Warning: fopen(111data/log202005250753.log): failed to open stream: No space left on device in /home/pde321/public_html/header.php on line 107

Warning: flock() expects parameter 1 to be resource, boolean given in /home/pde321/public_html/header.php on line 108

Warning: fclose() expects parameter 1 to be resource, boolean given in /home/pde321/public_html/header.php on line 113
METHODE ZUR INVIVO PRODUKTION EINER MUTANTEN-BIBLIOTHEK IN ZELLEN - Dokument DE69733059T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69733059T2 02.03.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000873398
Titel METHODE ZUR INVIVO PRODUKTION EINER MUTANTEN-BIBLIOTHEK IN ZELLEN
Anmelder Novozymes A/S, Bagsvaerd, DK
Erfinder BORCHERT, Torben Vedel, DK-2880 Bagsvaerd, DK;
EHRLICH, Dusko, Stanislas, F-78352 Jouy-en-Josas Cedex, FR
Vertreter Patentanwälte Isenbruck Bösl Hörschler Wichmann Huhn, 68165 Mannheim
DE-Aktenzeichen 69733059
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.01.1997
EP-Aktenzeichen 979002060
WO-Anmeldetag 10.01.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/DK97/00014
WO-Veröffentlichungsnummer 0097025410
WO-Veröffentlichungsdatum 17.07.1997
EP-Offenlegungsdatum 28.10.1998
EP date of grant 20.04.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.03.2006
IPC-Hauptklasse C12N 1/21(2006.01)A, F, I, ,  ,  ,   
IPC-Nebenklasse C12N 5/10(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden zur in vivo-Produktion von Bibliotheken von Polypeptidvarianten, das Durchmustern dieser Varianten und die Selektion solcher, welche die gewünschten Eigenschaften aufweisen. Die Erfindung betrifft darüber hinaus Methoden zum Herstellen der gewünschten Polypeptidvarianten.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Eine steigende Anzahl von Polypeptiden, einschließlich Enzyme und nicht-enzymatische Proteine, werden zur Verwendung in verschiedenen Industriezweigen, im Haushalt, Nahrungsmittel/Ernährung, Kosmetik, Medizin etc. industriell hergestellt. Eine der Hauptquellen für diese Proteine sind und waren in der Natur vorkommende Mikroorganismen.

Der klassische Ansatz zum Auffinden von Polypeptiden mit neuen und besonderen Eigenschaften bestand im Durchmustern von in der Natur vorkommenden Wildtyp-Organismen. Dies war sehr erfolgreich für das Bereitstellen von Polypeptiden, die in solch verschiedenen Gebieten wie die oben erwähnten Anwendungen zum Einsatz kommen sollen.

Jedoch war es oft nicht möglich, solche Polypeptide in ausreichenden Mengen herzustellen, weil die in natürlichen Wirtssystemen hergestellten Mengen für eine Produktion zu gering waren, und selbst wenn Kosten kein Problem darstellten, konnte man in der Bereitstellung ausreichender Mengen im Verhältnis zum Bedarf auf Probleme stoßen (z.B. menschliches Wachstumshormon).

Diese Probleme hat man in hohem Maß durch die Einführung rekombinanter Techniken zur Herstellung von Polypeptiden lösen können. Dabei werden Polypeptide unter Verwendung biologischer Systeme hergestellt. Für bestimmte Polypeptide kodierende Gene werden kloniert und in Zellen übertragen, welche die Polypeptide in viel größeren Mengen als wenn sie in dem ursprünglichen Organismus hergestellt werden, herstellen. Im Laufe der vergangenen 20 Jahre sind eine große Anzahl an Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß solchen Techniken entwickelt worden.

Proteine aus natürlichen Quellen entsprechen oft nicht den Erfordernissen für bestimmte Anwendungen, und es ist notwendig, die entstandenen Proteine hinsichtlich bestimmter Aktivitäten oder biophysikalischer Eigenschaften zu modifizieren.

Es ist möglich, neue Varianten eines Proteins durch klassische Mutagenese des Mikroorganismus mittels Bestrahlung (Röntgen- und UV-Strahlung) oder chemischer Mutagene zu erzeugen. Da dieser Ansatz jedoch ein sehr arbeits- und zeitaufwendiger Vorgang ist, haben Wissenschaftler in den selben letzten beiden Jahrzehnten unter Verwendung spezifischer und selektiver rekombinanter Techniken Verbesserungen an bestehenden Polypeptiden entwickelt, wie Protein- und Genmanipulation zum Erzeugen künstlicher Vielfalt.

Basierend auf Überlegungen, bei denen das Wissen über die Struktur-Funktionsbeziehungen und allgemeine Proteinchemie eingesetzt wird, war es für Wissenschaftler ein langer Weg, Polypeptidvarianten, welche Verbesserungen in verschiedenen Eigenschaften aufweisen, zu konstruieren.

Es ist jedoch auch erkannt worden, dass die verschiedenen Wechselwirkungen, an denen Polypeptide beteiligt sind, so komplex sind, dass ein vernünftiges Design entsprechend solchen Wissens beträchtliche Einschränkungen birgt, und dass in den letzten Jahren Methoden, welche auf Zufallsmutagenese gefolgt von dem Durchmustern oder der Selektion einer großen Anzahl der daraus entstandenen Varianten beruhen, an Interesse gewonnen haben.

Zu diesem Zweck wird eine mikrobielle Mutanten-Bibliothek zur nachfolgenden Expression und Durchmustern erzeugt, um Varianten, welche die gewünschten Eigenschaften aufweisen, zu bestimmen. Im Laufe der Jahre sind viele in vitro- und in vivo-DNA-Mutagenesetechniken zum Erzeugen hoher Zahlen verschiedener Varianten von Polypeptiden entwickelt worden.

In Anbetracht der Tatsache, dass ein typisches natürlich vorkommendes Polypeptid aus zwischen 100 und 1000 Aminosäuren besteht, und jede 20-fach verschieden sein kann (allein schon innerhalb der natürlich vorkommenden Aminosäuren), ist die Anzahl möglicher Varianten für ein spezifisches Polypeptid enorm. Da der Hauptparameter, welcher die Verwendbarkeit einer mikrobiellen Sammlung oder Bibliothek, die zum Identifizieren verbesserter Varianten eines Polypeptids verwendet wird, definiert oder misst, die Anzahl verschiedener in der Sammlung umfasster Varianten, N, ist, wuchs der Bedarf für große Bibliotheken.

Insbesondere in Fällen, in denen ein leistungsfähiges Selektionssystem verfügbar ist, ist der limitierende Faktor für die Identifizierung des gewünschten Polypeptids die Größe der Bibliothek.

In in vitro-Systemen ist die zweckmäßige Grenze des Standes der Technik für N etwa 108. Dies liegt hauptsächlich an der unzureichenden Transformation (Einführung der DNA in die Zelle) der manipulierten DNA in den Wirtsorganismus. Die Anzahl variiert ziemlich von Organismus zu Organismus: im gegenwärtig besten Fall, E. coli, führt die übliche Transformationseffizienz von in vitro-manipulierter DNA, z.B. eine Ligation von DNA-Fragmenten oder chemischer Behandlung von DNA, meistens zu Bibliotheksgrößen von bis zu 108 Bakterien (Greg Winter, Current methods in Immunology 5: 253–255, 1993). Sehr wenige Beispiele von Bibliotheken dieser Größe sind bekannt.

Konstruktionen von in vitro-Bibliotheken in anderen Prokaryonten, wie Bacillus sp., Streptococcus sp. oder Staphylococcus sp., liegen aus praktischen Gründen um Größenordnungen unter dieser Zahl. Betrachtet man eukaryontische Wirte wie Saccharomyces cerevisiae oder verschiedene Aspergillus sp., kann eine noch niedrigere Anzahl an Transformanden von in vitro-manipulierter DNA erwartet werden.

Ein Spezialfall einer großen Bibliothek bezieht sich auf in vivo-Rekombination zwischen Bibliotheken von schweren und leichten Antikörperketten basierend auf einem speziell konstruierten System, welches für diesen besonderen Fall verwendbar ist (Griffiths, A. D. et al., 1994, EMBO J. 14: 3245–3260).

Um Varianten eines Polypeptids in einem Mikroorganismus in vivo zu erzeugen, stehen eine Reihe von Verfahren zur Verfügung, welche von sehr einfachen wie das Behandeln der Zellen mit chemischen oder physikalischen Mutagenen, bis zu eher komplexen Methoden, beruhend auf Zellen, welche eine fehleranfällige („error-prone") DNA-Polymerase enthalten, aber kein mismatch-Reparatursystem, das die Fehler korrigiert (Stratagene, XL1-red (mutS, mutD, mutT) Catalog #200129), reichen.

