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Dokumentenidentifikation DE69732628T2 29.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000905232
Titel BETA 1-4 N-ACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE SOWIE DAS FÜR DIESE KODIERENDE GEN
Anmelder Kirin Beer K.K., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder OGURI, Suguru, Abashiri-shi, Hokkaido 093-0042, JP;
MINOWA, Mari, Yokohama-shi, Kanagawa 236, JP;
YOSHIDA, Aruto, Yokohama-shi, Kanagawa 236, JP;
TANIGUCHI, Naoyuki, Toyonaka-shi, Osaka 560, JP;
TAKEUCHI, Makoto, Yokohama-shi, Kanagawa 236, JP
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69732628
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.12.1997
EP-Aktenzeichen 979478815
WO-Anmeldetag 10.12.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/JP97/04546
WO-Veröffentlichungsnummer 0098026053
WO-Veröffentlichungsdatum 18.06.1998
EP-Offenlegungsdatum 31.03.1999
EP date of grant 02.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse C12N 9/10
IPC-Nebenklasse C12N 1/21   C12P 21/02   C12P 19/04   C12N 15/54   C12N 5/10   

Beschreibung[de]
TECHNISCHES GEBIET

Die gegenwärtige Erfindung betrifft eine neue N-Acetylglucosaminyltransferase (GlcNAc-Transferase), die eine spezifische Zuckerkettenstruktur in einem Saccharid erkennt und darin eine GlcNAc-&bgr;-1→4-Verzweigungsstruktur einführt.

STAND DER TECHNIK 1. GLYCOPROTEINE

Die meisten Proteine, die in der Natur auftreten, sind nicht einfache Proteine, die nur aus Aminosäuren bestehen, sondern "reife" Proteine mit Zuckerketten und anderen Substanzen, z.B. Phosphaten und Lipiden, die daran angebunden sind. Daher hat die Entwicklung von einfachen proteinartigen Produkten, erzeugt durch Escherichia coli als Wirt verschiedene Probleme mit sich gebracht, da solchen Produkten der Reifungsprozess der Proteine fehlt. Da alle physiologisch aktiven Proteine vom Sekretionstyp (z.B. Cytokine) Glycoproteine sind, mit nur einigen Ausnahmen, haben Funktion und Rolle der Zuckerketten die Aufmerksamkeit als besonders wichtigen Punkt bei der Entwicklung biologischer Pharmazeutika auf sich gezogen.

Zuckerketten in Glycoproteinen werden grob in den Asn-gebundenen Typ, den Mucin-Typ, den O-gebundenen GlcNAc-Typ, den GPI-Ankertyp und den Proteoglycan-Typ klassifiziert [Makoto Takeuchi, "Glycobiology Series 5: Glycotechnology", Kihata, Hakomori und Nagai (Autoren), Kodansha Scientific Co., (1994), 191–208]. Jeder dieser Typen von Zuckerketten hat seinen eigenen Biosyntheseweg und eine diskrete physiologische Funktion. Asn-gebundene Zuckerketten sind weit verbreitet in Schimmelpilzen, Hefen, Insekten, Pflanzen und Tieren. Der zugrundeliegende Biosyntheseweg für Asn-gebundene Zuckerketten ist zwischen den Arten konserviert (1). Eine Zuckerkette(ketten), die für eine spezifische Art charakteristisch ist (sind), wird auf der äußeren Seite (die als die "nicht-reduzierende Endseite" bezeichnet wird) des Kernzuckerkettenbestandteils, die in der Biosynthese von Asn-gebundenen Zuckerketten üblich ist, gebildet. Eine Mannanartige Zuckerkette, worin &agr;-1,3- und &agr;-1,2-verzweigte Mannosereste sich an eine Hauptkette anbinden, die über &agr;-1,6-Bindungen fortgeführt wird, ist eine Zuckerkettenstruktur, die für Pilze, wie z.B. Hefen charakteristisch ist (siehe Panel a in 2) [Hiroshi Nakajima, Sugar Chain Technology, Industry Survey Association (1992), 384–397]. Andererseits wird bei Insekten, Pflanzen und Tieren die Verlängerungen von Mannoseresten nicht beobachtet; stattdessen wird eine hoch Mannose-haltige Zuckerkette gebildet, worin eine Zuckerkette von einem Dolicholintermediat übertragen und nur getrimmt wird (siehe Panel c in 2). Eine einzigartige Struktur mit einer charakteristischen Xylose oder ähnlichem (siehe Panel b in 2) wird ebenfalls bei Insekten, Pflanzen und Mollusken beobachtet. Bei Tieren werden charakteristische Zuckerkettenstrukturen, wie z.B. Zuckerketten mit komplexer Struktur (Panel e in 2) und Zuckerketten mit einer Hybridstruktur (Panel d in 2) beobachtet; bei der letzteren werden GlcNAc-Verzweigungsstrukturen in einer früher getrimmten Zuckerkette gebildet und die Zugabe anderer Arten von Monosaccariden, wie z.B. Galactose und Sialinsäuren bildet komplizierte Strukturen; bei der letzteren liegen sowohl eine Zuckerkette vom komplexen Typ als auch eine Zuckerkette vom hoch Mannose-haltigen Typ vor [Kiyoshi Furukawa, Sugar Chain Technology, Industry Survey Association (1992), 64–75].

Solche Zuckerketten, wie oben beschrieben, werden auf den meisten Zellenoberflächenproteinen und Sekretionsproteinen ausgebildet und man nimmt an, dass sie wichtige Rollen spielen, die die Natur und Eigenschaften der Zellen und Proteine bestimmen. Unter allen wird der Teil einer Zuckerkettenstruktur, der eine Verzweigung bildet, und der sich wie Antennen von der gemeinsamen Kernzuckerkette erstreckt, eine Zuckerkettenverzweigungsstruktur genannt. Man nimmt an, dass diese Struktur die Funktion ausübt, einen Organismuserkennungsliganden (d.h., dem Endbereich der Zuckerkette) einen hohen Grad einer Freiheit zu verleihen, um dadurch Chancen für eine Multipunkterkennung und andere Funktionen bereitzustellen um die Schutzfähigkeit für den Proteinbestandteil durch deutliche Erhöhung des raumeinnehmenden Volumens zu maximieren (Takeuchi et al., supra). Durch Kontrolle der Verzweigungsstruktur von Zuckerketten ist es daher möglich, die physiologischen Funktionen, wie z.B. die in vivo Stabilität, die in vivo Kinetik und die Organ-Zielführungseigenschaften von Glycoproteinen auf verschiedene Weisen zu modifizieren. Im Hinblick hierauf wird angenommen, dass eine Technologie zur Kontrolle der Verzweigungsstrukturen von Zuckerketten eine Biotechnologie der nächsten Generation für die Entwicklung von Glycoprotein-artigen Pharmazeutika ist, die "für den Menschen sanft sind".

2. PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG VON GLYCOPROTEINZUCKERKETTEN

Zuckerketten der Glycoproteine vom Sekretionstyp zeigen exzellente Funktionen in der Biosynthese, der intrazellulären Sortierung, der Maskierung der Antigenizität, der in vivo Stabilität und der Organ-Zielfüllungseigenschaften von Glycoproteinen. Zuckerketten von Zelloberflächenproteinen verändern sich bekanntlich als Reaktion auf Veränderungen bei Zellen (wie z.B. eine Differenzierung, eine Veränderung in einen morbiden Zustand, eine Krebsbildung). Insbesondere wurde berichtet, dass es eine enge Beziehung zwischen der Metastase von Krebs und der Verzweigungsstruktur von Zuckerketten gibt.

(1) Maskierung der Antigenizität

Es wird angenommen, dass Zuckerketten einen hohen Freiheitsgrad im Hinblick auf ihre sterische Struktur aufweisen und sich so frei wie Propeller bewegen. Daher werden Proteinmoleküle, wie z.B. Proteasen und Antikörper gegen Proteine, die keine Affinität für Zuckerketten aufweisen, durch die Zuckerketten abgeschüttelt und können daher nicht Zugang zu dem Proteinbestandteil gewinnen. Selbst wenn es eine Antigenizität in dem Peptidbestandteil nahe der Zuckerkettenbindungsstellen gibt, können im Ergebnis daher Antikörpermoleküle keinen Zugang zu dem Peptidbestandteil gewinnen. So kann eine Antigen-Antikörperreaktion kaum auftreten. Wenn weiter ein Glycoprotein durch einen Macrophagen gefangen wurde und die Abbauprodukte als Antigen präsentiert werden, ist es für die Peptide um die Zuckerkettenbindungsstelle schwierig Zugang zu den Rezeptoren zu gewinnen. Daher tritt eine antigene Stimulierung nur schwierig auf. Tatsächlich wird berichtet, dass wenn Zuckerketten in den zentralen Bereich des antigenen Peptids von Ovalbuminlysozym eingeführt wurden, die Bindung von MHC-Klasse-II-Molekülen an das Antigen deutlich inhibiert ist [Mouritsen, S., Meldal, M., Christiansen-Brams, I., Elsner, H. und Werdelin, O., Eur. J. Immunol., (1994), 24, 1066–1072]. Die Wirkung einer solchen Maskierung der Antigenizität wird größer, wenn das von den Zuckerketten besetzte Volumen größer ist. Daher wird angenommen, dass die Entwicklung einer Verzweigungsstruktur zu der Wirkung einer solchen Maskierung deutlich beiträgt.

(2) In vivo Stabilität

Im Hinblick auf Erythropoietin, wobei es sich um das erste Pharmazeutikum vom Glycoproteintyp handelt, das jemals aus einer transgenen tierischen Zelle als Wirt erzeugt wurde, wurden die Funktionen seiner Zuckerketten intensiv untersucht. Im Ergebnis wurde gezeigt, dass die Zuckerketten von Erythropoietin inhibitorisch gegen seine Bindung an seinen Rezeptor wirken, jedoch einen entscheidenden Beitrag zum Erhalt der aktiven Struktur und der Verbesserung der in vivo Kinetik leisten; insgesamt wurde gezeigt, dass die Zuckerketten für die Expression der pharmakologischen Aktivität von Erythropoietin essentiell sind. [Takeuchi, M. und Kobata, A., Glycobiology 81991), 1, 337–346]. Insbesondere wurde eine enge Korrelation zwischen der Anzahl der Antennen der Zuckerketten und der pharmakologischen Wirkung von Erythropoietin angetroffen und so wurde die Wichtigkeit der Verzweigungsstruktur (einer Verzweigungsstruktur, gebildet durch GlcNAc-Reste, die sich an die Kernzuckerkette anheften), die früher niemals Aufmerksamkeit auf sich gezogen hatte, zum ersten mal deutlich gemacht [Takeuchi, M., Inoue, N., Strickland, T. W., Kobata, M., Wada, M., Shimizu, R., Hoshi, S., Kozutsumi, H., Takasaki S. und Kobata, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989), 86, 819–22] Der Hauptgrund für das obige Phänomen wird wie folgt erklärt: Erythropoietin ohne eine entwickelte Verzweigungsstruktur wird sehr schnell in der Niere entsorgt und im Ergebnis wird die in vivo Aufenthaltszeit eines solchen Erythropoietins kürzer [Misaizu, T., Matsuki, S., Strickland, T. W., Takeuchi, M., Kobata, A. und Takasaki, S., Blood, (1995), 86, 4097–4104].

(3) Organ-Zielführungseigenschaft

Die meisten biologischen Gewebe weisen Lectinähnliche Rezeptoren auf und verwenden sie in Zell-Zell-Wechselwirkungen oder zur Aufnahme von Glycoproteinen aus Blut. Das Asialoprotein-bindende Lectin in der Leber ist ein repräsentatives Beispiel für ein Clearance-System für gealterte Glycoproteine [Toshihiro Kawasaki, Sugar Chain Technology, Industry Survey Association (1992), 125–136]. Zusätzlich sind Selectin, enthalten in den vaslulären Endothelzellen, Thrombocyten und Leucocyten (Kawasaki, supra) und der Lectin-Rezeptor, der auf der Oberfläche von Macrophagen und NK-Zellen vorliegt (Kawasaki, supra) wohl bekannt. Weiterhin ist bekannt, dass sich nicht nur Glycoproteine sondern auch Zellen in spezifischen Geweben unter Verwendung von Zuckerketten als Liganden ansammeln. Fälle eines Heranführens von Knochenmarkzellen [Tatsuo Irimua, "Glycobiology Series 3: Glycobiology in Cell Society", Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori und Akira Kobata (Hrsg.), Kodansha Scientific Co., (1993), 127–175] und des Heranführens von Neutrophilen zu entzündlichen Stellen (Irimura, supra) wurden im Detail untersucht. Wenn man all diese Dinge zusammen betrachtet, kann wohl angenommen werden, dass Glycoproteine und Zellen über ihre Zuckerkettenstrukturen eine zielführende Eigenschaft zu spezifischen Organen oder Geweben, die einen Lectinrezeptor aufweisen, in der Blutzirkulation aufweisen, obwohl ein solches Zielführungssystem nicht in allen Organen angetroffen wird. Dies bedeutet, dass die Arzneimittelzufuhr durch Zuckerketten möglich ist. Bei einer solchen Arzneimittelzufuhr wird die Affinität des Lectins für die Zuckerketten durch den Grad der Freiheit und die Anzahl der Zuckerkettenliganden stark beeinflusst. Daher wird die Verzweigungsstruktur von Zuckerketten ein sehr wichtiger Punkt bei einer solchen Arzneimittelzufuhr sein.

(4) Korrelation zwischen der Veränderung von Zellen zu einem morbiden Zustand und ihrer Zuckerkettenverzweigungsstruktur [Junko Kato, Naoko Suzuki, "Sugar Chain Technology and Development for Pharmaceutical", Foundation for the Relief and Study of Injury Caused by Pharmaceutical Side Effect (Hrsg.), Yakugyo-Jiho-Sha, (1994), 107–13214].

Es wurde früher ein Pflanzenlectin, das als L-PHA bezeichnet wurde, als Sonde zum Nachweis einer sich vielfach verzweigenden Zuckerkettenstruktur entwickelt und es wurde dadurch möglich, verschiedene Proben von kranken Geweben zu überprüfen. Im Ergebnis wurde eine Tendenz angetroffen, dass einige Arten von Krebszellen, insbesondere Krebszellen mit einer hohen Metastasefähigkeit gut mit L-PHA angefärbt werden. So wurden die Forscher auf eine Korrelation zwischen der Verzweigungsstruktur von Zuckerketten und der Metastasefähigkeit von Krebszellen aufmerksam. Menschliches Choriongonadotropin (hCG) ist ein Glycoproteinhormon, das Villusgeweben kräftig in einen frühen Zustand einer Schwangerschaft biosynthetisch hergestellt wurde. Da eine deutliche Menge hCG in den Urin abgegeben wird, wird hCG klinische als Indikator für eine Schwangerschaft verwendet. Die Asn-gebundenen Zuckerketten, die im wesentlichen durch die mono- und biantennären Komplextypketten gebildet werden, sind für hCG charakteristisch. Wenn sich Krebs zu einer Malignität von einem Trophoblastom zu einem invasiven Tumor erhöht und von einem invasiven Tumor zu einem Chorionkarcinom wurde berichtet, dass 2,4,2-Typ tri-antennäre Zuckerketten und abnormale biantennäre Zuckerketten (beide werden durch die Wirkung von GnT-IV auf normale biantennäre bzw. mono-antennäre Zuckerketten gebildet) in den Zuckerketten von hCG auftreten [Katsuko Yamashita, Protein, Nucleic Acid and Enzyme (1992), 37, 1880–1888]. Als Grund für dieses Phänomen wird vorgeschlagen, dass die Aktivität von GnT-IV ansteigt, wenn die Malignität des Chorionkarcinoms fortschreitet.

