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Dokumentenidentifikation DE69831242T2 29.06.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000994955
Titel ERHÖHTE HERSTELLUNG VON SEKRETIERTEN PROTEINEN DURCH REKOMBINANTE HEFEZELLEN
Anmelder Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus, Espoo, FI
Erfinder KERÄNEN, Sirkka, FIN-00240 Helsinki, FI;
TOIKKANEN, Jaana, FIN-00200 Helsinki, FI;
TIEAHO, Ville, FI-04430 Järvenpää, FI;
SÖDERLUND, Hans, FIN-02940 Espoo, FI
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69831242
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.07.1998
EP-Aktenzeichen 989336680
WO-Anmeldetag 08.07.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/FI98/00576
WO-Veröffentlichungsnummer 0099002716
WO-Veröffentlichungsdatum 21.01.1999
EP-Offenlegungsdatum 26.04.2000
EP date of grant 17.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.06.2006
IPC-Hauptklasse C12N 15/81(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die rekombinante DNA-Technologie. Spezifisch betrifft diese Erfindung neue rekombinante Hefezellen, die mit dem SEB1-Gen oder seinen Homologen transformiert sind. Eine Hefezelle, die mit mehreren Kopien des SEB1-Gens oder einem Gen transformiert ist, das zu SEB1 homolog ist, hat eine erhöhte Fähigkeit zur Produktion von sekretierten fremdem oder endogenen Proteinen.

Darüber hinaus kann die besagte neue rekombinante Hefezelle, wenn sie mit Genen transformiert ist, die geeignete hydrolytische Enzyme exprimieren, geeignete makromolekulare/polymere Verbindungen effizienter hydrolysieren und/oder verwenden, was in einer erhöhten Zellmasseproduktion und/oder einer vielseitigeren Verwendung von Verbindungen bei relevanten biotechnologischen Anwendungen resultiert.

Hintergrund der Erfindung

Die Entwicklung von rekombinanten DNA-Verfahren hat die Produktion von Proteinen in heterologen Wirtssystemen möglich gemacht. Diese Möglichkeit erleichtert die Produktion von z.B. Proteinen von therapeutischer Bedeutung beträchtlich, die normalerweise in der Natur in sehr geringen Mengen vorkommen oder sonst schwer zu isolieren oder reinigen sind. Solche Proteine umfassen Wachstumsfaktoren, Hormone und andere biologisch aktive Proteine oder Peptide, die in herkömmlicher Weise aus menschlichen oder tierischen Geweben oder Körperflüssigkeiten wie z.B. Serum oder Urin isoliert wurden. Die zunehmende Gefahr der Anwesenheit von für den Menschen pathogenen Viren wie HBV, HIV und onkogenen Viren, Prionen oder anderen Pathogenen in den menschlichen oder tierischen Geweben oder Körperflüssigkeiten hat die Forschung nach heterologen Produktionssytemen für diese Therapeutika stark beschleunigt. Andere Proteine von klinischer Bedeutung sind virale oder andere mikrobielle oder menschliche Parasitenproteine, die für die Diagnostik und für Impfstoffe gebraucht werden, insbesondere von solchen Organismen, die man schwierig in vitro oder in Gewebekultur züchten kann, oder die gefährliche menschliche Pathogene sind. Diese umfassen Viren wie HBV, HIV, Gelbfieber-, Rötel-Virus, FMDV, Tollwutvirus und andere menschliche Parasiten wie Plasmodium falciparum, das Malaria verursacht.

Eine weitere Gruppe von Proteinen, für die heterologe Produktionssysteme entwickelt wurden oder werden, sind sekretierte Enzyme, insbesondere diejenigen, die pflanzliches Material hydrolysieren und die bei der Lebensmittel- und Futtermittelproduktion gebraucht werden, ebenso wie bei anderen industriellen Verfahren, einschließlich der Textilindustrie und der Zellstoff- und Papierindustrie. Die Möglichkeit der Produktion von Proteinen in heterologen Systemen oder der Produktion von endogenen Proteinen in genetisch veränderten Zellen erhöht ihre Ausbeuten und erleichtert ihre Reinigung beträchtlich und hat schon jetzt große Bedeutung bei der Untersuchung der Struktur und Funktion vieler wichtiger Enzyme und anderer Proteine. Die Produktion und Sekretion fremder hydrolytischer Enzyme in Hefe resultiert zum Beispiel in der Verbesserung von Verfahren, die auf industriellen Hefestämmen wie Destillier-, Brau- oder Bäckerhefe beruhen.

Es wurden und werden verschiedene Produktionssyteme einschließlich Bakterien, Hefen, filamentöser Pilze, Tier- und Pflanzenzellkulturen und sogar vielzelliger Organismen wie transgene Tiere oder Pflanzen entwickelt. Alle diese verschiedenen Systeme haben ihre Vorteile, auch wenn sie Nachteile haben, und sie werden alle gebraucht.

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist im Augenblick auf der genetischen Ebene der am besten bekannte Eukaryont. Ihre gesamte genomische Sequenz wurde am 24. April 1996 in Datenbasen bekannt. Als eukaryontische Mikrobe besitzt sie die Vorteile einer eukaryontischen Zelle wie die meisten, wenn nicht alle posttranslationalen Modifikationen von Eukaryonten, und als Mikrobe hat sie mit Bakterien die Eigenschaften der leichten Handhabbarkeit und Züchtung gemeinsam. Die Fermentationssysteme in großem Maßstab sind für S. cerevisiae gut entwickelt, die eine lange Geschichte als ein Arbeitspferd der Biotechnologie hat, einschließlich der Produktion von Lebensmittelinhaltsstoffen und von Getränken wie Bier und Wein.

Genetische Verfahren für Hefe sind die bei weitem am besten entwickelten bei Eukaryonten, basierend auf dem breiten Wissen, das mittels der klassischen Genetik erhalten wurde. Das machte es leicht, für die Gentechnik-Verfahren für Hefe anzupassen und weiter zu entwickeln, die zuerst für Escherichia coli beschrieben wurden. Entsprechend anderen Linien wurden die Verfahren für die Konstruktion von Hefestämmen für die Produktion von fremden Proteinen weitgehend entwickelt (Romanos et al., 1992).

Die Sekretion von Proteinen in das Kulturmedium umfaßt den Transfer der Proteine durch die verschiedenen, von Membranen umschlossenen Kompartimente, die den sekretorischen Weg darstellen. Zunächst werden die Proteine in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums ER überführt. Von dort werden die Proteine in Membranvesikeln zum Golgi-Komplex transportiert und vom Golgi zur Plasmamembran. Der sekretorische Prozeß umfaßt mehrere Schritte, bei denen die Vesikel, die die sekretierten Proteine enthalten, von der Donormembran abgelöst werden, zu der Akzeptormembran geleitet werden und damit fusioniert werden. Bei jedem dieser Schritte wird die Funktion von mehreren verschiedenen Proteinen benötigt.

