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Dokumentenidentifikation DE69826556T2 02.02.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000877055
Titel Verwendung eines blutverträglichen Materials mit supramolekularer Struktur
Anmelder President of Japan Advanced Institute of Science and Technology, Hokuriku, Ishikawa, JP
Erfinder Yui, Nobuhiko, Tatsunokuchimachi, Ishikawa-ken, JP;
Terano, Minoru, Tatsunokuchimachi, Ishikawa-ken, JP;
Mori, Hideharu, Tatsunokuchimachi, Ishikawa-ken, JP
Vertreter v. Bezold & Sozien, 80799 München
DE-Aktenzeichen 69826556
Vertragsstaaten BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.05.1998
EP-Aktenzeichen 983035197
EP-Offenlegungsdatum 11.11.1998
EP date of grant 29.09.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.02.2006
IPC-Hauptklasse C08L 71/00(2006.01)A, F, I, ,  ,  ,   
IPC-Nebenklasse A61L 33/00(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines blutverträglichen supramolekularen Materials und konkreter die Verwendung eines blutverträglichen Materials mit einer supramolekularen Struktur, welches zur Unterdrückung des Metabolismus von Thrombozyten in der Lage ist.

Medizinische Vorrichtungen, welche in Kontakt mit Blut gebracht werden, wie z. B. künstliche Organe, extrakorporale Blutkreisläufe und Blutbeutel, müssen eine sehr zuverlässige Blutverträglichkeit aufweisen.

Herkömmlicherweise werden solche medizinischen Vorrichtungen aus Harzen auf Polyolefinbasis, wie z. B. Polypropylen und Polyethylen, hergestellt, da solche Harze eine hohe mechanische Festigkeit aufweisen und leicht geformt werden können. Jedoch sind die zur Herstellung der medizinischen Vorrichtungen verwendeten herkömmlichen polymeren Materialien nicht blutverträglich. Deshalb müssen die herkömmlichen medizinischen Vorrichtungen zusammen mit einem Anti-Blutkoagulans eingesetzt werden. In Anbetracht möglicher schädlicher Einflüsse auf den menschlichen Körper oder das Blut ist die Zeit des kontinuierlichen Einsatzes des Anti-Blutkoagulans jedoch begrenzt. Dementsprechend ist die medizinische Behandlung, bei der eine solche herkömmliche medizinische Vorrichtung verwendet wird, zeitlich sehr begrenzt.

Unter diesen Umständen wurden und werden derzeit eine große Anzahl von Forschungsarbeiten durchgeführt, um ein Material zu entwickeln, welches eine ausgezeichnete Blutverträglichkeit aufweist. Als typisches Beispiel dafür gibt es ein Verfahren zur Fixierung eines Antithrombotikums, wie z. B. Heparin, auf der Oberfläche einer Vorrichtung zur medizinischen Behandlung, welche in Kontakt mit Blut gebracht wird. Jedoch erfordert ein solches Verfahren eine Behandlung zur Fixierung des Antithrombotikums für jede einzelne medizinische Vorrichtung und ist deshalb nicht effizient und beinhaltet ferner den Nachteil einer Verringerung der antithrombotischen Eigenschaft, welche durch beispielsweise Ablösen des Antithrombotikums verursacht wird.

Somit besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, die Verwendung eines blutverträglichen Materials zur Unterdrückung des Thrombozyten-Metabolismus bereitzustellen, welches keine Modifizierung seiner Oberfläche erfordert und selbst eine ausgezeichnete Verträglichkeit aufweist.

In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Material mit supramolekularer Struktur bei der Herstellung eines blutverträglichen Materials zur Unterdrückung des Thrombozyten-Metabolismus bereitgestellt, wobei das Material von supramolekularer Struktur eine Vielzahl cyclischer Verbindungen und ein hydrophiles geradkettiges Polymer, das in Hohlräume der cyclischen Verbindungen eingefädelt ist, umfasst, wobei beide Enden des geradkettigen Polymers jeweils mit biologisch abbaubaren Gruppen versehen sind, welche ausreichend sperrig sind, um das Entfädeln der cyclischen Verbindungen zu verhindern.

