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Dokumentenidentifikation DE10245845B4 29.06.2006
Titel Meßchip für die Verwendung ein einer Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Probe und Vorrichtung mit diesem Meßchip
Anmelder Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, 55129 Mainz, DE;
Technische Universität München, 80333 München, DE
Erfinder Kolb, Gunther, 67433 Neustadt, DE;
Frese, Ines, 55128 Mainz, DE;
Krämer, Petra, Dr., 80939 München, DE
Vertreter Dr. Weber, Dipl.-Phys. Seiffert, Dr. Lieke, 65183 Wiesbaden
DE-Anmeldedatum 30.09.2002
DE-Aktenzeichen 10245845
Offenlegungstag 15.04.2004
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 29.06.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.06.2006
IPC-Hauptklasse G01N 21/76(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G01N 33/18(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   G01N 33/24(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Meßchip für die Verwendung in einer Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Probe unter Anwendung einer Lumineszenzreaktion gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, wie aus DE 197 36 641 A1 bekannt, und eine Vorrichtung mit diesem Meßchip.

Meßgeräte der genannten Art werden vor allem in der chemischen, biochemischen, klinischen und umwelttechnischen Analytik eingesetzt, und zwar insbesondere für Untersuchungen, bei denen eine hohe Empfindlichkeit und Selektivität für die nachzuweisenden Substanzen erwünscht ist. Der Nachweis von Analyten beruht auf der Detektion von Licht, das durch Chemilumineszenz oder Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Menge an vorhandenem Analyten erzeugt wurde. Eine häufig verwendete Chemilumineszenzreaktion ist die Reaktion von Luminol und Wasserstoffperoxid mit dem Enzym Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase. Die Peroxidase ist je nach Art des Messverfahrens mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper oder mit einem Derivat des Analyten kovalent verbunden. Man spricht von einem Enzymtracer.

Beispiele für Analyten, die sich für eine, Detektion mit einer Vorrichtung nach der Erfindung eignen, sind Kontaminationen von TNT (Trinitrotoluol) oder Atrazin in Böden und Gewässern. Eine kontaminierte Probe wird mit spezifischen immobilisierten Antikörpern gegen den Analyten in Kontakt gebracht, und der in der Probe enthaltene Analyt bzw. der Enzymtracer werden dann von den Antikörpern gebunden. Die Zugabe und Inkubation von Analyt und Enzymtracer kann entweder nacheinander und/oder gemeinsam stattfinden. Der Enzymtracer, z.B. ein mit Meerrettich-Peroxidase gekoppeltes Derivat des Analyten, und der Analyt aus der Probe oder dem Standard konkurrieren hierbei um die Bindungsstellen der Antikörper. Durch Waschen mit Puffer werden hierbei die ungebundenen Moleküle entfernt und in einem weiteren Schritt wird die Lumineszenzreaktion durchgeführt. Im Falle von Meerrettich-Peroxidase als an den Tracer gekoppeltes Enzym wird eine Mischung aus Luminol und Wasserstoffperoxid (H2O2) auf die Antikörper aufgebracht. Das bei der stattfindenden Chemilumineszenreaktion emittierte Licht wird mit dem optischen Detektor erfaßt, und aus der detektierten Lichtmenge werden Rückschlüsse auf die Analytmenge gezogen.

Die eingangs genannte DE 197 36 641 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur parallelen Messung von mehreren Analyten in komplexen Mischungen. Bei dieser Meßvorrichtung, die u. a. auch eine Lumineszenzreaktion zur Detektion von Analyten verwendet, ist in einer Flußkammer einer Trägerplatte mit Spots immobilisierter Antikörper gegen die zu detektierende Analyte integriert. Zur Detektion wird jeweils eine Trägerplatte in die Meßvorrichtung eingebracht, der Tracer und die Probe werden außerhalb der Flußzelle vorgemischt und anschließend in die Flußzelle gepumpt. Danach wird die Flußkammer mit einer Waschlösung gewaschen um überflüssige Reagenzien zu entfernen, die Lumineszenzreaktion wird gestartet und die entstehende Strahlung mit einer CCD-Kamera detektiert. Vorräte sämtlicher benötigter Reagenzien werden in Kartuschen, Konzentratssystemen oder in Form von Pulvern bereitgestellt und mit einem Pumpen- und Ventilsystem in die entsprechenden Kompartimente der Meßvorrichtung und in die Flußkammer gefördert.

DE 198 23 876 beschreibt einen Biochip zur DNA-/RNA-Sequenzierung mittels Hybridisierung. Hier werden aus funktionalisierten Substraten Pins herausgetrennt, die in oder auf einen Träger ein/aufgesetzt werden. Der Träger mit den unterschiedlich funktionalisierten Pins stellt den Biochip dar. Um die Beladungsdichte der einzelnen Pins auf dem Träger zu vergrößern, wird eine Mikrostrukturierung der Oberfläche der Pins vorgeschlagen.