Der sekretorische Weg der Hefe und eine große Zahl von Genen, die dabei eine Rolle spielen, wurden durch die Isolierung von konditionell letalen Mutanten aufgeklärt, denen gewisse Stufen des sekretorischen Prozesses fehlen (Novick et al., 1980; 1981). Eine Mutation bei einem Protein, das für einen speziellen Transferschritt benötigt wird, resultiert in der Akkumulierung der sekretierten Proteine in dem vorhergehenden Membrankompartiment. Somit können Proteine im Cytoplasma, im ER, Golgi oder in Vesikeln zwischen ER und Golgi oder in Vesikeln zwischen Golgi und der Plasmamembran akkumulieren.

Eine detaillierte Analyse der Gene und Proteine, die im sekretorischen Prozeß eine Rolle spielen, wurde durch Clonierung der Gene und Charakterisierung der Funktion der codierten Proteine möglich. Es entsteht ein Bild, das zeigt, daß bei allen Schritten mehrere wechselwirkende Proteine in Funktion sind. Die Zahl an Genen, die bei der Proteinsekretion eine Rolle spielen und die zuerst in S. cerevisiae identifiziert und daraus isoliert wurden und die später in anderen Organismen einschließlich niederen und höheren Eukaryonten gefunden wurden, wächst schnell an. Für viele solche Proteine wurde eine strukturelle und funktionelle Homologie gezeigt.

Wir haben kürzlich ein neues Hefegen cloniert, SEB1 (Toikkanen et al., 1996), welches die &bgr;-Untereinheit des trimeren Sec61-Komplexes codiert (daher der Name SEB = SEc61 Beta-Untereinheit), die wahrscheinlich den Protein leitenden Kanal des ER bei der co- und post-translationalen Translokation darstellt (Hanein et al., 1996). Bei der ersteren funktioniert es in enger Verbindung mit dem Ribosom und im letzteren bildet es einen heptameren Membranproteinkomplex mit dem tetrameren Sec62/Sec63-Komplex (Panzner et al., 1995). Gene mit einer Sequenzähnlichkeit mit dem SEB1-Gen werden in Pflanzen- und Säurgerzellen gefunden, was anzeigt, daß der Sec61-Translokationskomplex in der Evolution konserviert ist. In der Tat funktionieren ähnliche Komponenten auch bei der Proteintranslokation in Prokaryonten (diskutiert bei Toikkanen et al., 1996). Dies unterstützt des weiteren die konservierte und zentrale Rolle des SEB1-Gen bei der Proteinsekretion und dem intrazellulären Transport. Bis jetzt gibt es allerdings noch keinen Bericht über irgendeinen positiven Effekt von SEB1 oder seinen Homologen in anderen Hefe-, Pflanzen- oder tierischen Zellen auf die Sekretion bei der Überexpression, wobei wir diesen Effekt in dieser Erfindung auf das SEB1-Gen von Hefe zeigen. Es sollte festgehalten werden, daß das Seb1-Protein in einem unterschiedlichen Proteinkomplex und an einer unterschiedlichen Lage als die Sso-Proteine vorhanden ist, von denen wir kürzlich gezeigt haben, daß sie die Produktion von sekretierten Proteinen erhöhen, wenn sie in den Zellen mit höheren Mengen als normal vorhanden sind.

Das Wissen über den Proteinsekretionsprozeß bei S. cerevisiae wächst rasch an. Über das sekretorische System von anderen Hefen wie Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Pichia und Hansenula, die sich jedoch als nützliche Wirte für die Produktion von fremden Genen erwiesen haben (Buckholz und Gleeson, 1991; Romanos et al., 1992), oder Candida und Yarrowia, die als Wirtssysteme ebenfalls interessant sind, ist wenig bekannt. Die genetische und molekulare Biologie dieser Hefen ist nicht so entwickelt wie bei Saccharomyces, aber die Vorteile dieser Hefen als Produktionswirte sind dieselben wie bei Saccharomyces.

Es hat mehrere, zuvor veröffentlichte Versuche gegeben, um die Produktion fremder Proteine in Hefe und filamentösen Pilzen ebenso wie in anderen Organismen zu erhöhen. Es wurde viel Arbeit in die Konstruktion verschiedener Promotoren und Plasmide zur Erhöhung des Niveaus der Transkription oder der Anzahl an Plasmidkopien investiert (vgl. z.B. Baldari et al., 1987; Martegani et al., 1992; Irani und Kilgore, 1988). Ein allgemeiner Weg, um die Sekretion zu testen und zu erhöhen, ist die Verwendung von Signalsequenzen der Hefe (Baldari et al., 1987; Vanoni et al., 1989). Die Zufallsmutagenese und die Durchmusterung auf sekretierte Proteine (Smith et al., 1985; Sakai et al., 1988; Shuster et al., 1989; Suzuki et al., 1989; Sleep et al., 1991; Lamsa und Bloebaum, 1990; Dunn-Coleman et al., 1991) oder die Fusion des fremden Proteins mit einem effizient sekretierten endogenen Protein (Ward et al., 1990; Harkki et al., 1989; Nyyssönen et al., 1993; Nyyssönen et al., 1992) wurden bei Hefe und filamentösen Pilzen weit verwendet, um die Sekretion fremder Proteine effizienter zu machen. Diese beiden Verfahren sind von eingeschränkter Verwendung. Die überproduzierenden Mutanten, die durch Zufallsmutagenese und Durchmusterung isoliert werden, sind fast ausschließlich rezessiv und können nicht in industrielle Hefestämme übertragen werden, die polyploid sind. Oft resultiert die Überproduktion von anderen Veränderungen als erhöhter Sekretion und in vielen Fällen betrifft sie nur das Protein, das für die Durchmusterung verwendet wird. Der Weg über Fusionsproteine erfordert die separate Konstruktion eines Fusionskonstrukts für jedes fremde Protein. Das Fusionsprotein ist häufig nicht funktionell und deswegen muß das Endprodukt durch proteolytische Spaltung freigesetzt werden, was das Produktionsverfahren kompliziert.

Unser Weg der Erhöhung der Kopienzahl von Genen, die bei der Sekretion eine Rolle spielen, und somit der Menge an Komponenten in der sekretorischen Maschinerie ist universeller; er ist bei jedem Protein ohne spezifische Fusionskonstrukte anwendbar und er ist bei diploiden und polyploiden Stämmem anwendbar.