Aber diese Techniken haben den Hauptnachteil, dass die Mutagenese nicht auf einen spezifischen Teil des Genoms (welches für das interessierende Polypeptid kodiert) gerichtet ist und hohe Mutationshäufigkeiten auch in für die Zelle essentiellen Genen als auch in dem Zielgen erzeugt werden, was zu einem massiven Zellsterben führt, auch bei einer hohen Anzahl an Zellen, bei denen die Mutationen das interessierende Polypeptid nicht beeinflussen. Dieses „Rauschen" limitiert die Anhäufung von Mutationen in der Zielregion.

Es ist daher der Gegenstand der Erfindung ein für die Zielregion spezifisches in vivo-Mutageneseverfahren bereitzustellen, um eine hohe Anzahl, N, von Polypeptidvarianten herzustellen.

Ein zweiter Gegenstand der Erfindung betrifft das Durchmustern oder die Selektion von Varianten mit den gewünschten Eigenschaften, sowohl durch bereits bestehende als auch zukünftige Technologien.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine Methode zur in vivo-Produktion einer Bibliothek in Zellen, umfassend eine Vielzahl von mutierten genetischen Elementen, wobei eine fehleranfällige Polymerase in der Vorläuferzelle verwendet wird, um ein ganzes oder Teil eines genetischen Elementes zu replizieren, umfassend

  • i) einen Replikationsursprung, von dem aus die Replikation beginnt,
  • ii) optional einen genetischen Marker, z.B. ein Gen, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht,
  • iii) ein Gen, das für das interessierende Polypeptid kodiert,
unabhängig von dem chromosomalen Replikationsapparat des Wirts.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Methode zur Erzeugung einer DNA-Sequenz, die für eine gewünschte Variante eines interessierenden Polypeptids kodiert, wobei

  • i) eine mutante Bibliothek durch die obige Methode hergestellt wird,
  • ii) die Bibliothek unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression des interessierenden Gens förderlich sind, um Polypeptidvarianten herzustellen,
  • iii) die varianten Polypeptide nach einer gewünschten Eigenschaft durchgemustert oder ausgewählt werden, und Wirte, die solche gewünschten Varianten produzieren, identifiziert und isoliert werden,
  • iv) das genetische Element in den Wirten sequenziert wird, um die DNA-Sequenz des mutierten Gens, das für eine gewünschte Variante kodiert, aufzuklären.
und eine Methode zur Bestimmung einer DNA-Sequenz, die für eine gewünschte Variante eines interessierenden Polypeptids kodiert, wobei
  • i) eine mutante Bibliothek durch die obige Methode hergestellt wird,
  • ii) die Bibliothek unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression des interessierenden Gens förderlich sind, um Polypeptidvarianten herzustellen,
  • iii) die varianten Polypeptide nach einer gewünschten Eigenschaft durchgemustert oder ausgewählt werden, und Wirte, die solche gewünschten Varianten produzieren, identifiziert und isoliert werden,
  • iv) das genetische Element in den Wirten sequenziert wird, um die DNA-Sequenz des mutierten Gens, das für eine gewünschte Variante kodiert, aufzuklären.

Das Durchmustern der Bibliothek oder die Selektion der Varianten hängt von dem spezifischen Polypeptid und welche Eigenschaften davon wünschenswerterweise zu verbessern und/oder beizubehalten sind ab. Es ist daher notwendig, für jeden Fall ein Durchmusterungsprotokoll zu erstellen. Solche Protokolle, die eine Reihe von Ansätzen enthalten, sind in der Literatur beschrieben (Clackson et al., Nature 352: 624–628, Bryan, P et al., Proteins 1: 326–334, 1986).

Ein eleganter Ansatz für die Kombinierung der Erzeugung von Vielfalt mit der Selektion von Varianten mit den gewünschten Eigenschaften wäre eine Kombinierung der in vivo-Methode der vorliegenden Erfindung zum Erzeugen der Vielfalt mit einem phage display system (Greg Winter, Supra).

Ein spezifisches Beispiel eines interessierenden Polypeptids sind alkalische Proteasen, die in der Waschmittelindustrie zur Entfernung von proteinösen Verfärbungen von Stoffen verwendet werden. In diesem Fall kann das Durchmustern in den tatsächlichen Waschmittelzusammensetzungen durchgeführt werden, um die Eigenschaften wie Wärmestabilität, Oxidationsstabilität, Lagerungsstabilität, Substratspezifizität und -affinität, Stabilität in nicht wässrigen Lösungsmitteln, pH-Profil, Abhängigkeit von der Ionenstärke, katalytische Wirksamkeit und Waschleistung zu untersuchen.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer gewünschten Polypeptidvariante, wobei

  • (i) eine DNA-Sequenz kodierend für ein interessierendes Polypeptid, welche gemäß obiger Methode bestimmt worden ist, in einen geeigneten Wirt eingebracht wird auf eine Weise, wodurch sie in diesem Wirt exprimiert werden kann,
  • (ii) der Wirt unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression der DNA-Sequenze förderlich sind, und
  • (iii) die Polypeptidvariante gewonnen wird.

Methoden zum Einbringen einer ausgewählten DNA-Sequenz in geeignete Wirtssysteme sind beschrieben in, (Sambrock et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY.).

Es liegt ebenfalls innerhalb der Kenntnisse eines Fachmannes, geeignete Wachstumsmedien und andere Bedingungen für das ausgewählte Wirtssystem auszuwählen, welche für die Expression der interessierenden Polypeptidvariante förderlich sind. Anleitung hierzu kann z.B. in (Sambrook et al., supra) gefunden werden.

Ebenfalls für die Gewinnung eines Polypeptids stehen zahlreiche Methoden zur Trennung und Reinigung von Proteinen zur Verfügung, z.B. in (Scopes, R. K., Protein Purification (1987), Springer-Verlag)

Schließlich betrifft die Erfindung Polypeptide, die anhand der obigen Methode hergestellt sind.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung umfasst eine Methode, um in vivo-Bibliotheken von Varianten in einem interessierenden Gen zu konstruieren. Die Methode schließt die Verwendung eines genetischen Elements, wie ein Bakteriophage oder ein Plasmid, welches in der Lage ist, unabhängig von dem chromosomalen Replikationssystem des Wirts zu replizieren, ein. Unter Einsatz der Möglichkeit, die Replikation des Wirtschromosoms von der Replikation des genetischen Elements (Phage/Plasmid) zu trennen, ist es möglich, durch Modifizierungen des einen Replikationssystems selektiv Mutationen in das genetische Element (Phage/Plasmid) einzuführen, wobei das Wirtschromosom intakt gelassen wird. Dies bedeutet, dass die Erzeugung von Vielfalt im interessierenden Gen nicht die Lebensfähigkeit des Wirts beeinträchtigt.

DNA-Replikation ist ein höchst genauer Vorgang, und die Falscheinbaurate der chromosomalen Replikation in E. coli liegt geschätzt bei einer Größenordnung von 10–10 pro Base pro Replikationsrunde. Die während der DNA-Replikation stattfindende Basenpaarung führt dazu, dass die Polymerase präferenziell die richtige Base an einer bestimmten Position einbaut, welches etwa 105 der insgesamten Replikationsgenauigkeit bedingt. Wenn eine falsche Base eingebaut worden ist, bleibt die Polymerase stehen und oft entfernt eine 3'-5' Exonuklease die 3' falsch eingebaute Base. Dieser Teil, genannt „proof-reading" bedingt etwa 102 der gesamten Replikationsgenauigkeit. Das Reparatursystem der Zelle bedingt die restlichen 103 der Genauigkeitsrate.

Die Replikation des Chromosoms in E. coli wird hauptsächlich ausgeführt von dem DNA-Polymerase III Holoenzym, ein Multiproteinkomplex enthaltend 10 verschiedene Polypeptide einschließlich einer Polymerase (alpha-Untereinheit, polC-Gen) und einer 3'-5'-Exonuklease (dnaQ-Gen).

Eine weitere Polymerase, DNA Polymerase I (DNA pol I, polA-Gen), enthält drei verschiedene Aktivitäten, nämlich eine DNA-Polymeraseaktivität, eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität und eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität trotz der Tatsache, dass es sich dabei um ein einzelnes Polypeptid handelt. Diese Polymerase erfüllt einige Funktionen in der Zelle. Außer für die DNA-Reparatur ist DNA pol I auch für die chromosomale DNA-Replikation erforderlich, sowie sie an der Zusammensetzung von DNA-Fragmenten während der Synthese des zurückliegenden („lagging") DNA-Stranges beteiligt ist. Jedoch repliziert sie nur einen geringen Teil des Genoms.

