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Dokumentenidentifikation DE69926770T2 29.06.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001120100
Titel ANTIBAKTERIELLE MITTEL UND EIN HERSTELLUNGSVERFAHREN DAFÜR
Anmelder Kabushiki Kaisha Yakult Honsha, Tokio/Tokyo, JP
Erfinder SHIBATA, Hideyuki, Tokyo 105-8660, JP;
NAGAOKA, Masato, Tokyo 105-8660, JP;
TAKAGI, Itsuko, Tokyo 105-8660, JP;
HASHIMOTO, Shusuke, Tokyo 105-8660, JP
Vertreter Samson & Partner, Patentanwälte, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69926770
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT, NL
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 04.10.1999
EP-Aktenzeichen 999700248
WO-Anmeldetag 04.10.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/JP99/05448
WO-Veröffentlichungsnummer 0000020009
WO-Veröffentlichungsdatum 13.04.2000
EP-Offenlegungsdatum 01.08.2001
EP date of grant 17.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.06.2006
IPC-Hauptklasse A61K 31/702(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 31/731(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 31/737(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 31/43(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 31/546(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 31/7016(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 1/04(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 31/04(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
TECHNISCHES GEBIET

Die Erfindung betrifft ein antibakterielles Mittel. Spezieller betrifft die Erfindung sulfatierte Polysaccharide und Oligosaccharid-Derivate, welche hergestellt werden, indem sulfatierte Polysaccharide partiell zersetzt werden, die für die Ausrottung von Helicobacter pylori als ätiologischem Mikroorganismus von Magenulkus oder Magenkrebs wirksam sind und typischerweise Fucoidan umfassen, und ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Als therapeutisches Mittel für Magenulkus sind traditionell H2-Blocker und Protonenpumpen-Inhibitoren für den Zweck der Sekretionssuppression von Magensäure und Magenschleimhaut-Schutzmittel verwendet worden. Obwohl diese Arzneimittel signifikante therapeutische Wirkungen ausüben, ist bekannt gewesen, dass es bei Individuen, die mit Helicobacter pylori infiziert sind, wiederholt zu Rückfällen bezüglich des Magenulkus kommt.

Zusätzlich ist bekannt gewesen, dass bei mit Helicobacter pylori infizierten Individuen eine hohe statistische Häufigkeit des Auftretens von Magenkrebs vorliegt. Aus dem Blickwinkel der radikalen Behandlung von Magenulkus oder der Prophylaxe von Magenkrebs wird festgestellt, dass eine therapeutische Behandlung, welche die Ausrottung von Helicobacter pylori mit umfasst, benötigt wird (M. Asaka, „Helicobactor pylori and Gastric Mucosa Diseases", Sentan Igaku Corp., 1. Juli 1995; Hrsg. Digestive Disease Society of Japan, „Guideline Reference for Helicobactor pylori Therapy", H. pylori Therapy Committee).

Basierend auf diesen Feststellungen ist die Ausrottung/therapeutische Behandlung in Kombination mit Antibiotika und die Magensäuresekretion unterdrückenden Mitteln ausgeführt worden. Es treten jedoch Probleme, wie das Auftreten von Diarrhöe und die Entstehung von resistenten Bakterien, aufgrund der relativ hohen Dosen von Antibiotika auf, obwohl die Behandlung eine starke Ausrottungswirkung hat.

Alternativ haben die Erfinder festgestellt, dass Oligosaccharid-Derivate, die ausgehend von partiell zersetzten Produkten von Nemacystus decipiens und von Meeressalat hergestellt worden sind, nicht nur eine die Therapie von Magenulkus befördernde Wirkung ausüben, sondern auch eine inhibitorische Wirkung gegenüber der Anheftung von Helicobacter pylori und eine antibakterielle Wirkung gegenüber dem Mikroorganismus ausüben (JP-A-11-60590). Die antibakterielle Wirkung der Derivat-Substanzen ist jedoch noch nicht zufrieden stellend, obwohl die Derivat-Substanzen eine starke, die Therapie von Ulcera befördernde Wirkung haben.

Einige antibakterielle Mittel, welche ein antimikrobiell wirksames Metallsalz von Polysacchariden (JP-A-8333213) oder ein antibakterielles Mittel, welches kovalent an Chondroitin oder Chondroitinsulfat gebunden ist (US-A-4 489 065), umfassen, sind ebenfalls bereits in diesem Fachgebiet beschrieben worden.

In einer solchen Situation haben die Erfinder Untersuchungen vorgenommen. In der Folge haben die Erfinder Saccharid-Derivate hergestellt, indem sulfatierte Polysaccharide mittels Säure-Behandlung zu einem Oligosaccharid modifiziert worden sind und zusätzlich das resultierende Oligosaccharid einer Periodat-Oxidation, einer Reaktion mit entsprechenen Aminen (antibakterielle Substanz) und einer Reduktionsbehandlung unterworfen worden ist. Dann haben die Erfinder verifiziert, dass sulfatierte Polysaccharide und die resultierenden Saccharid-Derivate hohe Affinität für Helicobacter pylori haben, um eine hervorragende antibakterielle Wirkung zu zeigen. Folglich ist man zu der Erfindung gelangt.

