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Dokumentenidentifikation DE69831147T2 29.06.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000977049
Titel VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG VON BILDERN UND SPEKTREN DES EXTRAZELLULÄREN pH UNTER VERWENDUNG DER MAGNETISCHEN RESONANZ MIT HILFE VON 1H UND 19F ENTHALTENDEN EXTRINSISCHEN INDIKATOREN
Anmelder Universidad Nacional de Educacion a Distancia, Madrid, ES;
Consejo Superior de Investigaciónes Científicas, Madrid, ES;
The University of Arizona, Tucson, Ariz., US;
The Johns Hopkins School of Medicine, Tucson, Ariz., US
Erfinder BALLESTEROS GARCIA, Paloma, 28015 Madrid, ES;
GIL CONZALEZ, M Soledad, 28015 Madrid, ES;
ZADERENKO PARTIDA, Paula, 28015 Madrid, ES;
CERDAN GARCIA-ESTELLER, Sebastián, 28029 Madrid, ES;
ALVAREZ PEREZ, Jose, 28029 Madrid, ES;
GILLIES, J.,, Robert, Tucson, US;
NATARAJAN, Raghunand, Tucson, US;
VAN SLUIS, Robert, Tucson, US;
BHUJWALA, Zaver, Tucson, US
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69831147
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 26.02.1998
EP-Aktenzeichen 989041801
WO-Anmeldetag 26.02.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/ES98/00045
WO-Veröffentlichungsnummer 0098039664
WO-Veröffentlichungsdatum 11.09.1998
EP-Offenlegungsdatum 02.02.2000
EP date of grant 10.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.06.2006
IPC-Hauptklasse G01R 33/48(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61B 5/055(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Fachgebiet der Erfindung
  • Physikalische Medizin
  • Pharmazie
  • Biomedizinische Forschung
  • Bildgebenden Diagnoseverfahren
Stand der Technik

Die biomedizinischen Anwendungen der magnetischen Resonanz (MR) haben in den letzten Jahrzehnten eine wichtige Entwicklung durchlaufen (Andrew, E. R., Byders, G., Griffiths, J., Iles, R., und Styles, P., Hrsg., (1990), Clinical Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy; John Wiley and Sons, New York). Sowohl die magnetische Resonanz-Spektroskopie (magnetic resonance spectroscopy, MRS) als auch Bildgebung (imaging, MRI) wurden für nicht-invasive Studien von pathologischen und physiologischen Prozessen bei Tieren und auch bei Menschen genutzt (Gillies, R. J., Hrsg., (1994), NMR in Physiology and Biomedicine, Academic Press, New York). Weiterhin konnten die Anwendungen der MR auch so erweitert werden, dass pathologische und physiologische Prozesse auf der Ebene von Zellen untersucht wurden (Gillies, R. J., Gallons, J. P., McGovern, K. A., Scherrer, P. G., Lien, Y. H., Job, C. R., Chapa, F., Cerdan, S., und Dale, B. E., (1993), NMR in Biomedicine 6: 95–104). Zusammengenommen boten diese Fortschritte die Möglichkeit, mit Hilfe der MR einige grundlegende Aspekte der Biologie und der Medizin zu untersuchen, z.B. die Proliferation und Differenzierung von Zellen oder die Tumortransformation. Mit diesen Prozessen gehen Änderungen im intra- und extrazellulären pH-Wert einher. Außerdem ist der pH-Wert in anderen grundlegenden Prozessen eine entscheidende physiologische Variable, z.B. bei der körperlichen Bewegung und Muskelermüdung, der Steuerung des Stoffwechsels und der Übertragung von Hormoninformationen (Roos, A., und Boron, W. F., (1981), Physiol. Rev. 61: 296–696).

Die intrazelluläre Proton-Konzentration resultiert aus einem Gleichgewicht zwischen einer Reihe von Faktoren, umfassend die intrazelluläre Proton-Produktion und der intrazelluläre Proton-Verbrauch, die Proton-Aufnahme aus dem extrazellulären Medium und die Abgabe dahin, und die intrazelluläre Proton-Pufferkapazität (Molde, M., Cruz, F., Chapa, F., Cerdan, F., und Cerdan, S., (1995), Quart. Mag. Res. in Biol. Med. 2: 5–17). Wenn man in Betracht zieht, dass die Letztere unter normalen Bedingungen ziemlich konstant ist, wird ein Anstieg der intrazellulären Proton-Produktion vermutlich entweder durch Abgabe von Säure an das extrazelluläre Medium oder durch Aufnahme von Base daraus ausgeglichen; wohingegen eine erhöhte intrazelluläre Basen-Produktion durch den entgegengesetzten Mechanismus kompensiert werden könnte. Somit zeigen Änderungen im extrazellulären pH-Wert normalerweise eine Änderung im intrazellulären pH-Wert an, und durch Messen des extrazellulären pH-Werts wird ein geeignetes Verfahren bereitgestellt, um jede Änderung in der intrazellulären pH-Homöostase zu überwachen.

