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Dokumentenidentifikation DE69829679T2 02.02.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001017793
Titel VARIANTEN DER CYCLOMALTODEXTRIN GLUCANOTRANSFERASE
Anmelder Novozymes A/S, Bagsvaerd, DK
Erfinder ANDERSEN, Carsten, DK-3500 Värlöse, DK;
NIELSEN, Rönfeldt, Bjarne, DK-2830 Virum, DK;
DIJKHUIZEN, Lubbert, NL-9751 NN Haren, NL;
DIJKSTRA, Bauke, NL-9751 NN Haren, NL
Vertreter Patentanwälte Isenbruck Bösl Hörschler Wichmann Huhn, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69829679
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.09.1998
EP-Aktenzeichen 989450838
WO-Anmeldetag 23.09.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/DK98/00412
WO-Veröffentlichungsnummer 0099015633
WO-Veröffentlichungsdatum 01.04.1999
EP-Offenlegungsdatum 12.07.2000
EP date of grant 06.04.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.02.2006
IPC-Hauptklasse C12N 9/10(2006.01)A, F, I, ,  ,  ,   
IPC-Nebenklasse C12P 19/18(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      

Beschreibung[de]
TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft Varianten der Cyclomaltodextrin-Glucano-Transferase mit erhöhter Produktspezifität.

HINTERGRUND

Die Cyclomaltodextrin-Glucano-Transferase (E. C. 2.4.1.19), auch bezeichnet als Cyclodextrin-Glucano-Transferase oder Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase und im folgenden CGTase genannt, katalysiert die Umwandlung von Stärke und ähnlichen Substraten in Cyclomaltodextrine über eine intramolekulare Transglycosylierungsreaktion, wodurch Cyclomaltodextrine, im folgenden Cyclodextrine (oder CD) genannt, unterschiedlicher Größen gebildet werden. Wirtschaftlich am bedeutendsten sind Cyclodextrine mit 6, 7 und 8 Glucoseeinheiten, die als &agr;-, &bgr;- bzw. &ggr;-Cyclodextrine bezeichnet werden. Kommerziell weniger wichtig sind Cyclodextrine mit 9, 10 und 11 Glucoseeinheiten, die als &dgr;-, &egr;- bzw. &zgr;-Cyclodextrine bezeichnet werden.

Cyclodextrine sind folglich zyklische Glucoseoligomere mit einer hydrophoben innen liegenden Spalte. Sie sind in der Lage Einschlusskomplexe mit vielen kleinen hydrophoben Molekülen in wässrigen Lösungen zu bilden, was zu Veränderungen der physikalischen Eigenschaften führt, z.B. erhöhte Löslichkeit und Stabilität und erniedrigte chemische Reaktivität und Flüchtigkeit. Cyclodextrine finden insbesondere in der Lebensmittel-, kosmetischen, chemischen und pharmazeutischen Industrie Anwendung.

Die meisten CGTasen haben sowohl Stärke-abbauende Aktivität als auch Transglycosylierungs-Aktivität. Obwohl einige CGTasen hauptsächlich &agr;-Cyclodextrine herstellen und einige CGTasen hauptsächlich &bgr;-Cyclodextrine herstellen, bilden CGTasen für gewöhnlich eine Mischung von &agr;-, &bgr;- und &ggr;-Cyclodextrinen. Selektive Fällungsschritte mit organischen Lösungsmitteln können zur Isolierung von getrennten &agr;-, &bgr;- und &ggr;-Cyclodextrinen verwendet werden. Um teure und für die Umwelt schädliche Verfahren zu vermeiden, ist die Verfügbarkeit von CGTasen, die in der Lage sind, einen erhöhten Anteil eines bestimmten Typs von Cyclodextrin, insbesondere im Hinblick auf &agr;-, &bgr;- oder &ggr;-Cyclodextrin, herzustellen, wünschenswert.

WO 96/33267 (Novo Nordisk) beschreibt CGTase-Varianten, die eine modifizierte Substratbindung und/oder Produktselektivität zeigen. Obwohl die CGTase-Varianten, die durch Mutation an den Positionen 47, 145, 146, 147, 196 oder 371 hergestellt worden waren, beschrieben wurden, wurden die spezifischen CGTase-Varianten dieser Erfindung niemals beschrieben oder sogar nahegelegt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt neue CGTase-Varianten mit erhöhter Produktspezifität bereit. Obwohl CGTase-Varianten mit erhöhter Produktspezifität im Stand der Technik (WO 96/33267) bereits beschrieben wurden, wurden die CGTase-Varianten der vorliegenden Erfindung bisher weder beschrieben noch nahegelegt.

Es ist uns nun gelungen, in der ungeheuren Zahl von möglichen CGTase-Varianten eine begrenzte Anzahl von Varianten zu finden, die im Vergleich zu dem Wildtyp-Enzym eine erhöhte Produktspezifität zeigen.

