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Dokumentenidentifikation DE102004029573A1 29.12.2005
Titel MIF-Adsorbent
Anmelder Gambro Lundia AB, Lund, SE;
Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V., 80686 München, DE
Erfinder Bernhagen, Jürgen, 52066 Aachen, DE;
Merz, Ina, 73431 Aalen, DE;
Geiger, Georg, 71032 Böblingen, DE;
Storr, Markus, 70771 Leinfelden-Echterdingen, DE;
Deppisch, Reinhold, 72379 Hechingen, DE;
Beck, Werner, 72108 Rottenburg, DE
Vertreter Dr. Weber, Dipl.-Phys. Seiffert, Dr. Lieke, 65183 Wiesbaden
DE-Anmeldedatum 18.06.2004
DE-Aktenzeichen 102004029573
Offenlegungstag 29.12.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse B01J 20/30
IPC-Nebenklasse A61M 1/36   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Apheresematerial bzw. Adsorbent sowie ein Verfahren für die Entfernung, Abreicherung oder Inaktivierung von MIF (Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor) aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines solchen Apheresematerials bzw. Adsorbents. Um ein neues Mittel und ein neues Verfahren bereitzustellen, die geeignet sind, die Aktivität oder Menge des Mediators für Sepsis und septischen Schock, MIF, in einer Körperflüssigkeit eines Patienten auf eine für einen Patienten schonendere und verträglichere Weise zu verringern, als dies aus dem Stand der Technik bekannt ist, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß das Apheresematerial bzw. Adsorbent ein festes Trägermaterial umfasst und wobei auf der Oberfläche des festen Trägermaterials MIF-bindende Moleküle oder funktionale Gruppen immobilisiert sind. Hinsichtlich des Verfahrens wird vorgeschlagen, daß man das Apheresematerial bzw. Adsorbent mit dem Blut, Blutplasma, Blutserum oder den anderen Körperflüssigkeiten eines Patienten extrakorporal in Kontakt bringt.

Beschreibung[de]
GEGENSTAND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Apheresematerial bzw. Adsorbent sowie ein Verfahren für die Entfernung, Abreicherung oder Inaktivierung von MIF (Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor, macrophage migration inhibitory factor) aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten, insbesondere aus solchen Körperflüssigkeiten eines Patienten mit Sepsis oder septischem Schock. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines solchen Apheresematerials bzw. Adsorbents zur Entfernung, Abreicherung oder Inaktivierung von MIF aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG Zytokine

Zytokine sind von verschiedenen Zellen gebildete Proteine, die das Verhalten anderer Zellen beeinflussen. Viele Zytokine üben ihre Wirkung meist über spezifische Rezeptoren auf ihre Zielzellen aus, wodurch häufig Wachstum, Differenzierung oder der Tod der Zelle ausgelöst wird.

Zytokine spielen vor allem bei der Entzündungsreaktion und deren Regulation eine wichtige Rolle, wobei sie zusammen mit anderen Entzündungsmediatoren Auswirkungen auf die Blutgefäße haben. Durch sie findet eine Erweiterung und eine erhöhte Durchlässigkeit der Blutgefäße statt, was zu einem erhöhten Blutfluss und zu einem Austreten von Flüssigkeit im Bereich des Infektionsherdes führt.

Eine weitere Funktion der Zytokine bei einer Entzündungsreaktion ist die Erhöhung der Expression von Adhäsionsmolekülen des Gefäßwandendothels, wodurch Immunzellen rekrutiert werden und zum Infektionsherd wandern können. Gleichzeitig bewirken Zytokine die Aktivierung der Immunzellen. Somit sind Zytokine vor allem Mediatoren des Immunsystems, die verschiedene Funktionen erfüllen und dadurch Entzündungsreaktionen regulieren.

Ein Zytokin kann von verschiedenen Zelltypen gebildet werden und auch auf verschiedene Zelltypen einwirken. Meist werden Zytokine als Antwort auf inflammatorische oder antigene Stimuli synthetisiert und wirken in den häufigsten Fällen lokal (autokrin oder parakrin). Manche Zytokine wirken auch endokrin, ähnlich wie Hormone. Im Unterschied zu den Hormonen werden sie jedoch von verschiedenen Zelltypen produziert.

Zytokine sind Polypeptide oder Glykoproteine mit einem Molekulargewicht ≤ 30 kDa und können anhand ihrer Struktur in verschiedene Unterfamilien klassifiziert werden, wie zum Beispiel die Hämatopoetine, die Interferone und die TNF-Familie.

Da Zytokine für die Regulation von Immunreaktionen eine wichtige Rolle spielen, sind sie auch häufig an Krankheiten beteiligt, wie zum Beispiel septischem Schock und Sepsis, Autoimmunerkrankungen und rheumatoider Arthritis. Sie sind die Mediatoren bei Entzündungsreaktionen und auch bei einer Sepsis. Sie werden z.B. als Reaktion auf einen eingedrungenen Mikroorganismus gebildet und lösen die Entzündungsreaktion durch Bildung von weiteren Mediatoren, freien Radikalen, Eikosanoiden usw. aus. Durch diese Reaktionskaskade wird das Immunsystem aktiviert. Vor allem TNF, IL-1 und MIF spielen als Zytokine eine wichtige Rolle bei der Sepsis. Es wird vermutet, dass MIF einen Hauptmediator der Sepsis darstellt, da Therapieansätze, wie die Gabe von Anti-TNF-Antikörpern oder Antagonisten des IL-1-Rezeptors, keine positiven Ergebnisse bei Sepsiserkrankten lieferten.

Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor (MIF)

Das Zytokin Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor (Macrophage migration inhibitory factor, MIF) wurde 1966 von Bloom & Bennett und David unabhängig voneinander entdeckt und als T-Zellprodukt beschrieben, das die Migration von Makrophagen inhibiert. Später konnten weitere Eigenschaften und Wirkungen für MIF festgestellt werden, wie z.B. die Stimulation der Aktivität von Makrophagen und die Steuerung der Immunantwort, welche weit über die Funktion eines T-Zell-Zytokins hinausreicht.

Die Klonierung von humanem MIF (huMIF) gelang erstmals 1989 und öffnete damit neue Möglichkeiten zur Charakterisierung dieses Zytokins. Aber erst nach der Herstellung des rekombinanten humanen MIF (rhuMIF) konnte auch die migrationshemmende Wirkung auf Makrophagen und die Induktion der TNF-Sekretion eindeutig nachgewiesen werden.

MIF ist ein ubiquitäres Protein, welches in fast allen Zellen gefunden wird. Es ist ein Regulator des angeborenen Immunsystems und der Immunantwort und wird unter verschiedensten Bedingungen freigesetzt. Bei der Regulation anderer Zytokine spielt es ebenso eine Rolle, wie bei der Expression von Rezeptoren (z. B. TLR-4), welche in das angeborene Immunsystem involviert sind. Weitere Funktionen sind die Inhibition von p53 und die Aktivierung von Bestandteilen der mitogen-aktivierten Protein-Kinase (MAP-Kinase) und von Jun-activation domain-binding protein-1 (JAB-1) Stoffwechselwegen.

MIF besitzt eine zentrale Funktion in der inflammatorischen Kaskade, wird aber auch von Zellen außerhalb des Immunsystems gebildet, wie z.B. von Zellen des Endokrinen und des Nervensystems. Außerdem wird es von Zellen gebildet, welche mit geringen Dosen an Glucocorticoiden stimuliert wurden. Üblicherweise inhibieren Glucocorticoide die Expression von Zytokinen. Offenbar wirken MIF und Glucocorticoide gegenseitig als Antagonisten und regulieren so die Immunantwort. MIF ist dabei für die Aktivierung der Immunsysteme verantwortlich und erhöht unter anderem die Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen wie TNF, IL-1, IL-6 und IL-8 ebenso wie die Proliferation von T-Zellen.

In den letzten Jahren wurde MIF mit vielen inflammatorischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wie z.B. Arthritis, Sepsis, Anämie, Encephalomyelitis, Tumorwachstum usw.. Deshalb wurde MIF immer häufiger als ein interessanter Therapieansatz bei inflammatorischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen angesehen. Seine katalytische Aktivität bietet dabei einen wichtigen Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer MIF-Inhibitoren. Es wird vermutet, dass die biologische Aktivität von MIF auf seinen enzymatischen Reaktionen beruht, jedoch ist der Zusammenhang zwischen den enzymatischen und den biologischen Aktivitäten von MIF noch nicht aufgeklärt.

Struktur von MIF

Das huMIF-Gen, ein relativ kleines Gen (<1000 bp), besteht aus drei Exons, die durch zwei kleine Introns (100-200 bp) voneinander getrennt sind. Bisher konnte ein mRNA-Transkript von 600 bp aus verschiedenen Geweben isoliert werden. Zu den Konsensussequenzen, die möglicherweise an der Transkriptionsregulation des MIF-Gens beteiligt sind, gehören unter anderem eine Cytokin-1 (CK-1) Stelle und eine Nuklear Faktor-&kgr;B (NF-&kgr;B) Stelle, möglicherweise auch ein negative glucocorticoid responsive element (nGRE), welches im Mausgen gefunden, bisher aber im humanen MIF (huMIF) noch nicht nachgewiesen wurde. Diese Elemente spiegeln sowohl die Zytokinaktivität, als auch Hormon- und Glucocorticoid-antagonistische Funktionen wieder.

Das huMIF-Monomer umfasst 114 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 12,5 kDa. Obwohl potentielle N-Glykosilierungsstellen vorhanden sind, findet keine N-Glykosilierung statt. MIF wird außerdem spezifisch sezerniert, obwohl eine hydrophobe N-terminale Signalsequenz nicht vorhanden ist.

Das huMIF-Monomer besteht aus zwei &agr;-Helices und sechs oder sieben &bgr;-Strängen. Dabei bilden vier &bgr;-Stränge ein zentrales Faltblatt, in dem zwei parallele &bgr;-Faltblätter antiparallel miteinander verknüpft sind.

