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Dokumentenidentifikation DE69826583T2 09.03.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000895084
Titel Vorrichtung und Verfahren zum Erreichen von klinischen wichtigen Analytverhältnissen
Anmelder Bayer Corp., Pittsburgh, Pa., US
Erfinder Kuo, Hai-Hang, Granger, US;
Miller, Carol A., Elkhart, Indiana 46514, US;
Wijesuriya, Dayaweere, Granger, Indiana 46530, US;
Yip, Meitak Teresa, Elkhart, Indiana 46516, US;
Zimmerle, Chris T., Goshen, Indiana 46528-8313, US
Vertreter Köhler, F., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 40723 Hilden
DE-Aktenzeichen 69826583
Vertragsstaaten BE, CH, DE, ES, FI, FR, GB, IE, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.07.1998
EP-Aktenzeichen 981129646
EP-Offenlegungsdatum 03.02.1999
EP date of grant 29.09.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 09.03.2006
IPC-Hauptklasse G01N 33/558(2006.01)A, F, I, ,  ,  ,   
IPC-Nebenklasse G01N 33/53(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Immunochromatografische Streifen-Formate sind zunehmend populär für qualitative und halb-quantitative Assayverfahren geworden, in denen Sicht-Nachweisschemata zur Anwendung gelangen. Dieser Typ eines Immunoassay beinhaltet die Aufbringung einer flüssigen Testprobe, die vermutlich einen nachzuweisenden Analyt enthält, auf die Aufbringzone eines immunochromatografischen Teststreifens. Der Streifen ist aus einem Matrixmaterial zusammengesetzt, durch welches das Testfluid und der Analyt, die darin suspendiert oder aufgelöst werden, durch Kapillarwirkung aus der Aufbringzone zu einer Einfangzone zu fließen vermögen, wo ein nachweisbares Signal oder dessen Abwesenheit das Vorhandensein des Analyt enthüllen oder nicht. In typischer Weise schließt der Streifen Mittel zur immunospezifischen Bindung des nachzuweisenden Analyt mit seinem spezifischen Bindungspartner ein, welcher die nachweisbare Markierung aufweist. In einem solchen Schema enthält, wie offenbart in US 4 446 232, der Streifen ein markiertes Enzym, das den mobilen Bindungspartner für den Analyt darstellt und in einer Zone stromabwärts von der Proben-Aufbringzone vorliegt. Ist Analyt in der Testprobe vorhanden, wird er mit seinem markierten Bindungspartner kombiniert, um einen Komplex zu bilden, der entlang dem Streifen zu einer Nachweiszone fließt, der ein Substrat für die Enzym-Markierung enthält, welches dazu befähigt ist, eine gefärbte Reaktion in der Gegenwart der Enzym-Markierung zu ergeben. Der Streifen kann eine Zone enthalten, in welcher Analyt immobilisiert ist, so dass markierter Bindungspartner, der wegen der Abwesenheit von Analyt in der Probe dann nicht mit Analyt kombiniert wird, eingefangen und dadurch inhibiert wird, die Nachweiszone zu erreichen. Es sind verschiedene Modifikationen dieser technischen Verfahrensweise veröffentlicht worden, die alle ein kompetitives spezifisches Bindungssystem beinhalten, in welchem die An- oder Abwesenheit von Analyt in der Testprobe durch den Nachweis oder das Fehlen von dessen markiertem Bindungspartner in der Einfangzone bestimmt bzw. ermittelt werden.

Eine Alternative zum oben beschriebenen immunometrischen Assay, welcher den freien markierten Antikörper nachweist, stellt das sogenannte Sandwich-Format dar, worin die Einfangzone immobilisierte Antikörper gegen eine Epitop des Analyt enthält, das sich von demjenigen Epitop unterscheidet, zu welchem der markierte Antikörper spezifisch ist. In diesem Format wird ein Sandwich des Analyt zwischen den immobilisierten und markierten Antikörpern gebildet, und dies stellt daher einen immunometrischen Assay dar, welcher die gebundene markierte Antikörperspezies nachweist.

Nicht alle der Schemata zur Immunochromatografie beruhen auf einem Enzym-markierten Bindungspartner/Enzym-Substrat zur Herstellung des Signals zum Nachweis des Analyt. In US 4 806 311 ist eine Multizonen-Testvorrichtung für die spezifische Bindungsassay-Bestimmung eines Analyt und eines immobilisierten Bindungspartners dafür zusammen mit einer Einfangzone zur Aufnahme von markiertem Reagens offenbart, welches dorthin aus der Reagenszone wandert. Die Einfangzone enthält eine immobilisierte Form einer Bindungssubstanz für das markierte Reagens. Das markierte Reagens weist eine chemische Gruppe mit einer nachweisbaren physikalischen Eigenschaft auf, welches auf der Basis seiner eigenen physikalischen Eigenschaften nachweisbar ist, so dass dieses keiner chemischen Reaktion mit einer weiteren Substanz bedarf. Beispiele solcher Gruppen sind gefärbte Spezies von Fluoreszierern, phosphoreszenten Molekülen, Radioisotopen und elektroaktiven Resten.

US 4 703 017 beschreibt die Verwendung sichtbarer teilchenförmiger Markierungen für den Rezeptor. Verschiedene teilchenförmige Markierungen wie Gold-Sol-Partikel und einen sichtbaren Farbstoff enthaltende Liposome werden genannt.

In WO 96/34271 ist eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Ziel-Analyt und von Kreatinin in einer fluiden Testprobe offenbart, wobei die Vorrichtung einen Assay-Streifen zum Nachweis von Kreatinin und einen zweiten Assay-Streifen zum Nachweis des Ziel-Analyt aufweist. Die Kreatinin-Konzentration kann kolorimetrisch oder durch den spezifischen Einfang markierter Kreatinin-Bindungspartner bestimmt werden. Die Konzentration des Ziel-Analyt wird, bezogen auf die Kreatinin-Konzentration der Probe, korrigiert, wobei die Korrektur entweder von Hand oder mittels eines sauber programmierten Reflexionsanalysiergeräts durchgeführt werden kann.

EP 0 462 376 A2 offenbart eine immunochromatografische Verfahrensweise, in welcher Signale an der Einfangstelle und an der Konjugat-Gewinnungsstelle des Streifens nachgewiesen und die Analyt-Konzentration durch die Intensität des Signals an der Einfangstelle relativ zum Signal an der Konjugat-Gewinnungsstelle bestimmt werden. Ebenfalls von Interesse in dieser Hinsicht ist US 5 569 608.