Folglich stellt die Erfindung eine CGTase-Variante mit erhöhter Produktspezifität bereit, in welcher ein oder mehrere der Aminosäurereste entsprechend den folgenden Positionen durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurden (CGTase Nummerierung):

  • (i) Position 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47K; 47N; 47P; 47R; 47S; 47T; 47V; 47W oder 47Y;
  • (ii) Position 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q oder 145V;
  • (iii) Position 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V oder 146Y;
  • (iv) Position 147: 147C; 147D; 147E; 147N; 147Q
  • (v) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V oder 196W; 196Y und/oder
  • (vi) Position 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M; 371Q; 371R; 371T; 371V oder 371W.

Aminosäuren

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung werden die folgenden Symbole und Abkürzungen für Aminosäuren und Aminosäurereste verwendet:

A
= Ala = Alanin
C
= Cys = Cystein
D
= Asp = Asparaginsäure
E
= Glu = Glutaminsäure
F
= Phe = Phenylalanin
G
= Gly = Glycin
H
= His = Histidin
I
= Ile = Isoleucin
K
= Lys = Lysin
L
= Leu = Leucin
M
= Met = Methionin
N
= Asn = Asparagin
P
= Pro = Prolin
Q
= Gln = Glutamin
R
= Arg = Arginin
S
= Ser = Serin
T
= Thr = Threonin
V
= Val = Valin
W
= Trp = Tryptophan
Y
= Tyr = Tyrosin
B
= Asx = Asp oder Asn
Z
= Glx = Glu oder Gln
X
= Xaa = Eine beliebige Aminosäure
*
= Deletion oder nicht vorhandene Aminosäure

CGTase-Varianten

Eine CGTase-Variante dieser Erfindung ist eine CGTase-Variante oder mutierte CGTase mit einer Aminosäuresequenz, die in der Natur nicht gefunden wird.

Als eine CGTase-Variante oder mutierte CGTase dieser Erfindung kann ein funktionelles Derivat eines Vorläufer-CGTase-Enzyms (d.h. das native, elterliche oder Wildtyp-Enzym) in Betracht gezogen werden und dies kann durch Veränderung einer DNA-Nukleotidsequenz eines Vorläufergens oder seiner Derivate, die das Vorläuferenzym kodieren, erhalten werden. Die CGTase-Variante oder mutierte CGTase kann exprimiert und hergestellt werden, wenn die DNA-Nukleotidsequenz, die die CGTase-Variante kodiert, in einem geeigneten Vektor in einen geeigneten Wirtsorganismus eingeführt wird. Der Wirtsorganismus ist nicht notwendigerweise identisch mit dem Organismus, aus dem das Vorläufergen ursprünglich stammte.

In der Literatur werden Enzymvarianten auch als Mutanten oder Muteine bezeichnet.

CGTase-Nummerierung

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird eine spezifische Nummerierung der Positionen der Aminosäurereste in CGTase-Enzymen eingesetzt. Durch Anlagerung (alignment) der Aminosäuresequenzen verschiedener bekannter CGTasen ist es möglich, jeder beliebigen Position eines Aminosäurerestes in jedem beliebigen CGTase-Enzym, dessen Aminosäuresequenz bekannt ist, eine CGTase-Aminosäure-Positionsnummer eindeutig zuzuordnen.

Unter Verwendung des Nummerierungssystems, das von der Aminosäuresequenz der CGTase stammt, die aus Bacillus circulans Stamm 251 erhalten wurde und die an die Aminosäuresequenz einer Reihe anderer bekannter CGTasen angelagert wird, ist es möglich, die Position eines Aminosäurerests in einem CGTase-Enzym eindeutig anzuzeigen.

Dieses CGTase-Nummerierungssystem wurde bereits in WO 96/33267 beschrieben, siehe Tabelle 1, Seiten 9–31 (in der Tabelle ist Bacillus circulans Stamm 251 als a dargestellt). Tabelle 1 von WO 96/33267 zeigt auch die Proteinsequenzen einer Anzahl relevanter CGTasen und wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.

Bei der Beschreibung der verschiedenen CGTase-Varianten, die erfindungsgemäß hergestellt oder in Betracht gezogen wurden, wurden zur Vereinfachung der Bezugnahme die folgenden Nomenklaturen angepasst:

[Ursprüngliche Aminosäure; Position; Substituierte Aminosäure]

Folglich wird die Substitution eines Serins mit Alanin in Position 145 als S145A bezeichnet.

Die Aminosäurereste, die im Hinblick auf die Aminosäuresequenz der CGTase aus Bacillus circulans Stamm 251 Insertionen darstellen, werden nummeriert, indem Buchstaben in alphabetischer Reihenfolge an die vorangegangene CGTase-Nummer angefügt werden, wie z.B. Position 91aF für das „Insert" Phe zwischen Thr bei Position 91 und Gly bei Position 92 der Aminosäuresequenz der CGTase aus Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627, vergl. Tabelle 1 (j).

Die Deletion eines Prolins an Position 149 wird als P149* angezeigt und eine Insertion zwischen Position 147 und 148, wo kein Aminosäurerest vorhanden ist, wird als *147aD für die Insertion einer Asparaginsäure an Position 147a angegeben.