Es ist ein Gegenstand der Erfindung, ein antibakterielles Mittel mit hoher Affinität für Helicobacter pylori, um eine antibakterielle Wirkung auszuüben, welche für Helicobacter pylori spezifisch ist, bereitzustellen.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Das antibakterielle Mittel der Erfindung weist eine chemische Struktur auf, welche ein sulfatiertes Polysaccharid oder ein Oligosaccharid, welches durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, und eine antibakterielle Substanz, welche chemisch an das sulfatierte Polysaccharid oder das Oligosaccharid gebunden ist, enthält, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die antibakterielle Substanz chemisch an den reduzierten Endzucker des sulfatierten Polysaccharids oder des Oligosaccharids gebunden ist.

Das antibakterielle Mittel der Erfindung weist vorzugsweise eine chemische Struktur auf, die durch eine der folgenden Formeln dargestellt wird: Y-OCH(AH2NHR)n oder Y-BH2NHR, worin Y ein sulfatiertes Polysaccharid oder ein Oligosaccharid, das durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, darstellt; A einen Kohlenstoff darstellt, der von einer Aldehydgruppe abstammt, die durch die Reduktion des reduzierten Endzuckers von Y und nachfolgende Oxidation des resultierenden Produkts mit einem Oxidationsmittel auftritt; B einen Kohlenstoff darstellt, der von der Aldehydgruppe am reduzierten Endzucker von Y abstammt; R eine antibakterielle Substanz mit einer primären Aminogruppe oder mit einer darin eingeführten Aminogruppe darstellt oder ein Derivat einer antibakteriellen Substanz, das durch Binden einer antibakteriellen Substanz durch einen Abstandshalter an den Kohlenstoff A oder den Kohlenstoff B hergestellt wird, darstellt; und n = 1 oder 2.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das sulfatierte Polysaccharid oder das Oligosaccharid, das durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fucoidan, Oligofucose, die durch partielle Zersetzung von Fucoidan hergestellt wird, Carrageenan und Carrabiose, die durch partielle Zersetzung von Carrageenan hergestellt wird.

Die Erfindung stellt gleichfalls ein antibakterielles Mittel zur Verwendung zur Ausrottung von Helicobacter pylori zur Verfügung, wobei das Mittel das vorerwähnte antibakterielle Mittel als wirksame Komponente zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff in flüssiger oder fester Form umfasst.

Die Erfindung stellt zusätzlich ein prophylaktisches und therapeutisches Mittel für Magenulkus, umfassend das vorerwähnte antibakterielle Mittel als wirksame Komponente zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff in flüssiger oder fester Form, bereit.

Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des antibakteriellen Mittels, welches ein sulfatiertes Polysaccharid oder ein Oligosaccharid, welches durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, und eine antibakterielle Substanz, welche chemisch an das sulfatierte Polysaccharid oder das Oligosaccharid gebunden ist, enthält, bereitgestellt, welches Verfahren die Schritte umfasst:

Öffnen des Rings der Aldehydgruppe des Zuckerrests, der am reduzierten Ende des sulfatierten Polysaccharids oder des Oligosaccharids verbleibt, direkt oder durch oxidative Zersetzung, um eine Oligosaccharid-Fraktion zu gewinnen;

Ermöglichen, dass die Amingruppe einer antibakteriellen Substanz, welche der Ring-geöffneten Aldehydgruppe entspricht, mit der Oligosaccharid-Fraktion reagiert, um eine Schift-Base herzustellen; und

Reduzieren der resultierenden Schift-Base.

In dem antibakteriellen Mittel der Erfindung ist eine antibakterielle Substanz an ein sulfatiertes Polysaccharid oder ein Oligosaccharid, welches durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, gebunden, wie Fucoidan, Carrageenan, Rhamnansulfat, Condroitinsulfat, Heparin, Dermatansulfat und Keratansulfat. Dementsprechend hat das antibakterielle Mittel hohe Affinität für Helicobacter pylori und übt eine antibakterielle Wirkung, die für Helicobacter pylori spezifisch ist, aus.

Spezieller weist das sulfatierte Polysaccharid oder Oligosaccharid, welches durch partielle Zersetzung von diesem hergestellt wird, eine hohe Affinität für Helicobacter pylori auf, so dass das sulfatierte Polysaccharid oder Oligosaccharid an Helicobacter pylori adsorbiert oder gebunden wird, so dass diese die Anheftung von Helicobacter pylori an die Magenwand inhibieren. Unter Ausnutzung der Spezifität des sulfatierten Polysaccharids oder Oligosaccharids, welches durch partielle Zersetzung von diesem hergestellt wird, für Helicobacter pylori stellt die Erfindung ein antibakterielles Mittel bereit, welches hergestellt wird, indem eine antibakterielle Substanz an ein sulfatiertes Polysaccharid oder Oligosaccharid gebunden wird, nämlich ein neues antibakterielles Mittel, welches in der Lage ist, effektiv zu ermöglichen, dass die antibakterielle Substanz ihre Wirkung gegen Helicobacter pylori ausübt.

Es wird ins Auge gefasst, dass Fucoidan oder Carrageenan, insbesondere Fucoidan als das im Rahmen der Erfindung verwendete sulfatierte Polysaccharid aufgrund der resultierenden hohen antibakteriellen Wirkung zu bevorzugen sein könnte.

