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Dokumentenidentifikation DE102004027856A1 06.07.2006
Titel Neue Pflanzenextrakte mit neuropotektiven, neuroregenerativen und entzündungshemmenden Eigenschaften
Anmelder Ullrich, Oliver, Prof. Dr. Dr., 39120 Magdeburg, DE
Erfinder Ullrich, Oliver, Prof. Dr. Dr., 39120 Magdeburg, DE
Vertreter BOEHMERT & BOEHMERT, 80336 München
DE-Anmeldedatum 08.06.2004
DE-Aktenzeichen 102004027856
Offenlegungstag 06.07.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.07.2006
IPC-Hauptklasse A61K 36/185(2006.01)A, F, I, 20051128, B, H, DE
IPC-Nebenklasse A61P 25/00(2006.01)A, L, I, 20051128, B, H, DE   A61P 29/00(2006.01)A, L, I, 20051128, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft Extrakte aus den Pflanzen Knema laurina und/oder Styrax fraserensis, Styrax benzoin und/oder Styrax tonkinensis, Verfahren zur Herstellung dieser Extrakte, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Extrakte enthalten, sowie die Verwendung der Extrakte zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Vorbeugung und/oder Behandlung von neurologischen Erkrankungen und/oder entzündungsbedingten Erkrankungen.

Beschreibung[de]

Die vorliegenden Erfindung betrifft Extrakte aus den Pflanzen Knema laurina und/oder Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis, Verfahren zur Herstellung dieser Extrakte, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Extrakte enthalten, sowie die Verwendung der Extrakte zur Herstellung eines pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Vorbeugung und/oder Behandlung von neurologischen Erkrankungen und/oder entzündungsbedingten Erkrankungen.

Pflanzenextrakte werden seit vielen Jahren in den unterschiedlichsten Kulturen für medizinische und andere Zwecke genutzt. Es werden immer wieder neue Pflanzenextrakte gewonnen, um deren medizinische Wirkung zu untersuchen. Viele Pflanzen, deren Nutzen man bisher noch nicht kannte und die als exotisch und unbedeutend galten, finden heute breite Anwendung, insbesondere in der Medizin. Die Naturstoffforschung nimmt demnach eine zentrale Rolle bei der Arzneimittelentwicklung ein. Ohne diese Disziplin würden ganze Therapiebereiche völlig brach liegen (Verdine G. Nature (1996) 384:11–13). Ein Wirkstoff, der aus einer natürlichen Quelle isoliert worden ist, wird heutzutage chemisch und pharmazeutisch so optimiert, daß die Nebenwirkungen des Wirkstoffes geringer werden und die spezifische Hauptwirkung verbessert wird. Ein Beispiel für die erfolgreiche Suche nach medizinisch relevanten Wirkstoffen aus natürlichen Quellen ist das Zytostatikum Taxol aus der Rinde einer pazifischen Eibenart (Taxus brevifolia). Diese Entdeckung hat die Wirkstoffsuche in Pflanzen wieder stärker in den Vordergrund gerückt.

Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzenextrakte aus Pflanzen zu gewinnen, die bisher für die medizinische Anwendung nicht bekannt waren und deren Inhaltsstoffe nun als Wirkstoffe in pharmazeutischen Zubereitungen nutzbar gemacht werden können.

Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird diese erfindungsgemäße Aufgabe durch die Bereitstellung eines Extrakts und/oder von Extrakten der Pflanze Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis aus der Familie der Styracaceae gelöst.

Bei der Pflanze Styrax fraserensis handelt es sich um einen Strauch oder Baum. Unter dem Begriff Pflanze sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung sowohl ganze Pflanzen als auch Pflanzenteile wie z.B. Blätter, Rinden, Blüten, Früchte, Samen, Wurzeln etc. sowie deren Gemische zu verstehen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Extrakt aus der Pflanze Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis, wobei als Extraktionsmedium Lösungsmittel oder Mischungen von Lösungsmittel verwendet werden, welche ausgewählt sind aus der Gruppe von destilliertem oder nicht destilliertem Wasser, niedermolekularen Alkoholen, Estern, Äthern, Polyolen, chlorierten Lösungsmitteln, Kohlenwasserstoffen, Ketonen oder halogenhaltigen Kohlenwasserstoffen. Die Herstellung der erfindungsgemäß einzusetzenden Extrakte erfolgt durch übliche Methoden der Extraktion von Pflanzen bzw. Pflanzenteilen. Bezüglich der geeigneten herkömmlichen Extraktionsverfahren wie der Mazeration, der Remazeration, der Digestion, der Bewegungsmazeration, der Wirbelextraktion, Ultraschallextraktion, der Gegenstromextraktion, der Perkolation, der Reperkolation, der Evakolation (Extraktion unter vermindertem Druck), der Diakolation und Festflüssig-Extraktion unter kontinuierlichem Rückfluß, die in einem Soxhlet-Extraktor durchgeführt wird, die dem Fachmann geläufig und im Prinzip alle anwendbar sind, sei beispielhaft auf Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis (5. Auflage, Bd. 2; S 1026–1030 Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York (1991)) verwiesen. Als Ausgangsmaterial können frische Pflanzen oder Pflanzenteile eingesetzt werden, üblicherweise wird jedoch von getrockneten Pflanzen und/oder Pflanzenteilen ausgegangen, die vor der Extraktion mechanisch zerkleinert werden können. Hierbei eignen sich alle dem Fachmann bekannten Zerkleinerungsmethoden, als Beispiel sei die Zerstoßung mit einem Mörser genannt.

Als Lösungsmittel für die Durchführung der Extraktionen können alle Lösungsmittel mit einer gewissen Polarität, vorzugsweise organische Lösungsmittel, Wasser (destilliert oder nicht destilliert) oder Gemische aus organischen Lösungsmitteln und Wasser, insbesondere niedermolekulare Alkohole, Ester, Kohlenwasserstoffe, Ketone oder halogenhaltige Kohlenwasserstoffe mit mehr oder weniger hohen Wassergehalten verwendet werden. Beispiele sind protische (Wasser, Alkohole, Säuren, primäre und sekundäre Amine) und aprotische (Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Hexamethylphosphorsäuretriamid, Nitromethan, tert-Amine) Lösungsmittel. Besonders bevorzugt ist die Extraktion mit Wasser, Methanol, Ethanol, Pentan, Hexan, Heptan, Aceton, Chloroform, Propylenglycolen, Polyethylenglycolen Ethylacetat, Dichlormethan, Trichlormethan sowie Mischungen hieraus. Die Extraktion erfolgt in der Regel bei 15 bis 100 °C, bevorzugt bei 20 bis 45 °C, weiter bevorzugt in etwa bei Körperwärme In einer möglichen Ausführungsform erfolgt die Extraktion unter Inertgasatmosphäre zur Vermeidung der Oxidation der Inhaltsstoffe des Extraktes. Die Extraktionszeiten werden vom Fachmann in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial, dem Extraktionsverfahren, der Extraktionstemperatur, vom Verhältnis Lösungsmittel zu Rohstoff u.a. eingestellt. Nach der Extraktion können die erhaltenen Rohextrakte gegebenenfalls weiteren üblichen Schritten, wie beispielsweise Aufreinigung, Konzentration und/oder Entfärbung unterzogen werden. Falls wünschenswert, können die so hergestellten Extrakte beispielsweise einer selektiven Abtrennung einzelner unerwünschter Inhaltsstoffe unterzogen werden. Die Extraktion kann bis zu jedem gewünschten Extraktionsgrad erfolgen, wird aber gewöhnlich bis zur Erschöpfung durchgeführt. Typische Ausbeuten (= Trockensubstanzmenge des Extraktes bezogen auf eingesetzte Rohstoffmenge) bei der Extraktion getrockneter Pflanzen liegen im Bereich von 3 bis 20, insbesondere 10 bis 17 Gew.-%. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Erkenntnis, daß die Extraktionsbedingungen sowie die Ausbeuten der Endextrakte je nach gewünschtem Einsatzgebiet gewählt werden können. Falls gewünscht, können die Extrakte anschließend beispielsweise einer Sprüh- oder Gefriertrocknung unterworfen werden. Unter dem Begriff "Extrakt" gemäß der vorliegenden Erfindung wird demnach ein Stoff und/oder Stoffgemisch verstanden, der/das durch einen oder mehreren Extraktions- und/oder anderen Verfahrensschritten aus einer Pflanze gewonnen wird.

Nach einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung können die für die Vorbereitung des Extraktes oder der Extrakte der Pflanze Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis verwendeten Pflanzenteile die Wurzeln, Rinden (der Wurzel, der Stengel und des Stammes), die Blätter und beblätterten Stengel, die Früchte, Körner (Samen) und/oder Blüten sein.

Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird für die Vorbereitung des Extraktes oder der Extrakte der Pflanze Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis vorzugsweise oberirdisch wachsendes Pflanzenmaterial, besonders bevorzugt das Blattmaterial verwendet. unter "oberirdisch wachsendes Pflanzenmaterial" von Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis wird für die Erfindung frisches oder getrocknetes Material aus den Blättern und/oder Stengeln verstanden, das von Pflanzen geerntet werden kann, ohne die Wachstumsfähigkeit signifikant zu beeinträchtigen, auch wenn es in erheblichen Masse z.B. bis 90% und typisch etwa 50% geerntet wird. "Oberirdisch wachsendes Pflanzenmaterial" bietet gegenüber Material aus dem Wurzeln den Vorteil, daß Kulturen dieser mehrjährigen Pflanze wiederholt ohne Neuanpflanzung abgeerntet werden können.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung mindestens einen erfindungsgemäßen Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis Extrakts und/oder einen Extrakt der Pflanze Knema laurina enthält.