Mehrfache Mutationen werden durch Markierung mittels Schrägstrich („/") getrennt, z.B. S145A/D147L, was Mutationen an Positionen 145 und 147 darstellt, an denen Serin mit Alanin bzw. Asparaginsäure mit Leucin substituiert wurde.

Wenn eine Substitution durch Mutation z.B. einer CGTase, die aus einem Stamm von Bacillus circulans stammt, durchgeführt wird, wird das Produkt z.B. „B. circulans/S145A" genannt.

Alle Positionen, auf die in dieser Anmeldung mittels CGTase-Nummerierung Bezug genommen wird, beziehen sich auf die oben beschriebenen CGTase-Nummern.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung wird durch die Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen dargestellt, in denen:

1 zeigt eine Darstellung der Substratsbindungsspalte von B. circulans St. 251 CGTase. Die gestrichelten Linien zeigen Wasserstoffbrücken zwischen dem Enzym (Wasser) und dem Substrat. Die Spaltungsstelle ist zwischen Glucoserest –1 und 1 definiert.

Die 2, 3 und 4 zeigen Cyclodextrine, die während der Inkubation von (mutierten) CGTase-Proteinen aus Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes gebildet wurden. A. Wildtyp (2); B. Variante D196H (3); C. Variante D371R (4).

AUSFÜHRLICHE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt neue CGTase-Varianten bereit, d.h. CGTase-Varianten mit einer Aminosäuresequenz, die in der Natur nicht gefunden wird. Formell kann die erfindungsgemäße CGTase-Variante als ein funktionelles Derivat eines Vorläufer-CGTase-Enzyms (d.h. des nativen, elterlichen oder Wildtyp-Enzyms) durch Substitution, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäurerests/e des Vorläuferenzyms angesehen werden.

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung ist eine CGTase-Variante mit erhöhter Produktspezifität eine CGTase-Variante, die in der Lage ist, einen erhöhten Anteil eines bestimmten Typs von Cyclodextrin im Vergleich zu dem Wildtyp-Enzym herzustellen.

In einer erfindungsgemäßen CGTase-Variante wurden ein oder mehrere Aminosäurereste entsprechend den folgenden Positionen (CGTase-Nummerierung) durch Substitution und/oder Insertion eingeführt:

  • (i) Position 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47K; 47N; 47P; 47R; 475; 47T; 47V; 47W oder 47Y;
  • (ii) Position 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q oder 145V;
  • (iii) Position 146: 146H, 146K; 146L; 146T; 146V oder 146Y;
  • (iv) Position 147: 147C; 147D; 147E; 147N; 147Q;
  • (v) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W oder 196Y und/oder
  • (vi) Position 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M; 371Q; 371R; 371T; 371V oder 371W.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden CGTase-Varianten, die im Hinblick auf die Herstellung von &agr;-Cyclodextrin eine erhöhte Produktspezifität zeigen, bereitgestellt, wobei in die Varianten eine oder mehrere Aminosäurereste entsprechend folgender Positionen (CGTase-Nummerierung) durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurden:

  • (i) Position 47: 47F; 47K; 47R; 47W oder 47Y;
  • (ii) Position 145: 145D; 145H; 145N oder 145Q;
  • (iii) Position 146: 146H, 146K; 146L; 146T; 146V oder 146Y;
  • (iv) Position 147: 147C; 147D; 147E; 147N; 147Q;
  • (v) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W oder 196Y und/oder
  • (vi) Position 371: 371C; 371H; 371K; 371R oder 371T.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden CGTase-Varianten, die im Hinblick auf die Herstellung von &bgr;-Cyclodextrin eine erhöhte Produktspezifität zeigen, bereitgestellt, wobei in die Varianten eine oder mehrere Aminosäurereste entsprechend folgender Positionen (CGTase-Nummerierung) durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurden:

  • (i) Position 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47N; 47P; 475; 47T; 47V; 47W oder 47Y;
  • (ii) Position 145: 145D; 145I; 145N oder 145V;
  • (iii) Position 147: 147E;
  • (iv) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W oder 196Y und/oder
  • (v) Position 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M; 371Q; 371R; 371T; 371V oder 371W.

In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform werden CGTase-Varianten, die im Hinblick auf die Herstellung von &ggr;-Cyclodextrin eine erhöhte Produktspezifität zeigen, bereitgestellt, wobei in die Varianten eine oder mehrere Aminosäurereste entsprechend folgender Positionen (CGTase-Nummerierung) durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurden:

  • (i) Position 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47N; 47P; 475; 47T; 47V; 47W oder 47Y;
  • (ii) Position 145: 145D; 145I; 145N oder 145V;
  • (iii) Position 147: 147E;
  • (iv) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W oder 196Y und/oder
  • (v) Position 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371K; 371M; 371Q; 371R; 371T oder 371W.