&ggr;-Glutamyltranspeptidase (&ggr;-GTP) ist ein Glycoprotein, das insbesondere im Überfluss in der Leber vorliegt. Da das Serum &ggr;-GTP-Niveau drastisch ansteigt, wenn es eine Lebererkrankung gibt, wird dieses Niveau als klinischer Indikator einer Lebererkrankung verwendet. Weiterhin haben Yamashita et al. [Yamashita, K., Totani, K., Iwaki, Y., Takamisawa, I., Takeishi, N., Higashi, T., Sakamoto, Y. und Kobata, A., J. Biochem., (1989), 05, 728–735] festgestellt, dass die Zuckerkettenstruktur von &ggr;-GTP als Ergebnis einer Krebsbildung von Zellen sich abnormal in ihrer Verzweigungsstruktur ähnlich wie diejenige bei abnormalem hCG verändert; so haben sie über eine Korrelation zwischen einer Krebsbildung und der Aktivierung von GnT-IV berichtet. Die Asn-gebundenen Zuckerketten von &ggr;-GTP, abgeleitet von gesunden menschlichen Leberzellen, bestehen im wesentlichen aus einer Zuckerkette vom biantennären Komplextyp mit geringen Mengen tri-antennärer und tetra-antennärer Zuckerketten die damit vermischt sind. Demgegenüber wurde ein deutlicher Anstieg im Grad der Verzweigung bei den Asn-gebundenen Zuckerketten von &ggr;-GTP, abgeleitet von menschlichen Hepatomzellen beobachtet. Gleichzeitig traten, wenn auch in geringen Mengen, Zuckerketten vom hoch Mannose-haltigen Typ und Zuckerketten mit abnormal biantennären Zuckerketten auf (die beide bei &ggr;-GTP aus normalen Zellen nicht beobachtet wurden). Als Grund für diese Veränderungen in der Zuckerkettenstruktur wurde die Möglichkeit vorgeschlagen, dass N-Acetylglucosaminyltransferase IV (GnT-IV) und V (GnT-V) in bezug auf die Krebsbildung von Leberzellen aktiviert werden (Yamashita et al., supra).

Es wird auch berichtet, dass die Zuckerkettenverzweigungsstruktur eines Glycoproteins in Zellen deutlich durch eine virale Infektion verändert wird (Yamashita et al., supra). BHK-Zellen weisen eine Zuckerkettenstruktur mit einer Verzweigung bis zum tetraantennären Typ auf. Wenn BHK-Zellen mit einem Polyomavirus transformiert werden, nehmen die Zuckerketten vom biantennären Typ in den von den Zellen erzeugten Glycoprotein-Zuckerketten ab, während die Zuckerketten vom tetraantennären Typ und die N-Acetyllactosamin-Wiederholungsstrukturen ansteigen. Insgesamt wird ein deutlich Anstieg der Zahl von Verzweigungen erkannt [Takasaki, S., Ikehira, H. und Kobata, A., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1980), 90, (3), 735–742]. Als Grund für diese obige Veränderung kann eine Aktivierung von GnT-IV, GnT-V und i-GnT in betracht gezogen werden.

3. ENZYME, DIE DIE ZUCKERKETTENVERZWEIGUNGSSTRUKTUREN VON GLYCOPROTEINEN BETREFFEN

Die Zuckerkette vom komplexen Typ, wobei es sich um eine Glycoprotein-Zuckerkettenstruktur handelt, die für Tiere charakteristisch ist, weist eine komplizierte Verzweigungsstruktur auf, worin sich N-Acetylglucosamin (GlcNAc)-Reste an die gemeinsame Kernstruktur auf verschiedene Weisen anbinden (Kiyoshi Furukawa, supra) (1). Da diese Verzweigungsstruktur in enger Beziehung mit der in vivo und in vito Stabilität, der Lokalisierung, der biologischen Aktivität und der pharmakologischen Eigenschaft der Glycoproteine steht (Makoto Takeuchi, supra), wurde der Biosyntheseprozess der Verzweigungsstruktur im Detail untersucht. Durch Verwendung von erfinderischen Substraten haben H. Schachter et al. die verschiedenen Enzymaktivitäten im Hennen-Oviduct unterschieden um dadurch die Gegenwart von GlcNAc-verzweigungsbildenden Enzymen von GnT-I bis GnT-VI vorherzusagen (Gruppe der GlcNAc-Gylcosyltransferasen; 3) [Glesson, P. A. und Schachter, H., J. Biol. Chem., (1983), 258, 6162–6173]. Danach wurden GnT-I [Kumar, R., Yang, J., Larsen, R. D. und Stanley, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1990), 87, 9948–9952; Sarkar, M., Hull, E., Nishikawa, Y., Simpson, R. J., Moritz, R. L., Dunn, R. und Schachter, H., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1991), 88, 234–238], GnT-II [D'Agostaro, GA., Zingoni, A., Moritz, RL., Simpson, RJ:, Schachter, H. und Bendiak, BG., J. Biol. Chem., (1995), 270, 15211–21], GnT-III [Nishikawa, A., Ihara, Y., Hatakeyama, M., Kangawa, K. und Taniguchi, N., J. Biol. Chem., (1992), 267, 18199–18204] und GnT-V [Shorebah, M. G., Hindsgaul, O. und Pierce, M., J. Biol. Chem., (1992), 267, 2920–2927; Gu, J., Nishikawa, A., Turuoka, N., Ono, M., Yamaguchi, N., Kangawa, K. und Taniguchi, N., J. Biochem., (1993), 113, 614–619] aufeinanderfolgend gereinigt und die Gene hierfür wurden kloniert. Mit diesen bekannten GlcNAc-Transferasen allein ist es jedoch unmöglich die Hauptzuckerkette zu bilden (tetraantennärer Typ; siehe unten stehende Formel) die in einem &agr; 1-Säureglycoprotein angetroffen wird, das als repräsentatives menschliches Blutglycoprotein bekannte ist [Yoshima, K., Tsuji, T., Irimura, T. und Osawa, T., J. Biol. Chem., (1984), 256, 10834–10840] und Erythropoietin [Takeuchi, M., Takasaki, S., Shimada, M. und Kobata, A., J. Biol. Chem., (1990), 265, 12127–12130]. Daher wurde nach einer N-Acetylglucosaminyltransferase mit einer solchen Substratspezifität und Reaktionsspezifität, die bei GnT-IV erwartet werden, als fehlendes Bindeglied gesucht.

Zuckerkettenstruktur vom Tetraantennen-Typ

Zusätzlich zu den oben erwähnten wurden die folgenden N-Acetylglucosaminyltransferasen gereinigt oder ihre Gene kloniert: eine Transferase, die auf Zuckerketten vom Mucin-Typ wirkt [Bierhuizen, M. F., Maemura, K. und Fukuda, M., J. Biol. Chem., (1994), 269, 44473–4479], eine Transferase, die auf Glycolipide wirkt und eine Transferase, die das Zuckerkettenepitop bildet, das als I-i-Antigenstruktur bekannt ist [Kawashima, H., Yamamoto, K., Osawa, T. und Irimura, T., J. Biol. Chem., (1993), 268, 27118–27126; Bierhuizen, M. F., Mattei, M. G. und Fukuda, M., Genes Dev., (1993), 7, 468–478]. Die Substratspezifität der Transferasen und ihre Bindungsweise der GlcNAc-Gruppe, übertragen durch diese Transferasen, unterscheiden sich jedoch von denjenigen von GnT-IV. Keiner dieser Transferasen ergab Produkte, die den GnT-IV-Produkten ähnelten.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Enzym mit einer &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase (hiernach bezeichnet als "GnT-IV") -Aktivität bereitzustellen; ein Gen, das dieses Enzym kodiert; eine rekombinante DNA, umfassend das Gen; eine Zelle, die die rekombinante DNA enthält; ein Verfahren zur Erzeugung eines Enzymproteins mit einer GnT-IV-Aktivität, umfassend das Kultivieren der Zellen in einem Medium; und ein Saccharid, worin die Zuckerketten durch GnT-IV modifiziert werden.

Um die obigen Aufgaben zu lösen, haben die gegenwärtigen Erfinder intensive und ausgedehnte Forschungen durchgeführt. Im Ergebnis haben die Erfinder ein GnT-IV-Enzymprotein aus dem Dünndarm von Rindern isoliert und gereinigt und die biochemischen Eigenschaften des Proteins gekennzeichnet. Dann waren die Erfinder erfolgreich bei der Klonierung eines Gens von einer cDNA-Bibliothek, das bovines GnT-IVa kodiert und der mRNA des Dünndarms, basierend auf einer Teil-Aminosäuresequenz des oben Enzymproteins. Weiterhin, basierend auf einem bovinen GnT-IVa-Gen waren die Erfinder erfolgreich bei der Klonierung von zwei Genen, die für menschliches GnT-IVa und menschliches GnT-IVb kodieren, aus cDNA-Bibliotheken und mRNAs von menschlicher Leber bzw. menschlicher Lunge. Die gegenwärtige Erfindung wurde durch die Bestätigung vervollständigt, dass die Produkte dieser Gene eine GnT-IV-Aktivität ausüben.

Die erste Erfindung der gegenwärtigen Anmeldung betrifft ein GnT-IV mit einer Aktivität zur Erzeugung eines Saccharids mit einer Teilstruktur, dargestellt durch die Formel unten:

unter Verwendung von UDP-GlcNAc als Zuckerdonor und einem Saccharid mit einer Teilstruktur, dargestellt durch die unten stehende Formel als Zuckerrezeptor:

Die zweite Erfindung betrifft ein GnT-IV, bestehend aus der Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 18, oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ-ID NO: 18, mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; ein GnT-IV, bestehend aus der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 24, oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 24, mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; und ein GnT-IV, bestehend aus der Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 37, oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ-ID NO: 37, mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten und noch immer einer GnT-IV-Aktivität.

Die dritte Erfindung betrifft ein GnT-IV-Gen, kodierend für ein GnT-IV, bestehend aus der Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 18 oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 18 mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminsäureresten, und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; ein GnT-IV-Gen, kodierend für ein GnT-IV, bestehend aus der Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 24 oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 24 mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminsäureresten, und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; ein GnT-IV-Gen, kodierend für ein GnT-IV, bestehend aus der Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 37 oder der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 37 mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminsäureresten, und noch immer einer GnT-IV-Aktivität; ein GnT-IV-Gen, bestehend aus der Nucleotidsequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 17; ein GnT-IV-Gen, bestehend aus der Nucleotidsequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 23; und ein GnT-IV-Gen, bestehend aus der Nucleotidsequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 36.

Die vierte Erfindung betrifft eine rekombinante DNA, erhältlich durch Insertion von einem der obigen GnT-IV-Gene in eine Vektor-DNA; und ein Chromosomenfragment, umfassend einen Teil oder die Gesamtheit von einem der obigen GnT-IV-Gene.

Die fünfte Erfindung betrifft eine Wirtszelle, die die obige rekombinante DNA trägt, und eine Wirtszelle, in die das obige chromosomale Fragment künstlich eingeführt wird.

Die sechste Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines GnT-IV, umfassend die Kultivierung der obigen Wirtszelle in einem Medium und die Gewinnung von GnT-IV aus der resultierenden Kultur; und ein Verfahren zur Erzeugung von GnT-IV, umfassend die Gewinnung des GnT-IV-Enzyms aus den Sekreten, Körperflüssigkeiten oder einem Homogenat, das von der obigen Wirtszelle abstammt.

Die siebte Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von GnT-IV aus biologischen Proben.

Die achte Erfindung betrifft ein Saccharid, worin die Zuckerkettenstruktur mit GnT-IV modifiziert wird.

Hiernach wird die gegenwärtige Erfindung im Detail beschrieben.

Das GnT-IV-Gen der Erfindung kann wie unten beschrieben isoliert werden.

ISOLIERUNG VON BOVINEM GnT-IVa-GEN

Zunächst wird eine Mikrosomenfraktion von einem Dünndarm von Rindern, löslich gemacht mit einem Detergens, einer Reihe von Reinigungsverfahren unter Verwendung einer Anionenaustauschchromatographie, Kupferchelatchromatographie, Zweischritt-Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Substratanalogs und Gelfiltration unterzogen, um dadurch eine gereinigte Probe des GnT-IV-Enzyms zu erhalten. Die resultierende gereinigte Probe wird einer SDS-PAGE unterzogen und dann auf eine PVDF-Membran übertragen. Das übertragene Protein, so wie es ist oder nach einer Restriktionshydrolyse, wird mit einem Gasphasen-Aminosäuresequenzierer analysiert, um eine Teil-Aminosäuresequenz für das GnT-IV-Enzym zu erhalten.

Darauffolgend wird eine RT-PCR an der RNA, extrahiert aus den Tierzellen, (d.h., Dünndarm von Rindern) durchgeführt als Matrize unter Verwendung von Primern, die basierend auf den oben bestimmten Teil-Aminosäuresequenzen entworfen wurden. Weiterhin wird unter Verwendung eines Fragments, erhalten durch RT-PCR als Sonde, das GnT-IV-Gen von Interesse aus einer cDNA-Bibliothek von dem oben erwähnten Gewebe durch Plaquehybridisierung einem Screening unterzogen. Ein cDNA-Fragment, enthalten in dem resultierenden positiven Plaque wird ausgeschnitten und in einen Vektor, wie z.B. pUC19 subkloniert, gefolgt von einer Analyse der Nucleotidsequenz.

Wenn die gesamte Länge des Gens, kodierend für das Protein von Interesse nicht in dem Fragment enthalten ist, wird die Plaquehybridisierung wiederum unter Verwendung eines Teils des subklonierten cDNA-Fragments als Sonde durchgeführt. Alternativ werden Endbereiche der cDNA von Interesse durch RACE oder ähnliches, basierend auf Information aus der oben erhaltenen Nucleotidsequenz, erhalten. Das so erhaltene GnT-IV-Gen (das hiernach GnT-IVa genannt wird) wird einer Analyse seiner gesamten Nucleotidsequenz unterzogen. Darauffolgend wird die Aminosäuresequenz von dem Gen mit der oben erwähnten Nucleotidsequenz translatiert. Diese Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR: 18 dargestellt.

ISOLIERUNG VON MENSCHLICHEN GnT-IVa- UND GnT-IVb-GENEN

Menschliche GnT-IVa- und GnT-IVb-Gene können durch Durchführung einer RT-PCR unter Verwendung von RNA erhalten werden, die aus einem menschlichen Gewebe extrahiert wurde (Leber oder Lunge) und basierend auf der Information über die Nucleotidsequenz von dem oben erhaltenen bovinen GnT-IVa-Gen, gefolgt von einem Screening einer cDNA-Bibliothek von dem obigen Gewebe. Die resultierenden menschlichen GnT-IVa- und GnT-IVb-Gene werden einer Analyse ihrer gesamten Nucleotidsequenzen unterzogen. Darauffolgend werden die Aminosäuresequenzen durch diese Gene translatiert. Diese Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NOS: 24 und 37 dargestellt.

Um eine DNA zu erhalten, kodierend für die in SEQ ID NO: 18, 24 oder 37 dargestellte Aminosäuresequenz mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten kann eine Anzahl von Verfahren verwendet werden. Z.B. ein Verfahren zur Behandlung einer DNA mit einem Mutagen, um eine Punktmutation oder eine Deletionsmutation zu induzieren; ein Verfahren, umfassend das selektive Spalten von DNA, die Entfernung oder Zugabe eines selektierten Nucleotids und dann die Ligation der DNA; eine ortspezifische Mutagenese; und ähnliches können aufgezählt werden.

