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Dokumentenidentifikation DE69732879T2 06.04.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000816490
Titel Mutierte Prenyldiphosphatsynthase
Anmelder Toyota Jidosha K.K., Toyota, Aichi, JP
Erfinder Narita, Keishi, Sendai-shi, Miyagi, JP;
Ishida, Chika, Toyota-shi, Aichi, JP;
Takeuchi, Yoshie, Toyota-shi, Aichi, JP;
Ohto, Chikara, Toyota-shi, Aichi, JP;
Ohnuma, Shinichi, Sendai-shi, Miyagi, JP;
Nishino, Tokuzo, Sendai-shi, Miyagi, JP
Vertreter TBK-Patent, 80336 München
DE-Aktenzeichen 69732879
Vertragsstaaten BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.07.1997
EP-Aktenzeichen 971110226
EP-Offenlegungsdatum 07.01.1998
EP date of grant 30.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.04.2006
IPC-Hauptklasse C12N 9/10(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein wie in Anspruch 1 definiertes Verfahren, um neuartige, mutierte Enzyme herzustellen, welche lineare Prenyldiphosphate synthetisieren, die Vorläufer von Verbindungen sind, die wichtig für Lebewesen sind, wie etwa Steroide, Ubichinone, Dolichole, Carotenoide, prenylierte Proteine, tierische Hormone, pflanzliche Hormone und ähnliche, oder ein Gen davon usw.

2. Verwandter Stand der Technik

Von den Substanzen mit wichtigen Funktionen im Körper werden viele Substanzen unter Verwendung von Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) als Baustein biologisch synthetisiert. Diese Verbindungen werden Isoprenoide, Terpenoide oder Terpene genannt, und werden in Abhängigkeit von der Anzahl der Kohlenstoffatome in Hemiterpene (C5), Monoterpene (C10), Sesquiterpene (C15), Diterpene (C20), Sesterterpene (C25), Triterpene (C30), Tetraterpene (40) usw. klassifiziert. Die tatsächliche Synthese beginnt mit dem Mevalonatweg über den Mevalonsäure-5-diphosphat synthetisiert wird, gefolgt durch die Synthese von Isopentenyldiphosphat (IPP), welches eine aktive Isopreneinheit ist.

Die Identität der Isopreneinheit, die als ein mutmaßlicher Vorläufer vorgeschlagen wurde, wurde als IPP bestätigt, die sogenannte aktive Isopreneinheit. Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), ein Isomer von IPP, welches als ein Substrat bei der Reaktion von Isopentenyladenin verwendet wird, welches als ein Cytokinin bekannt und eines der Pflanzenhormone ist, ist ebenfalls dafür bekannt, eine Kondensationsreaktion mit IPP zu durchlaufen, um lineare aktive Isoprenoide, wie etwa Geranyldiphosphat (GP), Neryldiphosphat, Farnesyldiphosphat (FPP), Geranylgeranyldiphosphat (GGPP), Geranylfarnesyldiphosphat (GFPP), Hexaprenyldiphosphat (HexPP), Heptaprenyldiphosphat (HepPP) und ähnliche zu synthetisieren.

Es gibt Kondensationsreaktionen vom Z-Typ und vom E-Typ. GPP ist ein Produkt der E-Typ-Kondensation und Neryldiphosphat ist ein Produkt der Z-Typ-Kondensation. Obwohl der all-E-Typ als die aktive Form bei FPP und GGPP angesehen wird, führen die Kondensationsreaktionen vom Z-Typ zu der Synthese von verschiedenen Polyprenolen, die in Naturkautschuk, Dolicholen, Baktoprenolen (Undecaprenolen) und Pflanzen gefunden werden. Von ihnen wird angenommen, dass sie die Kondensationsreaktion unter Verwendung der Phosphatesterbindungsenergie des Pyrophosphats und/oder des in dem Molekül vorhandenen Kohlenstoffgerüsts durchlaufen, um Pyrophosphat und/oder Phosphat als die Nebenprodukte der Reaktion zu erzeugen.

FPP oder GGPP dient als ein Reaktionssubstrat, das zu der Synthese von prenylierten Proteinen führt (aus FPP oder GGPP), repräsentiert durch G-Proteine, die wichtig beim Mechanismus der Signaltransduktion in der Zelle sind; Zellmembranlipide (aus GGPP) von Archaebakterien; Squalen (aus FPP), welches ein Vorläufer von Steroiden ist; und Phytoen (aus GGPP), welches ein Vorläufer von Carotenoid ist. Prenyldiphosphate aus HexPP und HepPP mit sechs bzw. sieben Isopreneinheiten bis zu Prenyldiphosphaten mit zehn Isopreneinheiten dienen als der Vorläufer für die Synthese von Ubichinon und Menachinon (Vitamin K2), die in dem Elektronentransportsystem wirken.

Ferner wurden über die Biosynthese dieser Isoprenoide in der Aktivform die folgenden pflanzlichen Verbindungen, die lebenswichtig sind, synthetisiert. Um nur einige zu nennen, gibt es dort Pflanzenhormone von Cytokininen und Isopentenyladenosin-modifizierte tRNS, die Hemiterpene als ihre Vorläufer für die Synthese nutzen, Monoterpengeraniol und seine Nerolisomere, die die Hauptbestandteile des Rosenölduftstoffs sind, und der Kampferextrakt des Kampferbaumes, welcher ein Insektizid ist. Sesquiterpene enthalten Juvenilhormone von Insekten, Diterpene enthalten das Pflanzenhormon Gibberellin, Spurenpheromone von Insekten, und Retinole und Retinale, die als Vorläufer für visuelle Pigmente dienen, Bindungsbestandteile der Purpurmembranproteine von halophilen Archaebakterien, und Vitamin A.

Ferner wurde unter Verwendung von Squalen, einem Triterpen, eine Vielzahl von Steoridverbindungen synthetisiert, einschließlich z.B. tierische Sexualhormone, Vitamin D, Ecdyson, welches ein Paarungshormon der Insekten ist, ein Pflanzenhormon, Brassinolid, und Bestandteile der Plasmamembranen. Verschiedene Carotenoide aus Tetraterpenen, die Vorläufer für verschiedene Pigmente von Organismen und Vitamin A sind, sind ebenfalls wichtige Verbindungen, die aus aktiven Isoprenoiden abgeleitet werden. Verbindungen, wie etwa Chlorophyll, Pheophytin, Tocopherol (Vitamin E) und Phyllochinon (Vitamin K1) werden ebenfalls von Tetraterpenen abgeleitet.