Die erfindungsgemäße CGTase-Variante kann von jedem beliebigen CGTase-Enzym, das in der Natur gefunden wird, stammen. Allerdings stammt die erfindungsgemäße CGTase-Variante vorzugsweise von einem mikrobiellen Enzym, bevorzugt einem bakteriellen Enzym und bevorzugt stammt die CGTase-Variante von einem Stamm von Bacillus, einem Stamm von Brevibacterium, einem Stamm von Clostridium, einem Stamm von Corynebacterium, einem Stamm von Klebsiella, einem Stamm von Micrococcus, einem Stamm von Thermoanaerobium, einem Stamm von Thermoanaerobacter, einem Stamm von Thermoanaerobacterium, einem Stamm von Thermoanaerobacterium oder einem Stamm von Thermoactinomyces.

In einer stärker bevorzugten Ausführungsform stammt die erfindungsgemäße CGTase-Variante von einem Stamm von Bacillus autolyticus, einem Stamm von Bacillus cereus, einem Stamm von Bacillus circulans, einem Stamm von Bacillus circulans var. alkalophilus, einem Stamm von Bacillus coagulans, einem Stamm von Bacillus firmus, einem Stamm von Bacillus halophilus, einem Stamm von Bacillus macerans, einem Stamm von Bacillus megaterium, einem Stamm von Bacillus ohbensis, einem Stamm von Bacillus stearothermophilus, einem Stamm von Bacillus subtilis, einem Stamm von Klebsiella pneumonia, einem Stamm von Thermoanaerobacter ethanolicus, einem Stamm von Thermoanaerobacter finnii, einem Stamm von Clostridium thermoamylolyticum, einem Stamm von Clostridium thermosaccharolyticum oder einem Stamm von Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes.

In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform stammt die erfindungsgemäße CGTase-Variante von dem Stamm Bacillus sp. Stamm 1011, dem Stamm Bacillus sp. Stamm 38-2, dem Stamm Bacillus sp. Stamm 17-1, dem Stamm Bacillus sp. 1-1, dem Stamm Bacillus sp. Stamm B1018, dem Stamm Bacillus circulans Stamm 8, dem Stamm Bacillus circulans Stamm 251 oder dem Stamm Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 oder Mutanten oder Varianten hiervon.

Wenn die erfindungsgemäße CGTase-Variante von einem Stamm von Bacillus circulans stammt, können ein oder mehrere Aminosäurereste entsprechend der folgenden Positionen eingeführt sein:

  • (i) Position R47: R47C; R47D; R47E; R47F; R47G; R47I; R47K; R47N; R47P; R47S; R47T; R47V; R47W oder R47Y;
  • (ii) Position S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q oder S145 V;
  • (iii) Position S146: S146H; S146K; S146L; S146T; S146V oder S146Y;
  • (iv) Position D147: D147C; D147E; D 47N; D147Q;
  • (v) Position D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W oder D196Y und/oder
  • (vi) Position D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371M; D371Q; D371R; D371T; D371V oder D371W.

Vorzugsweise stammt die CGTase-Variante von Bacillus circulans Stamm 251 oder einer Mutante oder Variante hiervon.

Wenn die CGTase-Variante von einem Stamm von Thermoanaerobacter sp. stammt, können ein oder mehrere Aminosäurereste entsprechend der folgenden Positionen eingeführt sein:

  • (i) Position K47: K47C; K47D; K47E; K47F; K47G; K47I; K47N; K47P; K47R; K47S; K47T; K47V; K47W oder K47Y;
  • (ii) Position S 145: S 145D; S 145H; S 145I; S 145N; S 145Q oder S 145 V;
  • (iii) Position E146: E146H, E146K; E146L; E146T; E146V oder E146Y;
  • (iv) Position T147: T147C; T147D; T147E; T147N; T147Q;
  • (v) Position D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W oder D196Y und/oder
  • (vi) Position D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371M; D371Q; D371R; D3717; D371V oder D371W.

Vorzugsweise stammt die CGTase-Variante von dem Stamm Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 oder einer Mutante oder Variante hiervon.

Beispiel 1 beschreibt die Konstruktion der T. thermosulfurigenes CGTase-Varianten Asp196His (D196H) und Asp371Arg (D371R) mit modifizierter Produktspezifität, in denen die ortsspezifische Mutagenese zu einer veränderten Anzahl von Wasserstoffbrücken in der Substratunterbindestelle der Spalte des aktiven Zentrums führte. Die Varianten stammen von einer Thermoanaerobacter thermosulfurigenes EM1 CGTase (d.h. dem Wildtyp), der wie von Haeckl und Bahl beschrieben erhalten wurde [Haeckl, K., und Bahl, H. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60, 333–338 oder Knegtel R. M. A., Wind R. D., Rozeboom H. J., Kalk K. H., Buitelaar R. M., Dijkhuizen L., Dijkstra B. W. J. Mol. Biol. 256: 611–622 (1996)].