Das GnT-IV-Protein der Erfindung kann durch Herstellung eines rekombinanten Vektors erzeugt werden, worin eine DNA, kodierend für das GnT-IV der Erfindung, erhalten durch das oben beschriebene Verfahren stromabwärts eines Promotors inseriert wird, Einführung des Vektors in eine Wirtszelle und Kultivieren der resultierenden Zelle. Die für diesen Zweck verwendete Vektor-DNA kann entweder eine Plasmid-DNA oder eine Bakteriophagen-DNA sein. Z.B. kann ein pSVL-Vektor (Pharmacia, Schweden), wie in dem später beschriebenen Beispiel dargestellt, verwendet werden. Als Wirtszelle, worin die resultierende rekombinante DNA eingeführt wird, kann jede Zelle, die konventionell bei rekombinanten DNA-Verfahren verwendet wird, verwendet werden, z.B. eine prokaryontische Zelle, eine tierische Zelle, eine Hefe, ein Pilz, ein Insektenzelle. Spezifische Beispiele beinhalten Escherichia coli als prokaryontische Zelle und CHO-Zellen vom chinesischen Hamster oder COS-Zellen von Affen als tierische Zellen.

Die Transformation der oben beschriebenen Wirtszelle wird durch konventionelle Verfahren für jeden Wirt durchgeführt. Wenn der Wirt z.B. E. coli ist, wird ein Vektor, umfassend die rekombinante DNA durch das Wärme-Schock-Verfahren oder Elektroporation in kompetente Zellen eingeführt, hergestellt durch das Calciumverfahren oder ähnliches. Wenn der Wirt eine Hefe ist, wird ein Vektor, umfassend die rekombinante DNA, durch das Hitze-Schock-Verfahren oder Elektroporation in kompetente Zellen eingeführt, hergestellt durch das Lithiumverfahren oder ähnliches. Wenn der Wirt eine tierische Zelle ist, wird ein Vektor, umfassend die rekombinante DNA in die Zelle in der Wachstumsphase oder ähnlichem durch das Calciumphosphatverfahren, eine Lipofektion oder Elektroporation eingeführt.

Durch Kultivierung des so erhaltenen Transformanten in einem Medium, wird das GnT-IV-Protein erzeugt.

Bei der Kultivierung eines Transformanten kann jedes Medium verwendet werden, solange der Wirt darin lebensfähig ist. Z.B. kann ein LB-Medium oder ähnliches verwendet werden, wenn der Wirt E. coli ist. Wenn der Wirt eine Hefe ist, kann ein YPD-Medium oder ähnliches verwendet werden. Wenn der Wirt ein tierische Zelle ist, kann ein Dulbecco's-Medium, supplementiert mit einem tierischen Serum oder ähnlichem verwendet werden. Die Kultivierung wird unter den Bedingungen durchgeführt, die konventionell für den Wirt verwendet werden. Wenn der Wirt z.B. E. coli ist, werden die Zellen bei ungefähr 30 bis 37°C für ungefähr 3 bis 24 Stunden mit, falls nötig, Belüftung und/oder Bewegung kultiviert. Wenn der Wirt Hefe ist, werden die Zellen bei ungefähr 25 bis 37°C für ungefähr 12 Stunden bis 2 Wochen mit, falls nötig, Belüftung und/oder Bewegung kultiviert. Wenn der Wirt eine tierische Zelle ist, wird die Kultivierung bei ungefähr 32 bis 37°C unter 5% CO2 und 100% Feuchtigkeit für ungefähr 24 Stunden bis 2 Wochen mit, falls nötig, Änderung der Belüftungsbedingungen und/oder Bewegung durchgeführt.

Nach der Kultivierung werden die kultivierten Mikroorganismen oder Zellen unter Verwendung eines Homogenisators, einer French-Press, einer Beschallung, Lysozym und/oder Einfrier-Auftau-Zyklen aufgebrochen, um dadurch das GnT-IV-Protein aus den Mikroorganismen oder Zellen zu eluieren. Dann kann das Protein aus den löslichen Fraktionen erhalten werden. Wenn das Protein von Interesse in den unlöslichen Fraktionen enthalten ist, werden die unlöslichen Fraktionen durch Zentrifugation nach Aufbrechen der Mikroorganismen oder Zellen gesammelt. Dann kann das Protein mit einem Puffer, enthaltend Guanidinhydrochlorid oder ähnliches für die Gewinnung löslich gemacht werden. Alternativ können die kultivierten Mikroorganismen oder Zellen direkt mit einem Puffer aufgebrochen werden, enthaltend ein Proteindenaturierungsmittel, wie z.B. Guanidinhydrochlorid um dadurch das Protein von Interesse außerhalb des Mikroorganismus oder der Zellen zu eluieren.

Die Reinigung des GnT-IV-Proteins aus dem obigen Überstand kann durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren durchgeführt werden. Alternativ kann diese Reinigung durch die geeignete Kombination konventioneller Abtrenn-/Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Diese konventionellen Abtrenn-/Reinigungsverfahren beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf eine Zentrifugation, ein Aussalzen, eine Lösungsmittelpräzipitation, eine Dialyse, eine Ultrafiltration, eine Trennchromatographie, eine Gelfiltration, eine Kapillarelektrophorese, eine DC, eine Ionenaustauschchromatographie, eine Metallchelatchromatographie, eine Affinitätschromatographie, eine Umkehrphasenchromatographie und ein isoelektrisches Fokussieren.

Die biochemischen Eigenschaften des aus dem Dünndarm von Rindern erhaltenen GnT-IV-Enzymproteins werden, wie oben beschrieben, wie folgt dargestellt.

(1) WIRKUNG

Dieses Enzymprotein erzeugt ein Saccharid mit einer Teilstruktur, dargestellt durch die Formel unten:

unter Verwendung von UDP-GlcNAc als Zuckerdonor und einem Saccharid mit einer Teilstruktur, dargestellt durch die Formel unten als Zuckerrezeptor:

Das Saccharid als Zuckerrezeptor bedeutet ein Oligosaccharid, Polysaccharid, Glycokonjugat (Glycopeptid, Glycoprotein, Glycolipid oder Proteoglycan) oder ein Derivat davon.

(2) SUBSTRATSPEZIFITÄT

Wenn der Zuckerrezeptor ein Oligosaccharid ist (für die Strukturen der Oligosaccharide, siehe 4) zeigt das Enzymprotein Reaktivitäten von 0% zu Kerntyp-Oligosacchariden, 54% zu GnT-I-Produkttyp-Oligosacchariden und 164% zu GnT-V-Produkttyp-Oligosacchariden, wobei die Reaktivität des Enzymproteins zu GnT-II-Produkttyp-Oligosacchariden als 100% angesetzt wird.

Das Enzymprotein zeigt eine Reaktivität von 46% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp-Oligosacchariden, worin Fucose über &agr;1→6-Bindungen an das GlcNAc am reduzierenden Ende angebunden ist.

Das Enzymprotein zeigt eine Reaktivität von 0% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp-Oligosacchariden, worin das GlcNAc an der &agr;1→3-Mannose fehlt.

Das Enzymprotein zeigt eine Reaktivität von 16% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp-Oligosacchariden, worin die Galactose über eine &bgr;1→4-Bindung an das GlcNAc an einer &agr;1→6-Mannose gebunden ist und eine Reaktivität von 0% zu einer Struktur von GnT-II-produktartigen Oligosacchariden, worin die Galactose über eine &bgr;1→4-Bindung an das GlcNAc der &agr;1→3-Mannose gebunden ist.

Das Enzymprotein zeigt eine Reaktivität von 0% zu einer Struktur von GnT-II-produktartigen Oligosacchariden, worin GlcNAc über eine &bgr;1→4-Bindung an die &bgr;1→4-Mannose gebunden ist.

(3) MOLEKULARGEWICHT

Ungefähr 66 K, wie bestimmt durch SDS-PAGE (unter nicht-reduzierenden Bedingungen). Ungefähr 60 K nach Behandlung mit dem Peptid N-Glycosidase F. Da eine Shift einer Bande beobachtet wird, wenn die Peptid N-Glycanase verwendet wird, nimmt man an, dass das Enzymprotein ein Glycoprotein ist.

Das anscheinende Molekulargewicht wurde bestimmt durch Filtration mit einem Gel, enthaltend Triton X-100, und beträgt 77 K. So wird angenommen, dass GnT-IV keine Untereinheitstruktur aufweist und als Monomer wirkt.

Der Proteinbestandteil dieses Enzyms, abgeleitet von einer Nucleotidsequenz, besteht aus 535 Aminosäureresten und hat ein Molekulargewicht von 61.614.

(4) OPTIMALER pH

Das pH-Optimum für die Reaktion liegt bei ungefähr 5,5. Mehr als 50% der maximalen Aktivität werden im Bereich von 6,5 bis 8,0 beobachtet.

(5) INHIBITION, AKTIVIERUNG UND STABILISIERUNG (i) INHIBITION

Die Aktivität dieses Enzyms wird durch Zugabe von 20 mM EDTA inhibiert.

Dieses Enzym wird durch UDP-Derivate inhibiert.

Die Intensität der Inhibition liegt in folgender Rangfolge: UDP>>UDP-Glc>>UDP-GalNAc>>2'-Deoxy UDP>UDP-Hexanolamin>>UDP-Gal>UTP>UDP-glucuronsäure>UMP.

Uridin, TDP und CDP weisen keine inhibitorische Wirkung auf.

(ii) AKTIVIERUNG

Ein divalentes Kation ist für die Expression der Aktivität essentiell. Unter den divalenten Kationen zeigt Mn2+ die größte Wirkung. Bei einer Konzentration von 7,5 mM liegen die respektiven Wirkungen von CO2+ und Mg2+ bei ungefähr 70% von der von Mn2+ und die Wirkung von Ca2+ beträgt ungefähr 10% derjenigen von Mn2+. Die Wirkung von Mn2+ ist im Bereich von 5 bis 20 mM am größten.

(iii) STABILISIERUNG

Eine stabilisierende Wirkung wird in BSA und Glycerin erkannt.

(6) KINETISCHE PARAMETER

Wenn das Saccharid als Rezeptor ein Oligosaccharid ist (für die Strukturen des Oligosaccharids, siehe 4):

  • (i) Unter Assaybedingungen, unter denen das Enzym in 50 &mgr;l eines 125 mM MOPS-Puffers (pH 7,3), enthaltend 0,8 mM Rezeptorsubstrat, 20 mM UDP-GlcNAc, 7,5 mM MnCl2, 200 mM GlcNAc, 0,5% (G/V) Triton X-100, 10% Glycerin und 1% BSA bei 37°C bis 4 Stunden umgesetzt wird:

    Km- und Vmax-Werte zu GnT-II-produktartigem Oligosaccharid betragen 0,73 mM bzw. 3,23 &mgr;M/min.

    Km- und Vmax-Werte zu einem GnT-V-produktartigen Oligosaccharid betragen 0,13 mM bzw. 1,75 &mgr;M/min.

    Wenn das GnT-II-produktartige Oligosaccharid das Rezeptorsubstrat ist liegt der Km-Wert zu UDP-GlcNAc bei 0,22 mM.
  • (ii) Unter Assaybedingungen, unter denen das Enzym in 125 mM MOPS-Puffer (pH 7,3), enthaltend 120 mM UDP-GlcNAc, 7,5 nM MnCl2, 0,5% (G/V) Triton X-100, 10% Glycerin und 1% BSA bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wird:

    Km- und Vmax-Werte zu dem GnT-II-produktartigen Oligosaccharid betragen 0,59 mM bzw. 0,74 mM/min/mg.

    Km- und Vmax-Werte zu dem GnT-V-produktartigen Oligosaccharid betragen 0,14 mM bzw. 0,47 mM/min/mg.

(7) Gnt-IV-FAMILIE

Die Homologie zwischen bovinem GnT-IVa und menschlichem GnT-IVa beträgt 91% auf dem Nucleinsäureniveau und 96% auf dem Aminosäureniveau.

Die gesamten partiellen Aminosäurestrukturen, enthalten in dem gereinigten GnT-IV aus Rinderdünndarm werden von dem Rinder-GnT-IVa-Gen kodiert.

Menschliches GnT-IVb und menschliches GnT-IVa weisen eine 63%ige Homologie auf dem Nucleinsäureniveau und eine 62%ige Homologie auf dem Aminosäureniveau auf. Sie unterscheiden sich jedoch vollständig in den C-terminalen und N-terminalen Regionen.

Aus den oben beschriebenen biochemischen Eigenschaften wurde das GnT-IV der Erfindung als neues Enzym in der Hinsicht erkannt, dass dieses Enzym in der Lage ist, die folgende Reaktion durchzuführen, die konventionelle Enzyme nicht durchführen können:

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt den Biosyntheseweg von Asn-gebundenen Zuckerketten.

2 zeigt Variationen der Asn-gebundenen Zuckerkette (revidiert von 1 in Makoto Takeuchi, Wako Purechemical Newsletter 64, 18–19, 1996).

  • a. Mannanart: Eine Zuckerkettenstruktur, die für Pilze, wie z.B. Hefen und Schimmelpilze charakteristisch ist.
  • b. Eine Xylo-Art mit hohem Mannosegehalt: Eine Struktur, die charakteristisch für Pflanzen, Mollusken und Insekten ist.
  • c. Eine Art mit hohem Mannosegehalt: Eine Struktur, die üblicherweise in Pflanzen, Insekten und Tieren angetroffen wird.
  • d. Hybridart: Eine Struktur, die üblicherweise bei Insekten und Tieren angetroffen wird.
  • e. Komplexart: Eine Struktur, die für Tiere charakteristisch ist.
  • f. Prokaryontische Zellen: Diese weisen kein System für eine Biosynthese von Asn-gebundenen Zuckerketten auf.

Der Bereich, der durch gepunktete Linien mit einem Kästchen versehen ist, repräsentiert den gemeinsamen Kern der Zuckerkette.

3 zeigt die Positionen des GlcNAc-Transfers durch verschiedene GlcNAc-Transferasen (GlcNAc-Glycosyltransferasen).

4 zeigt die Bezeichnungen und Strukturen von Oligosacchariden.

5 zeigt ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm für GnT-IV-Reaktionsprodukte.

6 zeigt die Ergebnisse der Analyse von GnT-IV durch Q-Sepharose FF-Chromatographie.

7 zeigt die Ergebnisse der Analyse von GnT-IV durch Kupferchelat-Sepharose FF-Chromatographie.

8 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von GnT-IV durch eine UDP-Hexanolaminagarose-Affinitätschromatographie (I).

9 zeigt die Ergebnisse der Analyse von GnT-IV durch eine UDP-Hexanolaminagarose-Affinitätschromatographie (II).

10 zeigt die Ergebnisse der Analyse von GnT-IV durch eine Superdex 200-Gelchromatographie.

11 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse von SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) von gereinigtem GnT-IV dargestellt.

12 zeigt die Ergebnisse der nativen Gelelektrophorese von gereinigtem GnT-IV und dessen Aktivität.

13 zeigt ein Smith-Abbauprofil von GnT-IV-, -V- und -VI-produktartigen Oligosacchariden.

14 zeigt die Ergebnisse von einer 1H-NMR (30°C) des GnT-IV-Reaktionsprodukts.

15 zeigt den optimalen pH für GnT-IV.

16 zeigt die optimale Mn2+-Konzentration für GnT-IV.

17 zeigt die Ergebnisse einer Analyse durch SDS-PAGE und Fluorchromatographie von Glycoproteinen, die die Reaktionsprodukte von GnT-IV sind.

Spuren 1 und 2: 7,6 &mgr;g menschliches Asialo-Agalacto-Transferrin

Spur 3: 7,6 &mgr;g menschliches Asialo-Transferrin

Spuren 4 und 5: 2,8 &mgr;g menschliches Asialoagalacto, von CHO-Zellen abgeleitetes Erythropoietin

Spuren 6 und 7: 1,3 &mgr;g Asialoagalacofetuin

Die Spuren 1, 4 und 6 repräsentieren Scheinexperimente, worin die Reaktion ohne GnT-IV durchgeführt wurde. M bedeutet molekularer Marker (Bio-Rad). PM repräsentiert vorgefärbte molekulare Marker (Bio-Rad, USA).

