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REKOMBINANTER VASKULÄRER ENDOTHELZELLEN WACHSTUMSFAKTOR D (VEGF-D) - Dokument DE69734359T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69734359T2 06.07.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000956339
Titel REKOMBINANTER VASKULÄRER ENDOTHELZELLEN WACHSTUMSFAKTOR D (VEGF-D)
Anmelder Ludwig Institute for Cancer Research, New York, N.Y., US;
Helsinki University Licensing Ltd. Oy, Helsinki, FI
Erfinder ACHEN, G., Marc, Fitzroy, AU;
WILKS, F., Andrew, South Yarra, AU;
STACKER, A., Steven, North Fitzroy, US;
ALITALO, Kari, FIN-02100 Espoo, FI
Vertreter WINTER, BRANDL, FÜRNISS, HÜBNER, RÖSS, KAISER, POLTE, Partnerschaft, 85354 Freising
DE-Aktenzeichen 69734359
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 21.08.1997
EP-Aktenzeichen 979384864
WO-Anmeldetag 21.08.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/14696
WO-Veröffentlichungsnummer 1998007832
WO-Veröffentlichungsdatum 26.02.1998
EP-Offenlegungsdatum 17.11.1999
EP date of grant 12.10.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.07.2006
IPC-Hauptklasse C12N 1/21(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/18(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/63(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 1/14(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/475(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/49(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/52(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Wachstumsfaktoren für Endothelzellen und insbesondere einen Teil eines neuartigen, vaskuloendothelialen Wachstumsfaktors, DNA, die für den Faktor codiert, und pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen und Verfahren, die den Faktor verwenden oder sich davon ableitet.

Hintergrund der Erfindung

Angiogenese ist ein fundamentaler Prozeß, der für normales Wachstum und normale Entwicklung von Gewebe notwendig ist und die Proliferation neuer Kapillaren aus bereits bestehenden Blutgefäßen umfaßt. Angiogenese ist nicht nur an der embryonalen Entwicklung und normalem Wachstum, Reparatur und Regeneration von Gewebe beteiligt, sondern auch am weiblichen Reproduktionszyklus, an der Etablierung und am Erhalt einer Schwangerschaft und an der Heilung von Wunden und Brüchen. Neben der bei einem normalen Individuum stattfindenden Angiogenese, sind Angiogenesevorgänge an vielen pathologischen Prozessen beteiligt, insbesondere an Tumorwachstum und Metastasierung, und an anderen Zuständen, bei denen eine erhöhte Blutgefäßproliferation, insbesondere des mikrovaskulären Systems, vorliegt, beispielsweise bei diabetischer Retinopathie, Psoriasis und Arthropathien. Eine Inhibierung der Angiogenese ist nützlich, um diese pathologischen Prozesse zu verhindern oder zu lindern.

Andererseits ist die Förderung von Angiogenese in Situationen erwünscht, in denen die Vaskularisation etabliert oder ausgeweitet werden soll, beispielsweise nach Gewebe- oder Organtransplantationen, oder um die Etablierung des Kollateralkreislaufs bei Gewebeinfarkt oder Arterienstenose, beispielsweise bei koronarer Herzerkrankung und Thrombangitis obliterans, zu stimulieren.

Wegen der entscheidenden Rolle der Angiogenese bei so vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, wurden Faktoren, die an der Kontrolle der Angiogenese beteiligt sind, intensiv untersucht. Von einer Reihe von Wachstumsfaktoren wurde gezeigt, daß sie an der Regulation der Angiogenese beteiligt sind; diese umfassen Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs), Plättchenwachstumsfaktor (Platelet-Derived Growth Factor, PDGF), transformierenden Wachstumsfaktor &agr; (TGF-&agr;) und Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF). Für einen Überblick siehe beispielsweise Folkman et al., „Angiogenesis", J. Biol. Chem., 1992 267 10931–10934.