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße CGTase-Variante einen oder mehrere der folgenden Aminosäurereste (CGTase-Nummerierung):

  • (i) 47K/145E/146V/147N;
  • (ii) 47K/145E/146E/147N;
  • (iii) 47K/145D/146R/147D;
  • (iv) 47K/145DI146E/147D;
  • (v) 47K/145E/146V/147N/196H;
  • (vi) 47K/145E/146E/147N/196H;
  • (vii) 47K/145E/146V/147N/196H/371R;
  • (viii) 47K/145E/146E/147N/196H/371R;
  • (ix) 47K/145D/146R/147D/196H;
  • (x) 47K/145D/146E/147D/196H;
  • (xi) 47K/145D/146R/147D/196H/371R und/oder
  • (xii) 47K/145D/146R/147D/196H/371R.
  • (xiii) 47K/196H;
  • (xiv) 47R/196H
  • (xv) 145E/146V/147N;
  • (xvi) 145E/146E/147N;
  • (xvii) 145D/146R/147D;
  • (xviii) 145D/146E/147D;
  • (xix) 47K/371R;
  • (xx) 47R/371R;

Wenn die CGTase-Variante von einem Stamm von Bacillus circulans stammt, kann einer oder mehrere der folgenden Aminosäurereste eingeführt sein:

  • (i) R47K/S145E/S146V/D147N;
  • (ii) R47K/S145E/S146E/D147N;
  • (iii) R47K/S145D/S146R;
  • (iv) R47K/S145D/S146E;
  • (v) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H;
  • (vi) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H;
  • (vii) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H/D371R;
  • (viii) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H/D371R;
  • (ix) R47K/S145D/S146R/D196H;
  • (x) R47K/S145D/S146E/D196H;
  • (xi) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R;
  • (xii) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R.
  • (xiii) R47K/D196H;
  • (xiv) S145E/S146V/D147N;
  • (xv) S145E/S146E/D147N;
  • (xvi) S145D/S146R;
  • (xvii) S145D/S146E;
  • (xviii) R47K/D371R;

Vorzugsweise stammt die CGTase-Variante aus Bacillus circulans Stamm 251 oder einer Mutante oder Variante hiervon.

Wenn die CGTase-Variante von einem Stamm von Thermoanaerobacter sp. stammt, kann einer oder mehrere der folgenden Aminosäurereste eingeführt sein:

  • (i) S145E/E146V/T147N;
  • (ii) S145E/T147N;
  • (iii) S145D/E146R/T147D;
  • (iv) S145D/T147D;
  • (v) S145E/E146V/T147N/D196H;
  • (vi) S145E/T147N/D196H;
  • (vii) S145E/E146V/T147N/D196H/D371R;
  • (viii) S145E/T147N/D196H/D371R;
  • (ix) S145D/E146R/T147D/D196H;
  • (x) S145D/T147D/D196H;
  • (xi) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R;
  • (xii) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R.
  • (xiii) S145E/E146V/T147N;
  • (xiv) S145E/T147N;
  • (xv) S145D/E146R/T147D;
  • (xvi) S145D/T147D und/oder
  • (xvii) K47R/D371R;
  • (xviii) K47R/D196H.

Vorzugsweise stammt die CGTase-Variante aus dem Stamm Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 oder einer Mutante oder Variante hiervon.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen CGTase-Variante zur Erhöhung des &agr;- oder &bgr;- oder &ggr;-Cyclodextringehalts eines Cyclodextrin-Endprodukts eines Cyclodextrinverfahrens.

In einem letzten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Produktspezifität im Hinblick auf die Herstellung von &agr;- oder &bgr;- oder &ggr;-Cyclodextrinen, wobei ein oder mehrere Aminosäurereste entsprechend der oben genannten Positionen der erfindungsgemäßen CGTase-Variante durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurden.

BEISPIELE BEISPIEL 1 Konstruktion von T. thermosulfurigenes CGTase-Varianten mit modifizierter Produktspezifität. Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen

Escherichia coli JM109 [endA1 recA1 gyrA96 thi hsdR17(rK-,mK+) relA1 supE44 (lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZ M15] (Yanish-Perron et al. 1985 Gene 33, 103–119) wurde für rekombinante DNA-Manipulationen verwendet. Escherichia coli PC1990 (Lazzaroni und Portalier 1979 FEMS Microbiol. Lett. 5, 411–416), von dem bekannt ist, dass es auf Grund einer Mutation in seinem tolB Locus periplasmatische Proteine in den Überstand austreten lässt, wurde zur Herstellung von (mutierten) CGTase-Proteinen verwendet. Das Plasmid pCT2, ein Derivat von pUC18 enthaltend das amyA Gen von Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1 (Knegtel R. M. A., Wind R. D., Rozeboom H. J., Kalk K. H., Buitelaar R. M., Dijkhuizen L., Dijkstra B. W. J. Mol. Biol. 256: 611–622 (1996)), wurde zur ortsspezifischen Mutagenese, dem Sequenzieren und der Expression von (mutierten) CGTase-Proteinen verwendet. Die Plasmid-tragenden Bakterienstämme wurden auf LB-Medium in Gegenwart von 100 &mgr;g/ml Ampicillin wachsen gelassen. Soweit geeignet wurde IPTG (Isopropyl-&bgr;-D-Thiogalactopyranosid) zur Induktion der Proteinexpression auf eine Konzentration von 0,1 mM zugegeben.