Die aktiven Isoprenoidsynthasen, die nacheinander IPP mit derartigen allylischen Substraten DMAPP, GPP, FPP, GGPP, GFPP und ähnlichen kondensieren, werden Prenyldiphosphatsynthasen genannt, und werden ebenfalls auf der Grundlage der maximalen Kettenlänge des Hauptreaktionsprodukts benannt, z.B. Farnesyldiphosphatsynthase (FPP-Synthase), Geranygeranyldiphosphatsynthase (GGPP-Synthase) usw. Es gibt Berichte über die Reinigung, die Aktivitätsmessung, die Genklonierung und die Nucleotidsequenzierung von Enzymen, wie etwa Farnesyldiphosphatsynthase, Geranylgeranyldiphosphatsynthase, Hexaprenyldiphosphatsynthase, Heptaprenyldiphosphatsynthase, Octaprenyldiphosphatsynthase, Nonaprenyldiphosphatsynthase (Solanesyldiphosphatsynthase), Undecaprenyldiphosphatsynthase, und ähnliche, aus Bakterien, Archaebakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren.

Diese aktiven Isoprenoidsynthasen, die die Grundlage für die Synthese einer großen Vielfalt von Verbindungen bilden, die sowohl in der Industrie als auch auf dem Gebiet der Biowissenschaften wichtig sind, haben aufgrund ihres instabilen Charakters und den geringen spezifischen Aktivitäten nur geringe Aufmerksamkeit hinsichtlich ihrer industriellen Anwendungen auf sich gezogen. Jedoch wurde durch die Isolation der Gene der FPP-Synthase und GGPP-Synthase von termophilen Bakterien und Archaebakterien (A. Chen und D. Poulter (1993) J. Biol. Chem. 268: 11002–11007, T. Koyama et al. (1993) J. Biochem. 113: 355–363, S.-I, Ohnuma et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 14792–14797), die Verfügbarkeit der Enzyme erhöht.

Die Enzyme, die Prenyldiphosphate mit 20 bis 25 Kohlenstoffen synthetisieren, sind Homodimere und reagieren relativ einfach in vitro, wie in vielen Berichten veröffentlicht. Jedoch wird angenommen, dass die Enzyme, die Prenyldiphosphate mit Kettenlängen synthetisieren, die die vorher erwähnten übersteigen, Heterodimere sind oder zusätzliche Faktoren, wie etwa ein Lipid oder ähnliches, benötigen. Daher war es notwendig, um ihre industrielle Anwendung zu verwirklichen, optimale Bedingungen zu finden, die die Wiedervereinigung von zwei Sorten von Untereinheiten ermöglichen, oder zusätzliche Faktoren zu finden, was ein schwierige Herausforderung war.

Daher gab es eine Notwendigkeit für eine Technologie, die es ermöglicht thermostabile Prenyldiphosphatsynthasen vom Homodimertyp durch künstliche Veränderung der Aminosäuresequenz der Prenyldiphosphatsynthasen vom Homodimertyp herzustellen, die Prenyldiphosphate mit einer längeren Kettenlänge synthetisieren, die stabil sind und eine hohe spezifische Aktivität haben und aus einem thermophilen Organismus stammen.

Für die aus thermophilen Organismen stammenden Prenyldiphosphatsynthasen gibt es zur Zeit Beispiele einer veränderten FPP-Synthase, die aus Bacillus stearothermophilus stammt, und einer GGPP-Synthase, die aus Sulfolobus acidocaldarius stammt. Das mutierte Enzym der FPP-Synthase aus Bacillus stearothermophilus und ihr Gen, wurden ausgewählt auf der Grundlage eines Farbumschwungs des Organismus durch Lycopen, erzeugt durch die Koexistenz von crtB (das Gen der Phytoensynthase) und crtI (das Gen der Phytoendesaturase, cis:trans-Isomerase), die aus Erwinia uredovora stammen, und dem Gen der FPP-Synthase des mutierten B. stearothermophilus in Escherichia coli. Die GGPP-Synthase und ihre Mutante und ihr Gen aus S. acidocaldarius wurden auf der Grundlage der Aktivität der Komplementierung der Glycerol-metabolischen Aktivität der HexPP-Synthase defizienten knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Das Koexistenzverfahren der CrtB und CrtI-Gene von E. uredovora kann nicht für das Screening der Reaktionsprodukte des mutierten Enzyms, die länger als GGPP sind, verwendet werden, und das Screening-Verfahren unter Verwendung der Komplementierungsaktivität der HexPP-Synthase defizienten knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae kann nicht für den spezifischen Nachweis der Reaktionsprodukte verwendet werden, die länger als HexPP sind. Diese genetischen Screening-Verfahren sind für die Klonierung der Gene der mutierten Prenyldiphosphatsynthasen mit den Syntheseaktivitäten von GGPP, GFPP und HexPP geeignet, aber können nicht systematisch die Kettenlänge der Reaktionsprodukte der Prenyldiphosphatsynthasen mit der Absicht der Verlängerung der Kettenlänge der Reaktionsprodukte kontrollieren. Eine Regel für diesen Zweck ist ebenfalls nicht bekannt.

Ohnuma, S.-I.; J. Biol. Chem., Vol. 217, Nr. 17 Seiten 10087–10095, (1996) ist eine Veröffentlichung, in der die Veränderung der katalytischen Aktivität der Farnesyldiphosphatsynthase aus B. stearothermophilus durch Substitution der Aminosäuren Leucin 34 zu Valin, Tyrosin 81 zu Histidin und Valin 157 zu Alanin beschrieben wird.