Die zurzeit verfügbaren Verfahren zum Bestimmen des pH-Werts in biologischen Proben umfassen potentiometrische Verfahren (pH-Elektroden), radiometrische Techniken, optische Methoden und magnetische Resonanz (Henderson, R. M., und Graf, J., (1988), in: pH Homeostasis: Mechanisms and Control, (Häussinger, D., Hrsg.), Academic Press, S. 5–26). Im Prinzip kann mit jedem dieser Verfahren ausschließlich der extrazelluläre pH-Wert gemessen werden, vorausgesetzt, dass eine nicht-permeable molekulare Sonde verwendet wird, z.B. eine radioaktive, chromophore, fluoreszierende, phosphoreszierende oder eine aktive Sonde, im Fall der MR. Jedoch macht es von allen diesen Verfahren nur die MR möglich, nicht-invasive bildliche Darstellungen des gesamten Volumens von optisch trüben Proben zu gewinnen. Aus diesem Grund ist die MR das am besten geeignete Verfahren für nicht-invasive Bestimmungen des extrazellulären pH-Werts in biologischen Proben. In diesem Patent beschreiben wir die Verwendung und Anwendungen einer neuen Reihe von Indikatormolekülen, die es möglich machen, den intrazellulären und extrazellulären pH-Wert anhand von MRS- und MRI-Methoden zu bestimmen.

In früheren Verfahren wurden hauptsächlich die 31P-MRS und die chemische Verschiebung (chemical shift) des anorganischen Phosphats verwendet, um den intrazellulären pH-Wert in Zellsuspensionen, perfundierten Organen, Gewebeproben, intakten Tieren und sogar in Menschen zu messen (Moon, R. B., und Richards, J. H., (1973), J. Biol. Chem. 248: 7276–7278). Eine Modifikation dieses Verfahrens, angewendet an Zellsuspensionen, hat 1D-31P-MRS-Messungen ausschließlich des extrazellulären pH-Werts möglich gemacht, indem Phosphonate eingesetzt werden, für die die Plasmamembran nicht permeabel ist (Guillies, R. J., Liu, Z., und Bhujawalla, Z., (1994), Am. J. Physiol. 267: C195–C203). Andereiseits wurde früher über lokalisierte 31P-MRS-Techniken berichtet, wodurch 31P-NMR-Spektren aus einer räumlich beschränkten Region (Voxel) innerhalb eines intakten Tiers erhalten werden und auf diese Weise der durchschnittliche intrazelluläre pH-Wert für diese bestimmte Region bestimmt wird, indem die chemische Verschiebung des Pi verwendet wird (Aue, W. P., (1986), Rev. Mag. 31P-NMR-Spektren gleichzeitig von einer Ansammlung von nebeneinander liegenden Voxel herstellen, die das 3-D-Volumen der Probe vollständig überspannen, wodurch dreidimensionale Karten der pH-Verteilung in der ganzen Probe bereitgestellt werden (Brown, T. R., Kincaid, B. M., und Ugurbil, K., (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3523–3526; Maudsley, A. A., Hilal, S. K., Perman, W. H., und Simon, H. E., (1983), J. Res. Med. 1: 21–72; Ordidge, R. J., Connelly, A., und Lohman, J. A. B., (1986), J. Mag. Res. 66: 283–294; Frahm, J., Bruhn, H., Gyngell, M. N. L., Merboldt, K. D., Hanike, W., und Sauter, R., (1989), Mag. Res. Med. 9: 79–93). Außerdem wurden 31P-MRS-Methoden für eine Multivoxel-Bildgebung entwickelt. Mit diesen Techniken lassen sich Mag. Res. 66: 283–294; Vigneron, D. B., Nelson, S. J., Nat, R., Murphy-Boesch, J., Kelley, D. A. C., Kessler, H. B., Brown, T. R., und Taylor, J. S., (1990), Radiology 177: 643–649; Shungu, D. C., und Glickson, J. D., (1993), Mag. Res. in Med. 30: 661–671; Shungu, D. C., und Glickson, J. D., (1994), Mag. Res. in Med. 32: 277–284).

Trotz dieses Fortschritts stellt die geringe Empfindlichkeit des 31P-Kerns einen begrenzenden Faktor für die Anwendung der 31P-MRS in der pH-Bestimmung dar. So sind bei 31P-MRS-Verfahren typischerweise lange Erfassungszeiten und außerdem eine große Voxel-Größe erforderlich, um ein gutes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis zu erhalten. Diese zwei Anforderungen reduzieren die räumliche und zeitliche Auflösung der pH-Bestimmung durch 31P-MRS stark. Beide Einschränkungen können abgeschwächt werden, indem 1H oder 19F eingesetzt wird, da diese Kerne in der MR von Natur aus empfindlicher sind als 31P (Gadian, D. G., (1982), Nuclear Magnetic Resonance and its application to living systems; Oxford University Press, S. 8). Aufgrund der erhöhten Empfindlichkeit der 1H- (19F-) MRS im Vergleich zur 31P-MRS könnte man Spektren oder 1-D-, 2-D- oder 3-D-Darstellungen mit einem ähnlichen Signal-zu-Rauschen-Verhältnis wie beim 31P-MRS erhalten, jedoch 4- (3-), 16- (12-) oder 64- (43-) mal schneller. Genauso wäre es bei Verwendung von 1H- (19F-) MRS möglich, eine signifikante Reduktion der Voxel-Größe im Vergleich zu der bei der 31P-MRS-Bestimmung erforderlichen Größe zu erhalten, während das gleiche Signal-zu-Rauschen-Verhältnis beibehalten wird. Jedoch ist das Vorliegen von intrinsischen Metaboliten mit der richtigen 1H-Resonanz ziemlich außergewöhnlich (Yoshisaki, K., Seo, Y. und Nishikawa, H., (1981), Biochem. Biophys. Acta 678: 283–291), und es gibt keine natürlichen Metaboliten, die 16F enthalten. Somit ist es durchweg ein Muss, auch um die 1H- oder 16F-MRS- (oder MRI-) Technik zum Bestimmen des intrazellulären pH-Werts erfolgreich durchzuführen, dass extrinsische Sonden verwendet werden, die als pH-empfindliche Kerne 1H (Rabenstein, D. L., und Isab, A., (1982), Anal. Biochem. 121: 423) oder 16F enthalten (Deutsch, C., Taylor, J. S., und Wilson, D. F., (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7944).