Da die beteiligten chemischen Substanzen im allgemeinen in flüssiger Form vorliegen, ist die Handhabung der Chemikalien sehr aufwendig. Darüber hinaus sind die für den Nachweis verwendeten Chemikalien zumindest teilweise verderblich, so daß bei den bekannten Meßgeräten nach der Benutzung eine intensive Reinigung erfolgen muß, die außerhalb des Labors nicht zu bewerkstelligen ist. Es sind daher bereits vereinzelt Meßgeräte vorgeschlagen worden, bei denen die Probe, ein Tracer und ein geeignetes Reaktionsmittel nacheinander auf eine ebene Reaktionsfläche, z.B. ein Objektträger, auf der Antikörper immobilisiert worden sind, aufgebracht werden. Dadurch wird zwar die Handhabung der chemischen Reaktion, insbesondere die Trennung der Antikörper von den Substanzen, deutlich vereinfacht, die Genauigkeit dieser Meßgeräte ist jedoch aufgrund der geringen Dichte der Antikörper auf der ebenen Meßfläche nur sehr gering. Um die bei diesen Meßgeräten emittierte Strahlung überhaupt mit akzeptabler Genauigkeit zu detektieren, ist ein sehr empfindliches Lichtdetektionssystem erforderlich, das aufgrund der notwendigen hochpräzisen Justage nicht transportierbar ist, so daß die Verwendung dieses Verfahrens bei mobilen Meßgeräten ausscheidet.

Die bekannten Meßgeräte sind des weiteren auch im allgemeinen nur für die Detektion eines ganz bestimmten Analyten geeignet. Wenn mit demselben Meßgerät ein anderer Analyt nachgewiesen werden soll, müssen zumindest die Antikörper und der Tracer ausgetauscht werden, was einen aufwendigen Umbau des Meßgeräts erfordert.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und einen Meßchip der eingangs genannten Art zur Verfügung zu stellen, die eine leichte Handhabung der für die Reaktion notwendigen Flüssigkeiten erlauben, kleine Ausmaße haben und bei denen die emittierte Lichtintensität sehr groß ist, so daß die emittierte Lichtmenge leicht mit hoher Genauigkeit erfaßt werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch einen Meßchip mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 und einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs 20 gelöst.

Durch solch eine Erhöhung oder eine Vertiefung, die in beliebiger Art und Weise ausgebildet sein kann, wird die Reaktionsfläche bei gleichbleibender Grundfläche vergrößert. Dies hat zur Folge, daß auf der selben Grundfläche eine größerer Anzahl von beispielsweise Antikörpern aufgebracht werden kann, was wiederum zur Folge hat, daß die Lichtintensität, das heißt die Anzahl der bei der lumineszenten Reaktion abgestrahlten Photonen je Grundfläche erhöht wird. Durch die erfindungsgemäße Ausgestaltung der Reaktionsfläche wird daher die Lichtintensität des emittierten Lichtes erhöht, wodurch die Lichtdetektion einfacher erfolgen kann und die Vorrichtung sogar als portables Gerät ausgestaltet werden kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Reaktionsfläche eine Mehrzahl von Erhöhungen und/oder Vertiefungen mit im wesentlichen gleicher Form auf, die vorzugsweise periodisch angeordnet sind. Mit anderen Worten kann die Fläche des Meßeinsatzes beispielsweise noppenartig oder geriffelt aufgebaut sein. Prinzipiell sind alle möglichen Arten von Erhöhungen und/oder Vertiefungen möglich. Durch die Vielzahl von Erhöhungen und/oder Vertiefungen der Reaktionsfläche wird, wie dies auch schon bei einer Erhöhung oder einer Vertiefung der Fall ist, wird die Oberfläche bei gleichbleibender Grundfläche stark vergrößert, so daß eine höhere Lichtintensität erzielt wird.

Bei zahlreichen Versuchen hat sich herausgestellt, daß mit Vorteil die Erhöhungen oder Vertiefungen polyederfömig und am besten pyramidenförmig, pyramidenstumpfförmig, tetraederförmig, keilförmig, obeliskförmig, kegelförmig oder kegelstumpfförmig sind, da dann eine sehr hohe Lichtausbeute erzielt werden kann. Grundsätzlich sind alle Polyederformen möglich. Bevorzugt sind aber konische bzw. zumindest abschnittweise spitz zulaufende Formen, da diese einfacher hergestellt werden können. Außerdem haben diese Formen und insbesondere die Pyramidenform den zusätzlichen Vorteil, daß ein größerer Anteil der durch die Lumineszenzreaktion erzeugten Photonen in Richtung des Detektors abgestrahlt wird.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Reaktionsfläche mehrere Reihen von pyramidenförmigen Erhöhungen oder Vertiefungen auf. Mit anderen Worten besteht die Reaktionsfläche aus einer Vielzahl von direkt nebeneinander angeordneten pyramidenförmigen Erhöhungen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Erhöhungen pyramidenförmig mit quadratischer Grundfläche. Das Verhältnis der Höhe zur Seitenlänge der Grundfläche (Aspektverhältnis) beträgt mehr als 0,25 und liegt vorzugsweise zwischen 0,5 und 3 und besonders bevorzugt zwischen 1,75 und 2,5 Durch das relativ große Aspektverhältnis wird die Oberfläche bei gleichbleibender Grundfläche des Meßeinsatzes weiter erhöht, so daß es zu einer verstärkten Lichtintensität kommt. Darüber hinaus hat sich bei dieser Anordnung gezeigt, daß ein größerer Anteil der erzeugten Photonen bzw. Lichtsignale in Richtung des Detektors abgestrahlt wird. Die Oberflächenstruktur der, Reaktionsfläche wirkt daher wie ein optischer Trichter, so daß ein Großteil der durch die Lumi neszenzreaktion erzeugten Photonen direkt in Richtung des Detektors abgestrahlt wird.