Knema laurina aus der Familie Myrisicaceae wurde bereits in Publikationen beschrieben, unter anderem im Zusammenhang mit der Isolierung von neuartigen Alkyl und Alkenylphenolen (Kijjoa A. et al. Planta Mediaca (1991) 57,6:75–577.; Gonzalez M. et al. Phytochemistry (1996) 43,6:1333–1337), so beschreiben Kijjoa A. et al. die Isolierung und Identifizierung von fünf Verbindungen aus der Borke von Knema laurina und Knema tenuinervia subsp. setosa. Extrakte der Letztgenannten wurden zur Krebsbehandlung in der traditionellen Thaimedizin verwendet. Bei Knema laurina handelt es sich um einen Strauch oder Baum, der bis zu 30m hoch wachsen kann. Der Stamm von Knema oblongifolia Wall. ist zur Verwendung als Bluttonikum bekannt. Knema angustifolia wird gegen Stomatitis (Enzündung der Mundhöhle) eingesetzt.

Die pharmazeutischen Mittel bzw. Zusammensetzungen der Erfindung werden mit üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln und üblichen pharmazeutischen und technischen Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart mit einer geeigneten Dosierung in an sich bekannter Weise hergestellt. Bevorzugte Zubereitungen bestehen in einer Darreichungsform, die zu einer oralen, enteralen oder parenteralen, beispielsweise i. p. (intraperitonealen), i. v. (intravenösen), i. m. (intramuskulären) oder perkutanen, Applikation geeignet ist. Solche Darreichungsformen sind beispielsweise Tablette, Filmtablette, Dragees, Pillen, Kapseln, Pulver, Cremes, Salben, Lotionen, Flüssigkeiten, wie Sirupe, Gele, injizierbare Flüssigkeiten, beispielsweise zur i. p., i. v., i. m. oder perkutanen Injektion usw. Weiterhin sind auch Depotformen, wie implantierbare Zubereitungen, sowie Suppositorien geeignet. Dabei geben die einzelnen Zubereitungen die erfindungsgemäßen Extrakte je nach deren Art allmählich oder die gesamte Menge in kurzer Zeit an den Körper ab. Zur oralen Verabreichung können Kapseln, Pillen, Tabletten, Dragees und Flüssigkeiten oder andere bekannte orale Darreichungsformen als pharmazeutische Präparate eingesetzt werden. In diesem Falle können die Arzneimittel in der Weise formuliert sein, daß sie die Wirkstoffe entweder in kurzer Zeit freisetzen und an den Körper abgeben oder eine Depotwirkung aufweisen, so daß eine länger anhaltende, langsame Zufuhr von Wirkstoff zum Körper erreicht wird. Die Dosierungseinheiten können neben mindestens einem erfindungsgemäßen Pflanzenextrakt einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, beispielsweise Stoffe zur Einstellung der Rheologie des Arzneimittels, oberflächenaktive Stoffe, Lösungsvermittler, Mikrokapseln, Mikropartikel, Granulate, Verdünner, Bindemittel, wie Stärke, Zucker, Sorbit und Gelatine, ferner Füllstoffe wie Kieselsäure und Talkum. Gleitmittel, Farbstoffe, Duftstoffe und andere Stoffe.

Entsprechende Tabletten können beispielsweise durch Mischen des erfindungsgemäßen Extraktes mit bekannten Hilfsstoffen beispielsweise inerten Verdünnungsmitteln wie Dextrose, Zucker, Sorbit, Mannit, Polyvinylpyrrolidon, Sprengmitteln, wie Maisstärke oder Alginsäure, Bindemitteln wie Stärke oder Gelatine, Gleitmitteln wie Carboxypolymethylen, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphtalat oder Polyvinylacetat, erhalten werden. Die Tabletten können auch aus mehreren Schichten bestehen.

Entsprechend können Dragees durch Überziehen von analog zu Tabletten hergestellten Kernen mit üblicherweise in Drageeüberzügen verwendeten Mitteln, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon oder Schellack, Gummiarabikum, Talk, Titanoxid oder Zucker, hergestellt werden. Dabei kann auch die Drageehülle aus mehreren Schichten bestehen, wobei die oben bei den Tabletten erwähnten Hilfsstoffe verwendet werden können.

Wirkstoffe können auch in Form einer Lösung formuliert werden, die für die orale Verabreichung bestimmt ist und die neben einem aktiven erfindungsgemäßen Pflanzenextrakt als Bestandteile ein pharmazeutisch verträgliches Öl und/oder eine pharmazeutisch verträgliche lipophile, oberflächenaktive Substanz und/oder eine pharmazeutisch verträgliche hydrophile, oberflächenaktive Substanz und/oder ein pharmazeutisch verträgliches wassermischbares Lösungsmittel enthält.

Falls Cremes, Salben, Lotionen und äußerlich anwendbare Flüssigkeiten eingesetzt werden sollen, müssen diese so beschaffen sein, daß die erfindungsgemäßen Extrakte dem Körper in ausreichender Menge zugeführt werden. In diesen Darreichungsformen sind Hilfsstoffe enthalten, beispielsweise Stoffe zur Einstellung der Rheologie der Arzneimittel, oberflächenaktive Mittel, Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Verdünner, Stoffe zur Erhöhung der Permeationsfähigkeit für die erfindungsgemäßen Extrakte durch die Haut, Farbstoffe, Duftstoffe und Hautschutzmittel, wie Konditionierer und Feuchteregulatoren. Zusammen mit den erfindungsgemäßen Extrakten können auch andere Wirkstoffe in dem Arzneimittel enthalten sein (Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie, Band 4 (1953), S. 1–39; J. Pharm. Sci. (1963) 52:918 ff., H. v. Czetsch-Lindenwald, Pharm. Ind. (1961) 2:72 ff, Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Cantor AG (1971)).

Die erfindungsgemäßen Extrakte können auch in geeigneten Lösungen, wie beispielsweise physiologischer Kochsalzlösung, als Infusions- oder Injektionslösung zur Anwendung kommen. Für die parenterale Applikation können die Wirkstoffe in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel gelöst oder suspendiert sein. Als Verdünnungsmittel sind insbesondere ölige Lösungen, wie zum Beispiel Lösungen in Sesamöl, Rizinusöl und Baumwollsamenöl, geeignet. Zur Erhöhung der Löslichkeit können Lösungsvermittler, wie Beispiel Benzylbenzoat oder Benzylalkohol, zugesetzt werden.

Zur Formulierung eines injizierbaren Präparats kann ein beliebiger flüssiger Träger verwendet werden, in dem die erfindungsgemäßen Extrakte gelöst oder emulgiert sind. Diese Flüssigkeiten enthalten häufig auch Stoffe zur Regulation der Viskosität, oberflächenaktive Stoffe, Konservierungsstoffe, Lösungsvermittler, Verdünner und weitere Zusatzstoffe, mit denen die Lösung iosotonisch eingestellt wird. Es ist auch möglich, die Extrakte in ein transdermales System einzuarbeiten und sie damit transdermal zu applizieren. Derartige Präparate können so formuliert sein, daß eine verzögerte Wirkstoff-Freigabe ermöglich wird. Hierzu können bekannt Techniken eingesetzt werden, beispielsweise sich auflösende oder mit einer Membran arbeitende Depots. Implantate können als inerte Materialien beispielsweise biologisch abbaubare Polymere oder synthetische Silikone, beispielsweise Silikonkautschuk, enthalten. die Dosierung der Extrakte kann je nach Art der Anwendung, Alter und Gewicht des Patienten, Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung und ähnlichen Faktoren variieren. Die tägliche Dosis kann als einmal zu verabreichende Einzeldosis oder unterteilt in zwei oder mehrere Tagesdosen gegeben werden.

In den letzten Jahren der neurobiologischen Forschung wurde erkannt, daß Signalwege der Entzündung im Zentralnervensystem im Wechselspiel zwischen Neuronen und den Nicht-neuronalen Zellen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und beim Krankheitsverlauf einiger wichtiger neurodegenerativer Krankheiten spielen (Floyd R. A; Free Radic. biol. med (1999) 26:1246–1355; McGeer et al., Brain Res. Brain Res. Rev. (1995) 21:195–218; McGeer et al., Alzheimer Dis. Assoc. disord. (1998) 12 Suppl.2:2–6). Eine Neurodegeneration als Konsequenz eines oder mehrerer pathologischer Ereignisse (wie etwa z.B. exzitotoxischen Gehirnläsionen nach einem Schlaganfall oder nach einem Trauma) zerstört primär das Hirnparenchym und dann nachfolgend durch invadierende Mikrogliazellen/Makrophagen auch benachbarte Neuronen. Der letztgenannte Folgeschaden ist wesentlich für den Verlust von Gehirnfunktionen verantwortlich, die z.B. nach einem Schlaganfall auftreten (Mabuchi et al. (2000) Stroke 31(7):1735–1743); Stoll et al. (1998) Glia 22(4):329–337). Das Absterben von Neuronen wird hauptsächlich durch toxische Cytokine, Stickstoffradikale und Sauerstoffradikale verursacht, die durch die invadierenden Microgliazellen und Makrophagen in großen Mengen gebildet werden. Pharmazeutische Zubereitungen auf Basis der Pflanze Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis und/oder Knema laurina zeigen nun eine überraschend gute neuroprotektive, neuroregenerative und/oder entzündungshemmende Wirkung in der Hinsicht, daß sie die Produktion und die Freisetzung der proinflammatorischen Cytokine, sowie der Radikale durch die Mikrogliazellen und die Makrophagen zu verhindern vermögen.