DNA-Manipulation

Die DNA-Manipulationen und Transformationen von E. coli wurden im Wesentlichen wie von Sambrook et al. [Sambrook, J., Fritsch, E. J., und Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York] beschrieben durchgeführt. Die Transformation von E. coli durch Elektroporation wurde unter Verwendung eines Bio-Rad Genpulserapparats durchgeführt (Bio-Rad, Veenendaal, Niederlande). Die ausgewählten Bedingungen waren 2,5 kV, 25 &mgr;F und 200 &OHgr;.

Ortsspezifische Mutagenese

Mutierte CGTase-Gene wurden mittels doppeltem PCR-Verfahren unter Verwendung der Pfu-DNA-Polymerase von Stratagene (Westburg, Leusden, Niederlande) konstruiert. Eine erste PCR-Reaktion wurde mit dem Mutagenese-Primer für den kodierenden Strang plus einem Primer 195–715 bp stromabwärts auf dem Matrizenstrang durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde anschließend als ein Primer in einer zweiten PCR-Reaktion zusammen mit einem Primer 295–815 bp stromaufwärts auf dem kodierenden Strang verwendet. Das Produkt der letzteren Reaktion wurde mit NcoI und MunI geschnitten und durch das entsprechende Fragment (900 bp) aus dem Vektor pCT2 ausgetauscht. Das resultierende (mutierte) Plasmid wurde in E. coli JM109 zum Sequenzieren und E. coli PC1990 zur Herstellung der (mutierten) Proteine transformiert. Die folgenden Oligonukleotide wurden verwendet:

D196H 5'-CGTAACTTATTTCATTTAGCAGATCTAAATCAACAG-3'

(SEQ ID Nr. 1)

D371R 5'-GACAGGCAATGGACGTCCTTATAATAGAGC-3'

(SEQ ID Nr. 2).

Erfolgreiche Mutationen resultierten in den unterstrichenen Restriktionsschnittstellen (BGlII für D196H und AatII für D371R), was ein schnelles Screenen nach Transformanten erlaubt. Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt (Sanger et al. 1977 Proc Natl. Sci. USA 74, 5463–5467). Die gesamten 900 bp auf dem MunI-NcoI-Fragment, die durch PCR erhalten wurden, wurden durch DNA-Sequenzierung überprüft.

Herstellung und Reinigung von CGTase-Proteinen

Zur Herstellung von CGTase-Proteinen wurde E. coli PC1990 in einem 2-Liter Fermentor bei pH 7,0 und 30°C wachsen gelassen. Das Medium enthielt 2% (Gew/Gew) Trypton (Oxoid, Boom BV, Meppel, Niederlande), 1% (Gew/Gew) Hefeextrakt (Oxoid), 1 (Gew/Gew) Natriumchlorid, 1% (Gew/Gew) Caseinhydrolysat (Merck, Darmstadt, Deutschland), 100 &mgr;g/l Ampicillin und 0,1 mM IPTG. Das Wachstum wurde durch Messen der optischen Dichte bei 450 nm beobachtet. Wenn die optische Dichte bei 450 nm 2 bis 3 erreichte, wurde eine zusätzliche Menge von 50 g Trypton zu dem Fermentor zugegeben. Die Zellen wurden nach 20–24 Stunden des Wachstums bei einer optischen Dichte von 8–12 geerntet (8000 g, 30 Minuten, 4°C) und der Überstand wurde zur weiteren Reinigung der CGTasen verwendet. Der Überstand wurde unmittelbar auf eine &agr;-CD-Sepharose-6FF-Affinitätssäule aufgebracht (Monma et al. 1988 Biotechnol. Bioeng. 32, 404–407). Nach dem Waschen der Säule mit 10 mM Natriumacetat (pH 5,5) wurde die CGTase mit dem gleichen Puffer, der mit 1% (Gew/Gew) &agr;-CD supplementiert war, eluiert. Die Reinheit und das Molekulargewicht der (mutierten) CGTase-Proteine wurden auf SDS-PAGE überprüft (Wind et al. 1995 Appl. Environ. Microb. 61, 1257–1265). Die Proteinkonzentrationen wurden durch das Verfahren von Bradford unter Verwendung des „Coomassie" Protein-Testreagenz von Pierce (Pierce Europe bv, Oud-Beijerland, Niederlande) bestimmt.

Enzymtests

Alle Tests wurden einheitlich bei pH 6,0 und 50°C durchgeführt. Cyclisierungs- und Verzuckerungstests wurden wie von Penninga et al. (Penninga, D., Strokopytov, B., Rozeboom, H. J., Lawson, C. L., Dijkstra, B. W., Bergsma, J., und Dijkhuizen, L. (1995) Biochemistry 34, 3368–3376) beschrieben durchgeführt. Die Einheiten für die verschiedenen Reaktionen sind definiert als die Menge an Enzym, die 1 &mgr;mol Substrat bei pH 6,0 und 50°C produziert.