In EP-A-0 733 709 wird eine ungerichtete Mutagenese einer Farnesyldiphosphatsynthase beschrieben, wobei verschiedene Aminosäurereste beschrieben werden, deren Substitution zu einer Kettenverlängerung des Reaktionsprodukts führt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der Erfindung eine Regel für die systematische Kontrolle der Kettenlänge der Reaktionsprodukte durch Modifizierung der Aminosäurereste von Prenyldiphosphatenzymen zu etablieren. Ein neues Enzym, das stabiler ist oder eine höhere spezifische Aktivität hat und für industrielle Anwendungen geeigneter ist, würde es ermöglichen, unmittelbar ein mutiertes Enzym oder sein Gen zu erhalten, das Prenyldiphosphat mit einer längeren Kettenlänge durch Modifikation der Aminosäurereste auf der Grundlage der vorher erwähnten Regel synthetisiert.

Durch die Informationen über die Nucleotidsequenz des Gens der GGPP-Synthase des mutierten S. acidocaladarius, wurde klargestellt, dass von den zwei vorgeschlagenen Asp-reichen Domänen auf der Grundlage der Analyse der Aminosäuresequenz der Prenyldiphosphatsynthase, der Aminosäurerest lokalisiert an der fünften Position aufwärts von der Asp-reichen Domäne der konservierten Sequenz I (DDXX(XX)D) an der aminoterminalen Seite an der Kontrolle der Kettenlänge der Reaktionsprodukte beteiligt ist.

Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren nach Anspruch 1 zur Verfügung.

In der vorliegenden Erfindung können Prenyldiphosphate mit 20 Kohlenstoffen oder mehr erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das vorher erwähnte Enzym in Kontakt mit einem Substrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Isopentenyldiphosphat, Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat, Farnesyldiphosphat und Geranylgeranyldiphosphat gebracht wird.

KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN

Die 1 ist eine Grafik, die die enzymatische Aktivität der erhaltenen 19 mutierten Typen der BstFPSs (B. stearothermophilus FPP-Synthase) und einer BstFPS vom Wildtyp (Probenname Y) zeigt. „Primer: DMAPP" zeigt an, dass DMAPP als das allylische Substrat verwendet wurde, „Primer: GPP" zeigt an, dass GPP als das allylische Substrat verwendet wurde, und „Primer: FPP" zeigt an, dass FPP als das allylische Substrat verwendet wurde. In den A bis W bezeichneten Proben, wird der Name der Aminosäure nach Einfügen der Substitution an der Position 81 durch die Einbuchstabenbezeichnung angegeben.

Die 2 zeigt eine Fotographie eines Entwicklungsmusters der TLC des dephosphorylierten Produkts der Reaktion der mutierten BstFPS, wenn DMAPP als das allylische Substrat verwendet wurde. Y81A bis Y81Y stellen Aminosäuresubstitutionsmutationen dar.

Die 3 zeigt eine Fotographie eines Entwicklungsmusters der TLC des dephosphorylierten Produkts der Reaktion der mutierten BstFPS, wenn GPP als das allylische Substrat verwendet wurde. Y81A bis Y81Y stellen Aminosäuresubstitutionsmutationen dar.

Die 4 zeigt eine Fotographie eines Entwicklungsmusters der TLC des dephosphorylierten Produkts der Reaktion der mutierten BstFPS, wenn EPP als das allylische Substrat verwendet wurde. Y81A bis Y81Y stellen Aminosäuresubstitutionsmutationen dar.

Die 5 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen der enzymatischen Aktivität und der Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten zeigt, wenn DMAPP als das allylische Substrat verwendet wird.

Die 6 ist eine grafische Darstellung, die die Beziehung zwischen der enzymatischen Aktivität und den Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten zeigt, wenn GPP als das allylische Substrat verwendet wurde.

Die 7 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen der enzymatischen Aktivität und den Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten zeigt, wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde.

Die 8 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen der mittleren Kettenlänge der Reaktionsprodukte und den Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten zeigt, wenn DAMPP als das allylische Substrat verwendet wurde.

Die 9 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen der mittleren Kettenlänge der Reaktionsprodukteund dem Molekulargewicht der Aminosäureseitenketten zeigt, wenn GPP als das allylische Substrat verwendet wurde.

Die 10 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen der mittleren Kettenlänge der Reaktionsprodukteund den Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten zeigt, wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde.

Die 11 ist eine Grafik, die die Bereiche (I) bis (VII) von verschiedenen Prenyldiphosphatsynthasen und Asp-reichen Domänen und die Aminosäure (Sternchen) lokalisiert an der fünften Position in der N-terminalen Richtung von ihrem Ende zeigt. In der Figur stellt die Sequenz die Aminosäuresequenz der Farnesyldiphosphatsynthase dar, 1 ist eine aus Bacillus stearothermophilus stammende, 2 stammt aus Escherichia coli, 3 aus Saccharomyces cerevisiae, 4 aus einer Ratte und 5 aus einem Menschen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Es wurde vorgeschlagen, dass es sieben konservierte Bereiche in den Aminosäuresequenzen von Prenyldiphosphatsynthasen (einer Untereinheit in dem Fall eines Heterodimers) gibt (A. Chem et al., Proteine Science Vol. 3, Seiten 600–607, 1994). Es ist ebenfalls bekannt, dass von den fünf konservierten Bereichen, der Bereich II eine Asp-reiche Domäne mit einem konservierten Bereich I [DDXX(XX)D] (wobei die zwei X in den Klammern nicht vorhanden sein können) enthält. Obwohl es ebenfalls eine Asp-reiche Domäne im Bereich IV gibt, ist die zur Spezifizierung des modifizierten Bereichs der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz verwendete Asp-reiche Domäne im Bereich II vorhanden, wobei die Domäne als die Asparaginsäure reiche Domäne I im Vergleich zu der im Bereich VI vorhandenen Asparaginsäure reichen Domäne II bezeichnet wird.

Als Prenyldiphosphatsynthasen mit der vorher beschriebenen Asp-reichen Domäne können Farnesyldiphosphatsynthase, Geranylgeranyldiphosphatsynthase, Hexaprenyldiphsophatsynthase, Heptaprenyldiphosphatsynthase, Octaprenyldiphosphatsynthase, Nonaprenyldiphosphatsynthase, Undecaprenyldiphosphatsynthase usw., erwähnt werden. Spezifischere Beispiele enthalten Farnesyldiphosphatsynthase von Bacillus stearothermophilus, Farnesyldiphosphatsynthase von Escherichia coli, Farnesyldiphosphatsynthase von Saccharomyces cerevisiae, Farnesyldiphosphatsynthase von der Ratte, Farnesyldiphosphatsynthase vom Menschen, Geranylgeranyldiphosphatsynthase von Neurospora crassa, Hexaprenyldiphosphatsynthase von Saccharomyces cerevisiae und ähnliche.