Da das erfindungsgemäße antibakterielle Mittel eine antibakterielle Wirkung gegenüber anderen pathologischen Bakterien als Helicobacter pylori aufweist, könnte das antibakterielle Mittel auch für diese pathologischen Bakterien anwendbar sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das antibakterielle Mittel eine chemische Struktur auf, welche ein sulfatiertes Polysaccharid oder ein Oligosaccharid, welches durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, und eine antibakterielle Substanz, welche chemisch an das reduzierte Ende des sulfatierten Polysaccharids oder des Oligosaccharids gebunden ist, umfasst, wobei die chemische Struktur dargestellt wird durch eine der folgenden Formeln: Y-OCH(AH2NHR)n oder Y-BH2NHR, worin Y ein sulfatiertes Polysaccharid oder ein Oligosaccharid, das durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, darstellt; A einen Kohlenstoff darstellt, der von einer Aldehydgruppe abstammt, die durch die Reduktion des reduzierten Endzuckers von Y und nachfolgende Oxidation des resultierenden Produkts mit einem Oxidationsmittel auftritt; B einen Kohlenstoff darstellt, der von der Aldehydgruppe am reduzierten Endzucker von Y abstammt; R eine antibakterielle Substanz mit einer primären Aminogruppe oder mit einer darin eingeführten Aminogruppe darstellt oder ein Derivat einer antibakteriellen Substanz, das durch Binden einer antibakteriellen Substanz durch einen Abstandshalter an den Kohlenstoff A oder den Kohlenstoff B hergestellt wird, darstellt; und n = 1 oder 2.

Spezieller ist Y in der Formel ein sulfatiertes Polysaccharid oder ein Oligosaccharid, das durch partielle Zersetzung desselben hergestellt wird, wie Fucoidan, Carrageenan, Rhamnansulfat, Chondroitinsulfat, Heparin, Dermatansulfat und Keratansulfat, wobei einige der Hydroxylgruppen zu sulfatierten Estern modifiziert sein können. Als sulfatiertes Polysaccharid können Oligosaccharide verwendet werden, welche durch eine Kombination von Ultrafiltrationsmembranen mit unterschiedlichen Fraktionierungsgrößen auf ein Molekulargewicht von ungefähr 300 bis 5000, vorzugsweise 300 bis 1000 eingestellt worden sind. In einem solchen Falle kann bei einer geringeren Antibiotika-Menge eine hohe antibakterielle Wirkung erzielt werden. Speziell zu bevorzugen sind Fucoidan mit einem Molekulargewicht von ungefähr 300 bis 5000, insbesondere 500 bis 3000 und Carrageenan mit einem Molekulargewicht von ungefähr 300 bis 2000, insbesondere 300 bis 900.

In der Formel ist R eine antibakterielle Substanz mit einer primären Amingruppe oder mit einer darin eingeführten Aminogruppe, wie aus der Cefem-Reihe, Penicillin-Reihe, Aminoglycosid-Reihe, Macrolid-Reihe, Pyridocarboxylat-Reihe, Oxafem-Reihe, Monobactam-Reihe, Carbapenem-Reihe, Tetracyclin-Reihe, Peptidreihe, Chloramphenicol und Sulfa-Mittel oder Derivate davon mit darin eingeführten Abstandshaltern.

Spezieller umfassen antibakterielle Mittel aus der Cefem-Gruppe Cefotaxim, Cephalotin, Cephaloridin, Cephalexin, Cefradin, Cefazolin, Ceftezol, Cephapirin, Cephacetril, Cefoxitin, Cefmetazol, Cefroxim, Cefotiam, Cephamandol, Cefsulodin, Ceftizoxim, Ceftazidim, Cefotetan, Cefmenoxim, Ceftriaxon, Cefoperazon, Cefbuperazon und Cefixim.

Antibakterielle Mittel aus der Penicillin-Gruppe umfassen Ampicillin, Benzyl-PC, Phenethicillin, Propicillin, Methicillin, Zxacillin, Cloxacillin, Amoxicillin, Cyclacillin, Carbenicillin, Sulbenicillin und Piperacillin.

Antibakterielle Mittel aus der Aminoglycosid-Gruppe umfassen Kanamycin, Bekanamycin, Tobramysin, Dibekacin, Gentamycin, Amikacin, Habekacin, Neomycin B und Paromomycin.

Antibakterielle Mittel aus der Macrolid-Gruppe umfassen Erythromycin, Kitasamycin, Acetylkitasamycin, Oleandomycin, Josamycin, Acetylspiramycin und Midecamycin.

Antibakterielle Mittel aus der Pyridocarboxylat-Gruppe umfassen Nalixidinsäure, Oxolinsäure, Norfloxacin, Piromidinsäure, Ofloxacin und Ciprofloxacin.

Antibakterielle Mittel aus der Oxafem-Gruppe umfassen Latamoxef.

Antibakterielle Mittel aus der Monobactam-Gruppe umfassen Sulfazecin und Monobactam.

Antibakterielle Mittel aus der Carbapenem-Gruppe umfassen Thienamycin.

Antibakterielle Mittel aus der Tetracyclin-Gruppe umfassen Tetracyclin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Demethylchlortetracyclin, Doxycyclin, Methacyclin und Minocyclin.

Antibakterielle Mittel aus der Peptid-Gruppe, die andere sind als jene, die in einem jeglichen der oben beschriebenen individuellen antibakteriellen Mittel enthalten sind, umfassen Gramicidin, Penicillin, Polymyxin, Gramicidin S, Viomycin und Actinomycin.