Diese Polymerase ist weiterhin an der Initiation der DNA-Replikation bestimmter Klassen von Plasmiden beteiligt, z.B. auf den ColEI-Replikationsursprung basierende Plasmide wie pBR322 in Escherichia coli und Gram-negativen Bakterien oder pAM&bgr;1-ähnliche Plasmide in Gram-positiven Bakterien. Solche Plasmide können vollständig durch die Aktivität der DNA-Polymerase I replizieren, ohne dass die DNA-Polymerase III in aktiver Form anwesend ist, z.B. wenn das Enzym aufgrund genetischer Ursachen funktionsgestört ist, z.B. Temperatur-sensitive Varianten bei einer nicht-permissiven Temperatur, oder unter Bedingungen, bei denen nur begrenzte Mengen an DNA-Polymerase III in der Zelle vorhanden sind.

Es ist bekannt, dass bestimmte Mutationen zu einer Erniedrigung (oder einer Erhöhung) in der Genauigkeit der DNA-Replikation führen. Diese Mutationen sind hauptsächlich auf die Polymerasen, Exonukleasen oder auf Elemente des Reparatursystems zurückzuführen. Leider ändern/behindern diese Mutationen die Genauigkeitsrate für das ganze anwesende Genom, und solche nicht-zielgerichteten Mutationen sind nicht wünschenswert.

Ein Beispiel einer solchen Mutation könnte die Inaktivierung der 3'-5'-Exonukleaseaktivität der DNA pol I sein.

Jedoch wird sich gemäß der Erfindung die Tatsache zunutze gemacht, dass einige Elemente in dem Replikationssystem temporär vollständig oder teilweise „ausgeschaltet" sind, wodurch die Replikation des Genoms aufgehalten oder sehr verlangsamt wird, während die Replikation der bestimmten genetischen Elemente wie hier definiert fortgesetzt wird.

Ein E. coli-Stamm, enthaltend eine Temperatur-sensitive DNA pol III (d.h. die Polymerase &agr;-Untereinheit oder eine andere Temperatur-sensitive Untereinheit, welche das Holoenzym konditionell unfunktionell macht), oder eine Funktion, die für die Initiation der chromosomalen Replikation erforderlich ist, wie DnaA, eine fehleranfällige („error-prone") DNA pol I und ein colEI-basierendes Plasmid enthaltend ein interessierendes Gen, stellt ein Beispiel für ein zur spezifischen Einführung von Mutationen in ein Plasmid (und das interessierende Gen), konstruiertes genetisches System gemäß der Erfindung dar.

Die Erhöhung der Temperatur auf einen nicht-permissiven Wert hat in einem solchen System den Effekt, dass DNA pol III die Funktion vollständig einstellt, während die fehleranfällige DNA pol I ihre Funktion beibehält und das Plasmid mit verminderter Genauigkeit repliziert, was in mutierten Kopien des Plasmids resultiert.

Da die Erzeugung der Mutation zufällig ist, erzeugt jede Zelle einzigartige Mutationen und nach Erniedrigen der Temperatur wird die Temperatur-sensitive Funktion wieder aktiviert und die normale Replikation der Zellen fortgesetzt.

Eine Abwandlung davon wäre ein E. coli-Stamm mit Temperatur-sensitiven Allelen von polIII und polI und einer induzierbaren Expression (durch einen ts-Repressor (Temperatursensitiv) oder durch chemische Induktion) der fehleranfälligen Polymerase. Bei einer restriktiven Temperatur und bei der Anwesenheit des Induktors werden sich die Mutationen in dem genetischen Element häufen. Bei der permissiven Temperatur und in Abwesenheit des Induktors funktionieren die ganzen Systeme wie die Wildtyp-Zelle.

Dementsprechend betrifft die Erfindung in ihrem ersten Aspekt eine Methode zur in vivo-Produktion einer Bibliothek in Zellen umfassend eine Vielzahl von mutierten genetischen Elementen, wobei eine fehleranfällige Polymerase in jeder Vorläuferzelle verwendet wird, um ein ganzes oder Teil des genetischen Elements zu replizieren, umfassend

  • i) einen Replikationsursprung, von dem aus die Replikation beginnt,
  • ii) optional einen genetischen Marker, z.B. ein Gen, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht,
  • iii) ein Gen, das für das interessierende Polypeptid kodiert,
unabhängig von dem chromosomalen Replikationsapparat des Wirts.

Die Erfindung umfasst folglich eine Methode zur in vivo-Produktion einer Bibliothek in Zellen, umfassend eine Vielzahl von mutierten genetischen Elementen umfassend

  • A) Bereitstellen einer Zelle aufweisend
  • i) eine fehleranfällige Polymerase, die unabhängig von dem chromosomalen Replikationsapparat der Zelle ein ganzes oder ein Teil eines genetischen Elements umfassend
  • a) einen Replikationsursprung, von dem aus die Replikation beginnt,
  • b) optional einen genetischen Marker, z.B. ein Gen, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht,
  • c) ein Gen, das für das interessierende Polypeptid kodiert, repliziert und
  • ii) einen chromosomalen Replikationsapparat, der reversibel dazu induziert werden kann, im Wesentlichen unfunktionell zu sein,
  • B) Züchten einer solchen Zelle unter Bedingungen, die für ihre Replikation förderlich ist, um eine Vielzahl von Vorläuferzellen zu erhalten,
  • C) reversibles Induzieren des chromosomalen Replikationsapparates in den Vorläuferzellen, im Wesentlichen unfunktionell zu sein für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Replikation des genetischen Elements durch die fehleranfällige Polymerase zu ermöglichen, um Mutationen in dem genetischen Element zu erzeugen,
  • D) reversibles Induzieren des chromosomalen Replikationsapparates in solchen mutierten Zellen, im Wesentlichen funktionell zu sein, und
  • E) Züchten solcher mutierten Zellen unter Bedingungen, die für ihre Replikation förderlich sind.

In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „Mutanten-Bibliothek" ein Set von Zellen, Bakterien, oder Phagen (typischerweise 105 bis 103 Zellen oder Phagen), welche sich im Hinblick auf ein besonderes Gen, das für ein interessierendes Polypeptid kodiert, unterscheiden. Typischerweise wird man eine oder mehrere verschiedene Aminosäureveränderungen in dieses besondere Polypeptid in jedem Mitglied der Bibliothek einführen.

In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „fehleranfällige Polymerase" eine Polymerase, die während der DNA-Replikation mit einer größeren Häufigkeit Fehler einbaut (eines der falschen Nukleotide an einer gegebenen Position oder eine Deletion oder eine Insertion einer oder mehrerer Nukleotide erzeugt) als die Polymerase, die normalerweise für diesen Zweck verwendet wird (z.B. E. coli DNA pol I, Bacillus subtilis DNA pol I, T4 DNA-Polymerase, T7 DNA-Polymerase).

Der Ausdruck „Vorläuferzelle" bedeutet hier derartige Zellen, bei denen keine Mutationen eingeführt worden sind. In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann der Mutationszyklus wiederholt werden, und in diesem Fall werden solche Zellen, die anfangs mutiert worden waren, Vorläuferzellen für den zweiten Mutationszyklus etc.

In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „wirtseigener chromosomaler Replikationsapparat" die DNA-Polymerase oder das DNA-Polymerase Holoenzym, welches hauptsächlich für die Replikation des Wirtschromosoms verantwortlich ist, z.B. DNA-Polymerase III in E. coli.

In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „genetisches Element" eine kleine (von 1 oder 2 Kilobasen bis 100 Kilobasen) Einheit, bestehend aus RNA oder DNA, welche unabhängig replizieren kann, d.h. es enthält einen Replikationsursprung. Das genetische Element ist typischerweise ein Bacteriophage, ein Phagemid oder ein Plasmid. Das genetische Element umfasst gemäß der Erfindung auch ein Gen, kodierend für das interessierende Polypeptid und es kann weiterhin einen genetischen Marker umfassen, z.B. ein Gen, welches Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht.

Ein Virus, ein Retrovirus oder ein Transposon, welches unabhängig von dem wirtseigenen Replikationsapparat replizieren kann, z.B. Retrotransposons könnten auch als „genetisches Element" verwendet werden.