Kurze Beschreibung der Erfindung

Ein Teil unserer Arbeitsgruppe hat kürzlich über die Synthese einer neuen Reihe von Indikatoren für 1H-NMR-Messungen des intrazellulären pH-Werts, des extrazellulären pH-Werts und des Zellvolumens in Zellsuspensionen berichtet (Gil, M. S., Cruz, F., Cerdan, S., und Ballesteros, P., (1992), Bioorg. Med. Chem. Lett. 2: 1117–1722; Gil, M. S., Zaderenko, P., Cruz, F., Cerdan, S., und Ballesteros, P., (1994), Bioorg. Med. Chem. 2: 305–314; Zaderenko, P., Gil, M. S., Ballesteros, P., und Cerdan, S., (1994), J. Org. Chem. 59: 6268–6273). Im vorliegenden Patent beschreiben wir einige pharmakologische und toxikologische Eigenschaften dieser Moleküle hinsichtlich ihrer Verwendung als pH-Indikatoren in Zellkulturen und intakten Tieren; außerdem erklären wir die Verfahren, die durchgeführt werden, um pH-Darstellungen aus sowohl Modellsystemen in vitro als auch aus Mäusen, die RIF-1-Tumoren enthalten, in vivo zu erhalten. Die Verwendung dieser neuen Indikatoren, zusammen mit 1H-MR-Techniken, z.B. der Chemical-Shift-Bildgebung (chemical shift imaging, CSI) oder der spektroskopischen Bildgebung (spectroscopic imaging, SI), führt im Vergleich zu den früheren, auf 31P-MR basierenden Verfahren zu einer deutlichen Verkürzung der Erfassungszeit und einer signifikant besseren Auflösung bei pH-Messungen.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Diagramm 1 zeigt die Strukturen einiger Indikatormoleküle, die für die pH-Bestimmung mit 1H-MRS geeignet sind. Imidazol (1, R1=R2=H) und Imidazol-1-yl-essigsäure (4, R1=R2=H) sind die am besten geeigneten permeablen Sonden, wenn gleichzeitige intra- und extrazelluläre pH-Bestimmungen vorgesehen sind; wohingegen (±)-3-(Ethoxycarbonyl)-2-Imidazol-1-yl-propionsäure (9, R1=R2=H) eine nicht-permeable Sonde für extrazelluläre pH-Messungen ist.

Abbildung 1:
worin R1 und R2 ein H oder einen Alkylsubstituenten bedeuten, der 19F umfassen kann. R stellt einen Alkylsubstituenten dar.

Die Verfahren zum Herstellen einiger dieser Moleküle und ihre NMR-Eigenschaften wurden früher ausführlich beschrieben (Gil, M. S., Cruz, F., Cerdan, S., und Ballesteros, P., (1992), Bioorg. Med. Chem. Lett. 2: 1117–1722; Gil, M. S., Zaderenko, P., Cruz, F., Cerdan, S., und Ballesteros, P., (1994), Bioorg. Med. Chem. 2: 305–314; Zaderenko, P., Gil., M. S., Ballesteros, P., und Cerdan, S., (1994), J. Org. Chem. 59: 6268–6273). Im Allgemeinen hängt das Verfahren zum Messen des pH-Werts mit einer dieser Substanzen davon ab, die chemische Verschiebung seines H2-Protons zu bestimmen, das im biologischen Medium als eine „informative Resonanz" wirkt, und diese anschließend mit der chemischen Verschiebung des gleichen Protons in Modelllösungen mit einem bekannten pH-Wert zu vergleichen. 1 zeigt den Zusammenhang zwischen der chemischen Verschiebung des H2-Protons der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) und dem pH-Wert. Dieses Verfahren kann erweitert werden, so dass man bildliche Darstellungen der MR des H2-Protons erhält. Diese bildlichen Darstellungen können entweder durch die selektive Anregung von H2 und das anschließendes Codieren als bildliche Darstellungen (Chemical-Shift-Bildgebung, CSI) oder als Alternative durch eine nicht-selektive Anregung des gesamten Protonenspektrums in nebeneinander liegenden Voxel, welche die gesamte Probe überspannen (spektroskopische Bildgebung, SI), erhalten werden. Beide Methoden zeigen die räumliche Verteilung der H2-Resonanz dieser Verbindungen innerhalb der Probe und somit die pH-Verteilung.