Es ist nicht genau bekannt, welche Stufen beim sekretorischen Prozeß den Flaschenhals bilden, es kann aber angenommen werden, daß es mehr als eine Stufe gibt, die geschwindigkeitsbestimmend wird, insbesondere unter den Bedingungen der Überproduktion. Das SEB1-Gen gemäß der Erfindung wurde unter Verwendung eines Weges der Hefegenetik cloniert und es wurde gezeigt, daß es genetisch mit dem SEC61-Gen wechselwirkt, das die Hauptkomponente des ER-Translokationskomplexes codiert. Die Tatsache, daß die Überexpression des SEB1-Gens die Produktion von sekretierten Proteinen in das Kulturmedium erhöht, legt nahe, daß das Seb1-Protein die geschwindigkeitsbestimmende Komponente im Translokationsprozeß ist. Das war überraschend, da das Seb1-Protein eine Komponente eines Multiprotein-Komplexes ist und die verstärkende Wirkung nicht erhöhte Niveaus der anderen Komponenten des Komplexes erforderte und da das SEB1-Gen für das Wachstum der Hefe nicht essentiell ist. Dies könnte bedeuten, daß es ein anderes Gen gibt, das dieselbe Funktion wie SEB1 wahrnehmen kann. Wir haben ein anderes Gen isoliert, SEB2, das mit SEB1 homolog ist; die Zerstörung von SEB1 und SEB2 war jedoch nicht letal, was anzeigt, daß die Funktion von SEB1 für das Wachstum der Hefe nicht essentiell ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren für die erhöhte Produktion von sekretierten Proteinen auf der Basis der Überexpression des zuvor isolierten SEB1-Gens von Saccharomyces cerevisiae. Spezifisch beschreibt die vorliegende Erfindung die Konstruktion von S. cerevisiae-Stämmen, die das SEB1-Gen entweder auf einem Multikopien-Plasmid exprimieren oder wenn es mit einer einzigen oder mehreren Kopien in das Hefegenom integriert ist oder unter der Regulierung eines starken Promotors gestellt ist. Außerdem beschreibt diese Erfindung die Identifizierung von SEB1-Homologen von anderen Hefen und den Nachweis von einem mit Seb1p homologen Protein in Kluyveromyces lactis.

Diese Erfindung stellt somit neue rekombinante Hefezellen bereit, die erhöhte Niveaus von Seb1-Protein in S. cerevisiae exprimieren.

Diese Erfindung stellt auch (ein) Verfahren für die Produktion von erhöhten Mengen von sekretierten Proteinen durch Überexpression von Genen bereit, die mit dem SEB1-Gen interagieren, wie SEC61.

Die Hefezellen gemäß der Erfindung, die mit dem SEB1-Gen transformiert sind, oder mit Genen, die mit dem SEB1-Gen interagieren, haben eine erhöhte Fähigkeit zur Produktion von sekretierten Proteinen. Die neuen Hefezellen gemäß der Erfindung können auch für die effizientere Produktion von hydrolytischen Enzymen und für die Hydrolyse von z.B. polymeren Substraten verwendet werden, was in einer Verbesserung von biotechnischen Verfahren wie der Einzelzell- oder Bäckerhefeproduktion aufgrund der erhöhten Zellmasse resultiert, oder bei anderen Verfahren verwendet werden, bei denen die effiziente Produktion von hydrolytischen Enzymen und/oder die effiziente Hydrolyse von Pflanzenmaterial von Vorteil ist.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

1 zeigt den Vektor YEpSEB1 von S. cerevisiae, bei dem die cDNA des SEB1-Gens zwischen dem ADH1-Promotor und dem CYC1-Terminator in dem Multikopien-Plasmid pMAC561 integriert ist.

2 zeigt die Western-Analyse, die die Überexpression des Seb1-Proteins in Hefe zeigt, die mit YEpSEB1 transformiert wurde. Spur 1: SEB1 überexprimierender Stamm, der mit dem Plasmid YEpSEB1 transformiert wurde, Spur 2: Trp-Segregant des SEB1 überexprimierenden Stamms, Spur 3: Kontrollstamm (mit dem Plasmid pMA56).

3 zeigt die erhöhte Produktion an sekretierter Bacillus-&agr;-Amylase von S. cerevisiae, der mit dem Multikopien-Plasmid YEpSEB1 transformiert war, das SEB1 exprimiert, und mit YEp&agr;a6, das das Bacillus-&agr;-Amylasegen exprimiert. Wachstum (gefüllte Symbole) und Sekretion von &agr;-Amylase (offene Symbole) in der Hefetransformante, die das SEB1-Gen überexprimiert (YEp&agr;a6 und YEpSEB1; Rechtecke), in der Kontrolltransformante (YEp-&agr;a6 und pMA56, Rauten), in der YEpSEB1-Segregante (YEp&agr;a6; Kreise) und in der &agr;-Amylase-Transformante (YEp&agr;a6; Sterne).

4 zeigt die Western-Analyse der Bacillus-&agr;-Amylase, die von S. cerevisiae mit oder ohne dem Multikopien-Plasmid sekretiert wurde, das SEB1 exprimiert. Spur 1: Kulturmedium von der YEpSEB1-Transformante, Spur 2: Kulturmedium vom Kontrollstamm, Spur 3: Bacillus-&agr;-Amylase-Standard.

5 zeigt die erhöhte Produktion an sekretierter Bacillus-&agr;-Amylase von dem S. cerevisiae-Stamm, der eine integrierte Kopie eines &agr;-Amylasegens von Bacillus enthält und mit dem Multikopien-Plasmid transformiert ist, das das SEB1-Gen exprimiert. Die Sekretion der Bacillus-&agr;-Amylase enthaltenden Hefe (offene Symbole): der Transformante, die das SEB1-Gen überexprimiert (YEpSEB1; Rechtecke), der Kontrolltransformante (pMA56, Kreise), der YEpSEB1-Segregante (Rauten) und der pMA56-Segregante (Sterne). Das Wachstum der Hefetransformanten wird durch gefüllte Symbole gezeigt.

6 zeigt die SEB1-Expressionskassette, flankiert von ribosomalen Sequenzen, integriert in BS+, was den Vektor YrbSEB1 ergibt.

7 Identifikation von SEB1-Homologen in anderen Hefe-Arten durch heterologe Hybridisierung unter nicht-stringenten Bedingungen. Mit HindIII verdaute genomische DNA von Saccharomyces cerevisiae (Spur 1), Schizosaccharomyces pombe (Spur 2), Kluyveromyces lactis (Spur 3), Pichia pastoris (Spur 4), Pichia stipitis (Spur 5), Candida utilis (Spur 6) und Yarrowia lipolytica (Spur 7).

8 Nachweis von Seb1p und seinem Homologen in der Hefe K. lactis unter Verwendung eines für Seb1p spezifischen Antikörpers. S. cerevisiae (Spur 1), K. lactis (Spur 2).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Für das bessere Verständnis der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung werden die folgenden Definitionen von bestimmten Begriffen angegeben, die hier nachstehend verwendet werden.

Homologe Gene, Homologe: Gene, die bezüglich ihrer DNA-Sequenz verwandt, aber nicht identisch sind und die dieselbe Funktion ausüben, sind miteinander homolog und werden als das Homolog von jeder anderen Sequenz bezeichnet.