Diese antibakteriellen Mittel haben so hohe Affinität für insbesondere Helicobacter pylori, dass jedes der antibakteriellen Mittel spezifisch an Helicobacter pylori adsorbiert oder gebunden wird. So ist jedes der antibakteriellen Mittel besonders wirksam als ein antibakterielles Mittel für eine Verwendung gegen Helicobacter pylori. Darüber hinaus inhibiert das antibakterielle Mittel spezifisch Helicobacter pylori, so dass das Mittel als ein prophylaktisches und therapeutisches Mittel für Magenulkus verwendet werden kann.

Um Derivate eines sulfatierten Polysaccharids oder eines Oligosaccharids, welches durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, herzustellen, kann man beispielsweise das Verfahren zur Herstellung von Oligofucose-Derivaten verwenden, welches Verfahren die Schritte 1 bis 8, wie nachfolgend beschrieben, umfasst.

Schritt 1: Extrahieren von Polysacchariden aus Meeresalgen (Phaecophyceae, wie Nemacystus, Kurome und Fucus), welche Fucoidan enthalten, durch bekannte Extraktionsverfahren (siehe K. Matsuda, Biochemistry Experimental Methods, Nr. 20, „Separation and Purification of Polysaccharides", Gakkai Shuppan Center).

Schritt 2: Lösen des resultierenden Fucoidans in einer Salzsäurelösung oder Trifluoressigsäurelösung von ungefähr 0,05 M bis 0,1 M, Erwärmen der resultierenden Lösung bei 100°C für 10 bis 20 min, um das Fucoidan zu einem Oligosaccharid zu modifizieren, und Neutralisieren der Lösung mit Natriumhydroxid. Die Oligosaccharid-Modifizierung kann in zufrieden stellender Weise ausgeführt werden unter Verwendung von Fucoidanase (Fucoidan-Zersetzungsenzym).

Die Reaktionsbedingungen können dann in geeigneter Weise bestimmt werden. Zu der so gewonnenen Oligosaccharid-Lösung wird NaBH4 für ein Reduktionsverfahren bei Umgebungstemperatur oder 4°C für 16 h zugesetzt (siehe JP-A-6-247861 und JP-A-7-138166).

Schritt 3: Entsalzen der Lösung des Oligosaccharids in Form von Alditol, wie es durch die in Schritt 2 ausgeführten Prozeduren gewonnen wird, durch Elektrodialyse (Microacylizer, hergestellt von Asahi Chemical Industry, Co., Ltd.).

Schritt 4: Zusetzen von Natriummetaperiodat zu der Lösung in Schritt 3 für eine Umsetzung bei Eistemperatur für ungefähr eine Stunde (die Reaktionsdauer kann in zufrieden stellender Weise länger sein abhängig von der Struktur der Zuckerkette, beispielsweise der Struktur eines Oligosaccharids mit 1→3-Bindung). Ethylenglycol wird in einem Volumen, welches einen Überschuss gegenüber der Periodsäure darstellt, zu der Reaktionslösung hinzugesetzt für eine Umsetzung für eine weitere Stunde. Die resultierende Lösung wird auf die gleiche Weise wie in Schritt 3 entsalzt. Durch die Vorgehensweisen kann ein Oligosaccharid mit einer Aldehydgruppe an dem reduzierten Ende desselben gewonnen werden.

Schritt 5: Essigsäure wird zu der in Schritt 4 hergestellten Probe bis zu einer Konzentration von 0,5 M zugesetzt für eine Reaktion bei Umgebungstemperatur für 20 h (unter Bedingungen, welche die Oxidation der Zuckerketten auf der Seite des nicht-reduzierten Endes in keiner Weise fördern, kann diese Prozedur übersprungen werden). Unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran oder Dialysemembran für das beabsichtigte Molekulargewicht wird die Reaktionslösung entsalzt, während Ethylenglycol und die Zersetzungsprodukte davon entfernt werden, um ein Oligosaccharid zurückzugewinnen. Zusätzlich kann die Oligosaccharid-Fraktion in eine gewünschte Molekülgröße überführt werden unter Verwendung einer Aktivkohle-Chromatographie und Gelfiltration, außer der Reinigung durch diese Verfahren.

Schritt 6: Die Oligosaccharid-Fraktion wird in Wasser gelöst, gefolgt von der Zugabe eines antibakteriellen Mittels, das dort hinein eingeführt werden soll, für eine Reaktion bei Umgebungstemperatur für eine Stunde, um eine Schift-Base herzustellen.

Schritt 7: Zu der in Schritt 6 gewonnenen Lösung wird Boran-Dimethylamin zugesetzt für eine Umsetzung bei Umgebungstemperatur für 20 h, um die Schiff-Base zu reduzieren. Als ein solches Reduktionsmittel können jegliche Reduktionsmittel, welche für den Zweck der Erfindung geeignet sind, in geeigneter Weise verwendet werden (beispielsweise Boran-Trimethylamin, NaCNBH3, NaBH4 u.s.w.).

Schritt 8: Nach vollständigem Abschluss der Umsetzung werden überschüssige Reagenzien durch Ultrafiltration oder Dialyse entfernt. Nach der Entfernung der überschüssigen Reagenzien wird die resultierende reduzierte Lösung durch Gefriertrocknung getrocknet oder durch Ionenaustauschchromatographie weiter gereinigt. Es wurde verifiziert, dass das so gewonnene Oligosaccharid-Derivat eine hohe antibakterielle Wirkung gegen Helicobacter pylori als das ätiologische Bakterium von Magenulkus hatte.

