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Neue Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen - Dokument DE102004024184A1
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE102004024184A1 26.01.2006
Titel Neue Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen
Anmelder BASF Plant Science GmbH, 67063 Ludwigshafen, DE
Erfinder Frank, Markus, Dr., 68163 Mannheim, DE;
Schmidt, Ralf-Michael, Dr., 67489 Kirrweiler, DE
DE-Anmeldedatum 13.05.2004
DE-Aktenzeichen 102004024184
Offenlegungstag 26.01.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 26.01.2006
IPC-Hauptklasse C12N 9/10(2006.01)A, F, I, ,  ,  ,   
IPC-Nebenklasse C12N 15/54(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      C12N 15/63(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      A01H 1/06(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      A01H 1/00(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      A01H 5/00(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      
Zusammenfassung Verfahren zur Erhöhung der Resistenz gegenüber Mesophyllzellen penetrierender Pathogene in einer Pflanze oder einem Organ, Gewebe oder einer Zelle davon, dadurch gekennzeichnet, dass die Kallose Synthase Aktivität in der Pflanze oder einem Organ, Gewebe oder einer Zelle davon im Vergleich zu Kontrollpflanzen reduziert wird.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft u.a. neue Polypeptide und für diese kodierende Nukleinsäuresequenzen aus Pflanzen sowie Expressionskassetten und Vektoren, die diese Sequenzen umfassen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung einer Pathogenresistenz in Pflanzen durch Verminderung der Expression mindestens eines Kallose-Synthase Polypeptids oder eines funktionellen Äquivalentes desselben.

Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteilhaften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No:487-96). Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze gegen Pathogene unzureichend. Allein Pilzerkrankungen führen zu Ernteverlusten in der Höhe von vielen Milliarden US-$ jährlich. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiele sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression von Bacillus thuringiensis Endotoxinen unter Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197). Die meisten der beschriebenen Ansätze gewähren jedoch nur eine Resistenz gegen ein einzelnes Pathogen oder gegen ein schmales Spektrum von Pathogenen.

Es gibt nur wenige Ansätze die Pflanzen eine Resistenz gegen Pathogene, vor allem Pilzpathogenen, verleihen. Dies liegt ursächlich in der Komplexität der betrachteten biologischen Systeme begründet. Dem Erreichen von Resistenzen gegenüber Pathogenen steht entgegen, dass die Wechselwirkungen zwischen Pathogen und Pflanze sehr komplex und äußerst arten- oder gattungsspezifisch sind. Dabei können als wesentliche Faktoren die große Anzahl unterschiedlicher Pathogene, die von diesen Organismen entwickelten verschiedenen Infektions-mechanismen und die von den Pflanzenstämmen, Familien und Arten entwickelten spezifischen Abwehrmechanismen angesehen werden.

Pilzpathogene haben im wesentlichen zwei ganz unterschiedliche Infektionsstrategien entwickelt. Manche Pilze dringen über die Spaltöffnungen in das Wirtsgewebe ein (z.B. Rostpilze, Septoria-, Fusarium-Arten) und penetrieren das Mesophyllgewebe, während andere über die Cuticula die darunterliegenden Epidermiszellen penetrieren (z.B. Blumeria Arten).

Infektionen führen in Pflanzen zur Ausbildung verschiedener Abwehrmechanismen. Diese Mechanismen können in Abhängigkeit vom betrachteten Pflanze/Pathogen-System sehr verschieden sein. So konnte gezeigt werden, dass Abwehrreaktionen gegen Epidermis penetrierende Pilze häufig mit der Ausbildung einer Penetrationsresistenz (Papillenbildung, Zellwandverdickungen mit Kallose als Hauptbestandteil) unterhalb der pilzlichen Penetrationshyphe beginnen, (Elliott et al. Mol Plant Microbe Interact. 15: 1069-77; 2002). Bisher wurden zur Erzeugung/Erhöhung von Resistenzen gegenüber Epidermis penetrierende Pilzpathogene verschiedene Ansätze beschrieben.

So soll durch Inhibierung der Expression des mlo Gens eine erhöhte Resistenz gegen zahlreiche Arten von Mehltau erzielt werden (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF et al. (1995) Plant Pathol 44:786-790). Die Mlo-bedingte Resistenz erfolge durch Papillenbildung (Zellwandverdickungen mit Kallose als Hauptbestandteil) unterhalb des Penetrationsortes des Pathogens, der epidermalen Zellwand. Nachteilig bei der Mlo-bedingten Pathogenresistenz ist, dass Mlo-defiziente Pflanzen – auch in Abwesenheit eines Pathogens – einen Abwehrmechanismus initiieren, der sich beispielsweise in einem spontanen Absterben von Blattzellen äußert (Wolter M et al. (1993) Mol Gen Genet 239:122-128), wodurch die erhöhte Suszeptibilität gegenüber nekrotrophe oder hemibiotrophe Pathogene erklärt werden kann.

Eine Steigerung der Pathogenabwehr in Pflanzen gegenüber nekrotrophe oder hemibiotrophe Pilzpathogene soll durch Erhöhung der Aktivität eines Bax Inhibitor-1 Proteins in Mesophyllgewebe von Pflanzen erreichbar sein.

Diese Ausbildung einer Penetrationsresistenz gegenüber Pathogenen deren Infektionsmechanismus eine Penetration der Epidermiszellen beinhaltet, ist möglicherweise insbesondere für monokotyledone Pflanzen von besonderer Bedeutung. Die Analyse von A.thaliana Pflanzen in denen die Expression der GSL-5 (kodiert für eine Kallose-Synthase) durch eine loss of function-Mutation (Nishimura et al. Science.2003 Aug 15;301 (5635):969-72) bzw. durch Induktion des Post Transcriptional Gene silencing (PTGS) unterdrückt wurde (Jacobs et al. Plant Cell. 2003 Nov; 15(11):2503-13.) hat gezeigt, dass diese Pflanzen eine stark reduzierte papilläre Kallosebildung und eine erhöhte Resistenz gegenüber Epidermis penetrierende virulente Mehltau-Spezies z.B Erysiphe cichoracearum aufweisen. Gleichzeitig zeigen diese Pflanzen eine leicht erhöhte Anfälligkeit gegenüber der ebenfalls die Epidermis penetrierende Echten Mehltau-Spezies Blumeria graminis.

Somit gibt es in monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen neben Gemeinsamkeiten, auch grundlegende Unterschiede bei den durch Pathogenbefall induzierten Abwehrreaktionen.

Die aus der Abwehrreaktion gegen Epidermis penetrierende Pathogene bekannte Penetrationsbarriere scheint bei Mesophyll-gewebe penetrierenden Pathogenen (z.B Roste, Septoria- oder Fusarium-Spezies) keine Bedeutung zu haben (z.B. Scharen, In Septoria and Stagonospora diseases of wheat, eds. Van Ginkel, McNab, pp.19-22). Derzeit ist keine Methode bekannt, mit der die Resistenz von Pflanzen gegenüber Pathogenen erzeugt werden kann, die Pflanzen durch Eindringen in pflanzliche Schließzellen mit folgender Penetration des Mesophyllgewebes infizieren.

Daher lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Methode zur Erzeugung einer Resistenz von Pflanzen gegen Mesophyllzellen penetrierende Pathogene bereitzustellen.

Die Lösung der Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.

Folglich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Resistenz gegenüber Mesophyllzellen penetrierende Pathogene in einer Pflanze, oder einem Organ, Gewebe oder einer Zelle davon, dadurch gekennzeichnet, dass die Kallose-Synthase Aktivität in der Pflanze oder einem Organ, Gewebe oder einer Zelle davon im Vergleich zu Kontrollpflanzen reduziert wird. In einer besonderen Ausführungsform sind die Pathogene ausgewählt aus den Familien der Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocreaceae.

Es ist es überraschend, dass die hier erfindungsgemäß offenbarten, für Kallose-Synthasen kodierenden cDNA-Sequenzen, z.B nach Gene Silencing via dsRNAi eine Erhöhung der Resistenz gegenüber Pilzpathogene zur Folge hat, die über Spaltöffnungen in Pflanzen eindringen und anschließend das Mesophyllgewebe penetrieren, insbesondere gegenüber Pathogenen aus den Familien Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocreaceae. Vorzugsweise handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyledone Pflanze.

Für die Kallose-Synthasen aus Gerste (Hordeum vulgare), Weizen (Triticum aestivum) und Mais (Zea mays) wird eine negative Kontrollfunktion bei einem Befall durch Mesophyllzellen penetrierende Pathogene angenommen. Die Verminderung einer Kallose-Synthase Expression in der Zelle durch einen sequenzspezifischen RNA-Interferenz Ansatz unter Verwendung doppelsträngiger Kallose-Synthase-dsRNA ("Gene-Silencing"), kann die Infektion des Mesophyllgewebes mit phytopathogenen Pilzen insbesondere der Familien Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocreaceae verringern.

In einer Ausführungsform erfolgt die Reduktion der Aktivität des Kallose Synthase Polypeptids Mesophyllgewebe-spezifisch, beispielsweise durch rekombinante Expression eines für besagtes Kallose-Synthase-Polypeptid kodierenden Nukleinsäuremoleküls zur Induktion eines Co-Suppressionseffektes unter Kontrolle eines Mesophyllgewebe spezifischen Promotors.

In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Verminderung der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion einer Kallose-Synthase in einer Pflanze kombiniert mit einer Erhöhung der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion eines Bax Inhibitor 1-Proteins (Bl-1), bevorzugt des Bax Inhibitor 1-Proteins aus Hordeum vulgare (GenBank Acc.-No.: AJ290421, SEQ ID NO: 37) oder des Bax Inhibitor 1-Proteins aus Nicotiana tabacum (GenBank Acc.-No.: AF390556, SEQ ID NO: 39). Dies kann beispielsweise durch Expression eines für ein Bax-Inhibitor-1 Polypeptid kodierenden Nukleinsäuremoleküls, z.B in Kombination mit einer gewebespezifischen Erhöhung der Aktivität eines Bax Inhibitor-1 Proteins im Mesophyllgewebe erfolgen. Die Reduktion der Kallose-Synthase Aktivität in einer transgenen Pflanze, die Bl-1 im Mesophyllgewebe überexprimiert, hat zur Folge, dass sowohl biotrophe als auch nektrotrophe Pilze erfolgreich abgewehrt werden können. Insofern bietet diese Kombination die Chance, eine umfassende Pilzresistenz in der Pflanze zu generieren. Nukleinsäuremoleküle, die für die Expression des Bl-1 geeignet sind, sind z.B. Bl1-Gene aus Reis (GenBank Acc.-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: AB025927), Tabak und Raps (GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N et al. (2003) Planta 216:377-386).

Da Kallosepolymere ein wichtiges Stoffwechselprodukt höherer Pflanzen darstellen und im Rahmen der Bildung von Pollen-schläuchen, Phragmoplasten, Papillen oder als Verschlussmasse für Zellwandporen, sowie in den Siebplatten der Phloem-Elemente synthetisiert werden, ist eine ubiquitäre Verbreitung von Kallose-Synthase Polypeptiden in Pflanzen zu vermuten. Aus diesem Grund kann das erfindungsgemäße Verfahren im Prinzip auf alle Pflanzenarten angewendet werden.

Die zu den im Rahmen dieser Erfindung offenbarten Kallose-Synthase Sequenzen homologen Sequenzen aus anderen Pflanzen können z.B. durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen-Banken – unter Verwendung der Kallose-Synthase Sequenzen als Suchsequenz vzw. Sonde, leicht aufgefunden werden.

"Pflanzen" im Rahmen der Erfindung meint alle dicotyledonen oder monokyledonen Pflanzen. Bevorzugt sind Pflanzen die unter der Klasse der Liliatae (Monocotyledoneae bzw. einkeimblättrige Pflanzen) subsumiert werden können. Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten.[Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.

"Pflanze" umfasst auch einjährige und mehrjährige dicotyledone oder monokotyledone Pflanzen und schließt, beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, solche der Gattungen, Bromus, Asparagus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum und Saccharum ein.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren auf monokotyle Pflanzen, beispielsweise aus der Familie der Poaceae, besonders bevorzugt auf die Gattungen Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, und Saccharum, ganz besonders bevorzugt auf Pflanzen mit landwirtschaftlicher Bedeutung, wie z.B. Hordeum vulgare (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Secale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) oder Oryza sative (Reis) angewendet.

„Mesophyllgewebe" meint das zwischen den Epidermisschichten liegende Blattgewebe, bestehend aus dem Palisadengewebe, dem Schwammgewebe und den Blattadern.

„Nukleinsäuren" meint Biopolymere aus Nukleotiden, die über Phosphodiesterbindungen miteinander verknüpft sind (Polynukleotide, Polynukleinsäuren). Je nach dem Zuckertyp in den Nukleotiden (Ribose oder Desoxyribose), unterscheidet man zwischen den beiden Klassen der Ribonukleinsäuren (RNA) und den Desoxyribonukleinsäuren (DNA).

Der Begriff „Ernte" meint alle durch landwirtschaftlichen Anbau von Pflanzen gewonnenen und im Rahmen des Erntevorgangs gesammelten Pflanzenteile.

Resistenz" meint das Vermindern oder Abschwächen von Krankheitssymptomen einer Pflanze infolge eines Befalls durch ein Pathogen. Die Symptome können vielfältiger Art sein, umfassen aber bevorzugt solche die direkt oder indirekt zu einer Beeinträchtigung der Qualität der Pflanze, der Quantität des Ertrages, der Eignung zur Verwendung als Futter- oder Nahrungsmittel führen oder aber auch Aussaat, Anbau, Ernte oder Prozessierung des Erntegutes erschweren.

"Verleihen, "bestehen", "erzeugen" oder "erhöhen einer Pathogenresistenz meint, dass die Abwehrmechanismen einer bestimmten Pflanzenart oder -sorte durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu dem Wildtyp der Pflanze („Kontrollpflanze" „Ausgangspflanze"), auf den das erfindungsgemäße Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonsten gleichen Bedingungen (wie beispielsweise Klima- oder Anbaubedingungen, Pathogenart etc.) eine erhöhte Resistenz gegen ein und mehr Pathogene aufweist. Dabei äußert sich die erhöhte Resistenz bevorzugt in einer verminderten Ausprägung der Krankheitssymptome, wobei Krankheitssymptome – neben den oben erwähnten Beeinträchtigungen – auch beispielsweise die Penetrationseffizienz eines Pathogens in die Pflanze oder pflanzliche Zelle oder die Proliferationseffizienz in oder auf denselben umfasst. Dabei sind die Krankheitssymptome bevorzugt um mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 % oder 95 % vermindert.

"Pathogen" meint im Rahmen der Erfindung Organismen, deren Interaktionen mit einer Pflanze zu den oben beschriebenen Kranheitssymptomen führen, insbesondere meint Pathogene Organismen aus dem Reich der Pilze. Vorzugsweise wird unter Pathogen ein Mesophyllgewebe penetrierendes Pathogen verstanden, besonders bevorzugt Pathogene die über Spaltöffnungen in Pflanzen eindringen und anschließend das Mesophyllgewebe penetrieren. Bevorzugt sind dabei Organismen der Stämme Ascomycota und Basidomycota genannt. Besonders bevorzugt sind dabei die Familien Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocreaceae.

Besonders bevorzugt sind Organismen dieser Familien, die zu den Gattungen Puccinia, Fusarium oder Mycosphaerella zählen.

Ganz besonders bevorzugt sind die Arten Puccinia triticina, Puccinia striiformis, Mycosphaerella graminicola, Stagonospora nodorum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae und Microdochium nivale.

Es ist jedoch anzunehmen, dass die Verminderung der Expression eines Kallose-Synthase Polypeptids, seiner Aktivität oder Funktion auch eine Resistenz gegen weitere Pathogene bewirkt. Veränderungen in der Zellwandstruktur können einen grundlegenden Mechanismus der Pathogenresistenz darstellen.

Besonders bevorzugt sind Ascomycota wie z.B. Fusarium oxysporum (Fusarium-Welke an Tomate), Septoria nodorum und Septoria tritici (Spelzenbräune an Weizen), Basidiomyceten wie z.B Puccinia graminis (Schwarzrost an Weizen, Gerste, Roggen, Hafer), Puccinia recondita (Braunrost an Weizen), Puccinia dispersa (Braunrost an Roggen), Puccinia hordei (Braunrost an Gerste), Puccinia coronata (Kronenrost an Hafer).

In einer Ausführungsform führt das erfindungsgemäße Verfahren zu einer Resistenz bei

Gerste gegen das Pathogen:

Puccinia graminis f.sp. hordei (barley stem rust),

bei Weizen gegen die Pathogene:

Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae oder Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat stem rust),

bei Mais gegen die Pathogene:

Fusarium moniliforme var. subglutinans, Puccinia sorghi oder Puccinia polysora,

bei Sorghum gegen die Pathogene:

Puccinia purpurea, Fusarium monilifonne, Fusarium graminearum oder Fusarium oxysporum.

"Kallose-Synthase Polypeptid" meint im Rahmen der Erfindung ein Protein mit der unten genannten Aktivität. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Kallose-Synthase Polypeptid, z.B ein Kallose-Synthase Polypeptid aus Gerste gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 und/oder sein Homolog aus Mais (Zea mays) SEQ ID NO: 10, 11, 13, 15, 17 und/oder aus Reis (Oryza sative) gemäß SEQ ID NO: 19, 21 und/oder Weizen (Triticum aestivum) gemäß SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31 und/oder 33 und/oder A.thaliana SEQ ID NO: 34 oder ein Fragment davon. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung funktionelle Äquivalente der vorgenannten Polypeptidsequenzen.

"Polypeptidmenge" meint beispielsweise die Anzahl an Kalloses Synthase Polypeptiden in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment. "Verminderung" der Polypeptidmenge meint die mengenmäßige Verminderung der Anzahl an Kallose-Synthase Polypeptiden in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment – beispielsweise durch eines der unten beschriebenen Verfahren – im Vergleich zu dem Wildtyp (Kontrollpflanze) derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc.). Der Verminderung beträgt dabei mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt mindestens 90 % oder 99 %.

"Aktivität" oder "Funktion" eines Kallose-Synthase Polypeptids meint die Bildung oder Synthese von linearen &bgr;-1→3 glykosidisch verknüpften Glucanpolymeren, die auch 1→6 glykosidisch bzw. 1→4 glykosidisch verknüpfte Verzweigungen aufweisen können (Kallosepolymere).

"Verminderung" der Aktivität oder Funktion einer Kallose-Synthase meint beispielsweise die Verminderung der Fähigkeit Kallosepolymere in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ zu synthetisieren oder zu verlängern – beispielsweise durch eines der unten beschriebenen Verfahren – im Vergleich zu dem Wildtyp derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc.). Die Verminderung beträgt dabei mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 %, 95 % oder mehr. Unter Verminderung ist auch die Veränderung der Substratspezifität zu verstehen, wie sie beispielsweise durch den kcat/Km-Wert ausgedrückt werden kann. Der Verminderung beträgt dabei mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20%, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 %, 95% oder mehr.