Da es bei der Herstellung der pyramidenförmigen Konstruktion oftmals zu Gratbildungen kommt, wird für eine alternative Ausführungsform erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß an Stelle von pyramidenförmigen Erhöhungen die Form von Pyramidenstümpfen verwendet wird.

In einer besonders zweckmäßigen Ausführungsform sind die Seiten der rechteckigen, vorzugsweise quadratischen Grundfläche der pyramidenförmigen Erhöhungen derart orientiert, daß sie mit der Hauptströmungsrichtung des Fluids über die Reaktionsfläche einen Winkel zwischen 1° und 89°, vorzugsweise zwischen 30° und 60°, besonders bevorzugt zwischen 40° und 50° einschließen.

Es hat sich nämlich gezeigt, daß die Genauigkeit der Meßvorrichtung noch erhöht werden kann, wenn dafür Sorge getragen wird, daß die Probe und die für den Nachweis des Analyten notwendigen chemischen Flüssigkeiten möglichst gleichmäßig über die gesamte Reaktionsfläche geleitet werden. Überraschenderweise hat sich dabei herausgestellt, daß die pyramidenförmige Ausgestaltung der Meßeinsatzfläche die gleichmäßige Überströmung des Meßeinsatzes begünstigt. Besonders günstig ist es, wenn die Pyramiden gerade nicht derart angeordnet sind, daß die sich zwischen zwei benachbarten Pyramidenreihen bildenden „Täler" in Richtung der Hauptströmungsrichtung des Fluids ausgerichtet sind, so daß das Fluid direkt entlang dieser „Täler" fließen kann. Die „Täler" sind daher mit Vorteil schräg und besonders bevorzugt diagonal, d.h. mit einem Winkel von etwa 45°, zu der Hauptströmungsrichtung angeordnet, so daß eine möglichst gleichmäßige Umspülung der pyramidenförmigen Erhebungen sichergestellt ist.

Besonders bevorzugt ist die Reaktionsfläche auf einem Grundkörper ausgebildet, der aus einem Polymer, vorzugsweise aus Polymethylvinyl und besonders bevorzugt aus Polymethylmethacrylat (PMMA) besteht. Mit Vorteil wird die Reaktionsfläche zumindest abschnittsweise mit einem Metall, vorzugsweise mit Gold, beschichtet. Gegebenenfalls kann mit Vorteil zwischen der Goldschicht und dem Meßeinsatz Chrom oder Titan, vorzugsweiss Titan, als Haftvermittler eingesetzt werden. Die Goldschicht unterstützt nicht nur die Immobilisierung der Antikörper auf der Reaktionsfläche, sondern sorgt darüber hinaus auch für eine Reflexion der durch die Lumineszenzreaktion emittierten Photonen, so daß der Anteil der emittierten Photonen, die zu dem optischen Detektor gelangen, erhöht wird. Die Reaktionsfläche stellt daher quasi einen optischen Trichter für die durch die Lumineszenzreaktion erzeugten Photonen dar.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform sieht vor, daß in Fluidströmungsrichtung vor und hinter der Reaktionsfläche ein Fluidzuleitungskanal bzw. ein Fluidableitungskanal vorgesehen ist. Dies hat unter anderem den Vorteil, daß der Meßchip leicht austauschbar ist und z.B. als Einwegmeßchip ausgestaltet werden kann. Der Meßchip kann nach Beendigung der Messung samt der mit verderblichen Antikörpern behafteten pyramidenförmigen Meßeinsatzschicht aus der Vorrichtung entnommen werden und durch einen anderen Meßchip ersetzt werden. Eine aufwendige Reinigung, wie sie im Stand der Technik notwendig ist, entfällt somit.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform weist der Meßchip eine Probenvorratskammer auf. Weiterhin kann vorgesehen sein, daß der Meßchip eine Vorratskammer für einen Tracer, z.B. einen Enzymtracer, aufweist, die vorzugsweise einen Zuleitungs- und einen Ableitungskanal besitzt. Insbesondere das Vorsehen der Vorratskammer für einen Tracer, der im allgemeinen ebenfalls leicht verderblich ist, ist von großem Vorteil. Durch Austausch des Meßchips werden nämlich in diesem Fall gleichzeitig alle Tracerreste mit ausgetauscht, so daß die Reinigung der Vorrichtung nach einer Messung weiter vereinfacht wird.