In der vorliegenden Erfindung beschreiben wir die Verwendung dieser Verbindungen, um 1H-NMR-Darstellungen oder Spektren zu erhalten, die den extrazellulären pH-Wert in zahlreichen biologischen Systemen zeigen, umfassend subzelluläre Organellen, isolierte oder kultivierte Zellen aus Tieren oder Pflanzen, perfundierte Organe, intakte Tiere und Menschen. Insbesondere bei den zwei letzten Systemen ist es erforderlich, dass vorher die mögliche Toxizität und die Pharmakokinetik dieser Verbindungen ermittelt werden, außerdem muss die Wirksamkeit der Verfahren für die pH-Bildgebung in vitro und in vivo zuverlässig gezeigt werden. Das vorliegende Patent beschreibt: 1) die toxikologischen Eigenschaften einiger nützlicher Sonden zum Messen des extrazellulären pH-Werts; 2) die Verteilungskinetik im Blut und die Gewebeaufnahme für die am wenigsten toxische Verbindung in dieser neuen Reihe, und 3) die in vitro- und in vivo-Verfahren für sowohl MR-Chemical-Shift-Bildgebung (CSI) als auch MR-spektroskopische Bildgebung (SI) zum Herstellen von MR-Darstellungen des extrazellulären pH-Werts in Modellproben und in Mäusen, die RIF-1-Tumoren enthalten.

Toxizitätsstudien in Zellkultur und in Mäusen

Die Toxizität der Verbindungen 5 (R1=R2=H, R = Et), 6 (R1=R2=H) und 9 (R1=R2=H, R = Et) wurde in Zellkultur unter Verwendung des im Folgenden beschriebenen Verfahrens festgestellt. NIH 3T3-Maus-Fibroblasten wurden in Dulbecco-modifiziertem essentiellem Medium (DMEM) gezüchtet, das mit 10% fetalem Kälberserum angereichert war (FCS, Hyclone, Logan, Utah, USA). Sobald die Konfluenz erreicht war, wurden die Verbindungen 5 (R1=R2=H, R = Et), 6 (R1=R2=H) und 9 (R1=R2=H, R = Et) zum Kulturmedium zugegeben, so dass eine Endkonzentration im Bereich von 0 bis 20 mM erhalten wurde. Nach 72 Std. Inkubation wurde die Zahl der überlebenden Zellen in der Kultur anhand des Verfahrens von Gillies und Mitarbeitern bestimmt (Gillies, R. J., Didier, N., und Denton, M., (1986), Anal. Biochem. 159: 109–113). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) zeigte keinerlei Toxizität, da die Zahl der lebensfähigen Zellen in Gegenwart von 20 mM der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) sich nicht signifikant von der Kontrolle (0 mM) unterschied. Die Verbindung 5 (R1=R2=H, R = Et) dagegen war sehr toxisch, wobei fast alle Zellen bei der Konzentration von 15 mM abstarben (LD50 6,8 mM). Die Verbindung 6 (R1=R2=H) schließlich erwies sich als mäßig toxisch; sie bewirkte nur bei 20 mM, der höchsten verwendeten Konzentration, eine signifikante Reduktion in der Zahl der lebensfähigen Zellen.

Tabelle 1 Wirkung von steigenden Konzentrationen der Verbindungen 5 (R1=R2=H, R = Et), 6 (R1=R2=H) und 9 (R1=R2=H, R = Et) auf das Überleben von Zellen

Das Überleben von Zellen wurde quantitativ bestimmt, indem die durchschnittliche optische Dichte (ein Index der Zellzahl) gemessen wurde (Gillies, R. J., Didier, N., und Denton, M., (1986), Anal. Biochem. 159: 109–113), wie in Referenz 24 angegeben ist. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD von vier Bestimmungen aus verschiedenen Kulturschalen bei jeder Konzentration dar.

Außerdem wurde die Toxizität (LD50) der Verbindungen 1 (R1=R2=H), 4 (R1=R2=H) und 9 (R1=R2=H, R = Et) in intakten Tieren bestimmt. Die Ergebnisse aus diesen Experimenten sind in Tabelle 2 dargestellt. Männlichen Swiss-Albino-Mäusen (30 bis 40 g Körpergewicht) wurden steigende Dosen der Verbindungen 1 (R1=R2=H), 4 (R1=R2=H) und 9 (R1=R2=H, R = Et) bis zu 3 g/kg Körpergewicht intraperitoneal injiziert. Für jede Verbindung wurden mindestens sieben verschiedene Dosen verwendet, die jeweils an sechs Mäuse verabreicht wurden, die in verschiedenen Käfigen gehalten wurden. Der LD50-Wert wurde eine Woche nach der Injektion anhand des Verfahrens von Miller und Tainter bestimmt (Vallette, G., (1966), Manual of Phamacodynamics; Màsson et Cie, Hrsg., Paris, Vle, S. 70). Die Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et), die aufgrund ihrer NMR-Eigenschaften und ihres Verhaltens in Erythrozytensuspensionen ein sehr nützlicher extrazellulärer pH-Indikator ist, zeigte keinerlei Toxizität bei den hohen Dosen von 3 g/kg Körpergewicht. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Verbindung 4 (R1=R2=H) erhalten. Andererseits erwies sich die Verbindung 1 (R1=R2=H) im getesteten Konzentrationsbereich als toxisch, zeigte jedoch eine relativ hohe LD50. Somit besitzt die Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) toxikologische Eigenschaften, aufgrund derer sie als ein extrazellulärer pH-Indikator eingesetzt werden kann, und zwar sowohl bei Tieren als auch bei Menschen.