Überexpression eines Gens: Ein Protein, das von dem besagten Gen codiert wird, wird in der Zelle in erhöhten Mengen produziert. Dies kann durch Erhöhung der Kopienzahl des Gens durch Einbringen zusätzlicher Kopien des Gens in die Zelle auf einem Plasmid erreicht werden, oder durch Integration in das Genom. Die Überexpression kann auch durch Platzierung des Gens unter einen Promotor erreicht werden, der stärker ist als sein eigener Promotor. Die Menge an Protein in der Zelle kann durch Veränderung der Kopienzahl des Gens und/oder der Stärke des für die Expression verwendeten Promotors verändert werden.

Sekretierte Proteine: Proteine, die innerhalb der Zelle den sekretorischen Weg betreffen und durch ihn außerhalb der Zelle, außerhalb der Plasmamembran transportiert werden, werden als sekretierte Proteine bezeichnet. Bei Hefe bleiben diese Proteine mit der Zellwand assoziiert, wie Invertase, oder sie können durch die Zellwand in das Wachstumsmedium freigesetzt werden, wie das fremde Protein Bacillus-&agr;-Amylase.

Suppression einer Mutation: Wenn die Wirkung einer Mutation bei einem vorgegebenen Gen durch eine Mutation bei einem anderen Gen beseitigt oder aufgehoben wird, wird das zweite Gen als der Suppressor des ersten Gens bezeichnet. Eine Suppression kann auch durch die Überexpression des Wildtyp-Allels des zweiten Gens mittels der vorstehend beschriebenen Wege eintreten. Dies wird als Überexpressions-Suppression bezeichnet. Wenn die Suppression durch vielfache Kopien des supprimierenden Gens verursacht wird, kann die Suppression auch als Multikopien-Suppression bezeichnet werden. Das Phänomen der Suppression zeigt, dass diese beiden Gene auf der genetischen Ebene wechselwirken. Die Wechselwirkung kann auch auf der physischen Ebene als direkter, physischer Kontakt zwischen den beiden Proteinen, die von den wechselwirkenden Genen codiert werden, eintreten.

Transformante/Segregante: Wenn Hefe mit einem Plasmid transformiert wird, wird sie als Transformante bezeichnet, d.h. transformierter Stamm. Wenn das Plasmid verloren geht, d.h. von der Transformante wegsegregiert wird, wird der Stamm als Segregante bezeichnet.

Das bei dieser Erfindung verwendete SEB1-Gen wird aus einem Organismus isoliert, der dieses Gen enthält, z.B. Saccharomyces cerevisiae oder Kluyveromyces lactis. Auch andere geeignete Hefen wie Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Candida spp., Pichia ssp. und Hansenula spp. können verwendet werden. Es sollte festgehalten werden, daß homologe Gene aus anderen Organismen ebenfalls verwendet werden können.

Darüber hinaus resultiert die Überexpression von anderen Genen, die in der Gegenwart von normalen oder erhöhten Niveaus an Seb1-Protein auf derselben Stufe mit dem SEB1-Gen funktionieren, wie SEC61, in einer erhöhten Produktion an sekretierten Proteinen.

Gene, die bei den anderen Stufen des sekretorischen Prozesses in Funktion sind, können auch einen ähnlichen Effekt haben. So kann die Freisetzung der sekretorischen Vesikel vom ER oder dem Golgi-Kompartiment durch Erhöhung der Kopienzahl geeigneter Gene, von denen bekannt ist, daß sie bei diesem Schritt in Funktion sind, oder durch Suche nach und Erhöhung der Kopienzahl von Genen, die mit den bekannten Genen wechselwirken, d.h. Suppressoren ihrer Mutationen, erleichtert werden. In ähnlicher Weise kann jeder andere Schritt des sekretorischen Weges durch Erhöhung der Kopienzahl der beteiligten Gene verbessert werden. Das neue Gen SEB1, das wir aus S. cerevisiae isolierten, stellt ein konserviertes Gen dar, was nahe legt, daß es in der Zelle eine wichtige Rolle spielt.

Basierend auf der konservierten Natur von SEB1 und seinen Homologen in anderen Arten, wie vorstehend erwähnt, schlagen wir vor, daß eine Zunahme des SEB1-Gens oder seiner Homologen in jeder anderen Hefe in einer erhöhten Effizienz der Proteinsekretion resultieren würde.

Der Wirt, der mit den Genen der Erfindung transformiert werden soll, kann jede Hefe sein, die für die Produktion von fremdem oder endogenen Proteinen geeignet ist, z.B. jeder S. cerevisiae-Stamm (z.B. DBY746, AH22, S150-2B, GPY55-15Ba, VTT-A-63015), jede Kluyveromyces lactis-Hefe (z.B. MW270-7B, MW179-1D), Schizosaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha, Candida, Pichia oder Yarrowia spp. Der Transfer der Gene in diese Zellen kann zum Beispiel unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erreicht werden, wie sie für diese Organismen beschrieben werden.

Die DNA-Sequenz, die SEB1 enthält, kann mittels herkömmlicher Verfahren aus S. cerevisiae isoliert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die bekannte DNA-Sequenz des SEB1-Gens von S. cerevisiae (Toikkanen et al., 1996) und von SEB1-ähnlichen Genen verwendet, um Sonden für die heterologe Hybridisierung oder PCR-Primer für die Clonierung des SEB1-Gens zu entwerfen. Bei einem anderen Verfahren werden Antikörper gegen die Proteine, die von den bekannten SEB1- und SEB1-ähnlichen Genen codiert werden, für die Clonierung der Gene mittels Standardverfahren verwendet.

Die DNA-Sequenz von K. lactis, die das SEB1-Gen von K. lactis enthält, wird aus der chromosomalen DNA oder aus einer cDNA oder aus einer chromosomalen Genbank isoliert, die durch heterologe Hybridisierung unter nicht-stringenten Bedingungen, wie in Beispiel 5 beschrieben, aus K. lactis gewonnen wurde, und mittels herkömmlicher Verfahren charakterisiert werden, und ihre Funktion kann, wie vorstehend beschrieben, gezeigt werden. Ein ähnlicher Weg ist für alle Organismen geeignet, bei denen zum Beispiel durch Southern-Hybridisierung von Gesamt-DNA gezeigt wurde, daß sie chromosomale Sequenzen enthalten, die mit dem SEB1-Gen von Hefe homolog sind. Es ist auch möglich, das Gen mit Antikörper, die gegen das Seb1-Protein von Hefe hergestellt wurden, aus einer Expressionsbibliothek zu isolieren.