Verfahren zum Nachweis der in Folge von biotischen oder abiotischen Streß gebildeten Kallosepolymere sind dem Fachmann bekannt und vielfach beschrieben (u.a. Jacobs et al., The Plant Cell, Vol. 15, 2503-13, 2003; Desprez et al.,Plant Physiology, 02. 2002, Vol. 128, pp. 482-490). Kalloseeinlagerungen können in Gewebeschnitten durch z.B. Färbung mit Anilinblau sichtbar gemacht werden. Die mit Anilinblau gefärbte Kallose ist an der gelben, durch UV Licht induzierten, Fluoreszenz des Anilinblau Fluorochromes erkenntlich.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Erzeugung einer Pathogenresistenz durch Verminderung der Funktion, Aktivität oder Polypeptidmenge mindestend eines Kallose-Synthase Polypeptids umfassend die Sequenzen gezeigt in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 und/oder eines Polypeptids das zu diesen eine Homologie von mindestens 40 % aufweist und/oder eines funktionellen Äquivalentes der vorgenannten Polypeptide.

Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird: Gap Weight: 50 Length Weight: 3 Average Match: 10 Average Mismatch: 0

Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.

Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird: Gap Weight: 8 Length Weight: 2 Average Match: 2,912 Average Mismatch: –2,003

Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Polypeptidbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die der Pflanze, dem pflanzlichen Organ, Gewebe oder der Zelle zur Verfügung stehende Kallose-Synthase Aktivität dadurch reduziert, dass die Aktivität, Funktion oder Polypeptidmenge mindestens eines Polypeptids in der Pflanze, dem pflanzlichen Organ, Gewebe oder der Zelle reduziert wird, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

  • a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 gezeigte Sequenz;
  • b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest einPolynukleotid der Sequenz nach der SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 umfasst;
  • c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 aufweist;
  • d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 kodiert;
  • e) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; und
  • f) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Kallose-Synthase, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente bestehend aus mindestens 15 Nukleotiden (nt), vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt hybridisiert;
  • g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Kallose-Synthase, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungs-bedingungen isoliert werden kann;
eine komplementäre Sequenz davon umfasst, oder ein funktionelles Äquivalent darstellt.

Vorzugsweise wird die Aktivität der genannten Polypeptide in den Mesophyllzellen einer Pflanze wie oben erläutert reduziert.

Unter "Epitop" versteht man die die Spezifität der Antikörper bestimmenden Bereiche eines Antigens (die antigene Determinante).

Ein Epitop ist demnach der Teil eines Antigens, der tatsächlich mit dem Antikörper in Kontakt tritt.

Solche antigenischen Determinaten sind die Bereiche eines Anitgens auf welches die T-Zell Rezeptoren reagieren und in der Folge Antikörper produzieren, die spezifisch die Antigene- Determinante/Epitop eines Antigens binden. Antigene bzw. deren Epitope sind demnach in der Lage, die Immunantwort eines Organismus mit der Folge der Bildung spezifischer -gegen das Epitop gerichtete- Antikörper zu induzieren. Epitope bestehen z.B. aus linearen Abfolgen von Aminosäuren in der Primärstruktur von Proteinen, oder aus komplexen sekundären oder tertiären Proteinstrukturen. Unter einem Hapten versteht man ein aus dem Kontext der Antigenumgebung herausgelöstes Epitop. Obwohl Haptene per Definition einen Antikörper gegen sich gerichtet haben, sind Haptene unter Umständen nicht in der Lage nach z.B. Injektion in einen Organismus eine Immunantwort zu induzieren. Zu diesem Zweck werden Haptene an Trägermoleküle gekoppelt. Als Beispiel sei Dinitrophenol (DNP) genannt, welches nach Kopplung an BSA (bovine serum albumine) zur Herstellung von Antikörpern gerichtet gegen DNP verwendet wurde. (Bohn, A., König, W. 1982)

Haptene sind daher (oft kleinmolekulare) Substanzen, die selbst keine Immunreaktion auslösen, aber sehr wohl, wenn sie an einen großmolekularen Träger gekoppelt wurde. Unter den so erzeugten Antikörpern finden sich auch solche, die das Hapten alleine binden können.

Antikörper im Rahmen der vorliegenden Erfindung können zur Identifikation und Isolierung von erfindungsgemäß offenbarten Polypeptiden aus Organismen, bevorzugt Pflanzen, besonders bevorzugt monokotyledone Pflanzen verwendet werden. Die Antikörper können sowohl monoclonal, polyclonal, synthetischer Natur sein, oder aus Antikörperfragmenten wie Fab, Fv oder scFv Fragmenten bestehen, die durch proteolytischen Abbau entstehen. "Single chain" Fv (scFv) Fragmente sind einkettige Fragmente, die verbunden über eine flexible Linkersequenz, nur die variablen Bereiche der schweren und leichten Antikörperketten enthalten. Solche scFv Fragmente können auch als rekombinate Antikörperderivate produziert werden. Eine Präsentation solcher Antikörperfragmente auf der Oberfläche filamentöser Phagen ermöglicht die direkte Selektion hochaffin bindender scFv-Moleküle aus kombinatorischen Phagenbibliotheken.

Monoclonale Antikörper können gemäß der von Köhler und Milstein beschriebenen Methode gewonnen werden (Nature 256 (1975), 495).

"Funktionelle Äquivalente" eines Kallose-Synthase Polypeptids meint bevorzugt solche Polypeptide, die zu den durch die Sequenzen SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 beschriebenen Polypeptiden eine Homologie von mindestens 40% aufweisen und im wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweisen oder Funktion besitzen.

"Im wesentlichen gleiche Eigenschaften" eines funktionellen Äquivalentes meint vor allem die Verleihung eines pathogenresistenten Phänotypes oder die Verleihung oder Steigerung der Pathogenresistenz gegen zumindest ein Pathogen bei Verminderung der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion des besagten funktionellen Kallose-Synthase Äquivalentes in einer Pflanze, Organ, Gewebe, Teil oder Zellen, insbesondere in Mesophyllzellen derselben.

Dabei kann die Effizienz der Pathogenresistenz sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Wert erhalten bei Verminderung eines der Kallose-Synthase Polypeptide gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 abweichen. Bevorzugt sind solche funktionellen Äquivalente, bei denen die Effizienz der Pathogenresistenz – gemessen beispielsweise an der Penetrationseffizienz eines Pathogens – um nicht mehr als 50 %, bevorzugt 25 %, besonders bevorzugt 10 % von einem Vergleichswert abweicht, der erhalten wird

durch Verminderung eines Kallose-Synthase-Polypeptids gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, bei deren Verminderung die Effizienz der Pathogenresistenz quantitativ um mehr als 50 %, bevorzugt 100 %, besonders bevorzugt 500 %, ganz besonders bevorzugt 1000 % einen Vergleichswert erhalten bei Verminderung eines der Kallose-Synthase-Polypeptid gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 übersteigt.

Der Vergleich wird bevorzugt unter analogen Bedingungen durch geführt.

"Analoge Bedingungen" bedeutet, dass alle Rahmenbedingungen wie beispielsweise Kultur- oder Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate, Pathogenkonzentration etc.) zwischen den zu vergleichenden Versuchen identisch gehalten werden und die Ansätze sich allein durch die Sequenz der zu vergleichenden Kallose-Synthase-Polypeptide, ihrem Ursprungs-organismus und gegebenenfalls dem Pathogen unterscheiden.

"Funktionelle Äquivalente" meint auch natürliche oder künstliche Mutationsvarianten der Kallose-Synthase-Polypeptide gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 sowie homologe Polypeptide aus anderen monokotyledonen Pflanzen, welche weiterhin im wesentlichen gleiche Eigenschaften aufweisen. Bevorzugt sind homologe Polypeptide aus oben beschriebenen bevorzugten Pflanzen. Die zu den im Rahmen dieser Erfindung offenbarten Kallose-Synthase Sequenzen homologen Sequenzen aus anderen Pflanzen (beispielsweise Oryza sative) können z.B. durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen-Banken – unter Verwendung der Kallose-Synthase -Sequenzen als Suchsequenz vzw. Sonde – leicht aufgefunden werden.

Funktionelle Äquivalente können z.B. auch von einem der erfindungsgemäßen Polypeptid gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitet sein und zu diesen Polypeptiden eine Homologie von mindestens 60 %, bevorzugt mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 98 % aufweisen und zeichnen sich durch im wesentlichen gleiche Eigenschaften wie die Polypeptid gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 aus.

Funktionelle Äquivalente sind auch von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitete Nukleinsäuremoleküle, und haben eine Homologie von mindestens 60 %, bevorzugt 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 98 % zu einem der erfindungsgemäßen Polynukleotide gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 und kodieren für Polypeptide mit im wesentlichen identischen Eigenschaften wie Polypeptide gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 oder 35.

Beispiele für die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu vermindernden funktionellen Äquivalente der Kallose-Synthasen gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 lassen sich beispielsweise aus Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, beispielsweise aus Oryza sative durch Homologievergleiche aus Datenbanken auffinden.

Auch die Durchmusterung von cDNA- oder genomischen-Bibliotheken anderer Organismen, bevorzugt von den weiter unten genannten als Wirt zur Transformation geeigneten Pflanzenarten, unter Verwendung der unter SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 beschriebene Nukleinsäuresequenz oder Teilen derselben als Sonde, ist ein dem Fachmann geläufiges Verfahren, um Homologe in anderen Arten zu identifizieren. Dabei haben die von der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 abgeleiteten Sonden eine Länge von mindestens 20 bp, bevorzugt mindestens 50 bp, besonders bevorzugt mindestens 100 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 bp, am meisten bevorzugt mindestens 400 bp. Die Sonde kann auch ein oder mehrere Kilobasen lang sein, z.b. 1 Kb, 1,5 Kb oder 3 Kb. Für die Durchmusterung der Bibliotheken kann auch ein zu den unter SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 beschriebenen Sequenzen komplementärer DNA-Strang, oder ein Fragment desselben mit einer Länge zwischen 20 Bp und mehreren Kilobasen eingesetzt werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch solche DNA Moleküle verwendet werden, die unter Standardbedingungen mit den durch SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30; 32 und/oder 34 beschriebenen und für Kallose-Synthasen kodierenden Nukleinsäuremoleküle, der zu diesen komplementären Nukleinsäuremolekülen oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und als vollständige Sequenzen für Polypeptide kodieren, die über die gleichen Eigenschaften wie die unter SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 beschriebenen Polypeptide verfügen.

"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint je nach Anwendung stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.

Der Fachmann würde Hybridisierungsbedingungen auswählen, die es ihm ermöglichen, spezifische von unspezifischen Hybridisierungen zu unterscheiden.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus Bedingungen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3M Natriumcitrat, 3M NaCl, pH 7.0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig oder auch einzeln variiert werden, wobei der jeweils andere Parameter konstant gehalten wird. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:

  • 1. Hybridisierungbedingungen können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:

    a) 4X SSC bei 65°C,

    b) 6X SSC bei 45°C,

    c) 6X SSC, 100 &mgr;g/ml denaturierter, fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C,

    d) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 &mgr;g/ml denaturierter, Lachsspenna-DNA bei 68°C,

    e) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 &mgr;g/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50 % Formamid bei 42°C.

    f) 50 % Formamid, 4XSSC bei 42°C, oder

    g) 50 % (vol/vol) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrate bei 42°C, oder

    h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung),

    30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung).

    500 mN Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 7 % SDS (g/V), 1mM EDTA, 10 &mgr;g/ml single stranded DNA, 0,5% BSA (g/V) (Church und Gilbert, Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A.81:1991. 1984)
  • 2. Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:

    a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % SDS bei 50°C.

    b) 0.1X SSC bei 65°C.

    c) 0,1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C.

    d) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C.

    e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C.

    f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).

In einer Ausführungsform werden die Hybridisierungsbedingungen wie folgt gewählt:

Es wird ein Hybridisierungspuffer gewählt, der Formamid, NaCl und PEG 6000 enthält. Die Anwesenheit von Formamid im Hybridisierungspuffer destabilisiert Doppelstrang Nukleinsäure-moleküle, wodurch die Hybridisierungstemperatur auf 42°C gesenkt werden kann, ohne dadurch die Stringenz zu erniedrigen. Die Verwendung von Salz im Hybridisierungspuffer erhöht die Renaturierungsrate einer Duplex, bzw. die Hybridisierungs-effizienz. Obwohl PEG die Viskosität der Lösung erhöht, was einen negativen Einfluß auf Renaturierungsraten besitzt, wird durch die Anwesenheit des Polymers in der Lösung die Konzentration der Sonde im verbleibenden Medium erhöht, was die Hybridisierungsrate steigert. Die Zusammensetzung des Puffers ist wie folgt:

Die Hybridisierungen werden bei 42°C über Nacht durchgeführt. Die Filter werden am nächsten Morgen 3x mit 2 × SSC + 0,1 % SDS für jeweils ca. 10 min. gewaschen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Erhöhung der Resistenz in dem erfindungsgemäßen Verfahren, dadurch erzielt, dass

  • a) die Expression mindestens einer Kallose-Synthase reduziert wird;
  • b) die Stabilität mindestens einer Kallose-Synthase oder der zu dieser Kallose-Synthase korrespondierenden mRNA Moleküle reduziert wird;
  • c) die Aktivität mindestens einer Kallose-Synthase reduziert wird;
  • d) die Transkription mindestens eines der für eine Kallose-Synthase kodierenden Gene durch Expression eines endogenen oder artifiziellen Transkriptions-faktors reduziert wird; oder
  • e) ein exogener die Kallose-Synthase Aktivität reduzierender Faktor zu der Nahrung oder dem Medium hinzugegeben wird.

Genexpression und Expression sind synomym zu verwenden und meinen das Realisieren der Information, die in einem Nukleinsäuremolekül gespeichert ist. Die Verminderung der Expression eines Kallose- Synthase-Gens umfaßt daher die Reduktion der Polypeptidmenge dieses Kallose-Synthase-Polypeptids, der Kallose-Synthase-Aktivität oder der Kallose-Synthase-Funktion. Die Reduktion der Genexpression eines Kallose-Synthase-Gens kann auf vielfältige Art und Weise -beispielsweise durch eine der unten aufgeführten Methoden- realisiert werden.

"Reduktion", „Verminderung" oder "vermindern" ist im Zusammenhang mit einem Kallose-Synthase Polypeptid, einer Kallose-Synthase Aktivität oder Kallose-Synthase Funktion weit auszulegen und umfasst die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Funktionalität eines Kallose-Synthase Polypeptids in einer Pflanze oder einem davon abgeleiteten Teil, Gewebe, Organ, Zellen oder Samen.

Eine Verminderung im Sinne der Erfindung umfasst auch eine mengenmäßige Verringerung eines Kallose-Synthase Polypeptids bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen des Kallose-Synthase Polypeptids (d.h. fehlende Nachweisbarkeit von Kallose-Synthase Aktivität bzw. Kallose-Synthase Funktion oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit des Kallose-Synthase Polypeptids und auch reduzierter Kalloseeinlagerungen infolge eines Pathogenbefalls). Dabei wird die Expression eines bestimmten Kallose-Synthase Polypeptids oder die Kallose-Synthase Aktivität bzw. Kallose-Synthase Funktion in einer Zelle oder einem Organismus bevorzugt um mehr als 50 %, besonders bevorzugt um mehr als 80 %, ganz besonders bevorzugt um mehr als 90%, im Vergleich zu dem Wildtyp derselben Gattung und Art („Kontrollpflanze") auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc.), vermindert.

Erfindungsgemäß sind verschiedene Strategien zur Verminderung der Expression eines Kallose-Synthase Polypeptids, der Kallose-Synthase Aktivität oder Kallose-Synthase Funktion beschrieben. Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe weiterer Methoden zur Verfügung stehen, um die Expression eines Kallose-Synthase Polypeptids, die Kallose-Synthase Aktivität oder die Kallose-Synthase Funktion in gewünschter Weise zu beeinflussen.

In einer Ausführungsform wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Verminderung der Kallose-Synthase Aktivität erreicht durch Anwendung mindestens eines Verfahrens aus der Gruppe ausgewählt aus:

  • a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für Ribonukleinsäuremoleküle geeignet zur Bildung von Doppelstrang-Ribonukleinsäuremolekülen (dsRNA), wobei der Sense-Strang des dsRNA-Moleküls mindestens eine Homologie von 30% zu dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, beispielsweise zu einem der Nukleinsäuremoleküle gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 aufweist oder ein Fragment von mindestens 17 Basenpaaren umfasst, welches mindestens eine 50% Homologie zu einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, beispielsweise gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34, oder einem funktionellen Äquivalent derselben aufweist, oder einer deren Expression gewährleistende Expressionskassette oder Expressionskassetten.
  • b) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Antisense-Ribonukleinsäuremolekül welches zumindest eine Homologie von 30% zum nicht kodierenden Strang eines der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, beispielsweise einem Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 aufweist oder ein Fragment von mindestens 15 Basenpaaren umfasst, welches mindestens eine 50% Homologie zu einem nicht kodierenden Strang eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, beispielsweise gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 oder einem funktionellen Äquivalent derselben aufweist. Umfasst sind solche Verfahren, bei denen die antisense-Nukleinsäuresequenz gegen ein Kallose-Synthase -Gen (also genomische DNA-Sequenzen) oder ein Kallose-Synthase -Gentranskript (also RNA-Sequenzen) gerichtet ist. Umfasst sind auch &agr;-anomere Nukleinsäuresequenzen.
  • c) Einbringen eines Ribozyms welches spezifisch die von einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, beispiels-weise gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 oder von deren funktionellen Äquivaltenten kodierten Ribonukleinsäure-moleküle spaltet, z.B. katalytisch, oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressions-kassette.
  • d) Einbringen eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls wie in b) spezifiziert, kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette.
  • e) Einbringen von Nukleinsäuremolekülen kodierend für Sense-Ribonukleinsäuremoleküle eines erfindungsgemäßen Polypeptides, beispielsweise gemäß den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 oder für Polypeptide die zumindest eine 40% Homologie zu der Aminosäure-sequenz eines erfindungsgemäßen Proteins aufweisen, oder ein funktionelles Äquivalent desselben darstellt.
  • f) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein dominant-negatives Polypeptid geeignet zur Unterdrückung der Kallose-Synthase Aktivität oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette.
  • g) Einbringen eines Faktors, der spezifisch Kallose-Synthase Polypeptide oder die für diese kodierenden DNA- oder RNA-Moleküle binden kann oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette.
  • h) Einbringen eines viralen Nukleinsäuresmoleküls, das einen Abbau von für Kallose-Synthasen kodierende mRNA Moleküle bewirkt oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette.
  • i) Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts geeignet zur Induktion einer homologen Rekombination an Genen kodierend für Kallose-Synthasen.
  • j) Einführung einer oder mehr Mutationen in ein oder mehr für Kallose-Synthasen kodierende Gene zur Erzeugung eines Funktionsverlustes (z.B. Generierung von Stopp-Kodons, Verschiebungen im Leseraster etc.)