Durch einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die einen erfindungsgemäßen Pflanzenextrakt oder erfindungsgemäße Pflanzenextrakte in Mengen zwischen 0.001% und 25% bezogen auf die Endzubereitung enthalten, mit der Maßgabe, daß sich die Mengenangaben mit Wasser und gegebenenfalls weiteren Hilfs- und Zusatzstoffen zu 100 Gew.-% addieren. Die Einsatzmenge der Pflanzenextrakte in den genannten Zubereitungen richtet sich nach der Konzentration der einzelnen Inhaltsstoffe und nach der Art der Anwendung der Extrakte. In der Regel werden 0.001 bis 25 Gew.%, insbesondere 0.03 bis 10, und insbesondere 0.1 bis 5 Gew.-% des Pflanzenextraktes bezogen auf die Endzubereitung der pharmazeutischen Zusammensetzung. Der Gesamtanteil der Hilfs- und Zusatzstoffe kann 1 bis 50, vorzugsweise 5 bis 40 Gew.-% bezogen auf die Endzubereitung der pharmazeutischen Zusammensetzung betragen. Die Herstellung der Zubereitung kann durch übliche Kalt – oder Heißprozesse erfolgen Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält in der Regel mindestens einen Inhaltsstoff aus der Gruppe bestehend aus Saponinen, Flavonderivate, Tanninen, Sterolen, Proteinen, Kohlenhydraten, Phenolsäuren, Xanthon-Derivate, Carotinoide und Triterpenen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes der Pflanze Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis, wobei zur Extraktion Lösungsmittel oder Mischungen von Lösungsmittel verwendet werden, welche ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von destilliertem oder nicht destilliertem Wasser, niedermolekularen Alkoholen, Estern, Kohlenwasserstoffen, Ketonen oder halogenhaltigen Kohlenwasserstoffen, Proteinen, Kohlenhydraten, Phenolsäuren, Xanthon-Derivaten, Carotinoiden und Triterpenen.

Ein weitere Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens eines Extraktes der Pflanze Knema laurina und/oder Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis, alleine oder in Verbindung mit mindestens einem anderen Wirkungsmittel, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung und/oder Behandlung von neurologischen Erkrankungen und/oder entzündungsbedingten Erkrankungen. Neuroinflammation ist ein Charakteristikum von verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten und ist gekennzeichnet durch eine Ansammlung einer großen Zahl von aktivierten Mikrogliazellen und Asterocyten sowie von einer geringen Anzahl T-Zellen in den betroffenen Gehirnregionen. Als begleitende biochemische Veränderungen in diesen Hirnregionen werden das Auftauchen und die Aufregulierung von inflammations-asszozierten Molekülen (wie z.B. Komplement-Proteine, Komplement-Inhibitoren, inflammatorische Zytokine etc.) sowie die Bildung von freien Radikalen beobachtet (McGeer et al. Alzheimer Dis Assoc Disord. (1998)12 Suppl 2:1–6). Das Absterben der Neuronen wird hauptsächlich durch die toxischen Cytokine, Stickstoffradikale und Sauerstoffradikale verursacht.

Die erfindungsgemäßen Extrakte können in diesem Zusammenhang neuroprotektiv (d.h vorbeugend) eingesetzt werden, um eine Schädigung bzw. ein Abtöten von neuronalen Zellen zu verhindern. Weiter beinhaltet die Erfindung auch die Verwendung der Extrakte zur Behandlung von erfindungsgemäßen Krankheiten, um z. B. Entzündungsreaktionen lokal zu begrenzen und weitere Schädigungen bei benachbarten Zellen zu verhindern.

Als neurologische Erkrankungen im Sinne der Erfindung werden demnach Erkrankungen bezeichnet, bei denen primäre oder sekundäre inflammatorische Prozesse eine Rolle spielen und bei denen es zu neuronaler Schädigung oder zum neuronalen Zelltod kommt. Darunter fallen Erkrankung wie z. B. Alzheimer, Parkinson Erkrankung, Amyotrophische Lateralsklerose, Schädel-Hirn-Trauma, Morbus Huntington, Multiple Sklerose und Schlaganfall. Weiterhin bezeichnet der Begriff neurologische Erkrankungen im Sinne der Erfindung Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems wie z. B. Senile Demenz, Multiinfarkt Demenz; Restless leg Syndrom, Epilepsie, Zellschäden durch Hypolgykämie, Hypoxie und Ischämie; neuronale Schäden, die durch unkontrollierte Bewegungen entstehen; Asphyxie sowie Psychosen, Schizophrenie, Angstzustände, Schmerzzustände, Migräne und Emesis; funktionelle Störungen wie Gedächtnisstörungen (Amnesie), Störungen des Lernprozesses, Vigilanzerscheinungen und Entzugserscheinungen nach chronischer Einnahme von Suchtmitteln wie Benzodiazepinen, Halluzinogenen, Alkohol, Kokain oder Opiaten, sowie AIDS-induzierte Encephalopathie und andere infektionsbedingte Encephalopathien, die durch Röteln-Viren, Herpes-Viren, Borrelien und durch unbekannte Erreger verursacht werden; Creutzfeld-Jakob-Erkrankung sowie neurodegenerative Erkrankungen des peripheren Nervensystems wie Polyneuropathien und Polyneuritiden.

Als entzündungsbedingte Erkrankungen im Sinne der Erfindung werden allgemein Krankheiten bezeichnet, die als Ergebnis unkontrollierter Reaktionen des Immunsystems entstehen. Enzündungsbedingte Erkrankungen können im ganzen Körper auftreten. Beispielsweise können Vorfälle an den Schleimhäuten auftreten, wie z. B. eine Entzündung der oberen Atemwege und eine Stomatitis Apthosa. Entzündungen können auch überall in den Atemwegen sowie im Gastrointestinaltrakt vorkommen. Einige Entzündungen der Schleimhäute werden nicht direkt durch ein infektiöses Agens vermittelt, sonder entstehen durch Überreaktionen des Immunsystems bei der Reaktion auf eine mikrobielle Infektion. Beispielhafte Krankheiten sind die akute obstruktive Bronchitis und durch Asthma verschärfte Infektionen der Atemwege. Eine gesundheitschädliche Entzündung kann an anderen Orten als den Schleimhäuten auftreten. Erkrankungen solcher nicht-mukosaler Stellen umfassen beispielsweise die rheumatische Arthritis (systemische juvenile rheumatoide Arthritis und Schuppenflechten-Arthritis), Reiters Syndrom, die ankylosierende Spondylitis, Morbus Crohn und M, Whipple Krankheit mit Arthritis, Colitis Ulcerosa und systemische Lupus Erythematosus. Als entzündungsbedingte Erkrankungen im Sinne der Erfindung werden weiter auch Krankheiten wie z. B. Allergien, Autoimmunkrankheiten, Arteriosklerose oder Transplantationsabstossungenreaktionen bezeichnet.

Hauptquelle für entzündliche Zytokine wie z.B. Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-&agr;), Stickstoff- und Sauerstoffradikale sowie Interleukin 6 (IL-6) sind die durch eine entzündungsbedingte Krankheit ins betroffene Gewebe invadierenden Makrophagen bzw. Mikrogliazellen.

Die entzündungsbedingten Zytokine werden als Reaktion auf eine Vielzahl von biologischen Reizen erzeugt, wie z. B. exzitotoxischen Gehirnläsionen nach einem Schlaganfall oder die Aktivierung von "pattern-recognition-Rezeptoren" (z.B. durch Lipopolysaccharide aus Gramnegativen Bakterien, aber auch durch andere Substanzen. TNF-&agr;, Stickstoff- und Sauerstoffradikale sowie IL-6 spielen eine zentrale Rolle bei vielen Immuneffektor-Funktionen und zellulären Wechselwirkungen, die notwendig sind, um eine wirksame Antwort des Wirts während der Entzündung und Immunantwort auszulösen. Eine unkontrollierte Erzeugung von entzündlichen Zytokinen ist jedoch schädlich für den Wirt.