Aminosäuresequenz von humanem MIF mit Sekundärstrukturelementen. (Pfeile stehen für &bgr;-Faltblattbereiche, Zylinder für &agr;-helikale Bereiche)

Röntgenstrukturanalysen zeigen, dass es sich bei huMIF um ein Homotrimer mit einer Größe von ca. 35×50×50 Å handelt, wobei drei &bgr;-Faltblattbereiche eine Kanalstruktur ausbilden, welche von sechs &agr;-Helices flankiert wird. Diese Struktur ist unter allen Mitgliedern der Zytokinfamilie einzigartig. Allerdings gibt es auch Hinweise auf eine Dimerstruktur von huMIF. Einige Studien weisen darauf hin, dass unter physiologischen Bedingungen ein Gemisch aus Monomeren, Dimeren und Trimeren vorliegt. Welche dabei die biologische aktive Struktur ist, konnte noch nicht geklärt werden.

Wirkung und Funktion von MIF

Die Inhibition der Makrophagenmigration durch MIF wurde bereits sehr früh beschrieben. In den vergangenen Jahren wurden weitere durch MIF verursachte Effekte nachgewiesen. MIF wird nicht nur von Makrophagen, sondern auch von T-Zellen und Hypophysenzellen ausgeschüttet und ist somit ein Zytokin der Makrophagen und T-Zellen, ebenso wie ein Hypophysenhormon. Dabei unterscheiden sich die beiden MIF-Quellen vor allem im Zeitpunkt der MIF-Sekretion und in ihren Dosis-Wirkungskurven.

Eine weitere wichtige Rolle spielt MIF bei der Regulation der Immunantwort im Zusammenspiel mit Glucocorticoiden. Diese sind potente anti-inflammatorische und immunsupressiv wirkende Hormone und unterdrücken normalerweise die Zytokinproduktion. Die MIF-Produktion wird dagegen durch geringe Dosen an Glucocorticoiden stimuliert, und MIF besitzt sogar Glucocorticoid-überschreibende Wirkung und verringert deren Inhibitionswirkung (glucocorticoid overriding activity). Eine effektive Immunantwort nach einer Infektion basiert offensichtlich auf einer genau geregelten Balance zwischen anti-inflammatorischen Glucocorticoiden und proinflammatorischen Zytokinen (MIF).

MIF ist bei verschiedenen Entzündungsreaktionen ein wichtiger Mediator, zum Beispiel beim septischen Schock bzw. der Sepsis, ebenso wie bei Rheumatoider Arthritis, bei der Makrophagen zur Pathogenese der Krankheit beitragen.

Neben den Immunzellen und den Zellen der Hypophyse wird MIF auch von anderen Gewebszellen produziert, wie zum Beispiel in den &bgr;-Zellen des Pankreas. Offensichtlich spielt MIF eine Rolle als autokriner Regulator der Insulinsekretion und könnte am Kohlehydratmetabolismus beteiligt sein.

Die Aufklärung der molekularen Wirkungsmechanismen war bisher nicht möglich, vor allem da bisher kein Membranrezeptor für MIF identifiziert werden konnte. Mittels Röntgenstrukturanalyse konnten Homologien zu zwei bakteriellen Isomerasen festgestellt werden: CHMI (5-Carboxymethyl-2-Hydroxy-muconat-Isomerase) und 4-OT (4-Oxalcrotonat-Tautomerase). Eine Tautomerase-Aktivität konnte für die nicht-physiologischen Substrate D-Dopachrom und p-Hydroxyphenylpyruvat nachgewiesen werden. Diese enzymatischen Bindestellen sind vor allem bei der Entwicklung von MIF-Inhibitoren ins Interesse der Forschung gerückt. Sie sind vor allem interessant bei der Entwicklung neuer Therapieansätze bei inflammatorischen Erkrankungen, wie z.B. Sepsis. MIF scheint auch eine Rolle bei zellulären Redoxprozessen zu spielen.

Sepsis und septischer Schock

Sepsis, septischer Schock und SIRS (systemic inflammatory response syndrome) sind in der Intensivmedizin der westlichen Länder Hauptursache für Todesfälle mit Todesraten zwischen 30 und 70%. In den USA erkranken >500 000 Patienten pro Jahr an Sepsis mit einer ansteigenden Rate von 1,5% pro Jahr.

Problematisch bei der Behandlung von Sepsispatienten ist die genaue Definition der verschiedenen Sepsisstadien. Man unterscheidet dabei: a) SIRS systemic inflammatory response syndrome