Es wurde vermutet, daß in erster Linie eine bestimmte Familie endothelzellspezifischer Wachstumsfaktoren und deren entsprechende Rezeptoren für die Stimulierung von Endothelzellwachstum und -differenzierung und für bestimmte Funktionen der differenzierten Zellen verantwortlich sind. Diese Faktoren sind Mitglieder der PDGF-Familie und scheinen über endotheliale Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) zu fungieren. Bisher wurden vier Subtypen von vaskuloendothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) identifiziert. Vaskuloendothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), inzwischen als VEGF-A bekannt, wurde aus verschiedenen Quellen isoliert. VEGF-A zeigt eine hochspezifische mitogene Wirkung auf Endothelzellen und kann die vollständige Kette von Vorgängen stimulieren, die zu Angiogenese führen. Ferner zeigt er eine starke chemoattraktive Wirkung auf Monozyten, kann Plasminogenaktivator und Plasminogenaktivator-Inhibitor in Endothelzellen induzieren und kann ferner mikrovaskuläre Permeabilität induzieren. Wegen der letztgenannten [TEXT FEHLT]

Aktivität wird er manchmal auch als vaskulärer Permeabilitätsfaktor (VPF) bezeichnet. Die Isolierung und die Eigenschaften von VEGF wurden in Übersichtsartikeln beschrieben; siehe Ferrara et al, „The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 1991 47 211–218 und Connolly, „Vascular Permeability Factor: A Unique Regulator of Blood Vessel Function", J. Cellular Biochem., 1991 47 219–223.

Kürzlich wurden drei weitere Mitglieder der VEGF-Familie identifiziert. Sie werden als VEGF-B, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US96/02957 (WO 96/26736) von Ludwig Institute for Cancer Research und The University of Helsinki, VEGF-C, beschrieben bei Joukov et al, The EMBO Journal, 1996 15 290–298, und VEGF2, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US94/05291 (WO 95/24473) von Human Genome Sciences, Inc., bezeichnet. VEGF-B besitzt sehr ähnliche angiogene und andere Eigenschaften wie VEGF, ist aber im Gewebe anders verteilt und wird anders exprimiert als VEGF. Insbesondere wird VEGF-B im Herzen sehr stark und in der Lunge nur schwach exprimiert, während für VEGF das Gegenteil der Fall ist. Dies läßt vermuten, daß VEGF und VEGF-B trotz der Tatsache, daß sie in vielen Geweben co-exprimiert werden, funktionelle Unterschiede aufweisen könnten.

VEGF-B wurde mit einer Hefe-Cohybrid-Interaction-Trap-Screeningmethode isoliert, indem auf zelluläre Proteine gescreent wurde, die mit zellulärem Retinsäure-Bindungsprotein I (CRABP-I) in Wechselwirkung treten könnten. Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind in der PCT/US96/02597 und bei Olofsson et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 1996 93 2576–2581 ausführlich beschrieben.

VEGF-C wurde aus konditionierten Medien der PC-3-Prostatataadenokarzinom-Zelllinie (CRL1435) isoliert, indem auf die Fähigkeit des Mediums gescreent wurde, eine Tyrosinphosphorylierung der endothelzellspezifischen Rezeptortyrosinkinase Flt4 herbeizuführen, wobei Zellen verwendet wurden, die so transfiziert waren, daß sie Flt4 exprimierten. VEGF-C wurde durch Affinitätschromatographie mit rekombinantem Flt4 gereinigt und wurde aus einer PC-3-cDNA-Genbank kloniert. Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind bei Joukov et al, The EMBO Journal, 1996 15 290–298 ausführlich beschrieben.

VEGF2 wurde aus einer stark tumorigenen, Östrogen-unabhängigen humanen Brustkrebszelllinie isoliert. Wenngleich von bei diesem Molekül festgestellt wurde, daß es zu etwa 22% homolog zu PDGF und zu 30% homolog zu VEGF ist, ist das Verfahren zur Isolierung des für VEGF2 codierenden Gens unklar und es ist keine Charakterisierung der biologischen Aktivität offenbart.

Vaskuloendotheliale Wachstumsfaktoren scheinen durch Bindung an die Rezeptortyrosinkinasen der PDGF-Rezeptorfamilie zu fungieren. Es wurden fünf endothelzellspezifische Rezeptortyrosinkinasen identifiziert, nämlich Flt-1 (VEGFR-1), KDR/Flk-1 (VEGFR-2), Flt4 (VEGFR-3), Tie und Tek/Tie-2. Alle besitzen die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität, die zur Signaltransduktion notwendig ist. Die wesentliche, spezifische Rolle von Flt-1, Flk-1, Tie und Tek/tie-2 bei Vaskulogenese und Angiogenese wurde durch gezielte Mutationen gezeigt, die diese Rezeptoren in Mäuseembryos inaktivieren. VEGFR-1 und VEGFR-2 binden VEGF mit hoher Affinität und VEGFR-1 bindet auch VEGF-B und den Placenta-Wachstumsfaktor (PlGF). Es wurde gezeigt, daß VEGF-C der Ligand für Flt4 (VEGFR-3) ist und auch VEGFR-2 aktiviert (Joukov et al, 1996). Ein Ligand für Tek/Tie-2 wurde beschrieben (Internationale Patentanmeldung PCT/US95/12935 (WO 96/11269) von Regeneron Pharmaceuticals, Inc.); der Ligand für Tie wurde jedoch noch nicht identifiziert.