Alternativ können basierend auf den Homologien, die zwischen den Sequenzen der entsprechenden Gene gefunden wurden, die aus mehreren Organismen isoliert wurden, Oligonucleotidprimer entworfen werden. Diese Primer werden verwendet, um das K. lactis-Gen in einer PCR-Reaktion zu amplifizieren.

Um ein Plasmid zu konstruieren, das für die Transformation in Hefe geeignet ist, wird das SEB1-Gen in einen geeigneten Expressionsvektor der Hefe cloniert, wie pAAH5 (Ammerer, 1983) oder davon abgeleitete Vektoren (Ruohonen et al., 1991; Ruohonen et al., 1995), der die geeigneten regulatorischen Regionen von Hefe enthält. Diese regulatorischen Regionen können zum Beispiel von Hefegenen wie ADH1, GAL1/GAL10, PGK1, CUP1, CYC1, PHO5, TPI1 oder dem Asparagin-Synthetasegen gewonnen werden. Alternativ können die regulatorischen Regionen von SEB1 auch verwendet werden, um die Gene in S. cerevisiae zu exprimieren. Das Plasmid, das das SEB1-Gen enthält, ist zur autonomen Replikation in der Lage, wenn es in den Empfängerhefestamm transformiert wird. Das SEB1-Gen kann auch zusammen mit den geeigneten regulatorischen Regionen von Hefe in einen Einzelkopien-Hefevektor cloniert werden, wie pHR70 von Hans Ronne oder pRS313, pRS314, pRS315 oder pRS316 (Sikorski und Hieter, 1989).

Alternativ können zusätzliche Kopien des SEB1-Gens auch in das Hefechromosom integriert werden, zum Beispiel in den ribosomalen RNA-Locus. Zu diesem Zweck werden die ribosomalen Sequenzen eines geeigneten Plasmids, z.B. des Plasmids pIRL9 (Hallbom et al., 1991), freigesetzt und in geeigneter Weise in den BS+-Vektor cloniert, wie in 6 gezeigt. Das SEB1-Gen, das zwischen geeigneten Hefepromotor- und Hefeterminatorregionen eingekoppelt ist, wird von dem Hybridvektor, der das Gen umfaßt, freigesetzt und in das Plasmid cloniert, das beim vorhergehenden Schritt erhalten wurde. Von dem resultierenden Plasmid kann die Expressionskassette, flankiert von ribosomalen Sequenzen, freigesetzt werden. Dieses Fragment wird mit einem autonom replizierenden Plasmid, das einen für die Transformation geeigneten Marker besitzt, in eine Hefe co-transformiert. Das Plasmid kann später durch Züchtung der Zellen unter nicht-selektiven Bedingungen aus den Zellen entfernt werden, die zusätzliche Kopien des SEB1-Gens in das Chromosom integriert enthalten. Unter Verwendung diese Verfahrens können rekombinante Stämme gewonnen werden, die keine zusätzliche fremde DNA wie bakterielle Vektorsequenzen enthalten. Wenn ein polyploider Hefestamm wie VTT-A-63015 verwendet wird, kann das Gen auch in einen essentiellen Locus integriert sein, wie dem ADH1- oder PGK1-Locus.

Um das SEB1-Gen in K. lactis zu exprimieren, wird das SEB1-Gen zwischen dem ADH1-Promotor und dem CYC1-Terminator mit im Stand der Technik bekannten Verfahren entweder in einen K lactis-Stamm auf einem Mutlikopien-Plasmid transformiert oder in das Genom integriert. Geeignete Promotoren zusätzlich zum ADH1-Promotor oder dem Promotor des SEB1-Gens selbst sind zum Beispiel die hier vorstehend aufgelisteten anderen Promotoren von S. cerevisiae.

Die Verfahren dieser Erfindung verwenden somit Hefestämme, die das SEB1-Gen von S. cerevisiae überexprimieren, ebenso wie das/die homologe(n) Gen(e) von K. lactis und anderen Hefen. Die Sequenzen der Gene können von den Plasmiden bestimmt werden, die sie enthalten, unter Verwendung von z.B. dem doppelsträngigen Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahren (Zagursky et al., 1986). Die Nucleotidsequenz des offenen Leserahmens des SEB1-Gens von S. cerevisiae ist als SEQ ID NO: 1 dargestellt.

Die Hefestämme enthalten spezifische Vektoren, die das SEB1-Gen enthalten. Bei Hefe ist ein solcher Vektor entweder ein autonom replizierendes Multikopien- oder Einzelkopienplasmid oder ein Vektor, der zur Integration in das Chromosom in der Lage ist, wie vorstehend beschrieben.

Die Hefestämme, die zusätzliche Kopien des SEB1-Gens entweder auf einem replizierenden Plasmid/replizierenden Plasmiden oder in das Chromosom integriert enthalten, stellen eine erhöhte Produktion an sekretierten Proteinen bereit, wie Bacillus-&agr;-Amylase, Hefe-Invertase oder Trichoderma-Cellulasen oder andere Hydrolasen.

Somit umfaßt ein Verfahren für die Konstruktion von neuen Hefezellen, die zur Expression erhöhter Niveaus an Seb1-Protein in der Lage sind:

  • (a) das Bereitstellen eines Vektors, der ein isoliertes DNA-Molekül enthält, das das Seb1-Protein codiert; und
  • (b) die Transformation mindestens eines solchen Vektors in eine Hefewirtszelle.

Somit werden Hefezellen bereitgestellt, die zusätzlich zu zusätzlichen Kopien des SEB1-Gens ein DNA-Molekül umfassen, das ein sekretiertes fremdes oder endogenes Protein codiert, wie eine &agr;-Amylase, eine Cellulase oder einen Antikörper, und in der Lage sind, dieses Protein zu exprimieren.

Die Sekretion kann durch Optimierung des Seb1-Proteinniveaus unter Verwendung verschiedener Promotoren und verschiedener Kopienzahlen des Gens und Kombination des SEB1-Gens mit anderen Genen, die in die Sekretion involviert sind, verbessert werden.

Somit stellt die Erfindung ein Verfahren für die Produktion erhöhter Mengen eines sekretierten fremden oder endogenen Proteins in Hefezellen bereit, wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht:

  • (a) Bereitstellen eines Vektors, umfassend ein isoliertes DNA-Molekül, das das Protein codiert;
  • (b1) Transformieren des bereitgestellten Vektors in einen geeigneten Hefewirt, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein, das die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz enthält, codiert, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, und der das SEB1-Gen überexprimiert, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen; oder
  • (b2) Transformieren des Vektors in einen geeigneten Hefewirt und Retransformieren dieser Transformante mit einem Hefeexpressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül, das ein Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein von einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen, die das SEB1-Gen überexprimieren; oder
  • (b3) Transformieren des bereitgestellten Vektor in einen geeigneten Hefewirt, der das SEB1-Gen und ein anderes Gen, das ein Protein codiert, das im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, überexprimiert, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen; oder
  • (b4) Transformieren des Vektors in einen geeigneten Hefewirt und Retransformieren dieser Transformante mit einem Hefeexpressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, und mit einem anderen Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, zum Erhalt von transformierten Hefezellen, die das SEB1-Gen und ein anders Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, überexprimieren; und
  • (c) Durchmustern nach Zellen mit verstärkter Produktion des Proteins; und
  • (d) Züchten der rekombinanten Hefewirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die erhöhte Produktion eines endogenen sekretierten Proteins bereit, wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht:

  • (a) Transformieren von Zellen, die das Protein produzieren, mit einem Hefeexpressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, alleine oder zusammen mit einem anderen Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert;
  • (b) Durchmustern nach Transformanten, die erhöhte Mengen des Proteins produzieren, und dadurch Bereitstellen von rekombinanten Zellen zur gesteigerten Produktion des Proteins; und
  • (c) Züchten der rekombinanten Zellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben.