Immunochromatografische Streifen-Formate ergeben ein zuverlässiges System zum Nachweis verschiedener Analyte (seien diese Antigene oder Antikörper), sie leiden aber an der Einschränkung, dass sie Ergebnisse liefern, die bestenfalls nur halb-quantitativ sind, wenn, für einige Analyte, genauere quantitative Ergebnisse benötigt werden. Demzufolge steht zu wünschen, und ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Quantifizierung der Ergebnisse von Analysen anzugeben und bereitzustellen, die durch die Anwendung immunochromatografischer Streifen-Formate durchgeführt werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyt in einer Probe einer Körperflüssigkeit, wobei das Verfahren die Stufen umfasst:

  • a) Bereitstellung eines Teststreifens, der eine Matrix umfasst, durch welche die fluide Probe durch Kapillarwirkung zu fließen vermag, wobei der genannte Streifen einen ersten Bereich, der einen mobilen spezifischen Bindungspartner für den Analyt enthält, wobei der Bindungspartner eine nachweisbare Markierung aufweist und mit dem Analyt zur Bildung eines Komplexes aus dem Analyt/markierten Bindungspartner zu reagieren vermag, und wobei der Streifen mindestens einen zweiten Bereich, der immobilisierten Analyt oder einen immobilisierten Bindungspartner enthält, welcher für ein Epitop des Analyt spezifisch ist, das sich von demjenigen unterscheidet, zu welchem der markierte Bindungspartner spezifisch ist, und wobei der Streifen mindestens einen dritten Bereich, der Mittel zum Einfangen des Komplexes aus dem Analyt/markierten spezifischen Bindungspartner enthält, welcher nicht im zweiten Bereich gebunden wird, und einen vierten Bereich aufweist, der Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals enthält, dessen Intensität dem Spiegel eines zweiten Analyt entspricht, dessen Konzentration in klinischem Bezug zu derjenigen des Analyt steht, dessen Konzentration in der Körperflüssigkeit bestimmt wird;
  • b) Entwicklung der Matrix, wobei die Probe der Körperflüssigkeit, die den vermuteten ersten Analyt und den zweiten Analyt dafür enthält, aufgebracht wird, um dadurch die Probe in Kontakt mit dem markierten spezifischen Bindungspartner so gelangen zu lassen, dass der in der fluiden Probe vorhandene Analyt an den markierten spezifischen Bindungspartner gebunden wird, um einen Komplex zu bilden, während überschüssiger, unreagierter markierter Bindungspartner frei zur Weiterreaktion zurückbleibt, wobei die fluide Probe den Komplex aus dem Analyt/markierten Partner und den unreagierten markierten Bindungspartner entlang der Matrix durch Kapillarwirkung zum zweiten Bereich trägt, der den immobilisierten Analyt enthält, in welchem Bereich der unreagierte markierte Bindungspartner an den immobilisierten Analyt in umgekehrter Beziehung zur Konzentration des ersten Analyt in der fluiden Testprobe oder an den immobilisierten spezifischen Bindungspartner in direkter Beziehung zur Analyt-Konzentration in der fluiden Testprobe gebunden wird, und wobei der markierte spezifische Bindungspartner, der nicht an den zweiten Bereich gebunden wird, durch Kapillarwirkung zum dritten Bereich getragen wird, wo er durch die Einfangmittel eingefangen wird;
  • c) Ablesung der zweiten Zone der entwickelten Matrix an einem Gerät, das einen Detektor mit der Befähigung zur Messung des Signals aus der nachweisbaren Markierung zur Bestimmung der Konzentration des markierten Bindungspartners in der zweiten Zone aufweist, und Ablesung der dritten Zone des entwickelten Streifens in ähnlicher Weise zur Bestimmung des Signals aus dem markierten Bindungspartner in der dritten Zone der Matrix;
  • d) Bestimmung des endgültigen Reaktionssignals durch Bildung der Verhältnisse der Signale aus dem markierten Bindungspartner, der im zweiten Bereich immobilisiert wurde, und aus dem markierten Bindungspartner, der im dritten Bereich eingefangen wurde;
  • e) Bestimmung der Konzentration des ersten Analyt in der fluiden Probe durch Vergleich des in Stufe d) bestimmten endgültigen Reaktionssignals mit endgültigen Reaktionssignalen, die in ähnlicher Weise für fluide Proben ermittelt werden, die bekannte Konzentrationen des ersten Analyt enthalten; und
  • f) Korrektur der Konzentration des in Stufe e) bestimmten ersten Analyt durch Bestimmung der Konzentration des zweiten Analyt in der fluiden Testprobe durch Messung der Intensität des Signals im vierten Bereich der Matrix und durch deren Umrechnung in den Konzentrationswert des zweiten Analyt und dann durch Bestimmung des Verhältnisses des zweiten Analyt zum ersten Analyt, dessen quantitative Konzentration gesucht wird.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird zuerst durch Bereitstellung der Testmatrix durchgeführt, durch welche die fluide Testprobe durch Kapillarwirkung zu fließen vermag. In typischer Weise liegt die Matrix in der Form eines Streifens vor, durch welchen das Testfluid horizontal fließt. Während die Matrix auch in einem geschichteten Format zusammengebaut sein könnte, durch welches das Testfluid vertikal von oben nach unten oder umgekehrt fließen könnte, ist die folgende Diskussion gezielt auf das bevorzugte Streifen-Format gerichtet.

Der Streifen kann aus einem Matrixmaterial hergestellt sein, durch welches das Testfluid und ein darin enthaltener Analyt durch Kapillarwirkung zu fließen vermögen, und er kann aus einem Material gefertigt sein, das die Befähigung aufweist, einen nicht-saugfähigen seitlichen Fluss zu unterstützen. Dieser Typ eines Fließens ist in US 4 943 522 als Flüssigkeitsfluss beschrieben, in welchem alle der gelösten oder dispergierten Komponenten der Flüssigkeit durch die Matrix im wesentlichen mit gleichen Geschwindigkeiten und mit relativ unbeeinträchtigtem Fluss getragen werden, im Gegensatz zu einem vorrangigen Zurückhalten einer oder mehrerer Komponenten, wie dies der Fall sein würde, falls das Matrixmaterial befähigt wäre, eine oder mehrere der Komponenten zu absorbieren oder aufzusaugen. Ein Beispiel eines solchen Matrixmaterials ist das Blattmaterial aus Polyethylen hoher Dichte oder mit ultrahohem Molekulargewicht von Porex Technologies. Gleichermaßen geeignet zur Verwendung als Matrix, aus welcher die chromatografischen Streifen gefertigt werden können, sind saugfähige Materialien, wie Papier, Nitrocellulose und Nylon.