Tabelle 2 LD50-Werte für die Verbindungen 1 (R1=R2=H), 4 (R1=R2=H) und 9 (R1=R2=H, R = Et)

Die LD50-Werte wurden durch das Verfahren von Miller und Tainter bestimmt (Vallette, G., (1966), Manual of Pharmacodynamics, Màsson et Cie, Hrsg., Paris, Vle, S. 70).

Pharmakokinetik

2 (Abbildungen A bis F) zeigt die Änderungen in der Konzentration der Verbindungen 1 (R1=R2=H) und 9 (R1=R2=H, R = Et) im Plasma und in verschiedenen anderen Geweben als Funktion der Zeit nach der Verabreichung von 1 mMol dieser Verbindungen an erwachsene Ratten. Für das in 2A dargestellte Experiment wurden 0,5 ml einer 2 mM Lösung entweder der Verbindung 1 (R1=R2=H; pH 7,0) oder der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et; pH 7,0) in die rechte Drosselvene männlicher Wistar-Ratten (277 bis 312 g Körpergewicht) injiziert; Blutproben (0,2 ml) wurden aus der linken Drosselvene vor und 1, 5, 10, 15, 30, 45 und 60 Minuten nach der Injektion entnommen. Die entsprechenden Plasmaproben wurden hergestellt, gefriergetrocknet, in 0,5 ml D2O (99,9% D) resuspendiert und danach durch 1H-NMR analysiert (360, 13 MHz, 22°C, pH 7,2).

Die Clearancerate der Verbindung 1 (R1=R2=H) aus dem Plasma war langsamer (t1/2 = 17 Min.) als die der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et; t1/2 = 6 Min.). Die höchsten Konzentrationen der Verbindungen 1 (R1=R2=H; 1,5 mM) und 9 ((R1=R2=H, R = Et; 6,6 mM) wurden zwei bzw. eine Minute nach der Injektion erreicht. Während des Experiments wurden keine Zeichen von Toxizität nachgewiesen.

Die 2B bis 2F zeigen die Aufnahmekinetiken der Verbindungen 1 (R1=R2=H) und 9 (R1=R2=H, R = Et) durch unterschiedliche Gewebe. In diesen Experimenten wurde 1 mMol entweder der Verbindung 1 (R1=R2=H) oder der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) zum Zeitpunkt 0 in die rechte Drosselvene von Wistar-Ratten (erwachsene männliche Tiere, 250 bis 300 g Körpergewicht) injiziert. Die Tiere wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion getötet, um die Organe von Interesse wie in den Abbildungen angegeben zu isolieren; Organextrakte von Stoffwechselprodukten, die in Perchlorsäure (6%) löslich waren, wurden hergestellt und durch 1H-NMR (360, 13 MHz, 22°C, pH 7,2) wie früher beschrieben analysiert (Gil, M. S., Cruz, F., Cerdan, S., und Ballesteros, P., (1992), Bioorg. Med. Chem. Lett. 2: 1117–1722). Die Konzentrationen der Verbindungen in jedem Gewebe wurden bestimmt, indem die Intensitäten der Imidazol-Protonen der Verbindung mit denjenigen der TSP- (Trimethylsilylpropionat-) Resonanz verglichen wurden, das als innere Referenz verwendet wurde (1 mM), wobei die Werte in allen Fällen durch die Menge der Gewebeprobe korrigiert wurden.

Die Verbindung 1 (R1=R2=H) lag in allen analysierten Geweben vor, wobei sie relativ hohe Konzentrationen (&mgr;Mol/g Körpergewicht) im Gehirn (15,1), Herz (12,1), Skelettmuskel (5,3), in der Niere (12,1) und Leber (2,2,) erreichte. Die Peak-Konzentration der Verbindung 1 (R1=R2=H) war in allen Geweben höher als im Plasma, dies zeigt, dass diese Verbindung dazu neigt, im extrazellulären Raum zu akkumulieren. Die Peak-Konzentrationen von Verbindung 1 (R1=R2=H) wurden nach Verlassen des Plasmas zuerst in der Leber (10 Min.), später im Skelettmuskel und Herz (10 bis 20 Min.) und zuletzt im Gehirn und in der Niere erreicht (30 Min.). Im Gegensatz dazu schien die Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) im Gehirn gar nicht vorzuliegen, während Spurenkonzentrationen in der Leber (< 0,2) und im Herz (< 0,5) nachgewiesen wurden, und sie erreichte ähnliche Konzentrationen wie die Verbindung 1 (R1=R2=H) nur im Skelettmuskel (5,8) und in der Niere (13,9). Die Spurenmengen der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et), die im Herz und in der Leber gefunden wurden, spiegeln höchstwahrscheinlich eine Blut-Verunreinigung dieser Organe wider. Die Peak-Konzentrationen der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) in Geweben wurden zuerst in der Niere (nach 10 Min.) und danach im Skelettmuskel erreicht (nach 20 Min.). Konzentrationen der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) auf einem ähnlichen Niveau wie im Plasma lagen nur in der Niere vor, dies zeigt, dass diese Verbindung ein guter Marker für den extrazellulären Raum ist, insbesondere für Gehirn, Leber und Herz. Schließlich trat die Peak-Konzentration der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) in der Niere schneller auf als die der Verbindung 1 (R1=R2=H), im Skelettmuskel dagegen war es umgekehrt.