Jedes einzelne dieser Verfahren kanneine Verminderung der Kallose-Synthase Expression, Kallose-Synthase Aktivität oder Kallose-Synthase Funktion im Sinne der Erfindung bewirken. Auch eine kombinierte Anwendung ist denkbar. Weitere Methoden sind dem Fachmann bekannt und können die Behinderung oder Unterbindung der Prozessierung des Kallose-Synthase Polypeptids, des Transports des Kallose-Synthase Polypeptids oder dessen mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA-Spleißens, Induktion eines Kallose-Synthase RNA abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Translationselongation oder -termination umfassen.

Eine Verminderung der Kallose-Synthase Aktivität, Funktion oder -Polypeptidemenge wird bevorzugt durch eine verminderte Expression eines endogenen Kallose-Synthase Gens erreicht.

Die einzelnen bevorzugten Verfahren seien infolge kurz beschrieben:

a) Einbringung einer doppelsträngigen Kallose-Synthase RNA-Nukleinsäuresequenz (Kallose-Synthase dsRNA)

Das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double-stranded RNA interference"; dsRNAi) ist vielfach in tierischen und pflanzlichen Organismen beschrieben (z.B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Eine effiziente Gensuppression kann auch bei transienter Expression oder nach transienter Transformation beispielsweise infolge einer biolistischen Transformation gezeigt werden (Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). dsRNAi-Verfahren beruhen auf dem Phänomen, dass durch gleichzeitiges Einbringen von komplementären Strang- und Gegenstrang eines Gentranskriptes eine hocheffiziente Unterdrückung der Expression des entsprechenden Gens bewirkt wird. Der bewirkte Phänotyp kommt dem einer entsprechenden knock-out Mutanten sehr ähnlich (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:13959-64).

Das dsRNAi-Verfahren hat sich bei der Verminderung der Kallose-Synthase-Expression als besonders effizient und vorteilhaft erwiesen (WO 99/32619).

In Bezug auf die doppelsträngigen RNA-Moleküle meint Kallose-SynthaseNukleinsäuresequenz bevorzugt eine der Sequenzen gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34, oder Sequenzen die zu diesen im wesentlichen identisch sind, vorzugsweise mindestens 50 %, 60 %, 70 %, 80 % oder 90 % oder mehr, beispielsweise ungefähr 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder mehr, oder Fragmente davon, die mindestens 17 Basenpaare lang sind. "Im wesentlichen identisch" meint, dass die dsRNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der Kallose-Synthase Zielsequenz aufweisen kann und dennoch eine effizient Verminderung der Expression bewirken. In einer Ausführungsform beträgt die Homologie nach obiger Definition mindestens 50 %, beispielsweise ungefähr 80 %, oder ungefähr 90 %, oder ungefähr 100 % zwischen dem "sense"-Strang einer inhibitorischen dsRNA und einem Teilabschnitt einer Kallose-Synthase Nukleinsäuresequenz (bzw. zwischen dem "antisense"-Strang und dem komplementären Strang einer Kallose-Synthase Nukleinsäuresequenz). Die Länge des Teilabschnittes beträgt ungefähr 17 Basen oder mehr, beispielsweise ungefähr 25 Basen, oder ungefähr 50 Basen, ungefähr 100 Basen, ungefähr200 Basen oder ungefähr 300 Basen. Alternativ, kann eine "im wesentlichen identische" dsRNA auch als Nukleinsäuresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil eines Kallose-Synthase Gentranskriptes unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren.

Auch der "antisense"-RNA-Strang kann Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu dem Komplement des "sense"-RNA-Stranges aufweisen. Bevorzugt beträgt die Homologie mindestens 80 %, beispielsweiseungefähr 90 %, oder ungefähr 95 %, oder ungefähr 100 % zwischen dem "antisense"-RNA-Strang und dem Komplement des "sense"-RNA-Strangs.

"Teilabschnitt des "sense"-RNA-Transkriptes" eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Kallose-Synthase Polypeptid oder ein funktionelles Äquivalent desselben meint Fragmente einer RNA oder mRNA transkibiert von einer für ein Kallose-Synthase Polypeptid oder ein funktionelles Äquivalent desselben kodierenden Nukleinsäuremoleküls, bevorzugt von einem Kallose-Synthase Gen. Dabei haben die Fragmente bevorzugt eine Sequenzlänge von ungefähr 20 Basen oder mehr, beispielsweise ungefähr 50 Basen, oder ungefähr 100 Basen, oder ungefähr 200 Basen, oder ungefähr 500 Basen. Umfasst ist auch die vollständige transkribierte RNA oder mRNA.

Die dsRNA kann aus einem oder mehr Strängen polymerisierter Ribonukleotide bestehen. Es können ferner Modifikationen sowohl des Zucker-Phosphat-Gerüstes als auch der Nukleoside vorliegen. Beispielsweise können die Phosphodiesterbindungen der natürlichen RNA dahingehend modifiziert sein, dass sie zumindest ein Stickstoff oder Schwefel-Heteroatom umfassen. Basen können dahingehend modifiziert werden, dass die Aktivität beispielsweise von Adenosindeaminase eingeschränkt wird. Solche und weitere Modifikationen sind weiter unten bei den Verfahren zur Stabilisierung von antisense-RNA beschrieben.

Natürlich können, um den gleichen Zweck zu erreichen, auch mehrere individuelle dsRNA Moleküle, die jeweils einen der oben definierten Ribonukleotidsequenzabschnitte umfassen, in die Zelle oder den Organismus eingebracht werden.

Die dsRNA kann enzymatisch oder ganz oder teilweise chemisch-synthetisch hergestellt werden.

Sollen die zwei Stränge der dsRNA in einer Zelle oder Pflanze zusammengebracht werden, so kann dies auf verschiedene Art geschehen:

  • a) Transformation der Zelle oder Pflanze mit einem Vektor, der beide Expressionskassetten umfasst,
  • b) Kotransformation der Zelle oder Pflanze mit zwei Vektoren, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst, und/oder
  • c) Kreuzung von zwei Pflanzen, die mit jeweils einem Vektor transformiert wurden, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst.

Die Bildung der RNA Duplex kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden. Wie in WO 99/53050 beschrieben, kann die dsRNA auch eine Haarnadelstruktur umfassen, indem "sense"- und "antisense"-Strang durch einen "Linker" (beispielsweise ein Intron) verbunden werden. Die selbstkomplementären dsRNA-Strukturen sind bevorzugt, da sie lediglich die Expression eines Konstruktes erfordern und die komplementären Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen.

Die Expressionskassetten kodierend für den "antisense"- oder "sense"-Strang einer dsRNA oder für den selbstkomplementären-Strang der dsRNA, werden bevorzugt in einen Vektor insertiert und mit den unten beschriebenen Verfahren stabil (beispielsweise unter Verwendung von Selektionsmarkern) in das Genom einer Pflanze insertiert, um eine dauerhafte Expression der dsRNA zu gewährleisten.

Die dsRNA kann unter Verwendung einer Menge eingeführt werden, die zumindest ein Kopie pro Zelle ermöglicht. Höhere Mengen (z.B. mindestens 5, 10, 100, 500 oder 1000 Kopien pro Zelle) können ggf. eine effizienter Verminderung bewirken.

Eine 100 %ige Sequenzidentität zwischen dsRNA und einem Kallose-Synthase Gentranskript oder dem Gentranskript eines funktionell äquivalenten Gens ist nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der Kallose-Synthase Expression zu bewirken. Demzufolge besteht der Vorteil, dass das Verfahren tolerant ist gegenüber Sequenzabweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Polymorphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. Die hohe Sequenzhomologie zwischen den Kallose-Synthase Sequenzen aus Reis, Mais und Gerste lässt auf einen hohen Konservierungsgrad dieses Polypeptids innerhalb von Pflanzen schließen, so dass die Expression einer dsRNA abgeleitet von einer der offenbarten Kallose-Synthase Sequenzen gemäß SEQ SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 oder 34 auch einen vorteilhaften Effekt in anderen Pflanzenarten haben dürfte.

Auch ist es aufgrund der hohen Homologie zwischen den einzelnen Kallose-Synthase Polypeptiden und ihren funktionellen Äquivalenten möglich, mit einer einzigen dsRNA, die ausgehend von einer bestimmten Kallose-Synthase Sequenz eines Organismus generiert wurde, die Expression weiterer homologer Kallose-Synthase Polypeptide und/oder deren funktioneller Äquivalente des gleichen Organismus oder aber auch die Expression von Kallose-Synthase Polypeptiden in anderen verwandten Arten zu unterdrücken. Zu diesem Zweck umfasst die dsRNA bevorzugt Sequenzbereiche von Kallose-Synthase -Gentranskripten, die konservierten Bereichen entsprechen. Besagte konservierte Bereiche können aus Sequenzvergleichen leicht abgeleitet werden.

Eine dsRNA kann chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Dazu können zelluläre RNA Polymerasen oder Bakteriophagen RNA Polymerasen (wie z.B. T3-T7- oder SP6 RNA-Polymerase) verwendet werden. Entsprechende Verfahren zu in vitro Expression von RNA sind beschrieben (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Eine chemisch oder enzymatisch in vitro syntetisierte dsRNA kann vor der Einführung in eine Zelle, Gewebe oder Organismus aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Extraktion, Präzipitation, Elektrophorese, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren ganz oder teilweise aufgereinigt werden. Die dsRNA kann unmittelbar in die Zelle eingeführt werden oder aber auch extrazellulär (z.B. in den interstitialen Raum) appliziert werden.

Bevorzugt wird die Pflanze jedoch stabil mit einem Expressionskonstrukt, das die Expression der dsRNA realisiert, transformiert. Entsprechende Verfahren sind weiter unten beschrieben.

b) Einbringung einer Kallose-Synthase antisense-Nukleinsäuresequenz

Verfahren zur Suppression eines bestimmten Polypeptids durch Verhinderung der Akkumulation seiner mRNA durch die "antisense"-Technologie sind vielfach – auch in Pflanzen – beschrieben (Sheehy et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 8805-8809; US 4,801,340; Mol JN et al. (1990) FEBS Lett 268(2):427-430). Das antisense Nukleinsäuremolekül hybridisiert bzw. bindet an die zelluläre mRNA und/oder genomischen DNA kodierend für das zu supprimierende Kallose-Synthase Zielpolypeptid. Dadurch wird die Transkription und/oder Translation des Zielpolypeptids unterdrückt. Die Hybridisierung kann auf konventionelle Art über die Bildung einer stabilen Duplex oder – im Fall von genomischer DNA – durch Bindung des antisense Nukleinsäuremoleküls mit der Duplex der genomischen DNA durch spezifische Wechselwirkung in der großen Furche der DNA-Helix entstehen.

Ein antisense Nukleinsäuremolekül geeignet zur Verminderung eines Kallose-Synthase Polypeptids kann unter Verwendung der für dieses Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz, beispielsweise des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 oder eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein funktionelles Äquivalent derselben, nach den Basenpaarregeln von Watson und Crick abgeleitet werden. Das antisense Nukleinsäuremolekül kann zu der gesamten transkribierten mRNA des besagten Polypeptids komplementär sein, sich auf die kodierende Region beschränken oder nur aus einem Oligonukleotid bestehen, das zu einem Teil der kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz der mRNA komplementär ist. So kann das Oligonukleotid beispielsweise komplementär zu der Region sein, die den Translationsstart für das besagte Polypeptid umfasst. Antisense-Nukleinsäuremoleküle können eine Länge von zum Beispiel 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide haben, können aber auch länger sein und 100, 200, 500, 1000, 2000 oder 5000 Nukleotide umfassen. Antisense-Nukleinsäuremoleküle können rekombinant exprimiert oder chemisch bzw. enzymatisch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisiert werden. Bei der chemischen Synthese können natürliche oder modifizierte Nukleotide verwendet werden. Modifizierte Nukleotide können dem antisense Nukleinsäuremolekül eine erhöhte biochemische Stabilität verleihen und zu einer erhöhten physikalischen Stabilität der Duplex gebildet aus antisense-Nukleinsäuresequenz und sense-Zielsequenz führen. Verwendet werden können beispielsweise Phosphorothioatderivative und Acridin-substitierte Nukleotide wie 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5-Iodouracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxy-hydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, &bgr;-D-Galactosylqueosin, Inosine, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyl-guanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylamino-methyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, &bgr;-D-mannosyl queosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure, Pseudouracil, Queosine, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure, 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil und 2,6-Diaminopurin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Expression eines Kallose-Synthase Polypeptids durch Nukleinsäuremoleküle inhibiert werden, die komplementär zu der regulatorischen Region eines Kallose-Synthase Gens (z.B. einem Kallose-Synthase Promotor und/oder Enhancer) sind und triple-helikale Strukturen mit der dortigen DNA-Doppelhelix ausbilden, so dass die Transkription des Kallose-Synthase Gens vermindert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6(6):569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660:27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14(12):807-815). In einer weiteren Ausführungsform kann das antisense Nukleinsäuremolekül eine &agr;-anomere Nukleinsäure sein. Derartige &agr;-anomere Nukleinsäuremoleküle bilden spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen – im Unterschied zu den konventionellen &bgr;-Nukleinsäuren – die beiden Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier C et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641). Das antisense Nukleinsäuremolekül kann ferner auch 2'-O-Methylribo-nukleotide (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6131-6148) oder chimäre RNA-DNA Analoge beinhalten (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215:327-330).

c) Einbringen eines Ribozyms welches spezifisch die für Kallose-Synthasen kodierenden Ribonukleinsäuremoleküle spaltet, beispielsweise katalysisch.

Katalytische RNA-Moleküle oder Ribozyme können an jede beliebige Ziel-RNA angepasst werden und spalten das Phosphodiester-Gerüst an spezifischen Positionen, wodurch die Ziel-RNA funktionell deaktiviert wird (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23(3):257-275). Das Ribozym wird dadurch nicht selber modifiziert, sondern ist in der Lage, weitere Ziel-RNA-Moleküle analog zu spalten, wodurch es die Eigenschaften eines Enzyms erhält.

Auf diese Art können Ribozyme (z.B. "Hammerhead"-Ribozyme; Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591) verwendet werden, um die mRNA eines zu supprimierenden Enzyms – z.B. Kallose-Synthasen – zu spalten und die Translation zu verhindern. Verfahren zur Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Polypeptide sind beschrieben in (EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257). In pflanzlichen Zellen ist eine Ribozym-Expression ebenfalls beschrieben (Steinecke P et al. (1992) EMBO J 11(4):1525-1530; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250(3):329-338). Ribozyme können über einen Selektionsprozess aus einer Bibliothek diverser Ribozyme identifiziert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261:1411-1418).

d) Einbringung einer Kallose-Synthase antisense-Nukleinsäure-sequenz kombiniert mit einem Ribozym.

Vorteilhaft kann die oben beschriebene antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren gekoppelt werden. Der Einbau von Ribozymsequenzen in "antisense"-RNAs verleiht eben diesen "antisense"-RNAs diese enzymähnliche, RNA-spaltende Eigenschaft und steigert so deren Effizienz bei der Inaktivierung der Ziel-RNA. Die Herstellung und Verwendung entsprechender Ribozym-"antisense"-RNA-Moleküle ist beispielsweise beschrieben bei Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591.

Die Ribozym-Technologie kann die Effizienz einer antisense-Strategie erhöhen. Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei "Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), S. 449-460" beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol. 18(2):353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet. 242(6):653-657). Beispielsweise können Derivate der Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, die komplementäre Bereiche zu der mRNA des zu supprimierenden Kallose-Synthase Polypeptids aufweisen (siehe auch US 4,987,071 und US 5,116,742).

e) Einbringung einer Kallose-Synthase sense-Nukleinsäuresequenz zur Induktion eines Kosuppression

Die Expression einer Kallose-Synthase Nukleinsäuresequenz in sense-Orientierung kann zu einer Kosuppression des entsprechenden homologen, endogenen Gens führen. Die Expression von sense-RNA mit Homologie zu einem endogenen Gen kann die Expression desselben vermindern oder ausschalten, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol 31(5):957-973; Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224:447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2:291-99). Dabei kann das eingeführte Konstrukt das zu vermindernde homologe Gen ganz oder nur teilweise representieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich. Die Anwendung dieser Technologie auf Pflanzen ist beispielsweise beschrieben bei Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289 und in US 5,034,323.

Bevorzugt wird die Kosuppression unter Verwendung einer Sequenz realisert, die im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil der Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Kallose-Synthase-Polypeptid oder ein funktionelles Äquivalent desselben, beispielsweise des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, z.B. der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 und/oder 34 oder der Nukleinsäuresequenz kodierend für ein funktionelles Äquivalent derselben.

f) Einbringung von Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein dominant-negatives Kallose-Synthase Polypeptid.

Die Aktivität eines Kallose-Synthase Polypeptids kann vermutlich auch durch Expression einer dominant-negativen Variante dieses Kallose-Synthase Polypeptids realisiert werden. Verfahren zur Verminderung der Funktion bzw. Aktivität eines Polypeptid mittels Koexpression seiner dominant-negativen Form sind dem Fachmann bekannt (Lagna G und Hemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental Biology 36:75-98; Perlmutter RM und Alberola-IIa J (1996) Current Opinion in Immunology 8(2):285-90; Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 11(1):1-6; Herskowitz I (1987) Nature 329(6136):219-22).

Eine dominant-negative Kallose-Synthase Variante kann beispielsweise durch Veränderung von Aminosäureresten erfolgen, die Bestandteil des katalytischen Zentrums sind und infolge deren Mutation das Polypeptid seine Aktivität verliert. Bevorzugt zu mutierende Aminosäurereste sind solche, die in den Kallose-Synthase Polypeptiden verschiedener Organismen konserviert sind. Solche konservierten Bereiche können beispielsweise mittels Computer-unterstütztem Vergleich ("Alignment") ermittelt werden. Diese Mutationen zum Erreichen einer dominant-negativen Kallose-Synthase Variante werden bevorzugt auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz kodierend für Kallose-Synthase Polypeptide durchgeführt. Eine entsprechende Mutation kann beispielsweise durch PCR vermittelte in vitro Mutagenese unter Verwendung entsprechender Oligonukleotidprimer, durch welche die gewünschte Mutation eingeführt wird, realisiert werden. Dazu werden dem Fachmann geläufige Verfahren verwendet. Beispielsweise kann zu diesem Zweck der "LA PCR in vitro Mutagenesis Kit" (Takara Shuzo, Kyoto) verwendet werden.

g) Einbringung von Kallose Synthase Gene, RNAs oder Polypeptid-bindende Faktoren.