Verschiedene immunochromatografische Streifen-Formate eignen sich zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. Ein besonders geeignetes Format ist das, welches in US 4 446 232 offenbart ist, worin eine Vorrichtung zur Bestimmung des Vorliegens von Antigenen beschrieben ist, welche einen Streifen aus Matrixmaterial mit einer ersten Zone umfasst, worin immobilisierter Analyt und Enzym-gebundene Antikörper bereitgestellt sind, die spezifisch zum zu bestimmenden Analyt sind. Die markierten Antikörper können zu einer zweiten Zone fließen, wenn sie mit Analyt reagiert haben, der in die erste Zone durch die Testprobe eingebracht wurde, sie tun dies aber nicht in Abwesenheit von Analyt im Testfluid, weil sie im ersten Bereich durch Wechselwirkung mit dem immobilisierten Analyt gebunden werden. Der Analyt ist in typischer Weise ein Antigen, obwohl das Format auch entworfen werden kann, um das Vorliegen und Vorhandensein von Antikörpern als Analyt nachzuweisen. Modifikationen zu diesem Format sind in US 4 868 108 offenbart. In einer weiteren Modifikation wird das Enzym-Substrat in der Bereichsregion eines zweiten, immobilisierten Antikörpers bereitgestellt und angeordnet, um dadurch den Komplex einzufangen, der zwischen den mit Enzym markierten Bindungspartner und dem Analyt gebildet wird. Diese Sorte eines Formats wird in besonders geeigneter Weise auf die vorliegende Erfindung angewandt, obwohl jeglicher physikalisch nachweisbarer Signal-Erzeuger als die Markierung verwendet werden kann, da die vorliegende Erfindung nicht auf die Wechselwirkung eines Enzyms mit seinem Substrat zur Erstellung des nachweisbaren Signals eingeschränkt zu werden braucht. Somit werden, durch Immobilisierung des Konjugats in einer diskreten Nachweiszone, die stromabwärts auf dem Streifen von der Zone angeordnet wird, worin der markierte Bindungspartner für den Analyt eingefangen wird, zwei Bereichregionen bereitgestellt, aus denen die physikalisch nachweisbare Eigenschaft der Markierung zur Bestimmung ihrer Konzentration gemessen werden kann. Durch Messung des Signals aus der nachweisbaren Markierung im zweiten Bereich der Matrix (welcher manchmal als Einfangzone bezeichnet wird) und des Signals aus der physikalisch nachweisbaren Eigenschaften der Markierung im dritten Bereich (welcher manchmal als die Nachweiszone bezeichnet wird), in welchem ein immobilisierter Antikörper gegen den markierten Bindungspartner (z. B. Anti-Maus-IgG, wenn der markierte Bindungspartner ein Antikörper ist) das Einfangmittel ist, und durch Bestimmung des Verhältnisses dieser Signale kann die Genauigkeit des Tests für die Analyt-Konzentration gesteigert werden. Die Genauigkeit wird gesteigert, weil diese Verfahrenstechnik Ungenauigkeiten, die durch die Ablagerung von markiertem Konjugat und/oder durch einen nicht-einheitlichen Fluss durch die Matrix verursacht werden, korrigiert. Da die vorgenannten Ungenauigkeiten durch Ablagerung von markiertem Konjugat und durch nicht-einheitlichen Fluidfluss gewöhnlich von nur kleiner, aber signifikanter Größe sind, stören sie, in ganz besonderer Weise, das Bindungsgleichgewicht im wesentlichen nicht. Daher stellt das Verhältnis der Signale in den zwei Bindungsbereichen ein genauereres Maß der Analyt-Konzentration als das Signal aus einem der beiden Bereiche selbst dar. Dieses Prinzip gilt mit gleicher Aussagekraft, wenn das vorher beschriebene Sandwich-Format angewandt wird.

Die zweiten und dritten Zonen der Matrix, die in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen, können jeweils in zwei oder mehr Banden aufgeteilt sein, wobei die zweite Bereichsregion vorzugsweise 1 bis 3 diskrete Banden und die dritte Bereichsregion 1 bis 2 Banden aufweisen. Durch Aufteilung dieser Bereichsregionen in Banden wird es ermöglicht, den dynamischen Bereich und/oder die Präzision des Assay aufgrund der Nicht-Linearität der Reflexion zur Anzahl nachgewiesener markierter Bindungspartner zu erhöhen. Die Aufteilung der Bereichsregionen in diskrete Banden kann wünschenswert sein, weil die Messung kleiner Änderungen in nachgewiesenen markierten Bindungspartnern robuster bei höheren Reflexionswerten als bei niedrigen Werten ist. Die Anzahl der Einfang- und/oder Sammelbanden, die wünschbar sind, hängt vom besonderen Assay ab, für welchen der Streifen entworfen wird, da die Aufteilung der Einfang- und Sammelzonen in zwei oder mehr diskrete Banden den dynamischen Bereich zwar bestimmter Assay-Verfahren, aber nicht den von weiteren erhöht. Der dynamische Bereich betrifft die Tatsache, dass das Gesamtsignal gesteigert werden kann, falls man sich gezielt auf mehr als eine einzelne Einfang- oder Nachweisbande innerhalb einer Zone richtet. Somit kann es, wenn die nachweisbare Markierung eine ist, die durch ein Reflexionsmessgerät nachweisbar ist, zu einer großen Nicht-Linearität der Reflexion und zu dem mit dem eingesetzten Reflexionsmessgerät zusammenhängenden Fehler kommen. Beispielsweise stellt die Differenz zwischen 70% R und 75% R einen ziemlich kleinen Betrag an nachweisbarer Markierung dar, wogegen die Differenz zwischen 30% R und 35% R einen hohen Prozentsatz der nachweisbaren Markierung darstellt. Bei Anwendung bestimmter Reflexionsmessgeräte bleibt der Fehler bei der Reflexionsablesung konstant oder erhöht sich, wenn der Reflexionswert abnimmt. Somit kann es von Vorteil sein, eine oder mehrere zusätzliche Einfang- oder Nachweisbanden einzusetzen und anzuwenden, falls dies die Reflexionsablesung bei einem höheren Wert anordnet, wo sie empfindlicher gegen Partikel-Konzentrationen ist. In jenen Assayverfahren, in denen ein breiter dynamischer Bereich nicht notwendig ist, vermögen eine einfache Ablesung und Einteilung einer einzelnen Einfang- und einer einzelnen Nachweisbereichsregion gute quantitative Ergebnisse zu liefern bzw. zu erstellen. Dies wird durch das folgende Beispiel 1 veranschaulicht, in welchem Deoxypryridinolin der erste Analyt ist und die Einfangzone in drei Banden (P1, P2 und P3) aufgeteilt ist, während die Nachweiszone eine Einzelbande (P4) und der Decode-Algorithmus für den DPB-Assay T/Pn sind, worin T die Summierung des Signals aus allen vier Banden ist. Algorithmen, die diese Reagensbanden-Reflexionswerte verwenden, werden in einer solchen Weise konstruiert, dass das Signal-zu-Rausch-Verhältnis maximiert und dadurch die Quantifizierung des Assay durch Reduzierung von Variationskoeffizienten (CV) gesteigert werden. Der besondere Algorithmus, der gewählt wird, hängt von der Anzahl der Reagensbanden auf dem besonderen Teststreifen, der eingesetzt wird, und der Empfindlichkeit und/oder Präzision des Assay ab. Sobald der entsprechend geeignete Algorithmus gewählt ist, wird die Beziehung zwischen dem Algorithmuswert und der Analyt-Konzentration ermittelt und an eine nicht-lineare Regressionsfunktion angepasst. Der Zweck einer derartigen Anpassung ist es, den Fehler zu minimieren, der den gewählten Algorithmuswert in Beziehung zum Wert der Analyt-Konzentration setzt. Die Regressionsfunktion wird angewandt, um eine Eichkurve zu erstellen, die angewandt wird, um den ermittelten Algorithmuswert zum Wert der Analyt-Konzentration in Beziehung zu setzen. Sobald diese Beziehung erstellt worden ist, wird die Eichkurve, die als eine Gleichung im Reflexionsgerät gespeichert werden kann, zur Berechnung der Analyt-Konzentration herangezogen.

Da sich die Reflexion der Einfang- und Nachweiszonen umgekehrt zueinander verändert, d. h., je größer das Signal aus der Einfangzone ist, um so niedriger ist das Signal aus der Nachweiszone, wird der Einsatz mehrfacher Einfang- und/oder Nachweisbanden geplant, um diesen Bereich der Reflexionswerte zu ändern. Der Mechanismus, durch welchen die Analyt-Konzentration die Banden-Reflexion verändert, ist eine Funktion des Chemismus des besonderen Assay. Für Sandwich-Assayverfahren steigt, bei ansteigender Analyt-Konzentration, die Einfangbandenreflexion an, und die Nachweisbanden-Reflexionsbandenreflexion sinkt ab. Für kompetitive Assayverfahren sinkt die Einfangbandenreflexion ab, und die Nachweisbandenreflexion steigt mit ansteigenden Mengen des Analyt in der fluiden Testprobe an.