Als Beispiel einiger davon werden in der 11 die Bereiche I bis VII und die Asp-reiche Domäne I (im Kasten) im Bereich II der Aminosäuresequenz von Farnesyldiphosphatsynthasen gezeigt.

Die vorliegende Erfindung kann bei Prenyldiphosphatsynthasen mit diesen Asparaginsäure reichen Domänen I angewendet werden.

Erfindungsgemäß wird der Aminosäurerest lokalisiert an der fünften Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asparaginsäure reichen Domäne „DDXX(XX)D" (wobei die zwei X in den Klammern nicht vorhanden sein können) durch eine andere Aminosäure substituiert. Diese Aminosäure wird durch ein Sternchen in der 11 angezeigt. Die Aminosäure nach der Substitution kann jede natürlich auftretende Aminosäure sein, die unterschiedlich zu der ursprünglichen Aminosäure ist. Als ein derartiges Beispiel wird ein Enzym erwähnt, mit einer Aminosäuresequenz in welcher die Aminosäure Tyrosin an der Position 81 in der SEQ ID Nr. 1 durch eine natürlich auftretende Aminosäure substituiert wurde.

Viele mutierte Prenyldiphosphatsynthasen, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, können ein Prenyldiphosphat mit einer längeren Kettenlänge als das durch die natürliche Prenyldiphosphatsynthase synthetisierte synthetisieren. Z.B. können einige Farnesyldiphosphatsynthasen, die ein Farnesyldiphosphat mit 15 Kohlenstoffen synthetisieren, wenn sie in ein mutiertes Enzym modifiziert werden, Hexaprenyldiphosphat mit 30 Kohlenstoffen synthetisieren.

Ferner kann, wenn einmal die Aminosäuresequenz des erwünschten Enzyms bestimmt wurde, eine geeignete Nucleotidsequenz davon bestimmt, und die DNS in einem herkömmlichen Verfahren der DNS-Synthese chemisch synthetisiert werden.

Expressionsvektoren enthalten einen Ursprung der Replikation, die Expression regulierende Sequenzen usw., aber sie können mit dem Wirt differieren. In Bezug auf die Wirte können Prokaryoten, z.B. Bakterien, wie etwa Escherichia coli und die Gattung Bacillus, wie etwa Bacillus subtilis, als euch Eukaryoten, z.B. Pilze, wie etwa Hefe, z.B. Gattung Saccharomyces, wie etwa Saccharomyces cerevisiae, Gattung Pichia, wie etwa Pichia pastoris, filamentöse Pilze, z.B. Gattung Aspergillus, wie etwa Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, tierische Zellen, z.B. kultivierte Zellen der Seidenraupe, kultivierte Zellen höherer Tiere, wie etwa CHO-Zellen, und ähnliche genannt werden. Ferner können Pflanzen als der Wirt verwendet werden.

Wie in den Beispielen gezeigt, können erfindungsgemäß während der Kultivierung des durch die DNS transformierten Wirts langkettige Prenyldiphosphate, wie etwa GGPP, GFPP, HexPP und ähnliche im Kulturmedium akkumulieren, welche gewonnen werden, um ihre entsprechenden Diphosphate zu erzeugen. Ferner können langkettige Diphosphate ebenfalls durch in Kontakt bringen der erfindungsgemäß hergestellten mutierten Prenyldiphosphatsynthase mit dem Substrat Isopentenyldiphosphat und einem Allylsubstrat, wie etwa Farnesyldiphosphat, hergestellt werden.

Wenn Escherichia coli als der Wirt verwendet wird, ist bekannt, dass der Wirt regulatorische Funktionen für das Gen während des Stadiums der Transkription von mRNS aus DNS und bei der Translation von Protein aus mRNS hat. Als die Promotorsequenz, die die mRNS-Synthese reguliert, sind zusätzlich zu den natürlich auftretenden Sequenzen (z.B. lac, trp, bla, lpp. PL, PR, ter, T3, T7, usw.) ihre Mutanten (z.B. lacUV5) und die Sequenzen (wie etwa tac, trc, usw.), in welche ein natürlich auftretender Promotor künstlich fusioniert ist, bekannt, und sie können für die vorliegende Erfindung verwendet werden.

Es ist bekannt, dass der Abstand zwischen der Sequenz der Ribosomenbindungsstelle (GAGG und dazu ähnliche Sequenzen) und dem Initiationskodon ATG wichtig als eine Sequenz zur Regulierung der Fähigkeit der Synthese von Protein aus mRNS ist. Es ist ebenfalls gut bekannt, dass ein Terminator (z.B. ein Vektor mit rrnPT1 T2, kommerziell erhältlich von Pharmacia), der die Transkriptionstermination am 3'-Ende steuert, die Effizienz der Proteinsynthese durch eine Rekombinante beeinflusst.

Als Vektoren, die für die Herstellung von rekombinanten Vektoren verwendet werden könne, können verschiedene Vektoren erwähnt werden, die in Abhängigkeit von ihrer beabsichtigten Verwendung abgeleitet werden. Z.B. können erwähnt werden pBR322, pBR327, pKK223-3, pKK233-3, pTrc99 und ähnliche, mit einem von pMB1 abgeleiteten Replikon; pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 und ähnliche, mit einer Veränderung zur Erhöhung der Kopienanzahl; oder pACYC177, pACYC184 und ähnliche, mit einem von p15A abgeleiteten Replikon; und ferner von pSC101, ColEl, R1, F-Faktor und ähnliche abgeleitete Plasmide. Ferner können Fusionsproteine exprimierende Vektoren verwendet werden, die eine leichtere Reinigung ermöglichen, wie etwa pGEX-2T, pGEX-3X, pMal-c2. Ein Beispiel für das als Ausgangsmaterial der vorliegenden Erfindung verwendete Gen wird in der japanischen Patentanmeldung Nr. 6-315572 beschrieben.