Da der Tracer möglicherweise in einer nicht leicht fließfähigen Form vorliegt, ist vorzugsweise ein Zuleitungs- und ein Ableitungskanal vorgesehen. So könnte beispielsweise eine Pufferlösung über den Zuleitungskanal in die Tracer-Vorratskammer eingebracht werden, die den Tracer über den Ableitungskanal aus der Vorratskammer herausspült. Der Tracer kann dann zusammen mit der Pufferlösung über die Meßeinsatzfläche geleitet werden.

Versuche haben gezeigt, daß die Vorratskammer für den Tracer mit Vorteil einen mäanderförmigen Abschnitt aufweist, da dann ein optimales Ausspülen des Tracers aus der Vorratskammer möglich ist.

Mit Vorteil ist die Vorratskammer für den Tracer derart bemessen, daß sie im wesentlichen exakt diejenige Tracermenge aufnehmen kann, die für eine einzige quantitative Bestimmung eines Analyten notwendig ist.

Um den Meßchip vor der Messung mit der Tracermenge und gegebenenfalls mit dem Probenmaterial zu befüllen, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß zumindest ein Zuleitungs- oder zumindest ein Ableitungskanal mit Hilfe einer Dichtung, vorzugsweise einer Silikondichtung oder einem Septum, verschlossen ist. Es ist daher leicht möglich, den Tracer mit einer Spritze in die entsprechende Vorratskammer einzubringen. Da die Vorratskammer aufgrund der Dichtung gut verschlossen ist, wird eine hohe Haltbarkeit des leicht verderblichen Tracers gewährleistet. Das Tracermittel kommt erst unmittelbar vor Einsatz des chemischen Nachweisverfahrens mit anderen Chemikalien in Berührung und wird unmittelbar im Anschluß an die chemische Nachweisreaktion samt Meßchip aus der Vorrichtung entfernt.

Erfindungsgemäß ist der Meßchip vorzugsweise von der Basisplatte abnehmbar und austauschbar. Durch die erfindungsgemäße Anordnung der Vorratskammer für den Tracer und der Reaktionsfläche, auf der beispielsweise gegen den zu bestimmenden Analyten gerichtete Antikörper immobilisiert sind, kann der Meßchip auch einfach gegen einen Meßchip mit einer Reaktionsfläche, die gegen einen anderen zu bestimmenden Analyten gerichtete Antikörper enthält, und einer mit einem anderen Tracer befüllte Vorratskammer ausgetauscht werden. So kann mit derselben Vorrichtung nur durch Austausch des Chips eine Mehrzahl von Analyten zügig nachgewiesen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Basisplatte Vorratsbehälter und/oder Anschlüsse für Reagenzien und Pufferlösungen. Z. B. könnte ein Vorratsbehälter oder ein Zuführungsanschluß sowohl für Luminol als auch für Wasserstoffperoxid und eine Pufferlösung vorgesehen sein. Durch entsprechende Steuerung kann dann je nach Bedarf aus den verschiedenen Vorratsbehältern die entsprechende Chemikalie zu dem Meßchip übertragen werden.

Es hat sich gezeigt, daß mit Vorteil ein Mischer auf der Basisplatte angeordnet ist. Dies hat den Vorteil, daß Reagenzien unmittelbar vor der Zugabe auf die Reaktionsfläche gemischt werden können. Eine optimale Durchmischung sowie eine genaue Dosierung der Menge des Gemischs ist dadurch möglich, was insbesondere bei Mischungen, die verderblich sind oder bei denen nach einer gewissen Zeit eine Phasentrennung einsetzt, von Vorteil ist.

Als optischer Detektor kommt vorzugsweise ein Photomultiplier zum Einsatz.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung werden deutlich anhand der folgenden Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform sowie der dazugehörigen Figuren. Es zeigen:

1 und 2 jeweils eine Explosionsansicht einer Ausführungsform der Erfindung,

3 eine vergrößerte Darstellung der Basisplatte der in den 1 und 2 gezeigten Ausführungsform der Erfindung in einer Explosionsansicht,

4 eine vergrößerte Darstellung des Meßchips der in den 1 und 2 gezeigten Ausführungsform der Erfindung in einer Explosionsansicht,

5 eine vergrößerte Ansicht des Meßchips mit angehobener Abdeckplatte,

6 eine perspektivische Schnittansicht des Meßchips,

7 eine Schnittansicht des Meßchips,

8 eine Detailvergrößerung der Meßzelle bzw. des Meßeinsatzes, und

913 schematische Darstellungen des Fluidflusses in der Vorrichtung für verschiedene Betriebszustände.

In den 1 und 2 ist jeweils eine Explosionsansicht einer Ausführungsform der Vorrichtung für die Atrazin-Detektion gezeigt. Die wesentlichen Elemente der Vorrichtung sind die Basisplatte 3 zur Fluidverteilung, die mit als Mikromagnetventile ausgebildeten Ventilen 45 ausgestattet ist, der Meßchip 2 und der Detektor 4 mit Seitenteilen 5, 6, 7, 46 als Detektorabschirmung.