Diese Erfindung lässt sich vollständiger anhand der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Begleitzeichnungen verstehen, worin:

1 eine Ansicht ist, welche schematisch eine Struktur des hier beschriebenen blutverträglichen Materials zeigt;

2 ein Diagramm ist, welche die Unterdrückungswirkung der Verwendung des blutverträglichen Materials der vorliegenden Erfindung bezüglich einer Erhöhung des freien zytoplasmatischen Calciums, induziert durch Thrombin, zusammen mit Vergleichsbeispielen zeigt;

3 ein Diagramm ist, welches die Anisotropie von DPH-Fluoreszenzpolarisation zeigt; und

4 ein Diagramm ist, welches die Wirkung der Verwendung des erfindungsgemäßen blutverträglichen Materials auf die Membranfluidität zeigt.

Die vorliegende Erfindung wurde nicht mit dem Ansatz der herkömmlichen Entwicklung des blutverträglichen Materials erzielt, sondern auf der Grundlage des Befunds, dass Polyrotaxane einer supramolekularen Struktur, worin sich ein geradkettiges Polymer in eine Vielzahl cyclischer Verbindungen einfädelt, zur Unterdrückung des Metabolismus von Thrombozyten dient.

Kürzlich wurde die Forschung auf dem Gebiet der supramolekularen Chemie von Polyrotaxanen mit einer Struktur, in der sich eine hochmolekulare Kette in eine große Anzahl cyclischer Verbindungen einfädelt, sehr populär. Beispielsweise offenbart die offengelegte japanische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 8-92130 ein biologisch abbaubares Medikament-Polymer-Aggregat mit einer supramolekularen Struktur, umfassend eine Vielzahl Medikament-gebundener cyclischer Verbindungen, welche durch Bindung eines Medikaments an Cyclodextrine hergestellt wurden, und eine geradkettige Polymerverbindung, welche sich in die Hohlräume dieser cyclischen Verbindungen einfädelt.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass ein bestimmter Typ von Polyrotaxan den Metabolismus von Thrombozyten unterdrückt oder inhibiert, und deshalb weist ein solches Polyrotaxan als solches eine ausgezeichnete Blutverträglichkeit auf, und auf Grundlage dieses Befunds haben sie die vorliegende Erfindung zum Abschluss gebracht.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten cyclischen Verbindungen sind vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, welche aus &agr;-Cyclodextrin, &bgr;-Cyclodextrin, &ggr;-Cyclodextrin und einer Mischung davon besteht. Von diesen ist &agr;-Cyclodextrin besonders bevorzugt.

In der vorliegenden Erfindung besitzt das geradkettige hydrophile Polymer, welches sich in die Hohlräume der cyclischen Verbindungen einfädelt, biologische Verträglichkeit und bevorzugte Beispiele davon sind Polyethylenglycol (manchmal als PEG bezeichnet) und Copolymere von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol. Vorzugsweise sollten diese geradkettigen hydrophilen Polymere ein Zahlenmittel-Molekulargewicht von 200 bis 10.000, und bevorzugter 400 bis 5.000, aufweisen. Vorzugsweise sollten die Copolymere von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol Polyethylenglycol in einer Menge von 10 bis 90 Mol-%, bevorzugter 30 bis 60 Mol-%, aufweisen. Falls diese geradkettigen hydrophilen Polymere von dem Typ sind, der von Anfang an sperrige Gruppen an beiden Enden aufweist, wird ein solches Polymer nicht in die Hohlräume der cyclischen Verbindungen eingefädelt. Deshalb sollten jene Polymere mit solchen kleinen Gruppen wie eine Methylgruppe, Methoxygruppe und Aminogruppe, welche das Einfädeln des hydrophilen Polymers in die cyclischen Verbindungen nicht blockieren, an beiden Enden eingesetzt werden, um zuerst in die Hohlräume der cyclischen Verbindungen eingefädelt zu werden.

Das hydrophile Polymer kann in die Hohlräume der cyclischen Verbindungen eingefädelt werden durch einen einfachen Vorgang der Zugabe einer wässerigen Lösung der hydrophilen Polymerverbindung tropfenweise zu einer gesättigten wässerigen Lösung der cyclischen Verbindung, gefolgt von Rühren. Mit diesem Vorgang kann eine supramolekulare Struktur (Polyrotaxan), bei der eine hydrophile Polymerverbindung in die Hohlräume cyclischer Verbindungen eingefädelt ist, in Form eines Präzipitats erhalten werden.