Temperatur >38.3°C oder <36°C

erhöhte Herzfrequenz

erhöhte Atmungsrate

erhöhte Anzahl an weißen Blutkörperchen

keine Mikroorganismen im Blut
b) Sepsis systemische Reaktion auf eine Infektion, welche sich durch zwei oder mehr Merkmale der SIRS zeigt (SIRS + mikrobielle Infektion) c) schwere Sepsis Sepsis, welche zu Organstörungen, Hypoperfusion oder zu Hypotonie führen kann d) septischer Schock Sepsis-induzierte Hypotonie e) MODS multiple organ dysfunction syndrome

stark veränderte Organfunktionen

Das Spektrum der Mikroorganismen, welche eine Sepsis auslösen können, hat sich seit den 70er Jahren stark verändert. Zunächst waren vor allem Gram-negative Bakterien für eine Sepsis verantwortlich, jedoch heute treten immer mehr Sepsisfälle durch Gram-positive Bakterien auf. Eine systemische Entzündungsreaktion, eine Sepsis, kann aber auch durch nicht-infektiöse Störungen ausgelöst werden, wie zum Beispiel durch ein Trauma, eine Pankreatitis oder durch abdominale bzw. kardiovaskuläre Chirurgie. Vermutlich wird eine Sepsis durch eine Überreaktion des Immunsystems ausgelöst. Bei einem Eindringen von Mirkoorganismen reagiert das angeborene Immunsystem als erstes, wobei Neutrophile, Makrophagen und natürliche Killerzellen eingesetzt werden. Dabei spielen vor allem Zytokine eine wichtige Rolle als Mediatoren, die die Aktivierung und Differenzierung regulieren. Über sie und andere stimulierende Moleküle aktiviert das angeborene Immunsystem schließlich das adaptive Immunsystem, welches die Fähigkeit hat, ein immunologisches Gedächtnis aufzubauen.

Beim septischen Schock reagiert das angeborene Immunsystem unangemessen stark, wodurch eine systemische Entzündungsreaktion auftreten kann, die schließlich zu Organschädigungen führt.

MIF und Sepsis 1 septischer Schock

Pro-inflammatorische Zytokine, wie zum Beispiel TNF, IL-1 und MIF spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer Sepsis. Es sind Mediatoren, welche die Entzündungsreaktion aktivieren und die Expression weiterer Mediatoren bzw. die Proliferation inflammatorischer Zellen anregen. Sie wirken gegenüber Glucocorticoiden, welche die Entzündungsreaktion hemmen, antagonistisch und verstärken somit die Entzündungsreaktion. Aus diesem Grund erscheint die Inhibition dieser pro-inflammatorischer Zytokine als Therapieansatz bei inflammatorischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen interessant.

MIF wird als ein Hauptmediator der Sepsis angesehen, da durch MIF die Produktion von TNF, weiteren pro-inflammatorischen Zytokinen und Eikosanoiden angeregt, die Expression von TLR-4, welcher LPS erkennt, induziert und die angeborene Immunantwort aktiviert wird. MIF und Glucocorticoide wirken als Antagonisten und sind für die Regulation der Entzündungsreaktion verantwortlich. MIF hat eine hemmende Wirkung auf Glucocorticoide, die entzündungshemmend wirken.

Vermutete Mechanismen durch MIF bei einer Sepsis. (Entnommen aus Riedemann et al., 2003 (Nature Medicine. 9; 517-524))

Im Falle einer Sepsis ist die MIF-Konzentration im Serum von Patienten deutlich erhöht, wodurch die pro-inflammatorische Reaktion verstärkt wird und sich die Prognose deutlich verschlechtert. Mäuse, denen das MIF-Gen fehlt, zeigten dagegen einen Schutz vor letaler Endotoxämie und bildeten eine Sepsis erst nach Verabreichung von MIF aus.

Therapiestrategien bei Sepsis

Pro-inflammatorische Zytokine sind eine interessante Zielstruktur für Therapiestrategien bei Sepsis, da sie deren Entstehung und Fortlauf auslösen und beeinflussen. Bisherige Therapieansätze gegen TNF und IL-1 scheiterten beim Menschen, trotz Erfolgen im Tierversuch. Dies lässt sich darauf zurückführen, dass Therapeutika (Antikörper gegen das entsprechende Zytokin) im Tierversuch kurz nach der Injektion von LPS, einem Auslöser der bakteriellen Sepsis, verabreicht wurden. Ein Sepsispatient war dagegen im Krankheitsverlauf schon weiter fortgeschritten, bevor eine eindeutige Diagnose gestellt werden konnte und mit der Therapie begonnen wurde. Weitere multifaktoriellen Gründe und Nebenwirkungen waren zudem beteiligt am negativen Ausgang dieser Studien.

MIF wird als ein Hauptmediator der Sepsis angesehen und hat in ersten Tierversuchen vielversprechende Ergebnisse geliefert. Es konnte nachgewiesen werden, dass Mäuse mit defektem oder fehlendem MIF-Gen, eine deutlich höhere Überlebensrate nach LPS-Injektionen aufweisen. Wurde zusätzlich MIF injiziert, erhöhte sich die Sterberate dieser Mäuse. Eine deutliche Verbesserung der Überlebensrate von Mäusen nach einer LPS-Injektion zeigten weitere Versuche mit Anti-MIF-Antikörper. Ähnliche Ergebnisse wurden mit monoklonalen MIF-Antikörpern erzielt, sowie auch in Tierversuchen mit lebenden Bakterien (CLP-Modell).