Der Detektor 4 ist bei der gezeigten Ausführungsform ein miniaturisierter Photomultiplier. Ausführliche Messungen haben gezeigt, daß handelsübliche einfache Detektoren, wie sie für Chemilumineszenzmessungen angeboten werden, für die vorliegende Meßaufgabe nicht empfindlich genug sind. Der verwendete hochempfindliche Photomultiplier muß jedoch lichtdicht gekapselt werden, da er durch Tageslichteinfluß geschädigt wird. Zu diesem Zweck wird der Detektor 4 innerhalb eines Kastens angeordnet, der durch die Seitenteile 5, 6, 7, 46 und die Basisplatte 3 gebildet wird.

Die gesamte Vorrichtung ist kompakt ausgeführt und daher tragbar. Der Meßchip 2 ist als Einwegchip ausgeführt, der die empfindlichsten und verderblichen Komponenten, das heißt die biologisch aktiven Substanzen, wie z. B. die Antikörper und einen Enzymtracer, bereits in definierten Mengen für jeweils eine Messung dicht verschlossen und damit lagerfähig enthält.

Die Basisplatte 3 ist in 3 vergrößert in einer Explosionsansicht dargestellt. Die Basisplatte 3 besteht aus zwei Teilen 8, 9. Der obere Teil 8 der Basisplatte ist aus transparentem PMMA gefertigt, der untere Teil 9 aus schwarzem PMMA. Dies hat den Vorteil, daß Laserschweißen für die Verbindung der beiden Platten und zum Abdichten der Fluidkanäle verwendet werden kann. In dem oberen Teil 8 der Basisplatte 3 ist eine Ausnehmung 10 zur Aufnahme des Meßchips 2 dargestellt. Weiterhin ist ein Durchgang 11 für den Detektor vorgesehen. Auf dem unteren Teil 9 der Basisplatte 3 sind verschiedene Fluidkanäle eingefräst, deren Funktion noch erläutert wird. Weiterhin trägt die Basisplatte die Bohrungen 22 für die Montage der Ventile 45.

Das Reaktionsmittel – auch Substrat genannt -, das bei diesem Verfahren zum Einsatz kommt, besteht aus zwei Flüssigkeiten (Luminol und eine wäßrige Wasserstoffperoxidlösung). Diese müssen unmittelbar vor der Nachweisreaktion gemischt werden, da die Haltbarkeit der Mischung nur sehr begrenzt ist. Um dies zu ermöglichen und eine optimale Vermischung der beiden Komponenten zu gewährleisten, ist ein Mikromischer 16 auf der Basisplatte 3 aufgenommen.

In 4 ist der als Einwegchip ausgestaltete Meßchip 2 gezeigt. Wie bereits erwähnt, sind die empfindlichsten Komponenten, nämlich die verderblichen biologisch aktiven Komponenten, bereits in definierten Mengen für jeweils eine Messung dicht verschlossen und damit lagerfähig in dem Meßchip aufgenommen. Der Meßchip 2 besteht aus einem Basisteil 23 mit einer Ausnehmung 33 für den Meßeinsatz, einer oberen transparenten Abdeckplatte 27 und einer unteren Abdeckplatte r zum Verschließen der Probenvorratskammer 35.

Die wesentlichen Komponenten des Meßchips 2 sind die Probenvorratskammer 35, die von der Rückseite befüllt wird und mit der unteren Abdeckplatte 34 verschlossen wird, die Vorratskammer 26 für einen Tracer, die Mäanderstruktur besitzt, in der der Enzymtracer gelagert wird, sowie die Meßzelle, die ihrerseits aus der Reaktionsfläche 24, die auf einem Grundkörper 47 angeordnet ist und auf der Antikörper immobilisiert sind, und dem fluidischen Zu- und Abführsystem 31, 32 besteht.

Im montierten Zustand liegt die obere Abdeckplatte 27 des Meßchips 2 auf der Oberfläche der Ausnehmung 10 der Basisplatte 3 auf. Dadurch wird einerseits der Vorratsraum für den Tracer verschlossen und andererseits wird dadurch oberhalb der Reaktionsfläche 24 ein Reaktionsraum gebildet, durch den während des Nachweisverfahrens die verschiedenen Fluide fließen. Die Abdeckplatte 27 ist transparent ausgeführt, damit die auf der Reaktionsfläche 24 emittierten Lichtsignale den Reaktionsraum bzw. den Meßchip in Richtung des optischen Detektors 4 verlassen können.

Die Probenvorratskammer 35, die Vorratskammer 26 für den Enzymtracer und die Meßzelle werden mittels laserverschweißter Abdeckplatten verschlossen. Die Probenvorratskammer 35 ist konisch geformt, um eine vollständige Entleerung zu ermöglichen. Alle Fluidein- und -ausgänge (28, 29, 30; 31, 32) sind durch spezielle Silikondichtungsscheiben als Dichtung 25 verschlossen, die eine einfache und luftfreie Befüllung der Vorratskammer 26 und der Meßzelle mittels Nadelspritzen erlauben. Der Meßchip 2 wird dann mittels Paßstiften an die Basisplatte 3 montiert. Die fluidischen Verbindungen werden über Injektionsnadeln, die in der Basisplatte montiert sind, hergestellt.