pH-Bildgebung durch magnetische Resonanz; 1H-CSI und 1H-SI

3 zeigt ein bildliche Darstellung des pH-Werts, die durch 1H-CSI (Chemical-Shift-Bildgebung) unter Verwendung der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) erhalten wurde. Unseres Wissens ist dies die erste bildliche Darstellung der räumlichen pH-Verteilung, die mit CSI-Techniken und einer extrinsischen Molekularsonde aufgenommen wurde. In diesem Experiment wurde eine 0,3 mM Lösung der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) in Wasser in ein 5-mm-NMR-Röhrchen gegeben, das eine wassergefüllte Kapillare mit Durchmesser von 2 mm enthielt. Eine NMR-Darstellung wurde erfasst, die einem kranzförmigen Schnitt („coronal section") senkrecht zur längsten Röhrchenachse entsprach, wobei eine handelsübliche Mikroimaging-Sonde (Bruker Analytische Messtechnik, Rheinstetten, Deutschland) verwendet wurde, die mit einer 5-mm-Rohrverschraubung und einer senkrecht dazu stehenden magnetischen Gradienten-Vorrichtung ausgestattet war, die aktiv gegen Eddy-Ströme geschützt war. Die Erfassungsbedingungen waren: Stärke von 8,4 Tesla für das statische Magnetfeld (BO), Temperatur von 22°C, 500-&mgr;m-Scheibe senkrecht zur z-Achse, selektive Anregung der H2-Resonanz der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et; 8,04 ppm) durch Spin-Echo-Sequenz und Darstellungs-Codierung des resultierenden Echos unter Verwendung eines konstanten Ablese-Gradienten (x-Achse) bzw. eines variablen Phasen-Gradienten (y-Achse) (Browun, T. R., Kincaid, B. M., und Ugurbil, K., (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3523–3526; Maudsley, A. A., Hilal, S. K., Perman, W. H., und Simon, H. E., (1983), J. Mag. Res. 66: 283–294). Die bildliche Darstellung der chemischen Verschiebung (chemical shift image) zeigt, dass eine H2-Resonanz nur in dem am weitesten außen gelegenen Teil des Röhrchens vorliegt und in keinem signifikanten Ausmaß den Raum verunreinigt, den die koaxiale Kapillare ausfüllt, welche nur Wasser enthält. Aufgrund der gleichmäßigen Verteilung der H2-Resonanz in dem Raum peripher zur Kapillare kann man folgern, dass der pH-Wert von 7,4, der aus der H2-Resonanz der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) abgeschätzt wurde, für die gesamte Lösung homogen ist. Dieses Ergebnis macht deutlich, dass es möglich ist, eine bildliche Darstellung von den Regionen einer Probe mit einem identischen pH-Wert zu erhalten, indem CSI-Verfahren und die H2-Resonanz der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) verwendet werden. Ganz ähnliche Ergebnisse können erhalten werden, wenn die anderen in 1 dargestellten Sonden verwendet werden, oder andererseits können diese Ergebnisse auch unter Verwendung neuer Sonden mit 19F zusammen mit 19F-CSI noch erweitert werden.

Schließlich wurden Experimente mit spektroskopischer Bildgebung (SI) unter Verwendung der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) in Tumor-enthaltenden Mäusen durchgeführt. Für diesen Zweck wurden sechs bis acht Wochen alte C3H/Hen-Mäuse am Rücken subkutan mit 0,5 ml Hank-Puffer, enthaltend 1 × 106 Zellen eines durch Bestrahlung induzierten Fibrosarkoms (RIF-1), geimpft. Man ließ die Tumoren in einer bis zwei Wochen bis zu einem Endvolumen von 400 bis 900 mm3 wachsen, wie durch orthogonale 3-D-Messungen der Tumoren bestimmt wurde. Als Präparat für das Experiment der spektroskopischen Bildgebung erhielten die Mäuse eine intraperitoneale Injektion der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et; 0,5 ml einer 1 M Lösung, pH 7,0). Zwei bis fünf Minuten nach der Injektion wurden die Mäuse mit Cetamin (50 mg/kg) und Acepromazin (5 mg/kg) anästhesiert und danach in einer Haltevorrichtung für Tiere immobilisiert, die mit eine 1H-Zylinderspule ausgestattet war, die in einem horizontalen Magneten von 4,7 Tesla verwendet werden kann. Unter die anästhesierten Mäuse legte man einen Beutel mit warmem zirkulierendem Wasser, so dass ihre Körpertemperatur konstant gehalten werden konnte.