Der Rezeptor Flt-4 wird im Fötus im Venen- und Lymphendothel exprimiert und beim Erwachsenen überwiegend im Lymphendothel (Kaipainen et al, Cancer Res, 1994 54 6571–6577; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92 3566–3570). Es wurde vermutet, daß VEGF-C eine primäre Funktion im Lymphendothel und eine sekundäre Funktion bei Angiogenese- und Permeabilitätsregulation haben könnte, die mit VEGF geteilt wird (Joukov et al, 1996).

Wir haben nun humane cDNA isoliert, die für einen Teil eines neuartigen Proteins der Familie der vaskuloendothelialen Wachstumsfaktoren codiert. Das neue Polypeptid mit der Bezeichnung VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C weist strukturelle Ähnlichkeiten mit anderen Mitgliedern dieser Familie auf.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt allgemein ein isoliertes, neues Wachstumsfaktorpolypeptid bereit, das die Fähigkeit besitzt, Proliferation oder Differenzierung von Endothelzellen zu stimulieren und/oder zu fördern, isolierte DNA-Sequenzen, die für den neuen Wachstumsfaktor codieren, und Zusammensetzungen, die sich für diagnostische und/oder therapeutische Anwendungen eignen.

Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül bereit, das ein neues Polypeptid mit der Bezeichnung VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C codiert, das zu VEGF, VEGF-B und VEGF-C strukturhomolog ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül eine cDNA, die für einen Teil von VEGF-D von Aminosäurerest 93 bis Aminosäurerest 201 der SEQ ID NO: 5 codiert, die gegebenenfalls funktionsfähig mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die für das FLAGTM-Peptid codiert.

Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Polypeptid bereit, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, die Proliferation von Endothelzellen zu stimulieren, und wobei das Polypeptid aus einer Folge von Aminosäuren besteht, die der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht und aus den Aminosäuren 93–201 besteht, und die Fähigkeit besitzt, Endothelzellproliferation, -differenzierung, -migration oder -überleben oder mehr davon zu stimulieren.

Diese Fähigkeiten werden hier als „biologische Aktivitäten von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C" bezeichnet und können leicht mit im Stand der Technik bekannten Verfahren getestet werden. Das Polypeptid besitzt vorzugsweise die Fähigkeit, Endothelzellproliferation oder -differenzierung zu stimulieren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Proliferation oder Differenzierung vaskulärer Endothelzellen und/oder lymphatischer Endothelzellen.

Das Polypeptid hat besonders bevorzugt die in SEQ ID NO: 5 angegebene Sequenz der Aminosäuren 93–201 und ist gegebenenfalls mit dem FLAGTM-Peptid gekoppelt. Wenn das Fragment mit FLAGTM gekoppelt ist, wird das Fragment hier als VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C definiert.

Die Wachstumsfaktoren der PDGF-Familie, einschließlich VEGF, sind dimer, und VEGF-B, VEGF-C, PlGF, PDGF-A und PDGF-B weisen vollständige Konservierung von 8 Cysteinresten in den N-terminalen Domänen, d.h. den PDGF-ähnlichen Domänen, auf (Olofsson et al, 1996; Joukov et al, 1996). Es wird angenommen, daß diese Cysteine an intra- und intermolekularen Disulfidbrücken beteiligt sind. Außerdem gibt es weitere stark, aber nicht vollständig konservierte Cysteinreste in den C-terminalen Domänen. Loops 1, 2 und 3 jeder Untereinheit, die durch intramolekulare Disulfidbrücken gebildet werden, sind an der Bindung an die Rezeptoren für die PDGF/VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren beteiligt (Andersson et al: Growth Factors, 1995 12 159–164). Wie hier gezeigt, sind die Cysteine, die in bereits bekannten Mitgliedern der VEGF-Familie konserviert sind, auch in VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C konserviert.