5 zeigt eine perspektivische Ansicht des Meßchips 2, wobei der Grundkörper 47 mit der Reaktionsfläche 24 und die Dichtungen 25 bereits eingesetzt sind. Zur Verdeutlichung des genauen Aufbaus des Meßchips 2 sind in den 6 und 7 eine perspektivische Schnittansicht bzw. eine Schnittansicht durch den Meßchip 2 gezeigt. Hier ist deutlich die Probenvorratskammer 35 für die Probe zu erkennen, die durch die untere Abdeckplatte 34 verschlossen ist. Die Probe kann durch den Ausgang 28, der über die Dichtung 25 verschlossen ist, entnommen werden. Die mäanderförmige Vorratskammer 26 für den Enzymtracer weist einen Eingang 29 und einen Ausgang 30 auf. Soll der Enzymtracer aus der Vorratskammer 26 entnommen werden, so kann über den Eingang 29 beispielsweise eine Pufferlösung zugeführt werden, die durch die mäanderförmige Vorratskammer 26 fließt und an dem Ausgang 30 wieder entnommen wird.

In gleicher Weise besteht die Meßzelle aus dem Grundkörper 47 mit der Reaktionsfläche 24 und einem Fluidzuleitungskanal 31 sowie einem Fluidableitungskanal 32. Die beiden Kanäle 31, 32 sind jeweils durch eine Dichtung 25 verschlossen. Ein gewünschtes Fluid kann über die Reaktionsfläche 24 geleitet werden, indem eine Injektionsnadel durch die Dichtung 25 des Fluidzuleitungskanals 31 der Meßzelle dringt und das Fluid abgibt, wobei gleichzeitig über eine weitere Injektionsnadel, die durch die Bohrung in der Abdeckplatte 27 und durch die Dichtung 25 in den Fluidableitungskanal 32 dringt, das Fluid wieder abfließen kann.

In der 8 ist eine vergrößerte Darstellung der Meßzelle einschließlich des Grundkörpers 47 mit der Reaktionsfläche 24 gezeigt. Die Reaktionsfläche 24 hat eine quadratische Grundfläche, die derart ausgewählt wurde, daß sie exakt dem optischen Eingang des als Photomultiplier ausgebildeten Detektors 4 entspricht. Die Reaktionsfläche 24 weist eine Vielzahl von in Reihen angeordneten Erhöhungen 36 in Form von Pyramiden mit quadratischer Grundfläche auf. Diese Reihen sind nicht in Richtung der Hauptfließrichtung 38 der Meßzelle angeordnet, sondern diagonal hierzu. Mit anderen Worten sind die Seiten der quadratischen Grundfläche der einzelnen Pyramiden derart orientiert, daß sie mit der Fluidströmungsrichtung 38 des Fluids über der mit Antikörpern beladenen Fläche einen Winkel einschließen und zwar vorzugsweise zwischen 30° und 60°, besonders bevorzugt zwischen 40° und 50°.

Außerdem sind in der Fluidzuführung drei Strömungsbrecher 39 angeordnet, die einen trapezförmigen Querschnitt haben und der gleichmäßigen Verteilung des Fluids dienen.

In der bevorzugten Ausführungsform haben die Pyramiden ein Aspektverhältnis von etwa 2, das heißt, die Höhe der Pyramide ist etwa doppelt so groß wie die Länge der Seiten der quadratischen Basisfläche. Es hat sich gezeigt, daß dieses Aspektverhältnis zu einem maximalen Wert der Lichtemission führt. Dies liegt im wesentlichen an der deutlich vergrößerten Oberfläche bezogen auf die konstante Grundfläche. Zum anderen liegt dies jedoch auch daran, daß Pyramiden mit einem Aspektverhältnis von 2 geeignet geneigte Seitenflächen haben, so daß diese dazu beitragen, daß das Lumineszenzlicht an den reflektierend beschichteten Seitenflächen der Pyramiden zum überwiegenden Teil in Richtung des optischen Detektors reflektiert werden.

Der genaue Ablauf des Verfahrens wird deutlich anhand der schematischen Ablaufdiagramme in den 9 bis 13. Die in den 9 bis 13 gezeigte Anordnung entspricht dem Verlauf der Fluidkanäle in der Basisplatte 3, der in 3 gezeigt ist.

In 9 ist eine erste mögliche Einstellung gezeigt, in der die Fluidkanäle in der Basisplatte 3 mit Pufferlösung gespült werden können. Dazu werden die Ventile 40, 42, 43 und 44 geschlossen, während die Ventile 41 und 45 geöffnet werden. Dies hat zur Folge, daß über den Fluideingang für Puffer 14 Pufferlösung durch das Ventil 41 zu dem Ventil 45 und zu dem Abwasserausgang 15 fließen kann.