Die bei dieser Erfindung verwendeten Hefestämme können zusätzlich zu zusätzlichen Kopien des SEB1-Gens oder seines Homologen auch eine DNA-Sequenz enthalten, die ein hydrolytisches Enzym wie eine &agr;-Amylase und/oder Glucoamylase oder Lignocellulose hydrolysierende Enzyme wie Cellulasen, Hemicellulasen oder Lignasen codiert, welche der Hefe die Fähigkeit der erhöhten Hydrolyse von und/oder des verstärkten Wachstums auf polymeren Verbindungen wie Stärke oder Lignocellulose verleiht. Somit wird ein Verfahren für die effiziente Produktion von Biomasse auf einem Rohmaterial oder die effizienten Hydrolyse von Rohmaterial bereitgestellt, wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht:

  • (a) Bereitstellen eines Vektors, umfassend ein isoliertes DNA-Molekül, das ein endogenes oder fremdes hydrolytisches Enzym codiert;
  • (b1) Transformieren des bereitgestellten Vektors in einen geeigneten Hefewirt, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, und der das SEB1-Gen überexprimiert, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen; oder
  • (b2) Transformieren des Vektors in einen geeigneten Hefewirt und Retransformieren dieser Transformante mit einem Hefeexpressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein, das die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz enthält, codiert, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein von einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen, die das SEB1-Gen überexprimieren; oder
  • (b3) Transformieren des bereitgestellten Vektors in einen geeigneten Hefewirt, der das SEB1-Gen und ein anderes Gen, das ein Protein codiert, das im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, überexprimiert, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen; oder
  • (b4) Transformieren des Vektors in einen geeigneten Hefewirt und Retransformieren dieser Transformante mit einem Hefeexpressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein, das die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz enthält, codiert, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, und mit einem anderen Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, zum Erhalt von transformierten Hefezellen, die das SEB1-Gen und ein anderes Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, überexprimeren; und
  • (c) Durchmustern nach Zellen mit erhöhter Produktion des Enzyms; und
  • (d) Züchten der rekombinanten Hefewirtszellen unter Bedingungen, die eine Expression des hydrolytischen Enzyms erlauben.

Mögliche Anwendungen der besagten rekombinanten Zellen sind z.B. bei der Einzelzellproduktion, bei der verbesserten Alkoholproduktion oder bei Verfahren, wo eine effiziente Hydrolyse von Rohmaterial erwünscht ist.

EXPERIMENTELL

Der bei allen Experimenten verwendete S. cerevisiae-Stamm war DBY746 (&agr; his3DI leu2–3 leu2–112 ura3–52 trp –289 Cyh®) (erhalten von David Botstein, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA).

Beispiel 1: Überexpression des Seb1-Proteins in Hefe, die mit YEpSEB1 transformiert war

Die S. cerevisiae-Stämme, die mit dem Kontrollplasmid pMA56 (1) (Ammerer, 1983) oder mit YEpSEB1 (Toikkanen et al., 1996) transformiert (Ito et al., 1983) waren, wurden in synthetischem vollständigem Medium (Sherman et al., 1983) gezüchtet, dem Trp fehlte, und ein Stamm, von dem das YEpSEB1-Plasmid wegsegregiert war (2), wurden in synthetischem vollständigem Medium gezüchtet. In der Gegenwart von SDS wurden Hefezelllysate hergestellt, wie von Keränen (1986) beschrieben. 30 &mgr;g Gesamthefeprotein, das in den Lysaten vorhanden war, wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt (Schrägger und von Jagow, 1987) und unter Verwendung polyclonaler Antikörpern, die in Kaninchen gegen das 18 Aminosäuren lange N-terminale Peptid von Seb1-Protein (Toikkanen et al., 1996) gemacht worden waren, und von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG für den Nachweis mittels des Western-Blot-Verfahrens nachgewiesen. Wie in 2 gezeigt, wurde eine beträchtlich erhöhte Menge an Seb1-Protein in der YEpSEB1-Transformante gesehen. Wenn das YEpSEB1-Plasmid von der Hefe wegsegregiert war, wurde das Niveau an Seb1-Protein auf das Niveau des Kontrollstammes reduziert, der mit dem Vektorplasmid transformiert war, der das SEB1-Gen nicht enthielt.

Beispiel 2: Erhöhte Produktion eines sekretierten fremdem Proteins, Bacillus-&agr;-Amylase, und eines endogenen Proteins, Invertase, in einem Hefestamm, der SEB1 überexprimiert

Der S. cerevisiae-Stamm, der das Plasmid YEp&agr;a6 aufgenommen hatte, das das Bacillus-&agr;-Amylase-Gen, ligiert zwischen dem ADH1-Promotor und -Terminator (Ruohonen et al., 1987) enthielt und durch Deletion von vorhergesagten inhibitorischen Sequenzen 5' vom Promotorelement (Ruohonen et al., 1991; 1995), für eine effizientere Expression modifiziert war, wurde entweder mit YEpSEB1 oder mit dem Kontrollplasmid pMA56 (Ammerer, 1983) transformiert. Die erhaltenen Hefestämme, die YEpSEB1 und YEp&agr;a6 oder pMA56 und YEp&agr;a6 enthielten, wurden bei 30°C in selektivem Medium gezüchtet und die Sekretion der &agr;-Amylase in das Kulturmedium wurde durch Messung der &agr;-Amylase-Aktivität unter Verwendung des Phadebas-Amylasetests (Pharmacia Diagnostics AB, Schweden) verfolgt. Wie in 3 gezeigt, wurde eine erhöhte &agr;-Amylase-Aktivität in dem Stamm, der SEB1 auf dem Multikopien-Plasmid enthielt, im Vergleich mit dem Kontrollstamm erhalten, der mit dem Kontrollplasmid ohne das SEB1-Gen transformiert war. Bei dem Hefewachstum wurde kein Unterschied zwischen der Kontrolltransformante und der SEB1-Transformante beobachtet. Die Sekretion des endogenen Proteins Invertase wurde auch durch die SEB1-Überexpression erhöht, gemessen in der späten logarithmischen bis zur frühen stationären Wachstumsphase. Die Aktivität der sekretierten Invertase bei der YEpSEB1-Transformante war 1,4-fach im Vergleich mit der Kontrolltransformante, die pMA56 enthielt.