Ein Fachmann ist sich darüber im Klaren, daß diese Cysteinreste in jeder vorgeschlagenen varianten Form erhalten bleiben sollten und daß die aktiven Zentren in den Loops 1, 2 und 3 ebenfalls erhalten bleiben sollten. Von anderen Regionen des Moleküls ist jedoch zu erwarten, daß sie für die biologische Funktion von geringerer Bedeutung sind und daß sie daher geeignete Ziele für eine Modifikation bieten. Modifizierte Polypeptide können leicht mit Hilfe üblicher Aktivitätstests, wie beispielsweise Zellproliferationstests, auf ihre Fähigkeit getestet werden, die biologische Aktivität von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C zu zeigen.

Es wird in Betracht gezogen, daß einige modifizierte VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Polypeptide die Fähigkeit besitzen werden, an Endothelzellen, d.h. an VEGF-D-Rezeptoren, zu binden, aber nicht in der Lage sind, Endothelzellproliferation, -differenzierung, -migration oder -überleben zu stimulieren. Es ist zu erwarten, daß diese modifizierten Polypeptide dazu fähig sind, als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren von VEGF-D zu fungieren, und daß sie sich für Situationen eignen, in denen es wünschenswert ist, die Wirkung von VEGF-D zu verhindern oder zu reduzieren.

Gemäß einem dritten Aspekt stellt die Erfindung eine gereinigte und isolierte Nukleinsäure bereit, die für das erfindungsgemäße Polypeptidfragment codiert. Die Nukleinsäure kann DNA, genomische DNA, cDNA oder RNA sein und kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die Nukleinsäure kann aus einer Zelle oder einem Gewebe als Quelle isoliert werden oder rekombinanten oder synthetischen Ursprungs sein. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es für den Fachmann offensichtlich, daß viele solche codierenden Sequenzen möglich sind, wobei jede Sequenz die in SEQ ID NO: 5, Aminosäurereste 93–201, gezeigte Aminosäuresequenz codiert.

Ein vierter Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, die die erfindungsgemäße cDNA oder eine Nukleinsäure gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung umfassen, sowie Wirtszellen, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformiert oder transfiziert sind. Diese Zellen sind besonders zur Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids geeignet und umfassen Insektenzellen, wie beispielsweise Sf9-Zellen, die bei der American Type Culture Collection (ATCC SRL-171) erhältlich sind und mit einem Baculovirus-Vektor transformiert sind, und die humane Embryo-Nierenzelllinie 293EBNA, die mit einem geeigneten Expressionsplasmid transfiziert ist. Bevorzugte Vektoren der Erfindung sind Expressionsvektoren, in denen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure funktionsfähig mit einem oder mehreren geeigneten Promotoren und/oder anderen Kontrollsequenzen verknüpft ist, so daß geeignete Wirtszellen, die mit den Vektoren transformiert oder transfiziert sind, in der Lage sind, das erfindungsgemäße Polypeptid zu exprimieren. Andere bevorzugte Vektoren sind solche, die für die Transfektion von Säugerzellen oder für gentherapeutische Zwecke geeignet sind, wie beispielsweise Adenovirus- oder Retrovirus-Vektoren oder Liposomen. Eine Vielzahl entsprechender Vektoren ist im Stand der Technik bekannt.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors bereit, der in der Lage ist ein Polypeptid zu exprimieren, für das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure codiert, wobei es die Schritte der funktionsfähigen Verknüpfung der Nukleinsäure mit einem oder mehreren geeigneten Promotoren und/oder anderen Kontrollsequenzen umfaßt, wie oben beschrieben ist.

Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids bereit, welches die Schritte des Exprimierens eines erfindungsgemäßen Vektors in einer Wirtszelle und des Isolierens des Polypeptids aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium für die Wirtszelle umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfaßt der Expressionsvektor ferner eine Sequenz, die für ein Affinitäts-Tag, wie beispielsweise FLAGTM oder Hexahistidin, codiert, um die Reinigung des Polypeptids durch Affinitätschromatographie zu erleichtern.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der spezifisch mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid reagiert. Dieser Aspekt der Erfindung umfaßt Antikörper, die für den oben angegebenen VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C spezifisch sind. Solche Antikörper eignen sich als Inhibitoren oder Agonisten von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C sowie als diagnostische Mittel zum Nachweis und zur Quantifizierung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C geeignet. Es können polyklonale oder monoklonale Antikörper verwendet werden. Monoklonale und polyklonale Antikörper gegen erfindungsgemäße Polypeptide können mittels auf diesem Gebiet üblicher Standardverfahren erzeugt werden. Für manche Zwecke, beispielsweise wenn bei einer klinischen Situation ein monoklonaler Antikörper zur Inhibierung der Wirkungen von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C eingesetzt werden soll, kann der Einsatz humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper erwünscht sein. Verfahren zu deren Herstellung, einschließlich rekombinanter DNA-Verfahren, sind im Stand der Technik ebenfalls gut bekannt.