Die notwendige Zufügung weiterer Einfang- und/oder Nachweisbanden hängt davon ab, ob Änderungen in einer zusätzlichen Bande signifikant größer in einer gegebenen Analyt-Vergleichsregion als in einer der weiteren Banden sind. Abhängig von der Markierungs-(z. B. der Gold-Sol)-Konzentration, setzen zusätzliche Einfangbanden auch die Signaländerungen an der Nachweiszone herab. In bestimmten Assayverfahren spiegelt eine zweite Einfangbande ganz einfach die erste Einfangbande, aber mit reduzierten Signalveränderungen, und es kann in solchen Fällen deren Notwendigkeit in Frage gestellt werden. Allerdings kann in jenen Assayverfahren, in denen die Nachweiszone zu dunkel wegen niedriger Reflexion ist, die Zufügung von Einfangbanden das Signal in dieser Zone verringern.

Ganz allgemein, ist es in der vorliegenden Erfindung entscheidend, einen besonderen Algorithmus und zusätzliche Einfang- und/oder Nachweisbanden so zu wählen, dass das Signal in solch einer Weise geändert und angepasst wird, dass es mit größerer Präzision durch ein Reflexionsmessgerät abgelesen wird.

Es gibt zwei Stufen, die bei der Entwicklung eines entsprechend geeigneten Algorithmus eine Rolle spielen. Die erste beruht darauf, das Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf ein so hoch wie mögliches Niveau anzuheben. Die zweite Stufe beruht darauf, einen Algorithmus zu definieren, der ganz leicht auf eine Gleichung passt, so dass genaue Werte für jede Analyt-Konzentration erhältlich sind. Dies wird durch die folgende Untersuchung an einem Streifen belegt, der drei Banden (zwei Einfangbanden und eine Nachweisbande) enthält. Die zwei Einfangbanden wiesen unterschiedliche Einfangreagens-Konzentrationen auf, wobei die erste Einfangbande eine 10-fach niedrigere Einfangreagens-Konzentration als die zweite aufwies. Dieses Format belegt, dass unterschiedliche Kombinationen und Konzentrationen von Einfang- und Sammelbanden angewandt werden können, und zwar in Abhängigkeit von den einzigartigen Eigenschaften eines jeden Assay. Messdaten wurden ermittelt (darstellend N = 18 für jeden Analyt-Spiegel) mit drei unterschiedlichen CLINITEK®-Reflexionsmessgeräten über eine Dauer von 2 Tagen. In Tabelle 1 sind die Vorteil-(Figure of Merit = FOM)-Differenzen zwischen DPD-Spiegeln der verschiedenen Bandenreflexionsveränderungen unter Anwendung verschiedener Reflexionsveränderungen unter Anwendung verschiedener Algorithmen angegeben. Der FOM ist berechnet als (Avg1 – Avg2)/(SD1 + SD2), worin Avg1 und Avg2 die Durchschnittsmesswerte für Analyt-Spiegel 1 und Analyt-Spiegel 2 und SD1 und SD2 die Standardabweichungen der Durchschnittswerte für Analyt-Spiegel 1 und Analyt-Spiegel 2 sind.

Tabelle 1

In Tabelle 1 ist Einfang 1 der IR-korrigierte Reflexionsmesswert für die Einfang 1-Bande, die Nachweisbande 1 ist der IR-korrigierte Reflexionsmesswert für die Einfangbande 2, Einf1/Nachw1 ist der K/S-transformierte Messwert von Einfang 1, dividiert durch Nachweis 1, und Algor 1 ist: C/{Einfangbande 2/&Sgr;(Einfangbanden) × ABS(2 – C)}, worin C = 100 × (1 + &Sgr;(Nachweisbanden/&Sgr;(Reagensbanden)),

und für Gesamt/Einf1 gilt: &Sgr;(Aller Banden)/Einfang 1, worin ABS den Absolutwert der Anzahl darstellt. In dieser veranschaulichenden Darstellung sinkt das Leistungsvermögen der Nachweisbande mit dem Anstieg der DPD-Konzentration ab, wogegen größere Signalveränderungen für die Einfangbande festgestellt werden. Für jedweden Algorithmus ist es das Ziel, die Reflexionswerte in solch einer Weise zu gewichten, dass das Signal-zu-Rausch-Verhältnis in der Bereichsregion, welche am kritischsten für den Assay ist, maximiert wird. Dies kann durch Anwendung der FOM-Analyse bewerkstelligt werden, und Algor 1 ist entworfen, um die Differenzen der zwei Einfangbanden bei niedrigen Analyt-Konzentrationen höher zu gewichten, wo diese Differenz mit jener Gewichtung der Sammelbande über die Gesamtheit bei höheren Analyt-Konzentrationen am größten ist. Das andere Ziel von Algor 1 ist es, diese Gewichtung in einer Weise einzusetzen, die die Anpassung an eine allgemein gültige Vier-Parameter-Anpassung erlaubt, die in vielen Immunoassayverfahren zur Anwendung gelangt.

Die zweite Stufe der Algorithmus-Entwicklung beruht darauf, eine Gleichung anzuwenden, die leicht angepasst werden kann und genaue Analyt-Konzentrationen für Zwischenwerte zu ergeben vermag. Während FOM eine gute Verfahrensweise zur Unterscheidung zwischen zwei diskreten Analyt-Spiegeln ist, liefert dieser keine Information über die Form der Kurve. Der beste Näherungsansatz ist oft einer, der den Chemismus des besonderen Assay nachahmt. Für Immunoassayverfahren ist dieser oft eine Vier-Parameter-Anpassungsgleichung. Der Test für jede angepasste Gleichung und den entsprechenden Algorithmus ist die Verwendung von Zufallsproben mit verschiedenen Analyt-Konzentrationen und die Fehlerberechnung (% CV) und Abweichung. Das Ziel ist es, den niedrigsten Prozent-CV bei Minimalabweichung über den erwarteten Bereich des Assay hinweg zu suchen. Ein Vergleich der DPD-Ergebnisse von 0 bis 250 nM/mM in Urin für 2 Typen von Analysen ist in den Tabellen 2 und 3 für die Drei-Banden-Immunostreifen angegeben und dargestellt, die in dieser veranschaulichenden Darstellung verwendet sind.

Tabelle 2

Algor1-Ergebnisse
Tabelle 3

Gesamt/P1-Ergebnisse

Aus den Daten der Tabellen 2 und 3 ist ermittelbar, dass für diese besondere Analyse der erste Algorithmus einen geringeren Fehler, gemäß Messung mit dem % CV, bei allen DPD-Werten aufweist. Dieses Beispiel verdeutlicht die etwas empirische Verfahrensweise zur Findung eines korrekten Algorithmus. Der gewählte Algorithmus wird einer sein, welcher den geringsten Fehler in seinem Zusammenhang für bzw. mit einer gegebenen Streifen-Formulierung und dem entsprechenden Format und einen gegebenen klinischen Bereich für den Analyt aufweist und ergibt.