Überraschenderweise sind die erfindungsgemäßen Extrakte in der Lage, das Ausschütten der entzündlichen Zytokine durch die Makrophagen bzw. Mikrogliazellen zu verhindern oder entscheidend zu minimieren. Weitere Untersuchungen des intrazellulären Mechanismus der Hemmung bzw. der Minimierung des Ausschüttens der entzündlichen Zytokine haben ergeben, daß die Extrakte aus Knema laurina die Phosphorylierung der ERK-1/2 durch phosphoryliertes MEK inhibieren und dadurch die Translokation des dimerisierten P-ERK-1/2 in den Zellkern und die Aktivierung der "Downstream" Kinasen wie z. B. p70 S6K in den Makrophagen bzw. Mikrogliazellen reduzieren. Weiter wurde beobachtet, daß Knema laurina Extrakte nahezu komplett die Translokation von NF-kappa-&bgr; in den Zellkern und die darauf folgende Induktion der Expression von iNOS, welches verantwortlich ist für die Ausschüttung von Stickstoffmonoxid, verhindern. Bei den Extrakten aus Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis kommt es anscheinend nicht zu der Hemmung der NF-kappa-&bgr; Translokation. Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis Extrakte auch haben im Gegensatz zu den Knema Leurina Extrakten keinen Effekt auf den MAPK-Signalweg, den ras/raf-Signalweg oder die elk-Phosphorylierung. Die Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis besitzen jedoch eine über die Verhinderung der entzündlichen Schädigung hinausgehende protektive bzw. regenerative Wirkung auf Neurone. Beiden Extrakten gemeinsam ist die Fähigkeit die Expression des Oberflächenmoleküls ICAM-1 zu reduzieren und die Migration von Mikrogliazellen zu verhindern.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Verwendung der Pflanzenextrakte aus Knema laurina, wobei als Extraktionsmedium für die Pflanzenextrakte Lösungsmittel verwendet werden, welche ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von destilliertem oder nicht destilliertem Wasser, niedermolekularen Alkoholen, Estern, Äther, Polyole, chlorierte Lösungsmittel, Kohlenwasserstoffe, Ketone oder halogenhaltige Kohlenwasserstoffe. Für die Extraktion von Knema laurina Extrakte sind weiter die gleichen Bedingungen gültig, wie diejenigen die für Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis oben ausführlich beschrieben wurden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Verwendung der Pflanzenextrakte aus Knema laurina, wobei die für die Vorbereitung des Knema laurina Extrakts oder der Knema laurina Extrakte verwendeten Pflanzenteile die Wurzeln, Rinden, Blätter, und beblätterten Stengel, die Früchte, Körner und/oder Blüten sind. Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Blattmaterials zur Vorbereitung der Kema laurina Extrakte.

Ein noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Verwendung der Pflanzenextrakte wie oben genannt in Verbindung mit mindestens einem weiteren neuroprotektiv und/oder entzündungshemmend medizinisch wirksamen Mittel/Wirkstoff. Beispiele dafür sind Mittel, die derzeit zur Therapie inflammatorischer Schäden im ZNS oder als Neuroprotektiva entweder in klinischen Studien oder im experimentellen Stadium eingesetzt werden: NMDA-Rezeptoren-Antagonisten; Calcium-Kanal-Antagonisten; Antioxidantien und Radikalfänger; Antikörpern gegen Zelloberflächenmoleküle; Zytokine und Chemokine; Antikörper gegen Zytokine und Chemokine; Immunsuppressive Medikamente; Statine; Phosphodiesterase-Inhibitoren und Antibiotika.

Die folgenden Abbildungen und Beispiele dienen lediglich der Illustration der Erfindung und sind nicht als Beschränkung derselben auf die konkret in den Beispielen angegebenen Ausführungsformen zu verstehen.

1: Deaktivierende Wirkung von Extrakt aus Knema laurina auf Mikrogliazellen: Konzentrationsabhängige Reduktion der NO-Freisetzung in LPS-stimulierten BV-2-Mikrogliazellen (1a) und der Zellvitalität in unstimulierten (-LPS, 1b) oder LPS-stimulierten (LPS, 1c) BV-2-Mikrogliazellen (Datenpunkte + S.D., n = 8)

2: Konzentrationsabhängige Wirkung von Extrakt aus Knema laurina auf Nervenzellen: Dargestellt ist die Vitalität (2a), die Protektion gegenüber NO-induzierter Schädigung (2b). die Protektion gegenüber Glutamat-induzierter Schädigung (2c) und die Protektion gegenüber H2O2-induzierter Schädigung (2d) in HT22 murinen hippocampalen Neuronen. (Datenpunkte + S.D., n = 8)

3: Deaktivierende Wirkung von Extrakt aus Styrax fraserensis auf Mikrogliazellen: Konzentrationsabhängige Reduktion der NO-Freisetzung in LPS-stimulierten BV-2-Mikrogliazellen (3a) und der Zellvitalität in unstimulierten (-LPS, 3b) oder LPS-stimulierten (LPS, 3c) BV-2-Mikrogliazellen (Datenpunkte + S.D., n = 8)

4: Konzentrationsabhängige Wirkung von Extrakt aus Styrax fraserensis auf Nervenzellen: Dargestellt ist die Vitalität (4a), die Protektion gegenüber NO-induzierter Schädigung (4b). die Protektion gegenüber Glutamat-induzierter Schädigung (4c) und die Protektion gegenüber H2O2-induzierter Schädigung (4d) in HT22 murinen hippocampalen Neuronen. (Datenpunkte + S.D., n = 8)

5: Verminderte inflammatorische neuronale Schädigung durch Extrakt aus Knema laurina (ALM 5540): Propidium-Iodid-Färbung von initial NMDA-geschädigtem lebendem Hirngewebe aus organotypischen hippocampalen Schnittkulturen 3d nach Transfer von BV-2-Mikrogliazellen in Anwesenheit verschiedener Verdünnungen (ALM 5540) oder Abwesenheit des Extraktes von Knema laurina. 5b: Quantitative Auswertung der neuronalen Schädigung in den neuronalen Zonen CA1–CA4 als Relativwerte zur initialen Schädigung nach Applikation von 5&mgr;M NMDA (con) nach Transfer von BV-2-Mikrogliazellen (Mikroglia) in Anwesenheit verschiedener Verdünnungen (1,2, 5 × 104) oder Abwesenheit (con) des Extraktes von Knema laurina. (Datenpunkte + S.D., n = 5)

6: Verminderte inflammatorische neuronale Schädigung durch Extrakt aus Styrax fraserensis (ALM 5552): Propidium-Iodid-Färbung von initial NMDA-geschädigtem lebendem Hirngewebe aus organotypischen hippocampalen Schnittkulturen 3d nach Transfer von BV-2-Mikrogliazellen in Anwesenheit verschiedener Verdünnungen (ALM 5552) oder Abwesenheit des Extraktes von Styrax fraserensis. 5b: Quantitative Auswertung der neuronalen Schädigung in den neuronalen Zonen CA1–CA4 als Relativwerte zur initialen Schädigung nach Applikation von 5&mgr;M NMDA (con) nach Transfer von BV-2-Mikrogliazellen (Mikroglia) in Anwesenheit verschiedener Verdünnungen (1,2, 5 × 104) oder Abwesenheit (con) des Extraktes von Styrax fraserensis. (Datenpunkte + S.D., n = 5)

7: Konzentrationsabhängige Hemmung der NO-Freisetzung von Mikrogliazellen nach 3d in lebenden organotypischen hippocampalen Hirnschnittkulturen mit (+NMDA) oder ohne (-NMDA) initiale neuronale Schädigung mit 5&mgr;M NMDA durch Extrakte aus Knema laurina (7a, ALM 5540) und Styrax fraserensis (7b, ALM 5552). (Datenpunkte + S.D., n = 8)

8: Konzentrationsabhängige Hemmung der Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine TNF-&agr; und IL-6 durch Extrakt aus Knema laurina in lebenden organotypischen hippocampalen Hirnschnittkulturen (8a und 8c) nach dem Transfer von BV-2 Mikrogliazellen und in kultivierten BV-2-Mikrogliazellen (8b und 8d) nach Stimulation mit LPS. (Datenpunkte + S.D., n = 8)

9: Konzentrationsabhängige Hemmung der Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine TNF-&agr; und IL-6 durch Extrakt aus Styrax fraserensis in lebenden organotypischen hippocampalen Hirnschnittkulturen (9a und 9c) nach dem Transfer von BV-2 Mikrogliazellen und in kultivierten BV-2-Mikrogliazellen (9b und 9d) nach Stimulation mit LPS. (Datenpunkte + S.D., n = 8)

10: Veränderte Signaltransduktion durch Extrakt aus Knema laurina in Mikrogliazellen (I): Effekt von Extrakt aus Knema laurina auf die Phosphorylierung von MEK (p-MEK, 10a), von ERK-1/2 (p-ERK-1/2, 10b) und von raf und elk (p-raf, p-elk, 10c) und die Induktion der iNOS (10c) 0–24h nach Stimulation mit LPS mit oder ohne Anwesenheit von Extrakt aus Knema laurina (ALM 5540) in BV-2-Mikrogliazellen.

11: Veränderte Signaltransduktion durch Extrakt aus Knema laurina in Mikrogliazellen (II): Effekt von Extrakt aus Knema laurina auf die nukleäre Translokation des phosphorylierten ERK-1/2 (p-ERK-1/2, 11a) und von p65 (NF-kappa &bgr;, 11b) und auf die Phosphorylierung von IkB (11c) 0–24h nach Stimulation mit LPS mit oder ohne Anwesenheit von Extrakt aus Knema laurina (ALM 5540) in BV-2-Mikrogliazellen.

12: Aufgehobene ICAM-1-Mehrexpression in aktivierten Mikrogliazellen durch Extrakte aus Knema laurina und Styrax fraserensis. ICAM-1-Expression in Relation zur unstimulierten Kontrolle ohne LPS (con, -LPS) 24h nach Stimulation mit LPS (+LPS) in Anwesenheit oder Abwesenheit von Extrakten aus Knema laurina (ALM 5540, 12a) oder Styrax fraserensis (ALM 5552, 12b). (Datenpunkte + S.D., n = 3)

13: Proapoptotische Wirkung durch Extrakte aus Knema laurina und Styrax fraserensis in aktivierten Mikrogliazellen. Annexin-5-Expression in Relation zur unstimulierten Kontrolle ohne LPS (con, -LPS) 24h nach Stimulation mit LPS (+LPS) in Anwesenheit oder Abwesenheit von Extrakten aus Knema laurina (ALM 5540, 13a) oder Styrax fraserensis (ALM 5552, 13b). (Datenpunkte + S.D., n = 3)

Neben Styrax fraserensis können die folgenden Versuche auch analog mit Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis durchgeführt werden.