Eine Verminderung einer Kallose-Synthase Genexpression ist auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren z.B. mit Faktoren vom Typus der Zinkfingertranskriptionsfaktoren möglich. Diese Faktoren lagern sich an die genomische Sequenz des endogenen Zielgens, bevorzugt in den regulatorischen Bereichen, an und bewirken eine Repression des endogenen Gens. Die Verwendung eines solchen Verfahrens ermöglicht die Verminderung der Expression eines endogenen Kallose-Synthase Gens, ohne dass dessen Sequenz gentechnisch manipuliert werden muss. Entsprechende Verfahren zur Herstellung entsprechender Faktoren sind beschrieben (Dreier B et al. (2001) J Biol Chem 276(31):29466-78; Dreier B et al. (2000) J Mol Biol 303(4):489-502; Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (4):1495-1500; Beerli RR et al. (2000) J Biol Chem 275(42):32617-32627; Segal DJ and Barbas CF 3rd. (2000) Curr Opin Chem Biol 4(1):34-39; Kang JS and Kim JS (2000) J Biol Chem 275(12):8742-8748; Beerli RR et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(25):14628-14633; Kim JS et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(8):3616-3620; Klug A (1999) J Mol Biol 293(2):215-218; Tsai SY et al. (1998) Adv Drug Deliv Rev 30(1-3):23-31; Mapp AK et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(8):3930-3935; Sharrocks AD et al. (1997) Int J Biochem Cell Biol 29(12):1371-1387; Zhang L et al. (2000) J Biol Chem 275(43):33850-33860).

Die Selektion dieser Faktoren kann unter Verwendung eines geeigneten Stückes eines Kallose-Synthase Gens erfolgen. Bevorzugt liegt dieser Abschnitt im Bereich der Promotorregion. Für eine Genunterdrückung kann er aber auch im Bereich der kodierenden Exons oder Introns liegen. Die entsprechenden Abschnitte sind für den Fachmann mittels Datenbankabfrage aus der Genbank oder – ausgehend von einer Kallose-Synthase cDNA, deren Gen nicht in der Genbank vorhanden ist, durch Durchmusterung einer genomischen Bibliothek nach korrespondierenden genomischen Klonen erhältlich. Die dazu erforderlichen Verfahren sind dem Fachmann geläufig.

Ferner können Faktoren in eine Zelle eingebracht werden, die das Kallose-Synthase Zielpolypeptid selber inhibieren. Die Polypeptidbindenden Faktoren können z.B. Aptamere (Famulok M und Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243:123-36) oder Antikörper bzw. Antikörperfragmente sein.

Die Gewinnung dieser Faktoren ist beschrieben und dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wurde ein cytoplasmatischer scFv Antikörper eingesetzt, um die Aktivität des Phytochrom A Proteins in gentechnisch veränderten Tabakpflanzen zu modulieren (Owen M et al. (1992) Biotechnology (NY) 10(7):790-794; Franken E et al. (1997) Curr Opin Biotechnol 8(4):411-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sci 1:286-272).

Die Genexpression kann auch durch maßgeschneiderte, niedermolekulare synthetische Verbindungen unterdrückt werden, beispielsweise vom Polyamid-Typ (Dervan PB und Bürli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:688-693; Gottesfeld JM et al. (2000) Gene Expr 9(1-2):77-91). Diese Oligomere bestehen aus den Bausteinen 3-(Dimethylamino)propylamin, N-Methyl-3-hydroxypyrrol, N-Methylimidazol und N-Methylpyrrole und können an jedes Stück doppelsträngiger DNA so angepasst werden, dass sie sequenzspezifisch in die große Furche binden und die Expression der dortigen Genesequenzen blockieren. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (siehe unter anderem Bremer RE et al. (2001) Bioorg Med Chem. 9(8):2093-103; Ansari AZ et al. (2001) Chem Biol. 8(6):583-92; Gottesfeld JM et al. (2001) J Mol Biol. 309(3):615-29; Wurtz NR et al. (2001) Org Lett 3(8):1201-3; Wang CC et al. (2001) Bioorg Med Chem 9(3):653-7; Urbach AR und Dervan PB (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8):4343-8; Chiang SY et al. (2000) J Biol Chem. 275(32):24246-54).

h) Einbringung von den Kallose-Synthase RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsäuremolekülen und Expressionskonstrukten.

Die Kallose-Synthase Expression kann effektiv auch durch Induktion des spezifischen Kallose-Synthase RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) (Angell, SM et al. (1999) Plant J. 20(3):357-362) realisiert werden. Diese Systeme – auch als "VIGS" (viral induced gene silencing) bezeichnet – bringen Nukleinsäuresequenzen mit Homologie zu den zu supprimierenden Transkripten mittels viraler Vektoren in die Pflanze ein. Die Transkription wird sodann – vermutlich mediiert durch pflanzliche Abwehrmechanismen gegen Viren – abgeschaltet. Entsprechende Techniken und Verfahren sind beschrieben (Ratcliff F et al. (2001) Plant J 25(2):237-45; Fagard M und Vaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43(2-3):285-93; Anandalakshmi R et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(22):13079-84; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10(6):937-46).

Die Methoden der dsRNAi, der Kosuppression mittels sense-RNA und der "VIGS" ("virus induced gene silencing") werden auch als "post-transcriptional gene silencing" (PTGS) bezeichnet. PTGS-Verfahren sind besonders vorteilhaft, weil die Anforderungen an die Homologie zwischen dem zu supprimierenden endogenem Gen und der transgen exprimierten sense- oder dsRNA-Nukleinsäuresequenz geringer sind als beispielsweise bei einem klassischen antisense-Ansatz. Entsprechende Homologie-Kriterien sind bei der Beschreibung des dsRNAI-Verfahrens genannt und allgemein für PTGS-Verfahren oder dominant-negative Ansätze übertragbar. Aufgrund der hohen Homologie zwischen den Kallose-Synthase Polypeptiden aus Mais, Weizen, Reis und Gerste kann auf einen hohen Konservierungsgrad dieses Polypeptid bei Pflanzen geschlossen werden. So kann man voraussichtlich unter Verwendung der Kallose-Synthase – Nukleinsäuremolekülen aus Gerste, Mais oder Reis auch die Expression von homologen Kallose-Synthase Polypeptiden in anderen Arten effektiv supprimieren, ohne dass die Isolierung und Strukturaufklärung der dort vorkommenden Kallose-Synthase Homologen zwingend erforderlich wäre. Dies erleichtert erheblich den Arbeitsaufwand.

i) Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts geeignet zur Induktion einer homologen Rekombination an Genen kodierend für Kallose-Synthasen – beispielsweise zur Erzeugung von Knockout-Mutanten.

Zur Herstellung eines homolog rekombinanten Organismus mit verminderter Kallose-Synthase Aktivität verwendet man beispielsweise ein Nukleinsäurekonstrukt, das zumindest einen Teil eines endogenen Kallose-Synthase Gens enthält, das durch eine Deletion, Addition oder Substitution mindestens eines Nukleotids so verändert wird, so dass die Funktionalität vermindert oder gänzlich aufgehoben wird. Die Veränderung kann auch die regulativen Elemente (z.B. den Promotor) des Gens betreffen, so dass die kodierende Sequenz unverändert bleibt, eine Expression (Transkription und/oder Translation) jedoch unterbleibt und vermindert wird.

Bei der konventionellen homologen Rekombination ist die veränderte Region an ihrem 5'- und 3'-Ende von weiteren Nukleinsäuresequenzen flankiert, die eine ausreichende Länge für die Ermöglichung der Rekombination aufweisen müssen. Die Länge liegt in der Regel in einem Bereich von mehreren einhundert oder mehr Basen bis zu mehreren Kilobasen (Thomas KR und Capecchi MR (1987) Cell 51:503; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(8):4368-4373). Für die homologe Rekombination wird der Wirtsorganismus – zum Beispiel eine Pflanze – mit dem Rekombinationskonstrukt unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren transformiert und erfolgreich rekombinierte Klone unter Verwendung zum Beispiel einer Antibiotika- oder Herbizidresistenz selektioniert.

j) Einführung von Mutationen in endogene Kallose-Synthase Gene zur Erzeugung eines Funktionsverlustes (z.B. Generierung von Stopp-Kodons, Verschiebungen im Leseraster etc.)

Weitere geeignete Methoden zur Verminderung der Kallose-Synthase Aktivität sind die Einführung von Nonsense-Mutationen in endogene Kallose-Synthase Gene, zum Beispiel mittels Generierung von Knockout-Mutanten mit Hilfe von z.B. T-DNA-Mutagenese (Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20(5):963-976), ENU-(N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff) – Mutagenese oder homolger Rekombination (Hohn B und Puchta (1999) H Proc Natl Acad Sci USA 96:8321-8323.) oder EMS Mutangenese (Birchler JA, Schwartz D. Biochem Genet. 1979 Dec;17(11-12):1173-80; Hoffmann GR. Mutat Res. 1980 Jan;75(1):63-129). Punktmutationen können auch mittels DNA-RNA Hybrid Oligonukleotiden erzeugt werden, die auch als "chimeraplasty" bekannt sind (Zhu et al. (2000) Nat Biotechnol 18(5):555-558, Cole-Strauss et al. (1999) Nucl Acids Res 27(5):1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87(3):240-247).

„Mutationen" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint die Veränderung der Nukleinsäureabfolge einer Genvariante in einem Plasmid oder im Genom eines Organismus. Mutationen können z.B als Folge von Fehlern bei der Replikation entstehen oder durch Mutagene hervorgerufen werden. Die Rate der Spontanmutationen im Zellgenom von Organismen ist sehr gering, allerdings sind dem kundigen Fachmann eine Vielzahl von biologischen, chemischen oder physikalischen Mutagenen bekannt.

Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen eines oder mehrerer Nukleinsäurereste. Unter Substitutionen versteht man den Austausch von einzelnen Nukleinsäurebasen, dabei unterscheidet man zwischen Transitionen (Substitution einer Purin- gegen eine Purinbase bzw. einer Pyrimidin- gegen eine Pyrimidinbase) und Transversionen (Substitution einer Purin- gegen eine Pyrimidinbase (oder umgekehrt).

Unter Additionen bzw. Insertion versteht man den Einbau von zusätzlichen Nukleinsäureresten in die DNA, wobei es zu Verschiebungen des Leserahmens kommen kann. Bei derartigen Leserahmenverschiebungen unterscheidet man zwischen „in frame" Insertionen/Addtitionen und „out of frame" Insertionen. Bei den „in-frame" Insertionen/Additionen bleibt der Leserahmen erhalten und ein um die Anzahl der von den insertierten Nukleinsäuren kodierten Aminosäuren vergrößertes Polypeptid entsteht. Bei „out of frame" Insertionen/Additionen geht der ursprüngliche Leserahmen verloren und die Bildung eines vollständigen und funktionstüchtigen Polypeptids ist nicht mehr möglich.

Deletionen beschreiben den Verlust von einem oder mehreren Basenpaaren, die ebenfalls zu „in frame" oder „out of frame" Verschiebungen des Leserahmens und den damit verbundenen Folgen bezüglich der Bildung eines intakten Proteins führen.

Die zur Erzeugung von zufälligen oder gezielten Mutationen verwendbaren mutagenen Agenzien (Mutagene) und die anwendbaren Methoden und Techniken sind dem Fachmann bekannt. Deratige Methoden und Mutagene sind z.B. beschrieben bei A.M. van Harten [(1998), "Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, UK], E Friedberg, G Walker, W Siede [(1995), „DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing], oder K. Sankaranarayanan, J. M. Gentile, L. R. Ferguson [(2000) „Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences].

Für die Einführung von gezielten Mutationen können geläufige molekulabiologische Methoden und Verfahren wie z.B der vitro Mutagense Kits, LA PCR in vitro Mutagenesis Kit (Takara Shuzo, Kyoto), oder PCR Mutagenesen unter Verwendung geeigenter Primer angewendet werden.

Wie bereits oben aufgeführt, gibt es eine Vielzahl von chemischen physikalischen und biologischen Mutagenen.

Die im folgenden aufgeführten seien beispielhaft aber nicht einschränkend genannt.

Chemische Mutagene können gemäß ihres Wirkmechanismus unterteilt werden. So gibt es Basenanaloga (z.B. 5-bromouracil, 2-amino purin), mono- und bifunktionale alkylierende Agentien (z.B. monfunktionale wie ethylmethylsulfonat, dimethylsulfat, oder bifunktionale wie dichloroethyl sulfit, Mitomycin, Nitrosoguanidine – dialkylnitrosamine, N-Nitrosoguanidin Derivate) oder interkalierende Substanzen (z.B. Acridine, Ethidiumbromid).

Physikalische Mutagene sind zum Beispiel ionisierende Strahlungen. Ionisierende Strahlungen sind elektromagnetische Wellen oder Teilchenstrahlungen die in der Lage sind, Moleküle zu ionisieren, d.h. aus diesen Elektronen zu entfernen. Die zurückbleibenden Ionen sind meist sehr reaktiv, so dass sie, falls sie in lebendem Gewebe entstehen, großen Schaden z.B an der DNA anrichten können und (bei geringer Intensität) dadurch Mutationen induzieren. Ionisierende Strahlungen sind z.B. Gammastrahlung (Photonenenergie von etwa einem Megaelektronenvolt MeV), Röntgenstrahlung (Photonenenergie von mehreren oder vielen Kiloelektronenvolt keV) oder auch Ultraviolettes Licht (UV-Licht, Photonenenergie von über 3,1 eV). UV Licht bewirkt die Bildung von Dimeren zwischen Basen, am häufigsten sind hier Thymidindimere, durch die Mutationen entstehen.

Die klassische Erzeugung von Mutanten durch Behandlung der Samen mit mutagenisierenden Agentien wie z.B. Ethylmethylsulfonat (EMS) (Birchler JA, Schwartz D. Biochem Genet. 1979 Dec;17(11-12):1173-80; Hoffmann GR. Mutat Res. 1980 Jan;75(1):63-129) oder ionosierender Strahlung ist durch die Verwendung biologischer Mutagene z.B. Transposons (z.B. Tn5, Tn903, Tn916, Tn1000, Balcells et al.,1991, May BP et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 30;100(20):11541-6.) oder molekularbiologischer Methoden wie die Mutagense durch T-DNA Insertion (Feldman, K.A. Plant J. 1:71-82.1991, Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20(5):963-976).) erweitert worden.

Bevorzugt ist die Verwendung von chemischen oder biologischen Mutagenen zur Erzeugung von mutierten Genvarianten. Bei den chemischen Agenzien ist besonders bevorzugt die Erzeugung von Mutanten durch Anwendung der EMS (Ethylmethylsulfonat)Mutagenese genannt. Bei der Erzeugung von Mutanten unter Verwendung biologischer Mutagene sei bevorzugt die T-DNA-Mutagenese oder transposon mutagense genannt.

Somit können beispielsweise auch solche Polypeptide für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, welche man in Folge einer Mutation eines erfindungsgemäßen Polypeptides z.B. gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 erhält.

Alle Substanzen und Verbindungen die direkt oder indirekt eine Verminderung der Polypeptidmenge, RNA-Menge, Genaktivität oder Polypeptidaktivität eines Kallose-Synthase-Polypeptids bewirken, seien infolge unter der Bezeichnung "anti Kallose-Synthase Verbindungen" zusammengefasst. Der Begriff "anti Kallose-Synthase Verbindung schließt explizit die in den oben beschriebenen Verfahren zum Einsatz kommenden Nukleinsäuresequenzen, Peptide, Proteine oder andere Faktoren ein.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Erhöhung der Resistenz gegenüber Pathogenen aus den Familien der Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocreaceae in einer monocotyledonen Pflanze, oder einem Organ, Gewebe oder einer Zelle davon, erreicht durch:

  • a) Einbringung einer rekombinanten Expressionskassette enthaltend in funktioneller Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotor eine „anti-Kallose-Synthase Verbindung" in eine pflanzliche Zelle;
  • b) Regeneration der Pflanze aus der pflanzlichen Zelle, und
  • c) Expression besagter „anti-Kallose-Synthase Verbindung" in einer Menge und für eine Zeit, hinreichend um eine Pathogenresistenz in besagter Pflanze zu erzeugen oder zu erhöhen.

"Transgen" meint zum Beispiel bezüglich einer Nukleinsäure-sequenz, einer Expressionskassette oder einem Vektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor, alle solche durch gentechnische Methoden zustande-gekommenen Konstruktionen oder Organismen, in denen sich entweder

  • a) die Kallose-Synthase Nukleinsäuresequenz, oder
  • b) eine mit der Kallose-Synthase Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
  • c) (a) und (b)
nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des Kallose-Synthase-Promotors mit dem entsprechenden Kallose-Synthase-Gen – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815).

"Einbringung" umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet eine "anti Kallose-Synthase Verbindung", direkt oder indirekt, in eine Pflanze oder eine Zelle, Kompartiment, Gewebe, Organ oder Samen derselben einzuführen oder dort zu generieren. Direkte und indirekte Verfahren sind umfasst. Die Einbringung kann zu einer vorübergehenden (transienten) Präsenz einer "anti Kallose-Synthase Verbindung"" (beispielsweise einer dsRNA) führen oder aber auch zu einer dauerhaften (stabilen).

Gemäß der unterschiedlichen Natur der oben beschriebenen Ansätze kann die "anti Kallose-Synthase Verbindung" ihre Funktion direkt ausüben (zum Beispiel durch Insertion in ein endogenes Kallose-Synthase Gen). Die Funktion kann aber auch indirekt nach Transkription in eine RNA (zum Beispiel bei antisense Ansätzen) oder nach Transkription und Translation in ein Protein (zum Beispiel bei Bindungsfaktoren) ausgeübt werden. Sowohl direkte als auch indirekt wirkende "anti Kallose-Synthase Verbindungen" sind erfindungsgemäß umfasst.

„Einbringung" umfasst beispielsweise Verfahren wie Transfektion, Transduktion oder Transformation.

"Anti Kallose-Synthase Verbindung" umfasst somit beispielsweise auch rekombinante Expressionskonstrukte, die eine Expression (d.h. Transkription und ggf. Translation) beispielsweise einer Kallose-Synthase dsRNA oder einer Kallose-Synthase "antisense"-RNA -bevorzugt in einer Pflanze oder einem Teil, Gewebe, Organ oder Samen derselben – bedingen.

In besagten Expressionskonstrukten/Expressionskassetten steht ein Nukleinsäuremolekül, dessen Expression (Transkription und ggf. Translation) eine "anti Kallose-Synthase Verbindung" generiert, bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor), das eine Expression in Pflanzen gewährleistet. Soll das Expressionskonstrukt direkt in die Pflanze eingeführt und die "anti Kallose-Synthase Verbindung" (beispielsweise die Kallose-Synthase dsRNA) dort in plantae erzeugt werden, so sind pflanzenspezifische genetische Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt. Die "anti Kallose-Synthase Verbindung" kann jedoch auch in anderen Organismen oder in vitro erzeugt und dann in die Pflanze eingebracht werden. In diesem sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen genetischen Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt, die die Expression in der jeweils für die Herstellung gewählte Pflanze erlauben.

Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel einer "anti Kallose-Synthase Verbindung") und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäure-sequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.

Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung einer Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.

Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen ein Promotor – zum Beispiel durch eine homologe Rekombination – hinter ein endogenes Kallose-Synthase Gen platziert wird, und durch Expression einer antisense Kallose-Synthase RNA die erfindungsgemäße Verminderung eines Kallose-Synthase Polypeptids bewirkt wird. Analog kann auch eine "anti Kallose-Synthase Verbindung" (zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eines Kallose-Synthase dsRNA oder eine Kallose-Synthase antisense RNA) derart hinter einen endogenen Promotor platziert werden, dass der gleiche Effekt auftritt. Beide Ansätze führen zu Expressionskassetten im Sinne der Erfindung.

Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.

Bevorzugt sind:

a) Konstitutive Promotoren

Bevorzugt sind Vektoren, die eine konstitutive Expression in Pflanzen ermöglichen (Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202). "Konstitutiver" Promotor meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221-228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962,028),, der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist. Als konstitutiver Promotor insbesondere bevorzugt ist der Promotor des Nitrilase-1 (nit1) Gens aus A. thaliana (GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170:197-200).

b) Gewebespezifische Promotoren

In einer Ausführungsform werden Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen verwendet.

Samenspezifische Promotoren

wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1(9):839-53), des 2S Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67), des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225:121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10):1090f), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980). Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promotor des Ipt2 oder Ipt1-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Onzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens).

Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), und der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.

Blattspezifische Promotoren

wie der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8:2445-2451). Epidermis-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der Promotor des OXLP-Gens ("Oxalat-Oxidase like protein"; Wei et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36:101-112).

Blütenspezifische Promotoren

wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).

Antheren-spezifische Promotoren

wie den 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), den glob-I Promotor und den &ggr;-Zein Promotor.

c) Chemisch induzierbare Promotoren

Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden. So kann beispielsweise die Expression eines die Kallose-Synthase Aktivität reduzierenden oder inhibierenden Moleküls, wie z.B. die oben aufgezählten dsRNA, Ribozyme, Antisense-Nukleinsäuremoleküle etc. zu geeigneten Zeitpunkten induziert werden.

d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren

Ganz besonders vorteilhaft ist die Verwendung von induzierbaren Promotoren zur Expression der zur Verminderung der Kallose-Synthase Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion eingesetzten RNAi Konstrukte, was beispielsweise bei Verwendung von pathogen-induzierbaren Promotoren eine Expression nur im Bedarfsfall (d.h. Pathogenbefall) ermöglicht.

Im erfindungegemäßen Verfahren werden daher in einer Ausführungsform in Pflanzen aktive Promotoren verwendet, bei denen es sich Pathogen-induzierbare Promotor handelt.

Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die Promotoren von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden, wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, &bgr;-1,3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968(1989).

Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinII Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494-498), des wun1 und wun2-Gens (US 5,428,148), des win1- und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), des Systemin (McGurl et al: (1992) Science 225:1570-1573), des WIP1-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) Plant J 6(2):141-150) und dergleichen.

Eine Quelle für weitere pathogen-induzierbare Promotoren stellt die PR-Genfamilie dar. Eine Reihe von Elementen in diesen Promotoren haben sich als vorteilhaft erwiesen. So vermittelt die Region -364 bis -288 im Promotor von PR-2d Salicylat-Spezifität (Buchel et al. (1996) Plant Mol Biol 30, 493-504). Die Sequenz 5'-TCATCTTCTT-3' taucht im Promotor der Gersten &bgr;-1,3-Glucanase und in mehr als 30 weiteren stressinduzierten Genen wiederholt auf. Diese Region bindet in Tabak ein nukleäres Protein, dessen Abundanz durch Salicylat erhöht wird. Die PR-1-Promotoren aus Tabak und Arabidopsis (EP-A 0 332 104, WO 98/03536) eignen sich ebenfalls als pathogeninduzierbare Promotoren. Bevorzugt, da besonders spezifisch durch Pathogeninduziert, sind die "acidic PR-5"-(aPR5)-Promotoren aus Gerste (Schweizer et al. (1997) Plant Physiol 114:79-88) und Weizen (Rebmann et al. (1991) Plant Mol Biol 16:329-331). aPR5-Proteine akkumulieren in ca. 4 bis 6 Stunden nach Pathogenbefall und zeigen nur eine sehr geringe Hintergrundsexpression (WO 99/66057). Ein Ansatz, um eine erhöhte pathogen-induzierte Spezifität zu erreichen, bildet die Herstellung synthetischer Promotoren aus Kombinationen von bekannten pathogen-responsiven Elementen (Rushton et al. (2002) Plant Cell 14, 749-762; WO 00/01830; WO 99/66057). Weitere pathogen-induzierbare Promotoren aus verschiedenen Arten sind dem Fachmann bekannt (EP-A 1 165 794; EP-A 1 062 356; EP-A 1 041 148; EP-A 1 032 684).

Weitere pathogen-induzierbare Promtoren umfassen den Flachs Fis1-Promotor (WO 96/34949), den Vst1-Promotor (Schubert et al. (1997) Plant Mol Biol 34:417-426) sowie den EAS4 Sesquiterpene-Cyclase-Promotor aus Tabak (US 6,100,451).

Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRP1-Gens (bzw. gst1 Promotor) z.B. aus Kartoffel (WO 96/28561; Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierare alpha-Amylase Promotor aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinll-Promotor (EP-A 0 375 091).

e) Mesophyllgewebe spezifische Promotoren

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden in einer Ausführungsform Mesophyllgewebe-spezifische Promotoren wie beispielsweise der Promotor des Weizen Germin 9f-3.8 Gens (GenBank Acc.-No.: M63224) oder der Gerste GerA Promotor (WO 02/057412) verwendet. Besagte Promotoren sind insbesondere vorteilhaft, da sie sowohl Mesophyllgewebe-spezifisch und pathogen-induzierbar sind. Ferner geeignet ist der Mesophyllgewebe-spezifische Arabidopsis CAB-2 Promotor (GenBank Acc.-No.: X15222), sowie der Zea mays PPCZm1 Promotor (GenBank Acc.-No.: X63869) oder Homologe davon. Mesophyllgewebe spezifisch meint eine durch die spezifische Wechselwirkung von in der Promotorsequenz vorhandenen Cis Elementen und an diese bindende Transkriptionsfaktoren hervorgerufene Einschränkung der Transkription eines Gens auf möglichst wenige, das Mesophyllgewebe enthaltende Pflanzengewebe, vorzugseise ist eine auf das Mesophyllgewebe beschränkte Transkription gemeint.

f) Entwicklungsabhängige Promotoren

Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifungs-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifungs-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Entwicklungsabhängige Promotoren schließt zum Teil die gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.

Besonders bevorzugt sind konstitutive, sowie Blatt und/oder Stengel-spezifische, pathogen-induzierbare, Wurzel-spezifische, Mesophyllgewebe-spezifische Promotoren, wobei konstitutive, pathogen-induzierbare, Mesophyllgewebe-spezifische und Wurzelspezifische Promotoren am meisten bevorzugt sind.

Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.

Weitere zur Expression in Pflanzen geeignete Promotoren sind beschrieben (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:8402-8406).

Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promotor funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen Promotor mit einer der vorab beschriebenenen Spezifität und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217(2-3):246-53, 1989) beschrieben.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Regionen, Introns oder nicht kodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440).

Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3:835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator.

Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte ausgetauscht werden. Eine Expressionskassette und die von ihr abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

  • a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-Phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleih, das Streptomycinphosphotransferase (SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin gewährt, das Neomycinphosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hygromycinphosphotransferase (HPT) Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthas Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z.B. mutierte ALS-Varianten mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation).
  • b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant Journal 8(5):777-784; Haseloff et al.(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel et al.(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques. 23(5):912-8), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:32414), das Aequoringen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268), die &bgr;-Galactosidase, R-Locus Gen (kodieren ein Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht; Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988), ganz besonders bevorzugt ist die &bgr;-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
  • c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Zur Selektion erfolgreich transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).

Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die Expressionskassetten enthalten sind. Die Expressionskassette kann in den Vektor (zum Beispiel ein Plasmid) über eine geeignete Restriktions-schnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.

Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterien sein. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.

Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle) erfordert, dass das entsprechende DNA-Moleküle und somit die in Folge von dessen Genexpression gebildeten RNA-Molekülen oder Proteinen in die entsprechende Wirtszelle eingebracht werden.

Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).

Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.

Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Die Verfahren sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f).

Werden Agrobacterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden.

Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakterien und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).

Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.

Stabil transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s.o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21(5):871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.

Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711f).

Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.

Dem Fachmann sind auch Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533 verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft mit weiteren Verfahren die eine Pathogenresistenz (beispielsweise gegen Insekten, Pilze, Bakterien, Nematoden etc.), Stressresistenz oder eine andere Verbesserung der pflanzlichen Eigenschaften bewirken kombiniert werden. Beispiele sind u.a. genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000;51 Spec No; Seite 487-96.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verminderung der Aktivität einer Kallose-Synthase in einer Pflanze kombiniert mit einer Erhöhung derAktivität eines Bax Inhibitor 1-Proteins. Dies kann beispielsweise durch Expression einer für ein Bax-Inhibitor-1 Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, z.B. im Mesophyllgewebe und/oder Wurzelgewebe erfolgen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren sind die Bax-Inhibitor-1 Proteine aus Hordeum vulgare (SEQ ID NO:37) oder Nicotiana tabacum SEQ ID NO: 39) besonders bevorzugt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die Nukleinsäuremoleküle kodierend für Kallose-Synthase-Polypeptide aus Gerste, Weizen und Mais gemäß den Polynukleotiden SEQ. ID No: 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, und/oder 32 umfassen, sowie die dazu komplementären Nukleinsäuresequenzen, und die durch Entartung (Degeneration) des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen und die für funktionelle Äquivalente der Polypeptide gemäß SEQ. ID No.: 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31 und/oder 33 kodierenden Nukleinsäuremoleküle, wobei die Nukleinsäuremoleküle nicht aus der SEQ ID NO: 1, 18, 20 oder 34 bestehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft das Kallose-Synthase Polypeptid aus Gerste, Weizen, Mais gemäß SEQ. ID No.: 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31 oder 33 oder eines, das diese Sequenzen enthält, sowie funktionelle Äquivalente davon, die nicht aus der SEQ ID NO: 2, 19, 21 oder 35 bestehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Doppelsträngige RNA-Nukleinsäuremoleküle (dsRNA-Molekül), die bei Einführung in eine Pflanze (oder einer davon abgeleiteten Zelle, Gewebe, Organ oder Samen) die Verminderung einer Kallose-Synthase bewirken, wobei der Sense-Strang des besagten dsRNA-Molekül mindestens eine Homologie von 30%, bevorzugt mindestens 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt 100 % zu einem Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ. ID No: 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, und/oder 32 aufweist, oder ein Fragment von mindestens 17 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Basenpaaren, besonders bevorzugt mindestens 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt mindestens 100, 200, 300 oder 400 Basenpaaren, am allermeisten bevorzugt mindestens 500, 600, 700, 800, 900 mindestens 1000 Basenpaaren umfasst, und welches mindestens eine 50%, 60%, 70% oder 80%, besonders bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt 100% Homologie zu einem Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ. ID No: 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, und/oder 32 aufweist, aber nicht der SEQ ID NO: 1, 18, 20 und 34 entsprechen.

Die doppelsträngige Struktur kann ausgehend von einem einzelnen, selbstkomplementären Strang oder ausgehend von zwei komplementären Strängen gebildet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind "sense"- und "antisense"-Sequenz durch eine verbindende Sequenz ("Linker") verknüpft und können beispielsweise eine Haarnadelstruktur ausbilden. Ganz besonderes bevorzugt kann die verbindende Sequenz ein Intron sein, das nach Synthese der dsRNA herausgespleißt wird.

Die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine dsRNA kann weitere Elemente beinhalten, wie beispielsweise Transkriptions-terminationssignale oder Polyadenylierungssignale.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskassetten, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen umfassen. In den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten ist die Nukleinsäuresequenz kodierend für die Kallose-Synthase Polypeptide aus Gerste, Weizen und Mais mit mindestens einem genetischen Kontrollelement nach obiger Definition derart verknüpft, das die Expression (Transkription und ggf. Translation) in einem beliebigen Organismus – bevorzugt in monokotyledone Pflanzen – realisiert werden kann. Dazu geeignete genetische Kontrollelemente sind oben beschrieben. Die transgenen Expressionskassetten können auch weitere Funktionselementen gemäß obiger Definition enthalten.

Derartige Expressionskassetten enthalten beispielsweise eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, z.B. eine die im wesentlichen identisch ist zu einem Nukleinsäuremolekül gemäß ID No: 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, oder 32, oder einem erfindungsgemäßen Fragment davon, wobei besagte Nukleinsäuresequenz bevorzugt in Sense-Orientierung oder in Antisense-Orientrierung zu einem Promotor vorliegt und damit zu Expression von sense- oder antisense-RNA führen kann, wobei es sich bei dem besagten Promotor um einen in Pflanzen aktiven, bevorzugt um einen durch Pathogenbefall induzierbaren Promotor handelt. Erfindungsgemäß sind auch transgene Vektoren umfaßt, die die besagten transgenen Expressionskassetten beinhalten.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft Pflanzen, die durch natürliche Vorgänge oder künstlich induziert Mutationen in einem Nukleinsäuremolekül enthalten, das die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ. ID No: 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, oder 32 umfaßt, die nicht aus der SEQ ID NO: 1, 18, 20 und 34 bestehen, wobei besagte Mutation eine Verminderung der Aktivität, Funktion oder Polypeptidmenge eines der durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß gemäß SEQ. ID No: 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, oder 32 kodierten Polypeptide bewirkt. Bevorzugt sind dabei Pflanzen die zu der Familie der Poaceae gehören, besonders bevorzugt sind Pflanzen ausgewählt aus den Pflanzengattungen Hordeum, Avena, Secale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza, ganz besonders bevorzugt Pflanzen ausgewählt aus den Arten Hordeum vulgare (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Secale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) und Oryza sative (Reis).

Folglich betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform einen Monokotyledonen Organismus enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, welche eine Mutation enthält, die eine Verminderung der Aktivität eines der durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten Proteine in den Organismen oder Teilen davon bewirkt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Pflanzen, transformiert mit wenigstens

  • a) einer Nukleinsäuresequenz, die Nukleinsäuremoleküle gemäß SEQ. ID No: 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, oder 32 umfasst, enthalten, die dazu komplementären Nukleinsäuresequenzen, und die für funktionelle Äquivalente der Polypeptide gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31 oder 33 kodierenden Nukleinsäuremoleküle, die vorzugsweise nicht der SEQ ID NO: 1, 18, 20 und 34 entsprechen,
  • b) einem Doppelsträngigen RNA-Nukleinsäuremoleküle (dsRNA-Molekül), welches eine die Verminderung einer Kallose-Synthase bewirkt, wobei der Sense-Strang des besagten dsRNA-Moleküls mindstens eine Homologie von 30 %, bevorzugt mindestens 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt 100 % zu einem Nukleinsäure-molekül gemäß SEQ. ID No: 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, oder 32 aufweist, oder ein Fragment von mindestens 17 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Basenpaaren, besonders bevorzugt mindestens 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt mindestens 100, 200, 300 or 400 Basenpaaren, am allermeisten bevorzugt mindestens 500, 600, 700, 800, 900 oder mehr Basenpaaren umfasst, welches mindestens eine 50 %, 60 %, 70 % oder 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt 100 % Homologie zu einem Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ. ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, oder 32 aufweist, aber vorzugsweise nicht der SEQ ID NO: 1, 18, 20 und 34 entsprechen
  • c) einer transgenen Expressionskassette, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen umfasst, oder einem erfindungsgemäßen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen.

Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen gemäß der oben genannten Definition. Beispielsweise alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen die zur Klasse der Liliopsidae gehören. In einer Ausführungsform ist der transgene Organismus eine reife Pflanze, Saatgut, Spross und Keimling, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. „Reife Pflanze" meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. „Keimling" meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. Insbesondere als Wirtsorganismen bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen, auf die der erfindungsgemäße Verfahren zum Erzielen einer Pathogenresistenz gemäß oben genannten Kriterien angewendet werden kann. In einer Ausführungsform ist die Pflanze eine monokotyle Pflanze wie z.B. Weizen, Hafer, Hirse, Gerste, Roggen, Mais, Reis, Buchweizen, Sorghum, Triticale, Dinkel oder Zuckerrohr, insbesondere ausgewählt aus den Arten Hordeum vulgare (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Secale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) oder Oryza sative (Reis).

Die Herstellung der transgenen Organismen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die erfindungsgemäß beschriebenen transgenen Pflanzen, die zusätzlich über eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität verfügen, bevorzugt sind dabei Pflanzen, die eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität in Mesophyllzellen oder Wurzelzellen aufweisen, besonders bevorzugt sind transgene Pflanzen die zu der Familie der Poaceae gehören und eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität in Mesophyllzellen oder Wurzelzellen aufweisen, am meisten bevorzugt sind transgene Pflanzen ausgewählt aus den Pflanzengattungen Hordeum, Avena, Secale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza, am allermeisten bevorzugt sind die Pflanzenarten Hordeum vulgare (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Secale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) und Oryza sative (Reis).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile – wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung zudem ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei ein Wirtsorganismus oder ein Teil davon mit einer der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle Expressionskassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Feinchemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Feinchemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakkzinen ist beschrieben bei Hood EE, Jilka JM (1999). Curr Opin Biotechnol. 10(4):382-6; Ma JK, Vine ND (1999). Curr Top Microbiol Immunol. 236:275-92.

Erfindungsgemäß kann die Expression eines Strukturgens natürlich auch unabhängig von der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände erfolgen oder beeinflusst werden.