Ferner können zusätzlich zu Plasmiden, virale Vektoren, wie etwa der &lgr;-Phage oder der M13-Phage oder Transposons für die Einführung von Genen verwendet werden. Bezüglich der Einführung des Gens in andere Mikroorganismen als Escherichia coli ist die Geneinführung in Organismen der Gattung Bacillus durch pHY300PLK (Takara Shuzo) bekannt. Diese Vektoren werden in Molecular Cloning (J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maiatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Cloning Vector (P. H. Pouwles, B. E. Enger, Valk, und W. J. Brammar, Elsevier) und Katalogen vieler Hersteller beschrieben.

pTrc99 ist besonders bevorzugt, da es, zusätzlich zu dem selektierbaren Marker des Ampicillinresistenzgens, einen Promotor, regulatorische Gene, wie etwa Ptrc und lacIq, die Sequenz AGGA als Ribosombindungsstelle, rrnPT1T2 als Terminator und eine Funktion der Regulierung der Genexpression der FPP-Synthase hat.

Die Integration des für die Prenyldiphosphatsynthase kodierenden DNS-Fragments und, wo erforderlich, des DNS-Fragments mit der Funktion der regulierten Expression des Gens des Enzyms in diesen Vektoren, kann durch ein herkömmliches Verfahren unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms und einer Ligase durchgeführt werden. Spezifische Beispiele für die derartig konstruierten Plasmide umfassen z.B. pTV118N-Bst FPS.

Als die für die Integration von Genen durch derartige rekombinante Vektoren geeignete Mikroorganismen können Escherichia coli und Mikroorganismen der Gattung Bacillus verwendet werden. Eine derartige Transformation kann ebenfalls unter Verwendung des CaCl2-Verfahrens und des Protoplastenverfahrens wie in Molecular Cloning (J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und DNA Cloning Vol. I to III (D. M. Clover ed., IRL PRESS) beschrieben, durchgeführt werden.

Um das wie in der vorliegenden Erfindung definierte mutierte Enzym zu erzeugen, wird ein wie vorher beschriebener, transformierter Wirt kultiviert und dann wird die Kultur einem Verfahren mit Aussalzen, Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, Gelchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und ähnlichem unterzogen, um das Enzym zu gewinnen und zu reinigen.

Als das Enzym kann nicht nur das gereinigte Enzym sondern ebenfalls das rohe Enzym verwendet werden, das halb bis zu verschiedenen Stadien gereinigt wird, oder eine Mischung der kultivierten Biomasse eines Mikroorganismus kann verwendet werden. Alternativ können immobilisierte Enzyme, hergestellt gemäß einem herkömmlichen Verfahren aus den Enzymen, dem rohen Enzym oder einem Produkt, das das Enzym enthält, hergestellt werden.

Als das Substrat können Prenyldiphosphate und Isopentenyldiphosphate mit 5 bis 20, bevorzugt 5 Kohlenstoffen weniger als die Anzahl des erwünschten Prenyldiphosphats verwendet werden. Als das Reaktionsmedium können Wasser oder eine wässrige Pufferlösung, z.B. Tris-Puffer oder Phosphat-Puffer, und ähnliche, verwendet werden.

Unter Verwendung des durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Systems für die Regulierung der Kettenlänge des Reaktionsprodukts von Prenyldiphosphatsynthase, kann Prenyldiphosphat mit längerer Kettenlänge, dessen Synthese bisher nur mit dem Enzym vom Heterodimertyp möglich war, unter Verwendung einer mutierten Prenyldiphosphatsynthase vom Homodimertyp synthetisiert werden, die einfacher zu Handhaben ist. Ferner kann durch die Modifizierung des Aminosäurerestes lokalisiert an der fünften Position stromaufwärts von der Asparaginsäure reichen Domäne I der entsprechenden Untereinheit mit der Asparaginsäure reichen Domäne der Prenyldiphosphatsynthase vom Heterodimertyp unter Verwendung des vorher erwähnten Systems, die Schaffung eines mutierten Enzyms erwartet werden, das Prenyldiphosphate mit verlängerten Ketten synthetisiert.

In den Ansprüchen und der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Aminosäurereste durch die Einbuchstabencodes oder die Dreibuchstabencodes dargestellt.:

A; Ala; Alanin

C; Cys; Cystin

D; Asp; Asparaginsäure

E; Glu; Glutaminsäure

F; Phe; Phenylalanin

G; Gly; Glycin

H; His; Histidin

I; Ile; Isoleucin

K; Lys; Lysin

L; Leu; Leucin

M; Met; Methionin

N; Asn; Asparagin

P; Prl; Prolin

Q; Gln; Glutamin

R; Arg; Arginin

S; Ser; Serin

T; Thr; Threonin

V; Val; Valin

W; Trp; Tryptophan

Y; Tyr; Tyrosin

Die Substitution der Aminosäure wird in der Reihenfolge "der Aminosäurerest vor Substitution", "die Nummer des Aminosäurerestes" und „Aminosäurerest nach Substitution" bezeichnet. Z.B. wird die Mutation, in welcher ein Tyrosinrest an der Position 81 durch ein Methioninrest ausgetauscht wird, als Y81M dargestellt.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf die spezifischen Beispiele erläutert, aber sie dürfen nicht als Beschränkung der Erfindung auf irgendeine Art und Weise ausgelegt werden.

Beispiel 1: Konstruktion eines Plasmids, das das Gen der FPP-Synthase enthält

Das Gen der aus Bacillus stearothermophilus stammenden FPP-Synthase (hiernach als BstFPS bezeichnet), wurde an die NcoI-HindIII-Stelle des Plasmidvektors pTV118N, kommerziell erhältlich von Takara Shuzo, unterkloniert. Die Plasmid-DNS wurde als pTV118N-BstFPS bezeichnet. Das BstFPS-Gen ist erhältlich aus Escherichia coli JM109 (pEX1), das international am 26. September 1991 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Ibalaki, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3581 hinterlegt wurde. Ebenfalls wurde die gesamte Nucleotidsequenz des BstFPS-Gens in der japanischen Patentanmeldung 3(1991)-253788, T. Koyama et al., (1993) J. Biochem. 113: 355–363 oder in einer genetischen Informationsdatenbank, wie etwa GenBank, unter der Eintragungsnummer D13293 veröffentlicht. Da Bacillus stearothermophilus ebenfalls von verschiedenen Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen, wie etwa ATCC usw. erhältlich ist, kann die DNS des Gens des BstFPS-Bereichs durch ein herkömmliches Genklonierungsverfahren erhalten werden.