GnT-IV-Reaktionsbedingungen: Zu 10 &mgr;l einer Lösung, enthaltend 0,702 nmol/Std. GnT-IV, einem Substrat Glycoproteinäquivalent zu 1,6 nmol von Zuckerketten vom Biantennentyp (nur für Fetuin, der Zuckerkettengehalt war 1,6 nmol) und 450 nCi UDP-[14C] GlcNAc, wurde ein entsprechendes Volumen einer Assaymischung (250 mM MOPS-Puffer, pH 7,3, 400 mM GlcNAc, 20% Glycerin, 1,0% (G/V) Triton X-100, 15 mM MnCl2, 1 mM UDP-GlcNAc) zugefügt, um eine Reaktionslösung zu erhalten, die bei 37°C 20 Stunden inkubiert wurde. Ein Zehntel der resultierenden Lösung wurde durch SDS-PAGE und Fluorographie analysiert.

Für SDS-PAGE wurde 10 bis 20% Gradientengel (Daiichi Kagaku) verwendet. Für die Fluorographie wurde Amplify (Amersham) verwendet, um die Proben einem Röntgenfilm für 20 Stunden auszusetzen. Die Sichtbarmachung der Biantennen-Zuckerketten im Glycoprotein wurde unter Verwendung von ConA-HRP und des POD-Immunostain-Kit (Wako Purechemical) nach Tüpfelung auf einer PVDF-Membran durchgeführt.

18 zeigt den offenen Leserahmen von menschlichem GnT-IVa und der Region, enthalten in dem pCore-His-Expressionsvektor.

19 zeigt die Ergebnisse einer isoelektrischen Fokussierung und einer Western-Analyse von Erythropoietin, erzeugt durch individuelle Zellklone. Unter Verwendung von zwei Erythropoietin-erzeugenden Stämmen und denselben Stämmen, in die die Rinder bzw. menschlichen GnT-IVa-Gene eingeführt worden waren, wurde das von jedem Stamm sezernierte Erythropoietin durch isoelektrisches Fokussieren und Western-Blot unter Verwendung von Anti-Erythropoietin-Antikörper analysiert. Auf der linken Seite sind die Positionen der pI-Marker dargestellt.

BESTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG

Hiernach wird die gegenwärtige Erfindung im Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele begrenzt.

[REFERENZBEISPIEL 1] (1) In den Beispielen verwendete Reagenzien

Wenn nicht anders angegeben, waren die verwendeten Reagenzien Produkte vom höchsten Grad, hergestellt von Wako Purechemical Industries, Ltd.

(i) Pyridylaminierte Oligosaccharide

Jedes der verwendeten pyridylaminierten Oligosaccharide wurde wie unten beschrieben erhalten. Zunächst wurden die pyridylaminierten Oligosaccharide aus menschlichem Transferrin (apo-Typ; Sigma, USA) gemäß dem Verfahren von Tokugawa et al. [Bierhuizen, M. F., Mattei, M. G. und Fukuda, M. (1993) Genes Dev., 7, 468–478] hergestellt. Das resultierende Material wurde mit einem oder einer Kombination der folgenden Enzyme behandelt: Arthrobacter ureafaciens-abgeleitete Sialidase (Nacalai Tesque), Aspergillus sp.-abgeleitete &bgr;-Galactosidase (Toyobo), Jack-Bohnen-abgeleitete &bgr;-N-Acetylhexosaminidase (Seikagaku Corpl), GnT-V-aktive Fraktion im CHO-K1-Zellextrakt (Überstand erhalten durch Beschallung von CHO-K1-Zellen in 2 Volumen 5 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, enthaltend 2 mM MgCl2 und 1 mM PMSF und dann Zentrifugation bei 900 × g für 10 Minuten) und der GnT-V-aktiven Fraktion in löslich gemachter Fraktion von Rinderdünndarmhomogenat (für das Herstellungsverfahren, siehe "Herstellung der Mikrosomenfraktion" und "Löslichmachen" in Beispiel 1). Ein Teil der pyridylaminierten Oligosaccharide wurde durch Behandlung der PA-Zuckerkette 021 und 022 (Takara Shuzo) mit den obigen Enzymen hergestellt. In beiden Fällen wurden die Oligosaccharide, die hergestellt wurden, durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer ODS-Säule (10 × 250 mm; Vydac, USA) vor der Verwendung gereinigt.

(ii) Glycoproteinsubstrate

Rinderfetuin (Sigma, USA) und von CHO-Zellen abstammendes rekombinantes menschliches Erythropoietin (Kirin Brewery) wurden der folgenden Vorbehandlung für ihre Reinigung in eine relativ einheitliche Glycoform unterzogen. Kurz gefasst, wurden 40 bis 100 mg des Glycoproteins auf eine ConA-Sepharosesäule (5 ml; Pharmacia, Schweden), äquilibriert mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, enthaltend 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 und 0,15 M NaCl aufgebracht, um dadurch eine Glycoform mit einem niedrigen Biantennen-Zuckerkettengehalt als nicht-adsorbierte Fraktion zu erhalten. Danach wurde die Säule mit dem obigen Puffer, enthaltend 1,0 M &agr;-Methylmannosid (Nacalai Tesque) eluiert um dadurch die Fraktion zu erhalten, die ein Glycoform mit einem hohen Biantennen-Zuckerkettengehalt adsorbiert. Dadurch wurde Fetuin mit einem niedrigen Biantennen-Zuckerkettengehalt und Erythropoietin mit einem hohen Biantennen-Zuckerkettengehalt erhalten. Im Hinblick auf menschliches Transferrin gab es keinen Bedarf dieses Glycoprotein zu reinigen, da fast alle Zuckerketten davon biantennär sind.

Das so erhaltene Fetuin und menschliches Transferrin wurden individuell mit 1 U Sialidase und 0 oder 107 U &bgr;-Galactosidase in 1 ml 0,4 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0, enthaltend 4 mM MgCl2 bei 37°C für 16 Stunden umgesetzt, um dadurch Asialo- oder Asialoagalacto-Glycoproteine zu erhalten. Das Erythropoietin mit einem hohen Biantennen-Zuckerkettengehalt wurde mit 0,5 U Sialidase und 5 U &bgr;-Galactosidase auf dieselbe Weise wie oben beschrieben umgesetzt, um ein Asialoagalakto-Glycoprotein zu erhalten.

Jedes der so erhaltenen Glycoproteinsubstrate wurde gegen 50 mM Ammoniumacetatpuffer, pH 7,3 dialysiert. Dann wurde die Menge des Proteins durch den BCA-Proteinassay (Pierce, USA), unter Verwendung von BSA (bovinem Serumalbumin) als Standard bestimmt. Weiterhin wurde das Protein durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese) analysiert. Die so hergestellten Glycoproteine wurden in den Beispielen verwendet.

(iii) RT-PCR (reverse Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion)

Für RT-PCR wurde das Access RT-PCR-System (Promega, USA) verwendet. Für die Amplifikation eines Fragments eines interessierenden Gens wurde Pfu-Polymerase (Stratagene, USA) verwendet.

(2) In den Beispielen verwendete Ausrüstung (i) Gensequenzierung
  • ABI PLISM 377 DNA-Sequencer (Perkin-Elmer, USA)
[REFERENZBEISPIEL 2] SPEZIFISCHER ASSAY AUF DIE GnT-IV-AKTIVITÄT

Im allgemeinen gibt es zwei Verfahren um die GnT-IV-Aktivität zu überprüfen: ein Verfahren, wobei der Transfer von radioaktiv markiertem GlcNAc auf ein Oligosaccharidsubstrat überprüft wird und ein Verfahren, bei dem der Transfer von GlcNAc auf ein markiertes Oligosaccharidsubstrat fraktionsweise durch HPLC oder ähnliches analysiert wird. Taniguchi et al. entwickelten ein Verfahren, wobei die GnT-III-, -IV- und -V-Aktivitäten simultan unter Verwendung des GnT-II-produktartigen Oligosaccharids als Rezeptor bestimmt wurden, [Nishikawa, A., Fujii, S., Sugiyama, T. und Taniguchi, N. (1988) Anal. Biochem., 170, 349–354]. Dieses Assayverfahren in seiner vorliegenden Form war jedoch als Assay während der Reinigung von GnT-IV ungeeignet und zwar aufgrund der relativen Aktivität von GnT-IV, die nieder liegt als diejenigen von GnT-III und -V.

Daraufhin haben die gegenwärtigen Erfinder ein Verfahren zur Bestimmung der GnT-IV-Aktivität auf quantitative und sensitive Weise entwickelt, indem sie die Menge des Akzeptorpyridylaminierten Oligosaccharids auf das 10-fache im Vergleich mit der in dem vorherigen Assaysystem verwendeten Menge erhöht haben [Tokugawa, K., Oguri, S. und Takeuchi, M. (1996) Glycoconjugate J., 13, 53–56]. Es ist allgemein sehr schwierig eine so große Menge des Akzeptor-Oligosaccharids herzustellen. Gemäß dem Verfahren von Tokugawa et al. [Tokugawa, K., Oguri, S. und Takeuchi, M. (1996) Glycoconjugate J., 13, 53–56] können solche Oligosaccharide jedoch einfach hergestellt werden.

In den Beispielen der vorliegenden Erfindung wurde die GnT-IV-Aktivität wie unten beschrieben überprüft.

Das Enzym wurde in 125 mM MOPS [3-(N-Morpholino)propansulfonsäure]-Puffer, pH 7,3, enthaltend 0,8 mM pyridylaminiertes Oligosaccharidsubstrat (GnT-II-produktartiges Oligosaccharidsubstrat), 20 mM UDP-GlcNAc, 7,5 mM MnCl2, 200 mM GlcNAc, 0,5% (G/V) Triton X-100, 10 Glycerin und 1% BSA bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Dann wurde die Reaktion durch Kochen der Lösung für 2 Minuten beendet. Nach Entfernung der Feststoffe mit 0,45 nm Filtern wurden 5 &mgr;l des Filtrats mit einer ODS-80TM-Säule (4,6 × 150 mm; TOSO) (5) bei 50°C mit einem 50 mM Ammoniumacetatpuffer, pH 4,0, enthaltend 0,15% (G/V) n-Butanol bei einer Flussrate von 1,2 ml/min analysiert. Die Fluoreszenz von Pyridolaminogruppen wurde unter Verwendung von einer Anregung bei 320 nm und einer Emission bei 400 nm nachgewiesen.

[BEISPIEL 1] Isolierung und Reinigung des Enzyms (1) Screening einer Quelle des Enzyms

Es wurde nach einer Quelle des GnT-IV-Enzyms, das gereinigt werden sollte, gesucht, wobei das oben beschriebene Assayverfahren verwendet wurde. Es wurde festgestellt, dass die relative Aktivität von GnT-IV zu denjenigen von GnT-III und GnT-V in Rinderdünndarm deutlich höher ist als die relative Aktivität von GnT-IV in anderen Geweben, wie in Tabelle 1 dargestellt. So wurde der Dünndarm von Rindern als Ausgangsmaterial für die Reinigung gewählt.

TABELLE 1

SUCHE NACH QUELLEN FÜR GnT-IV-Enzyme
: Daten von Nishikawa, A. et al., BBA 1035, 313–318 (1990)
N.D.
unterhalb der Nachweisgrenze

(2) Reinigung

Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Arbeitsschritte bei 4°C durchgeführt.

(i) Herstellung der Mikrosomenfraktion

Zwei Kilogramm Dünndarm von Rindern (erhalten von einem Fleischverarbeiter) wurden gehackt. Dann wurden 4 Volumen Extraktionspuffer (10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,25 M Saccharose, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 1 mM Dithiothreitol und 10 mg/ml Antipain) hinzugefügt und mit Polytron (Kinematica, Schweden) homogenisiert. Das resultierende Homogenat wurde bei 900 × g 10 Minuten zentrifugiert. Dann wurde der Überstand weiter bei 105.000 × g für 60 Minuten zentrifugiert, um dadurch die Mikrosomenfraktion als Präzipitat zu erhalten (Probe 1).

(ii) Löslichmachen

Die Probe 1 wurde in 3 Volumen eines Lösungspuffers suspendiert, hergestellt durch Zugabe von Triton-100 zu dem Extraktionspuffer, um eine Endkonzentration von 1% zu erhalten. Der Überstand wurde durch Zentrifugation bei 105.000 × g für 60 Minuten erhalten. Das Pellet wurde wiederum suspendiert und der Überstand gesammelt. Die ersten und zweiten Extrakte wurden kombiniert (Probe 2).

(iii) Q-Sepharose FF-Chromatographie

Probe 2 wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (5 × 30 cm; Pharmacia, Schweden), prä-äquilibriert mit Arbeitspuffer 1 (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 1 mM Benzamidinhydrochlorid 0,1% Triton X-100 und 20% Glycerin) aufgebracht und dann durch einen linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M KCl (6) eluiert (Probe 3)

(iv) Kupferchelatsepharose FF-Chromatographie

Probe 3 wurde auf eine Kupferchelatsepharose FF-Säule (5 × 10 cm; Pharmacia Schweden) aufgebracht, prä-äquilibriert mit dem Arbeitspuffer 2 (erhältlich durch Zugabe von KCl zu dem Arbeitspuffer 1 mit einer Endkonzentration von 0,15 M). Dann wurden die nicht adsorbierten Fraktionen mit 5 Volumen des Arbeitspuffers 2 ausgewaschen. Danach wurde das Absorbat durch einen linearen Gradienten von 0,01 M Glycin eluiert (7). Die resultierende GnT-IV-aktive Fraktion wurde gesammelt und mit einer YM30-Ultrafiltrationsmembran (Amicon, USA) konzentriert (Probe 4).

(v) UDP-Hexanolamin-Agarose-Affinitätschromatographie I

Zu einer UDP-Hexanolamin-Agarose-Affinitätssäule (1,2 × 4,5 cm; Sigma, USA) prä-äquilibriert mit Arbeitspuffer 3 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 0,15 M KCl, 10 mM MnCl2, 0,05% Triton X-100 und 20% Glycerin), wurde eine Hälfte der Probe 4, dialysiert gegen 1 mM Benzamidinhydrochlorid-versetztem Arbeitspuffer 3 aufgebracht. Dann wurden die nicht-adsorbierten Fraktionen mit Arbeitspuffer 4 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 10 mM MnCl2, 0,05% Triton X-100 und 20% Glycerin) ausgewaschen. Danach wurde das Adsorbat mit Arbeitspuffer 4 eluiert, zu dem 1 M (Endkonzentration) KCl zugefügt worden war (8). Die GnT-IV-aktive Fraktion wurde gesammelt und gegen Arbeitspuffer 5 (mit derselben Zusammensetzung wie derjenigen von Arbeitspuffer 4, jedoch mit einem pH von 7,4) dialysiert (Probe 5).

(vi) UDP-Hexanolamin-Agarose-Affinitätschromatographie II

Probe 5 wurde zu einer UDP-Hexanolamin-Agarose-Affinitätssäule (1,0 × 6,5 cm; Sigma, USA) prä-äquilibriert mit Arbeitspuffer 5 aufgebracht. Dann wurden die nicht-adsorbierten Fraktionen mit Arbeitspuffer 5 ausgewaschen. Danach wurde das Adsorbat mit einem von MnCl2-befreiten Arbeitspuffer 5 eluiert (9). Die resultierende GnT-IV-aktive Fraktion wurde gesammelt (Probe 6).

(vii) Superdex 200-Gelchromatograhie

Probe 6 wurde mit einer kleinen Q-Sepharose FF-Säule konzentriert und auf eine Superdex 200HR5/5-Säule (1 × 30 cm; Pharmacia, Schweden), prä-äquilibriert mit Arbeitspuffer 6 (erhalten durch Zugabe von KCl zu Arbeitspuffer 5 mit einer Endkonzentration von 0,15 M) aufgebracht (10). Arbeitspuffer 6 wurde auf die Säule mit einer Flussrate von 0,25 ml/min aufgebracht, um dadurch die GnT-IV-aktive Fraktion zu erhalten. (Probe 7).