Sequenzen
  • 1. SEQ ID NO: 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-1 (HvCSL-1) aus Hordeum vulgare.
  • 2. SEQ ID NO: 2 Aminosäuresequenz des Kallose-Synthase Polypeptid-1 aus Hordeum vulgare.
  • 3. SEQ ID NO: 3 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-2 (HvCSL-2) aus Hordeum vulgare.
  • 4. SEQ ID NO: 4 Aminosäuresequenz des Kallose-Synthase Polypeptid-2 aus Hordeum vulgare.
  • 5. SEQ ID NO: 5 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-3 (HvCSL-3) aus Hordeum vulgare.
  • 6. SEQ ID NO: 6 Aminosäuresequenz des Kallose-Synthase Polypeptid-3 aus Hordeum vulgare.
  • 7. SEQ ID NO: 7 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-7 (HvCSL-7) aus Hordeum vulgare.
  • 8. SEQ ID NO: 8 Aminosäuresequenz des Kallose-Synthase Polypeptid-7 aus Hordeum vulgare.
  • 9. SEQ ID NO: 9 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-1 (ZmCSL-1) aus Zea mays.
  • 10. SEQ ID NO: 10 Aminosäuresequenz des Kallose-Synthase Polypeptid-1 (Leserahmen +1) aus Mais (Zea mays).
  • 11. SEQ ID NO: 11 Aminosäuresequenz des Kallose-Synthase Polypeptid-1 (Leserahmen +2) aus Mais (Zea mays).
  • 12. SEQ ID NO: 12 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-1a (ZmCSL-1a) aus Zea mays.
  • 13. SEQ ID NO: 13 Aminosäuresequenz des Kallose-Synthase Polypeptid-1a aus Mais (Zea mays).
  • 14. SEQ ID NO: 14 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-2 (ZmCSL-2) aus Zea mays.
  • 15. SEQ ID NO: 15 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-2 aus Zea mays.
  • 16. SEQ ID NO: 16 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-3 (ZmCSL-3) aus Zea mays.
  • 17. SEQ ID NO: 17 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-3 aus Zea mays.
  • 18. SEQ ID NO: 18 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-1 (OsCSL-1) aus Oryza sativa.
  • 19. SEQ ID NO: 19 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-1 aus Oryza sativa.
  • 20. SEQ ID NO: 20 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-2 (OsCSL-2) aus Oryza sativa.
  • 21. SEQ ID NO: 21 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-2 aus Oryza sative.
  • 22. SEQ ID NO: 22 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-1 aus (TaCSL-1) Triticum aestivum.
  • 23. SEQ ID NO: 23 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-1 aus Triticum aestivum.
  • 24. SEQ ID NO: 24 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-2 (TaCSL-2)aus Triticum aestivum.
  • 25. SEQ ID NO: 25 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-2 aus Triticum aestivum.
  • 26. SEQ ID NO: 26 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-4 (TaCSL-4)aus Triticum aestivum.
  • 27. SEQ ID NO: 27 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-4 aus Triticum aestivum.
  • 28. SEQ ID NO: 28 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-5 (TaCSL-5)aus Triticum aestivum.
  • 29. SEQ ID NO: 29 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-5 aus Triticum aestivum.
  • 30. SEQ ID NO: 30 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-6 (TaCSL-6)aus Triticum aestivum.
  • 31. SEQ ID NO: 31 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-6 aus Triticum aestivum.
  • 32. SEQ ID NO: 32 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Kallose Synthase Polypeptid-7 (TaCSL-7)aus Triticum aestivum.
  • 33. SEQ ID NO: 33 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase Polypeptid-7 aus Triticum aestivum.
  • 34. SEQ ID NO: 34 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Glucan synthase like Polypeptid-5 aus A.thalina (accession no. NM_116593).
  • 35. SEQ ID NO: 35 Aminosäuresequenz der Kallose-Synthase kodierend für das Glucan synthase like Polypeptid-5 aus A.thalina.
  • 36. SEQ ID NO: 36 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Bax Inhibitor 1 aus Hordeum vulgare. GenBank Acc.-No.: AJ290421
  • 37. SEQ ID NO: 37 Aminosäuresequenz des Bax Inhibitor 1-Polypeptids aus Hordeum vulgare.
  • 38. SEQ ID NO: 38 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Bax Inhibitor 1 aus Nicotiana tabacum. (GenBank Acc.-No.: AF390556)
  • 39. SEQ ID NO: 39 Aminosäuresequenz des Bax Inhibitor 1-Polypeptids aus Nicotiana tabacum.
  • 40. SEQ ID NO: 40 Hei131 5'-GTTCGCCGTTTCCTCCCGCAACT-3'
  • 41. SEQ ID NO: 41 Gene Racer 5'-Nested-Primer,Invitrogen

    5'- GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3'
  • 42. SEQ ID NO: 42 RACE-HvCSL1:5'-GCCCAACATCTCTTCCTTTACCAACCT-3'
  • 43. SEQ ID NO: 43 GeneRacerTM 5'-Primer:

    5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3
  • 44. SEQ ID NO: 44 RACE-5' nested HvCSL1:

    5'-TCTGGCTTTATCTGGTGTTGGAGAATC-3'
  • 45. SEQ ID NO: 45 GeneRacerTM 3'-Primer:

    5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3
  • 46. SEQ ID NO: 46 GeneRacerTM 3'-Nested Primer:

    5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3
  • 47. SEQ ID NO: 47 M13-fwd: 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
  • 48. SEQ ID NO: 48 M13-Rev: 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'
  • 49. SEQ ID NO: 49 Hei 97 forward 5'-TTGGGCTTAATCAGATCGCACTA-3'
  • 50. SEQ ID NO: 50 Hei 98 reverse

    5'-GTCAAAAAGTTGCCCAAGTCTGT-3'
Beispiele Allgemeine Methoden:

Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratoty Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma MWG-Licor nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467).

Beispiel 1: Pflanzen, Pathogene und Inokulation

Die Gerstensorte Ingrid stammt von Patrick Schweizer, Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben. Die Sorte Pallas und die rückgekreuzte Linie BCIngrid-mlo5 wurde von Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agriculturai University, Kopenhagen, Dänemark zur Verfügung gestellt. Ihre Herstellung ist beschrieben (K∅lster P et al. (1986)Crop Sci 26: 903-907).

Das 12 bis 36 h im Dunkeln auf feuchtem Filterpapier vorgekeimte Saatgut wird, wenn nicht anders beschrieben, zu je 5 Körnern an den Rand eines Vierkanttopfes (8 × 8cm) in Fruhstorfer Erde vom Typ P ausgelegt, mit Erde bedeckt und regelmäßig mit Leitungswasser gegossen. Alle Pflanzen werden in Klimaschränken oder -kammern bei 16 bis 18°C, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchte und einem 16-stündigen Licht/8-stündigen Dunkelheitszyklus mit 3000 bzw. 5000 lux (50 bzw. 60 &mgr;mols-1m2 Photonenflussdichte) 5 bis 8 Tage lang kultiviert und im Keimlingsstadium in den Versuchen verwendet. Bei Experimenten, in denen Applikationen an Primärblättern durchgeführt werden, sind diese vollständig entwickelt.

Vor Durchführung der transienten Transfektionsexperimente werden die Pflanzen in Klimaschränken oder-kammern bei tagsüber 24°C, nachts 20°C, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchte und einem 16stündigen Licht/8stündigen Dunkelheitszyklus mit 30000 lux kultiviert.

Für die Inokulation von Gerstenpflanzen wird Echte Gerstenmehltau Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei Em. Marchal der Rasse A6 (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148) (BghA6) verwendet. Dieser wurde vom Institut für Biometrie, JLU Gießen bereitgestellt. Die Nachzucht des Inokulums erfolgt in Klimakammern zu den gleichen Bedingungen, wie sie oben für die Pflanzen beschrieben sind, durch Übertragung der Konidien von befallenem Pflanzenmaterial auf regelmäßig angezogene, 7 Tage alte Gerstenpflanzen cv. Golden Promise bei einer Dichte von 100 Konidia/mm2.

Die Inokulation mit BghA6 erfolgt unter Verwendung von 7 Tagen alten Keimlingen durch Abschütteln der Konidien bereits befallener Pflanzen in einem Inokulationsturm mit ca. 100 Konidien/mm2 (soweit nicht anders angegeben).

Beispiel 2: RNA-Extraktion

Gesamt RNA wird aus 8 bis 10 primären Blattsegmenten (Länge 5 cm) mittels "RNA Extraction Buffer" (AGS, Heidelberg, Germany) extrahiert.

Dazu werden zentrale Primärblattsegmente von 5 cm Länge geerntet und in flüssigem Stickstoff in Mörsern homogenisiert. Das Homogenisat wird bis zur RNA-Extraktion bei –70°C gelagert.

Aus dem tiefgefrorenen Blattmaterial wird mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kits (AGS, Heidelberg) Gesamt-RNA extrahiert. Dazu wird 200 mg des tiefgefrorenen Blattmaterials in einem Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL) mit 1,7 mL RNA-Extraktionspuffer (AGS) überschichtet und sofort gut durchmischt. Nach Zugabe von 200 &mgr;L Chloroform wird erneut gut gemischt und bei Raumtemperatur 45 min auf einem Horizontalschüttler bei 200 U/min geschüttelt. Anschließend wird zur Phasentrennung 15 min bei 20000 g und 4°C zentrifugiert, die obere wäsige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die untere verworfen. Die wässrige Phase wird erneut mit 900 &mgr;L Chloroform gereinigt, indem 3 mal für 10 sec homogenisiert und erneut zentrifugiert (s.o.) und abgehoben wird. Zur Fällung der RNA wird dann 850 &mgr;L 2-Propanol hinzugegeben, homogenisiert und für 30 bis 60 min auf Eis gestellt. Im Anschluss daran wird für 20 min zentrifugiert (s.o), vorsichtig der Überstand dekantiert, 2 mL 70 %iges Ethanol (–20°C) hinzu pipettiert, durchmischt und erneut 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird dann wiederum dekantiert und das Pelet vorsichtig mit einer Pipette von Flüssigkeitsresten befreit, bevor es an einem Reinluftarbeitsplatz im Reinluftstrom getrocknet wird. Danach wird die RNA in 50 &mgr;L DEPC-Wasser auf Eis gelöst, durchmischt und 5 min zentrifugiert (s.o.). 40 &mgr;l des Überstandes werden als RNA-Lösung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei –70°C gelagert.

Die Konzentration der RNA wird photometrisch bestimmt. Dazu wird die RNA-Lösung 1:99 (v/v) mit destilliertem Wasser verdünnt und die Extinktion (Photometer DU 7400, Beckman) bei 260 nm gemessen (E260 nm = 1 bei 40 ∝g RNA/mL). Gemäß der errechneten RNA-Gehalte werden die Konzentrationen der RNA-Lösungen anschließend mit DEPC-Wasser auf 1 &mgr;g/&mgr;L angeglichen und im Agarosegel überprüft.

Zur Überprüfung der RNA-Konzentrationen im horizontalen Agarosegel (1 % Agarose in 1 × MOPS-Puffer mit 0,2 &mgr;g/mL Ethidiumbromid) wird 1 &mgr;L RNA-Lösung mit 1 &mgr;L 10 × MOPS, 1 &mgr;L Farbmarker und 7 &mgr;L DEPC-Wasser versetzt, nach Ihrer Größe bei 120 V Spannung im Gel in 1 × MOPS-Laufpuffer über 1,5 h aufgetrennt und unter UV-Licht fotographiert. Eventuelle Konzentrationsunterschiede der RNA-Extrakte wrden mit DEPC-Wasser ausgeglichen und die Anpassung erneut im Gel überprüft.

Beipiel 3: Klonierung der HvCSL1 cDNA Sequenz aus Gerste

Die zur Isolation der HvCSL1 cDNA, ihrer Klonierung, Sequenzierung und Herstellung von Sonden benötigten cDNA Fragmente wurden mittel RT-PCR unter Verwendung des "One Step RT-PCR Kit" (Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland oder Qiagen, Hilden, Deutschland) erhalten. Dazu wurde Gesamt-RNA aus Gerste-Sämlingen als Matrize verwendet. Die RNA wurde aus cv. Ingrid 7 Tage nach Keimung isoliert. Darüberhinaus wurde RNA aus cv. Ingrid und den rückgekreuzten Linien mit mlo5 1,2 und 5 Tage nach Inokulation mit BghA6 am 7 Tag nach Keimung isoliert. Für die RT-PCR wurden die folgenden Primer verwendet:

Hei131 5'-GTTCGCCGTTTCCTCCCGCAACT-3' (SEQ ID NO:40)

und

Gene Racer 5'-Nested-Primer,Invitrogen

5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3' (SEQ ID NO: 41)

Für die Reaktion (25 &mgr;L-Ansatz) wurden je 1000 ng Gesamt-RNA, 0,4 mM dNTPs, je 0,6 mM OPN-1 und OPN-2 Primer, 10 &mgr;l RNase-Inhibitor und 1 &mgr;l Enzymmix in 1 × RT-Puffer (one step RT-PCR Kit, Qiagen, Hilden) eingesetzt.

Folgendes Temperaturprogramm wird verwendet (PTC-100TM Modell 96V; MJ Research, Inc., Watertown, Massachussetts): 1 Zyklus mit 30 min bei 50°C 1 Zyklus mit 150 sec bei 94°C 30 Zyklen mit 94°C für 45 sec, 55°C für 1 min und 72°C für 2 min 1 Zyklus mit 72°C für 7 min

Die PCR Produkt wurde mittels 2 % w/v Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Es wurde ein RT-PCR Produkt von insgesamt 249 bp erhalten. Die entsprechende cDNA wurde aus einem Agarosegel isoliert und in den pTOPO-Vektor (Fa. Invitrogen Life Technologies) mittels T-Überhang-Ligation kloniert. Die cDNAs wurden ausgehend von der Plasmid-DNA unter Verwendung des "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Deutschland) sequenziert.

Die cDNA-Sequenz von HvCSL1 wurde mittels der RACE-Technologie unter Verwendung des "GeneRacer Kit" (INVITROGENE Life Technologies) verlängert. Dazu wurden 100 ng poly-A mRNA, 1 &mgr;L 10 × CIP-Puffer, 10 Units RNAse-Inhibitor, 10 Units CIP ("calf intestinal phosphatase") und DEPC-behandeltes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 &mgr;L für 1 h bei 50°C behandelt. Zur Präzipitation der RNA wurden weitere 90 &mgr;L DEPC-Wasser und 100 &mgr;L Phenol:chloroform hinzugegeben und intensiv für ca. 30 sec durchmischt. Nach 5 min Zentrifugation bei 20.000 g wurde die obere Phase mit 2 &mgr;l 10 mg/ml Mussel Glycogen, 10 &mgr;l 3 M Natriumacetat (pH 5,2) in einem neuen Mikroreaktionsgefäß versetzt. 220 &mgr;l 95 % Ethanol wurden hinzugegeben und die Mischung auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die RNA durch Zentrifugation für 20 min bei 20.000 g und 4°C präzipitiert. Der Überstand wurde verworfen, 500 &mgr;l 75 % Ethanol hinzugegeben, kurz gevortext und wieder für 2 min zentrifugiert (20000 g). Der Überstand wurde wiederum verworfen, das Präzipitat für 2 min bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und anschließend in 6 &mgr;l DEPC-Wasser suspendiert. mRNA CAP-Strukturen wurden durch Zugage von 1 &mgr;l 10 × TAP Puffer, 10 Units RNAsin und 1 Unit TAP ("tobacco acid pyrophosphatase") entfernt. Die Mischung wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt. Die RNA wurde wiederum- wie oben beschrieben – präzipitiert und in ein Reaktionsgefäß mit 0,25 &mgr;g GeneRacer Oligonukleotid-Primer überführt. Der Oligonukleotid-Primer wurde in der RNA-Lösung resuspendiert, die Mischung für 5 min bei 70°C inkubiert und dann auf Eis gekühlt. 1 &mgr;l 10 × Ligasepuffer, 10 mM ATP, 1 Unit RNAsin und 5 Units T4 RNA-Ligase wurden hinzugegeben und der Reaktionsansatz für 1 h bei 37°C inkubiert. Die RNA wurde wiederum – wie oben beschrieben – präzipitiert und in 13 &mgr;l DEPC-Wasser resuspendiert. 10 pMol oligo-dT Primer wurden zu der RNA gegeben, sofort auf 70°C erhitzt und wieder auf Eis gekühlt. 1 &mgr;L jeder dNTP-Lösung (25 mM), 2 &mgr;L 10 × RT buffer, 5u (1 &mgr;l) AMV reverse Transkriptase und 20 Units RNAsin wurden hinzugegeben und die Reaktionslösung für 1 h bei 42°C und anschließend für 15 min bei 85°C inkubiert. Die so hergestellte Erststrang-cDNA wurde bei –20°C gelagert.

Zur Amplifikation der 5' und 3'-cDNA-Enden wurden nachfolgende Primer verwendet:

RACE-HvCSL1:

5'-GCCCAACATCTCTTCCTTTACCAACCT-3'(SEQ ID NO: 42)

GeneRacerTM 5'-Primer:

5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 (SEQ ID NO: 43)

GeneRacerTM 5'-Nested Primer:

5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3 (SEQ ID NO: 41)

RACE-HvCSL1-nested:

5'-TCTGGCTTTATCTGGTGTTGGAGAATC-3' (SEQ ID NO: 44)

GeneRacerTM 3'-Primer:

5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3 (SEQ ID NO: 45)

GeneRacerTM 3'-Nested Primer:

5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3 (SEQ ID NO: 46)

Der Ansatz (Gesamtvolumen 25 &mgr;L) hatte nachfolgende Zusammensetzung: 1 &mgr;l Primer RACE-HvCSL1 (5 pmol/&mgr;L), 0,5 &mgr;l GeneRacer 5'-Primer (10 pmol/&mgr;L) 2,5 &mgr;l 10 × Puffer Qiagen, 2,5 &mgr;l dNTPs (2mM) 0,5 &mgr;l cDNA 0,2 &mgr;l QiagenTAG (5 u/microL) 17,8 &mgr;l H2O

Die PCR-Bedingungen lauteten: 94°C 5 min Denaturierung 5 Zyklen mit 70°C 30 sek (Annealing),

72°C 1 min (Extension),

94°C 30 sek (Denaturierung)
5 Zyklen mit 68°C 30 sek (Annealing),

72°C 1 min (Extension),

94°C 30 sek (Denaturierung)
28 Zyklen mit 66°C 30 sek (Annealing),

72°C 1 min (Extension),

94°C 30 sek (Denaturierung)
72°C 10 min abschließende Extension

4°C Kühlung bis zur Weiterverarbeitung

Die PCR ergab ein Produkt von ca. 400 bp Produkt. Davon ausgehend wurde eine "nested"-PCR mit dem HvCSL1-spezifischen Oligonukleotidprimer und dem "GeneRacer Nested 5'-Primer" durchgeführt: 94°C 5 min Denaturierung 30 Zyklen mit 64°C 30 sek (Annealing),

72°C 1 min (Extension),

94°C 30 sek (Denaturierung)
72°C 10 min abschließende Extension

4°C Kühlung bis zur Weiterverarbeitung

Das erhaltene PCR-Produkt wurde über ein Gel isoliert, aus dem Gel extrahiert und in pTOPO mittels T-Überhang-Ligation kloniert und sequenziert. Die unter SEQ ID NO: 1 wiedergegebene Sequenz ist also identisch mit der HvCSL1-Sequenz aus Gerste.

Beispiel 4: Quantitative Polymerasekettenreaktion (Q-PCR)

Blattmaterial von Gerste cv. Ingrid wurde 7 Tage nach Keimung mit Konidiosporen des avirulenten Echten Mehltaupilzes Blumeria graminis f. sp. tritici sowie des virulenten Echten Mehltaupilzes Blumeria graminis f. sp. hordei.0, 24 bzw. 48 h nach Inokulation wurde Blattmaterial dieser Interaktionen geerntet. Zudem wurde zu gleichen Zeitpunkten nicht-infiziertes Material als Kontrolle geerntet.

Das geerntete Blattmateral wurde in Aluminiumfolie verpackt und sofort in flüssigem N2 tiefgefroren. Die Lagerung erfolgte bei –80°C. Nach dem Zerkleinern des Blattmaterials wurde die RNA wurde mit dem RNeasy Maxi Kit® der Firma QIAGEN (Hilden) nach Herstellerangaben isoliert. Die Elution erfolgte mit 1,2 ml RNase freiem Wasser. Anschließend wurde die RNA gefällt und im entsprechenden Volumen H2O aufgenommen. Die RNA-Konzentrationen wurden mit dem Eppendorf BioPhotometer 6131 bestimmt.