Beispiel 2: Synthese der Oligonucleotide für das Einfügen von Mutationen

Für das Einfügen von Mutationen in das Gen der FPP-Synthese wurden die folgenden Oligonucleotide entworfen und synthetisiert:

Primer DNS (Y81X): 5'GAT CCA TAC GNN NTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3' (SEQ ID Nr.: 2)

Primer DNS (Y81N): 5'GAT CCA TAC GAA CTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3' (SEQ ID Nr.: 3)

Primer DNS (Y81I): 5'GAT CCA TAC GAT TTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3' (SEQ ID Nr.: 4)

Primer DNS (Y81M): 5'GAT CCA TAC GAT GTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3' (SEQ ID Nr.: 5)

Primer DNS (Y81F): 5'GAT CCA TAC GTT CTC TTT GAT TCA TGR TGA TTT G3' (SEQ ID Nr.: 6)

Primer DNS (Y81P): 5'GAT CCA TAC GCC GTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3' (SEQ ID Nr.: 7)

Primer DNS (Y81V): 5'GAT CCA TAC GGT GTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3' (SEQ ID Nr.: 8)

Sie sind dafür entworfen, die Spaltstelle des Restriktionsenzyms BspHI (5'TCATGA3') als auch Mutationen in das Codon neu einzufügen, das für den Aminosäurerest an der Position 81 von BstFPS kodiert. Das Einbringen der Spaltstelle von BspHI ändert die durch das BstFPS-Gen kodierte Aminosäuresequenz aufgrund der Regeneration der Codons nicht. Dies wird verwendet, um substitutionsmutierte Plasmide mittels Agarosegel-Elektrophorese nach Verdau mit BspHI nachzuweisen, da die Einführung der Mutation durch Substitution des Aminosäurerest an der Position 81 des BstFPS-Gens gleichzeitig eine neue BspHI-Spaltstelle erzeugt.

Diese Primer DNS wurden einer Phosphorylierung bei 37°C für 30 Minuten in dem unten gezeigten Reaktionsmedium unterzogen, gefolgt durch Denaturierung bei 70°C für 10 Minuten. 10 pmol/&mgr;l Primer DNS 2 &mgr;l 10 × Kinasepuffer 1 &mgr;l 10 mM ATP 1 &mgr;l H2O 5 &mgr;l T4 Polynucleotidkinase 1 &mgr;l
in welchem der 10 × Kinasepuffer 1000 mM Tris-Cl (pH 8,0), 100 mM MgCl2 und 70 mM DTT ist.

Beispiel 3: Einfügen von Substitutionsmutationen in das Codon entsprechend Aminosäurerest an der Position 81 des BstFPS-Gens

Unter Verwendung jeder im Beispiel 2 konstruierten Primer-DNS wurden Substitutionsmutationen in das in Beispiel 1 hergestellte Plasmid gemäß dem Verfahren von Kunkel eingeführt. Das kommerziell erhältliche Mutan-K-Reagenziensatz von Takara Shuzo wurde verwendet, um das Verfahren von Kunkel durchzuführen. Das experimentelle Vorgehen wurde in der Reagenziensatzbeilage beschrieben. Die Substitutionsmutation des Plasmids muss nicht durch das Verfahren von Kunkel durchgeführt werden. Z.B. kann das gleiche Ergebnis durch ein Verfahren unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten werden.

Unter Verwendung von Escherichia coli CJ236 in dem Mutan-K-Reagenziensatz als die Wirtszelle, wurde eine einzelsträngige DNS erhalten, in welcher die Thyminbase im Plasmid pTV118N-BstFPS durch die Deoxyuracilbase ersetzt wurde.

Die derartig erhaltene einzelsträngige DNS wurde als Matrize in einer Reaktion verwendet, in welchem eine Primer-DNS für die Synthese eines komplementären Stranges in der folgenden Reaktionslösung bei 65°C für 15 Minuten behandelt und dann durch Stehenlassen bei 37°C für 15 Minuten annealt wird: Einzelsträngige DNS 0,6 pmol Annealing-Pufferlösung 1 &mgr;l Primer DNS-Lösung (Beispiel 2) 1 &mgr;l H2O um ein Endvolumen von 10 &mgr;l zu ergeben
in welchem die Annealing-Pufferlösung 200 mM Tris-Cl (pH 8,0), 100 mM MgCl2, 500 mM NaCl und 10 mM DTT ist.

Ferner wurden 25 &mgr;l einer Verlängerungspufferlösung, 60 Einheiten der Escherichia coli DNS-Ligase und 1 Einheit der T4-DNS-Polymerase zugegeben, um bei 25°C für 2 Stunden einen komplementären Strang zu synthetisieren. Die Verlängerungspufferlösung ist 50 mM Tris-Cl (ph 8,0), 60 mM Ammoniumacetat, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM NAD und 0,5 mM dNTP.

Nachdem die Reaktion vorbei ist, wurden 3 &mgr;l 0,2 M EDTA (pH 8,0) dazugegeben und einer Behandlung bei 65°C für 5 Minuten unterzogen, um die Reaktion zu beenden.

Beispiel 4: Konstruktion einer Rekombinante mit einem Gen von welchem Substitutionsmutationen in das Codon entsprechend dem Aminosäurerest an der Position 81 des BstFPS-Gens einfügt wurde

In Übereinstimmung mit Beispiel 3 wurde die konstruierte DNS-Lösung verwendet, um Escherichia coli DH5&agr; durch das CaCl2-Verfahren zu transformieren. Ein alternatives Verfahren, wie etwa die Elektroporation, ergibt ähnliche Ergebnisse.