(viii) Die Menge an Protein, Aktivität und spezifischer Aktivität in jedem Reinigungsschritt sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die endgültige Probe wurde 224.000-fach im Vergleich mit dem Homogenat aus dem Dünndarm gereinigt.

(3) Eigenschaften im Hinblick auf die Enzymchemie und Proteinchemie (i) Reinheit

Probe 7 ergab eine einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von 60 K in SDS-PAGE (11). Wenn Probe 7 einer nativen PAGE unterzogen wurde und die resultierende Bande aus dem Gel ausgeschnitten wurde, um die GnT-IV-Aktivität zu bestimmen, stimmte die Lokalisierung der Proteinbande mit der Lokalisierung der Aktivität überein (12). Weiterhin wurde keinerlei GnT-I, -II-, -III- oder -V-Aktivität in Probe 7 nachgewiesen. Aus diesen Feststellungen wurde geschlossen, dass Probe 7 reines GnT-IV ist. Unter Einbeziehung der Tatsache, dass das anscheinende Molekulargewicht dieses Proteins 77 K war, wie bestimmt durch Triton X-100-haltige Gelfiltration (10) wird angenommen, dass GnT-IV keine Untereinheitsstruktur aufweist und seine Aktivität in Form eines Monomers exprimiert. Wenn Probe 7 mit dem Peptid N-Glycosidase F (Boehringer-Mannheim, Deutschland) behandelt wurde, wurde ein Anstieg der Mobilität auf SDS-PAGE beobachtet. So wird angenommen, dass GnT-IV von Rinderdünndarm ein Glycoprotein mit mindestens Asn-gebundenen Zuckerketten ist.

(ii) Reaktionsspezifität

Wenn dieses Enzym auf das GnT-II-produktartigen Oligosaccharid einwirkt, dargestellt durch die Formel unten als Substrat:

unter Standardassaybedingungen, ergab das Enzym ein einzelnes Produkt (pyridylaminiertes Oligosaccharid 1), wie überprüft durch HPLC.

Dieses Produkt wurde gesammelt, gefolgt von einer Bestimmung seiner Struktur durch (i) eine Kombination von Smith Abbau und Laser TOF-MS (time-of-flight-Massenspektrometer) und (ii) 1H-NMR. So wurde die Reaktionsspezifität dieses Enzyms überprüft. Wenn das pyridylaminierte Oligosaccharid 1 einem Smith-Abbau gemäß dem Verfahren von Kobata und Takasaki (Kobata, A. und Takasaki, S. (1993) in Glycobiology "A Practical Approach" (Fukuda, M. und Kobaa, A., Hrsg.) 165–185, IRL Press, Oxford, England] unterzogen wurde, veränderte sich seine Massezahl von 1.599,0 zu 795,30 als Ergebnis des ersten Abbaus und veränderte sich weiter auf 634,68 als Ergebnis des zweiten Abbaus. Dies stimmt mit dem in 13 dargestellten Reaktionsweg überein. So wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass das Reaktionsprodukt dieses Enzyms die folgende Struktur aufweist:

Wenn das pyridylaminierte Oligosaccharid 1 weiterhin einer 1H-NMR unterzogen wurde, wurde ein Peak von 4,53 ppm, der zu dem anomeren Proton von GlcNAc7 korrespondiert, dargestellt in der folgenden Formel, nachgewiesen; seine Kopplungskonstante J1,2 war 7,9 Hz (14). Diese Ergebnisse zeigen an, dass GlcNAc7, wie in der Formel unten dargestellt, an Position 4 von Man4 über eine &bgr;-Typbindung angebunden ist, was die obige Struktur vollständig unterstützt.

(iii) pH-Optimum

Das pH-Optimum dieses Enzyms liegt ungefähr bei 7,5, wie in 15 dargestellt.

(iv) Bedarf an divalenten Kationen

Wie in Tabelle 3 dargestellt, wird dieses Enzym durch die Addition von EDTA (Ethylendiamintetra-Essigsäure) deaktiviert. Ein divalentes Kation ist für seine Aktivität essentiell. Unter den divalenten Kationen zeigt Mn2+ die größte Wirkung, gefolgt von Co2+ und Mg2+. Eine schwache Wirkung wird für Ca2+ und Fe2+ erkannt. Die optimale Konzentration von Mn2+ liegt bei ungefähr 10 mM, wie in 16 dargestellt.

TABELLE 3

Bedarf von GnT-IV an divalenten Kationen

Die GnT-IV-Aktivität wurde durch Zugabe jedes der Metallionen (10 mM) zu einer GnT-IV-Probe bestimmt, aus der Metallionen entfernt worden waren. Die GnT-IV-Aktivität wird in Prozent in der Tabelle dargestellt, worin die Aktivität, wenn 10 mM MnCl2 zugefügt wurden, als 100 angesehen wird.

(v) Inhibition durch Zuckernucleotide

Wie in Tabelle 4 dargestellt, inhibierte UDP die Aktivität dieses Enzyms am stärksten. Die inhibitorischen Wirkungen von UDP-Glucose, UDP-GalNAc, 2'-Deoxy-UDP und UDP-Hexanolamin (Sigma, USA) folgten derjenigen von UDP in dieser Reihenfolge. Uridin, UMP, TDP und CDP zeigten eine geringe inhibitorische Wirkung.

TABELLE 4

Inhibition von GnT-IV durch Nucleotide

Die GnT-IV-Aktivität, wenn jedes Nucleotid (2 mM) in Gegenwart von 0,5 mM UDP-GlcNAc zugefügt wird, wird in Prozent in der Tabelle ausgedrückt, wobei die Aktivität, wenn nichts zugefügt wurde, als 100% betrachtet wird.

(vi) Substratspezifität

Wie in Tabelle 5 dargestellt, bevorzugte diese Enzym das GnT-V-Produkttyp Oligosaccharid (E in Tabelle 5) als Akzeptor am meisten. Danach bevorzugte das Enzym die GnT-II-Produkttyp-Oligosaccharide (D in Tabelle 5).

Wenn die Reaktivität dieses Enzyms zu dem GnT-II-Typ Oligosaccharid als 100% angesehen wird, zeigt dieses Enzym Reaktivitäten von 0% und 54% zu den Kerntyp-Oligosacchariden (A in Tabelle 5) bzw. den GnT-I-Produkttyp Oligosacchariden (C in Tabelle 5).

Dieses Enzym zeigt eine Reaktivität von 46% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp Oligosaccharid, worin Fucose über eine &agr;1→6-Bindung an das GlcNAc am reduzierenden Ende angebunden ist (F in Tabelle 5).

Dieses Enzym zeigt eine Reaktivität von 0% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp Oligosacchariden, worin das GlcNAc an der &agr;1→3-Mannose fehlt (B in Tabelle 5).

Dieses Enzym zeigt eine Reaktivität von 16% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp Oligosacchariden, worin die Galactose über eine &bgr;1→4-Bindung an das GlcNAc an der &agr;1→6-Mannose angebunden ist (G in Tabelle 5) und eine Reaktivität von 0% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp Oligosacchariden, worin die Galactose über eine &bgr;1→4-Bindung an das GlcNAc an der &agr;1→3-Mannose angebunden ist (H und I in Tabelle 5).

Dieses Enzym zeigt eine Reaktivität von 0% zu einer Struktur von GnT-II-Produkttyp Oligosacchariden, worin das GlcNAc über eine &bgr;1→4-Bindung an die &bgr;1→4-Mannose angebunden ist (J in Tabelle 5).

Die Substratspezifität, wie oben beschrieben, stimmt fast vollständig mit der Substratspezifität von GnT-IV überein, wie vorhergesagt von Schachter et al. [Glesson, P. A. und Schachter, H. (1983) J. Biol. Chem., 258, 6162–6173]. So wird deutlich, dass dieses Enzym der Erfindung genau das GnT-IV ist, das seit langem ein fehlendes Bindeglied bei der Biosynthese von Zuckerketten vom Komplextyp war.

TABELLE 5
(vii) Kinetische Parameter

Unter den wie in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Assaybedingungen betrugen die Km- und Vmax-Werte dieses Enzyms zu den GnT-II-Produkttyp Oligosacchariden 0,73 mM bzw. 3,23 &mgr;M/min und diese Werte zu den GnT-V-Produkttyp Oligosacchariden betrugen 0,13 mM bzw. 1,75 &mgr;M/min. Der Km-Wert zu UDP-GlcNAc betrug 0,22 mM.

Unter den erhaltenen pyridylaminierten Oligosacchariden erwiesen sich diejenigen, die durch die folgenden repräsentiert werden, als neue Oligosaccharide:

(vii) Wirkung auf Glycoproteine

Um zu demonstrieren, dass GnT-IV nicht nur auf Oligosaccharidsubstrate sondern auch Oligosaccharidketten auf Glycoproteinen wirken kann, wird GnT-IV mit Asialo-Agalacto-Glycoproteinen unter Verwendung von UDP[14C]-GlcNAc als Zuckerdonator umgesetzt. Dann wurden die Reaktionsprodukte durch SDS-PAGE und Fluorographie (Panels A und B, 17) analysiert. Wie in den Spuren 2 und 5 von Panel B in 17 dargestellt, gibt es einen Transfer von [14C]-GlcNAc zu Asialo-Agalacto-menschlichem Transferrin und menschlichem Asialo-Agalacto, CHO-Zellen-abgeleiteten rekombinantem Erythropoietin.

Das menschliche Transferrin mit der GnT-IV-Produkttyp-Zuckerkette (der folgenden Formel), erhalten durch diese GnT-IV-Reaktion ist eine neue Substanz, die in der Natur nicht auftritt.

GnT-IV-Produkttyp-Zuckerkettenstruktur
[BEISPIEL 2] PEPTID-KARTIERUNGSANALYSE

Ungefähr 1 mg dieses Enzyms der Erfindung, wie schließlich gereinigt, wurde auf einem 0,1%igem SDS-10%igem Polyacrylamidgel gemäß dem Verfahren von Laemmli [Laemmli, U. K. Nature (1970) 313, 756–762] elektrophoretisch behandelt. Die abgetrennten Proteine wurden auf einer PVDF-Membran elektrogeblottet. Das auf der Membran fixierte Protein war S-carboxymethyliert und wurde dann mit Lysylendopeptidase Achromobacter-Protease I (AP-I) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zum Erhalt einer AP-I-verdauten Fragmentmischung verdaut. Die AP-I-verdaute PVDF-Membran wurde weiter mit Asp-N (Takara Shuzo) verdaut um eine Asp-N-verdaute Fragmentmischung zu erhalten. Jede der Peptid-Fragmentmischungen wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie getrennt und einer Aminosäure-Sequenzanalyse unterzogen. Im Ergebnis wurden die in SEQ ID NOS: 1 bis 14 dargestellten Sequenzen erhalten.

[BEISPIEL 3] ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON RINDER-GnT-IVa-cDNA (1) RT-PCR

Basierend auf den in SEQ ID NOS: 7 und 11, wie erhalten in Beispiel 2, dargestellten Aminosäuresequenzen wurden das Oligomer AP-5F, dargestellt in SEQ ID NO: 15 bzw. das Oligomer DN-9R, wie dargestellt in SEQ ID NO: 16 synthetisiert. Eine RT-PCR wurde durchgeführt, wobei als Matrize die aus Dünndarmgewebe von Rindern extrahierte Gesamt-RNA (durch das Guanidinium-Isothiocyanat-Verfahren) verwendet wurde und wobei die obigen Primer verwendet wurden. Im Ergebnis wurde ein amplifiziertes Fragment mit ungefähr 170 bp, das spezifisch erschien, erhalten. Dieses Fragment wurde subkloniert.

(2) Screening einer Bibliothek

Eine Rinderdünndarm-cDNA-Bibliothek (Clontech, USA) wurde mit dem oben erwähnten RT-PCR-Produkt zum Erhalt von vier positiven Plaques einem Screening unterzogen. Die Nucleotidsequenzen dieser Klone wurden bestimmt. Die resultierenden Sequenzen enthielten eine Anzahl von Nucleotidsequenzen, die für einige Teil-Aminosequenzen (SEQ ID NOS: 1 bis 14), erhalten in Beispiel 2, kodierten und enthielten auch eine Sequenz, bei der es sich um einen Stopp-Kodon zu handeln schien. Unter Verwendung eines Fragments von 150 bp, das den am meisten stromaufwärts gelegenen Bereich der resultierenden Nucleotidsequenz repräsentierte, wurde die Bibliothek wiederum mit einem Screening überprüft um zwei positive Plaques zu erhalten. Die Nucleotidsequenzen dieser Klone wurden bestimmt. Dann wurde die Bibliothek weiter ähnlich mit einer Sonde von 150 bp von dem am meisten stromaufwärts gelegenen Bereich gescreent, es wurden jedoch keine neuen Klone erhalten.

(3) 5'-RACE (Schnellamplifizierung der cDNA-Enden)

Darauffolgend wurde eine 5'-RACE durchgeführt, um eine Gesamtlängen-cDNA zu erhalten. Unter Verwendung der Sequenz des am meisten stromaufwärts gelegenen Bereichs, erhalten durch Phagen-Screening, wurde die erste 5'-RACE durchgeführt. Jedoch konnte kein Startkodon gefunden werden. Dann wurde, basierend auf der durch die erste 5'-RACE erhaltenen Sequenz, die zweite 5'-RACE durchgeführt um dadurch eine Sequenz zu erhalten, die ein Startkodon enthielt. Diese Sequenz wurde mit der vorher erhaltenen Teil-Gensequenz des Phagenklons ligiert, um dadurch ein Genfragment zu erhalten, das einen intakten offenen Leserahmen enthielt (Gen 1). Die Nucleotidsequenz für das so erhaltene Genfragment ist in SEQ ID NO: 17 dargestellt und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 18 dargestellt. Es wurde bestätigt, dass dieses DNA-Fragment die gesamten Nucleotidsequenzen enthält, die für die 14 Teil-Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 1 bis 15), erhalten in Beispiel 2, kodieren.

[BEISPIEL 4] KONSTRUKTION EINES EXPRESSIONSVEKTORS UNTER VERWENDUNG DES KLONIERTEN RINDER-GnT-IVa-GENS UND EIN VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG DES GnT-IVa-ENZYMS (1) Konstruktion eines Vektors

Ein Primer (SEQ ID NO: 19), der eine XhoI-Stelle in einem Bereich stromaufwärts vom Stratkodon von Gen 1 einfügt und ein anderer Primer (SEQ ID NO: 20) der eine XbaI-Stelle in einen Bereich stromabwärts vom Endkodon des Gens einführt, wurden synthetisiert. Dann wurde das gesamte Gen, das das GnT-IV-Enzym kodiert, durch PCR mit diesen Primern amplifiziert. Das erhaltene amplifizierte Fragment wurde mit XhoI und XbaI verdaut und zwischen den XhoI und XbaI-Stellen des pSVL-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert, um das Plasmid pBGT4 herzustellen.

(2) Einführung in COS7-Zellen

Das Plasmid pGBT4 wurde in COS7-Zellen (RIKEN Cell Bank) durch Elektroporation eingeführt. Kurzgefasst wurden 10 &mgr;g des Plasmids zu ungefähr 5 × 106 Zellen in 0,8 ml PBS(–) (Nissui Pharmaceutical Co.) zugefügt. Eine Spannung von 1.600 V wurde bei einer Kapazität von 25 &mgr;F mit einem Genpulser (BioRad, USA) bei Raumtemperatur angewandt, um das Gen in die Zellen einzuführen. Die resultierenden Zellen wurden in eine Laborschale mit einem Durchmesser von 90 mm übertragen und in 10 ml Dulbecco's-modifiziertem Eagle's-Medium kultiviert (Base Catalogue Nr. 12430, Life Technologies, Inc., USA), enthaltend 10% fötales Rinderserum unter 5% CO2 bei 37°C für 72 Stunden. Danach wurden die Zellen wiedergewonnen und in 100 &mgr;l eines Puffers (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert, gefolgt von einer Beschallung und Zentrifugation bei 2.000 × g für 5 Minuten. So wurde ein Zellextrakt erhalten.