1. Identifikation wirksamer Pflanzenextrakte durch Voruntersuchungen 1.1 Sammlung und Extraktion der Pflanzenextrakte

Pflanzenbestandteile (Blätter, Rinde, Wurzeln) von Styrax fraserensis bzw. Knema laurina wurden von der Malaysischen Halbinsel oder Sabah (Sammlungsgebiete: Frasers Hill, Westmalaysia; Danum Valley, Sabah; Kelabit Highlands, Sarawak) eingesammelt. Insgesamt 10 bis 20 Blätter (20–100g) sowie Rinden und Wurzelmaterial von 100–200g wurden getrocknet und gepulvert und mit Methanol für 2 Tage bei Raumtemperatur extrahiert. Das Mark wurde durch Filtrierung beseitigt und das Lösungsmittel wurde durch Rotovaporation (Buchi, Schweiz) entfernt, um ein erstes Methanol-Rohextrakt zu erhalten (F0001). Danach wurde das Methanolextrakt mit einer 1:1 Mixtur aus Chloroform und Wasser partitioniert. Anschließend wurde das ungelöste Material durch Filtrierung beseitigt (F0002) sowie das Lösungsmittel durch Separationstrichter getrennt. Der wäßrige Extrakt wurde gefriergetrocknet (F0004). Das Extrakt F0003 wurde durch Evaporation des Chloroforms erhalten. Der Chloroform Extrakt wurde dann mit einer 1:1 Mixtur aus Hexan und 20% wäßrigem Methanol weiter partitioniert. Durch die selben Schritte wie oben erwähnt wurde durch Abfiltrierung des unlöslichen Materials und durch Trennen des Lösungsmittels durch einen Separationstrichter ein Hexanextrakt (F0005) und ein wäßriger Methanolextrakt (F0006) hergestellt.

1.2. Weiterverarbeitung der Pflanzenextrakte

Die methanolischen Extrakte (F0006) wurden von der National University of Malaysia, Bangi, Kuala Lumpur, Malaysia an das Institut für Zell- und Neurobiologie, Zentrum für Anatomie, Universitätsmedizin Berlin, übergeben. Dort wurden die Extrakte im Stickstoffstrom bei Raumtemperatur bis zur maximalen Trockenheit verblasen und die jeweiligen Extraktgewichte bestimmt. Anschließend wurden die verblasenen Extrakte in 5 ml Ethanol aufgenommen, verschiedene Verdünnungen in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) angefertigt und diese bei –80°C eingefroren.

1.3. Effekt auf die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) durch aktivierte Mikrogliazellen

Die Extrakte wurden anschließend folgenden Voruntersuchungen unterzogen, wobei jeweils ein Verdünnungsbereich von 10–6 bis 10–3 in 8 unabhängigen Experimenten untersucht wurde. Dabei wurde die Wirkung auf die Immuneffektorfunktion von BV-2-Mikrogliazellen, einer mittels einem c-myc-Onkogen immortalisierten Zelllinie, die alle funktionellen und immunphänotypischen Eigenschaften primärer Mikroglia aufweist, anhand des Parameters der Freisetzung von NO (1a, 3a) nach Stimulation des CD 14/TLR4-Rezeptor durch Lipopolysaccharid (LPS) untersucht. Dieser Parameter wurde ausgewählt, da pathologisch überaktivierte Mikroglia NO freisetzt, und dieses Produkt zentral zur zell- und gewebeschädigenden Funktion pathologisch überaktivierter Mikroglia beiträgt. Gleichzeitig wurde die Vitalität kultivierter BV-2-Mikrogliazellen mit und ohne Stimulation mit LPS (1bc, 3bc) untersucht, um auszuschließen, daß eine reduzierte NO-Freisetzung die unspezifische Folge einer reduzierten Zahl vitaler Zellen ist. Als Kontrollen dienten die jeweiligen Lösungsmittelverdünnungen (absoluter Ethanol in PBS) und die direkte Inokulation des Extraktes mit NO-Donatoren ohne Zellen.

Hierbei ergab sich der Befund, daß der Knema Laurina Extrakt in Verdünnungen oberhalb von 10–4 die CD14/TLR4-stimulierte Freisetzung von NO durch BV-2-Mikrogliazellen über 50 % inhibiert (1a), während die Vitalität der Zellen bis zu einer Verdünnung von 2 × 10–4 nicht beeinträchtigt war (1bc). Oberhalb einer Verdünnung von 5 × 10–4 kam es dann auch zu einer Verminderung der Zahl vitaler Zellen (1bc).

Weiterhin wurde gefunden, daß der Styrax fraserensis Extrakt in Verdünnung oberhalb von 2 × 10–4 die CD14/TLR4-stimulierte Freisetzung von NO durch BV-2-Mikrogliazellen konzentrationsabhängig reduziert (3a). Dabei konnte bei der höchsten Extraktkonzentration (Verdünnung 10–3) eine Hemmung der NO-Freisetzung um etwa 70% (3a) bei gleichzeitig unbeeinträchtigter Zellvitalität (3bc) erreicht werden.

1.4. Effekt auf die neuronale Vitalität bei verschiedenen oxidativen und nitrosativen Schadensprozessen

Die Extrakte wurden in Verdünnungsbereichen von 10–6 bis 10–3 in 8 unabhängigen Experimenten auf ihre Toxizität gegenüber einer neuronalen Zelllinie, sowie in Bezug auf eine mögliche protektive Wirkung bei unterschiedlichen neuronalen Schadensmodellen untersucht. Verwendet wurden HT22-Zellen, eine Zelllinie NMDA-Rezeptor-defizienter primärer Neurone aus der Hippocampusformation der Maus. Die angewandten Schadensmodelle umfassen die oxidative Schädigung durch Wasserstoffperoxid, die nitrosative Schädigung durch den NO-Donator Natriumnitroprussid und die oxidative NMDA-Rezeptor unabhängige Glutamat-Schädigung durch Inkubation mit Glutamat. Diese Szenarien sind an die in inflammatorisch geschädigten Hirngewebe ablaufenden Schadensmechanismen durch invadierende Entzündungszellen angelehnt. Zudem involviert die NMDA-Rezeptor unabhängige Glutamat-Schädigung die Aktivierung der MAPK-Kaskade in Neuronen, eines zentralen aktivierenden Signalweges in Mikrogliazellen. Daher kann eine Koinzidenz eines deaktivierenden Effektes auf Mikrogliazellen mit einem protektiven Effekt bei NMDA-Rezeptor-unabhängiger Glutamat-Schädigung in Neuronen auf einen Eingriff des Extraktes in den MAPK-Signalweg hindeuten, der im Falle des Knema laurina Extraktes auch tatsächlich bestätigt werden konnte (10).

Hierbei wurde gefunden, daß der Knema laurina Extrakt in Verdünnungen von 10–6 bis 10–3 keine toxische Wirkung auf HT22-Neurone entwickelte (2a). Ab einer Verdünnung von 5 × 10–4 wirkte er protektiv gegenüber einer oxidativen Glutamat-Schädigung (2c), protektive Effekte gegenüber einer Wasserstoffperoxid- (2b) oder NO-vermittelten Schädigung (2d) konnten nicht gefunden werden.

Der Styrax fraserensis Extrakt entwickelte in Verdünnungen von 10–6 bis 10–3 keine toxische Wirkung auf HT22-Neurone (4a). Ab einer Verdünnung von 10–4 wirkte er protektiv gegenüber einer oxidativen Glutamat-Schädigung (4c), protektive Effekte gegenüber einer Wasserstoffperoxid- (4b) oder NO-vermittelten Schädigung (4d) konnten nicht gefunden werden.

1.5. Effekt auf die inflammatorische neuronale Schädigung in lebenden organotypischen Hirngewebe

In den folgenden Untersuchungen wurde der Effekt der Extrakte auf die inflammatorische neuronale Schädigung direkt im lebenden Hirngewebe untersucht. Dazu dient das Modell der organotypischen hippocampalen Schnittkultur, in der nach 9 Tagen in Kultur in der Mitte des Gewebes organotypische Bedingungen herrschen (keine Gliaaktivierung, normaler Stoffwechsel, neuronale Aktivität). Dazu wurde initial ein leichter, stark subletaler Neuronspezifischer Primärschaden mit 5 &mgr;M NMDA über 4 h induziert und anschließend BV-2-Mikrogliazellen auf das Hirngewebe transferiert. Nach Entfernung des NMDA durch Mediumwechsel und Transfer der Mikrogliazellen wurde das lebende Hirngewebe mit den Extrakten von Knema laurina und Styrax fraserensis in Verdünnungen von 5 × 10–4, 2 × 10–4 und 10–4 inkubiert und der Schaden in den neuronalen Zonen des Hippocampus (CA1–CA4) nach 3 Tagen durch Propidiumiodid-Färbung quantifiziert (5ab). Dabei zeigte sich eine deutliche Verminderung des Mikroglia-induzierten neuronalen Sekundärschadens um etwa 50 % bei einer Extraktverdünnung von 10–4, bei einer Verdünnung von 5 × 10–4 ist der inflammnatorische Sekundärschaden nicht mehr vorhanden (5ab). Der Styrax fraserensis Extrakt hob bereits bei einer Verdünnung von 10–4 komplett den inflammatorsichen Sekundärschaden auf, und senkt den neuronalen Schaden in Anwesenheit von Mikrogliazellen sogar unter das Niveau des Primärschadens (6ab). Dieses spricht für eine Initiierung neuroprotektiver und/oder neuroregenerativer Prozesse durch Mikrogliazellen.