Die durch das CaCl2-Verfahren erhaltene Transformante wurde auf einer Agarplatte mit Ampicillin, einem selektierbaren Marker für die Transformanten, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Unter den wie vorher erhaltenen Transformanten wurden diejenigen mit dem substitutionsmutierten pTV118N-BstFPS-Plasmid, die eine BspHI-Spaltstelle in dem BstFPS kodierenden Bereich haben, ausgewählt. Die Nucleotidsequenz in der Nachbarschaft des Codons, das dem Aminosäurerest an der Position 81 des BstFPS-Gens des ausgewählten substitutionsmutierten pTV118N-BstFPS-Plasmid entspricht, wurde durch das Dideoxyverfahren bestimmt. Im Ergebnis wurden pTV118N-BstFPs-Plasmide mit den folgenden 19 substitutionsmutierten BstFPS-Genen erhalten: Mutation Codon Y81A GCT Y81C TGC Y81D GAC Y81E GAA Y81F TTC Y81G GGT Y81H CAC Y81I ATT Y81K AAG Y81L CTC Y81M ATG Y81N AAC Y81P CCG Y81Q CAA Y81R AGG Y81S TCG Y81T ACA Y81V GTG Y81W TGG Y81Y (Wildtyp) TAC

Beispiel 5: Messung der Aktivität der mutierten BstFPS

Rohe Enzymlösungen wurden wie folgt aus den in Beispiel 4 erhaltenen 20 Transformanten mit 19 mutierten BstFPS-Genen und einem Wildtyp-BstFPS-Gen hergestellt.

Die über Nacht in dem 2 × LB-Medium kultivierte Transformante wurde zur Ernte der Zellen zentrifugiert, und dann wurden die Zellen in dem Puffer für die Zellhomogenisierung (50 mM Tris-Cl (pH 8,0), 10 mM &bgr;-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA) suspendiert. Dies wurde durch Ultraschall homogenisiert und dann bei 4°C bei 10.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde bei 55°C für 30 Minuten behandelt, um die Aktivität der aus Escherichia coli stammenden Prenyldiphosphatsynthase zu inaktivieren. Dies wurde weiter unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und der erhaltenen Überstand wurde als ein roher Enzymextrakt bei einer Reaktion bei 55°C für 15 Minuten in der folgenden Reaktionslösung verwendet: [1-14C]-IPP (1 Ci/mol) 25 nmol Allylisches Substrat (DMAPP oder GPP oder FPP) 25 nmol Tris-Cl (pH 8,5) 50 nM MgCl2 5 mM NH4Cl 50 mM &bgr;-Mercaptoethanol 50 mM Enzymlösung 50 &mgr;g H2O um 1 ml zu ergeben

Nachdem die Reaktion vorüber ist, wurden 3 ml Butanol zugegeben, um das Reaktionsprodukt in eine Butanolschicht zu extrahieren. 1 ml der erhaltenen Butanolschicht wurde in 3 ml eines Flüssigszintillators gegeben, um die Aktivität durch einen Szintillationszähler zu messen. Das Ergebnis wird in der 1 gezeigt. Die Y81P BstFPs-Mutante wies nur eine geringe enzymatische Aktivität auf, was von der Tatsache ableitbar ist, dass nur der Prolinaminosäurerest aus der Iminosäure abgeleitet wird und daher nicht in der Lage ist, die Form einer &agr;-Helix oder einer &bgr;-Faltblattstruktur anzunehmen, wodurch signifikant die wesentliche höhere Struktur des Enzyms selbst geändert wird.

Das Lösungsmittel wird vom Rückstand der Butanolschicht durch Einspülen von Stickstoffgas unter Erwärmung der Schicht verdampft, um auf 0,5 ml konzentriert zu werden. Zu dem Konzentrat wurden zwei ml Ethanol und ein ml einer Lösung der sauren Phosphatase aus der Kartoffel (2 mg/ml Phosphatase aus der Kartoffel, 0,5 M Natriumacetat (pH 4,7)), um die Dephosphorylierungsreaktion bei 37°C durchzuführen. Nachfolgend wurde das dephosphorylierte Reaktionsprodukt mit 3 ml n-Pentan extrahiert. Dieses wurde durch Verdampfen des Lösungsmittels durch Einspülen von Stickstoffgas verdampft, welches dann durch TLC (Umkehrphase-TLC-Platte: LKC18 (Whatman), Entwicklungsmittel: Aceton/Wasser = 9/1) analysiert. Das entwickelte dephosphorylierte Reaktionsprodukt wurde durch den Bio Image Analyzer BAS2000 (Fuji Photo Film) analysiert, um die Lokalisierung und die relative Radioaktivität zu bestimmen. Wenn das Mengenverhältnis aller Reaktionsprodukte gleich ist, wird das Verhältnis der Radioaktivität FPP : GGPP : GFPP : HexPP = 2 : 3 : 4 5. Das Ergebnis, wenn DMAPP als das allylische Substrat verwendet wurde, wird in der 2 gezeigt, wenn GPP als das allylische Substrat verwendet wurde, wird in der 3 gezeigt und wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde, wird in der 4 gezeigt.

Beispiel 6: Verhältnis des substitutionsmutierten Aminosäurerestes zu der Kettenlänge des Reaktionsprodukts

Die 1 und die 4 zeigen, dass wenn die Reaktion unter Verwendung von FPP als das allylische Substrat durchgeführt wurde, die meisten der mutierten BstFPS IPP zu Prenyldiphosphaten mit höherer Kettenlänge als GGPP umwandeln. Zu diesem Zeitpunkt hatten die Substitutionsmutanten, in welchem die Seitenketten der Aminosäuren derartig kleine Moleküle wie Glycin, Alanin und Serin sind, eine höhere Aktivität, während die Substitutionsmutanten, in welchem die Seitenketten der Aminosäuren große Wildtypmoleküle wie Tyrosin und Tryptophan sind, eine geringere Aktivität zeigten.

Dann wurde die enzymatische Aktivität gegen die Molekulargewichte der Seitenketten (5, 6 und 7) mit Bezug auf den Aminosäurerest an Position 81 aufgetragen. Jedoch wurde das Enzym der Y81P-Substitutionsmutante, in welchem die enzymatische Funktion verloren ging, weggelassen.