Verschiedene diskutierte Therapieansätze gegen Sepsis umfassen die Inhibition oder Blockierung von MIF durch Einsatz spezifischer Anti-MIF-Antikörper. Ein anderer Ansatz ist der Einsatz von small molecular weight (SMW)-Inhibitoren, welche z.B. so entwickelt werden, dass sie MIF über die enzymatische Bindestelle inhibieren. Die Blockade der MIF-Sekretion wäre ebenfalls ein Therapieansatz. Denkbar wären auch Strategien, die an der Wechselwirkung von MIF mit seinen derzeit bekannten Bindungsproteinen JAB1/CSN5, CD74/li, MHC II und BNPL ansetzen. Hier könnten Domänen oder Bindungsmotive dieser Bindungspartner als MIF-neutralisierende Agenzien Einsatz finden.

AUFGABE DER ERFINDUNG

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues Mittel und ein neues Verfahren bereitzustellen, die geeignet sind, die Aktivität oder Menge des Mediators für Sepsis und septischen Schock, MIF, in einer Körperflüssigkeit eines Patienten auf eine für einen Patienten schonendere und verträglichere Weise zu verringern als dies aus dem Stand der Technik bekannt ist.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Apheresematerial bzw. Adsorbent für die Entfernung, Abreicherung oder Inaktivierung von MIF (Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor) aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten, welches ein festes Trägermaterial umfasst und wobei auf der Oberfläche des festen Trägermaterials MIF-bindende Moleküle oder funktionale Gruppen immobilisiert sind.

Das erfindungsgemäße Apheresematerial bzw. Adsorbent ist besonders geeignet für die extrakorporale Dialyse von Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten, um eine überhöhte MIF-Konzentration oder -Aktivität darin zu erniedrigen und sie wieder in physiologische Bereiche zu bringen. Hierbei nimmt man an, das Verringerungsfaktoren von etwa 5 bis max. 100-fach erzielt werden müssen. Bei der Apherese wird Blut eines Patienten, z. B. eines Patienten mit Sepsis oder septischem Schock, außerhalb des Körpers entweder als Vollblut oder z. B. nach einer Abtrennung der Blutzellen als Blutplasma über das erfindungsgemäße Apheresematerial bzw. Adsorbent geleitet. Da das erfindungsgemäße Apheresematerial bzw. Adsorbent MIF-bindende Moleküle oder funktionale Gruppen auf der Oberfläche immobilisiert aufweist, bindet MIF an diese Moleküle oder funktionalen Gruppen und wird dem Blut- oder Plasmastrom entzogen oder in eine inaktive Form überführt. Anschließend kann das bezüglich MIF abgereicherte oder inaktivierte Blut oder Plasma, gegebenenfalls nach weiterer Behandlung, dem Patienten wieder zugeführt werden. Aufgrund der verminderten MIF-Konzentration bzw. -Aktivität wird dessen inflammatorische Wirkung im Körper des Patienten abnehmen und sich das Krankheitsbild bessern.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apheresematerials bzw. Adsorbents sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen über einen Abstandshalterrest (Spacer) oder auf das Trägermaterial gepfropfte Polymerketten, mit dem Trägermaterial verbunden.

Es hat sich gezeigt, dass die Bindungsstärke MIF-bindender Moleküle oder funktionaler Gruppen dadurch erheblich verbessert werden konnte, dass diese nicht unmittelbar auf der Oberfläche des Trägermaterials gebunden bzw. immobilisiert sind, sondern über einen Abstandshalterrest (Spacer) oder über auf das Trägermaterial gepfropfte Polymerketten. Es wird angenommen, dass die verbesserte Bindung auf eine geringere sterische Hinderung der MIF-Bindung an die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen aufgrund des Abstandes zur Oberfläche des Trägermaterials zurückzuführen ist. Ein weiterer Vorteil des Abstandshalters kann eine Vervielfältigung der MIF-Bindungsstellen sein, wenn jeweils mehrere MIF-bindende Moleküle oder funktionale Gruppen pro Abstandshalter oder Polymerkette gebunden werden können. Dies lässt sich mit Vorteil verwirklichen, wenn die zur Bindung der immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen auf das Trägermaterial gepfropfte Polymerketten sind. Die Herstellung des Materials basiert auf einer radikalischen Pfropfpolymerisation von Monomeren mit ungesättigten C=C-Doppelbindungen (z.B. Acrylsäurederivaten) und reaktiven Seitengruppen (z. B. Oxirangruppen). Verbindungen, die sowohl ungesättigte C=C-Doppelbindungen als auch Oxiranseitengruppen enthalten, sind dem Fachmann bekannt. Beispiele hierfür sind insbesondere Glycidylmethacrylat, Glycidylacrylat und Vinylglycidylether. Bevorzugt wird Glycidylmethacrylat verwendet. Für die erfindungsgemäße Anwendung geeignete Pfropfgrade liegen im Bereich zwischen 101 und 200 %. Bevorzugt sind Werte zwischen 105 und 120 %.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen unter Inhibitoren der katalytischen und/oder enzymatischen Aktivität von MIF ausgewählt. So ist bekannt, dass S-Hexyl-Glutathion und Hexanthiol eine starke inhibitorische Wirkung auf die Dopachrom-Tautomerase-Aktivität von MIF ausüben (Swope et al., The Journal of Biological Chemistry, 273:14877-14884, 1998). Besonders bevorzugt sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter Mercaptogruppen oder Thiolgruppen enthaltenden Molekülen ausgewählt. Als erfindungsgemäß ganz besonders geeignet haben sich Mercaptopyridin-Reste als immobilisierte MIF-bindende Moleküle oder funktionale Gruppen erwiesen.