HPLC-Produkt-Analyse

Die Bildung von Cyclodextrinen wurde unter industriellen Verfahrensbedingungen durch Inkubieren von 0,1 U/ml CGTase (&bgr;-CD-bildende Aktivität) mit 10% Paselli WA4 (prägelatinisierte trommelgetrocknete Stärke mit einem hohen Polymerisationsgrad; AVEBE, Niederlande) in 10 mM Natriumcitrat-Puffer (pH 6,0) bei 60°C für 45 Stunden gemessen. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben genommen und für 10 Minuten gekocht. Die gebildeten Produkte wurden durch HPLC unter Verwendung einer 25-cm Econosil-NH2 10-&mgr;m Säule (Alltech Nederland bv, Breda, Niederlande), die mit Acetonitril-Wasser (65:45) mit 1 ml/Minute eluiert wurde, analysiert. Die Produkte wurden durch einen Brechungsindexdetektor (Waters 410, Waters Chromatography Division, Milford, USA) nachgewiesen. Die Temperatur der Fließzelle und Säule wurde auf 50°C festgesetzt, um eine mögliche Präzipitation der Stärke zu vermeiden. Die Bildung linearer Produkte wurde unmittelbar analysiert. Die Bildung von CDs wurde nach Inkubation der Proben mit einer geeigneten Menge an &bgr;-Amylase (Typ I-B aus Süßkartoffel, Sigma, Boom BV, Meppel, Niederlande) analysiert.

Cyclodextrin-Produktspezifität

Um die Produktspezifität der Thermoanaerobacterium CGTase zu verändern, ersetzten wir Asp196 durch His (D196H) und Asp371 durch Arg (D371R). In der Mutante D196H war die Produktion von &agr;-CD auf Kosten der Herstellung von &bgr;-CD im Vergleich zur Wildtyp-CGTase erhöht (2). Das Cyclodextrin-Produktverhältnis war von 28:58:14 (&agr;:&bgr;:&ggr;) für die Wildtyp-CGTase auf 35:49:16 für die Mutante D196H verändert (Tabelle 1). Dieses entspricht den Erwartungen auf Grundlage der strukturellen Arbeiten. Durch Ersetzen von Asp197 mit His wird ein größerer Rest eingeführt, was den so genannten Bindungsmodus für gerade Substrate blockieren würde. Darüber hinaus ist His 197 wahrscheinlich auch in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem in dem „gebogenen" Modus gebunden Produkt zu bilden. Diese Ergebnisse stärken die Theorie, dass die gebogene Konformation mit einer &agr;-Cyclodextrin-Herstellung verbunden ist und zeigen, dass sie verwendet werden kann, um durch rationale Überlegungen eine CGTase mit gewünschter Produktspezifität technisch herzustellen.

Tabelle 1: Stärkeumwandlung von T. thermosulfurigenes Wildtyp- und mutierten CGTase-Proteinen. Proteine (0,1 U/ml &bgr;-CD-bildende Aktivität) wurden für 45 Stunden bei pH 6,0 und 60°C mit 10% Paselli WA4 inkubiert.

Asp371 hat eine sehr wichtige Rolle bei der Substratbindung von Substratunterbindedomäne 2 sowohl bei der BC251- als auch bei der Tabium-CGTase. Das Ersetzen von Asp371 durch Arg resultiert in der Einführung einer sehr sperrigen Aminosäure, die wahrscheinlich ernstlich in die Bindung jeglicher Art von Substraten bei Substratunterbindedomäne 2 eingreifen würde, wodurch der Gesamtabfall an Aktivität zu erklären ist. Abgesehen von dieser geringen Aktivität war das Produktverhältnis von 28:58:14 für das Wildtyp-Enzym auf 6:68:26 für die Mutante D371H geändert (Tabelle 1, 2). Dies legt nahe, dass die Cyclisierungsreaktion, die zu einem &agr;-Cyclodextrin führt, durch das Arg371 stärker behindert wird als die anderen Cyclisierungsreaktionen. Wahrscheinlich behindert dieser sperrige Rest die „gebogene" Konformation sterisch. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Tabium-CGTase durch nur eine Mutation von einem &agr;/&bgr;-Cyclodextrinproduzenten zu einem &bgr;/&ggr;-Cyclodextrinproduzenten geändert werden kann, was die Umsetzbarkeit des CGTase-Protein-Engineerings veranschaulicht.

Die Erfindung ist mit Bezug auf die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, von denen nicht beabsichtigt ist, dass sie in irgend einer Weise den Umfang der Erfindung wie beansprucht begrenzen sollen.