Dieser Aspekt der Erfindung umfaßt auch einen Antikörper, der VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C erkennt und der zweckmäßig markiert ist.

Erfindungsgemäße Polypeptide oder Antikörper können mit einem nachweisbaren Marker markiert sein und für Diagnosezwecke eingesetzt werden. Ähnlich kann das so markierte erfindungsgemäße Polypeptid zur in situ-Identifizierung seines entsprechenden Rezeptors verwendet werden. Zur Bildgebung können das Polypeptid oder der Antikörper kovalent oder nicht-kovalent an ein geeignetes supermagnetisches, paramagnetisches, elektronendichtes, echogenes oder radioaktives Mittel gekuppelt werden. Für den Einsatz bei diagnostischen Tests können radioaktive oder nicht-radioaktive Marker verwendet werden, wobei letztere Enzymmarker oder Marker des Biotin/Avidin-Systems umfassen.

Klinische Applikationen der Erfindung umfassen diagnostische Applikationen, Beschleunigung der Angiogenese bei Wundheilung, Gewebe- oder Organtransplantation oder Etablierung des Kollateralkreislaufs bei Gewebeinfarkt oder Arterienstenose, wie beispielsweise bei koronarer Arterienerkrankung, sowie Inhibierung der Angiogenese bei der Behandlung von Krebs oder diabetischer Retinopathie. Quantifizierung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C in Biopsieproben bei Krebs kann als Indikator für zukünftiges Metastaserisiko nützlich sein.

Soweit VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C in der Lunge stark exprimiert wird und auch die Gefäßpermeabilität erhöht, ist es für verschiedene Zustände der Lunge von Bedeutung. VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Tests könnten bei der Diagnose verschiedener Lungenerkrankungen verwendet werden. VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C könnte auch bei der Behandlung von Lungenerkrankungen verwendet werden, um die Blutzirkulation in der Lunge und/oder den Gasaustausch zwischen den Lungenflügeln und dem Blutstrom zu verbessern. Ähnlich könnte VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C dazu verwendet werden, die Blutzirkulation zum Herzen und die Permeabilität für O2-Gas im Falle von Herzinsuffizienz zu verbessern. In ähnlicher Weise könnte VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C dazu verwendet werden, die Blutzufuhr und den Gasaustausch bei chronisch obstruktiven Luftwegserkrankungen zu verbessern.

Umgekehrt könnten VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Antagonisten (z.B. Antikörper und/oder Inhibitoren) zur Behandlung von Zuständen wie kongestiver Herzinsuffizienz verwendet werden, bei denen es aufgrund eines Anstiegs der Gefäßpermeabilität zu einer Flüssigkeitsakkumulation, beispielsweise in der Lunge, kommt, indem eine ausgleichende Wirkung auf die Gefäßpermeabilität ausgeübt wird, um der Flüssigkeitsakkumulation entgegenzuwirken.

Die Erfindung stellt daher Zusammensetzungen bereit, die die Angiogenese und/oder die Neovaskularisation in einem Säuger stimulieren, was den Schritt der Verabreichung einer wirksamen Dosis von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C umfaßt, die die Fähigkeit besitzt, die Endothelzellproliferation in dem Säuger zu stimulieren.

VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C kann gegebenenfalls zusammen oder in Verbindung mit VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, PlGF, PDGF, FGF und/oder Heparin oder mehreren davon verabreicht werden.