Kim und Loeb (1995, PNAS 92: 684–688) haben gezeigt, dass die HIV-reverse Transkriptase (HIV-RT) die E. coli-DNA-Polymerase hinsichtlich der chromosomalen DNA-Replikation und der Initiation der Plasmid-DNA-Replikation komplementieren kann. Die Falscheinbaurate von HIV-RT (und verwandter retroviraler reverser Transkriptasen) ist um einige Größenordnungen höher als die Rate der DNA-Polymerase I, d.h. 10–3 bis 10–4 Falscheinbauten pro Base pro Replikationsrunde. Die Verwendung einer derartigen Polymerase anstatt einer mutierten fehleranfälligen E. coli-DNA-Polymerase I in einer Ausführungsform der Erfindung würde die Häufigkeit von Replikationsfehlern in dem oben beschriebenem System signifikant erhöhen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der oben beschriebene Mutationszyklus wiederholt werden, d.h. die mutagene Polymerase mehrere Male an- und ausgeschaltet werden, wobei noch mehr Mutanten erzeugt werden. Solch ein Schritt könnte darüber hinaus bei der Trennung von Plasmiden helfen, wenn ein Multicopy-Plasmid als genetisches Element verwendet wird.

Bei bestimmten genetischen Elementen ist denkbar, dass nur der Teil des genetischen Elements, der in der Nähe des Replikationsursprungs lokalisiert ist, von der fehleranfälligen Polymerase repliziert wird. In solchen Fällen sollte das interessierende Gen innerhalb dieser Region liegen.

In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung ist das genetische Element ein Phage, wobei das Gen kodierend für das interessierende Polypeptid an einer Stelle positioniert ist, an der das Polypeptid nach Expression von der Phagenoberfläche präsentiert wird, wodurch ein Durchmustern direkt durchgeführt werden kann (siehe Greg Winther, supra). Um sicherzustellen, dass sich die DNA-Sequenz des Phagen und des zu präsentierenden Proteins entsprechen, sollte der primäre Phagenstamm vor der Selektion oder dem Durchmustern bei niedriger Infektionszahl durch Wildtyp E. coli passiert werden.

Um die Häufigkeit der Mutationen weiter zu erhöhen, umfasst die Methode der Erfindung Ausführungsformen, bei denen die Methode in Verbindung mit einem reparaturdefizienten Wirt, z.B. mutL, mutS, mutH oder in Kombination mit Mutatorgenomtypen verwendet wird.

In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „reparaturdefizienter Wirt" eine Zelle enthaltend eine oder mehrere Veränderungen in Genen, welche für Proteine kodieren, die bekanntermaßen direkt oder indirekt an der DNA-Reparatur beteiligt sind. Die Auswirkung solcher Mutationen liegt darin, dass eine größere Häufigkeit der (durch die Polymerasen, Chemikalien, Röntgenstrahlung, UV-Licht, usw.) eingeführten Mutationen nicht repariert werden und „dauerhaft" im Genom eingebaut werden, der sogenannte Mutatorphänotyp. Beispiele solcher Gene sind mutL, mutS, mutH, mutT.

Als genetisches Element könnte man, wie oben gezeigt, ein Phagemid anstelle eines Plasmids verwenden, um die variante Generation mit einem Präsentationssystem, z.B. M13, fI, fd, zu koppeln.

In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „Phagemid" ein Plasmid, welches neben seinem Plasmidreplikationsursprung einen Phagenreplikationsursprung enthält. Je nach den Bedingungen sind Phagemide in der Lage, als Plasmid oder als Phage zu replizieren (nach Infektion mit einem Helferphagen).

Ein Phagemid-basierendes System würde die Konstruktion eines Phagemids enthaltend:

  • 1) ein Plasmidreplikationsursprung, z.B. ColEI
  • 2) ein M13-Phagenreplikationsursprung
  • 3) ein chimeres Gen, bestehend aus einem interessierenden Gen, fusioniert an das Gen, das für das GIII-Protein kodiert. (∅rum, P. et al., Nucl. Acid. Res. 21: 4491–4498, 1993).
einschließen.

Der erste Schritt bestünde in der Erzeugung von Vielfalt durch Züchten/Aufrechterhalten eines E. coli-Stammes, der mit diesem Phagemid wie oben beschrieben transformiert worden ist. Der zweite Schritt wäre die Infektion mit dem Helferphagen, um einzelsträngige Phagemide zu erzeugen, welche in Phagenpartikeln verpackt werden. Die Phagen, die die varianten Proteine präsentieren, können dann einem Selektionsverfahren unterzogen werden.

Ferner enthalten bestimmte Bacteriophagen wie T4 oder T7 in Escherichia oder SPOII und PHi29 in Bacillus ihre eigene DNA-Polymerase, und gemäß der Erfindung sind Ausführungsformen denkbar, wobei das oben beschriebene genetische Element ein Bacteriophage ist, der eine fehleranfällige DNA-Polymerase enthält.

Gemäß der Erfindung ist die fehleranfällige Polymerase typischerweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend DNA-Polymerase I oder reverse Transkriptase. Eine bevorzugte fehleranfällige Polymerase ist eine Variante der E.coli-DNA-Polymerase I oder HIV-reverse Transkriptase.

Als interessierendes Polypeptid kommt eine große Anzahl in Frage, und besonders solche Polypeptide, welche biologische Aktivitäten aufweisen, könnten erwähnt werden. Unter diesen sind Enzyme, Hormone, Rezeptoren, Blutgerinnungsfaktoren, antimikrobielle Agenzien und andere Polypeptide, die wichtig für die Prophylaxe und die Behandlung von verschiedenen Fehlfunktionen und Krankheiten in Menschen und Tieren sind.

Ferner können Enzyme, welche für industrielle Zwecke verwendet werden, erwähnt werden. Unter diesen industriellen Enzymen sind Enzyme, welche zu den Gruppen der Carbonylhydrolasen, Carbohydrasen, Oxidoreductasen, Transferasen, Phytasen, antimikrobielle Polypeptide, Oxidoreductasen, Isomerasen, Lyasen und Ligasen gehören, erwähnenswert.

In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „Carbonylhydrolase" Enzyme, die Substanzen hydrolysieren, welche eine -C(=O)-X-Gruppe enthalten, wobei X ein Sauerstoff oder ein Stickstoff ist.

Spezifische Klassen von Enzymen, welche zu der Gruppe der Carbonylhydrolasen gehören, sind Hydrolasen (Lipasen) und Peptidhydrolasen (Proteasen).

Proteasen bedeuten hier Enzyme, die unter der Enzyklassifizierungsnummer E. C. 3.4 in Übereinstimmung mit den Empfehlungen (1992) der „International Union of Biochemistry and Molecular Biology" (IUBMB) klassifiziert sind.

Beispiele schließen Proteasen ein, welche ausgewählt sind aus denen, die unter den Enzymklassifizierungsnummern (E. C.) klassifiziert sind:

3.4.11 (d.h. sogenannte Aminopeptidasen) einschließlich 3.4.11.5 (Prolylaminopeptidasen), 3.4.11.9 (X-pro-Aminopeptidase), 3.4.11.10 (bakterielle Leucylaminopeptidase), 3.4.11.12 (thermophile Aminopeptidase), 3.4.11.15 (Lysylaminopeptidase), 3.4.11.17 (Tryptophanylaminopeptidase), 3.4.11.18 (Methionylaminopeptidase).

3.4.21 (d.h. die sogenannte Serinendopeptidasen) einschließlich 3.4.21.1 (Chymotrypsin), 3.4.21.4 (Trypsin), 3.4.21.25 (Cucumisin), 3.4.21.32 (Brachyurin), 3.4.21.48 (Cerevisin) und 3.4.21.62 (Subtilisin);

3.4.22 (d.h. sogenannte Cysteinendopeptidasen) einschließlich 3.4.22.2 (Papain), 3.4.22.3 (Ficain), 3.4.22.6 (Chymopapain), 3.4.22.7 (Ascepain), 3.4.22.14 (Actinidain), 3.4.22.30 (Caricain) und 3.4.22.31 (Ananain);

3.4.23 (d.h. sogenannte Aspartatendopeptidasen) einschließlich 3.4.23.1 (Pepsin A), 3.4.23.18 (Aspergillopepsin I), 3.4.23.20 (Penicillopepsin) und 3.4.23.25 (Saccharopepsin); und

3.4.24 (d.h. sogenannte Metalloendopeptidasen) einschließlich 3.4.24.28 (Bacillolysin).

Beispiele relevanter Subtilisine umfassen Subtilisin BPN', Subtilisin-Amylosacchariticus, Subtilisin 168, Subtilisin-Mesentericopeptidase, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin 309, Subtilisin 147, Thermitase, Aqualysin, Bacillus PB92-Protease, Proteinase K, Protease TW7 und Protease TW3.