Das Apheresematerial bzw. Adsorbent der vorliegenden Erfindung ist zweckmäßigerweise ein poröses Material, vorzugsweise eine Membran, ein Teilchenbett, eine Fasermatte oder Perlen (Beads). Da das erfindungsgemäße Apheresematerial bzw. Adsorbent mit menschlichem oder tierischen Blut, Blutplasma oder anderen Körperflüssigkeiten in Kontakt kommt, welche anschließend in den Patienten zurückgeführt werden sollen, ist das Trägermaterial besonders zweckmäßig ein biokompatibles Polymermaterial. Geeignete biokompatible Trägermaterialien sind Polyethersulfon (PES), Polypropylen (PP), Polysulfon (PSU), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polyacrylnitril (PAN), Polyamid (PA), Polytetrafluorethylen (PTFE), quervernetztes Polystyrol-Polyethylenglycol (PS-PEG), Cyclo-olefincopolymere (COC), Celluloseacetat (CA) oder Gemische oder Copolymere davon oder Gemische oder Copolymere mit hydrophilisierenden Polymeren, wie Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Polyethylenoxid (PEO).

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apheresematerials bzw. Adsorbents sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter Anti-MIF-Antikörpern oder Fragmenten oder Derivaten davon mit wenigstens einer für MIF spezifischen Bindungsstelle ausgewählt. Solche Antikörper, die spezifisch gegen MIF gerichtet sind, wurden bereits hergestellt oder lassen sich vom Fachmann auf dem Gebiet nach bekannten Verfahren und unter Auswahl geeigneter MIF-Epitope herstellen. Geeignet sind monoklonale und polyklonale Anti-MIF-Antikörper, wobei monoklonale Antikörper bevorzugt sind.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apheresematerials bzw. Adsorbents sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter zellulären MIF-Bindungsproteinen ausgewählt. Hier sind dem Fachmann das intrazelluläre Protein JAB1/CSN5, ein transkriptioneller Coaktivator und Zellzyklusregulator, sowie ggf. weitere Untereinheiten des CSN-Signalosomkomplexes bekannt, das Membran- und MHC-assoziierte Protein CD74/Invariant chain (Ii chain) und das Apoptoseregulierende Protein BNPL. Aus diesen MIF-bindenden Proteinen lassen sich lösliche, handhabbare, MIF-bindende Domänen oder Sequenzen ableiten, die bei der Immobilisierung auf dem erfindungsgemäßen Adsorbent mit Vorteil Einsatz finden können.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apheresematerials bzw. Adsorbents sind die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter weiteren Inhibitoren und Substraten der katalytischen und/oder enzymatischen Aktivitäten von MIF ausgewählt. So eignen sich Substrate der Tautomerase/Isomeraseaktivität von MIF wie Dopachrom, Phenylpyruvat oder die Vielzahl der bis dato beschriebenen Inhibitoren dieser katalytischen Aktivität und Derivate dieser Verbindungen. Auch eignen sich Substrate/Co-Substrate der Thiolproteinoxidoreduktaseaktivität von MIF wie Glutathion, Liponsäure, Hydroxyethyldisulfid, Cystein und andere Cystein-haltige Peptide, sowie Insulinpeptidsequenzen.

Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Entfernung, Abreicherung oder Inaktivierung von MIF (Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor) aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten, bei dem man das oben hierin beschriebene Apheresematerial bzw. Adsorbent mit dem Blut, Blutplasma, Blutserum oder den anderen Körperflüssigkeiten eines Patienten extrakorporal in Kontakt bringt. Liegt das erfindungsgemäße Apheresematerial bzw. Adsorbent in der Form von Teilchen oder Perlen (Beads) vor, so wird es geeigneterweise in eine Durchflußkammer bzw. Säule gepackt, die dann von dem Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Patienten extrakorporal durchströmt wird. Vor oder nach der Behandlung, bei der MIF abgereichert wird, kann eine oder können mehrere weitere Behandlungsstufen des Blutes oder der anderen Flüssigkeiten erfolgen. Es können auch mehrere Behandlungen des Blutes oder der anderen Flüssigkeiten in hintereinander angeordneten Einheiten, in denen MIF durch Adsorption abgereichert wird, vorgenommen werden, um eine gewünschte Endkonzentration an MIF zu erreichen, bevor das Blut oder die anderen Körperflüssigkeiten in einen Patienten reinfundiert werden.

BEISPIELE Beispiel 1: Herstellung erfindungsgemäßer Apheresematerialien zur Adsorption von MIF aus Blutplasma 1.1. Herstellung von Mercaptopyridin- bzw. Hexanthiol-Acrylatbeads (ohne Spacer)

2 g Oxiran-Polyacrylatbeads (ToyopearlTM HW70EC Tosoh Biosep, Stuttgart) mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 140 &mgr;m, einer mittleren Porenausschlussgrenze von 800.000 Da und einem mittleren Oxirangehalt von 4,0 mmol/g werden für 24 h bei 40 °C mit 20 ml 0,1 M Mercaptopyridin bzw. 0,1 M Hexanthiol in DMF umgesetzt. Nach Abschluß der Umsetzung und mehrmaligem Waschen mit destilliertem Wasser werden die Beads bei 40 °C im Vakuumtrockenschrank getrocknet.