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. CGTase-Variante mit im Hinblick auf die Herstellung von Alpha-Cyclodextrin erhöhter Produktspezifität, in welcher der Aminosäurerest 196H durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurde.
  2. CGTase-Variante nach Anspruch 1, die von einem Stamm von Bacillus, einem Stamm von Brevibacterium, einem Stamm von Clostridium, einem Stamm von Corynebacterium, einem Stamm von Klebsiella, einem Stamm von Micrococcus, einem Stamm von Thermoanaerobium, einem Stamm von Thermoanaerobacterium, einem Stamm von Thermoanaerobacter oder einem Stamm von Thermoactinomyces stammt.
  3. CGTase-Variante nach Anspruch 2, die von einem Stamm von Bacillus autolyticus, einem Stamm von Bacillus cereus, einem Stamm von Bacillus circulans, einem Stamm von Bacillus circulans var. alkalophilus, einem Stamm von Bacillus coagulans, einem Stamm von Bacillus firmus, einem Stamm von Bacillus halophilus, einem Stamm von Bacillus macerans, einem Stamm von Bacillus megaterium, einem Stamm von Bacillus ohbensis, einem Stamm von Bacillus stearothermophilus oder einem Stamm von Bacillus subtilis stammt.
  4. CGTase-Variante nach Anspruch 3, die von dem Stamm Bacillus sp. Stamm 1011, dem Stamm Bacillus sp. Stamm 38-2, dem Stamm Bacillus sp. Stamm 17-1, dem Stamm Bacillus sp. 1-1, dem Stamm Bacillus sp. Stamm B1018, dem Stamm Bacillus circulans Stamm 8 oder dem Stamm Bacillus circulans Stamm 251 oder einer Mutante oder einer Variante hiervon stammt.
  5. CGTase-Variante nach Anspruch 4, die von dem Stamm Bacillus circulans Stamm 251 oder einer Mutante oder einer Variante hiervon stammt.
  6. CGTase-Variante nach Anspruch 2, die von einem Stamm von Klebsiella pneumonia, einem Stamm von Thermoanaerobacter ethanolicus, einem Stamm von Thermoanaerobacter finii, einem Stamm von Clostridium thermoamylolyticum, einem Stamm von Clostridium thermosaccharolyticum oder einem Stamm von Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes stammt.
  7. CGTase-Variante nach Anspruch 2, die von dem Stamm Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 oder einer Mutante oder einer Variante hiervon stammt.
  8. CGTase-Variante nach Anspruch 1, die von einem Stamm von Bacillus circulans stammt und wobei in die Variante der Aminosäurerest D 196H durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurde.
  9. CGTase-Variante nach Anspruch 1, die von einem Stamm von Thermoanaerobacter sp. stammt und wobei in die Variante der Aminosäurerest D 196H durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurde.
  10. CGTase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die einen oder mehrere der folgenden Aminosäurereste (CGTase Nummerierung) umfasst:

    (i) 47K/145E/146V/147N/196H;

    (ii) 47K/145E/146E/147N/196H;

    (iii) 47K/145E/146V/147N/196H/371R;

    (iv) 47K/145E/146E/147N/196H/371R;

    (v) 47K/145D/146R/147D/196H;

    (vi) 47K/145D/146E/147D/196H;

    (vii) 47K/145D/146R/147D/196H/371R;

    (viii) 47K/145D/146R/147D/196H/371R;

    (ix) 47K/196H;

    (x) 47R/196H;
  11. CGTase-Variante nach Anspruch 10, die von einem Stamm von Bacillus circulans stammt und die einen oder mehrere der folgenden Aminosäurereste (CGTase Nummerierung) umfasst:

    (i) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H;

    (ii) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H;

    (iii) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H/D371R;

    (iv) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H/D371R;

    (v) R47K/S145D/S146R/D196H;

    (vi) R47K/S145D/S146E/D196H;

    (vii) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R;

    (viii) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R;

    (ix) R47K/D196H.
  12. CGTase-Variante nach Anspruch 11, die von Bacillus circulans Stamm 251 oder einer Mutante oder einer Variante hiervon stammt.
  13. CGTase-Variante nach Anspruch 10, die von einem Stamm von Thermoanaerobacter sp. stammt und die eine oder mehrere der folgenden Aminosäurereste (CGTase Nummerierung) umfasst:

    (i) S145E/E146V/T147N/D196H;

    (ii) S145E/T147N/D196H;

    (iii) S145E/E146V/T147N/D196H/D371R;

    (iv) S145E/T147N/D196H/D371R;

    (v) S145D/E146R/T147D/D196H;

    (vi) S145D/T147D/D196H;

    (vii) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R;

    (viii) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R;

    (ix) K47R/D196H.
  14. CGTase-Variante nach Anspruch 13, die von dem Stamm Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 oder einer Mutante oder einer Variante hiervon stammt.
  15. Verwendung einer CGTase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zum Erhöhen des Alpha-Cyclodextrin-Gehalts des Cyclodextrin-Endprodukts von Cyclodextrin-Verfahren.
  16. Verfahren zum Erhöhen der Produktspezifität im Hinblick auf die Herstellung von Alpha-Dextrinen, wobei der Aminosäurerest 196H durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurde und wobei ein oder mehrere Aminosäurereste entsprechend den Positionen der Varianten von einem der Ansprüche 1 bis 14 durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurden.
Es folgen 4 Blatt Zeichnungen






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