Spezifische Beispiele von bereits kommerziell erhältlichen Proteasen schließen Esperase®, Alcalase®, Neutrase®, Dyrazym®, Savinase®, Pyrase®, Pancreatic Trypsin NOVO (PTN), Bio-FeedTM Pro, Clear-Lens Pro ein (alle Enzyme von Novo Nordisk A/S erhältlich).

Beispiele anderer kommerzieller Proteasen schließen Maxatase®, Maxacal®, Maxapem® vermarktet durch Gist-Brocades N. V., Opticlean® vermarktet durch Solvay et Cie. und Purafect® vermarktet durch Genencor International ein.

Es versteht sich, dass auch Proteasevarianten als das interessierende Polypeptid erwogen werden. Beispiele solcher Proteasevarianten sind offenbart in EP 130.756 (Genentech), EP 214.435 (Henkel), WO 87/04461 (Amgen), WO 87/05050 (Genex), EP 251.446 (Genencor), EP 260.105 (Genencor), Thomas et al., (1985), Nature. 318, S. 375–376, Thomas et al., (1987), J. Mol. Biol., 193, S. 803–813, Russel et al., (1987), Nature, 328, S. 496–500, WO 88/08028 (Genex), WO 88/08033 (Amgen), WO 89/06279 (Novo Nordisk A/S), WO 91/00345 (Novo Nordisk A/S), EP 525 610 (Solvay) und WO 94/02618 (Gist-Brocades N. V.).

Die Aktivität von Proteasen kann wie in „Methods of Enzymatic Analysis", 3. Auflage, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 5 beschrieben bestimmt werden.

Lipasen bedeuten hier Enzyme, welche unter der Enzymklassifikationsnummer E. C. 3.1.1 (Carboxylesterhydrolasen) in Übereinstimmung mit den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert sind.

Beispiele schließen Lipasen ein, die aus denen ausgewählt sind, welche unter den Enzymklassifizierungsnummern klassifiziert sind:

3.1.1 (d.h. sogenannte Carboxylesterhydrolasen) einschließlich (3.1.1.3) Triacylglycerollipasen, (3.1.1.4) Phospholipase A2.

Beispiele von Lipasen schließen Lipasen ein, die von den folgenden Mikroorganismen stammen. Die erwähnten Patentveröffentlichungen sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen:

  • Humicola, z.B. H. brevispora, H. lanuginosa, H. brevis var. thermoida und H. insolens (US 4,810,414).
  • Pseudomonas, z.B. Ps. fragi, Ps. stutzeri, Ps. cepacia und Ps. fluorescens (WO 98/04361) oder Ps. plantarii oder Ps. gladioli (US Patent Nr. 4,950,417 (Solvay-Enzyme)) oder Ps. alcaligenes und Ps. pseudoalcaligenes (EP 218 272) oder Ps. mendocina (WO 88/09367; US 5,389,536).
  • Fusarium, z.B. F. oxysporum (EP 130,064) oder F. solani pisi (WO 90/09446).
  • Mucor (auch bezeichnet Rhizomucor), z.B. M. miehei (EP 238 023).
  • Chromobacterium (insbesondere C. viscosum)
  • Aspergillus (insbesondere A. niger).
  • Candida, z.B. C. cylindracea (auch bezeichnet C. rugosa) oder C. antarctica (WO 88/02775) oder C. antarctica Lipase A oder B (WO 94/01541 und WO 89/02916).
  • Geotricum, z.B. G. candidum (Schimada et al., (1989), J. Biochem., 106, 383–388).
  • Penicillium, z.B. P. camembertii (Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61–67).
  • Rhizopus, z.B. R. delemar (Hass et al., (1991), Gene 109, 107–113) oder R. niveus (Kugimiya et al., (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56, 716–719) oder R. oryzae.
  • Bacillus, z.B. B. subtilis (Dartois et al., (1993) Biochemica et Biophysica acta 1131, 253–260) oder B. stearothermophilus (JP 64/7744992) oder B. pumilus (WO 91/16422).

Spezifische Beispiele von fertig kommerziell erhältlichen Lipasen schließen Lipolase®, LipolaseTM Ultra, Lipozyme, Palatase®, Novozym® 435, Lecitase® ein (alle erhältlich von Novo Nordisk A/S).

Beispiele anderer Lipasen sind LumafastTM, Ps. mendocina-Lipase von Genencor Int. Inc.; LipomaxTM, Ps. pseudoalcaligenes-Lipase von G ist Brocades/Genencor Int. Inc.; Fusarium solani-Lipase (Cutinase) von Unilever; Bacillus sp.-Lipase von Solvay enzymes. Andere Lipasen sind von anderen Firmen erhältlich.

Die Aktivität der Lipase kann wie in „Methods of Enzymatic Analysis", 3. Auflage, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 4 beschrieben bestimmt werden oder wie in AF 95/5 GB (erhältlich auf Anfrage von Novo Nordisk A/S) beschrieben.

In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „Carbohydrase" alle Enzyme, die in der Lage sind, Carbohydratketten (z.B. Stärken) von insbesondere Fünf- und Sechsringstrukturen abzubauen (d.h. Enzyme, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E. C. 3.2 (Glycosidasen) in Übereinstimmung mit den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert sind). Ebenfalls eingeschlossen in die Gruppe der Carbohydrasen gemäß der Erfindung sind Enzyme, die in der Lage sind, Carbohydrate zu isomerisieren, z.B. Sechsringstrukturen, wie D-Glucose zu z.B. Fünfringstrukturen wie D-Fructose.

Beispiele schließen Carbohydrasen ein, die aus denen ausgewählt sind, die unter den Enzymklassifizierungsnummern klassifiziert sind:

&agr;-Amylase (3.2.1.1) &bgr;-Amylase (3.2.1.2), Glucan-1,4-&agr;-glucosidase (3.2.1.3), Cellulase (3.2.1.4), Endo-1,3(4)-&bgr;-glucanase (3.2.1.6), Endo-1,4-&bgr;-xylanase (3.2.1.8), Dextranase (3.2.1.11), Chitinose (3.2.1.14), Polygalacturonase (3.2.1.15), Lysozyme (3.2.1.17), &bgr;-Glucosidase (3.2.1.21), &agr;-Galactosidase (3.2.1.22), &bgr;-Galactosidase (3.2.1.23), Amylo-1,6-glucosidase (3.2.1.33), Xylan-1,4-xylosidase (3.2.1.37), Glucanendo-1,3-&bgr;-D-glucosidase (3.2.1.39), &agr;-Dextrinendo-1,6-glucosidase (3.2.1.41), Sucrose-&agr;-glucosidase (3.2.1.48), Glucanendo-1,3-&agr;-glucosidase (3.2.1.59), Glucan-1,4-&bgr;-glucosidase (3.2.1.74), Glucanendo-1,6-&bgr;-glucosidase (3.2.1.75), Arabinanendo-1,5-&agr;-Arabinosidase (3.2.1.99), Lactase (3.2.1.108), Chitonanase (3.2.1.132) und Xyloseisomerase (5.3.1.5).

Beispiele relevanter Carbohydrasen schließen ein &agr;-1,3-Glucanasen von Trichoderma harzianum; &agr;-1,6-Glucanasen von arabinosidase (3.2.1.99), Lactase (3.2.1.108), Chitonanase (3.2.1.132) und Xyloseisomerase (5.3.1.5).

Beispiele relevanter Carbohydrasen schließen ein &agr;-1,3-Glucanasen von Trichoderma harianum; &agr;-1,6-Glucanasen von einem Stamm von Paecilomyces; &bgr;-Glucanasen von Bacillus subtilis; &bgr;-Glucanasen von Humicola insolens; &bgr;-Glucanasen von Aspergillus niger; &bgr;-Glucanasen von einem Stamm von Trichoderma; &bgr;-Glucanasen von einem Stamm von Oerskovia xanthineolytica; exo-1,4-&agr;-D-Glucosidasen (Glucoamylasen) von Aspergillus niger; &agr;-Amylasen von Bacillus subtilis; &agr;-Amylasen von Bacillus amyloliquefaciens; &agr;-Amylasen von Bacillus stearothermophilus; &agr;-Amylasen von Aspergillus oryzae; &agr;-Amylasen von nicht-pathogenen Mikroorganismen; &agr;-Galactosidasen von Aspergillus niger; Pentosanasen, Xylanansen, Cellobiasen, Cellulasen, Hemicellulasen von Humicola insolens; Cellulasen von Trichoderma reesei; Cellulasen von nicht-pathogenen Pilzen; Pectinasen, Cellulasen, Arabinasen, Hemicellulasen von Aspergillus niger; Dextranasen von Penicillium lilacinum; Endoglucanase von nicht-pathogenen Pilzen; Pullulanasen von Bacillus acidopullyticus; &bgr;-Galactosidasen von Kluyvermyces fragilis; Xylanasen von Trichoderma reesei;

Spezifische Beispiele von fertig kommerziell erhältlichen Carbohydrasen schließen ein Alpha-GalTM, Bio-FeedTM Alpha, Bio-FeedTM Beta, Bio-FeedTM Plus, Bio-FeedTM Plus, Novozyme® 188, Carzyme®, Celluclast®, Cellusoft®, Ceremyl®, CitrozymTM, DenimaxTM, DezymeTM, DextrozymeTM, Finizyme®, FungamylTM, GamanaseTM, Glucanex®, Lactozym®, MaltogenaseTM, PentopanTM, PectinexTM, Promozyme®, PulpzymeTM, NovamylTM, Termamyl®, AMG (Amyloglucosidase Novo), Maltogenase, Sweetzyme®, Aquazym® (alle Enzyme erhältlich von Novo Nordisk A/S). Andere Carbohydrasen sind von anderen Firmen erhältlich.