Nach Erhalt des Wertes für den Ziel-Analyt setzt das Gerät den Reflexionswert bei einer oder mehreren Wellenlängen der Reagens-Unterlage für den zweiten Analyt zur Bestimmung der Konzentration dieses Analyt in der fluiden Testprobe ein. Im Fall, in welchem DPD der Ziel-Analyt und Kreatinin der zweite Analyt sind, sind die Präzision (oder die Verringerung von Signal zu Rauschen) kritisch für den Assay für beide Analyte. Ohne ein hohes Genauigkeitsniveau erzeugt der sich ergebende Fehler einen Test, dem eine nur geringe medizinische Bedeutung zukommt, da ein nur so niedriger wie ein zweifacher Anstieg beim DPD/Kreatinin-Verhältnis zwischen den normalen und Osteoporose-Zuständen auftritt. Der zweite Analyt wird aus denjenigen Materialien der Körperflüssigkeit ausgewählt, die klinisch in Bezug zum ersten Analyt stehen. Das am meisten feststellbare Beispiel eines zweiten Analyt ist Kreatinin, d. h. der End-Metabolit, wenn Kreatin zu Kreatinphosphat wird, das als Energiequelle zur Muskelkontraktion verwendet wird. Das produzierte Kreatinin wird durch die Nieren-Glomeruli gefiltert und dann im Urin ohne Reabsorption ausgeschieden. Zur Steigerung der Empfindlichkeit urinärer Assayverfahren und zur Minimierung des Problems hoher Urin-Durchflussraten, die zu einer Verdünnung des Urins führen, werden Analyt/Kreatinin-Verhältnisse in Urinprotein-Assayverfahren eingesetzt, um die Urin-Konzentration zu normalisieren. Allgemeine Kreatinin-Assayverfahren schließen die alkalischen Jaffe- und Benedict-Behre-Verfahren ein, die bei einem hohen pH-Wert, in typischer Weise im Bereich von 11,5 bis 12,5, durchgeführt werden. In jüngerer Zeit ist ein Kreatinin-Assay entwickelt worden, in welchem die Urinprobe in Kontakt mit Kupferionen in der Gegenwart von Zitrat, einem Hydroperoxid und einem oxidierbaren Farbstoff gebracht werden, der eine gefärbte Reaktion in der Gegenwart Sauerstofffreier Radikale und eines Pseudoperoxids ergibt. Dieses Verfahren ist vollständiger in US 5 374 561 beschrieben. Eine Kreatinin-Quantifizierung kann auch immunologisch bewerkstelligt werden, wie beschrieben in WO 96/34271. Diese Zweit-Analyte, deren Konzentration in der Körperflüssigkeitsprobe klinisch in Bezug zur Konzentration des Ziel-Analyt steht, sind weder auf Kreatinin in Urin eingeschränkt, noch ist Urin die einzige Körperflüssigkeit, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit einem Assayverfahren analysiert werden kann. So kann die getestete Körperflüssigkeit beispielsweise Vollblut, der erste (Ziel-)Analyt kann HbA1c und der zweite Analyt kann Gesamt-Hämoglobin sein, da die auftretende HbA1c-Konzentration auf die Gesamt-Hämoglobin-Konzentration des Vollbluts eingestellt werden kann, um Abweichungen im HbA1c-Assay auszugleichen. Inulin, das intravenös verabreicht wird, ist, wie Kreatinin, ein Indikator des Nierenflusses. In Serologie-basierten Assayverfahren kann der erste Analyt gesamtes Prostata-spezifisches Antigen und der zweite Analyt kann freies Prostata-spezifisches Antigen sein. Ein weiteres Paar von Analyten, deren Konzentrationen klinisch in Bezug zueinander stehen, sind Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST), die in menschlichen Geweben breit verteilt sind. Sowohl AST als auch ALT sind im Normalfall im Plasma, der Galle und dem Speichel des Menschen vorhanden. Bei viraler Hepatitis und weiteren Formen von Leberkrankheiten sind die Spiegel von AST und ALT erhöht, sogar bevor klinische Anzeigen für die Krankheit, wie Gelbsucht, auftreten. Bei toxischer oder viraler Hepatitis ist ALT in charakteristischer Weise so hoch wie oder höher als AST, und das ALT/AST-Verhältnis, das im Normalfall < 1 ist, nähert sich der Einheit oder wird größer als diese. Ferner steigen die AST-Konzentrationen nach einem Herzinfarkt an, um dadurch das Verhältnis dieser beiden Enzyme und deren Aktivität zu verändern. Somit sind klinisch signifikante Ergebnisse durch Bestimmung des Verhältnisses aus diesen beiden Analyten in Serum erhältlich.

Viele klinisch signifikanten Ziel-Analyte sind in Urin vorhanden und mit der vorliegenden Erfindung bestimmbar. Unter diesen Analyten finden sich Deoxypyridinolin (DPD), menschliches Serumalbumin, Missbrauchsdrogen, wie Amphetamine/Barbiturate/Kokain, klinisch wichtige Protein-Marker wie Prostata-spezifisches Antigen, Nierenkrankheit-Proteine wie Lactat-Dehydrogenase, N-Acetyl-&bgr;-D-glucosaminidase, mit Schwangerschaft oder Fruchtbarkeit zusammenhängende Hormone, wie menschliches chorionisches Gonadotropin, Follikel-stimulierendes Hormon und lutenisierendes Hormon, Marker von Harntraktinfektionen, wie Tamm-Horsfall-Protein oder Lipopolysaccharid, &bgr;-2-Mikroglobulin, Amylase und chlamydiales LPS. Die Bestimmung des IgA/IgG-Verhältnisses zur Bewertung einer Infektion kann mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. Die Korrektur von deren Absolutkonzentrationen für Variationen im Nierenfluss durch Verhältnisbildung dieser Konzentrationen zu beobachteten Kreatinin-Konzentrationen steigert die Präzision und Genauigkeit der Messungen.

Während die Mittel zum Nachweis des Signals aus dem entwickelten Streifen von der am markierten Bindungspartner befestigten nachweisbaren Markierung abhängen, ist die Anwendung eines Reflexionsmessgerätes typisch, wenn die nachweisbare physikalische Eigenschaft der Markierung die Reflexion von Licht bei einer vorbestimmten Wellenlänge im sichtbaren oder IR-Bereich des Spektrums ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird ein Reflexionsmessgerät mit Mitteln zur Bewegung des Streifens oder des Detektorelements des Messgeräts relativ zueinander wie durch den Einsatz eines Specimen-Tisches für den Streifen bereitgestellt, welcher seitlich unter dem Lesekopf des Detektors bewegt werden kann. Diese technische Verfahrensweise trägt dazu bei, eine genaue Quantifizierung für Bereichsregionen des Streifens zu ergeben, die gegebenenfalls nicht präzise genug bezüglich der Nachweismittel des Reflexionsmessgeräts angeordnet worden sein könnten. In noch spezifischerer Weise kann die Anordnung des Streifens relativ zum Detektor unter Mikroprozessorsteuerung erfolgen, so dass die Reflexionswerte aus den zweiten, dritten oder vierten Bereichsregionen des Streifens und individuelle Banden innerhalb dieser Bereichsregionen individuell bestimmt werden können.