Aus Fucoidan an sich ohne die Schritte 2 und 3 hergestellte Polysaccharid-Derivate können die gleiche Wirkung ausüben. Die Dosis des antibakteriellen Mittels der Erfindung kann in geeigneter Weise auf die gleiche Weise wie für generelle pharmazeutische Arzneimittel ausgewählt werden, vorzugsweise gemäß der Verordnung eines Arztes. Beispielsweise wird ein aus Oligofucose mit einem Molekulargewicht von 500 bis 3000 hergestelltes Derivat in einer Dosis von 100 mg/Tag bis 500 mg/Tag pro Erwachsenem, insbesondere in einer Dosis von 200 mg/Tag bis 300 mg/Tag pro Erwachsenem verabreicht. In einem solchen Falle kann eine hohe antibakterielle Wirkung realisiert werden zusammen mit der Unterdrückung der Nebenwirkungen. Das höhere Molekulargewicht von Fucoidan macht die höhere Dosis für ein bestimmtes Niveau antibakterieller Wirkung erforderlich. Dementsprechend kann in dem Falle, wo Fucoidan mit einem andern Wert für das Molekulargewicht verwendet wird, der Fucoidan-Gehalt in geeigneter Weise je nach dem Molekulargewicht desselben angepasst werden.

Die Form des erfindungsgemäßen antibakteriellen Mittels kann in geeigneter Weise ausgewählt werden. Typischerweise wird das antibakterielle Mittel gemischt mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in flüssiger oder fester Form, zu welchem Lösemittel, Dispersionsmittel, Emulgatoren, Puffer, Stabilisatoren, Trägersubstanzen/Vehikel, Bindemittel, Aufschlussmittel und/oder Gleitmittel hinzugesetzt werden, sofern erforderlich, um das antibakterielle Mittel zu Tabletten, Granulat, Pulvern oder Kapseln für eine Verwendung zu formulieren.

Wie oben beschrieben, stellt die Erfindung in vorteilhafter Weise ein antibakterielles Mittel mit einer hohen Affinität für Helicobacter pylori und einer antibakteriellen Wirkung, die für Helicobacter pylori spezifisch ist, bereit.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt ein 13C-NMR-Diagramm von OF-CTX; die Abszisse repräsentiert die relative Intensität des gemessenen Signals, während die Ordinate die Frequenz (Hz) darstellt; und

2 zeigt ein Diagramm, welches die inhibitorischen Wirkungen von OF-CTX und CTX auf die Vermehrung von Helicobacter pylori zeigt; die Abszisse repräsentiert die Trübung (600 nm) und die Ordinate stellt die zugesetzten Mengen (&mgr;g/ml) dar.

BESTE WEISE FÜR DAS AUSFÜHREN DER ERFINDUNG Beispiel 1: Herstellung eines Oligofucose-Derivats (1.1) Fucoidan-Extraktion und Oligofucose-Herstellung

Cladosiphon okamuranus Tolida wurde in entionisiertem Wasser entsalzt. Danach wurden die resultierenden Algen in entionisiertem Wasser in einem Verhältnis von 1 kg der Algen pro ein Liter entionisiertes Wasser suspendiert. Die Suspension wurde mit Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Nach Erwärmen der resultierenden Lösung bei 100°C für 10 min für eine Extraktion und Filtrieren der Algen durch Gaze wurde das resultierende Filtrat des Weiteren zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen (9000 Upm, 60 min).

Nachdem der Überstand mit NaOH neutralisiert worden war, wurde Natriummetaperiodat bis zu einer Endkonzentration von 0,2 M zugesetzt, um als Verunreinigung enthaltene Bestandteile von Alginsäure und Uronsäure zu zersetzen. Nach einer zwanzigstündigen Umsetzung im Dunkeln wurde die Umsetzung mit Ethylenglycol beendet. Zu der resultierenden Lösung wurde Natriumborhydrid bis zu einer Konzentration von 0,2 M für eine Umsetzung bei Umgebungstemperatur für 16 h zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde über Ultrafiltration (fraktioniertes Molekulargewicht von 5000) für eine Dialyse aufkonzentriert. Mit Salzsäure wurde die dialysierte Lösung auf pH 2 eingestellt. Dann wurde die Lösung unter Erwärmen bei 10°C für 10 min behandelt. Nachdem die behandelte Lösung dialysiert und gefriergetrocknet worden war, wurde Fucoidan gewonnen (4 g/1 kg feuchte Algen).

(1.2) Herstellung und Periodat-Oxidation von Oligofucose

Fucoidan wurde in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 200 mg/ml gelöst, wozu Salzsäure (oder es kann Trifluoressigsäure zufrieden stellend sein) bis zu einer Endkonzentration von 0,075 M bis 0,1 M zugesetzt wurde. Nach Erwärmen bei 100°C für 10 min wurde die resultierende Lösung auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde mit NaOH neutralisiert und dann wurde NaBH4 in einem Verhältnis von 200 mg pro 1 g Fucoidan zugesetzt. Die Mischung wurde zusammen bei 4°C 20 h umgesetzt.