Es versteht sich, dass auch Varianten solcher Carbohydrasen als das interessierende Polypeptid erwogen werden.

Die Aktivität der Carbohydrasen kann, wie in „Methods of Enzymatic Analysis", 3. Auflage, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 4 beschrieben, bestimmt werden.

Oxidoreductasen bedeuten hier Enzyme, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E. C. 1 (Oxidoreducasen) in Übereinstimmung mit den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert sind.

Beispiele schließen Oxidoreductasen ein, die aus denen ausgewählt sind, welche unter den Enzymklassifizierungsnummern (E. C.) klassifiziert sind:

Glycerol-3-phosphatdehydrogenase (NAD*) (1.1.1.8), Glycerol-3-phosphatdehydrogenase (NAD(P)+ (1.1.1.94), Glycerol-3-phosphat-1-dehydrogenase (NADP) (1.1.1.94), Glucoseoxidase (1.1.3.4), Hexoseoxidase (1.1.3.5), Catecholoxidase (1.1.3.14), Bilirubinoxidase (1.3.3.5), Alanindehydrogenase (1.4.1.1), Glutamatdehydrogenase (1.4.1.2), Glutamatdehydrogenase (NAD(P)+ (1.4.1.3), Glutamatdehydrogenase (NADP+) (1.4.1.4), L-Aminosäuredehydrogenase (1.4.1.5), Serindehydrogenase (1.4.1.7), Valindehydrogenase (NADP+) (1.4.1.8), Leucindehydrogenase (1.4.1.9), Glycindehydrogenase (1.4.1.10), L-Aminosäureoxidase (1.4.3.2), D-Aminosäureoxidase (1.4.3.3), L-Glutamatoxidase (1.4.3.11), Proteinlysin-6-oxidase (1.4.3.13), L-Lysinoxidase (1.4.3.14), L-Aspartatoxidase (1.4.3.16), D-Aminosäuredehydrogenase (1.4.99.1), Proteindisulfidreductase (1.6.4.4), Thioredoxinreductase (1.6.4.5), Proteindisulfidreductase (Glutathion) (1.8.4.2), Laccase (1.10.3.2), Catalase (1.11.1.6), Peroxidase (1.11.1.7), Lipoxygenase (1.13.11.12), Superoxiddismutase (1.15.1.1).

Besagte Glucoseoxidasen können von Aspergillus niger stammen.

Besagte Laccasen können von Polyporus pinsitus, Myceliophtora thermophila, Coprinus cinereus, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia praticola, Scytalidium thermophilum und Rhus vernicifera stammen.

Bilirubinoxidasen können von Myrothechecium verrucaria stammen.

Die Peroxidase kann von z.B. Sojabohnen, Meerrettich oder Coprinus cinereus stammen.

Die Proteindisulfidreductase kann jede der in den DK-Patentanmeldungen Nr. 768/93, 265/94 und 264/95 (Novo Nordisk A/S) erwähnten sein, welche hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen sind einschließlich Proteindisulfidreductasen aus Rind, Proteindisulfidreductasen von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger und DsbA oder DsbC von Escherichia coli.

Spezifische Beispiele von fertig kommerziell erhältlichen Oxidoreductasen schließen GluzymTM (Enzym erhältlich bei Novo Nordisk A/S) ein. Jedoch sind andere Oxidoreductasen von anderen erhältlich.

Es versteht sich, dass auch Varianten von Oxidoreductasen als das interessierende Polypeptid erwogen werden.

Die Aktivität der Oxidoreductasen kann, wie in „Methods of Enzymatic Analysis", 3. Auflage, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 3 beschrieben, bestimmt werden.

In diesem Zusammenhang sind Transferasen Enzyme, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E. C. 2 in Übereinstimmung mit den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology klassifiziert sind.

Die Transferasen können jede Transferase in den Untergruppen der Transferasen sein:

Transferasen, die Ein-Kohlenstoff-Gruppen übertragen (E. C. 2.1); Transferasen, die Aldehyd oder Reste übertragen (E. C. 2.2), Acyltransferasen (E. C. 2.3); Glucosyltransferasen (E. C. 2.4); Transferasen, die Alkyl oder Arylgruppen, andere als Methylgruppen, übertragen (E. C. 2.5); Transferasen, die Stickstoffgruppen (2.6) übertragen.

In einer bevorzugen Ausführungsform ist die Transferase eine Transglutaminase E. C. 2.3.2.13 (Proteinglutamin-&ggr;-glutamyltransferase).

Transglutaminasen sind Enzyme, die in der Lage sind, eine Acyltransferreaktion zu katalysieren, bei der eine &ggr;-Carboxyamidgruppe eines Peptid-gebundenen Glutaminrests der Acyldonor ist. Primäre Aminogruppen in einer Vielfalt von Substanzen können als Acylakzeptoren fungieren bei anschließender Bildung von monosubstituierten &ggr;-Amiden von Peptid-gebundener Glutaminsäure. Wenn die Epsilon-Aminogruppe eines Lysinrests in einer Peptidkette als der Acylakzeptor dient, bilden die Transferasen intramolekulare oder intermolekulare &ggr;-Glutamyl-&egr;-lysyl-Kreuzvernetzungen.

Beispiele von Transglutaminasen sind in der anhängigen DK-Patentanmeldung Nr. 990/94 (Novo Nordisk A/S) beschrieben.

Die Transglutaminase kann menschlichen, tierischen (z.B. Rind) oder mikrobiellen Ursprungs sein.

Beispiele solcher Transglutaminasen sind aus Tieren stammende Transglutaminasen, FXIIIa; mikrobielle Transglutaminasen von Physarum polycephalum (Klein et al., Journal of Bacteriology, 174, S. 2599–2605); Transglutaminasen von Streptomyces sp. einschließlich Streptomyces lavendulae, Streptomyces lydicus (früher Streptomyces libani) und Streptoverticillium sp. einschließlich Streptoverticillium mobaraense, Streptoverticillium cinnamoneum und Streptoverticillium griseocarneum (Motoki et al., US 5,156,956; Andou et al., US 5,252,469; Kaempfer et al., Journal of General Microbiology, 137, 1831–1892; Ochi et al., International Journal of Sytematic Bacteriology, 44, 285–292; Andou et al., US 5,252,469; Williams et al., Journal of General Microbiology, 129, 1743–1813.

Es versteht sich, dass auch Transferasevarianten als das interessierende Polypeptid erwogen werden.

Die Aktivität der Transglutaminasen kann, wie in „Methods of Enzymatic Analysis", 3. Auflage, 1984, Verlage Chemie, Weinheim, Bd. 1–10 beschrieben, bestimmt werden.

In diesem Zusammenhang sind Phytasen Enzyme, die unter der Enzymklassifizierungsnummer E. C. 3.1.3 (phosphorische Monoesterhydrolasen) in Übereinstimmung mit den Empfehlungen (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) klassifiziert sind.

Phytasen sind von Mikroorganismen produzierte Enzyme, welche die Umwandlung von Phytat zu Inositol und inorganischem Phosphor katalysieren.

Phytase-produzierende Mikroorganismen umfassen Bakterien, wie Bacillus subtilis, Bacillus natto und Pseudomonas; Hefen wie Saccharomyces cerevisiae und Pilze wie Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus oder Aspergillus nidulans und verschiedene andere Aspergillus-Species).

Beispiele von Phytasen schließen Phytasen ein, die aus denen ausgewählt sind, die unter den Enzymklassifizierungsnummern klassifiziert sind: 3-Phytase (3.1.3.8) und 6-Phytase (3.1.3.26).