Das Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird nun noch vollständiger durch die folgenden Beispiele verdeutlicht und veranschlaulicht:

Beispiel 1

Ein Teststreifen zur Bestimmung von Kreatinin und Deoxypyridinolin (DPD), enthaltend 6 unterschiedene Flächen, die zusammen auf einer Stützunterlage aus Polystyrol von 101,6 mm (4 inches) Länge und 5,0 mm (0,2 inch) Breite angeordnet sind, ist in 1 dargestellt. Bezüglich 1, ist die Fläche 1 die Kreatinin-Unterlage (der 4. Bereich, enthaltend Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals der Intensität, die dem Spiegel des Zweit-Analyt entspricht, dessen Konzentration klinisch in Bezug zu derjenigen des Erst-Analyt steht, dessen Konzentration bestimmt wird) mit einer Größe von 5 mm × 5 mm (0,2 × 0,2 inch). Die Kreatinin-Unterlage wurde wie folgt hergestellt, um sie zur kolorimetrischen Bestimmung von Kreatinin geeignet zu machen: Whatman 3 mm-Filterpapier wurde zuerst durch Eintauchen auf eine Tiefe von 5 mm (0,2 inch) in eine Lösung behandelt, enthaltend 30 mM Kupfersulfat, 50 mM Zitrat, 750 mM Glyceryl-2-phosphat, 0,2% Hexansulfonsäure, 50 mM Phytinsäure und 0,2% Natriumdodecylsulfonat (SDS) bei pH = 6,94. Nach Trocknung des Streifens wurde der Streifen in eine Lösung getaucht, enthaltend 33 mM 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 73 mM Diisopropylbenzoldihydroperoxid, 63 mM Triisopropanolaminborat, 0,5% Plasonde und 0,032% Ethyl-Orange. Die erzeugte Intensität der gefärbten Reaktion ist, wenn der Streifen in Kontakt mit einem wässrigen Medium gebracht wird, das Kreatinin enthält, proportional zur Kreatinin-Konzentration. Die Fläche 2 ist die Puffer-Unterlage, hergestellt durch Imprägnieren von Whatman-F07507-Glasfaser mit 0,5 bis 1 M Glycin und 175 bis 350 mM Harnstoff, mit einer Größe von 5 mm × 12,7 mm (0,2 × 0,5 inch). Die Puffer-Unterlage dient dem Zweck, den pH-Wert der Urinprobe auf den gewünschten Wert zu puffern. Beispielsweise kann der pH-Wert von Urin im Bereich von 4,5 bis 8 liegen, und es kann eine Puffer-Unterlage eingesetzt werden, um die Proben bei pH > 7 zu halten, um die Antigen/Antikörper-Bindungsreaktion zu begünstigen. Es gibt eine Lücke von 2,5 mm (0,1 inch) zwischen der Kreatinin-Unterlage 1 und der Puffer-Unterlage 2 zum Zweck, das Kreatinin-Reagens isoliert vom Puffer-Unterlagen-Reagens zu halten. Die Fläche 3 ist eine Gold-Sol-DPD-Antikörper-Unterlage (der erste Bereich, enthaltend einen markierten Bindungspartner, der für den Analyt spezifisch ist). Die Flächen 4 und 5 sind die Immunochromatografie-Entwicklungsflächen, wo die Einfang- und Nachweisreagenzien auf einem Stück aus Nitrocellulose mit einer Größe von 5 mm × 31,75 mm (0,2 × 1,25 inch) abgeschieden werden. Die Fläche 4 enthält drei Einfangbanden (den zweiten Bereich, enthaltend immobilisierten Analyt) mit DPD, immobilisiert an Carboxyl-terminiertes Polyethylenglykol, mit einer Bandenbreite von ca. 1,5 mm (0,059 inch) pro Bande und einem Zwischenraum von 5 mm (0,2 inch) zwischen den Banden (von Zentrum zu Zentrum). Bei 5 mm (0,2 inch) vom Zentrum der dritten Einfangbande befindet sich die Fläche 5, bestehend aus 1 anti-IgG-Sammelbande (dem dritten Bereich zur Immobilisierung des Komplexes aus dem Analyt/markierten Bindungspartner) mit einer Bandenbreite von ca. 1,5 mm (0,059 inch). Bei 5 mm (0,2 inch) oberhalb der Sammelbande befindet sich die absorbierende Unterlage 6, die dazu dient, die Flüssigkeit zu absorbieren, die aus der Nitrocellulose-Fläche des Streifens wandert, und welche eine Größe von 5 mm × 12,7 mm (0,2 inch × 0,5 inch) aufweist.

Zur Durchführung des Assay wurde der Streifen in die Test-Lösung, d. h. eine Urinprobe, enthaltend den DPD-Analyt, der bestimmt wird, 3 s lang so tief eingetaucht, dass nur die Kreatinin-Zone und die Puffer-Unterlage unter die Oberfläche der Test-Lösung gelangten, was es ermöglichte, dass die Test-Lösung nach oben im Streifen durch Kapillarwirkung durch die Einfangbanden des Einfangbereichs, die Einzelbande des Nachweisbereichs und zur absorbierenden Unterlage floss. Am Ende des 3 s langen Eintauchvorgangs wurde der Streifen auf den Ablese-Tisch eines CLINITEK® 50-Reflexionsspektrometers gelegt, und es wurde der Startknopf des Gerätes gedrückt. Der Kreatinin-Unterlage-Reflexionswert wurde bei 3 min aufgenommen, und der Reflexionswert des Immuno-DPD-Streifens (aller vier Banden) wurde bei 3 min gemessen und aufgenommen. Die Reflexionssignale für den DPD-Assay wurden mit IR- und Grün-Filtern gemessen, wogegen die Reflexion für den Kreatinin-Assay mit Rot- und Grün-Filtern gemessen wurde. Das Gerät ergibt eine Reaktion in Decode-Werten, die durch die Gleichungen 1 bis 5 abgeleitet werden:

Gleichung 1
worin [R]grün der mit dem Grün-Filter gemessene Reflexionswert und [R]rot der mit dem Rot-Filter gemessene Reflexionswert sind.

Für den DPD-Assay wurden die Banden-Reaktionssignale, wie dies in Tabelle 4 angegeben ist, bezeichnet:

Tabelle 4

Banden-Signalbezeichnung für DPD-Assay

Der Reflexionswert mit dem Grün-Filter wird ins Verhältnis zum Reflexionswert mit dem IR-Filter gesetzt, um den Fehler aus den Schwankungen zwischen den Streifen, wie den Höhen- und Oberflächenschwankungen, zu verringern. Der Reflexionswert an der IR-Wellenlänge bleibt ziemlich konstant, und zwar unabhängig von der Gold-Sol-Intensitätsbande. Der korrigierte Reflexionswert [Rn] wird gemäß Gleichung 2 berechnet:

Gleichung 2
worin n die Bandenzahl 1, 2, 3 oder 4, [Rn]grün der Reflexionswert der Bande n mit dem Grün-Filter und [Rn]IR der Reflexionswert der Bande n mit dem IR-Filter sind. Die Zahl 65 wird dem korrigierten Reflexionswert zugeordnet, da die %-Reflexion mit dem IR-Filter ca. 65% beträgt.

Der IR-korrigierte Reflexionswert [Rn] wird dann auf K/S gemäß Gleichung 3 umgerechnet, um das Bandenreaktionssignal für jede Bande zu ergeben:

Gleichung 3
worin das Bandensignal Pn der K/S-Transformationsreflexionswert [Rn] ist.

Der Reaktion-Decode jeder Bande wird schließlich gemäß Gleichung 4 berechnet:

Gleichung 4
worin T die Summierung des Bandessignals für alle Banden (Gleichung 5) ist:

Gleichung 5
  • T = &Sgr;n = 1 bis NPn, worin N die Gesamtzahl der Einfangbanden, welche im vorliegenden Beispiel 4 beträgt, Pn das Bandensignal n und n 1, 2, 3 oder 4 sind.

Standardkurven für DPD und Kreatinin wurden mit Eichmitteln, enthaltend 6 Niveaus von Analyt-Konzentrationen, erstellt. Beispiele von Standardkurven sind in 2 für den DPD-Assay und in 3 für den Kreatinin-Assay dargestellt. Die DPD- und Kreatinin-Konzentrationen für die Urin-Testprobe wurden aus den DPD- bzw. den Kreatinin-Standardkurven berechnet. Das DPD-Kreatinin-Verhältnis in nM/mM wurde dann für Urinprobe A gemäß der folgenden Berechnung ermittelt:

DPD-Konzentration, berechnet aus der DPD-Standardkurve = 123 nM,

Kreatinin-Konzentration, berechnet aus der Kreatinin-Standardkurve = 10,2 mM, und

das DPD/Kreatinin-Verhältnis = 123 nM/10,2 mM = 12,1 nM/mM.