2. Untersuchung des molekularen Mechanismus der durch Extrakte von Knema laurina und Styrax fraserensis bewirkten Neuroprotektion durch Hemmung inflammatorischer Schadenskaskaden in lebendem Hirngewebe 2.1. Hemmung der mikroglialen Freisetzung von NO durch Extrakte von Knema laurina und Styrax fraserensis in lebenden Hirngewebe

Beide Extrakte hemmen deutlich konzentrationsabhängig die mikrogliale Freisetzung von NO in lebendem Hirngewebe (7ab). In diesem Modellsystem wurde dabei die Aktivierung der Mikroglia durch endogene Mechanismen über eine leichte, subletale Neuronenspezifische Schädigung mittels NMDA induziert. Hirngewebe ohne NMDA-induzierte neuronale Primärschädigung bewirkt dabei keine Mikrogliaaktivierung und somit auch keine Freisetzung von NO (7ab, – NMDA). Dabei korreliert das Ausmaß der reduzierten NO-Freisetzung (7ab) gut mit der erreichten Protektion gegenüber der inflammatorischen Sekundärschädigung (5ab und 6ab): Der Extrakt von Knema laurina hemmt die Freisetzung von NO durch Mikrogliazellen in lebendem Hirngewebe bei einer Verdünnung von 10–4 um etwa 50 % (7a), was quantitativ in etwa dem Ausmaß der Protektion gegenüber dem inflammatorischen Sekundärschaden bei dieser Konzentration entspricht (5ab). Der Extrakt von Styrax fraserensis hemmt die Freisetzung von NO durch Mikrogliazellen bei einer Verdünnung von 10–4 um etwa 60%, ab einer Verdünnung von 2 × 10–4 vollständig (7b). Dieses geht mit einer vollständigen Verhinderung des inflammatorischen Sekundärschadens einher (6ab). Die aus dieser Hemmung der NO-Freisetzung in lebendem Hirngewebe kalkulierten halbmaximalen Hemmkonzentrationen der Extrakte betragen 14,8 mg/l für den Extrakt von Knema laurina und 6,8 mg/l für den Extrakt von Styrax fraserensis.

2.2. Hemmung der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine durch Extrakte von Knema laurina und Styrax fraserensis in lebendem Hirngewebe und in kultivierten Mikrogliazellen

sDer Extrakt von Knema laurina reduzierte konzentrationsabhängig die Freisetzung des B-Zell-stimulierenden Zytokins IL-6 in lebenden Hirngewebe um etwa 50 % bei einer Vedünnung von 5 × 10–4 und in kultivierten BV-2-Mikrogliazellen um etwa 50 % bei einer Verdünnung von 2 × 10–4 (8). Die Freisetzung von TNF-&agr; wurde von diesem Extrakt in kultivierten BV-2-Mikrogliazellen bei einer Verdünnung von 5 × 10–4 um etwa 50 % reduziert, nicht aber in lebendem Hirngewebe (8). Daher kann der bereits bei einer Verdünnung von 10–4 gemessene neuroprotektive Effekt in lebendem Hirngewebe wahrscheinlich nicht auf eine Reduktion des proinflammatorischen Zytokins TNF-&agr; zurückgeführt werden, während eine Beteiligung der Reduktion von IL-6 möglich ist.

Der Extrakt von Styrax fraserensis reduzierte konzentrationsabhängig die Freisetzung des Zytokins IL-6 in lebenden Hirngewebe um etwa 50 % bei einer Verdünnung von 103 und in kultivierten BV-2-Mikrogliazellen um weniger als 20 % bei dieser Verdünnung (9). Die Freisetzung von TNF-&agr; wurde von diesem Extrakt in kultivierten BV-2-Mikrogliazellen bei einer Verdünnung von 2 × 10–4 nur um etwa 10 % reduziert, in lebendem Hirngewebe aber um etwa 50 % (9). Daher kann der bereits bei einer Verdünnung von 10–4 gemessene komplette neuroprotektive Effekt in lebendem Hirngewebe wahrscheinlich nicht auf eine Reduktion des proinflammatorischen Zytokins IL-6 zurückgeführt werden. Eine Beteiligung der TNF-&agr;-Reduktion an dem gemessenen neuroprotektiven Effekt ist aber möglich.

2.3. Verzögerte Phosphorylierung von MEK und Hemmung der Phosphorylierung von ERK-1/2 durch das Extrakt von Knema laurina

Eine Analyse der CD 14/TLR4-induzierten Signalwege zeigte, daß es nach Inkubation mit Extrakt von Knema laurina in einer Verdünnung von 10–4 nach 24 h zu einer Phosphorylierung von MEK kommt, während diese ohne Extrakt bereits nach 4 h voll ausgeprägt ist (10). Während mit der Phosphorylierung von MEK nach 4 h auch ERK-1/2 phosphoryliert wird, kommt es sogar nach 24 h unter Inkubation mit dem Extrakt von Knema laurina nur zu einer sehr reduzierten Phosphorylierung von ERK-1/2 (10).

2.4. Verzögerte, aber peristierende Phosphorylierung von raf durch den Extrakt von Knema laurina

Upstream von MEK kommt es nach CD 14/TLR4-Stimulation nach 1 Stunde zu einer Phosphorylierung von raf, das nach 4 h bereits wieder dephosphoryliert vorliegt. Der Extrakt von Knema laurina verzögert die Phosphorylierung von raf, die dafür aber über 4 h hinaus und auch noch nach 24h persistiert (10).

2.5. Hemmung der nukleären Translokation von NF-kB durch Hemmung der IkB-Phosphorylierung und Hemmung der nukleären Translokation von p-ERK-1/2 durch das Extrakt von Knema laurina

Als Folge einer verzögerten und auch insgesamt verminderten ERK-1/2-Phosphorylierung durch den Extrakt von Knema laurina kam es nach 24 h zu einer reduzierten Translokation von p-ERK-1/2 in den Zellkern (11). Ebenso wurde eine deutlich reduzierte Translokation des für die Aktivierung inflammatorischer Zellen zentralen Transkriptionsfaktors NF-kB, wahrscheinlich durch eine gehemmte Phosphorylierung von IkB, gefunden (11).

2.6. Verzögerte Phosphorylierung von elk und verzögerte Induktion der iNOS durch den Extrakt von Knema laurina

Auf nukleärer Ebene verzögerte der Extrakt von Knema laurina die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors elk, der an der Aktivierung inflammatorischer Zellen beteiligt ist, und die Induktion der iNOS von 4 h auf 24 h (10).

2.7. Unbeeinflußte Signalwege in Mikrogliazellen durch Extrakte von Knema laurina und Styrax fraserensis

Das Extrakt von Styrax fraserensis bewirkte in der neuroprotektiven Verdünnung von 10–4 keine verzögerte oder reduziere Phosphorylierung von MAPK-Proteinen, von raf oder von elk, keine verzögerte oder reduzierte Translokation von p-elk oder von NF-kB und keine verzögerte oder reduzierte Induktion der iNOS. Beide Extrakte bewirkten keine Hemmung des bei inflammatorischer Mikrogliaaktivierung zentralen nukleären Enzyms Poly-ADP-Ribose-Polymerase-1 (PARP-1). Der der reduzierten NO- und TNF-&agr; Freisetzung durch Extrakt von Styrax fraserensis zugrunde liegende molekulare Mechanismus ist daher bisher noch nicht identifiziert.

2.8. Aufgehobene LPS-induzierte Expression von ICAM-1 auf der Oberfläche von Mikrogliazellen durch Extrakte von Knema laurina und Styrax fraserensis

Die Extrakte von Knema laurina und Styrax fraserensis bewirkten in der neuroprotektiven Verdünnung von 10–4 eine Aufhebung der durch LPS-Stimulierung bewirkten Expression von ICAM-1 (CD54) auf der Oberfläche von BV-2-Mikrogliazellen (12). Über die Interaktion mit LFA-1 (CD11a/CD18) ist dieses Molekül für die Migrationsfähigkeit von Entzündungszellen von entscheidender Bedeutung.

2.9. Apoptotischer Effekt von Extrakten von Knema laurina und Styrax fraserensis in LPS-stimulierten Mikrogliazellen

Die Exposition von Annexin-5 auf der Außenseite der äußeren Zellmembran ist ein frühes und spezifisches Ereignis der Apoptose. Während die Stimulation von BV-2-Mikrogliazellen mit LPS über den CD14/TLR4-Rezeptor zu keine Erhöhung des Anteils apoptotischer Zellen führt, kommt es bei gleichzeitiger Inkubation mit dem Extrakt von Knema laurina und Styrax fraserensis in einer Verdünnung von 10–4 zur erhöhten Detektion von Annexin-5 auf der Oberfläche von BV-2-Mikrogliazellen (13). Unstimulierte BV-2-Mikrogliazellen zeigte keinen erhöhten Anteil apoptotischer Zellen nach Inkubation mit den Extrakten (13). Diese Erhöhung apoptotischer Zellen ist in der Gesamtzellzahl allerdings zu gering, um dort eine verminderte Zahl vitaler Zellen detektieren zu können (1c, 3c).