Umgekehrt stellt die Erfindung Zusammensetzungen zur Inhibierung von Angiogenese und/oder Neovaskularisation in einem Säuger bereit, was den Schritt der Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antagonisten von VEGF-D an einen Säuger umfaßt. Der Antagonist kann jedes Mittel sein, welches die Wirkung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C verhindert, indem es entweder die Bindung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C an dessen entsprechenden Rezeptor oder die Zielzelle verhindert, oder indem es die Aktivierung des Signaltransduktors vom Rezeptor zum Wirkzentrum in der Zelle verhindert. Geeignete Antagonisten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, gegen VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C gerichtete Antikörper; kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der Bindung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C an den VEGF-D-Rezeptor, wie beispielsweise die oben angegebenen rezeptorbindenden, aber nicht-mitogenen VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Varianten; sowie Antisense-Nukleotidsequenzen, die zu wenigstens einem Teil der für VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C codierenden DNA-Sequenz komplementär sind.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C in einer biologischen Probe bereit, welches den Schritt des In-Kontakt-bringens der Probe mit einem zur Bindung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C fähigen Reagens und den Nachweis der Bindung umfaßt. Das zur Bindung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C fähige Reagens ist vorzugsweise ein gegen VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C gerichteter Antikörper und besonders bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Bindung und/oder das Ausmaß der Bindung mit einem nachweisbaren Marker nachgewiesen; geeignete Marker sind oben erörtert.

Wenn VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C oder ein Antagonist für therapeutische Zwecke verwendet werden sollen, hängen Dosis und Verabreichungsweg vom zu behandelnden Zustand ab und werden vom behandelnden Arzt oder Veterinär bestimmt. Geeignete Wege umfassen subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, topische Applikation, Implantate usw. Die topische Applikation von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C kann analog zu VEGF erfolgen.

Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Mittel zur Diagnose/Prognose, üblicherweise in Form von Testkits, bereit. In einer Ausführungsform der Erfindung wird beispielsweise ein Testkit zur Diagnose/Prognose bereitgestellt, der einen Antikörper gegen VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C sowie Mittel zum Nachweis, und besonders bevorzugt zur Bestimmung, der Bindung zwischen dem Antikörper und VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mittel zur Diagnose/Prognose ist entweder der Antikörper oder das VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C mit einem nachweisbaren Marker markiert, und entweder ist der Antikörper oder das VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C substratgebunden, so daß die Wechselwirkung VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Antikörper festgestellt werden kann, indem die Menge an Marker bestimmt wird, die nach Bindung zwischen dem Antikörper und dem VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C an das Substrat gebunden ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Mittel zur Diagnose/Prognose in Form eines üblichen ELISA-Kits bereitgestellt werden.

In einer weiteren alternativen Ausführungsform können die Mittel zur Diagnose/Prognose Mittel für eine Polymerasekettenreaktion umfassen, um die genomische Sequenzstruktur eines VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Gens eines individuellen Tests zu ermitteln und um diese Sequenzstruktur mit der in dieser Anmeldung offenbarten Struktur zu vergleichen, um Anomalien aufzufinden und festzustellen, ob Aberrationen bei der VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Expression mit einem gegebenen Krankheitszustand in Zusammenhang stehen.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Strukturaberrationen in der Struktur des VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Gens bei einem Testsubjekt, welche mit einem Krankheitszustand dieses Testsubjekts zusammenhängen könnten. Das Verfahren umfaßt das Bereitstellen einer DNA-Probe dieses Testsubjekts; das In-Kontakt-Bringen der DNA-Probe mit einem für VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C spezifischen Primersatz, der funktionsfähig mit einer Polymerase gekoppelt ist, sowie das selektive Amplifizieren der VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-DNA aus der Probe durch Polymerasekettenreaktion, und den Vergleich der Nukleotidsequenz der amplifizierten VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-DNA aus der Probe mit den in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 4 angegebenen Nukleotidsequenzen. Die Erfindung umfaßt auch die Bereitstellung eines Testkits, welcher ein für VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-DNA spezifisches Primerpaar umfasst, das funktionsfähig mit einer Polymerase gekoppelt ist, wodurch die Polymerase zur selektiven Amplifikation von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-DNA aus einer DNA-Probe fähig ist.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche entweder ein VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Polypeptid umfaßt, das die Proliferation von Endothelzellen fördert, oder einen Antikörper dagegen. Daneben können Zusammensetzungen, die ein VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Polypeptid umfassen, gegebenenfalls VEGF, VEGF-B und VEGF-C und/oder Heparin oder mehrere davon umfassen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Proteindimer, das VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Polypeptid umfaßt, insbesondere ein disulfidverbrücktes Dimer. Die erfindungsgemäßen Proteindimere umfassen sowohl Homodimere des VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Polypeptids als auch Heterodimere aus VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C und VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PlGF oder PDGF.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C bereitgestellt, welches den Schritt des Aussetzens einer VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C exprimierenden Zelle gegen Heparin umfaßt, um die Freisetzung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C aus der Zelle und die Reinigung des auf diese Weise freigesetzten VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C zu erleichtern.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet die Bereitstellung eines Vektors, welcher eine Antisense-Nukleotidsequenz umfaßt, die zu wenigstens einem Teil einer DNA-Sequenz komplementär ist, die für VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C codiert, das die Endothelzellproliferation fördert. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann ein solcher Vektor, der eine Antisense-Sequenz umfaßt, dazu eingesetzt werden, die VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Expression zu inhibieren oder mindestens abzuschwächen. Die Verwendung eines Vektors dieses Typs zur Inhibierung der VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Expression wird in Situationen bevorzugt, in denen die VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Expression mit einer Erkrankung zusammenhängt, beispielsweise wenn Tumore VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C produzieren, um Angiogenese sicherzustellen. Eine Transformation solcher Tumorzellen mit einem Vektor, der eine Antisense-Nukleotidsequenz enthält, würde eine Angiogenese unterdrücken oder verlangsamen und so das Tumorwachstum inhibieren oder verlangsamen.