(3) Assay auf GnT-IV-Aktivität

Die GnT-IV-Aktivität in dem Zellextrakt wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Im Vergleich mit dem Extrakt von Zellen, in die der pSVL-Vektor als Kontrolle eingeführt worden war, zeigten diejenigen Extrakte, in die das Plasmid pBGT4 eingeführt worden war, eine 44- bis 78-fach höhere GnT-IV-Aktivität pro Zelle. Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass Gen 1 das GnT-IV-Enzym kodiert. So kann das GnT-IV-Enzym durch kultivierte Zellen gemäß diesem Verfahren erzeugt werden.

TABELLE 6
Reaktionszeit: 4 Stunden

Die Aktivitätsverhältnisse werden unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pSVL, die als 1 angesetzt wird, ausgedrückt.

[BEISPIEL 5] ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON MENSCHLICHER GnT-IVa-cDNA (1) RT-PCR

Basierend auf der Nucleotidsequenz von bovinem GnT-IVa, erhalten in Beispiel 3, wurden die Primer h1-2F, dargestellt in SEQ ID NO: 21 und Primer h1-1R, dargestellt in SEQ ID NO: 22, synthetisiert. Unter Verwendung von Gesamt-RNA von menschlicher Leber (Clontech, USA) als Matrize, wurde eine PT-PCR mit den obigen Primern durchgeführt. Im Ergebnis wurde ein amplifiziertes Fragment mit ungefähr 650 bp, das spezifisch zu sein schien, erhalten. Dieses Fragment wurde subkloniert und seine Nucleotidsequenz wurde bestimmt.

(2) Screening einer Bibliothek

Eine cDNA-Bibliothek von menschlicher Leber (Clontech, USA) wurde unter Verwendung des durch die obige RT-PCR erhaltenen 685 bp-DNA-Fragment als Sonde gescreent.

Zwei positive Plaques von hGT4/&lgr; gt10-1 und hGT4/&lgr; gt10-2 wurden erhalten. Die Nucleotidsequenzen der Inserts in diesen Phagenklonen wurden bestimmt. Im Ergebnis enthielt hGT4/&lgr; gt10-1 einen 804 bp-DNA-Bereich und hGT4/&lgr; gt10-2 enthielt einen 2.115 bp-DNA-Bereich. Der erstere Bereich war vollständig in dem letzteren Bereich beinhaltet. Wie in SEQ ID NO: 23 dargestellt, hatte das DNA-Fragment, enthalten in hGT4/&lgr; gt10-2 einen offenen Leserahmen (ORF), der zu der Aminosäuresequenz von Rinder-GnT-IVa hoch homolog war (96% identisch). Durch die in Beispiel 6 beschriebenen Ergebnissen wurde bestätigt, dass dieser ORF ein menschliches GnT-IVa-Gen ist. Die Aminosäuresequenz dieses ORF ist in SEQ ID NO: 24 dargestellt.

[BEISPIEL 6] KONSTRUKTION EINES EXPRESSIONSPLASMIDS FÜR DAS MENSCHLICHE GnT-IVa-GEN UND EIN VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG VON MENSCHLICHEM GnT-IVa-ENZYM (1) Konstruktion des Expressionsplasmids pHGT4-1 für das menschliche GnT-IVa-Gen

Ein Primer (h1-7F; SEQ ID NO: 25), der eine XhoI-Stelle in einem Bereich stromaufwärts von dem Startkodon des menschlichen GnT-IVa-Gens einführt und ein anderer Primer (h1-7R; SEQ ID NO: 26), der zu einer Region stromabwärts von dem Startkodon des Gens komplementär ist, wurden synthetisiert. Unter Verwendung von RNA von menschlicher Leber (Clontech, USA) als Matrize, wurde das gesamte Gen, das für das menschliche GnT-IVa-Enzym kodierte, durch RT-PCR mit den obigen Primern amplifiziert. Das resultierende amplifizierte Fragment wurde in die SrfI-Stelle des Plasmids pCRScript Amp SK(+) (Stratagene, DNA) in entgegengesetzter Richtung zu der Transkription des lacZ-Gens inseriert. Unter Verwendung des resultierenden Plasmids wurde durch eine Nucleotidsequenzanalyse bestätigt, dass das amplifizierte Fragment die in SEQ ID NO: 24 dargestellte Aminosäuresequenz kodiert. Weiterhin wurde dieses Plasmid mit XhoI und SacI verdaut, um ein XhoI-SacI-1,7 kb-Fragment. Dieses Fragment wurde zwischen den XhoI- und SacI-Stellen von dem pSVL-Vektor (Pharmacia, Schweden) inseriert, um ein Expressionsplasmid pHGT4-1 für das menschliche GnT-IVa-Gen herzustellen.

(2) Einführung des menschlichen GnT-IVa-Gens in COS7-Zellen

Das Plasmid pHGT4-1 wurde in COS7-Zellen durch Elektroporation eingeführt. Die resultierenden Zellen wurden unter 10% CO2 bei 37°C 72 Stunden kultiviert. Dann wurden die Zellen geerntet, in 100 &mgr;l eines Puffers (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen, bei 2.000 × g 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand gesammelt, um einen Zellextrakt zu erhalten.

(3) Expression des menschlichen GnT-IVa-Gens in COS7-Zellen

Die GnT-IV-Aktivität in dem Zellextrakt wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Im Vergleich mit einem Extrakt von Zellen, in die der pSVL-Vektor als Kontrolle eingeführt worden war, zeigten die Extrakte von Zellen, in die das Plasmid pHGT4-1 eingeführt worden war, eine 21- bis 28-fach höhere GnT-IV-Aktivität pro Zelle. Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass das in SEQ ID NO: 23 dargestellte GnT-IVa-Gen die Glycosyltransferase GnT-IV kodiert. Es wurde auch bestätigt, dass das menschliche GnT-IVa-Enzym durch kultivierte Zellen gemäß diesem Verfahren erzeugt werden kann.

TABELLE 7
Reaktionszeit: 1,3 Stunden

Die Aktivitätsverhältnisse werden unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pSVL, die als 1 angesetzt wird, ausgedrückt.

[BEISPIEL 7] ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON MENSCHLICHER GnT-IVb-cDNA (1) Erhalt des menschlichen GnT-IVa-ähnlichen Gens durch PCR, RT-PCR und 5'-RACE (Schnellamplifizierung von cDNA-Enden)

Nucleotidsequenzen mit einer Ähnlichkeit zu der Nucleotidsequenz von menschlichem GnT-IVa-Gen, erhalten in Beispiel 3, wurden in der DNA-Datenbank-GenBank durch BLASTN gesucht. Im Ergebnis wurden die Hinterlegungsnummern R12057, H10557 und W16571 aufgefunden. Dann wurden die Primer h2-45F, dargestellt in SEQ ID NO: 27, und h2-43R, dargestellt in SEQ ID NO: 28, zur Durchführung einer PCR unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek von menschlichen Gehirn der Quick Screen Human cDNA Library Panel (Clontech, USA) als Matrize synthetisiert. Das amplifizierte Fragment wurde in die SrfI-Stelle des pCRScript Amp SK(+) (Stratagene, USA) subkloniert und einer Analyse der Nucleotidsequenz unterzogen. Außerdem wurden die Primer h2-2F, dargestellt in SEQ ID NO: 29, und h2-1R, dargestellt in SEQ ID NO: 30, synthetisiert um eine RT-PCR unter Verwendung von Gesamt-RNA von menschlicher Lunge (Contech, USA) als Matrize durchzuführen. Im Ergebnis wurde ein amplifizierte Fragment mit ungefähr 500 bp der erwarteten Größe erhalten. Dann wurde dieses Fragment in der SrfI-Stelle des pCRScript Amp SK(+) (Stratagene, USA) subkloniert und einer Analyse der Nucleotidsequenz unterzogen.

Die so erhaltenen Nucleotidsequenzen der beiden DNA-Fragmente überlappen einander und bildeten eine Region von 1.006 bp. In dieser Region wurde ein Leserahmen, der die homologe Aminosäuresequenzen zu denjenigen von Rinder und menschlichem GnT-IVa kodiert, erkannt. So wurde das Vorhandensein eines Proteins, das in Bezug zu GnT-IVa-Proteinen stand, vorgeschlagen.

Dann wurden mögliche Nucleotidsequenzen, die eine stromaufwärts gelegene Sequenz zu R12057 oder stromabwärts gelegene Sequenzen zu W16571 sein könnten in der DNA-Datenbank-Genbank durch BLASTN gesucht. Im Ergebnis wurde R15554 als stromabwärts gelegene Sequenz zu R12057 gefunden und W16466 als stromabwärts gelegene Sequenz zu W16571. Ein anscheinend nicht geeignetes Stoppkodon war jedoch in den ORFs, abgeleitet von diesen Nucleotidsequenzen, enthalten. Um daher die Nucleotidsequenzen zu bestätigen wurden DNA-Fragmente durch RT-PCR erhalten. Als Primer wurden h2-1F, dargestellt in SEQ ID NO: 31, h2-3F, dargestellt in SEQ ID NO: 32 und h2-8R, dargestellt in SEQ ID NO: 33, synthetisiert. Mit einer Kombination aus h2-1F und dem in Beispiel 5 beschriebenen h1-1R oder einer Kombination aus h2-3F und h2-8R wurde eine RC-PCR unter Verwendung von Gesamt-RNA von menschlicher Leber (Clontech, US) als Matrize durchgeführt. Amplifizierte Fragmente mit ungefähr 550 bp und ungefähr 300 bp, die jeweils mit den erwarteten Größen übereinstimmten, wurden nachgewiesen. Jedes dieser Fragmente wurde in die SrfI-Stelle von pCRScript Amp SK(+) subkloniert, um die Nucleotidsequenz zu analysieren. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass diese Fragmente jeweils mit einem stromaufwärts gelegenen und einem stromabwärts gelegenen Bereich zu dem 1.006-Bereich zwischen den oben erwähnten h2-45F und h2-1R überlappten. In dem ligierten Bereich von 1.361 bp wurde ein ORF angetroffen, der ein 433-Aminosäurenprotein mit einer hohen Ähnlichkeit zu den Aminosäuresequenzen von bovinen und menschlichen GnT-IVa-Proteinen aufwies.

Wenn jedoch dieser ORF mit den Aminosäuresequenzen von GnT-IVa-Proteinen verglichen wird, wird angenommen, dass das Startmethionin in einer Region stromaufwärts zu diesem ORF vorliegen sollte. Daher wurde der stromaufwärts gelegene Bereich durch 5'-RACE unter Verwendung von menschlicher Lungen-5'-RACE-Ready-cDNA (Clontech, USA) erhalten. In der ersten PCR wurden ein Anchor-Primer und h2-5R, dargestellt in SEQ ID NO: 34, als Primer verwendet. In der zweiten PCR wurden ein Anchor-Primer und h2-3R, dargestellt in SEQ ID NO: 35, als Primer verwendet. Die durch 5'-RACE erhaltenen Fragmente wurden gereinigt, mit EcoRI und PstI verdaut und dann durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Ein Fragment mit ungefähr 450 bp wurde von dem Gel gewonnen. Dieses Fragment wurde zwischen die EcoRI- und PstI-Stellen des pUC18-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert, um die Nucleotidsequenzen zu analysieren. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass dieses Fragment mit einem Bereich stromaufwärts zu dem Bereich zwischen h2-1F und h2-8R überlappt. In dem ligierten Bereich von 1.758 bp wurde ein ORF bestätigt, das ein 548-Aminosäureprotein mit hoher Ähnlichkeit zu den Aminosäuresequenzen von Rinder- und menschlichen GnT-IVa-Proteinen kodiert. Die Nucleotidsequenz dieses ORF ist in SEQ ID NO: 36 dargestellt und die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 37. Aus den in Beispiel 8 unten beschriebenen Ergebnissen wurde bestätigt, dass dieses Gen das menschliche Gen GnT-IVb-Gen ist.

[BEISPIEL 8] KONSTRUKTION EINES EXRESSIONSPLASMIDS FÜR DAS MENSCHLICHE GnT-IVb-GEN UND EIN VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG DES MENSCHLICHEN GnT-IVb-ENZYMS (1) Konstruktion des Expressionsplasmids pHGT4-2 für das menschliche GnT-IVb-Gen

Ein Primer (h2-4: SEQ ID NO: 38), der eine XhoI-Stelle in einer Region, stromaufwärts zum Startkodon des menschlichen GnT-IVb-Gens einführt und ein anderer Primer (h2-10R: SEQ ID NO: 39), der eine XbaI-Stelle in einer Region stromabwärts zum Stoppkodon des obigen Gens einführt, wurden synthetisiert. Unter Verwendung dieser Primer wurde der gesamte ORF, kodierend für das menschliche GnT-IVb-Enzym, durch RT-PCR mit einer RNA von menschlicher Lunge (Clontech, USA) als Matrize amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde in die SrfI-Stelle des Plasmids pCRScript Amp SK(+) inseriert, gefolgt von einer Bestimmung seiner Nucleotidsequenz. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass das amplifizierte Fragment für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 37 kodiert. Weiterhin wurde dieses Plasmid mit XhoI und XbaI verdaut, um ein XhoI-XbaI-1,7 kg-Fragment zu erhalten. Diese Fragment wurde zwischen die XhoI- und XbaI-Stellen des pSVL-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert, um ein Expressionsplasmid pHGT4-2 für das menschliche GnT-IVb-Gen zu konstruieren.

(2) Einführung des menschlichen GnT-IVb-Gens in COS7-Zellen

Das Plasmid pHGT4-2 wurde in COS7-Zellen durch Elektroporation eingeführt. Die resultierenden Zellen wurden unter 10% CO2 bei 37°C für 72 Stunden kultiviert.

Dann wurden die Zellen wiedergewonnen, in 100 &mgr;l eines Puffers (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen, bei 2.000 × g 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand gesammelt um dadurch einen Zellextrakt zu erhalten.

(3) Expression des menschlichen GnT-IVb-Gens in COS7-Zellen.

Die GnT-IV-Aktivität in dem Zellextrat wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 oben dargestellt. Im Vergleich zu dem Extrakt von Zellen, in die der pSVL-Vektor als Kontrolle eingeführt worden war zeigten die Extrakte von Zellen, in die das Plasmid pHGT4-2 eingeführt worden war, eine 8- bis 11-fach höhere GnT-IV-Aktivität pro Zelle. Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass das in SEQ ID NO: 36 dargestellte GnT-IVb-Gen die Glycosyltransferase-GnT-IV kodiert. Es wurde auch bestätigt, dass das menschliche GnT-IVb-Enzym durch kultivierte Zellen, gemäß diesem Verfahren, erzeugt werden kann.