Die Reaktionslösung wurde mit Essigsäure auf pH 6 eingestellt, die dann mittels einer Elektrodialysiereinrichtung (Asahi Chemical Industry, Co., Ltd.; Microacylizer; es wurde eine AC220-Membran verwendet) entsalzt wurde. Nach dem Entsalzen wurde NaIO4 zu der Probenlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,2 M zugesetzt für eine Umsetzung bei Eistemperatur für eine Stunde. Ethylenglycol wurde in einer Menge von 2 Äquivalenten entsprechend jener der Periodsäure zu der Reaktionslösung hinzugesetzt für eine weitere Umsetzung bei Eistemperatur für eine Stunde. Die Reaktionslösung wurde zur Aufkonzentrierung durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Fraktionierungs-Molekulargewicht von 1000 (hergestellt von Millipore Co.) filtriert. Die innere Lösung wurde gefriergetrocknet, wodurch ein Aldehyd-Derivat von Oligofucose erhalten wurde (Ausbeute von ungefähr 25%).

(1.3) Kopplungsreaktion mit einer antibakteriellen Substanz und Reduktion

Das Aldehyd-Derivat (5 g) des Oligosaccharids, wie in (1.2) hergestellt, wurde in Wasser (100 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von 1 g Cefotaxim (CTX). Nach Zugabe von 1 ml 0,5 M NaH-CO3-Lösung schritt die Reaktion bei Umgebungstemperatur 1 h fort. Nach der Umsetzung wurde 1 g Boran-Dimethylamin-Komplex zugesetzt für eine Umsetzung bei Umgebungstemperatur für 20 h. Die Reaktionslösung wurde einen Tag lang gegen eine Dialysemembran mit einem Fraktionierungs-Molekulargewicht von 1000 dialysiert. Die resultierende Lösung wurde gefriergetrocknet, um die Zielprobe OF-CTX (Ausbeute 1,14 g) zu erhalten. 1 zeigt ein 13C-NMR-Diagramm des resultierenden OF-CTX. Die Struktur des OF-CTX wird speziell durch die folgende chemische Formel (1) gezeigt.

Chemische Formel (1)

Auf die gleiche Weise wie in dem Falle von (1.3) fand die Reaktion statt mit der Ausnahme, dass Ampicillin anstelle von Cefotaxim verwendet wurde, um das Oligofucose-Ampicillin-Derivat OF-AM zu erhalten. Die Struktur des resultierenden OF-AM wird speziell durch die nachfolgend angegebene chemische Formel (2) gezeigt.

Oligofucose (2 g) wurde in 80 ml wässrigem 40%-igem Ethanol (0,05 M NaCO) gelöst. 350 mg 12-Aminolaurinsäure (C12) wurde zu der resultierenden Lösung hinzugesetzt für eine Umsetzung bei 45°C für eine Stunde. Es wurden 300 mg Boran-Dimethylamin zugesetzt für eine Umsetzung bei 45°C für 16 h.

Chemische Formel (2)

Nach der Umsetzung wurde die Lösung gegen einen Dialyseschlauch mit einem Fraktionierungs-Molekulargewicht mit einer Trenngrenze von 1000 dialysiert. Das gefriergetrocknete Dialyseprodukt (875 mg) wurde in 10 ml Wasser gelöst, gefolgt von der Zugabe von 500 mg EDC. Nach Umsetzung bei Umgebungstemperatur für 2 h wurden 350 mg Cefotaxim-Na zugesetzt für eine Umsetzung für 4 h. Dann wurde die Lösung gegen eine Dialysemembran mit einem Fraktionierungs-Molekulargewicht von 1000 2 Tage dialysiert. Die resultierende Lösung wurde gefriergetrocknet, um ein Derivat OF-C12-CTX mit einer Ausbeute von 384 mg zu erhalten. Die Struktur des resultierenden OF-C12-CTX wird speziell durch die nachfolgend angegebene chemische Formel (3) gezeigt.

4,5 g Aminolaurinsäure wurden in 200 ml wässrigem, 30%-igem Ethanol suspendiert, gefolgt von einer geeigneten Zugabe von NaOH für eine Auflösung. 14,5 g Oligofucose wurden zu der resultierenden Lösung für eine Umsetzung bei 40°C für eine Stunde zugesetzt. Nach Zugabe von 3 g Boran-Dimethylamin schritt die Umsetzung bei 40°C 20 h fort. Die resultierende Reaktionslösung wurde mit Salzsäure auf pH 5 eingestellt für eine Zentrifugation bei 9000 Upm für 15 min. Der resultierende Überstand wurde dann gegen eine Dialysemembran mit einem Fraktionierungs-Molekulargewicht mit einer Trenngrenze von 1000 dialysiert. Nachdem das dialysierte Produkt filtriert und gefriergetrocknet worden war, wurde ein Aminolaurat-Derivat von Oligofucose erhalten (Ausbeute: 2,67 g).

Das resultierende Derivat wurde in 40 ml Wasser suspendiert, gefolgt von der Zugabe von Methanol, bis das Derivat darin gelöst war. Die resultierende Lösung wurde mit Salzsäure auf pH 5 eingestellt, gefolgt von der Zugabe von 3,5 g wasserlöslichem Carbodiimid und 1,5 g N-Hydroxysuccinimid für eine Umsetzung bei Umgebungstemperatur für 20 h. Die Reaktionslösung wurde dialysiert und gefriergetrocknet. Das resultierende trockene Produkt von 1,2 g wurde in Wasser (20 ml) gelöst.