1.2. Herstellung von thiophilen Acrylatbeads (ohne Spacer)

3 g Toyopearl HW70EC Beads werden in 20 ml 4 M Natriumhydrogensulfidlösung (pH 11) gegeben und 1 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach sorgfältigem Waschen mit destilliertem Wasser reagieren die Beads 1 h mit Divinylsulfon (0,4 M) in 20 ml 0,1 M Carbonat-Puffer (pH 11) bei Raumtemperatur. Die Beads werden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen und dann 45 min in 20 ml einer 2,3 M Mercaptoethanol-Lösung in 0,5 M Natriumcarbonat (pH 11) bei Raumtemperatur gerührt. Schließlich werden die Beads pH-neutral gewaschen und im Vakuumtrockenschrank getrocknet.

1.3. Herstellung von mit Mercaptopyridin bzw. Hexanthiol modifizierten Acrylatbeads mit Polyacrylat-Spacer

5 g Toyopearl HW70EC Beads werden in 20 ml 32%-iger Ammoniaklösung für 24 h bei Raumtemperatur aminiert und anschließend ammoniakfrei gewaschen. Anschließend werden die Beads in 45 ml 0,1 M NaOH und 0,6 g 4,4'-Azobis-(4-cyanopentansäure) resuspendiert. Nach Zugabe von 0,85 g N-Hydroxysuccinimid und 0,85 g 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid wird der Ansatz 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach anschließendem Spülen mit Wasser und 2-Propanol erfolgt die Pfropfpolymerisation des Acrylat-Spacers durch Umsetzung der Beads mit 2,5 g Glycidylmethacrylat in 100 ml 2-Propanol. Die Reaktion erfolgt unter Stickstoffatmosphäre bei 75°C für 6 h bei leichtem Rühren. Nach Waschen mit Propanol und Wasser erfolgt die Anbindung von Mercaptopyridin über die Oxiran Gruppen der gepfropften Polymerseitenketten. Hierzu werden die Beads in 40 ml 2-Propanol vorgelegt und nach Zugabe von Mercaptopyridin (0,1 M) für 24 h bei 40 °C umgesetzt. Anschließend wird mit Propanol und Wasser gewaschen.

Beispiel 2: Adsorption von MIF aus PBS-Puffer

Es wurden die in Beispiel 1 gefertigten Materialien sowie S-Hexyl-Glutathion-Agarose Beads (Fa. Sigma-Aldrich, München) bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, rhuMIF aus PBS-Puffer (pH 7,2) zu binden. Als Kontrolle wurden die Basismaterialien ohne Ligandenmodifizierung eingesetzt. Zur Durchführung der Tests wurden jeweils ca. 1,2 ml Beads in Säulen, die mit einer Fritte ausgestattet waren, vorgelegt. Anschließend wurde mit PBS-Puffer gespült und mit einer rhuMIF-Lösung für 15 min inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Lösung über die Fritte von den Beads getrennt und die rhuMIF-Konzentration mittels Bradford-Test (Fa. Bio-Rad) bestimmt. Die Auswertung erfolgte mithilfe eines BSA-Standards. Die aus den Differenzen der rhuMIF-Konzentrationen vor und nach der Inkubation ermittelten Bindungskapazitäten wurden jeweils auf die eingesetzte Bead-Masse normiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 wiedergegeben.

Beispiel 3: Adsorption von MIF aus Humanplasma

Die in Beispiel 1 gefertigten Materialien wurden in einem Batchverfahren auf ihre Bindungseigenschaft bezüglich rhuMIF aus Humanplasma getestet. Dazu wurden jeweils 1,2 ml Beads mit 500 &mgr;l frischem ACD-antikoaguliertem Humanplasma für 15 min bei Raumtempaeratur inkubiert. Das Humanplasma wurde vor der Inkubation mit 10 &mgr;l/ml rhuMIF versetzt. Im Überstand wurde vor und nach der Inkubation die MIF-Konzentration mittels eines huMIF-Sandwich-ELISA (Fa. R&D Systems, MAB289 und BAF289) gemessen. Die Bindungskapazitäten, die sich aus den MIF-Konzentrationen vor und nach der Inkubation ergeben, sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 1: MIF-Bindungskapazität aus PBS-Puffer in &mgr;g rhuMIF/ml Beads (MIF Eingangskonzentration: 20 &mgr;g/ml)
Tabelle 2: MIF-Bindungskapazität aus PBS-Puffer in &mgr;g rhuMIF/ml Beads (MIF Eingangskonzentration: 50 &mgr;g/ml)
Tabelle 3: MIF-Bindungskapazität aus Humanplasma in &mgr;g rhuMIF/ml Beads (MIF Eingangskonzentration: 10 &mgr;g/ml)