Tabelle 1: Konzentrationen der Gerste Gesamt-RNA

Für die quantitative PCR wurden die RNA-Proben aus Tabelle 1 eingesetzt. Von den einzelnen RNA-Proben wurde zuerst eventuell noch vorhandene DNA verdaut. Der Verdau wurde mit DNA-freeTM der Firma AMBION (Huntingdon, USA) wie folgt angesetzt: Gesamtvolumen 60 &mgr;l RNA 50 &mgr;l 10 × DNase I Buffer 6 &mgr;l DNase 1 (2U/&mgr;l) 1 &mgr;l H2O ad 60 &mgr;l 3 &mgr;l

Der Ansatz wurde für 60 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 6 &mgr;l DNase Inactivation Reagent zugegeben und der Ansatz gut gemischt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 2 min bei Raumtemperatur wurde die Lösung bei 10 000 g für 1 min zentrifugiert, um das DNase Inactivation Reagent zu pelletieren. Die RNA wurde in ein neues Gefäß überführt und bei –20°C aufbewahrt.

Nach dem Verdau wurde die RNA in DNA trankripiert. Der Ansatz erfolgte abweichend von den Herstellerangaben mit den Taq Man Reverse Transcription Reagents der Firma APPLIED BIOSYSTEMS (Applera Deutschland GmbH, Darmstadt): Gesamtvolumen 20 &mgr;l RNA 3 &mgr;l 25mM MgCl2 4,4 &mgr;l dNTP-Mix (10mM) 4 &mgr;l 50 &mgr;M Random Hexamer 1 &mgr;l 10 × RT Puffer 2 &mgr;l Rnase Inhibitor 0,4 &mgr;l Multiscribe RT (50 U/&mgr;l) 1,5 &mgr;l H2O nuclease free 3,7 &mgr;l

Der Ansatz wurde 10 min bei 25°C inkubiert, anschließend erfolgte eine Inkubation bei 37°C für 60 min. Abschließend wurde der Ansatz für 5 min bei 95°C hitzeinaktiviert.

Von der transkribierten DNA wurde jeweils 3 &mgr;l für die quantitative PCR eingesetzt. Als interner Standard wurde die 18S rRNA mitbestimmt. Von allen Proben wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt. Die Ansätze wurden in eine 96 well Platte pipettiert. Zunächst wurde der SYBR Green® Master Mix mit den Primern und der entsprechenden Menge Wasser vorgelegt, dann wurde die DNA einzeln dazupipettiert und der Ansatz gemischt. Gesamtvolumen 25 &mgr;l cDNA 3 &mgr;l 2 × SYBR Green® Master Mix 12,5 &mgr;l forward Primer, 200 nM × &mgr;l reverse Primer, 200 nM × &mgr;l H2O nuclease free add 25 &mgr;l × &mgr;l

Tabelle 2: QPCR-Primer für Gerste

Die Primer wurden mit Hilfe des Programms Primer Express von APPLIED BIOSYS-TEMS (Applera Deutschland GmbH, Darmstadt) aus der EST-Sequenz gesucht.

Die Platte wurde bei RT und 2500 rpm (Zentrifuge 4K15C, SIGMA, Osterode) für 1 min zentrifugiert, danach wurden die Proben direkt vermessen. Für die quantitative PCR wurde das Gerät ABI PRISM 7000 der Firma APPLIED BIOSYSTEMS (Applera Deutschland GmbH, Darmstadt) eingesetzt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms ABI PRISM 7000 SDS der Firma APPLIED BIOSYSTEMS (Applera Deutschland GmbH, Darmstadt).

In der Tabelle 3 sind die Expressionsdaten von HvCSL1 dargestellt. Die Messung wurde zweimal durchgeführt und eine dreifach Bestimmung der einzelnen Messwerte vorgenommen. Gezeigt sind die jeweils gemittelten Werte und die dazugehörende Standardabweichung.

Tabelle 3: Expressionsdaten von HvCSL1

Dargestellt sind die Expressionsdaten von HvGsl1, die sich aus zwei Messungen mit einer jeweiligen 3-fach Bestimmung zusammensetzen. Die eingesetzte RNA wurde DNA-Verdaut und anschließend mit dem Taq Man Reverse Transcription Reagents in DNA transkribiert. Als endogene Kontrolle diente bei der Messung 18S rRNA. Als Vergleichswert bzw. Kalibrator diente für jede Interaktion der 0 h-Wert der Messung.

Die Daten zeigen, dass in Übereinstimmung mit der Rolle von HvCSL1 als Kompatibilitätsfaktor die Expression in der kompatiblen Interaktion mit Blumeria graminis f. sp. hordei im Vergleich zur inkompatiblen Interaktion mit Blumeria graminis f. sp. tritici stark erhöht ist.

Beispiel 5: Northern-Blot Analyse

Zur Vorbereitung des Northem-Blottings wird die RNA im Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt. Ein Teil RNA-Lösung (entsprechend 5 &mgr;g RNA) wird dazu mit gleichem Volumen Probenpuffer (mit Ethidiumbromid) gemischt, 5 min bei 94°C denaturiert, 5 min auf Eis gestellt, kurz zentrifugiert und aufs Gel aufgetragen. Das 1 × MOPS-Gel (1,5 % Agarose, ultra pure) enthält 5 Volumenprozent konzentrierte Formaldehydlösung (36,5 % [v/v]). Die RNA wird bei 100 V 2 h lang aufgetrennt und anschließend geblottet.

Das Northern-Blotting erfolgt als aufwärtsgerichteter RNA-Transfer im Kapillarstrom. Das Gel wird dazu zunächst 30 min in 25 mM Natriumhydrogen/dihydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) geschwenkt und zurechtgeschnitten. Ein Whatmanpapier wird so vorbereitet, dass es auf einer horizontalen Platte auflag und auf 2 Seiten in eine Wanne mit 25 mM Natriumhydrogen/dihydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) ragt. Auf dieses Papier wird das Gel aufgelegt, wobei nicht bedeckte Teile des Whatmanpapiers mit einer Plastikfolie abgedeckt werden. Das Gel wird dann mit einer positiv geladenen Nylonmembran (Boehringer-Mannheim) luftblasenfrei abgedekt, wonach die Membran wiederum mit saugfähigem Papier in mehreren Lagen etwa 5 cm hoch bedeckt wird. Das saugfähige Papier wird noch mit einer Glasplatte und einem 100 g Gewicht beschwert. Das Blotting erfolgt über Nacht bei Raumtemperatur. Die Membran wird kurz in A. bidest geschwenkt und zur RNA-Fixierung mit einer Lichtenergie von 125 mJ im Crosslinker (Biorad) UV-Licht bestrahlt. Die Überprüfung des gleichmäßigen RNA-Transfers auf die Membran erfolgt auf der UV-Lichtbank.

Zur Detektion von Gersten mRNA werden 10 &mgr;g Gesamt-RNA aus jeder Probe über ein Agarosegel aufgetrennt und mittels Kapillartransfer auf eine positiv-geladene Nylonmembran geblottet. Die Detektion erfolgt mit dem DIG-System.

Herstellung der Sonden: Zur Hybridisierung mit den zu detektierenden mRNAs werden mit Digogygenin oder Fluoreszein markierte RNA Sonden hergestellt. Diese werden durch in vitro Transkription eines PCR-Produktes mittels einer T7 oder SP6 RNA Polymerase mit markierten UTPs erstellt. Als Vorlage für die PCR gestützte Amplifikation dienen die oben beschriebenen Plasmidvektoren.

Je nach Orienttierung des Inserts werden unterschiedliche RNA-Polymerasen zur Herstellung des antisense-Stranges herangezogen, die T7-RNA-Polymerase oder die SP6-RNA-Polymerase.

Das Insert der einzelnen Vektor wird über PCR mit flankierenden Standard-Primern (M13 fwd und rev) amplifiziert. Die Reaktion läuft dabei mit folgenden Endkonzentrationen in einem Gesamtvolumen von 50 &mgr;L PCR-Puffer (Silverstar) ab:

M13-fwd: 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3' (SEQ ID NO: 47)

M13-Rev: 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3' (SEQ ID NO: 48)

10 % Dimethylsulfoxid (v/v)

je 2 ng/&mgr;L Primer (M13 forward und reversed)

1,5 mM MgCl2,

0,2 mM dNTPs,

4 Units Taq-Polymerase (Silverstar),

2 ng/&mgr;L Plasmid-DNA.

Die Amplifikation verläuft in einem Thermocycler (Perkin-Elmar 2400) temperaturgesteuert: 94°C 3 min Denaturierung 30 Zyklen mit 94°C 30 sek (Denaturierung)

58°C 30 sek (Annealing),

72°C 1,2 min (Extension),
72°C 5 min abschließende Extension

4°C Kühlung bis zur Weiterverarbeitung

Der Erfolg der Reaktion wird im 1 %igen Agarosegel überprüft. Die Produkte werden anschließend mit einem "High Pure PCR-Product Purification Kit" (Boehringer-Mannheim) aufgereinigt. Man erhält etwa 40 &mgr;L Säuleneluat, das erneut im Gel überprüft und bei –20°C gelagert wird.

Die RNA Polymerisation, die Hybridisierung und die Immunodetektion werden weitestgehend nach Angaben des Herstellers des Kits zur nicht-radioaktiven RNA-Detektion durchgeführt (DIG System User's Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim, Kogel et al. (1994) Plant Physiol 106:1264-1277). 4 &mgr;l gereinigtes PCR-Produkt werden mit 2 &mgr;L Transskriptionspuffer, 2 &mgr;l NTP-Markierungsmix, 2 &mgr;l-NTP-Mix und 10 &mgr;l DEPC-Wasser versetzt. Anschließend werden 2 &mgr;L der T7-RNA-Polymeraselösung zu pipettiert. Die Reaktion wird dann 2 h bei 37°C durchgeführt und anschließend mit DEPC-Wasser auf 100 &mgr;L aufgefüllt. Die RNA-Sonde wird im Ethidiumbromidgel detektiert und bei –20°C gelagert.

Zur Vorbereitung der Hybridisierung werden die Membranen zunächst 1 h bei 68°C in 2 × SSC (Salt, Sodiumcitrate), 0,1 % SDS-Puffer (Sodiumdodecylsulfate) geschwenkt, wobei der Puffer 2 bis 3 mal erneuert wird. Die Membranen werden anschließend an die Innenwand auf 68°C vorgeheizter Hybridisierungsröhren angelegt und 30 min mit 10 mL Dig-Easy-Hybridisierungspuffer im vorgeheizten Hybridisierungsofen inkubiert. Währenddessen werden 10 &mgr;L Sondenlösung in 80 &mgr;L Hybridisierungspuffer bei 94°C für 5 min denaturiert, anschließend auf Eis gestellt und kurz zentrifugiert. Zur Hybridisierung wird die Sonde dann in 10 mL 68°C warmem Hybridisierungspuffer überführt, und der Puffer in der Hybridisierungsröhre durch diesen Sondenpuffer ersetzt. Die Hybridisierung erfolgt dann ebenfalls bei 68°C über Nacht.

Vor Immundetektion von RNA-RNA Hybriden werden die Blots stringent zweimal für jeweils 20 min in 0.1 % (w/v) SDS, 0.1 × SSC bei 68°C gewaschen.

Zur Immunodetektion werden die Blots zunächst zweimal für 5 min bei RT in 2 × SSC, 0,1 % SDS geschwenkt. Anschließend erfolgen 2 stringente Waschschritte bei 68°C in 0,1 × SSC, 0,1 % SDS für je 15 min. Die Lösung wird anschließend durch Waschpuffer ohne Tween ersetzt. Es wird 1 min geschüttelt und die Lösung durch Blockingreagenz ausgetauscht. Nach weiteren 30 min Schütteln wurden 10 &mgr;L Anti-Fluoreszein-Antikörperlösung hinzugefügt und weitere 60 min geschüttelt. Es folgen zwei 15 minütige Waschschritte in Waschpuffer mit Tween. Die Membran wird anschließend 2 min in Substratpuffer äquilibriert und nach Abtropfen auf eine Kopierfolie überführt. Auf der "RNA-Seite" der Membran wird dann ein Gemisch aus 20 &mgr;L CDP-StarTM und 2 mL Substratpuffer gleichmäßig verteilt. Im Anschluss wird die Membran mit einer zweiten Kopierfolie abgedeckt und an den Rändern mit Hitze luftblasenfrei und wasserdicht verschweißt. Die Membran wird dann in einer Dunkelkammer für 10 min mit einem Roentgenfilm bedeckt und dieser anschließend entwickelt. Je nach Stärke der Lumineszenzreaktion wird die Belichtungszeit variiert.

Wenn nicht extra gekennzeichnet sind die Lösungen im Lieferumfang des Kits enthalten (DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim). Alle anderen werden aus folgenden Stammlösungen durch Verdünnung mit autoklaviertem, destilliertem Wasser hergestellt. Alle Stammlösungen werden, wenn nicht anders spezifiziert, mit DEPC (wie DEPC-Wasser) angesetzt und anschließend autoklaviert.

  • – DEPC-Wasser: Destilliertes Wasser wird über Nacht bei 37°C mit Diethylpyrokarbonat (DEPC, 0,1 %, w/v) behandelt und anschließend autoklaviert
  • – 10 × MOPS-Puffer: 0,2 M MOPS (Morpholin-3-propansulfonsäure), 0,05 M Natriumacetat, 0,01 M EDTA, pH mit 10 M NaOH auf pH 7,0 eingestellt
  • – 20 × SSC (Natriumchlorid-Natriumzitrat, Salt-Sodiumcitrate): 3 M NaClo, 0.3 M triNatriumcitrat × 2H2O, pH mit 4 M HCl auf pH 7,0 eingestellt.
  • – 1 % SDS (Natriumdodecylsufat, Sodiumdodecylsulfate)Natriumdodecylsulfat (w/v), ohne DEPC
  • – RNA-Probenpufter: 760 ∝L Formamid, 260 &mgr;L Formaldehyd, 100 &mgr;L Ethidiumbromid (10 mg/mL), 80 &mgr;L Glycerol, 80 &mgr;L Bromphenolblau (gesättigt), 160 &mgr;L 10 × MOPS, 100 &mgr;L Wasser.
  • – 10 × Waschpuffer ohne Tween: 1,0 M Maleinsäure, 1,5 M NaCl; ohne DEPC, mit NaOH (fest, ca. 77 g) und 10 M NaOH auf pH 7,5 einstellen.
  • – Waschpuffer mit Tween: aus Waschpuffer ohne Tween mit Tween (0,3 %, v/v)
  • – 10 × Blockingreagenz: 50 g Blockingpulver (Boehringer-Mannheim) in 500 mL Waschpuffer ohne Tween suspendieren.
  • – Substratpuffer: 100 mM Tris (Trishydroxymethylamino-methan), 150 mM NaCl mit 4 M HCl auf pH 9,5 einstellen.
  • - 10 × Farbmarker: 50 % Glycerol (v/v), 1,0 mM EDTA pH 8,0, 0,25 % Bromphenolblau (w/v), 0,25 % Xylencyanol (w/v).

Beispiel 6: In vitro Synthese der HvCSL1-dsRNA

Alle Plasmide, die für die in vitro Transkription eingesetzt werden, beinhalten den T7 und SP6 Promotor (pGEM-T, Promega) an den jeweiligen Enden der insertierten Nukleinsäuresequenz, was die Synthese von sense- bzw. antisense RNA ermöglicht. Die Plasmide können mit geeigneten Restriktionsenzymen linearisiert werden, um eine korrekte Transkription der insertierten Nukleinsäuresequenz zu gewährleisten und ein Durchlesen in vektorielle Sequenzen zu verhindern.

Dazu werden 10 &mgr;g Plasmid-DNA jeweils mit an der distal vom Promotor gelegenen Seite des Inserts geschnitten. Die geschnittenen Plasmide werden in 200 &mgr;l Wasser mit gleichem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, in ein neues Eppendorfreaktionsgefäß (RNAse frei) transferiert und 5 min bei 20000 g zentrifugiert. 180 &mgr;l der Plasmid-Lösung werden mit 420 &mgr;l Ethanol versetzt, auf Eis gestellt und anschließend durch Zentrifugation für 30 min bei 20000 g und –4°C präzipitiert. Das Präzipitat wird in 10 &mgr;l TE Puffer aufgenommen.

Zur Herstellung der HvCSL1-dsRNA wird das Plasmid pTOPO-HvCSL1 mit Spel verdaut und sense-RNA mit der T7-RNA-Polymerase transkribiert. Ferner wird pTOPO-HvCSL1 mit Ncol verdaut und antisense-RNA mit der SP6-RNA-Polymerase transkribiert. RNA Polymerasen werden von Roche Molecular Biology, Mannheim, Deutschland bezogen.

Jeder Transkriptionsansatz beinhaltet in einem Volumen of 40 &mgr;l:

2 &mgr;l linearisierte Plasmid DNA (1 &mgr;g)

2 &mgr;l NTP's (25 mM) (1,25 mM von jedem NTP)

4 &mgr;l 10 × Reaktionspuffer (Roche Molecular Biology),

1 &mgr;l RNAsin RNAsin (27 Units; Roche Molecular Biology),

2 &mgr;l RNA Polymerase (40 Units)

29 &mgr;l DEPC-Wasser

Nach einer Inkubation von 2 h bei 37°C wird jeweils ein Teil der Reaktionsansätze aus der Transktiption des "sense"- bzw. "antisense"-Stranges gemischt, für 5 min bei 95°C denaturiert und anschließend durch Abkühlung über 30 min auf eine Endtemperatur von 37°C miteinander hybridisiert ("annealing"). Alternativ kann nach der Denaturierung das Gemisch aus sense- und antisense-STrang auch für 30 min bei –20°C gekühlt werden. Das Proteinpräzipitat, das sich während Denaturierung und Hybridisierung bildet, wird durch kurze Zentrifugation bei 20.800 g abgetrennt und der Überstand direkt zur Beschichtung von Wolframpartikeln verwendet (s. unten). Zur Analyse werden jeweils 1 &mgr;l jeden RNA-Stranges und der dsRNA auf einem nicht-denaturierenden Agarosegel aufgetrennt. Eine erfolgreiche Hybridisierung zeigt sich, durch eine Bandenverschiebung zu höherem Molekulargewicht im Vergleich zu den Einzelsträngen.

4 &mgr;l der dsRNA werden Ethanol-präzipitiert (durch Zugabe von 6 &mgr;l Wasser, 1 &mgr;l 3M Natriumacetat-Lösung und 25 &mgr;l Ethanol, sowie Zenrifugation für mindestens 5 min bei 20000 g und 4°C) und in 500 &mgr;l Wasser resuspendiert. Das Absorbtionsspektrum zwischen 230 und 300 nm wird gemessen, bzw. die Absorption bei 280 und 260 nm bestimmt, um die Reinheit und die Konzentration der dsRNA zu bestimmen. In der Regel werden 80 bis 100 &mgr;g dsRNA mit einem OD260/OD208-Verhältnis von 1,80 bis 1,95 erhalten. Ein Verdau mit DNase I kann optional durchgeführt werden, beeinflusst jedoch nachfolgende Ergebnisse nicht wesentlich.