Im Ergebnis wurde klar gezeigt, dass wenn die Molekulargewichte der Seitenketten gering sind, die Aktivität dazu neigt anzusteigen (7). Die Tendenz wurde ebenfalls beobachtet, selbst wenn andere Parameter als das Molekulargewicht der Seitenketten, das die Größe des Aminosäurerests darstellt, wie etwa die zugängliche Oberfläche, d.h. ein Parameter der exponierten Oberfläche des Aminosäurerests [C. Chothia (1976) J. Mol. Biol. 195: 1–14, B. Lee und F. M. Richads (1971) J. Mol. Biol. 55: 379-400, S. Miller et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 641), und ähnliche verwendet wurden.

Es gab bisher sehr wenige Berichte darüber, die anzeigten, dass die Kettenlänge des Reaktionsprodukts bei der Untersuchung des Mechanismus der Katalyse von FPP-Synthase durch das Einbringen von ortsgerichteten Mutationen ohne Screening, wie etwa durch das Einbringen von ungerichteten Mutationen, verändert wurde. Die Tatsache, dass das Einfügen einer einzelnen ortsgerichteten Mutation eine dynamische Kontrolle der Kettenlänge des Reaktionsprodukts ermöglicht, wie durch die vorliegende Erfindung ermöglicht, war völlig unerwartet.

Aus den 5 und 6 ist ersichtlich, dass wenn DMAPP und GPP als das allylische Substrat verwendet wurden, es keine signifikante Beziehung zwischen dem Molekulargewicht des substitutionsmutierten Aminosäurerestes und der enzymatischen Aktivität gab. Es wird angenommen, dass dies aufgrund der Tatsache ist, dass wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wird, die Reaktionsspezifität des Wildtypenzyms sich direkt als die enzymatische Aktivität widerspiegelt. Die Spezifität, die DMAPP und GPP als das allylische Substrat verwendet, ist dem Wildtypenzym eigen und daher ist die Analyse einer Tendenz beim Parameter der enzymatischen Aktivität alleine schwierig.

Daher wurde der erwartete Wert der Kettenlänge des Reaktionsprodukt, d.h. die mittlere Kettenlänge, durch die folgende Formel erhalten: (erwarteter Wert der Kettenlänge eines Reaktionsprodukts) = (Anteil an FPP) × 15 + (Anteil an GGPP) × 20 + (Anteil GFPP) × 25 + (Anteil HexPP) × 30

Die erhaltenen erwarteten Werte für die Kettenlänge des Reaktionsprodukts wurden gegen die Molekulargewichte der Seitenketten der Aminosäuren an der Position 81 aufgetragen. Jedoch wurde das mutierte Enzym mit der Y81P-Substitution, bei welchem die enzymatische Funktion verloren ging, ausgeschlossen. Es wurde aus diesen Figuren gefunden, dass die erwarteten Werte der Kettenlänge des Reaktionsprodukts höher wurden, so wie das Molekulargewicht der Seitenkette des Aminosäurerests an der Position 81 geringer wurde, selbst wenn das allylische Substrat DMAPP oder GPP ist.

Wenn eine ähnliche Auftragungsanalyse unter Verwendung einer weiteren Eigenschaft des Aminosäurerests an der Position 81 durchgeführt wurde, wie etwa die Hopp & Woods-Skala als ein Parameter für die Hydrophobizität (J. E. Coligan et al. (1995) Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc.), wurde, wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde, keine reguläre Tendenz in Bezug auf den erwarteten Wert der Kettenlänge des Reaktionsprodukts oder der enzymatischen Aktivität gefunden. Überdies, selbst wenn Parameter, wie etwa die Leichtigkeit der Einnahme der &agr;-Helixstruktur (J. E. Coligan et al. (1995) Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc.) oder die Leichtigkeit der Einnahme der &bgr;-Faltblattstruktur (J. E. Coligan et al. (1995) Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc.) verwendet werden, wurden keine deutlichen Beziehungen hinsichtlich des erwarteten Werts der Kettenlänge des Reaktionsprodukts oder der enzymatischen Aktivität beobachtet, wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde. Es wurde zum ersten Mal durch die vorliegende Erfindung klargestellt, dass der für die Bestimmung der Kettenlänge des Reaktionsprodukts verantwortliche Faktor die Größe der Seitenkette des Aminosäurerests lokalisiert 5 Aminosäurereste stromabwärts von der Asparaginsäure reichen Domäne I (DDXX(XX)D) ist.

Sequenzprotokoll

Anspruch[de]
  1. Verfahren für die Regulierung der Kettenlänge des durch eine mutierte Prenyldiphosphatsynthase erhaltenen Reaktionsprodukts, wobei ein Aminosäurerest lokalisiert an der fünften Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Aspartatsäure reichen Domäne DDXX(XX)D (wobei die zwei X in den Klammern nicht vorhanden sein können), die in dem zweiten Bereich innerhalb der konservierten Bereiche der ursprünglichen Prenyldiphosphatsynthase vorhanden ist, durch eine andere Aminosäure substituiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die substituierende Aminosäure gemäß dem Regulierungssystem ausgewählt wird, dass die Kettenlänge des Reaktionsprodukts durch das Molekulargewicht der substituierenden Aminosäure bestimmt wird, so dass ein Anstieg des Molekulargewichts der Seitenkette der substituierenden Aminosäure in einer höheren Kettenlänge des Reaktionsprodukts resultiert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Prenyldiphosphatsynthase Farnesyldiphosphatsynthase, Geranylgeranyldiphosphatsynthase, Hexaprenyldiphosphatsynthase, Heptaprenyldiphosphatsynthase, Octaprenyldiphosphatsynthase, Nonaprenyldiphosphatsynthase, oder Undecaprenyldiphosphatsynthase ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Prenyldiphosphatsynthase ein thermostabiles Enzym ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Tyrosin an der Position 81 der Farnesyldiphosphatsynthase mit einer in der SEQ ID Nr.: 1 festgelegten Aminosäuresequenz, durch eine andere Aminosäure substituiert wurde.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die andere Aminosäure ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Tyrosin, Tryptophan, Arginin, Asparagin, Lysin, Serin, Glutamin, Phenylalanin, Glutaminsäure und Alanin.
Es folgen 9 Blatt Zeichnungen






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