Kurze Beschreibung der Figuren

1 zeigt einen Vergleich zwischen den Sequenzen von humanem VEGF-D und humanem VEGF165 (1a), humanem VEGF-B (1b), humanem VEGF-C (1c) und humanem PlGF (1d). Der Kasten zeigt die Reste an, die mit den in humanem VEGF-D vorkommenden übereinstimmen;

2 zeigt Sequenz-Alignments zwischen den Sequenzen von humanem VEGF-D, humanem VEGF165, humanem VEGF-B, humanem VEGF-C und humanem PlGF. Die Kästen zeigen die Reste an, die mit der VEGF-D-Sequenz übereinstimmen; und

3 zeigt die Aminosäuresequenz des humanen VEGF-D (SEQ ID NO: 3), wie sie aus der cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) vorhergesagt wird. Die Kästen zeigen mögliche Stellen für eine N-verknüpfte Glykosylierung;

4 zeigt die Nukleotidsequenz einer zweiten cDNA-Sequenz, welche für humanes VEGF-D (SEQ ID NO: 4) codiert, die durch Hybridisierung aus einer kommerziell erhältlichen cDNA-Genbank von humaner Lunge isoliert wurde; diese DNA enthält die vollständige codierende Region für humanen VEGF-D;

5 zeigt die Aminosäuresequenz für humanen VEGF-D (SEQ ID NO: 5), die sich aus der cDNA-Sequenz der 4 ableitet;

6 zeigt Sequenz-Alignments zwischen den Aminosäuresequenzen von humanem VEGF-D, humanem VEGF165, humanem VEGF-B, humanem VEGF-C und humanem PlGF; und

7 zeigt die Ergebnisse eines Bioassays, bei dem konditioniertes Medium von COS-Zellen, welche entweder VEGF-A oder VEGF-D exprimieren, auf seine Fähigkeit getestet wurde, an die extrazelluläre Domäne eines chimären Rezeptors, der in Ba/F3-Zellen exprimiert wurde, zu binden.

8 zeigt die Ergebnisse einer Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse von VEGF-D-Peptiden

(A) pEFBOSVEGFDfullFLAG und pCDNA-1VEGF-A wurden in COS-Zellen transfiziert und für 4 Stunden biosynthetisch mit 35S-Cystein/Methionin markiert. Die Überstände dieser Kulturen wurden entweder mit M2-Gel oder einem Antiserum, das gegen an Protein A gekoppeltes VEGF-A gerichtet ist, immunpräzipitiert. Gewaschene Kügelchen wurden mit einem gleichen Volumen 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer eluiert und zum Sieden erhitzt. Die Proben wurden anschließend mit 12%iger SDS-PAGE aufgetrennt. Bahnen, die mit einem Stern (*) markiert sind, zeigen an, wo Proben mit Dithiothreitol reduziert und mit Iodacetamid alkyliert wurden. Die Molekulargewichtmarker sind angegeben. fA und fB zeigen die 43 kD- und 25 kD-Spezies an, die im M2-Gel aus den pEFBOSVEGFDfullFLAG exprimierenden COS-Zellen immunpräzipitiert wurden.