Die Aktivität der Phytasen kann wie in „Methods of Enzymatic Analysis", 3. Auflage, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 1–10 beschrieben, bestimmt werden oder kann gemäß der in der EP A1 0 420 358, Beispiel 2A beschriebenen Methode gemessen werden.

Im vorliegenden Zusammenhang können antimikrobielle Polypeptide jedes Polypeptid sein, welches antimikrobielle Eigenschaften aufweist, wie eine antifungale, antibakterielle und/oder antiinsektizidale Aktivität.

Solche Polypeptide können auch andere Aktivitäten aufweisen wie enzymatische Aktivität.

Beispiele von antimikrobiellen Polypeptiden gemäß der Erfindung schließen ein: Fungizidaktive Polypeptide von dem in der WO 94/01459 (Novo Nordisk A/S) beschriebenen Schleimpilzgattung Curvularia; in der EP 403.458 beschriebenen antibakteriellen Polypeptide (Kabigen AB); antimikrobielle Proteine, die aus Mirabilis-Samen isoliert sind, beschrieben in der WO 92/15691 (Imperial Chem. Ind. PLC); antibakterielle Polypeptide, die aus einem Extrakt von kleinem Schweinedarm isoliert sind, beschrieben in der WO 92/22578 (Boman et al.); Polypeptide mit für Hefen lethaler Wirkungsweise, die in der Hefe von Hansenula spp. akkumuliert werden, wie in der JP-60130599 beschrieben; das antivirale Protein aus Phytolacca insularis, welches als ein in der US-Patent Nr. 5,348,865 (Jin Ro LTD.) beschriebenes Antimikrobium verwendet werden kann; bakteriolytische Enzympräparationen aus Nocardiopsis dassonvillei, beschrieben in der US-Patent Nr. 5,354,681 (Novo Industri A/S).

Beispiele anderer antimikrobieller Peptide sind Maganinin, Protegrin, Defensin, Pseudomycin, Mutanolysin und N-Acetylmuramidase.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem weiteren Aspekt auf eine Methode zur Erzeugung einer DNA-Sequenz, die für eine gewünschte Variante eines interessierenden Polypeptids kodiert, wobei

  • i) eine mutante Bibliothek durch die obige Methode hergestellt wird,
  • ii) die Bibliothek unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression des interessierenden Gens förderlich sind, um Polypeptidvarianten herzustellen,
  • iii) die varianten Polypeptide nach einer gewünschten Eigenschaft durchgemustert oder ausgewählt werden, und Wirte, die solche gewünschten Varianten produzieren, identifiziert und isoliert werden,
  • iv) die für diese Varianten kodierende DNA isoliert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Methode zur Bestimmung einer DNA-Sequenz, die für eine gewünschte Variante eines interessierenden Polypeptids kodiert, wobei

  • i) eine mutante Bibliothek durch die obige Methode hergestellt wird,
  • ii) die Bibliothek unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression des interessierenden Gens förderlich sind, um Polypeptidvarianten herzustellen,
  • iii) die varianten Polypeptide nach einer gewünschten Eigenschaft durchgemustert oder ausgewählt werden, und Wirte, die solche gewünschten Varianten produzieren, identifiziert und isoliert werden,
  • iv) das genetische Element in den Wirten sequenziert wird, um die DNA-Sequenz des mutierten Gens, das für eine gewünschte Variante kodiert, aufzuklären.

Dieser Aspekt der Erfindung kann durch das Herstellen von Verdünnungen der Bibliothek (z.B. in Mikrotiter-Platten) und Kultivieren derselben durchgeführt werden, wobei Populationen hergestellt werden, wovon jede von einem Mitglied der Bibliothek abstammt, und das variante Polypeptid, das von jeder dieser Populationen produziert wird nach gewünschten Eigenschaften durchgemustert wird. Alternativ kann die Bibliothek auf Agar-Platten ausplattiert werden, die ein gewünschtes Wachstumsmedium enthalten, welches das Durchmustern oder die Selektion nach gewünschten Eigenschaften des varianten Polypeptids erlaubt.

Wenn die Phagendisplay-Methode verwendet wird, wird das Durchmustern oder die Selektion direkt mit den Phagen durchgeführt.

Die Selektionskriterien können gemäß der letztendlichen Verwendung der interessierenden Polypeptid-Variante variieren, aber typischerweise getestete Eigenschaften schließen Löslichkeit und Halbwertszeit in verschiedenen Medien ein, Antigenität und Allergenität, Wärmestabilität, Oxidationsstabilität, Lagerungsstabilität, Substratspezifität und Affinität, Stabilität in nicht-wässrigen Lösungsmitteln, pH-Profil, Ionenstärkeabhängigkeit, katalytische Wirksamkeit und Kompatibilität mit anderen Komponenten denkbarer Endprodukte, von denen die Polypeptidvariante ein Teil sein wird.

Für Enzyme, die in Waschmitteln verwendet werden sollen, sind weitere zu untersuchende Eigenschaften die Waschleistung und Kompatibilität mit verschiedenen Oberflächen, insbesondere Stoffen.

Zahlreiche andere Kriterien könnten erwähnt werden.

Nach Identifizierung von Populationen, die variante Polypeptide produzieren, welche die ausgewählten Kriterien erfüllen, wird die für die interessierende Polypeptidvariante kodierende DNA isoliert und mittels aus dem Stand der Technik bekannter Methoden sequenziert.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer gewünschten Polypeptidvariante, wobei

  • (i) eine DNA-Sequenz, welche wie oben angegeben bestimmt worden ist, in einen geeigneten Wirt eingebracht wird auf eine Weise, wodurch sie in diesem Wirt exprimiert werden kann,
  • (ii) der Wirt unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression der DNA-Sequenz förderlich sind, und
  • (iii) die Polypeptidvariante gewonnen wird.

Die vorliegende Erfindung kann mit jeder Zelle verwendet werden, insbesondere jeder mikrobiellen Zelle, aber es ist oft günstig, einen Prokaryonten zu verwenden, insbesondere ein Bakterium, bevorzugt der Gattung Bacillus, etc.

Unter den Bacilli ist es bevorzugt, einen Stamm zu verwenden, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend B. lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, etc.

Für einige Verwendungen ist es bevorzugt, eine mikrobielle Zelle zu verwenden, welche ein Pilz ist, insbesondere ein filamentöser Pilz, bevorzugt der Gattung Aspergillus, Trichoderma, etc.

Unter den Aspergilli ist es bevorzugt, einen Stamm zu verwenden, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend A. oryzae, A. niger, A. awamori, etc.

Unter den Trichoderma ist es bevorzugt, einen Stamm zu verwenden, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend T. reseei, etc.

Bei anderen Gegebenheiten ist es zweckmäßiger, eine Säugerzelle zu verwenden, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend BHK-Zellen usw.

Die Erfindung soll nicht dahingehend aufgefasst werden, auf die spezifischen Beispiele oder Ausführungsformen, die in der obigen Beschreibung erwähnt sind oder auf die vorliegenden Beispiele beschränkt zu sein.

MATERIAL UND METHODEN BEISPIELE BEISPIEL 1

Das verwendete System ist eine Escherichia coli-Wirtszelle, welche durch eine Anzahl chromosomaler Mutationen charakterisiert ist:

  • i) eine ts (thermosensitive) Mutation im polC-Gen (kodierend für die DNA-Polymerase III, welche die Hauptreplikationspolymerase ist)
  • ii) eine Mutation im polA-Gen (kodierend für die DNA-Polymerase I), die eine gesteigerte Fehlerrate durch eine Reduzierung in der 3'-5'-Exonuklease-Aktivität hervorruft.
  • iii) mangelhafte Reparatur durch die mutL-Mutation.

Das Ziel für die in vivo-Mutagenese ist das Plasmid pBR322 (colE1-Ursprung), das entweder (i) eine Leserasterverschiebungsmutation oder (ii) ein Stop-Codon aufweist, welches in das Tet-Gen, das für ein Resistenz gegenüber Tetracyclin verleihendes Protein kodiert, eingeführt ist.

In jedem Fall führt die Reparatur der Mutation zu einem dominanten Tetracyclinresistenz-Phänotyp.

pBR322 enthält auch das Resistenz gegenüber Ampicillin verleihende bla-Gen. Die höhere Mutagenese-Häufigkeit an der Zielregion wird ersichtlich anhand einer höheren Häufigkeit der Tetracyclin-resistenten Kolonien nach Ausplattieren einer Kultur unter „mutationseinführenden" Bedingungen.