Beispiel 4: Untersuchungen zur Spezifität der MIF-Bindung

Zur Untersuchung der Spezifität der MIF-Bindung wurden die Materialien aus den Bindungstests nach der Inkubation zunächst in unterschiedlichen Medien sorgfältig mit PBS-Puffer gewaschen. Zur Desorption der adsorbierten Proteine wurden die Adsorbentien anschließend 7 min bei 100 °C in SDS-haltigem Beladungspuffer für die SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelektrophorese) gekocht. Der Beladungspuffer hatte die folgende Zusammensetzung: 2,5 ml 0,5 M Tris (pH 6,8), 4 ml 10% SDS, 2 ml Glycerol, 1 ml &bgr;-Mercaptoethanol und 1 ml Bromphenolblau. Anschließend wurde der Überstand mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Zur Darstellung der rhuMIF-Banden wurden die Proteine durch Western-Blot auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, die Membran mit einem Anti-huMIF-Antikörper aus Maus (MAB298 anti-huMIF, R&D Systems) inkubiert. Nach Waschen der Membran wurde diese mit einem mit Meerrettichperoxidase (POD) gekoppelten Anti-Maus-Antikörper inkubiert und der Western-Blot in bekannter Weise gefärbt. Der Western-Blot ist in 1 dargestellt. Die Analyse der adsorbierten Proteine erfolgte durch SDS-PAGE-Trennung des Desorptionsüberstandes und anschließende Silberfärbung. Das Ergebnis ist in 2 dargestellt.


Anspruch[de]
  1. Apheresematerial bzw. Adsorbent für die Entfernung, Abreicherung oder Inaktivierung von MIF (Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor) aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten, welches ein festes Trägermaterial umfasst und wobei auf der Oberfläche des festen Trägermaterials MIF-bindende Moleküle oder funktionale Gruppen immobilisiert sind.
  2. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen über einen Abstandshalterrest (Spacer) oder auf das Trägermaterial gepfropfte Polymerseitenketten mit dem Trägermaterial verbunden sind.
  3. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen über auf das Trägermaterial gepfropfte Polyacrylatseitenketten mit dem Trägermaterial verbunden sind.
  4. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen unter Inhibitoren der katalytischen und/oder enzymatischen Aktivität von MIF ausgewählt sind.
  5. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen unter Substraten oder Cosubstraten der katalytischen und/oder enzymatischen Aktivität von MIF ausgewählt sind.
  6. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter Mercaptogruppen oder Thiolgruppen enthaltenden Molekülen ausgewählt sind.
  7. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder funktionalen Gruppen Mercaptopyridin-Reste sind.
  8. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial ein poröses Material, vorzugsweise eine Membran, ein Teilchenbett, eine Fasermatte oder Perlen (Beads) ist/sind.
  9. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial ein biokompatibles Polymermaterial ist, vorzugsweise Polyethersulfon (PES), Polypropylen (PP), Polysulfon (PSU), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polyacrylnitril (PAN), Polyamid (PA), Polytetrafluorethylen (PTFE), quervernetztes Polystyrol-Polyethylenglycol (PS-PEG), Cycloolefincopolymere (COC), Celluloseacetat (CA) oder Gemische oder Copolymere davon oder Gemische oder Copolymere mit hydrophilisierenden Polymeren, wie Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Polyethylenoxid (PEO).
  10. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter Anti-MIF-Antikörpern oder Fragmenten oder Derivaten davon mit wenigstens einer für MIF spezifischen Bindungsstelle ausgewählt sind.
  11. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen unter zellulären MIF-Bindungsproteinen oder Domänen oder Sequenzmotiven davon mit wenigstens einer für MIF spezifischen Bindungsstelle ausgewählt sind.
  12. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen JAB1/CSN5 oder Domänen oder Sequenzmotive davon mit wenigstens einer für MIF spezifischen Bindungsstelle sind.
  13. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen CD74 oder Domänen oder Sequenzmotive davon mit wenigstens einer für MIF spezifischen Bindungsstelle sind.
  14. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen MHC II-Moleküle oder Domänen oder Sequenzmotive davon mit wenigstens einer für MIF spezifischen Bindungsstelle sind.
  15. Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten MIF-bindenden Moleküle oder MIF-bindenden funktionalen Gruppen BNPL oder Domänen oder Sequenzmotive davon mit wenigstens einer für MIF spezifischen Bindungsstelle sind.
  16. Verfahren zur Entfernung, Abreicherung oder Inaktivierung von MIF (Makrophagenmigrationsinhibierender Faktor) aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten, bei dem man das Apheresematerial bzw. Adsorbent nach einem der Ansprüche 1 bis 15 mit dem Blut, Blutplasma, Blutserum oder den anderen Körperflüssigkeiten eines Patienten extrakorporal in Kontakt bringt.
  17. Verwendung eines Apheresematerials bzw. Adsorbents nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur extrakorporalen Entfernung oder Abreicherung von MIF (Makrophagenmigrationsinhibierender Faktor) aus Blut, Blutplasma, Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Patienten.
Es folgen 2 Blatt Zeichnungen






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