Die Entfernung der vorhergesagten inhibitorischen Sequenzen auf dem ADH1-Promotor (siehe vorstehend), der für die Expression von SEB1 in YEpSEB1 verwendet wurde, resultiert in einer verlängerten Expression von SEB1 und verlängert das Vorkommen von erhöhten Niveaus von Seb1-Protein und folglich werden sogar höhere Endniveaus an Bacillus-&agr;-Amylase in das Medium sekretiert.

Beispiel 3: Erhöhte Produktion des sekretierten fremden Proteins Bacillus-&agr;-Amylase in einem Hefestamm, bei dem das &agr;-Amylasegen am HIS3-Locus in das Genom integriert ist und das SEB1-Gen überexprimiert wird

Die Kassette, die die &agr;-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens exprimiert, wurde durch Verdau mit BamHI und SalI als Fragment von 3,35 kb aus dem Plasmid YEp&agr;a6 (Ruohonen et al., 1995) freigesetzt und sie wurde in den integrierenden Vektor pRS403 (Sikorski und Hieter, 1989) der Hefe zwischen den BamHI- und SalI-Stellen cloniert, um das Plasmid YIp&agr;a1 zu ergeben. Das Plasmid wurde durch Verdau mit PstI innerhalb des HIS3-Gens linearisiert und für die Transformation von Hefe verwendet. Die Transformanten wurden auf Histidin-Prototrophie selektiert. Die Integration der &agr;-Amylase-Expressionskassette an dem HIS3-Locus wurde mittels Southern-Analyse bestätigt. Der so erhaltene Integrationsstamm wurde mit YEpSEB1 oder mit dem Kontrollplasmid pMA56 transformiert. Die Transformanten wurden bei 30°C in selektivem Medium gezüchtet und die Sekretion der &agr;-Amylase in das Kulturmedium wurde durch Messung der &agr;-Amylase-Aktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben, verfolgt. Eindeutig erhöhte Niveaus an sekretierter &agr;-Amylase wurden bei den YEpSEB1-Transformanten nachgewiesen, bei denen die &agr;-Amylase-Niveaus in dem Kulturmedium 4,2-fach waren im Vergleich mit dem Kontrollstamm.

Beispiel 4: Erhöhte Produktion des sekretierten fremden Proteins Bacillus-&agr;-Amylase in einem Hefestamm, bei dem das &agr;-Amylasegen am URA3-Locus in das Genom integriert ist und das SEB1-Gen überexprimiert wird

Eine Integrationskassette für die Integration des &agr;-Amylasegens in den URA3-Locus wurde wie folgt konstruiert. Die URA3-Fragmente wurden mittels PCR hergestellt und in die Multiclonierungsstelle von pBluescript SK(–) cloniert. Das erste Fragment, das die Basenpaare (bp) 71–450 des 1135 bp langen URA3 enthielt, wurde als ein SacI-XbaI-Fragment cloniert. Das zweite Fragment (781–1135 bp) wurde als ein XhoI-KpnI-Fragment cloniert. Das resultierende Plasmid ist pBUF. Die 3,35 kb lange &agr;-Amylase-Expressionskassette wurde als ein BamHI-SalI-Fragment aus dem Plasmid YEp&agr;a6 (Ruohonen et al., 1995) ausgeschnitten und in den pBluescript-Vektor cloniert, was das Plasmid pB&agr;a6 ergab. Die Expressionskassette wurde dann erneut als ein BamHI-SalI-Fragment freigesetzt und dann zwischen den URA3-Fragmenten in pBUF inseriert. Dieses Konstrukt ist pUI&agr;a1. Der S. cerevisiae-Stamm, der ura3–52 ist, wurde zunächst durch Transformation mit einem Fragment, das das gesamte URA3-Gen enthielt, in wt URA3 umgewandelt. Dieser Stamm wurde dann mit einer &agr;-Amylase-Integrationskassette transformiert, die als SacI-NsiI-Fragment aus pUI&agr;a1 freigesetzt worden war, und die Transformanten wurden in der Gegenwart von 5-FOA selektiert, was auf Stämme selektiert, bei denen das URA3-Gen durch Integration der &agr;-Amylase-Kassette inaktiviert ist. Die Integration an dem URA3-Locus wurde mittels Southern-Analyse bestätigt. Der so erhaltene Stamm wurde mit YEpSEB1 oder mit dem Kontrollplasmid pMA56 transformiert. Die erhaltene YEpSEB1-Transformante wurde als VTT C-97280 bezeichnet und gemäß dem Budapester Vertrag am 16. Juni 1997 mit der Zugangsnummer DSM 11615 bei der DSZM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) hinterlegt.

Die Transformanten wurden bei 30°C in selektivem Medium gezüchtet und die Sekretion der &agr;-Amylase in das Kulturmedium wurde durch Messung der &agr;-Amylase-Aktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben, verfolgt. Wie in 4 und 5 gezeigt, wurden durch Western-Blot-Verfahren und die Messung der &agr;-Amylase-Aktivität eindeutig erhöhte Niveaus an sekretierter &agr;-Amylase bei den YEpSEB1-Transformanten nachgewiesen.

Beispiel 5: Identifikation von SEB1-Homologen in anderen Hefen durch heterologe Hybridisierung

Genomische DNA von den Pilzarten Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Candida utilis und Yarrowia lipolytica wurden isoliert, mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut, mittels Elektrophorese in einem 0,8%-igen Agarosegel aufgetrennt und auf ein Nylonfilter überführt. Die Southern-Hybridisierung der Filter wurde unter Verwendung der codierenden Region für das Saccharomyces-SEB1-Gen als Sonde bei verschiedenen Stringenzen durchgeführt. Die Hybridisierung in einem Gemisch, das 30% Formamid, 6 × SSC, 10 × Denhardt, 0,5% SDS, 100 mg/ml Heringssamen-DNA und 10 mg/ml PolyA enthielt, bei 35°C und 15 Minuten Waschen in 6 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C und 2 × 30 Minuten in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C offenbarte klare Hybridisierungsbanden bei der DNA, die von S. cerevisiae, S. pombe, K. lactis, P. stipitis und Y. lipolytica abgeleitet war, und eine viel schwächere Bande bei der DNA von C. utilis (7).