Als Kontroll-dsRNA fungiert die dsRNA des humanen Thyroidrezeptors (Ausgangsvektor pT7betaSal (Norman C et al. (1988) Cell 55(6):989-1003); die Sequenz des Insert ist beschrieben unter der GenBank Acc.-No.: NM_000461). Für die Herstellung der sense-RNA wird das Plasmid mit Pvull, für die antsense-RNA mit Hindlll verdaut und die RNA dann mit T7- bzw. SP6 RNA-Polymerase transkribiert. Die einzelnen Verfahrensschritte zur Herstellung der Kontroll-dsRNA werden analog den oben für die HvCSL1-dsRNA beschriebenen durchgeführt.

Beispiel 7: Transiente Transformation, RNAi und Evaluation der Pilzpathogenentwicklung

Gerste cv Ingrid Blattsegmente werden mit einer HvCSL1-dsRNA zusammen mit einem GFP-Expressionsvektor transformiert. Anschließend werden die Blätter mit Bgh inokuliert und das Ergebnis nach 48 h mittels Licht- und Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Penetration in GFP-exprimierenden Zellen wird mittels Detektion von Haustorien in lebenden Zellen und durch Bewertung der Pilzentwicklung in eben diesen Zellen beurteilt. In allen sechs Experimenten führt die Bombardierung von Gerste cv Ingrid mit HvCSL1-dsRNA zu einer verminderten Anzahl von erfolgreich durch Bgh penetrierten Zellen im Vergleich zu Zellen die mit einer fremden Kontroll-dsRNA (humaner Thyroidhormonrezeptor dsRNA, TR) bombardiert werden. Der resistenzinduzierende Effekt der HvCSL1-dsRNA bedingt eine durchschnittliche Verminderung der Penetrationseffizienz durch Bgh von mindestens 20 %.

Es wird ein Verfahren zur transienten Transformation eingesetzt, das bereits für die biolistische Einführung von dsRNA in epidermale Zellen von Gerstenblättern beschrieben wurde (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). Wolframpartikel mit einem Durchmesser von 1,1 &mgr;m (Partikeldichte 25 mg/ml) werden mit dsRNA (Herstellung siehe oben) zusammen mit Plasmid-DNA des Vektors pGFP (GFP unter Kontrolle des pUBI-Promotors) als Transformationsmarker beschichtet. Dazu werden pro Schuss die nachfolgender Mengen an dsRNA bzw. Reporterplasmid zur Beschichtung verwendet: 1 &mgr;g pGFP und 2 &mgr;g dsRNA. Dopplesträngige RNA wurde mittels Verschmelzens von "sense" und "antisense"-RNA in vitro synthetisiert (s.o.).

Für Microcarrier-Präparation werden 55 mg Wolframpartikel (M 17, Durchmesser 1,1 &mgr;m; Bio-Rad, München) zweimal mit 1 ml autoklaviertem Destilliertem Wasser und einmal mit 1 mL absolutem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 1 ml 50 %igem Glycerin aufgenommen (ca. 50 mg/ml Stammlösung). Die Lösung wird mit 50 %igem Glycerin auf 25 mg/ml verdünnt, vor Gebrauch gut gemischt und im Ultraschallbad suspendiert. Zur Microcarrier-Beschichtung werden pro Schuss 1 &mgr;g Plasmid, 2 &mgr;g dsRNA (1 &mgr;L), 12,5 &mgr;l Wolframpartikel-Suspension (25 mg/ml), 12,5 &mgr;l 1 M Ca(NO3)2-Lösung (pH 10) tropfenweise unter ständigem Mischen zusammengegeben, 10 min bei RT stehengelassen, kurz zentrifugiert und 20 &mgr;l vom Überstand abgenommen. Der Rest mit den Wolframpartikeln wird resuspendiert (Ultraschallbad) und ins Experiment eingesetzt.

Es werden ca. 4 cm lange Segmente von Gerstenprimärblättern verwendet. Die Gewebe werden auf 0,5 % Phytagar (GibcoBRLTM Life TechnologiesTM, Karlsruhe) mit 20 &mgr;g/ml Benzimidazol in Petrischalen (6,5 cm Durchmesser) gelegt und direkt vor dem Partikelbeschuss an den Rändern mit einer Schablone mit einer rechteckigen Aussparung von 2,2 cm × 2,3 cm abgedeckt. Die Schalen werden nacheinander auf den Boden der Vakuumkammer (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54) gestellt, über dem ein Nylonnetz (Maschenweite 0,2 mm, Millipore, Eschborn) als Diffusor auf einer Lochplatte eingeschoben ist (5 cm über dem Boden, 11 cm unterhalb des Macrocarriers, s.u.), um Partikelklumpen zu zerstreuen und den Partikelstrom abzubremsen. Der oben an der Kammer angebrachte Macrocarrier (Plastik-Sterilfilterhalter, 13 mm, Gelman Sciences, Swinney, UK) wird je Schuss mit 5,8 &mgr;L DNA-beschichteten Wolframpartikeln (Microcarrier, s.u.) beladen. Mit einer Membranvakuumpumpe (Vacuubrand, Wertheim) wird der Druck um 0,9 bar in der Kammer reduziert und die Wolframpartikel mit 9 bar Heliumgasdruck auf die Oberfläche des Pflanzengewebes geschossen. Sofort danach wird die Kammer belüftet. Zur Markierung transformierter Zellen werden die Blätter mit dem Plasmid (pGFP; Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; zur Verfügung gestellt von Dr. P. Schweizer Schweizer P, Institut für Pflanzengenetik IPK, Gatersleben, Deutschland) beschossen. Vor dem Schießen eines anderen Plasmids wird der Macrocarrier jeweils gründlich mit Wasser gereinigt. Nach vierstündiger Inkubation nach dem Beschuss bei leicht geöffneten Petrischalen, RT und Tageslicht werden die Blätter mit 100 Konidien/mm2 des Echten Gerstenmehltaupilzes (Rasse A6) inokuliert und für weitere 4036 bis 48 h unter gleichen Bedingungen inkubiert.

Blattsegmente werden mit den beschichteten Partikeln unter Verwendung einer "particle inflow gun" bombardiert. Pro Schuss werden 312 &mgr;g Wolframpartikel appliziert. 4 h nach der Bombardierung wird Inokulation mit Blumeria graminis f.sp. hordei Mehltau (Rasse A6) inokuliert und nach weiteren 40 h bezüglich der Infektionsanzeichen ausgewertet. Das Ergebnis (z.B. die Penetrationseffizienz, definiert als prozentualer Anteil angegriffener Zellen, die ein mit reifems Haustorium und einer Sekundärhyphae ("secondary elongating hyphae"), wird mittels Fluoreszens- und Lichtmikroskopie analysiert. Eine Inokulation mit 100 Konidien/mm2 ergibt eine Angriffsfrequenz von ca. 50 der transformierten Zellen. Für jedes einzelne Experiment wird eine minimale Anzahl von 100 Interaktionsstellen ausgewertet. Transformierte (GFP exprimierende) Zellen werden unter Anregung mit blauem Licht identifiziert. Drei verschiedene Katagorien von transformierten Zellen können unterschieden werden:

  • 1. Penetrierte Zellen, die ein leicht erkennbares Haustorium beinhalten. Eine Zelle mit mehr als einem Haustorium wird als eine Zelle gewertet.
  • 2. Zellen, die durch ein Pilz-Appressorium zwar angegriffen wurden, aber kein Haustorium beinhalten. Eine Zelle, die mehrfach von Bgh angegriffen wird, aber kein Haustorium enthält, wird als eine Zelle gewertet.
  • 3. Zellen, die nicht durch Bgh angegriffen sind.

Stomatazellen und Stomatanebenzellen werden von der Bewertung ausgeschlossen. Oberflächenstrukturen von Bgh werden mittels Lichtmikroskopie oder Fluoreszenzfärbung des Pilzes mit 0,1 % Calcofluor (w/v in Wasser) für 30 sec analysiert. Die Entwicklung des Pilzes kann leicht durch Fluoreszenzmikroskopie nach Anfärbung mit Calcofluor evaluiert werden. In HvCSL1-dsRNA transformierten Zellen entwickelt der Pilz zwar ein primäres und ein appressoriales Keimschlauch ("Germ-Tube"), aber kein Haustorium. Haustoriumausbildung ist eine Vorbedingung für die Bildung einer Sekundärhyphe.

Die relative Penetrationseffizien (RPE) errechnet sich als Differenz aus der Penetrationseffizienz bei transformierten Zellen (Transformation mit HvCSL1- oder KontroldsRNA) und der Penetrationseffizienz bei untransformierten Zellen (durchschnittliche Penetrationseffizienz 50 – 60 %). Die prozentuale RPE (%-RPE) errechnet sich aus der RPE minus 1 und multipliziert mit 100.

%-RPE = 100·(RPE-1)

Der %-RPE-Wert (Abweichung von der durchschnittlichen Penetrationseffizienz der Kontrolle) dient der Bestimmung des Suszeptibilität von Zellen, die mit HvCSL1-dsRNA transfiziert sind.

Bei der Kontroll-dsRNA wird bei fünf unabhängigen Versuchen kein Unterschied zwischen der Transfektion mit der Kontroll dsRNA und Wasser bezüglich der Penetrationseffizienz von Bgh beobachtet.

SEQUENCE LISTING

Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Erhöhung der Resistenz gegenüber Mesophyllzellen penetrierende Pathogene in einer Pflanze, oder einem Organ, Gewebe oder einer Zelle davon, dadurch gekennzeichnet, dass die Kallose Synthase Aktivität in der Pflanze oder einem Organ, Gewebe oder einer Zelle davon im Vergleich zu Kontrollpflanzen reduziert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Pathogene ausgewählt sind aus den Familien der Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocreaceae.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität eines Kallose Synthase Proteins umfassend die Sequenzen gezeigt in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 oder 35 oder eines Proteins das zu diesen eine Homologie von mindestens 40 % aufweist reduziert ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die der Pflanze, dem pflanzlichen Organ, Gewebe oder der Zelle zur Verfügung stehende Kallose Synthase Aktivität dadurch reduziert wird, dass die Aktivität mindestens eines Polypeptids reduziert wird, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

    a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 oder 35 gezeigte Sequenz;

    b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 oder 34 umfasst;

    c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 oder 35 aufweist;

    d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 oder 35 kodiert;

    e) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; und

    f) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Kallose Synthase, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und

    g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Kallose Synthase, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann;

    oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst;
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass

    a) die Expression mindestens einer Kallose Synthase reduziert wird;

    b) die Stabilität mindestens einer Kallose Synthase oder der zu dieser Kallose Synthase korrespondierenden mRNA Moleküle reduziert wird;

    c) die Aktivität mindestens einer Kallose Synthase reduziert wird;

    d) die Transkription mindestens eines der für eine Kallose Synthase kodierenden Gene durch Expression eines endogenen oder artifiziellen Transkriptions-faktors reduziert wird; oder

    e) ein exogener die Kallose Synthase Aktivität reduzierender Faktor zu der Nahrung oder dem Medium hinzugegeben wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung der Kallose-Synthase Aktivtät erreicht wird durch Anwendung mindestens eines Verfahrens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

    a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für Ribonukleinsäuremoleküle geeignet zur Bildung von Doppelstrang-Ribonukleinsäuremolekülen (dsRNA), wobei der Sense-Strang des dsRNA-Moleküls mindestens eine Homologie von 30 % zu einem in Anspruch 4 charakterisierten Nukleinsäuremoleküls aufweist oder ein Fragment von mindestens 17 Basenpaaren umfasst, welches mindestens eine 50 % Homologie zu einem in Anspruch 4 (a) oder (b) charakterisierten Nukleinsäuremoleküls aufweist,

    b) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein Antisense-Ribonukleinsäuremolekül welches zumindest eine Homologie von 30 % zum nicht kodierenden Strang eines in Anspruch 4 charakterisierten Nukleinsäuremoleküls aufweist oder ein Fragment von mindestens 15 Basenpaaren umfasst, welches mindestens eine 50 % Homologie zu einem nicht kodierenden Strang eines in Anspruch 4 (a) oder (b) charakterisierten Nukleinsäuremoleküls aufweist,

    c) Einbringen eines Ribozyms welches spezifisch die von einem der in Anspruch 4 benannten Nukleinsäuremoleküle kodierten Ribonukleinsäuremoleküle spaltet oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette,

    d) Einbringen eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls wie in Anspruch 6 b) spezifiziert, kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette,

    e) Einbringen von Nukleinsäuremolekülen kodierend für Sense-Ribonukleinsäuremoleküle kodierend für ein Polypeptid welches durch ein in Anspruch 4 charakterisiertes Nukleinsäuremolekül kodiert wird, insbesondere der Proteine gemäß den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 und/oder 35 oder für Polypeptide die zumindest eine 40% Homologie zu der Aminosäuresequenz eines Polypeptide aufweisen, die durch die in Anspruch 4 benannten Nukleinsäuremoleküle kodiert werden,

    f) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für ein dominant-negatives Polypeptid geeignet zur Unterdrückung der Kallose Synthase Aktivität oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette,

    g) Einbringen eines Faktoren, der spezifisch das Kallose Synthase Polypeptid oder die für dieses Polypeptid kodierenden DNA- oder RNA-Moleküle binden kann oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette,

    h) Einbringen eines viralen Nukleinsäuremoleküls, das einen Abbau von für Kallose Synthasen kodierende mRNA Moleküle bewirkt oder einer dessen Expression gewährleistenden Expressionskassette,

    i) Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts geeignet zur Induktion einer homologen Rekombination an Genen kodierend für Kallose Synthasen; und

    j) Einführung einer oder mehr inaktivierenden Mutationen in ein oder mehr Gene kodierend für Kallose Synthasen.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend

    a) die Einbringung einer rekombinanten Expressionskassette enthaltend in funktioneller Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotor, eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 6 (a-i) in eine pflanzliche Zelle;

    b) Regeneration der Pflanze aus der pflanzlichen Zelle, und

    c) Expression besagter Nukleinsäuresequenz in einer Menge und für eine Zeit, hinreichend um eine Pathogenresistenz in besagter Pflanze zu erzeugen oder zu erhöhen.
  8. Verfahren nach Anspnuch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem in Pflanzen aktiven Promotor um einen Pathogen-induzierbaren Promotor handelt.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem in Pflanzen aktiven Promotor um einen Mesophyll spezifischen Promotor handelt.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass in der Pflanze, dem pflanzlichen Organ, Gewebe oder der Zelle ein Bax Inhibitor 1-Protein exprimiert wird.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Bax-Inhibitor 1 unter Kontrolle eines Mesophyll und/oder Wurzel spezifischen Promotors exprimiert wird.
  12. Verfahren nach einem der Anspruche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Pathogen ausgewählt ist aus den Arten Puccinia triticina, Puccinia striiformis, Mycosphaerella graminicola, Stagonospora nodorum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae oder Microdochium nivale.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt ist aus der Pflanzenfamilie der Poaceae.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze aus den Pflanzengattungen Hordeum, Avena, Secale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza ausgewählt ist.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze aus den Arten Hordeum vulgare (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Secale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) Zea mays (Mais) und Oryza sative (Reis) ausgewählt ist.
  16. Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid kodiert welches ein Polypeptid umfasst, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

    a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID No: 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31 oder 33 gezeigte Sequenz;

    b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz nach der SEQ ID No: 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, oder 32 umfasst;

    c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40 % zu den Sequenzen SEQ ID No: 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31 oder 33 aufweist;

    d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31 oder 33 kodiert;

    e) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; und

    f) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Kallose Synthase, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert;

    g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Kallose Synthase, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann;

    oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst; wobei das Nukleinsäuremolekül nicht aus der in SEQ ID NO: 1, 18, 20 oder 34 gezeigten Sequenz besteht.
  17. Protein kodiert durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 16, wobei das Protein nicht aus der in SEQ ID. NO. 2,19, 21 oder 35 gezeigten Sequenz besteht.
  18. Doppelsträngiges RNA-Nukleinsäuremolekül (dsRNA-Molekül) wobei der Sense-Strang des besagten dsRNA-Moleküls mindestens eine Homologie von 30 % zu dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 16 aufweist, oder ein Fragment von mindestens 50 Basenpaaren umfasst, welches mindestens eine 50 % Homologie zu dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 16 besitzt.
  19. dsRNA-Molekül nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden RNA-Stränge kovalent miteinander verbunden sind.
  20. DNA Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz die im wesentlichen identisch ist zu einem Nukleinsäure-molekül gemäß Anspruch 16, wobei besagte Nukleinsäuresequenz in Sense-Orientierung zu einem Promotor vorliegt.
  21. DNA Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz die im wesentlichen identisch ist zu einem Nukleinsäure-molekül gemäß Anspruch 16, wobei besagte Nukleinsäure-sequenz in Antisense-Orientierung zu einem Promotor vorliegt.
  22. DNA Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein dsRNA-Molekül gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei besagte Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor verknüpft ist.
  23. DNA Expressionskassette nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit einem in Pflanzen funktionellen Promotor verknüpft ist.
  24. DNA Expressionskassette nach Anspruch 23, wobei der in Pflanzen funktionelle Promotor ein pathogen-induzierbarer Promotor ist.
  25. Vektor enthaltend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24.
  26. Transgene Zelle, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 16, ein dsRNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19, eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24 oder einen Vektor gemäß Anspruch 25.
  27. Monokotyledoner Organismus enthaltend eine Nukleinsäure-sequenz gemäß Anspruch 16, welche eine Mutation enthält, die eine Verminderung der Aktivität eines der durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß Anspruch 16 kodierten Proteine in den Organismen oder Teilen davon bewirkt.
  28. Transgener monokotyledoner Organismus enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 16, ein dsRNA-Molekül gemäß Anspruch 18 oder 19, eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24 oder einen Vektor gemäß Anspruch 25.
  29. Organismus gemäß Anspruch 27 oder 28, der über eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität verfügt.
  30. Organismus gemäß Anspruch 29, der eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität in Mesophyllzellen und/oder Wurzelzellen besitzt.
  31. Organismus nach einem der Ansprüche 27 bis 30, der der Pflanzenfamilie Poaceae angehört.
  32. Organismus gemäß Anspruch 31, ausgewählt aus den Pflanzengattungen Hordeum, Avena, Secale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza.
  33. Organismus gemäß Anspruch 32, ausgewählt aus den Arten Hordeum vulgare (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Secale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) und Oryza sative (Reis).
  34. Verwendung eines Vektors nach Anspruch 25, einer transgenen Zelle nach Anspruch 26, einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 16, einem Protein nach Anspruch 17, eines dsRNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 18 oder 19, eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 20 bis 24 zur Herstellung einer Pflanze, resistent gegen Mesophyllgewebe penetrierende Pathogene.
  35. Ernte oder Vermehrungsmaterial enthaltend die transgene Zelle nach Anspruch 26, oder einen Vektor nach Anspruch 25, oder eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 16, oder ein Protein nach Anspruch 17, oder eine dsRNA-Molekül nach einem der Ansprüche 18 oder 19, oder eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 20 bis 24.
Es folgt kein Blatt Zeichnungen






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