Nach dem Erhalt des Polyrotaxans, bei dem ein geradkettiges hydrophiles Polymer in die Hohlräume einer Vielzahl cyclischer Verbindungen eingefädelt ist, werden beide Enden des geradkettigen Polymers jeweils mit biologisch abbaubaren Gruppen versehen, welche ausreichend sperrig sind, um das Entfädeln der cyclischen Verbindungen zu verhindern.

Vorzugsweise sollten die biologisch abbaubaren Gruppen aus einer Oligopeptidkette bestehen, deren Einheit eine Aminosäure ist, wie z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Serin, Threonin, Thyrosin, Cystein, Lysin, Arginin oder Histidin, oder einer Oligosaccharidkette, deren Grundeinheit ein Zucker ist, wie z. B. Dextrin, Hyaluronsäure, Chitin, Chitosan, Argininsäure, Chondroitinsulfat, Stärke oder Pullulan. Die Oligopeptidkette und Oligosaccharidkette sollte jeweils vorzugsweise 1 bis 5 Grundeinheiten enthalten und die Einheiten können vom selben Typ oder verschiedene Typen sein.

Diese biologisch abbaubare Gruppe kann nach einem im Stand der Technik an sich bekannten Verfahren, beispielsweise der Umesterung, eingeführt werden.

Bezüglich des blutverträglichen Materials einer supramolekularen Struktur, bestehend aus einem geradkettigen hydrophilen Polymer, das in die Hohlräume von Cyclodextrinen eingefädelt ist, wurde festgestellt, dass das Material eine noch effektivere Blutverträglichkeit aufweisen wird, wenn die Cyclodextrine hydroxypropyliert sind. Eine Modellstruktur eines solchen blutverträglichen Materials mit einer supramolekularen Struktur (d. h. HP-&agr;/E-PHE, synthetisiert im folgenden Beispiel) ist schematisch in 1 dargestellt. Wie aus 1 ersichtlich, besteht die supramolekulare Struktur aus einer Vielzahl von &agr;-Cyclodextrinen und einem Polyethylenglycol, das in die Hohlräume der &agr;-Cyclodextrine eingefädelt ist, wobei L-Phenylalanin eingeführt und an beide Enden des Polyethylenglycols gebunden ist. Jedes &agr;-Cyclodextrin enthält Hydroxypropyl-Gruppen als Ergebnis der Hydroxypropylierung. Vorzugsweise sollten 2 bis 16, bevorzugter 6 bis 9, Hydroxypropyl-Gruppen pro Cyclodextrinmolekül, wie z. B. &agr;-Cyclodextrin, vorliegen.

Das blutverträgliche Material hat eine Polyrotaxan-Struktur (supramolekulare Struktur), bei der ein geradkettiges hydrophiles Polymer in die Hohlräume einer Vielzahl cyclischer Verbindungen (&agr;-Cyclodextrin und dgl.) eingefädelt ist, und deshalb dient das Material zur Erhöhung der Membranfluidität von Blutzellen, welche in Kontakt mit dem Material gebracht werden. Ferner kann im Zusammenhang damit das Material eine Erhöhung der Konzentration an zytoplasmatischem freien Calcium unterdrücken und den intrazellulären Metabolismus in Blutzellen regulieren, welcher von der Calciumkonzentration abhängt. Die biologisch abbaubaren Gruppen an beiden Enden des hydrophilen Polymers werden durch ein Enzym abgebaut, welches damit sofort alle cyclischen Verbindungen, in die das Polymer eingefädelt ist, freisetzt, und diese werden in vivo absorbiert und ausgeschieden.

Beispiele Synthese von blutverträglichem Material

Zu gesättigten wässerigen Lösungen von &agr;-Cyclodextrin (&agr;-CD) werden 10 gew.-%ige wässerige Lösungen von &agr;-[(2-Amino-2-ethylmethyl)-x-oxypropyl]-&ohgr;-(amino-&ggr;-oxypropyl)polyethylenglycol (x + y = 2,5) mit einem Zahlenmittel-Molekulargewicht Mn des Polyethylenglycols von 2000 (hier im Folgenden "PEG-BA 2000", geliefert von Suntechno Chemical Co., Tokio, Japan, als JEFFAMINE® ED-2001) und &agr;-(3-Aminopropyl)-&ohgr;-(aminopropyl)polyethylenglycol mit Mn 4000 (im Folgenden "PEG-BA 4000", geliefert von Sanyo Chemical Co. Ltd., Kyoto, Japan, als IONET® YB-400) jeweils tropfenweise zugegeben und gerührt, um jeweils weiße Präzipitate (Polyrotaxane) zu ergeben.