3. Zusammenfassung der Ergebnisse 3.1. Extrakte der Pflanze Knema laurina enthalten Wirkstoffe, die einzeln oder in ihrer Gesamtheit:
  • • Eine inflammatorische Schädigung von Neuronen durch Mikrogliazellen vermindern oder aufheben können,
  • • Eine neuronale Schädigung durch Glutamat vermindern oder aufheben können,
  • • Eine Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) und proinflammatorischen Zytokinen wie z.B. IL-6 aus aktivierten Immunzellen vermindern oder aufheben können,
  • • Eine Expression von Oberflächenmolekülen wie z.B. ICAM-1 in aktivierten Immunzellen vermindern können,
  • • Eine Phosphorylierung von Signalproteinen aus der Gruppe der MAPK verzögern oder reduzieren können,
  • • Eine Translokation von NF-kB in den Zellkern verzögern oder vermindern können,
  • • Eine Phosphorylierung von IkB verzögern oder vermindern können,
  • • Eine Induktion der iNOS in aktivierten Immunzellen verzögern oder vermindern können,
  • • Eine Phosphorylierung von raf modulieren können,
  • • Proapoptotische Prozesse in aktivierten Immunzellen verstärken können.
3.2. Extrakte der Pflanze Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis enthalten Wirkstoffe, die einzeln oder in ihrer Gesamtheit:
  • • Eine inflammatorsiche Schädigung von Neuronen durch Mikrogliazellen vermindern oder aufheben können,
  • • Eine neuronale Schädigung direkt oder in Anwesenheit von Mikrogliazellen vermindern oder aufheben können oder regenerative Prozesse in Neuronen direkt oder in Anwesenheit von Mikrogliazellen unterstützen können,
  • • Eine neuronale Schädigung durch Glutamat vermindern oder aufheben können,
  • • Eine Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) und proinflammatorischen Zytokinen wie z.B. TNF-&agr; aus aktivierten Immunzellen vermindern oder aufheben können,
  • • Eine Expression von Oberflächenmolekülen wie z.B. ICAM-1 in aktivierten Immunzellen vermindern können,
  • • Proapoptotische Prozesse in aktivierten Immunzellen verstärken können.
Materialien und Methoden 1. Verarbeitung der Pflanzen-Extrakte

Die Extrakte wurden als methanolische Suspensionen in Glasgefäßen von der National University Malaysia nach Deutschland transportiert und nach Ankunft sofort bei –80°C gelagert. Vor Verwendung wurde das Methanol unter einem Stickstoff-Strom verblasen, der Trocken-Extrakt gewogen und in 5 ml absolutem Ethanol resuspendiert. Dabei wurden für Knema Laurina 147,9 mg/ml und für Styrax Fraserensis 5552 84 mg/ml erreicht (w/w.). Die so hergestellten Suspensionen wurde in sterilem PBS 1:102, 1:103, 1:104, 1:105 verdünnt und diese Verdünnungen als Stammlösungen verwandt. Als Kontrolle diente eine entsprechende Verdünnungsreihe von Ethanol in sterilem PBS. Alle Lösungen wurden bei –80°C gelagert und nur kurzmöglichst für die jeweiligen Versuche aufgetaut. Im Versuch wurden mit folgenden Verdünnungen gearbeitet: 1 × 10–3, 5 × 10–4, 2 × 10–4, 1 × 10–4, 5 × 10–5, 2 × 10–5, 1 × 10–5, 5 × 10–6, 2 × 10–6, 1 × 10–6.

2. Zellkultur

BV-2-Mikrogliazellen: BV-2 Mikrogliazellen besitzen morphologische, phänotypische und funktionelle Eigenschaften von frisch isolierter primärer Mikroglia und stellen ein adäquates Modellsystem dar, um die Aktivierung und Deaktivierung von Mikrogliazellen in vitro zu testen. Die Zellen wurden in Medium kultiviert, welches aus DMEM, hitzeinaktiviertem Fetalem Kälber Serum (FCS) [10%], Glutamin [10%] und Penicillin/Streptomycin [5%] bestand. Die Kultivierung im Brutschrank wurde bei einem CO2-Gehalt von 5% und einer Temperatur von 37°C durchgeführt. Die Passage der Zellen wurden alle 2–3 Tage durchgeführt. Die Aktivierung der Zellen wurde mittels CD14/TLR4-Aktivierung über Lipopolysaccharid (LPS) [10 &mgr;g/ml] durchgeführt. Am Tag 0 der Vitalitäts- und Aktivitäts-Assays wurden die Mikroglia-Zellen in 96-well-Mikrotiterplatten mit 100 &mgr;l/well in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen/ml ausgesät und 24 h belassen. Zum Versuchsbeginn am Tag 1 wurde der Überstand entfernt und neues Medium mit den jeweiligen Substraten hinzugefügt (LPS, Pflanzenextrakt, Ethanol, PBS). Nach weiteren 24 h am Tag 2 wurde der Versuch beendet und die Zellen, bzw. Überstand den jeweiligen Assays zugeführt.

HT-22 Hippocampale Neurone (murin): HT-22 Zellen sind eine etablierte murine hippocampale Neuronen-Zellline, die als Subklon aus immortalisierten HT-4 Zellen entwickelt wurden und keine ionotropen Glutamat-Rezeptor tragen (Maher et al. "The role of monoamine metabolism in oxidative glutamate toxicity" (1996) J. of Neuroscience 16 (20), 6394–6401). Die Zellen werden in DMEM Medium kultiviert, das mit FCS [10%], Glutamin [10%], Penicillin/Streptomycin [5%] und Glucose versetzt ist. Die Passage erfolgte alle 2–3 Tage. Modellhafte Schädigungen der Neuronen wurden mit Glutamat [20 mM] (exzitotoxischer Schaden), H2O2 [150 &mgr;M] (oxidativer Schaden) und dem NO-Donator Natriumnitroprussid [250 &mgr;M] (nitrosativer Schaden) durchgeführt.

3. Organotypische hippocampale Schnittkultur (murin)

Zur Präparation von organotypischen hippocampalen Komplexschnittkulturen wurden 10 Tage alte Mäuse (p10) dekaptiert und unter sterilen Bedingungen das Hirn entnommen. Anschließend wird der den Hippocampus enthaltende Hirnanteil nach rostral vom restlichen Neocortex und nach kaudal vom Hirnstamm und Kleinhirn abpräpariert und in eiskaltem Präparationsmedium (MEM mit 1% L-Glutamin, pH = 7,35) auf einen Sektionsblock aufgeklebt. Die nach dem Schneiden mit dem Vibratom gewonnenen Koronarschnitte mit einer Schichtdicke von 350&mgr;m werden auf Millipore-Filtermembranen (Porengröße 0,1&mgr;m) in die Vertiefungen einer 6-Loch-Kulturschale gebracht und mit Kulturmedium (MEM:HBSS 2:1, 25% normal horse serum, 2% L-Glutamin, 2,64 mg/ml Glucose und Penicillin/Streptomycin) bei 35°C, 5% CO2 und 95% Raumluft in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert. Dabei hat das Medium nur von unten direkten Kontakt mit dem hippocampalen Gewebe.

4. Modellsystem der inflammatorischen Invasion von Mikrogliazellen in Hirnge

Mit 20 &mgr;g/ml Rhodamin-markiertem Dextran MiniRuby für 24h inkubierte BV-2-Mikrogliazellen werden mehrfach mit PBS gewaschen, in einem geringen Volumen Kulturmedium (s.o.) resuspendiert und auf die Oberfläche der hippocampalen Schnittkulturen gebracht. 1, 2 und 3 Tage nach NMDA-Läsion wird die Migration der Mikrogliazellen zum Ort der Neurodegeneration zunächst im intakten Schnitt fluoreszenz- und lichtmikroskopisch dokumentiert. Anschließend werden die Schnitte nach Fixierung (4% Formaldehyd, 0,1 % Glutaraldehyd, 15% Pikrinsäure) und Überführung in 0,8 M Saccharose-Lösung im Kryostaten geschnitten, auf gelatinierte Objektträger aufgezogen und mit Immunomount eingedeckelt. Zur Doppelfärbung der Mikrogliazellen werden die Kryostat-Schnitte mit Griffonia simplicifolia isolectin B4 (IB4)-FITC (1:40 in 0,1 M PB, pH = 6,8 und 0,5% Triton X-100) inkubiert und fluoreszenzmikroskopisch bei Rhodamin- oder FITC-Fluoreszenz untersucht. Die sitespezifische Migration in das Gebiet der Neurodegeneration wird dann statistisch ausgewertet. Die Zahl und Dichte geschädigter Neurone wird mittels Propidium-Iodid-Färbung in unfixiertem Schnittgewebe bestimmt.