Beispiel 6. Nachweis von einem mit Seb1p homologen Protein in der Hefe Kluyveromyces lactis

Das Plasmid YEpSEB1 (S. cerevisiae-Vektor, der das SEB1-Gen enthält) und das Vektorplasmid wurden in Shuttlevektoren umgewandelt, die in der Lage waren, in K. lactis zu replizieren. Der K. lactis-Replikationsursprung (Chen et al., 1986) wurde aus dem Plasmid Kep6 als ein Fragment von etwa 1000 bp (Verdau mit AatII und ClaI, Auffüllen mit T4-DNA-Polymerase) freigesetzt und gereinigt und in die PvuII-Stelle von YEpSEB1 und den Kontrollvektor pMA56 ligiert, um die Plasmide KEpSEB1 bzw. KpMA56 zu erhalten. Die Plasmide wurden in K. lactis transformiert und die Transformanten nach Wachstum auf SC-Trp-Platten selektiert. Die SDS-Lysate, die von den Transformanten gewonnen wurden, wurden unter Verwendung des für Seb1p spezifischen Antikörpers, wie in Beispiel 1 beschrieben, mittels des Western-Blot-Verfahrens analysiert. Der Antikörper wies eine Bande mit einer geringfügig langsameren Wanderungsgeschwindigkeit als Seb1p von S. cerevisiae nach (8).

Beispiel 7: Erhöhte Produktion des sekretierten fremden Proteins Bacillus-&agr;-Amylase in Hefe, die SEC61 in Kombination mit normalen oder erhöhten Niveaus an funktionellem Seb1-Protein überexprimiert

Der S. cerevisiae-Stamm, in den die Bacillus-&agr;-Amylase-Expressionskassette am URA3-Locus integriert ist, wurde entweder mit dem Multikopienplasmid YEpSEC61, das das SEC61-Gen exprimiert, oder mit dem Kontrollplasmid pRS425 transformiert (Christianson et al., 1992). Die Transformanten wurden bei 30°C in selektivem Medium gezüchtet und die Sekretion der &agr;-Amylase in das Kulturmedium wurde durch Messung der &agr;-Amylase-Aktivität unter Verwendung des Phadebas-Amylasetests (Pharmacia Diagnostics AB, Schweden) verfolgt. In dem Stamm, der SEC61 auf einem Multikopienplasmid enthält, wurde eine erhöhte &agr;-Amylase-Aktivität (1,3-fach) im Vergleich mit dem Stamm, der mit dem Vektor ohne das SEC61-Gen transformiert worden war, erhalten.

Die simultane Überexpression von Sec61p und Seb1p von den beiden verschiedenen Plasmiden erhöhte die Produktion an sekretierter &agr;-Amylase sogar noch weiter (3,3-fach). Bei diesen 2-Plasmid-Bedingungen war die Erhöhung durch SEB1 allein 2,4-fach. Das Plasmid, das das SEC61-Gen exprimiert, ist bei VTT, Biotechnical Laboratory, Espoo, Finnland, erhältlich.

Hinterlegter Mikroorganismus

Der folgende Mikroorganismus wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSZM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt.

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SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Herstellung gesteigerter Mengen eines sekretierten fremden oder endogenen Proteins in einer Hefezelle, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren aus den Schritten besteht:

    (a) Bereitstellen eines Vektors, umfassend ein isoliertes DNA-Molekül, das das Protein codiert;

    (b1) Transformieren des bereitgestellten Vektors in einen geeigneten Hefewirt, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, und der das SEB1-Gen überexprimiert, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen; oder

    (b2) Transformieren des Vektors in einen geeigneten Hefewirt und Retransformieren der Transformante mit einem Hefeexpressionsvektor umfassend ein DNA-Molekül, das ein Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein von einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen, die das SEB1-Gen überexprimieren; oder

    (b3) Transformieren des bereitgestellten Vektors in einen geeigneten Hefewirt, der das SEB1-Gen und ein anderes Gen, das ein Protein codiert, das im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, überexprimiert, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen; oder

    (b4) Transformieren des Vektors in einen geeigneten Hefewirt und Retransformieren der Transformante mit einem Hefeexpressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, und mit einem anderen Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, zum Erhalt von transformierten Hefezellen, die das SEB1-Gen und ein anderes Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, überexprimieren; und

    (c) Durchmustern nach Zellen mit verstärkter Produktion des Proteins; und

    (d) Züchten der rekombinanten Hefewirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben.
  2. Verfahren zur gesteigerten Produktion eines endogenen sekretierten Proteins, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren aus den Schritten besteht:

    (a) Transformieren von Zellen, die das Protein produzieren, mit einem Hefeexpressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, alleine oder zusammen mit einem anderen Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert;

    (b) Durchmustern nach Transformanten, die erhöhte Mengen des Proteins produzieren, und dadurch Bereitstellen von rekombinanten Zellen zur gesteigerten Produktion des Proteins; und

    (c) Züchten der rekombinanten Zellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben.
  3. Verfahren zur effizienten Biomasseproduktion mit einem Rohmaterial oder wirksamen Hydrolyse eines Rohmaterials, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren aus den Schritten besteht:

    (a) Bereitstellen eines Vektors, umfassend ein isoliertes DNA-Molekül, das ein endogenes oder fremdes hydrolytisches Enzym codiert;

    (b1) Transformieren des bereitgestellten Vektors in einen geeigneten Hefewirt, umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, und der das SEB1-Gen überexprimiert, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen; oder

    (b2) Transformieren des Vektors in einen geeigneten Hefewirt und Retransformieren der Transformante mit einem Hefeexpressionsvektor umfassend ein DNA-Molekül, das ein Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein von einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen, die das SEB1-Gen überexprimieren; oder

    (b3) Transformieren des bereitgestellten Vektors in einen geeigneten Hefewirt, der das SEB1-Gen und ein anderes Gen, das ein Protein codiert, das im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, überexprimiert, zum Erhalt von rekombinanten Hefewirtszellen; oder

    (b4) Transformieren des Vektors in einen geeigneten Hefewirt und Retransformieren der Transformante mit einem Hefeexpressionsvektor umfassend ein DNA-Molekül, das das Seb1-Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz hat wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein DNA-Molekül, das ein homologes Seb1-Protein einer anderen Hefe codiert, oder ein funktionelles Fragment davon, und mit einem anderen Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, zum Erhalt von transformierten Hefezellen, die das SEB1-Gen und ein anderes Gen, das ein Protein codiert, welches im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, überexprimieren; und

    (c) Durchmustern nach Zellen mit erhöhter Produktion des Enzyms; und

    (d) Züchten der rekombinanten Hefewirtszellen unter Bedingungen, die eine Expression des hydrolytischen Enzyms erlauben.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gen, welches ein Protein codiert, das im gleichen Schritt wie das Seb1-Protein funktioniert, das SEC61-Gen ist.
  5. Rekombinante Hefezellen, welche Zellen des Saccharomyces cerevisiae-Stamms VTT C-97280 sind, mit der Hinterlegungsnummer DSM 11615.
Es folgen 8 Blatt Zeichnungen






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