Die Aminogruppen an beiden Enden eines jeden PEG wurden mit durch Umesterung wie folgt mit L-Phenylalanin (L-Phe)-Endgruppen versehen.

Benzyloxycarbonyl (als Z abzukürzen)-L-Phe (geliefert von Wako Pure Chemical Co. Ltd.) wurde in trockenem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, gefolgt von der Zugabe des jeweiligen Polyrotaxans. Dann wurde DMSO der resultierenden Suspension bis zur Homogenität zugegeben und bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt.

Die erhaltenen Polyrotaxane, deren beiden Enden mit Z-L-Phe-Endgruppen (&agr;/E2-PHE-Z bzw. &agr;/E4-PHE-Z, wobei E2 das Polyrotaxan mit PEG eines Mn von 2000 repräsentiert und E4 das Polyrotaxan mit PEG eines Mn von 4000 repräsentiert) versehen waren, wurden mit Propylenoxid in 1 N wässeriger NaOH-Lösung bei Raumtemperatur 24 Stunden lang umgesetzt. Nach Neutralisation mit wässeriger HCl-Lösung wurde die resultierende Lösung gegen Wasser dialysiert und das resultierende Produkt wurde lyophilisiert. So wurden Z-L-Phe-terminierte hydroxypropylierte Polyrotaxane erhalten.

Schließlich wurde die Z-Gruppe in jedem der Z-L-Pheterminierten Polyrotaxane unter einer Wasserstoffatmosphäre mit Palladium-Kohlenstoff entfernt, um hydroxypropylierte Polyrotaxane (HP-&agr;/E2-PHE und HP-&agr;-/E4-PHE) zu ergeben. (Wenn sie zusammen genannt werden, wird hier im Folgenden der allgemeine Begriff HP-&agr;/E-PHE verwendet werden.) Die Anzahl von &agr;-CDs in HP-&agr;/E2-PHE und HP-&agr;/E4-PHE wurde mittels 1H-NMR als etwa 11 bzw. 22 bestimmt. Der Grad der Hydroxypropylierung (d. h. die Anzahl der Hydroxypropylgruppen pro &agr;-CD) wurde ebenfalls als 8 pro &agr;-CD in sowohl HP-&agr;/E2-PHE als auch HP-&agr;/E4-PHE durch 1H-NMR bestimmt.

Als Referenzproben wurden hydroxypropyliertes &agr;-CD (HP-&agr;-CD) und L-Phe-terminierte PEGs (E2-PHE und E4-PHE, diese werden hier im Folgenden manchmal zusammen als "E-PHE" bezeichnet werden) wie folgt hergestellt:

  • (1) HP-&agr;-CD wurde durch Hydroxypropylierung von &agr;-CD auf dieselbe Weise wie im Falle von HP-&agr;/E-PHEs erhalten. Der Hydroxypropylierungsgrad wurde als 8 pro &agr;-CD mittels 1H-NMR bestimmt.
  • (2) E2-PHE und E4-PHE wurden durch Umsetzung von Z-L-Phe-Succinimid und PEG-BA 2000 bzw. PEG-BA 4000 in DMF synthetisiert. Die Reaktionsmischungen wurden in überschüssigen trockenen Ether gegossen und dann mit Ether gewaschen, um E2-PHE und E4-PHE zu ergeben.

Messungen von Eigenschaften der Polyrotaxane durch statische Lichtstreuungs(SLS)-Messungen

Das Gewichtsmittel-Molekulargewicht (Mw), die Assozierungszahl, der zweite Virialkoeffizient (A2) und der Trägheitsradius (Rg) von HP-&agr;/E-PHEs wurden mittels SLS-Messungen unter Verwendung eines Lichtstreuungsinstruments (Otsuka Electronics, Co., Osaka, Japan, DLS-7000), das mit einem He-Ne-Laser von 10 mW (mit einer Wellenlänge von 633 nm) ausgerüstet war, bestimmt.