5. Zytotoxizitätsassy

Ziel der quantitativen Vitalitätsmessung von Zellen durch mitochondriale Oxidation von MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) und anschließende Messung der Absorption bei 563 nm (nach Mosman et al. "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays" (1983) J. Immunol Methods (65) 55–63) war 1.) die Ermittlung der toxischen Konzentrationen der Pflanzenextrakte in BV-2-Zellen und HT-22-Zellenmittels Verdünnungsreihen und 2.) die Ermittlung neuroprotektiver Effekte an HT-22-Zellen mittels Verdünnungsreihen nach verschiedenen modellhaften Schädigungen (s.o.). Kontrollversuche mit Ethanol-Verdünnungsreihen dienten zum Ausschluß unspezifischer Effekte. Am Ende eines Zellkulturversuchs mit BV-2 oder HT-22-Zellen wurde das MTT-Reagenz (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) in PBS [5 mg/ml] in den Medium-Überstand der 96-well-Platten gegeben (effekt. Konz.: 0,5 mg/ml). Hiernach wurde eine weitere Stunde bei 37°C im Brutschrank inkubiert, um die mitochondriale Oxidation des MTT zu gestatten. Im Anschluß wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und eine dem Mediumüberstand gleiche Menge an HCl/Isopropanol (1:100) zur Zellyse in die wells gegeben. Der in den Zellen entstandene Farbstoff konnte sich nun während einer 30 minütigen Inkubation auf dem Schüttler bei Raumtemperatur lösen. Die Messung der Extinktion erfolgte am Plattenreader bei 562 nm (Meßfilter) gegen 630 nm (Referenzfilter).

Die Auswertung erfolgte durch Mittelung der Werte (n = 8 je Pflanzenkonzentration) und Angabe der Vitalität in % der Kontrolle (Zellen ohne Pflanzenextrakt). Es wurden nur Ergebnisse mit einer Standardabweichung unter 10% gewertet.

6. Screeningassay zur Messung der Immunoeffektorfunktion von Mikrogliazellen über die Freisetzung von Stickstoffmonoxid mittels der Griess-Reaktion

Die quantitative Messung von stabilen Nitriten im Mediumüberstand, die durch Freisetzung des kurzlebigen Radikals Stickstoffmonoxid (NO) entstanden sind diente zum Screening auf antiinflammatorische Effekte der Pflanzen in unstimulierten oder LPS-stimulierten BV-2-Mikrogliazellen durch Messung der NO-Freisetzung. Die Nitrite reagieren mit dem Griess-Reagens, was durch einen Farbumschlag von gelb zu tiefrot quantitativ sichtbar wird. Danach kann die optische Dichte bei 540 nm (Meßfilter) gegen 630 nm (Referenzfilter) ermittelt werden. Methode: Um den Gehalt an stabilen Nitriten im Mediumüberstand am Ende eines Versuches zu ermitteln (nach L. Green et al, "Analysis of Nitrate, Nitrite, and [15-N]-Nitrate in Biological Fluids" (1982) Anal. Biochem. (126), 131–138) wurde 50 &mgr;l Überstand aus jedem well der 96-well-Platte entnommen, in eine neue Platte überführt und mit 50 &mgr;l Griess-Reagenz (Sulfanilamid 1% in H2O) 1:1 gemischt mit N-1-naphtylethylendiamin Dihydrochloride 0.1% in 5% Phosphorsäure) versetzt. Auf derselben Platte wurde eine Standard-Nitrit-Reihe [0, 5, 10, 20, 60 &mgr;M] angesetzt, die ebenfalls mit Griess-Reagenz versetzt wurde. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur waren die Proben meßbereit für den Plattenreader. Die optische Dichte wurde bei 540 nm (Meßfilter) gegen 630 nm (Referenzfilter) gemessen. Danach wurden die Werte gemittelt (n = 8 je Konzentration und Versuch) und NO-Senkung in % der Kontrolle (Zellen ohne Pflanzenextrakt) angegeben. Nur Ergebnisse mit einer Standardabweichung unter 10% wurden verwandt.

7. FACS-Assay-Messung von Oberflächenproteinen

Ziel dieser Untersuchungen war 1.) die Charakterisierung der Effekte von der Pflanzenextrakte auf Oberflächenprotein-Expression (CD 11a, CD 11b, CD18, ICAM-1-Expression) der BV-2-Zellen und 2.) zusammen mit der unspezifischen Detektion der Zellvitalität mittels MTT-Assay die Quantifizierung des Anteils apoptotischer Zellen mittels Annexin-V-Bestimmung. Methode: Nach Versuchsende wurden für die Oberflächenprotein-Messung die BV-2-Zellen im 75cm2-Flakon mit Formaldehyd [4%] vor der Ernte durch Schaben fixiert. Für die Apoptose-Messung erfolgte keine Fixierung. Nach Ernten durch Schaben und zweimaligem Waschen in eiskaltem PBS wurden die Zellen gezählt und in einer Menge von 2 – 5 × 105 Zellen in FACS-Puffer (FCS 2%, NaN3 0.1 % in PBS) oder Annexin-Puffer (HEPES 0,1 M in Na-OH, NaCl 1,4 M, CaCl2 25 mM, pH 7,4) auf die FACS-Röhrchen verteilt. Nach einer weiteren Waschung wurden die Antikörper nach Anleitung auf die Zellen gegeben. Nach einer letzten Waschung erfolgte die Messung durch das FACS-Gerät und die Auswertung mit dem Programm FLOWJO. Als Kontrolle der Oberflächenproteine wurden die vom Hersteller empfohlenen Isotypen der jeweiligen Antikörper verwandt. Für die Apoptose-Messung erfolgte zur Kontrolle der durch Nekrose verstorbenen Zellen die Doppelfärbung der Zellen mit Propidium Jodid (PI). Annexin-positive/PI-negative Zellen wurden dem Stadium der beginnenden Apoptose zugeordnet, A-neg./PI-neg. wurden als vital eingestuft, A.-pos/PI-pos. zählen als "Gesamt-Todesrate" und A.-neg./PI-pos. Zellen wurden als Artefakt verworfen. Quelle: Longobardi-Givan, A. "Flow Cytometry – First Principles" Wiley Liss, New York 1992 Nebe, C.T. "Durchflußzytometrische Meßtechnik und Datenauswertung" Infusionsther Transfusionsmed 23 : 111–113 (1996)

8. Immunblot-Anal

Immunblotanalysen wurden mit dem Ziel der Charakterisierung der Effekte der Pflanzenextrakte auf die durch CD14/TLR4-induzierte Signaltransduktion in BV-2-Mikrogliazellen durchgeführt. Untersucht wurde die spezifische Phosphorylierung von p38, CREB, MEK, ERK-1/2, raf, p70, AKT und I-kappaB, die Expression von egr-1. IRAK und iNOS und die nukleäre Translokation von NF-kappaB und p-ERK-1/2. Methode: Nach der Proteinbestimmung aus Lysaten von BV-2-Mikrogliazellen mittels BCA-Kit wurden die Proteine in einem 12%, 15% oder 18% SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran mittels Elektroblot transferiert und mittels spezifischer Primär- und HRP-konjugierter Sekundärantikörper und ECL-Entwicklung nachgewiesen. Die Gele wurden zur Beladungskontrolle nachträglich mit Coomassie-Blue (0,05 %), die Membranen zur Proteintransferkontrolle mit Poncaeu S (0,5 %) gefärbt.


Anspruch[de]
  1. Pflanzlicher Extrakt von Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis, hergestellt durch Extraktion mit einem geeigneten Extraktionsmedium.
  2. Pflanzlicher Extrakt von Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis nach Anspruch 1 und/oder pflanzlicher Extrakt von Knema laurina zur Behandlung von Erkrankungen.
  3. Pflanzlicher Extrakt nach Anspruch 1 oder 2, wobei als Extraktionsmedium Lösungsmittel und/oder Gemische von Lösungsmittel verwendet werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus destilliertem oder nicht destilliertem Wasser, niedermolekularen Alkoholen, Estern, Äthern, Polyolen, chlorierten Lösungsmitteln, Kohlenwasserstoffen, Ketonen und/oder halogenhaltigen Kohlenwasserstoffen.
  4. Pflanzlicher Extrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Extrakt hergestellt ist aus Pflanzenteilen, die Wurzeln, Rinden, Blätter, beblätterte Stengel, Früchte, Körner und/oder Blüten sind.
  5. Pflanzlicher Extrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Extrakt hergestellt ist aus oberirdisch wachsendem Pflanzenmaterial, insbesondere Blattmaterial von Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis.
  6. Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Extraktes, umfassend die Extraktion von Pflanzen und/oder Pflanzenteilen der Spezies Styrax fraserensis, Styrax benzoin, und/oder Styrax tonkinensis und/oder Knema laurina mittels eines geeigneten Extraktionsmediums.
  7. Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Extraktes nach Anspruch 6, wobei zur Extraktion Lösungsmittel oder Gemische von Lösungsmittel verwendet werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus destilliertem oder nicht destilliertem Wasser, niedermolekularen Alkoholen, Estern, Äthern, Polyolen, chlorierten Lösungsmitteln, Kohlenwasserstoffen, Ketonen und/oder halogenhaltigen Kohlenwasserstoffen.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pflanzlichen Extrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Gemische davon.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung den Pflanzenextrakt oder die Pflanzenextrakte in Mengen zwischen 0.001 % und 25% bezogen auf die Endzubereitung enthält.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung mindestens eine Substanz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Saponinen, Flavonderivate, Tanninen, Sterolen, Proteinen, Kohlenhydraten, Phenolsäuren, Xanthon-Derivaten, Carotinoiden und/oder Triterpenen.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, weiterhin enthaltend pharmazeutisch geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.
  12. Verwendung eines Extraktes eines pflanzlichen Extraktes nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 11 zur Vorbeugung und/oder Behandlung von neurologischen Erkrankungen und/oder entzündungsbedingten Erkrankungen.
  13. Verwendung nach Anspruch 12 in Verbindung mit mindestens einem weiteren medizinisch wirksamen Mittel.
Es folgen 13 Blatt Zeichnungen






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