[BEISPIEL 9] KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSPLASMIDEN FÜR BOVINE GnT-IVa-N-TERMINALE DELETIONSMUTANTEN UND IHRE EXPRESSION (1) Konstruktion von Expressionsplasmiden pSigIle93, pSigPro113 und pSigPro142 für Rinder-GnT-IVa

Ein Primer (XhoEsig: SEQ ID NO: 40), der eine XhoI-Stelle in einem Bereich, stromaufwärts von der Signalsequenz von menschlichem Erythropoietin (GenBank Accessions Number X02157) und ein Antisinn-Primer (E4-1R: SEQ ID NO: 41), der das C-terminale Ende der obigen Signalsequenz mit einem Teil der Rinder GnT-IVa-Aminosäuresequenz legiert, die sich von Position 94 (Ile) zum Ende erstreckt, wurden synthetisiert, um die Signalsequenz von menschlichem Erythropoietin durch PCR zu amplifizieren. Außerdem wurde ein Sinn-Primer (E4-1F: SEQ ID NO: 42), korrespondierend zu dem obigen Antisinn-Primer und ein Primer (4EXPR: SEQ ID NO: 20), der eine XbaI-Stelle in einer Region, stromabwärts vom Stoppkodon des Rinder-GnT-IVa-Gens einführt, synthetisiert, um eine Teilsequenz des Rinder-GnT-IVa-Gens durch PCR zu amplifizieren. Unter Verwendung von Teilen der resultierenden zwei PCR-Produkte als Mischmatrize wurde eine PCR mit dem Primern XhoEsig und 4EXPR durchgeführt. Das amplifizierte Fragment wurde mit XhoI und XbaI verdaut und zwischen die XhoI- und XbaI-Stellen des pSVL-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert, um dadurch das Plasmid pSigIle93 zu konstruieren, das eine Aminosäuresequenz exprimiert, worin das menschliche Erythropoietinsignal mit einem Teil der Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz verbunden ist, die sich von der Position 93 zum Ende hin erstreckt.

Das Plasmid pSigPro113, das eine Aminosäuresequenz exprimiert, worin das menschliche Erythropoietinsignal an einen Teil der Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz gebunden ist, die sich von Position 113 (Pro) zum Ende erstreckt; oder das Plasmid pSigPro142, das eine Aminosäuresequenz exprimiert, worin das menschliche Erythropoiethinsignal an einen Teil der Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz gebunden ist, die sich von Position 142 (Pro) zum Ende erstreckt, wurden jeweils auf dieselbe Weise wie oben unter Verwendung der E4-2R-Primer (SEQ ID NO: 43) oder E4-3R-Primer (SEQ ID NO: 44) anstelle des E4-1R-Primers; und E4-2F-Primer (SEQ ID NO: 45) oder E4-3F-Primer (SEQ ID NO: 46) anstelle des E4-1F-Primers konstruiert.

(2) Einführung von Plasmiden, die Rinder-GnT-IVa-N-terminale Deletionsmutanten exprimieren, in COS7-Zellen

Das Plasmid pSigIle93, pSigPro113 oder pSigPro142 wurde in COS7-Zellen durch Elektroporation eingeführt. Die resultierenden Zellen wurden unter 10% CO2 72 Stunden bei 37°C kultiviert. Dann wurden die Zellen und der Kulturüberstand getrennt wiedergewonnen. Die Zellen wurden in 100 &mgr;l eines Puffers (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen und bei 2.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, um einen Zellextrakt zu erhalten. Der Kulturüberstand wurde auf ungefähr 100 &mgr;l mit Centriplus 30 (Amicon) konzentriert.

(3) Expression von Rinder-GnT-IVa-N-terminalen Deletionsmutanten in COS7-Zellen

Die GnT-IV-Aktivität im Kulturüberstand und dem Zellextrakt wurden durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Im Vergleich mit der Gesamtaktivität (d.h., Aktivität der Zellen + Aktivität im Überstand) der Zellen, in die der pBGT4-Vektor als positive Kontrolle eingeführt worden war, betrug die Gesamtaktivität der Zellen, in die pSigIle93 eingeführt worden war, mehr als 30%. Weiterhin wurde mehr als ein Drittel der Aktivität in den Kulturüberstand sezerniert. Aus diesen Ergebnissen wurde festgestellt, dass die Aminosäuren vom N-Terminus zu Position 92 der Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz deletiert werden können ohne die Enzymaktivität zurückzuhalten. Es wurde auch dargestellt, dass das GnT-IVa-Enzym sezernierend unter Verwendung eines geeigneten Sekretionssignals exprimiert werden kann.

TABELLE 8
Reaktionszeit: 2,5 Stunden

Die Aktivitätsverhältnisse werden unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pBGT4, die als 100% angesetzt wird, ausgedrückt.

[BEISPIEL 10] KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSPLASMIDEN FÜR BOVINE GnT-IVa-DELETIONSMUTANTEN UND IHRE EXPRESSION (1) Konstruktion der Expressionsplasmide pCGly499, pCPro465, pCLys432 und pCPro383 für Rinder-GnT-IVa

Ein Primer (SEQ ID NO: 19), der eine XhoI-Stelle in einen Bereich, stromaufwärts zu dem Startkodon des Rinder-GnT-IVa-Gens einführt und ein Primer (CGly499: SEQ ID NO: 47), der das Stoppkodon nach dem Gly-Kodon an Position 499 ligiert und eines XbaI-Stelle in einem Bereich, stromabwärts zu dem Stoppkodon einführt, wurden synthetisiert um eine Teilsequenz von dem Rinder-GnT-IVa-Gen durch PCR zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment wurde mit XhoI und XbaI verdaut und zwischen den XhoI- und XbaI-Stellen des pSVL-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert. So wurde das Plasmid pCGly499, das die Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz bis zu Position 499 (Glycin) exprimiert, konstruiert. Unter Verwendung des CPro465-Primers (SEQ ID NO: 48), CLys432-Primers (SEQ ID NO: 49) oder CPro383-Primers (SEQ ID NO: 50) anstelle des CGly499-Primers wurden drei zusätzliche Plasmide auf dieselbe Weise konstruiert. Sie wurden als pCPro465 (Plasmid, das die Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz bis Position 465 (Proline) exprimiert); pCLys432 (Plasmid, das die Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz bis zu Position 432 (Lysin) exprimiert) bzw. pCPro383 (Plasmid, das die Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz bis zu Position 383 (Prolin) exprimiert) bezeichnet.

(2) Einführung von Plasmiden, die Rinder-GnT-IVa-C-terminale Deletionsmutanten exprimieren, in COS7-Zellen

Das Plasmid pCGly499, pCPro465, pCLys432 oder pCPro383 wurde in COS7-Zellen durch Elektroporation eingeführt. Die resultierenden Zellen wurden unter 10% CO2 72 Stunden bei 37°C kultiviert. Dann wurden die Zellen wiedergewonnen und in 100 &mgr;l eines Puffers (5 ml Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen und bei 2.000 × g 5 Minuten zentrifugiert, um einen Zellextrakt zu erhalten.

(3) Expression von Rinder-GnT-IVa-C-terminalen Deletionsmutanten in COS7-Zellen

Die GnT-IV-Aktivität in dem Zellextrakt wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Im Vergleich mit der GnT-IV-Aktivität des Extrakts von Zellen, in die der pBGT4-Vektor als positive Kontrolle eingeführt war, betrug die Aktivität des Extrakts von Zellen, in die pCGly499, pCPro465, pCLys432 oder pCPro383 eingeführt worden war, 15,2%, 12,1%, 2,8% bzw. 104,2% pro Zelle. Aus diesen Ergebnissen wurde gezeigt, dass die GnT-IV-Aktivität erhalten werden kann, selbst wenn die Aminosäuren von Position 384 bis zum C-Terminus in der Rinder-GnT-IVa-Aminosäuresequenz deletiert sind.

TABELLE 9
Reaktionszeit: 2 Stunden

Die Aktivitätsverhältnisse werden unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pBGT4, die als 100% angesetzt wird, ausgedrückt.

[BEISPIEL 11] KONSTRUKTION VON PLASMIDEN UM VERSCHIEDENE GnT-IV-GENE IN E. COLI ZU EXPRIMIEREN UND IHRE EXPRESSION (1) Konstruktion eines E. coli-Expressionsplasmids für Rinder-GnT-IVa

Ein Primer (BSP-N: SEQ ID NO: 51), der eine BspHI-Stelle in einem Bereich stromaufwärts vom Startkodon des Rinder-GnT-IVa-Gens einführt und ein anderer Primer (C-Hd: SEQ ID NO: 52), der eine HindIII-Stelle in einem Bereich stromabwärts vom Stoppkodon einführt, wurden synthetisiert, um den gesamten offenen Leserahmen von dem Rinder-GnT-IVa-Gen durch PCR zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment wurde mit BspHI und HindIII verdaut und zwischen die NcoI- und HindIII-Stellen des pTrc99A-Vektors (Pharmacia, Schweden) eingeführt, um dadurch das Plasmid pEBGT4 zu konstruieren. Unter Verwendung des BSP-sN-Primers (SEQ ID NO: 53) anstelle des BSP-N-Primers zusammen mit den C-Hd-Primer wurde das Plasmid pEIle93 auf ähnliche Weise konstruiert. Weiterhin wird ein Gen, kodierend für den offenen Leserahmen, worin ein His-Tag zum C-Terminus zugefügt ist, unter Verwendung des BSP-N-Primers, einem Primer (CH-Hd: SEQ ID NO: 54), der ein His-Tag einführen kann, einem Stoppkodon und einer HindIII-Stelle in einem Bereich stromabwärts vom C-Terminus des Rinder-GnT-IVa-Gens und einem Primer (H-Hd: SEQ ID NO: 55), der ein His-Tag aufweist, einem Stoppkodon und einer HindIII-Stelle, amplifiziert, um dadurch das Plasmid pEBGT4+His auf ähnliche Weise zu konstruieren.

(2) Konstruktion des E. coli-Expressionsplasmids für das menschliche GnT-IVa-Gen und das menschliche GnT-IVb-Gen

Ein Primer (4aBSPIL94: SEQ ID NO: 56), der ein Startkodon und ein Ile-Kodon in einem Bereich stromaufwärts von Position 94 (Leu) der menschlichen GnT-IVa-Aminosäuresequenz einführt und der auch eine BspHI-Stelle in einem Bereich weiter stromaufwärts davon einführen kann; ein Primer (4aCH-Hd: SEQ ID NO: 57), der ein His-Tag, ein Stoppkodon und eine HindIII-Stelle in einem Bereich stromabwärts von der C-terminalen Aminosäure einführt und der H-Hd-Primer wurden synthetisiert, um ein Genfragment zu amplifizieren, bestehend aus einer Teilsequenz der menschlichen GnT-IVa-Aminosäuresequenz, wozu eine Sequenz, kodierend ein His-Tag zugefügt wurde. Das amplifizierte Fragment wurde mit BspHI und HindIII verdaut und zwischen NcoI- und HindIII-Stellen des pTrc99A-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert, um dadurch das Plasmid pMA4a+His zu konstruieren. Weiterhin wurde unter Verwendung des CP383H-Hd-Primer (SEQ ID NO: 58) anstelle des 4aCH-Hd-Primers, das Plasmid pCore+His auf ähnliche Weise konstruiert (18). Ein Fragment des menschlichen GnT-IVb-Gens wurde unter Verwendung eines Primers (4bBSP-N: SEQ ID NO: 59) amplifiziert, der eine BspHI-Stelle in einem Bereich stromaufwärts zum Startkodon des menschlichen GnT-IVb-Gens einführt und eines 4bSACR-Primers (SEQ ID NO: 60), verdaut mit BspHI und SacI und dann zwischen die NcoI- und SacI-Stellen des pTrc99A-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert. Zwischen den SacI- und HindIII-Stellen des resultierenden Plasmids wurde eine Teillänge des menschlichen GnT-IVb-Gens, amplifiziert unter Verwendung des 4bSACF-Primers (SEQ ID NO: 61), einem Primer (4bCH-Hd: SEQ ID NO: 62), der ein His-Tag am C-Terminus der menschlichen GnT-IVb-Aminosäuresequenz einführt und einem H-Hd-Primer und mit SacI und HindIII verdaut, inseriert, um dadurch das Plasmid pEHGT4-2+His zu erhalten. Weiterhin wurde eine Teilsequenz des menschlichen GnT-IVb-Gens unter Verwendung eines Primers (4bNCOG91: SEQ ID NO: 63) amplifiziert, der eine NcoI-Stelle und ein Startkodon in einem Bereich stromaufwärts von Position 91 (Gly) der menschlichen GnT-IVb-Aminosäuresequenz einführt, eines 4bCH-Hd-Primers und eines H-Hd-Primers, verdaut mit NcoI und HindIII und dann zwischen den NcoI- und HindIII-Stellen des pTrc99A-Vektors (Pharmacia, Schweden) inseriert und dadurch das Plasmid pMA4b+His zu konstruieren.

(3) Einführung von jedem Expressionsplasmid in den E. Coli-BL21-Stamm

Jedes Expressionsplasmid wurde in kompetente Zellen des E. coli-BL21-Stamms, hergestellt durch das Calciumverfahren, eingeführt. Die resultierenden Zellen wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 100 &mgr;g/ml Ampicillin kultiviert. Die resultierenden Kolonien von E. coli, transformiert mit jedem Plasmid, wurden in das LB-Flüssigmedium inokuliert und unter Schütteln über Nacht bei 37°C kultiviert. Dann wurde die Kultur in ein frisches LB-Flüssigmedium inokuliert, um eine Konzentration von 2% zu ergeben. Während die Trübheit (OD 595 nm) der Kulturflüssigkeit ungefähr 0,1 bis 0,2 betrug, wurde IPTG (Isopropyl-&bgr;-D-thiogalactopyranosid) hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1 mM zu ergeben. Die Zellen wurden für 2 Stunden bei 37°C oder für 4 Stunden bei 25°C kultiviert. Dann wurden 500 &mgr;l der Zellen geerntet. Das Zellpellet wurde in 50 &mgr;l eines Puffers (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert, durch Beschallung aufgebrochen und bei 2.000 × g 5 Minuten zentrifugiert, um einen Zellextrakt als Überstand zu erhalten.

(4) Expression von jedem Expressionsplasmid in dem E. coli-BL21-Stamm

Die GnT-IV-Aktivität in dem Zellextrakt wurde durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren bestimmt. Tabelle 10 zeigt die Ergebnisse der Expression des Rindergens. Obwohl der Extrakt von E. coli-Zellen, in die der pTrc99A-Vektor als Kontrolle eingeführt worden war, wenig GnT-IV aufwies, hatte der Extrakt von E. coli-Zellen, in die pEBGT4 eingeführt worden war, eine definitive GnT-IV-Aktivität. Durch dieses Ergebnisse wurde gezeigt, dass das GnT-IV-Enzym durch E. coli erzeugt werden kann. Die zum C-Terminus von Rinder-GnT-IVa zugefügte His-Tag-Sequenz beeinflusste die GnT-IV-Aktivität nicht sehr. So wurde gezeigt, dass eine geeignete Tag-Sequenz dem GnT-IV-Enzym zugefügt werden kann. Der Mutant (pEIle93), worin die N-terminalen 92 Aminosäuren deletiert sind, zeigte eine stärkere GnT-IV-Aktivität. So wurde gezeigt dass die Expression von Varianten des GnT-IV-Enzyms, die in tierischen Zellen bestätigt wurde, auch in E. coli möglich war.

TABELLE 10
Reaktionszeit: 3,0 Stunden

Nach einer IPTG-Addition wurden die Zellen bei 37°C 2 Stunden kultiviert.

Die Aktivitätsverhältnisse sind in Prozent unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pEBGT4, die als 100% angesetzt wird, ausgedrückt.

Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse der Expression des menschlichen Gens. Im Vergleich mit dem Extrakt von E. coli-Zellen, in die der pTrc99A-Vektor als Kontrolle eingeführt worden war, hatte der Extrakt von E. coli-Zellen, in die irgendeins der Expressionsplasmide eingeführt worden war, eine signifikante GnT-IV-Aktivität. Wie bei dem Rinder-GnT-IVa-Enzym dargestellt war es auch bei den menschlichen GnT-IVa- und GnT-IVb-Enzymen möglich, eine N-terminale Sequenz zu deletieren und die Aktivität beizubehalten. Weiterhin zeigte das menschliche GnT-IVa-Enzym, das sowohl eine N-terminale als auch eine C-terminale Deletion aufwies, eine hohe GnT-IV-Aktivität (pCore+His). Dies zeigt, dass die bei dieser Mutante deletierten Bereiche für die GnT-IV-Aktivität nicht essentiell sind.