Nachdem die Fluidkanäle entsprechend vorgereinigt wurden, kann das eigentliche Meßverfahren beginnen. Dazu werden die Ventile 41 und 45 geschlossen und kurz darauf die Ventile 42 und 44 geöffnet. Dies hat zur Folge, daß die fluide Probe aus dem Probenvorratsraum 35 über das Ventil 42 und das Ventil 44 durch die Meßzelle und insbesondere über die Reaktionsfläche 24 in Richtung des Abwasserausgangs 15 fließt. Da die Reaktionsfläche in dieser Ausführungsform immobilisierte Antikörpern aufweist, wird sich der zu detektierende Analyt an den Antikörpern binden. Diese Situation ist in 10 dargestellt.

Nach einer gewissen Zeit wird, wie dies in 11 gezeigt ist, das Ventil 42 geschlossen und die Ventile 41, 43 und 44 werden gegebenenfalls nach einem nochmaligen Spülvorgang, wie er in 9 gezeigt ist, geöffnet. Dies bewirkt, daß die Pufferlösung über das Ventil 41 und das Ventil 43 in die mäanderförmige Vorratskammer für den Enzymtracer eindringt, diesen aus der Vorratskammer herausspült und über das Ventil 44 in die Meßzelle und dort über die Reaktionsfläche 24 leitet, bevor der Enzymtracer in Richtung des Abwasserausgangs 15 geleitet wird. Der Enzymtracer bindet dabei an den noch ungebundenen Antikörpern, die auf der Reaktionsfläche 24 immobilisiert sind.

Im nächsten Schritt, den 12 veranschaulicht, werden die Ventile 41 und 43 wieder geschlossen und das Ventil 40 wird geöffnet. Dies hat zur Folge, daß die beiden Reaktionsmittel, die in der gezeigten Ausführungsform aus Luminol und Wasserstoffperoxid bestehen, über die beiden Eingänge 12 und 13 in den Mikromischer 16 fließen, dort geeignet vermischt werden und die resultierende Mischung dann über das Ventil 40 und das Ventil 44 in die Meßzelle geleitet wird. Dort fließt die Mischung über die Reaktionsfläche 24 und verläßt die Meßzelle dann in Richtung Abwasserausgang 15. Sollte sich Enzymtracer an den Antikörpern auf der Reaktionsfläche 24 gebunden haben, so kommt es zu einer Chemilumineszenreaktion zwischen dem Luminol und dem Enzymtracer. D. h. es werden Lichtsignale erzeugt, die die Reaktionsfläche 24 durch die transparente Abdeckplatte 27 und durch das Durchgangsloch 11 in der Basisplatte 3 in Richtung des Detektors 4 verlassen und dort detektiert werden. Die erfaßte Lichtmenge ist direkt proportional zu der Anzahl der Antikörper, an denen kein Analyt gebunden ist.

Nach Ablauf der Reaktion kann ein gegebenenfalls noch in der Probenkammer 35 verbleibender Probenrest durch Schließen der Ventile 40 und 44 sowie Öffnen der Ventile 42 und 45 über den Abwasserausgang 15 ausgegeben werden (13).

Durch die beschriebene Vorrichtung wird ein stark miniaturisiertes, einfach und kostengünstig herzustellendes portables Meßgerät zur Verfügung gestellt. Insbesondere durch Verwenden einer Reaktionsfläche 24 mit Vertiefungen und/oder Erhöhungen, wird die Meßempfindlichkeit deutlich erhöht.

Darüber hinaus ist ein wesentlicher Aspekt, den Meßchip als Einwegchip auszugestalten, wobei diejenigen chemischen Komponenten, die empfindlich, das heißt verderblich, sind, bereits in der entsprechend vordosierten Menge in dem Meßchip aufgenommen sind.

Es versteht sich daher, daß die beschriebene Ausbildung des Meßchips als Einwegchip, d.h. mit einer Vorratskammer für einen Tracer und/oder mit einer Reaktionsfläche, die für eine Immobilisierung von Antikörpern ausgelegt bzw. vorbereitet ist oder auf der bereits gegen den zu bestimmenden Analyten gerichtete Antikörper immoblisiert sind, auch mit Vorteil in Vorrichtungen eingesetzt werden kann, die keine Reaktionsfläche mit mindestens einer Erhöhung bzw. Vertiefung aufweisen, sondern z.B. eine ebene Reaktionsfläche besitzen.