Chemische Formel (3)

Natriumampicillin (0,5 g) wurde zu der Lösung hinzugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 1 ml 1 M NaHCO3. Nach Umsetzung bei Umgebungstemperatur für 20 h wurde die Reaktionslösung gegen eine Dialysemembran mit einer Trenngrenze von 1000 dialysiert. Nachdem die dialysierte innere Lösung filtriert und gefriergetrocknet worden war, wurde ein Ampicillin-Derivat OF-C12-AM mit einem in die Oligofucose darin eingeführten Abstandshalter gewonnen (Ausbeute: 230,6 mg). Die Struktur des so gewonnenen OF-C12-AM wird speziell durch die folgende chemische Formel (4) gezeigt.

Chemische Formel (4)
Beispiel 2: Herstellung eines Carrabiose-Derivats

Kappa-Carrageenan (10 g) wurde mit Wasser in 100 ml 0,3 N Schwefelsäure imprägniert. Nach Permeation bei 40°C für 20 h erfolgte ein Erwärmen bei 100°C für 10 min. Man ließ die resultierende Mischung bis zu Umgebungstemperatur stehen, und diese wurde dann neutralisiert. Nach Entfernung von unlöslichen Materialien durch Zentrifugation (20000 Upm für 30 min) wurde die resultierende Lösung mittels eines Microacylizers entsalzt und wurde dann gefriergetrocknet, wodurch 9,74 g Carrabiose erhalten wurden.

Zu 1 g so gewonnener Carrabiose wurde 1 g Ampicillin zugesetzt und die resultierende Mischung wurde in 20 ml entionisiertem Wasser gelöst. Zu 1 g Carrabiose wurde alternativ 1 g Cefotaxim zugesetzt und die resultierende Mischung wurde in 20 ml entionisiertem Wasser gelöst. Diese Lösungen wurden hergestellt, wie oben beschrieben.

Nach Umsetzung bei 35°C für eine Stunde wurde 1 g Boran-Dimethylamin zu den individuellen Reaktionsmischungen zugesetzt für eine Umsetzung bei 25°C für 20 h. Zu jeder der Reaktionslösungen wurde 1 ml 1 M Acetatpuffer, pH 4,6, zugesetzt, welche dann einer zuvor äquilibrierten Microprep HIGHQ (15 ml) für eine Elution mit 80 ml 50 mM Acetat-Puffer unterworfen wurde. Auf eine solche Weise wurden nicht umgesetzte Antibiotika und Boran eluiert. In der Folge wurden für die Elution 80 ml des gleichen Puffers, welcher des weiteren 1 M NaCl enthielt, verwendet.

Nach Sammeln der Fraktionen und Entsalzen der Fraktionen mittels Elektrodialyse wurde eine Dialyse mit einer Dialysemembran mit einem Fraktionierungs-Molekulargewicht mit einer Trenngrenze von 500 ausgeführt. Nach Rückgewinnung und Gefriertrocknung der dialysierten Produkte wurden das Carrabiose-Ampicillin-Derivat (CarrabioAM) und das Canabiose-Cefotaxim-Derivat (CarrabioCTX) in einer Menge von 587 mg bzw. 437 mg gewonnen.

Die Strukturen des resultierenden Carrabiose-Ampicillin-Derivats CarrabioAM und des resultierenden Carrabiose-Cefotaxim-Derivats CarrabioCTX werden speziell durch die folgenden chemischen Formeln (5) bzw. (6) gezeigt.

Chemische Formel (5)
Chemische Formel (6)
Beispiel 3: Demonstration 1, Antibakterielle Wirkung gegen Helicobacter pylori

Die die Vermehrung von Helicobacter pylori inhibierende Aktivität wurde durch das folgende Verfahren bestimmt. Zu 1 ml des Brucella-Kulturmediums wurden 100 &mgr;l eines klinischen Helicobacter pylori-Isolat-Stamms (1,5 × 108 CFU/ml) zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,3, 6,9 und 12 &mgr;l von 1 mg/ml OF-CTX oder Cefotaxim-Natrium CTX. Nach Kultivierung bei 37°C für 3 Tage wurde die Trübung (bei A600) gemessen, um das Vermehrungsverhältnis zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.

Wie in der Figur gezeigt, inhibierte OF-CTX in einer Konzentration von 6 &mgr;g/ml nahezu vollständig die Vermehrung von Helicobacter pylori. Die Aktivität war geringfügig geringer als die Aktivität von Cefotaxim, aber der Cefotaxim-Gehalt in dem OF-CTX-Molekül betrug ungefähr 1/10 bezogen auf das Molverhältnis. Folglich wird gezeigt, dass die OF-CTX-Aktivität höher ist als die Aktivität von CTX allein.

Beispiel 4: Demonstration 2, Antibakterielle Wirkung gegen Helicobacter pylori

Helicobacter pylori wird in 25 ml Brucella-Kulturmedium suspendiert. Dann werden jeweils 500 &mgr;l-Anteile abgeteilt, zu welchen 30 &mgr;l des Kulturmediums allein oder 30 &mgr;l des Kulturmediums zusammen mit 1 mg/ml OF-CTX für eine Behandlung bei 0°C für 0 bis 25 min zugesetzt werden. Nach Zentrifugation bei 14000 Upm für 7 min wird das Präzipitat erneut in 1 ml des Kulturmediums suspendiert. Die resultierende Suspension wird in 100 &mgr;l-Anteile aufgeteilt. Zu der Suspension wird 1 ml des Kulturmediums zugesetzt für eine Kultivierung bei 37°C für 3 Tage, um die Trübung bei 600 nm zu messen. In der Folge beträgt die Trübung der zuvor mit OF-CTX behandelten Gruppe 0,153, während die Trübung der Kontrollgruppe 0,494 beträgt, was anzeigt, dass OF-CTX eine die Vermehrung zu ungefähr 70% inhibierende Wirkung ausübt.