Konkreter wurden 0,2 g HP-&agr;/E-PHE in 10 ml 0,05 M Phosphatpufferlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 gelöst und 48 Stunden lang bei 37°C gerührt. Die resultierende Lösung wurde durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,45 &mgr;m filtriert und verdünnte Proben wurden im Bereich von 0,5 bis 8,0 mg/ml hergestellt. Diese Probenlösungen wurden durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,2 &mgr;m in eine Lichtstreuungszelle überführt. Die Messungen wurden über den Winkelbereich von 30 bis 150° bei 37 ± 0,5°C durchgeführt.

In derselben Weise wurden SLS-Messungen von HP-&agr;-CD und E-PHE durchgeführt.

Die Zunahme des Brechungsindex von HP-&agr;/E2-PHE- und HP-&agr;/E4-PHE-Lösungen bei 37°C wurden unter Einsatz eines Doppelstrahl-Differenzialrefraktometers (Otsuka Electronics, Co., Osaka, Japan, DRM-1030) als 0,16 bzw. 0,14 mg/Liter (L) bestimmt. Die Mw-, A2- und Rg-Werte von HP-&agr;/E-PHEs und E-PHEs wurden aus graphischen Darstellungen von (Kc/R(&thgr;)) gegen sin2 (&thgr;/2) (Zimm-Plot) erhalten, wobei K eine Kombination bekannter optischer Konstanten ist, c die Konzentration ist und R(&thgr;) das Rayleigh-Verhältnis. Die Mw- und A2-Werte von HP-&agr;-CD wurden durch (Kc/R(&thgr;)) gegen c (Debye-Plot) in einem Konzentrationsbereich von 10–50 mg/ml erhalten. Es sollte angemerkt werden, dass E2-PHE in einem Konzentrationsbereich von 10–50 mg/ml nicht vollständig gelöst war und deshalb wurde nur der in dem PBS lösliche Anteil gemessen. Ferner wurden die Mw- und A2-Werte von HP-&agr;-CD durch einen Debye-Plot erhalten und deshalb wurde der Rg-Wert von HP-&agr;-CD nicht Bestimmt.

Die Assoziationszahl wurde aus dem erhaltenen Gewichtsmittel-Molekulargewicht und dem Molekulargewicht des Monomers abgeschätzt. Die Ergebnisse der SLS-Messungen sind in TABELLE 1 unten zusammengefasst. Wie aus TABELLE 1 ersichtlich, betrugen die geschätzten Assoziationszahlen von HP-&agr;/E2-PHE und HP-&agr; beide etwa 2 und die geschätzte Assoziationszahl von HP-&agr;/E4-PHE betrug etwa 20. Ferner betrug die geschätzte Assoziationszahl von E-PHE etwa 50. Die A2-Werte von HP-&agr;/E-PHE und HP-&agr;-CD betrugen 2 × 104 bis 6 × 104 ml·Mol/g2, wohingegen derjenige von E-PHE 0,25 × 104 bis 0,90 × 104 ml·Mol/g2 betrug. Die Werte von HP-&agr;/E-PHE und dessen Komponenten-Molekülen liegen im Bereich von 64 bis 150 nm.

Messung der Änderung von freiem zytoplasmatischen Calcium in Thrombozyten

Die Konzentration an zytoplasmatischem freien Calcium ([Ca2+)i) in Thrombozyten wurde unter Einsatz einer Thrombozytensuspension, die mit 1-(2-(5'-Carboxyoxazol-2'-yl)-6-amonobenzofuran-5-oxy)-2-(2'-amino-5'-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-pentaacetoxymethylestertetraacetat (Fura 2-AM) beladen worden war, auf dieselbe Weise wie von J. Biomater. Sci. Polym. Edn. 4, 199 (1993) und J. Biomater. Sci. Polym. Edn. 4, 199 (1993) von Yui et al. untersucht.