1Vorrichtung 2Meßchip 3Basisplatte 4optischer Detektor 5, 6, 7, 46Seitenteile 8oberer Teil der Basisplatte 9unterer Teil der Basisplatte 10Ausnehmung 11Durchgang für den Detektor 12, 13Eingänge 14Fluideingang für Puffer 15Abwasserausgang 16Mikromischer 22Bohrungen 23Basisteil des Meßchips 24Reaktionsfläche 25Dichtung 26Vorratskammer für den Tracer 27transparente Abdeckplatte 28Ausgang 29Eingang des Tracer-Vorratsraums 30Ausgang des Tracer-Vorratsraums 31Fluidzuleitungskanal 32Fluidableitungskanal 33Ausnehmung für Meßeinsatz 34untere Abdeckplatte 35Probenvorratskammer 36Erhöhungen 38Fluidströmungsrichtung 39Strömungsbrecher 40–45Ventile 47Grundkörper

Anspruch[de]
  1. Meßchip für die Verwendung in einer Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Probe unter Anwendung einer Lumineszenzreaktion mit einer Basisplatte, einem Meßchip, der für eine Verbindung mit der Basisplatte ausgelegt oder integraler Bestandteil dieser ist, und eine von Fluid überströmbare Reaktionsfläche aufweist, die für die Durchführung der Lumineszenzreaktion auf der Reaktionsfläche ausgelegt ist, mit einem optischen Detektor für das Erfassen von Lichtsignalen von dem Meßchip, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßchip (2) eine Mehrzahl von Erhöhungen (36) oder Vertiefungen aufweist, um die Grundfläche der überströmbaren Reaktionsfläche zu vergrößern und daß der Meßchip eine Vorratskammer (26) für einen Tracer aufweist.
  2. Meßchip nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsfläche (24) eine Mehrzahl von Erhöhungen (36) und/oder Vertiefungen mit im wesentlichen gleicher Form aufweist, die vorzugsweise periodisch angeordnet sind.
  3. Meßchip nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erhöhungen (36) oder Vertiefungen polyederfömig, vorzugsweise pyramidenförmig, pyramidenstumpfförmig, tetraederförmig, keilförmig, obeliskförmig, kegelförmig oder kegelstumpfförmig sind.
  4. Meßchip nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsfläche (24) mehrere Reihen von polyederförmigen, vorzugsweise pyramidenförmigen Erhöhungen (36) oder Vertiefungen aufweist.
  5. Meßchip nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Erhöhungen pyramidenförmig mit quadratischer Grundfläche sind.
  6. Meßchip nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der Höhe zur Seitenlänge der Grundfläche mehr als 0,25 beträgt, vorzugsweise zwischen 0,5 und 3, besonders bevorzugt zwischen 1,75 und 2,5 liegt.
  7. Meßchip nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsfläche (24) auf einem Grundkörper (47) ausgebildet ist, der aus einem Polymer, vorzugsweise aus Polymethylvinyl und besonders bevorzugt aus Polymethylmethacrylat besteht.
  8. Meßchip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsfläche (24) zumindest abschnittsweise mit einem Metall, vorzugsweise mit Gold beschichtet ist.
  9. Meßchip nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß unter der Metall- oder Goldschicht Chrom oder Titan, vorzugsweise Titan, als Haftvermittler angeordnet ist.
  10. Meßchip nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Fluidströmungsrichtung (38) vor der Reaktionsfläche (24) ein Fluidzuleitungskanal (31) und hinter der Reaktionsfläche (24) ein Fluidableitungskanal (32) vorgesehen ist.
  11. Meßchip nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßchip (2) eine Probenvorratskammer (35) aufweist.
  12. Meßchip nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßchip (2) eine Vorratskammer (26) für den Tracer aufweist, die vorzugsweise einen Zuleitungskanal (Eingang 29) und einen Ableitungskanal (Ausgang 30) besitzt.
  13. Meßchip nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorratskammer (26) für den Tracer einen mäanderförmigen Abschnitt aufweist.
  14. Meßchip nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorratskammer (26) für den Tracer für die Aufnahme einer Tracermenge für eine quantitative Bestimmung eines Analyten bemessen ist.
  15. Meßchip nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Zuleitungskanal oder zumindest ein Ableitungskanal mit einer Dichtung (25), vorzugsweise einer Silikondichtung oder einem Septum, verschlossen ist.
  16. Meßchip nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsfläche (24) für eine Immobilisierung von Antikörpern ausgelegt und/oder vorbereitet ist.
  17. Meßchip nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsfläche (24) immobilisiertes Protein A oder ein anderes Reagenz, das selektiv Antikörper bindet, aufweist.
  18. Meßchip nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß gegen den zu bestimmenden Analyten gerichtete Antikörper auf der Reaktionsfläche (24) immobilisiert sind.
  19. Meßchip nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper monoklonale, polyklonale oder rekombinante Antikörper sind.
  20. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Probe mit Hilfe einer Lumineszenzreaktion, die eine Basisplatte (3), einen Meßchip (2) nach einem derq Ansprüche 1 bis 19 und einen optischen Detektor (4) für das Erfassen von Lichtsignalen von dem Meßchip (2) aufweist.
  21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßchip (2) von der Basisplatte (3) abnehmbar und vorzugsweise austauschbar ist.
  22. Vorrichtung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Basisplatte (3) Vorratsbehälter und/oder Anschlüsse für Reagenzien und Pufferlösungen aufweist.
  23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Basisplatte (3) Fluidmischer und/oder Ventile (4045) und/oder Pumpen vorgesehen sind.
  24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Detektor (4) ein Photomultiplier ist.
Es folgen 13 Blatt Zeichnungen






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