Wie oben beschrieben, haben gemäß der Erfindung die Derivate von Fucoidan und Oligofucose antibakterielle Wirkungen gegenüber Helicobacter pylori. Wie in Beispiel 4 gezeigt, behalten diese Derivate die Wirkung nach dem Spülen bei. Folglich wird gezeigt, dass diese Derivate an Helicobacter pylori haften und folglich die Wirkung ausüben. Dementsprechend wird gezeigt, dass diese Derivate als Arzneimittel, die für die therapeutische Behandlung von Magenulkus und Magenkrebs und als antibakterielle Mittel mit zielgerichteter Wirkung (Spezifität) gegenüber Helicobacter pylori vorteilhaft sind, verwendet werden können.

Beispiel 5: Demonstration 3, Antibakterielle Wirkung gegen Helicobacter pylori

Die Helicobacter pylori-Kultur wurde in einem Brucella-Kulturmedium, welches 5% FCS enthielt, zu einer Konzentration von 1,5 × 108 CFU/ml suspendiert. Es wurde dann jeweils ein 200 &mgr;l-Anteil als Inokulum in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen eingebracht. Nachfolgend wurde jeweils ein 2 &mgr;l-Anteil des Carrabiose-Ampicillin-Derivats CarrabioAM oder des Carrabiose-Cefotaxim-Derivats CarrabioCTX, die in Beispiel 2 erhalten worden waren (jeweils in einer Konzentration von 1 mg/ml), als Inokulum darauf aufgebracht. Nach Bewegung wurde das Bakterium unter geringfügig aeroben Bedingungen bei 37°C 3 Tage kultiviert, um die Trübung bei 600 nm zu messen. In der Folge betrugen die Absorptionsniveaus des Carrabiose-Ampicillin-Derivats CarrabioAM und des Carrabiose-Cefotaxim-Derivats CarrabioCTX 0,003 bzw. 0,000, während die Absorption der Kontrollgruppe 0,835 betrug. Folglich wird angezeigt, dass diese antibakteriellen Mittel die Vermehrung von Helicobacter pylori vollständig unterdrückten.


Anspruch[de]
  1. Antibakterielles Mittel mit einer chemischen Struktur, die ein sulfatiertes Polysaccharid oder ein Oligosaccharid, das durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, und eine antibakterielle Substanz umfasst, die chemisch an das sulfatierte Polysaccharid oder das Oligosaccharid gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass die antibakterielle Substanz chemisch an den reduzierten Endzucker des sulfatierten Polysaccharids oder des Oligosaccharids gebunden ist.
  2. Antibakterielles Mittel nach Anspruch 1, in dem die chemische Struktur durch eine der folgenden Formeln dargestellt wird: Y-OCH(AH2NHR)n oder Y-BH2NHR worin Y ein sulfatiertes Polysaccharid oder ein Oligosaccharid darstellt, das durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird; A einen Kohlenstoff darstellt, der von einer Aldehydgruppe abstammt, die durch die Reduktion des reduzierten Endzuckers von Y und anschließende Oxidation des resultierenden Produkts mit einem Oxidationsmittel auftritt; B einen Kohlenstoff darstellt, der von der Aldehydgruppe am reduzierten Endzucker von Y abstammt; R eine antibakterielle Substanz mit einer primären Aminogruppe oder einer darin eingeführten Aminogruppe darstellt oder ein Derivat einer antibakteriellen Substanz darstellt, das durch Binden einer antibakteriellen Substanz durch einen Abstandshalter an den Kohlenstoff A oder den Kohlenstoff B hergestellt wird; und n = 1 oder 2.
  3. Antibakterielles Mittel nach Anspruch 1, in dem das sulfatierte Polysaccharid oder das Oligosaccharid, das durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fucoidan, Oligofucose, die durch partielle Zersetzung von Fucoidan hergestellt wird, Carrageenan und Carrabiose, die durch partielle Zersetzung von Carrageenan hergestellt wird.
  4. Antibakterielles Mittel zur Verwendung gegen Helicobactor pylori, umfassend ein antibakterielles Mittel nach Anspruch 1 als wirksame Komponente zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff.
  5. Prophylaktisches und therapeutisches Mittel für Magenulkus, umfassend ein antibakterielles Mittel nach Anspruch 1 als wirksame Komponente zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff.
  6. Verfahren zur Herstellung eines antibakteriellen Mittels nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:

    Öffnen des Rings der Aldehydgruppe des Zuckerrests, der am reduzierten Ende des sulfatierten Polysaccharids oder des Oligosaccharids, das durch partielle Zersetzung des sulfatierten Polysaccharids hergestellt wird, verbleibt, direkt oder durch oxidative Zersetzung, um eine Oligosaccharid-Fraktion zu gewinnen;

    Ermöglichen, dass die Amingruppe einer antibakteriellen Substanz, welche der Ring-geöffneten Aldehydgruppe entspricht, mit der Oligosaccharid-Fraktion reagiert, um eine Schiff-Base herzustellen; und Reduzieren der resultierenden Schift-Base.
Es folgen 2 Blatt Zeichnungen






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