Sowohl die Haltevorrichtung für Tiere als auch die 1H-Spule wurden für die allgemeine 1H-Spektroskopie und Bildgebung entwickelt und stellen keine charakteristische Anordnung dar, die als spezifisch für die Verwendung von Imidazolderivaten als extrazelluläre pH-Sonden angesehen werden kann. Jede beliebige andere gleichwertige Sonde oder Konstruktion kann genauso einfach für diesen Zweck verwendet werden. Die spektroskopische Darstellung wurde unter Verwendung der BASSALE-Sequenz erfasst (Shungu, D. C., und Glickson, J. D., (1993), Mag. Res. in Med. 30: 661–671; Shungu, D. C., und Glickson, J. D., (1994), Mag. Res. in Med. 32: 277–284).

Die in 4 gezeigte spektroskopische Darstellung (spectroscopic image, SI) wurde unter Verwendung von Voxel von 2 × 2 × 4 mm3 erhalten. Jedes Spektrum (x1, y1) bis (x12, y12) stellt ein anderes Voxel innerhalb des Tumors dar. Die obere Abbildung (12 ppm bis 5,5 ppm) zeigt die räumliche Verteilung von einer der Resonanzen der Imidazol-Protonen der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) (vgl. die Voxel x10-y8, x11-y8, x10-y7 und x11-y7). Die untere Abbildung zeigt die Resonanzverteilung von Wasser (bei 4,7 ppm) für die gleichen Voxel.

Für jedes Voxel kann ein pH-Wert aus den Spektren der oberen Abbildung und den Titrationskurven der chemischen Verschiebung der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) gegenüber dem pH-Wert berechnet werden (20, vgl. 1). Wenn man berücksichtigt, dass die chemischen Verschiebungen dieses Protons nicht in jedem Voxel gleich sind und dass die Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) im extrazellulären Raum verbleibt, kann man sagen, dass die Schwankungen in der chemischen Verschiebung der Verbindung 9 zwischen verschiedenen Voxel die pH-Heterogenität in verschiedenen Bereichen des Tumors anzeigen.

Zusammenfassend zeigen die in diesem Patent dargestellten Ergebnisse ein neues Verfahren zur Bildgebung der extrazellulären pH-Verteilung in nicht-transparenten biologischen Proben unter Verwendung einer neuen Reihe von extrinsischen Indikatoren in Verbindung mit Magnetresonanz-Methoden. Wir zeigen, dass einige dieser Indikatoren nicht toxisch sind und pH-Bestimmungen durch Verfahren der Chemical-Shift-Bildgebung (CSI) oder der spektroskopischen Bildgebung (SI) in Volumina von bis zu 0,2 &mgr;l mit einer Pixel-Auflösung von 20 × 20 &mgr;m in einem Magnetfeld von 8.4 Tesla möglich machen. Die Ergebnisse, die bei der Anwendung dieses Verfahrens in vivo bei Tumor-enthaltenden Mäusen erhalten wurden, sind der erste Beweis für eine in situ-pH-Heterogenität in RIF-1-Tumoren, die den C3H/Hen-Mäusen implantiert wurden.

Genaue Beschreibung der Zeichnungen

1: Titrationskurve der Verbindung 9 (R1=R2=H, R = Et) in D2O (99,9% D). Die chemischen Verschiebungen (&dgr;) des H2-Protons wurden durch 1H-MRS (360, 13 MHz, 22°C) mit Bezug auf einen inneren TSP bei 0 ppm gemessen. Die pH-Messungen wurden nicht auf die Wirkung von D korrigiert.

2: Plasma- und Gewebekonzentrationen der Verbindungen 1 (R1=R2=H; leere Kreise) und 9 (R1=R2=H, R = Et; gefüllte Kreise) nach intravenöser Injektion von 1 mMol jeder Verbindung in männliche Wistar-Ratten. A: Plasma, B: Leber, C: Herz, D: Skelettmuskel (linker Gastrocnemius), E: Gehirn und F: Niere.

1:
  • Verbindung 9:
  • Chemische Verschiebung (&dgr;)
2:
  • A. Plasma

    &mgr;Mol Verbindung 1 oder 9/ml Plasma

    Zeit (Min.)
  • B. Herz

    &mgr;Mol Verbindung 1 oder 9/Nassgewicht

    Zeit (Min.)
  • C. Gehirn

    &mgr;Mol Verbindung 1 oder 9/Nassgewicht

    Zeit (Min.)
  • D. Leber

    &mgr;Mol Verbindung 1 oder 9/g Nassgewicht

    Zeit (Min.)
  • E. Skelettmuskel

    &mgr;Mol Verbindung 1 oder 9/g Nassgewicht

    Zeit (Min.)
  • F. Niere

    &mgr;Mol Verbindung 1 oder 9/Nassgewicht

    Zeit (Min.)