Der Abschnitt-Wert zur Bestimmung eines Zustandes hoher Knochenresorption wird durch ein DPD/Kreatinin-Verhältnis von 7,4 nM/mM dargestellt. Weniger als 7,4 ist normal, und größer als 7,4 liegt bei einem Zustand hoher Knochenresorption vor. Daher zeigt in diesem Beispiel das Ergebnis einen Zustand hoher Knochenresorption an. Eine zweite Urinprobe wurde in ähnlicher Weise analysiert und ergab das folgende Ergebnis:

DPD-Konzentration = 123 nM,

Kreatinin-Konzentration = 20,5 mM, und

DPD/Kreatinin-Verhältnis = 6,0 nM/mM.

Obwohl die DPD-Konzentration dieselbe ist, zeigt das Verhältnis von DPD zu Kreatinin einen Zustand niedriger Knochenresorption an.

Fünf Durchgänge wurden unter Anwendung der obigen Verfahrensweise mit Urinproben durchgeführt, die variierende Mengen von DPD und Kreatinin enthielten. Die erwarteten und beobachteten Verhältnisse sowie die Standardabweichungen, die %-Koeffizientvarianz und die Positiv/Negativ-Abweichungen sind in Tabelle 5 aufgeführt. Aus Tabelle 5 ist ermittelbar, dass eine Präzision von weniger als 12% CV bei den 3 Spiegeln 4,52, 7,54 und 12,07 nM/mM von DPD zu Kreatinin erhalten wurde:

Tabelle 5

DPD/Kreatinin-Assay-Leistungsvermögen
% CV-Durchschnitt
11,9%

Während die mit Gold-Sol markierten Antikörper visuell in den Einfang- und Sammelzonen des Streifens beobachtbar sind, sind klinisch bedeutungsvolle Ergebnisse nur durch die Anwendung eines Reflexionsmessgeräts erhältlich. Dies ist wegen der Anwendung von Mehrfachbanden über die gesamte Länge des Streifens hinweg der Fall. Außerdem machen die Bandensignale Reflexionsmessungen bei unterschiedlichen Wellenlängen (IR, grün und rot) mit einem Gerät erforderlich, das die Befähigung aufweist, die Reflexion bei diesen Wellenlängen zu messen und aufzunehmen. Die Reflexionsmessungen werden, bezogen auf einen vorbestimmten Algorithmus, unter Anwendung der Software des Geräts ins Verhältnis zu einander gesetzt. Ferner werden die Analyt-Konzentrationen mit Standardkurven ermittelt, die im Gerät gespeichert sind, und das DPD/Kreatinin-Verhältnis wird mit der im Gerät aufgestellten Software berechnet.

Im obigen Beispiel wurde das endgültige Reaktionssignal (Decode) für den DPD-Assay mit den Algorithmus-Decode = [T/Pn] ermittelt, worin T die Summierung des Signals aus allen 4 Banden und Pn das Bandensignal von Bande 1 sind. Die Anwendung dieses Algorithmus steigert die Genauigkeit des Assay, weil die Verhältnisbildung des Bandensignals den systematischen Fehler, wie den Fehler, der durch die Schwankungen von Gerät zu Gerät eingeführt wird, minimiert. Weitere Algorithmen können angewandt werden, um das endgültige Reaktionssignal zu ermitteln und zu bestimmen. Das Reaktionssignal in diesem Beispiel wurde wie folgt bestimmt: Reaktionssignal = [T/Einfangbande 1]

oder [T/P1],
worin alle Bandensignale K/S-Transformationsreflexionswerte und T die Summierung der Einfang- und Nachweisbande sind.

Die Vorteile der Anwendung einer Banden-Verhältnisbildung werden durch die Daten der Tabellen 6 und 7 belegt, aus denen ermittelbar ist, dass die Präzision, mit welcher der Streifen die DPD-Konzentration zu bestimmen vermag, viel größer als diejenige ist, die erhältlich ist, wenn nur das Signal aus der Einfangzone angewandt wird.

Tabelle 6

Reaktionssignal = Banden-Verhältnisbildungsalgorithmus [T/P1]
Tabelle 7

Reaktionssignal = Einfangzone [P1] (keine Banden-Verhältnisbildung)

Alternativ dazu, kann das endgültige Reaktionssignal wie folgt berechnet werden: Reaktionssignal = [Nachweisbande/Einfangbande], worin alle Bandensignale K/S-Transformationsreflexionswerte sind. Alternativ dazu, kann, wenn der Streifen mehrfache Einfang- und Nachweisbanden enthält, das endgültige Reaktionssignal wie folgt berechnet werden: [Einfangbande 1/Nachweisbande 1], worin alle Signale K/S-Transformationsreflexionswerte sind. Ein weiteres Verfahren zur Berechnung des Reaktionssignals beinhaltet die Anwendung des Algorithmus: Reaktionssignal =

[WEinf × Einfangbande 1/WNachw × Nachweisbande],
worin alle Bandensignale Reflexionswerte und die WEinf und WNachw Gewichtungsfunktionen sind, die die Einfang- und Nachweisbanden unterschiedlich gewichten. Somit kann eine große Anzahl von Algorithmen angewandt werden, um das endgültige Reaktionssignal zu ermitteln und zu bestimmen.

Die Berechnung des Reaktionssignals durch Verhältnisbildung der Signale aus dem im zweiten (Einfang-)Bereich des Streifens immobilisierten markierten Bindungspartner und dem im dritten (Nachweis-)Bereich immobilisierten markierten Bindungspartner ist kritisch gegenüber der Präzisionssteigerung des Assay durch Verringerung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses. Diese erhöhte Präzision ist notwendig für den Test, um klinische Signifikanz aufzuweisen, da lediglich ein Anstieg um das 2-Fache beim DPD/Kreatinin-Verhältnis zwischen den normalen und eine Krankheit anzeigenden Osteoporose-Zuständen auftritt.

Ein weiterer Beleg für die Verbesserungen bei den analytischen Ergebnissen, die mit der vorliegenden Erfindung erzielt werden, ist in den Tabellen 8 bis 10 angegeben. Diese Tabellen wurden unter Anwendung der gleichen festgelegten Daten erstellt, es werden aber 3 unterschiedliche Algorithmen ([T/P1] mit Banden-Verhältnisbildung, mit %-Reflexion der ersten Einfangbande mit keiner IR-Korrektur und keiner Banden-Verhältnisbildung und mit %-Reflexion der ersten Einfangbande mit keiner Banden-Verhältnisbildung, aber mit IR-Korrektur) vergleichen:

Tabelle 8

Leistungsvermögen mit [T/P1]-Banden-Verhältnisbildungsalgorithmus

Anmerkung: Der erste Spiegel wurde in der Berechnung des Mittelwertes ausgeschlossen.

Tabelle 9

Leistungsvermögen mit % R der Einfangbande 1 bei keiner Banden-Verhältnisbildung und keiner IR-Korrektur

Anmerkung: Der erste Spiegel wurde in der Berechnung des Mittelwertes ausgeschlossen.