TABELLE 11
Reaktionszeit: 4,0 Stunden

Nach einer IPTG-Addition wurden die Zellen bei 25°C 4 Stunden kultiviert.

Die Aktivitätsverhältnisse sind in Prozent unter Bezugnahme auf die Gesamtaktivität von pMA4a+His, die als 100% angesetzt wird, ausgedrückt.

[BEISPIEL 12] UMWANDLUNG EINER ZUCKERKETTENVERZWEIGUNGSSTRUKTUR EINES REKOMBINANTEN ERYTHROPOIETINS (EPO) DURCH EINFÜHRUNG EINES RINDER- ODER MENSCHLICHEN GnT-IVa-GENS IN EPO-ERZEUGENDE CHO-ZELLEN (1) Einführung des GnT-IV-Expressionsplasmids in EPO-erzeugende CHO-Zellen

EPO-erzeugende CHO-Zellklone wurden gemäß den in der japanischen geprüften Patentveröffentlichung Nr. 2-17156 offenbarten Verfahren erzeugt.

Das GnT-IVa-Expressionsplasmid pBGT4 oder pHGT4-1 wurde in die resultierenden Zellklone MO1 und H-5 durch Elektroporation eingeführt. Bei der Einführung wurden 15 &mgr;g des Expressionsplasmids und 1,5 &mgr;g eines Arzneimittelresistenz-Markerplasmids (pSV2bsr von Kaken Pharmaceutical oder pMAMneo von Clontech) in der Mischung verwendet. Die elektroporierten Zellen wurden unter 10% CO2 für ungefähr 60 Stunden bei 37°C kultiviert. Dann wurde Blasticidin S (Kaken Pharmaceuticals) (Endkonzentration: 10 &mgr;g/ml) oder Geneticin (Life Technologies, Inc.) (Endkonzentration: 500 &mgr;g/ml) dem Medium zugefügt, worin die Zellen für weitere 10 Tage bis 2 Wochen kultiviert wurden. So wurden Klone, die gegen eines der beiden Arzneimittel resistent waren, isoliert.

(2) Bestätigung der Expression der eingeführten GnT-IV-Gene in EPO-erzeugenden CHO-Zellklonen

EPO-erzeugende CHO-Zellklone (Anfangsklone) und individuelle Arzneimittel-resistente Klone wurden in geeignetem Umfang kultiviert. Die gesamte RNA von jedem Klon wurde gereinigt. Dann wurde eine RNA-Dot-Blot-Analyse unter Verwendung eines Teils des GnT-IVa-Gens als Sonde durchgeführt, um dadurch die Menge der GnT-IVa-mRNA zu überprüfen. Weiterhin wurde die GnT-IV-Aktivität, exprimiert in den Anfangsklonen und den Arzneimittel-resistenten Klonen durch den in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Assay bestimmt. Diejenigen Klone, die ein starkes Signal in der RNA-Dot-Blot-Analyse ergaben und dennoch eine höhere GnT-IV-Aktivität als die Anfangsklone zeigten, wurden selektiert und für die EPO-Produktion verwendet. Die selektierten Klone hatten einer erhöhte GnT-IV-Aktivität; z.B. zeigte MO1(Rinder-GnT-IV)#36 einen ungefähr 104-fachen Anstieg gegenüber dem MO1-Klon und H-5(menschliches GnT-IV)#23 zeigte einen ungefähr 125-fachen Anstieg gegenüber dem H-5-Klon.

(3) Produktion von EPO unter Verwendung der EPO-erzeugenden CHO-Zellklone mit eingeführtem GnT-IV-Gen.

EPO wird sezerniert in die Kulturflüssigkeit exprimiert. Dann wurden die EPO-erzeugenden CHO-Zellklone M01 und H-5 und die oben erwähnten Klone M01(Rinder-GnT-IV)#36 und H5(menschliches GnT-IV)#23 in Rollflaschen kultiviert. Zunächst wurde jeder Klon in eine Wachstumsmedium Adhäsion-kultiviert und dann wurden 1,5 × 107 Zellen in eine 850 cm2 Rollflasche, enthaltend 200 ml Wachstumsmedium, übertragen. Die Zellen wurden unter 10% CO2 bei 37°C 3 Tage kultiviert, so dass sie einheitlich an die Flasche anhafteten. Danach wurde das Wachstumsmedium entfernt und die Zellen wurden mit PBS-Puffer gewaschen. Dann wurden 200 ml eines serumfreien Mediums der Flasche zugefügt, worin die Zellen unter 10% CO2 7 Tage bei 37°C kultiviert wurden. Danach wurde der Kulturüberstand wiedergewonnen.

Als Wachstumsmedium wurden D-MEM/F12 Mischmedium, supplementiert mit 5% fötalem Rinderserum, 290 mg/l L-Glutaminsäure, 1 × MEM nicht-essentieller Aminosäurelösung und 100 nM Methotrexat verwendet. Als serumfreies Medium wurde das obige Medium ohne fötales Rinderserum verwendet. EPO, enthalten in jedem der serumfreien Kulturüberstände, wurde quantitativ durch ELISA unter Verwendung eines anti-humanen EPO-Antikörpers bestimmt.

(4) Analyse von EPOs, erzeugt durch Klone mit oder ohne eingeführtes GnT-IV-Gen, basierend auf ihren Zuckerkettenstrukturen.

Ein rekombinantes EPO existiert nicht als einzelnes Molekül auf einem isoelektrischen Fokussierungsgel; es ist eine Mischung von Molekülen mit verschiedenen elektrischen Ladungen. Da sich der Proteinbestandteil nicht ändert wurde gezeigt, dass der Unterschied in der elektrischen Ladung bei diesen Molekülen auf den Unterschieden auf der Zuckerkettenstruktur basiert; eine solche Mischung von Molekülen wird Glycoforme genannt [Watson, E. und Yao, F., Anal. Biochem. (1993), 210, 389–93]. EPO weist drei Asn-gebundene Zuckerketten auf; die Verzweigungsstrukturen der individuellen Zuckerketten variieren von biantennär zu tetraantennär. Gal (Galactose) ist weiter an das Ende von jedem verzweigen GlcNAc angebunden und weiterhin bindet sich Sialinsäure an dieses Gal. Wenn daher der Grad der Zuckerkettenverzweigung durch Einführung des GnT-IV-Gens ansteigt, sollte die Anzahl der Sialinsäuremoleküle, die sich an das Gal anbinden, steigen und so sollte sich der Gehalt an Glycoformen mit einem niedrigen isoelektrischen Punkt vermehren. Dann führten die Erfinder eine Analyse durch isoelektrisches Fokussieren durch, um Veränderungen in der Zuckerkettenstruktur der EPOs nachzuweisen, erzeugt durch die EPO-erzeugenden Zellen mit eingeführtem GnT-IV-Gen.

Für die isoelektrische Fokussierung wurde eine Multiphor II-Ausrüstung, hergestellt von Pharmacia, verwendet. Das Gel bestand aus 5% Acrylamid (30:0,8) und 1,5% Pharmalyte 2,5 bis 5 (Pharmacia). Als (+)-Elektrodenlösung wurde eine 0,1 M Schwefelsäure verwendet. Als (–)-Elektrodenlösung wurde 0,2 M L-Histidin verwendet. Nach der isoelektrischen Fokussierung wurden die Proben elektrophoretisch auf eine PVDF-Membran übertragen, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Anti-EPO-Maus-monoklonalen Antikörpers, um die Banden von individuellen Glycoformen der EPOs nachzuweisen. Kurz gefasst, wurde der serumfreie Kulturüberstand von jedem Zellklon auf das ungefähr 7- bis 1.000-fache mit Centripus 30 und Microcon 30 (beide von Amicon hergestellt), falls nötig, konzentriert. Am Beginn wurden ungefähr 50 bis 100 IU EPO als Probe verwendet, jedoch wurde diese Menge in geeigneter Weise eingestellt, so dass die Intensitäten der durch Western-Blot-Analyse nachgewiesenen Banden zwischen den Proben ungefähr gleich sein würden.

Wenn das EPO des M01-Klons mit dem EPO des M01(Rinder-GnT-IV)#36-Klons verglichen wurde, wurde bestätigt, dass die Positionen der Hauptglycoformen im letzteren eine Verlagerung zur Nieder-pI-Seite (+-Elektrodenlösungsseite) um mindestens ein Glycoform zeigen (19). Aus diesem Ergebnis wird abgelesen, dass das als Ergebnis der Geneinführung exprimierte GnT-IV-Enzym die Anzahl der GlcNAc-Verzweigungen in den Asn-gebundenen Zuckerketten, die sich an das EPO anhaften, erhöhte, und so die Anzahl von Sialinsäuremolekülen, die sich anbinden, um den Gehalt an Glycoformen mit niedrigen isoelektrischen Punkten zu vermehren. Eine ähnliche Analyse wurde an dem H-5-Klon und H-5(menschlichem GnT-IV)#23-Klon durchgeführt. Im Ergebnis wurde ebenfalls gefunden, dass die Positionen der Haupt-EPO-Glycoformen in dem letzteren sich zu der niedrigen pI-Seite verlagern (19).

Aus dem obigen wurde demonstriert, dass es möglich ist, die Struktur der Asn-gebundenen Zuckerketten des Proteins zu modifizieren, erzeugt durch die Zelle, durch Einführung eines GnT-IV-Gens in irgendeine Zelle.

GEWERBLICHE ANWENBARKEIT

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden eine neue &bgr;1→4-N-Acetylglucosaminyltransferase (GnT-IV), ein Verfahren zur Erzeugung des GnT-IV-Enzyms und ein Gen, kodierend für das GnT-IV bereitgestellt. Mit dem GnT-IV der gegenwärtigen Erfindung wurde es möglich, ein Glycokonjugat mit einer Verzweigungsstruktur zu erzeugen, die durch konventionelle Glycosyltransferasen nicht gebildet werden konnte. So ist das GnT-IV der Erfindung nicht nur für die Erzeugung oder Verbesserung von Glycokonjugat-artigen Pharmazeutika, Reagenzien und Nahrungsmitteln nützlich, sondern auch für eine Modifikation der Zuckerkettenstruktur von irgendeinem Biopolymer.

Das GnT-IV-Gen der Erfindung ist auch für die Diagnose oder Behandlung von Erkrankungen, wie z.B. Krebs geeignet und für eine Modifikation der Zuckerkettenstruktur von Glycokonjugatprodukten, erzeugt durch Mikroorganismen.

Weiterhin ist ein Antikörper oder ein Antiserum, gezüchtet gegen das GnT-IV-Protein der Erfindung als Antigen oder ein Teil oder das gesamte erfindungsgemäße GnT-IV-Gen als Sonde für die einer Charakterisierung von Mikroorganismen, kultivierten Zellen, verschiedenen Tiergeweben, Blutzellen und Blut oder für die Diagnose von erkrankten Zellen oder Geweben, wie z.B. durch Krebs, nützlich.

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase mit einer Aktivität zur Erzeugung eines Saccharids mit einer Teilstruktur, dargestellt durch unten stehende Formel:
    unter Verwendung von UDP-GlcNAc als Zuckerdonor und einem Saccharid mit einer Teilstruktur, dargestellt durch die unten stehende Formel als Zuckerrezeptor:
  2. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase gemäß Anspruch 1, wobei die &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase die in den SEQ ID NO: 1 bis 14 dargestellten Aminosäuresequenzen als Teilsequenzen umfaßt.
  3. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase gemäß Anspruch 1, wobei das Saccharid als Zuckerrezeptor ein Oligosaccharid, Polysaccharid, Glycokonjugat (Glycopeptid, Glycoprotein, Glycolipid oder Proteoglycan) oder ein Derivat davon ist.
  4. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase gemäß Anspruch 1, wobei der Zuckerrezeptor ein Saccharid der durch die unten stehende Formel dargestellten Teilstruktur ist:
    worin

    R1: H-, Man &agr; 1→6 oder GlcNAC &bgr; 1→6

    R2: H-, Man &agr; 1→3 oder GlcNAC &bgr; 1→2

    R3: -OH oder &bgr; 1→4 GlcNAC →R4

    R4: -OH, -H, -Pyridylamin oder eine Peptidkette ist.
  5. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase, bestehend aus der in SEQ ID NO: 18 dargestellten Aminosäuresequenz oder der in SEQ ID NO: 18 dargestellten Aminosäuresequenz mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten und die dennoch &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Aktivität erzeugt.
  6. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase, bestehend aus einer Teilsequenz der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 18, beinhaltend mindestens die Reste von Position 93 bis 383 oder die Teilsequenz, die eine Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten aufweist und die dennoch &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Aktivität erzeugt.
  7. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase, bestehend aus der in SEQ ID NO: 24 dargestellten Aminosäuresequenz oder der in SEQ ID NO: 24 dargestellten Aminosäuresequenz mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten und die dennoch &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Aktivität erzeugt.
  8. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase, bestehend aus einer Teilsequenz der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 24, beinhaltend mindestens die Reste von Position 94 bis 383 oder die Teilsequenz, die eine Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten aufweist und die dennoch &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Aktivität erzeugt.
  9. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase, bestehend aus der in SEQ ID NO: 37 dargestellten Aminosäuresequenz oder der in SEQ ID NO: 37 dargestellten Aminosäuresequenz mit einer Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten und die dennoch &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Aktivität erzeugt.
  10. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase, bestehend aus einer Teilsequenz der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 37, beinhaltend mindestens die Reste von Position 91 bis 390 oder die Teilsequenz, die eine Addition, Deletion oder Substitution von ein oder mehr Aminosäureresten aufweist und die dennoch &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Aktivität erzeugt.
  11. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Gen, kodierend für die &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase gemäß einem der Ansprüche 5 bis 10.
  12. &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Gen, bestehend aus der in SEQ ID NO: 17, 23 oder 36 dargestellten Nukleotidsequenz.
  13. Rekombinante DNA, erhalten durch Insertion des &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Gens gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 in eine Vektor-DNA.
  14. Wirtszelle, die die rekombinante DNA gemäß Anspruch 13 trägt.
  15. Verfahren zur Reinigung der &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 aus biologischen Proben.
  16. Verfahren zur Erzeugung einer &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle gemäß Anspruch 14 in einem Medium und Gewinnung der &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase aus der resultierenden Kultur.
  17. Verfahren zur Erzeugung einer &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase, umfassend die Gewinnung der &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase aus Sekreten, einer Körperflüssigkeit oder einem Homogenat, abstammend von der Wirtszelle gemäß Anspruch 14.
  18. Verfahren zur Erzeugung einer sich verzweigenden Struktur einer Zuckerkette eines Glycoproteins, erzeugt durch eine Wirtszelle, umfassend das Einführen des &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Gens gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 in die Wirtszelle.
  19. Verfahren zur Modifikation einer sich verzweigenden Struktur einer Zuckerkette eines Glycoproteins, erzeugt durch eine Wirtszelle, umfassend das Einführen des &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase-Gens gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 in die Wirtszelle.
  20. Verfahren zur Erzeugung eines Saccharids mit einer Teilstruktur, dargestellt durch die unten stehende Formel:
    umfassend das Umsetzen von UDP-GlcNAc als Zuckerdonor mit einem Saccharid mit einer Teilstruktur, dargestellt durch die unten stehende Formel als Zuckerrezeptor:
    in Gegenwart von &bgr; 1→4 N-Acetylglucosaminyltransferase.
Es folgen 17 Blatt Zeichnungen






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B Arbeitsverfahren; Transportieren
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