Eine Thrombozytensuspension in Ca2+- und Mg2+-freier Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) (Thrombozytenkonzentration: 3 × 108/ml) wurde aus Citrat-behandeltem Blut von männlichen weißen Japan-Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5–3,0 kg präpariert. Fura 2-AM wurde in die Thrombozyten eingebracht durch Inkubation der Thrombozytensuspension mit Fura 2-AM-Lösung bei 37°C für 60 Minuten bei einer Fura 2-AM-Konzentration von 5 &mgr;M. Die Thrombozyten wurden mit HBSS gewaschen und schließlich in HBSS resuspendiert, sodass die endgültige Thrombozytenkonzentration 3 × 108/ml betrug. Die Thrombozytensuspension wurde mit CaCl2 erneut calcifiziert, sodass die externe Calciumkonzentration unmittelbar vor der Verwendung in HP-&agr;/E-PHE-Messungen 1 mM betrug.

100 &mgr;l an 10 gew.-%iger HP-&agr;/E-PHE-Lösung in HBSS wurde mit 400 &mgr;l der obigen Fura-2-AM-beladenen Thrombozytensuspension gemischt und in einer Fluoreszenzküvette in einem Fluorimeter (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japan, Modell CAF-100), ausgerüstet mit einem Magnetrührer, bei 37°C gerührt. Dann wurde Thrombin der Mischung zugegeben. Die Mischung wurde sowohl bei 340 als auch bei 380 nm angeregt und die Emission bei 500 nm gemessen. Die Fluoreszenzintensitäten bei jeder der beiden Wellenlängen wurden zur Feststellung des Fluoreszenzdichroismus-Verhältnisses 340/380 (R) verwendet. Die Konzentration an zytoplasmatischem freien Calcium, [Ca2+]i, wurde auf Grundlage des R-Werts auf dieselbe Weise wie in J. Biol. Chem., 260, 3440 (1985) von G. Grynkiewicz et al. angegeben berechnet.

Als Kontrolle wurden 100–200 nM [Ca2+]i in nicht verwendeten Thrombozyten vor dem Mischen mit der Lösung untersucht. Zur Minimierung von zeitabhängigen Effekten auf die Thrombozytenfunktionen oder eines Austritts von Fura 2-AM wurden diese Experimente innerhalb von 1 h nach der Beladung mit Fura 2-AM abgeschlossen.

Auf dieselbe Weise wurde [Ca2+]i für die Komponenten-Moleküle von Polyrotaxanen und deren Mischung berechnet.

Als Ergebnis wurde wenig Veränderung in dem Fluoreszenzverhältnis von Fura 2-AM beobachtet, wenn eine HP-&agr;/E-PHE-Lösung der Thrombozytensuspension zugegeben wurde. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass HP-&agr;/E-PHEs keine Erhöhung der Konzentration an zytoplasmatischem freien Calcium [Ca2+]i induzierten, d. h., die Thrombozyten wurden durch HP-&agr;/E-PHEs nicht aktiviert. Dann wurde Thrombin (Endkonzentration: 0,1 Einheit/ml) der Thrombozytensuspension 1 min nach dem Mischen mit HP-&agr;/E-PHE-Lösung zugegeben. Die Thrombin-induzierte Erhöhung der Konzentration an zytoplasmatischem freien Calcium [Ca2+]i wurde durch die Zugabe von HP-&agr;/E2-PHE-Lösung signifikant inhibiert (2).

Als Referenzproben zeigte eine Mischung von HP-&agr;-CD und E2-PHE (HP-&agr;-CD + E2-PHE) und E2-PHE eine geringere Hemmwirkung auf die [Ca2+]i-Erhöhung, obwohl andere Komponenten-Moleküle, HP-&agr;-CD und PEG (E2-OH), keine inhibitorische Wirkung zeigten (2).

Beurteilung der Blutzell-Membranfluidität

Es wurde berichtet, dass etwaige physikochemische Veränderungen in Plasmamembranen, einschließlich erhöhter Fluidität, die Funktion von Membranproteinen und/oder den intrazellulären Metabolismus bestimmter Zellsysteme dominieren (Biochem. Biophys. Acta, 886, 109 (1986) von C. H. Bamford et al. und Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 368 (1979)). Unter diesem Gesichtspunkt wurde die Wirkung der Polyrotaxane auf die Plasmamembranfluidität unter Anwendung einer DPH-beladenen RBC-Ghost-Suspension untersucht.

