oder vorzugsweise der zumindest zwei keratinallelen Varianten ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gekürztem Keratin;

    (j) jedes der zumindest einen oder vorzugsweise der zumindest zwei keratinallelen Varianten ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hydrolysiertem Keratin;

    (k) bei dem Schritt, bei dem man erlangt, eine cDNA-Bibliothek von Zellen des ausgewählten Individuums erstellt, welche die allelen Varianten ausbilden und die cDNA- Bibliothek überprüft, um zumindest ein oder vorzugsweise zwei Isolate zu bestimmen, die geklonte Sequenzen enthalten, die unterschiedliche keratinproteinallele Varianten kodieren;

    (l) bei dem Schritt, bei dem man reinigt, jede Keratinallele Variante reinigt, bis diese zumindest 95 % rein ist;

    (m) attraktives Haar auf Basis von einer oder mehreren Merkmalen ausgewählt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Weichheit, Glätte, berühmte Individuen, Glanz, Reißfestigkeit, Flexibilität, Aufbau, bevorzugte Farbe, Geradheit, Lockigkeit und Welligkeit.
  6. Haarbehandlungszusammensetzung, aufweisend eine wässrige Lösung eines Detergens, zumindest eine keratinproteinallele Variante, die in Verhältnissen vorliegen, die ungefähr identisch sind mit denen, die in den Varianten im Haar eines ausgewählten Individuums vorliegen.
  7. Haarbehandlungszusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass:

    (a) zumindest zwei keratinproteinallele Varianten in Verhältnissen vorliegen, die ungefähr identisch sind mit denen, in denen die Varianten im Haar eines ausgewählten Individuums vorliegen,

    (b) zumindest eine oder vorzugsweise zumindest zwei der keratinproteinallelen Varianten modifiziert worden sind, um die Löslichkeit zu verbessern, und wobei die Modifikation gegebenenfalls die Zugabe eines Rests, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Liposomen, Fettsäuren, Kohlehydraten, Lipiden und Proteinen, aufweist, und des weiteren, wobei die Modifikation gegebenenfalls die Zugabe von Aminosäuren zu einem Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hydrophoben Aminosäuren, hydrophilen Aminosäuren oder cysteinreichen Aminosäuren, aufweist; oder

    (c) zumindest eine oder vorzugsweise zumindest zwei keratinproteinallele Varianten modifiziert worden sind, um deren Antigenität zu vermindern, und gegebenenfalls wobei die Modifikation die Änderung des lösemittelzugänglichen Teils der keratinproteinallele Variante aufweist.
  8. Wässriger, acetonbasierter Nagellackentferner, der:

    (a) von 40 bis 90 Gewichtsprozent Aceton und

    (b) von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent Keratinprotein, wobei das Keratinprotein eine allele Variante von Keratinprotein ist, aufweist.
  9. Nagellackentfernen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass

    (a) dieser von 50 bis 80 Gewichtsprozent Aceton aufweist,

    (b) dieser von 0,005 bis 1 Gewichtsprozent Keratin aufweist oder

    (c) dieser des weiteren von 1 bis 20 Gewichtsprozent Lanolin oder ein Derivat davon aufweist.
Es folgt kein Blatt Zeichnungen






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