Eine bei 37°C bis zu einer optischen Dichte von 1 gemessen bei 600 nm gewachsene E. coli-Kultur wird für 2, 4 oder 16 Stunden bei einer restriktiven Temperatur, z.B. 42°C ausgesetzt. Bei diesen Zeitpunkten werden Serien von Verdünnungen dieser Kulturen auf LBagar ergänzt mit

  • 1) Ampicillin (AmpR-Kolonien)
  • 2) Tetracyclin und Ampicillin. (AmpR und tetR-Kolonien) ausplattiert.

Das Verhältnis der Tetracyclin-resistenten Kolonien zu den Ampicillin-resistenten Kolonien zeigt die Anzahl der Zellen in der Kultur an, welche eine Kopie des reparierten tet-Gens enthalten, wodurch ein spezifisches Mutagenese-Ereignis angezeigt wird.

Das bedeutet, wenn ein Klon Tetracyclin-resistent geworden ist, hat sich mindestens eine spezifische Mutation ereignet, um den ursprünglich eingeführten Gendefekt zu reparieren.

IN DER BESCHREIBUNG ZITIERTE REFERENZEN
  • Greg Winter, Current methods in Immunology 5: 253–255, 1993
  • Griffiths, A. D. et al., 1994, EMBO J. 14: 3245–3260.
  • Clackson et al., Nature 352: 624–628, 1991
  • Bryan, P et al., Proteins 1: 326–334, 1986
  • Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY.
  • Scopes, R. K., Protein Purification (1987), Springer-Verlag
  • Kim and Loeb (1995, PNAS 92: 684–688)
  • ∅rum, P. et al., Nucl. Acid. Res. 21: 4491–4498, 1993

EP 130.756 (Genentech), EP 214.435 (Henkel), WO 87/04461 (Amgen), WO 87/05050 (Genex), EP 251.446 (Genencor), EP 260.105 (Genencor), Thomas et al. (1985) Nature 318, 375–376, Thomas et al. (1987) J. Mol. Biol., 193, 803–813, Russel et al. (1987) Nature 328 496–500, WO 88/08028 (Genex), WO 88/08033 (Amgen), WO 89/06279 (Novo Nordisk A/S), WO 91/00345 (Novo Nordisk A/S), EP 525 610 (Solvay) und WO 94/02618 (Gist-Brocades N. V.), US 4,810,414, WO 89/04361, US Patent-Nr. 4,950,417 (Solvay enzymes), EP 218 272, WO 88/09367, US 5,389,536, EP 130,064, WO 90/09446), EP 238 023, WO 88/02775, WO 94/01541, WO 89/02916, Schimada et al., (1989), J. Biochem., 106, 383–388, Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61–67, Hass et al., (1991), Gene 109, 107–113, Kugimiya et al., (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56, 716–719, Dartois et al., (1993) Biochimica et Biophysica acta 1131, 253–260, JP 64/7744992, WO 91/16422, WO 93/01285, WO 95/22615, DK-Patentanmeldungen Nr. 768/93, 265/94 und 264/94 (Novo Nordisk A/S), DK-Patentanmeldungsnr. 990/94 (Novo Nordisk A/S), Klein et al., Journal of Bacteriology, 174, S. 2599–2605, Motoki et al., US 5,156,956; Andou et al., US 5,252,469; Kaempfer et al., Journal of General Microbiology, 137, 1831–1892; Ochi et al., International Journal of Sytematic Bacteriology, 44, 285–292; Andou et al., US 5,252,469; Williams et al., Journal of General Microbiology, 129, 1743–1813, WO 94/01459 (Novo Nordisk A/S), EP 403.458 (Kabigen AB), WO 92/15691 (Imperial Chem Ind. PLC), WO 92/22578 (Boman et al.), JP-60130599, US-Patentnr. 5,348,865 (Jin Ro LTD.), US-Patentnr. 5,354,681 (Novo Industri A/S),

Methods of Enzymatic Analysis, 3. Auflage, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. 1–10. AF 95/5 GB (erhältlich auf Anfrage von Novo Nordisk A/S.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur in vitro-Produktion einer Bibliothek von Varianten eines Gens, das für ein interessierendes Polypeptid kodiert, in Zellen, wobei eine fehleranfällige Polymerase verwendet wird, um ein ganzes oder Teil eines genetischen Elements unabhängig von dem chromosomalen Replikationsapparat der Zellen zu replizieren, das genetische Element umfassend

    i) einen Replikationsursprung, von dem aus die Replikation beginnt,

    ii) optional einen genetischen Marker, z.B. ein Gen, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht,

    iii) das Gen, das für das interessierende Polypeptid kodiert,
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle weiterhin ein fehlerhaftes Reparatursystem umfasst.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das genetische Element ein Plasmid, ein Phagemid, ein Phage, ein Virus, ein Retrovirus oder ein Retrotransposon ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die reparaturanfällige Polymerase ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend DNA pol I, DNA pol II, reverse Transkriptase und insbesondere E. coli DNA pol I, Bacillus subtilis DNA pol I, HIV-reverse Transkriptase, T4 DNA-Polymerase, T7 DNA-Polymerase, Phi29 DNA-Polymerase.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die chromosomale Replikation, welche reversibel induziert werden kann, um im Wesentlichen nicht funktionell zu sein, eine Temperatur-sensitive E. coli-DNA-Polymerase III ist.
  6. Verfahren zur Bestimmung einer DNA-Sequenz, die für eine gewünschte Variante eines interessierenden Polypeptids kodiert, wobei

    (i) eine mutante Bibliothek durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 hergestellt wird, wobei das genetische Element ein Gen, das für das interessierende Polypeptid kodiert, umfasst,

    (ii) die Bibliothek unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression des interessierenden Gens förderlich sind, um Polypeptidvarianten herzustellen,

    (iii) die varianten Polypeptide nach einer gewünschten Eigenschaft durchgemustert oder ausgewählt werden, und Wirte, die solche gewünschten Varianten produzieren, identifiziert und isoliert werden,

    (iv) das genetische Element in den Wirten sequenziert wird, um die DNA-Sequenz des mutierten Gens, das für eine gewünschte Variante kodiert, aufzuklären.
  7. Verfahren zum Erzeugen einer DNA-Sequenz, die für eine gewünschte Variante eines interessierenden Polypeptids kodiert, wobei

    (i) eine mutante Bibliothek durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 hergestellt wird, wobei das genetische Element ein Gen, das für das interessierende Polypeptid kodiert, umfasst,

    (ii) die Bibliothek unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression des interessierenden Gens förderlich sind, um Polypeptidvarianten herzustellen,

    (iii) die varianten Polypeptide nach einer gewünschten Eigenschaft durchgemustert oder ausgewählt werden, und Wirte, die solche gewünschten Varianten produzieren, identifiziert und isoliert werden,

    (iv) die für die Varianten kodierende DNA isoliert wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das interessierende Polypeptid ein Enzym ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Enzym eine Carbonylhydrolase, Carbohydrase, Oxidoreductasen, Transferase, Phytase, Ligase, Lyase und ein antimikrobielles Polypeptid ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Carbonylhydrolase eine Protease oder eine Lipase ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Carbohydrase eine Amylase, Glucosidase, Cellulase, Glucanase, Xylanase, Dextranase, Chitinase, Polygalacturonase, Lysozyme, Glucosidase, Galactosidase, Xylosidase, Arabinosidase, Lactase, Chitonanase, Xyloseisomerase, Pektinesterase, Rhamnogalacturonase, Endoglucanase ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Oxidoreductase eine Dehydrogenase, Oxidase, Reductase, Laccase, Catalase, Peroxidase, Lipoxygenase, Superoxiddismutase ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Transferase eine Transferase, die Ein-Kohlenstoffgruppen überträgt, eine Transferase, die Aldehyd oder Reste überträgt, Acyltransferase, Glucosyltransferase, Transferase, die Alkyl- oder Arylgruppen, andere als Methylgruppen, überträgt, eine Transferase, die Stickstoffgruppen überträgt, ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–13, wobei die Zellen mikrobielle Zellen sind.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zelle ein Prokaryont, insbesondere ein Bakterium, bevorzugt der Gattung Bacillus, Escherichia, Staphylococcus und Streptococus ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei Escherichia E. coli ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei Bacillus ein Stamm ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus B. lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens und B. subtilis ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zelle ein Pilz ist, insbesondere eine Hefe oder ein filamentöser Pilz, vorzugsweise der Gattung Aspergillus oder Trichoderma.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Aspergillus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus A. oryzae, A. niger und A. awamori.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei Trichoderma T. reseei ist.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–13, wobei die Zelle eine Säuger-BHK-Zelle oder eine Insektenzelle ist.
Es folgt kein Blatt Zeichnungen






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com