Spezieller wurde Citrat-behandeltes Blut von männlichen weißen Japan-Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5–2,8 kg gewonnen und mit 1000 UpM 15 min lang zentrifugiert, um rote Blutzellen (RBCs) zu erhalten. Die RBCs wurden mit 0,155 M NaCl-Lösung (pH 7,4) gewaschen und mit 1000 UpM zweimal 10 min lang zentrifugiert. Die Suspension wurde mit einem 15–20-fachen Volumen von 0,01 M PBS (pH 7,4) mehrere Male gewaschen. Nach einer Zentrifugation mit 18000 UpM für 30 min bei 4°C wurde die erhaltene RBC-Ghost-Suspension mit 0,155 M NaCl-Lösung (pH 7,4) mit einem Mikro-BCA-Verfahren, erörtert in Anal. Biochem. 150, 76 (1985), von P. K. Smith et al., auf 0,1 mg Prot.·mL–1 eingestellt. Eine Lösung von 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien (DPH) (Wako Pure Chemical Co. Ltd.) in Tetrahydrofuran (2 mM) wurde in die RBC-Ghost-Suspension auf 2 &mgr;M verdünnt und unter sanfter mechanischer Bewegung bei 37°C 60 min lang im Dunkeln inkubiert.

Die Fluoreszenzanisotropie von DPH in RBC-Ghosts wurde gemessen, um die Membranfluidität zu ermitteln. Fluoreszenzemissionsspektren (360–500 nm) von DPH-beladenen RBC-Ghosts wurden bei einer Anregungswellenlänge von 360 nm überprüft. 100 &mgr;l Polyrotaxan-Lösung in 0,155 M NaCl-Lösung (pH 7,4) wurden mit 400 &mgr;l von DPH-beladener RBC-Ghost-Suspension in einer Fluoreszenzküvette in einem Spektralfluorimeter (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japan, FP-777) ausgerüstet mit einem Fluoreszenzpolarisationszusatzgerät (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japan, ADP-300) bei 37°C unter Magnetrühren gemischt. DPH wurde bei 360 nm angeregt und die Fluoreszenz bei 430 nm nachgewiesen. Die Spaltbreiten für sowohl Anregung als auch Emission betrugen 10 nm. Die Fluoreszenzintensitäten wurden mit Polarisatoren gemessen, welche in die Anregungs- und Emissionslichtwege eingebracht worden waren. Die Fluoreszenzanisotropie, <r>, wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: <r> = (IH – IHb) – G(IV – IVb)/((IH – IHb) + 2G((IV – IVb) wobei IH und IV Emissionsintensitäten sind, welche mit dem analysierenden Polarisator horizontal und vertikal zum polarisierten Anregungsstrahl beobachtet wurden; IHb und IVb Fluoreszenzintensitäten für die Blindlösung (0,155 M NaCl-Lösung) bei derselben Position des Polarisators wie IH und IV sind; und G ein Korrekturfaktor ist, gleich IV/IH', wobei die Apostrophen eine in horizontaler Richtung polarisierte Anregung anzeigen.

Auf dieselbe Weise wurde <r> für die Komponenten-Moleküle von HP-&agr;/E-PHEs und deren Mischung gemessen.

Die Fluoreszenzanisotropie, <r>0, betrug etwa 0,23–0,27 in nicht verwendeten RBC-Ghosts, was mit dem berichteten <r>0-Wert (Neurochem. 38, 1699 (1982), von C. Sambilla) übereinstimmt. Wie in 3 gezeigt, wurde <r> durch die Zugabe von HP-&agr;/E-PHE-Lösung sofort verringert, was eine Zunahme der Membranfluidität von RBC-Ghosts anzeigt. (In 3 zeigt die mit &#9826; dargestellte Linie den Fall der Kontrolle (0,155 M NaCl) an, die mit &#9744; dargestellte Linie zeigt den Fall von HP-&agr;-CD an, die mit &Dgr; dargestellte Linie zeigt den Fall der Mischung von HP-&agr;-CD und E2-PHE an, und die mit O dargestellte Linie zeigt den Fall von HP-&agr;/E2-PHE an). 4 fasst die Veränderungen in <r> durch die Zugabe von HP-&agr;/E-PHE-Lösungen (<r>t–<r>0) neben den Veränderungen durch die Zugabe ihrer Komponenten-Moleküle und Mischungen davon zusammen. Wie aus 4 ersichtlich, induzierte HP-&agr;/E2-PHE eine signifikante Abnahme von <r>, obwohl HP-&agr;-CD + E2-PHE und E2-PHE geringere Auswirkungen auf die Membranfluidität zeigten. HP-&agr;-CD und E2-OH zeigten keine Wirkungen auf die Membranfluidität. Ein solches spezifisches Phänomen des Polyrotaxans wurde auch im Falle von PEG mit einem Mn von 4000 (HP-&agr;/E4-PHE) beobachtet.