Tabelle 10

Leistungsvermögen mit % R der Einfangbande mit keiner Banden-Verhältnisbildung, aber mit IR-Korrektur

Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyt in einer Probe einer Körperflüssigkeit, welches die Stufen umfasst, aus:

    a) Bereitstellung einer Testmatrix, durch welche die fluide Probe durch Kapillarwirkung zu fließen vermag, wobei der genannte Streifen einen ersten Bereich, der einen mobilen spezifischen Bindungspartner für den Analyt enthält, wobei der Bindungspartner eine nachweisbare Markierung aufweist und mit dem Analyt zur Bildung eines Komplexes aus dem Analyt/markierten Bindungspartner zu reagieren vermag, und wobei der Streifen mindestens einen zweiten Bereich, der immobilisierten Analyt oder einen immobilisierten Bindungspartner enthält, welcher für ein Epitop des Analyt spezifisch ist, das sich von demjenigen unterscheidet, zu welchem der markierte Bindungspartner spezifisch ist, und wobei der Streifen mindestens einen dritten Bereich, der Mittel zum Einfangen des Komplexes aus dem Analyt/markierten spezifischen Bindungspartner enthält, welcher nicht im zweiten Bereich gebunden wird, und einen vierten Bereich aufweist, der Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals enthält, dessen Intensität dem Spiegel eines zweiten Analyt entspricht, dessen Konzentration in klinischem Bezug zu derjenigen des Analyt steht, dessen Konzentration in der Körperflüssigkeit bestimmt wird;

    b) Entwicklung der Matrix, wobei die Probe der Körperflüssigkeit, die den vermuteten ersten Analyt und den zweiten Analyt dafür enthält, aufgebracht wird, um dadurch die Probe in Kontakt mit dem markierten spezifischen Bindungspartner so gelangen zu lassen, dass der in der fluiden Probe vorhandene Analyt an den markierten spezifischen Bindungspartner gebunden wird, um einen Komplex zu bilden, während überschüssiger, unreagierter markierter Bindungspartner frei zur Weiterreaktion zurückbleibt, wobei die fluide Probe den Komplex aus dem Analyt/markierten Partner und den unreagierten markierten Bindungspartner entlang der Matrix durch Kapillarwirkung zum zweiten Bereich trägt, der den immobilisierten Analyt enthält, in welchem Bereich der unreagierte markierte Bindungspartner an den immobilisierten Analyt in umgekehrter Beziehung zur Konzentration des ersten Analyt in der fluiden Testprobe oder an den immobilisierten spezifischen Bindungspartner in direkter Beziehung zur Analyt-Konzentration in der fluiden Testprobe gebunden wird, und wobei der markierte spezifische Bindungspartner, der nicht an den zweiten Bereich gebunden wird, durch Kapillarwirkung zum dritten Bereich getragen wird, wo er durch die Immobilisierungsmittel immobilisiert wird;

    c) Ablesung der zweiten Zone der entwickelten Matrix an einem Gerät, das einen Detektor mit der Befähigung zur Messung des Signals aus der nachweisbaren Markierung zur Bestimmung der Konzentration des markierten Bindungspartners in der zweiten Zone aufweist, und Ablesung der dritten Zone des entwickelten Streifens in ähnlicher Weise zur Bestimmung des Signals aus dem markierten Bindungspartner in der dritten Zone der Matrix;

    d) Bestimmung des endgültigen Reaktionssignals durch auf einen vorbestimmten Algorithmus bezogene Bildung des Verhältnisses aus den Signalen aus dem im zweiten Bereich eingefangenen markierten Bindungspartner und aus dem im dritten Bereich immobilisierten markierten Bindungspartner;

    e) Bestimmung der Konzentration des Erst-Analyt in der fluiden Probe durch Vergleich des in Stufe d) bestimmten endgültigen Reaktionssignals mit endgültigen Reaktionssignalen, die in ähnlicher Weise für fluide Proben bestimmt werden, die bekannte Konzentrationen des Erst-Analyt enthalten; und

    f) Korrektur der Konzentration des in Stufe e) bestimmten Erst-Analyt durch Bestimmung der Konzentration des Zweit-Analyt in der fluiden Testprobe durch Messung der Intensität des Signals im vierten Bereich des Streifens und dann durch Bestimmung des Verhältnisses des Zweit-Analyt zum Erst-Analyt, dessen quantitative Konzentration gesucht wird.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Körperflüssigkeit Urin, Vollblut, Plasma, Serum, Schweiß oder Speichel ist.
  3. Verfahren gemäß. Anspruch 2, worin die Körperflüssigkeit Vollblut, der Erst-Analyt HbA1c und der Zweit-Analyt Gesamt-Hämoglobin sind.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Körperflüssigkeit Serum und der Erst-Analyt Transferrin sind und der Zweit-Analyt ein Eisen-Bindungsvermögen überträgt.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Körperflüssigkeit Urin, der Erst-Analyt eine in Urin enthaltene Substanz und der Zweit-Analyt ein Material ist, deren Konzentration ein Maß für die Klärungstätigkeit der Niere ist.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin der Zweit-Analyt Kreatinin oder Inulin ist.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, worin der Erst-Analyt Deoxypyridinolin, menschliches Serumalbumin, Amphetamine, Barbiturate, Kokain, Prostata-spezifisches Antigen, Lactat-Dehydrogenase, N-Acetyl-&bgr;-D-glucosaminidase, menschliches chorionisches Gonadotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, lutenisierendes Hormon, Tamm-Horsfall-Protein, Lipopolysaccharid, &bgr;-2-Mikroglobulin, Amylase und chlamydiales LPS ist.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Körperflüssigkeit Vollblut oder Serum, der Erst-Analyt gesamtes Prostata-spezifisches Antigen und der Zweit-Analyt freies Prostata-spezifisches Antigen sind.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Erst-Analyt Alanin-Aminotransferase und der Zweit-Analyt Aspartat-Aminotransferase sind.
  10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Matrix in der Form eines Streifens vorliegt, durch welche die fluide Probe horizontal fließt.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der zweite Bereich der Testmatrix in 3 diskrete Banden aufgeteilt und der dritte Bereich eine Einzelbande sind und das endgültige Reaktionssignal durch Lösen der Gleichung bestimmt wird: Reaktionssignal = [T/P1], worin T die Summierung des Signals aus allen 4 Banden und P1 die erste Bande des zweiten Bereichs sind.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die zweiten und dritten Bereiche der Testmatrix in mehrfache Einfang- und Nachweisbanden jeweils aufgeteilt sind und das endgültige Reaktionssignal durch Lösen der Gleichung bestimmt wird: Reaktionssignal = Einfangbande 1/Nachweisbande 1, worin die Einfangbande 1 das Signal aus der ersten Bande des zweiten Bereichs und die Nachweisbande 1 das Signal aus der ersten Bande des dritten Bereichs sind.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, worin der Streifen mit einem Reflexionsmessgerät abgelesen wird, das mit einer Software ausgerüstet ist, die mit dem entsprechend geeigneten Algorithmus zur Bestimmung des endgültigen Reaktionssignals aus Reflexionssignalen, die aus den zweiten und dritten Bereichen aufgenommen werden, und zur Bestimmung der Konzentration des Zweit-Analyt aus dem Reflexionssignal, das aus dem vierten Bereich empfangen wird, und zur Bestimmung des Verhältnisses der Konzentration des Zweit-Analyt in der Körperflüssigkeitsprobe zur Konzentration des Erst-Analyt vor-programmiert wird, um die korrigierte Konzentration des Erst-Analyt zu bestimmen.
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