3: Bildliche Darstellung von pH 7,2 eines Modellobjekts. Die bildliche Darstellung wurde unter Verwendung einer herkömmlichen Spin-Echo-Sequenz mit selektiver Anregung des H2-Proton-Signals (8,08 ppm) in einem kranzförmigen Schnitt mit einer Dicke von 500 &mgr; erhalten (z-Achse): In der Zeitdomäne wurden 256 Echos erhalten, von denen jedes 256 Punkte pro Echo enthielt, in Gegenwart eines konstanten Ablesegradienten (x-Achse) bzw. 256 Vergrößerungen des Phasengradienten (y-Achse). Die bildliche Darstellung wurde nach einer zweidimensionalen Fourier-Transformation der resultierenden Matrix (256 × 256) anhand einer Größenordnungs-Berechnung erhalten. Die Voxel-Größe ist (x, y, z) 20 &mgr;, 20 &mgr;, 20 &mgr; (0,2 &mgr;l Volumen, enthaltend 60 nMol der Verbindung 9). Erfassungszeit: etwa 60 Minuten.

4: Spektroskopische bildliche Darstellung (SI) der Verteilung von Verbindung 9 und Wasser (B) in einem in C3H/Hen-Mäuse implantierten RIF-1-Tumor. Die bildliche Darstellung wurde bei 4,7 Tesla erhalten.


Anspruch[de]
  1. Verwendung einer Imidazolverbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    worin

    R1 und R2 H oder ein Alkylsubstituent ist, welcher 19F umfassen kann; und

    R Alkyl ist;

    als Indikator in einem Verfahren zum Erhalten von bildlichen Darstellungen bzw. Bildern des extrazellulären oder intrazellulären pH in biologischen Systemen, durch magnetische Resonanz,

    wobei das Verfahren ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Protonen-Magnetresonanz-Chemical-Shift-Bildgebung (proton magnetic resonance chemical shift imaging, 1H CSI), Protonen-Magnetresonanz-spektroskopischen Bildgebung (proton magnetic resonance spectroscopic imaging, 1H SI), Fluor-Magnetresonanz-Chemical-Shift-Bildgebung (fluorine magnetic resonance chemical shift imaging, 19F CSI), Fluor-Magnetresonanz-spektroskopischen Bildgebung (fluorine magnetic resonance spectroscopic imaging, 19F SI) und Kombinationen davon.
  2. Verwendung einer Imidazolverbindung, definiert in Anspruch 1, bei der Herstellung von Zusammensetzungen oder Lösungen für ein Verfahren zum Erhalten von bildlichen Darstellungen bzw. Bildern des extrazellulären oder intrazellulären pH in biologischen Systemen durch magnetische Resonanz, nach Anspruch 1, wobei das Verfahren ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Protonen-Magnetresonanz-Chemical-Shift-Bildgebung (1H CSI), Protonen-Magnetresonanz-spektroskopischen Bildgebung (1H SI), Fluor-Magnetresonanz-Chemical-Shift-Bildgebung (19F CSI), Fluor-Magnetresonanz-spektroskopischen Bildgebung (19F SI) und Kombinationen davon.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Imidazolverbindung als extrinsischer Indikator beim Erhalten von bildlichen Darstellungen bzw. Bildern des extrazellulären pH verwendet wird.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Imidazolverbindung als Indikator, der in dem intrazellulären Raum eingeschlossen bleibt, beim Erhalten von bildlichen Darstellungen bzw. Bildern des intrazellulären pH verwendet wird.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Imidazolverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
    und
    worin

    R1 und R2 H ist; und

    R Et ist.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei die Imidazolverbindung
    ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, wobei der pH der extrazelluläre pH ist und eine Physiopathologie von beliebigen aus der Gruppe von Mikroorganismen, subzellulären Organellen, isolierten Zellen, kultivierten Zellen, perfundierten Organen, intakten Tieren und Menschen anzeigt.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3 und 7, wobei der extrazelluläre pH infolge von physiologischen, pathologischen oder therapeutischen Situationen modifiziert ist.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, 7 und 8, wobei der extrazelluläre pH infolge von beliebigen aus der Gruppe von Muskeldystrophien, ischämischen Pathologien, einer Reaktion auf Therapien; einer gutartigen oder bösartigen Tumortransformation, einer Metastase bzw. Metastasierung und einer Tumorreaktion auf Therapien modifiziert ist.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4, wobei der intrazelluläre pH eine Physiopathologie von beliebigen aus der Gruppe von Mikroorganismen, subzellulären Organellen, isolierten Zellen, kultivierten Zellen, perfundierten Organen, intakten Tieren und Menschen anzeigt.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 und 10, wobei der intrazelluläre pH infolge von physiologischen, pathologischen oder therapeutischen Situationen modifiziert ist.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 4, 10 und 11, wobei der intrazelluläre pH infolge von beliebigen aus der Gruppe von Muskeldystrophien, ischämischen Pathologien, einer Reaktion auf Therapien; einer gutartigen oder bösartigen Tumortransformation, einer Metastase bzw. Metastasierung und einer Tumorreaktion auf Therapien modifiziert ist.
Es folgen 4 Blatt Zeichnungen






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