Wie aus den obigen Resultaten ersichtlich, ist das aus Polyrotaxan hergestellte blutverträgliche Material in der Lage, eine Erhöhung der Thrombin-induzierten Konzentration an zytoplasmatischem freien Calcium effektiv zu inhibieren oder zu unterdrücken. Wie besonders im Falle von HP-&agr;/E2-PHE zu sehen ist, waren diese Wirkungen der Polyrotaxane signifikanter als bei ihren Komponenten-Molekülen (wie z. B. einer Mischung von HP-&agr;-CD und L-PHE-terminierten PEGs). Ferner wurde eine erhöhte Membranfluidität von RBC-Ghosts am deutlichsten mit dem blutverträglichen Material der vorliegenden Erfindung beobachtet. Ferner offenbarte eine SLS-Studie, dass eine spezifische supramolekulare Assoziation der Polyrotaxane aufgrund eines hydrophilen-hydrophoben Gleichgewichts von eingefädelten HP-&agr;-CDs und terminalen L-Phe-Gruppierungen vorlag. Diese Befunde sind von großer Bedeutung für die Regulation des intrazellulären Metabolismus in Blutzellen durch diese Polyrotaxane. Jedes der Moleküle, welche das blutverträgliche Material der vorliegenden Erfindung ausmachen, ist für den Organismus harmlos. Die biologisch abbaubaren Gruppen an den Enden des hydrophilen Polymers werden von einem Enzym abgebaut und deshalb werden alle cyclischen Verbindungen, in die das geradkettige hydrophile hochmolekulare Molekül eingefädelt ist, gleichzeitig freigesetzt, um in vivo absorbiert und ausgeschieden zu werden.

Wie oben beschrieben, wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines blutverträglichen Materials bereitgestellt, welches in der Lage ist, den Metabolismus von Thrombozyten zu unterdrücken, und selbst eine ausgezeichnete Blutverträglichkeit aufweist. Das blutverträgliche Material wird metabolisiert, wenn es abgebaut und im Körper absorbiert ist, und kann deshalb nicht nur bei einer extrakorporalen medizinischen Vorrichtung angewandt werden, welche in Kontakt mit Blut gebracht wird, wie z. B. künstliche Organe, Blutbeutel und extrakorporale Blutzirkulationskreisläufe, sondern auch in intrakorporalen enthetischen Mikromaschinen für die medizinische Versorgung.


Anspruch[de]
  1. Verwendung eines Materials mit einer supramolekularen Struktur zur Herstellung eines blutverträglichen Materials zur Unterdrückung des Thrombozyten-Metabolismus, wobei das Material mit einer supramolekularen Struktur eine Mehrzahl cyclischer Verbindungen und ein hydrophiles geradkettiges Polymer, das in Hohlräume der cyclischen Verbindungen eingefädelt ist, umfasst, wobei beide Enden des geradkettigen Polymers jeweils mit biologisch abbaubaren Gruppen versehen sind, welche ausreichend sperrig sind, um das Entfädeln der cyclischen Verbindungen zu verhindern.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die cyclischen Verbindungen aus der Gruppe bestehend aus &agr;-Cyclodextrin, &bgr;-Cyclodextrin, &ggr;-Cyclodextrin oder einer Mischung davon ausgewählt sind.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das geradkettige Polymer ein Polyethylenglycol mit einem Zahlenmittel-Molekulargewicht von 200 bis 10.000 ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das geradkettige Polymer ein Copolymer von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol ist, welches ein Zahlenmittel-Molekulargewicht von 200 bis 10.000 aufweist und Polyethylenglycol in einer Menge von 10 bis 90 Mol-% enthält.
  5. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische abbaubare Gruppe eine Oligopeptidkette oder Oligosaccharidkette umfasst.
  6. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Cyclodextrin hydroxypropyliert ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Cyclodextrin 2 bis 16 Hydroxypropyl-Gruppen pro Molekül aufweist.
Es folgen 2 Blatt Zeichnungen






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