(B) Western-Blot-Analyse von gereinigtem VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C. Ein Aliquot Material, das aus der M2-Affinitätssäule eluiert wurde (Fraktion #3, VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C) wurde mit 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer gemischt und auf einem 15%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Die Proteine wurden anschließend auf eine Nitrocellulosemembran überführt und entweder mit monoklonalem Antikörper M2 oder einem Isotyp-gematchten Antikörper als Kontrolle (Neg) ausgetestet. Die Blots wurden mit Hilfe eines Ziege-anti-Maus-HRP-Sekundärantikörpers und Chemilumineszenz (ECL, Amersham) entwickelt. Monomeres VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C ist mit einem Pfeil gekennzeichnet, ebenso wie die putative dimere Form dieses Peptids (VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C"). Die Molekulargewichtmarker sind angegeben.

9 zeigt die Ergebnisse der Analyse des VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C-Proteins bei einem VEGFR2-Bioassay. Rekombinantes VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C, und durch M2-Affinitätschromatographie gereinigtes Material, wurde in einem VEGFR2-Bioassay untersucht. Die Zellen des Bioassays (104), die gewaschen wurden, um IL-3 zu entfernen, wurden mit Aliquots von konditioniertem Medium von mit VEGF-D transfizierten COS-Zellen, Fraktion #1 von der Affinitätssäule (Porenvolumen) oder Fraktion #3 von der Affinitätssäule (mit VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C), inkubiert. Alle Proben wurden bei einer anfänglichen Konzentration von 20% (d.h. 1/5) und anschließend in doppelten Verdünnungen untersucht. Die Zellen wurden 48 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 10% CO2 inkubieren gelassen. Die Zellproliferation wurde durch Zugabe von 1 &mgr;Ci 3H-Thymidin und Zählung der in einer Zeitspanne von 4 Stunden eingebauten Menge quantifiziert.

10 zeigt die Stimulierung der Tyrosinphosphorylierung des VEGFR3-Rezeptors (Flt4) auf NIH3T3-Zellen durch Kulturüberstand von HF-Zellen, die mit einem mit VEGF-D transformierten, rekombinanten Baculovirus-Vektor infiziert waren.

11 zeigt die Stimulierung der Tyrosinphosphorylierung des VEGFR2-Rezeptors (KDR) in PAE-Zellen durch Kulturüberstand, der wie in 10 hergestellt wurde.

12 zeigt die mitogene Wirkung von VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C auf Endothelzellen der Rinderaorta (BAEs). Die BAEs wurden mit Fraktion #3, die VEGF-D&Dgr;N&Dgr;C und, als positive Kontrolle, gereinigtes VEGF-A enthielt, wie im Text beschrieben behandelt. Das Ergebnis, das man mit Medium erhält, dem kein Wachstumsfaktor zugegeben worden war, wird als Mediumkontrolle bezeichnet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Figuren und die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele ausführlich beschrieben.

Beispiel 1

Es wurde die Vermutung angestellt, daß keine weiteren Mitglieder der VEGF-Familie zu finden seien, da es keine bekannten Orphanrezeptoren in der VEGFR-Familie gibt. Zudem liegen uns keine Kenntnisse über Mutmaßungen im Stand der Technik vor, daß weitere derartige Familienmitglieder existieren würden.

Eine Computerrecherche in Nukleinsäuredatenbanken wurde zufällig im Rahmen eines anderen Projekts durchgeführt, wobei die Aminosäuresequenzen von VEGF, VEGF-B, VEGF-C und PlGF Gegenstand der Suche waren. Mehrere cDNA-Sequenzen wurden bei dieser Suche identifiziert. Eine dieser Sequenzen, GenBank-Zugriffsnummer H24828, codiert für ein Polypeptid, das der cysteinreichen C-terminalen Region von VEGF-C in seiner Struktur ähnelte. Diese Sequenz wurde aus der Datenbank von „Expressed Sequence Tags" (dbEST) erhalten und wird im Rahmen dieser Beschreibung mit XPT bezeichnet. Die XPT-cDNA war aus einer humanen cDNA-Genbank mit der Bezeichnung "Soares Breast 3NbHBst" isoliert worden, die mit Hilfe von mRNA aus adultem humanem weiblichen Brustgewebe konstruiert wurde. Soweit festgestellt werden konnte, war dies normales Brustgewebe. Die Sequenzierung der XPT-DNA erfolgte nach Vorgaben des Integrated Molecular Analysis of Genome Expression Consortium (IMAGE Consortium), das cDNA-Genbanken von Laboratorien der ganzen Welt erbittet, die cDNA-Klone sortiert und sie anderen Organisationen zur Sequenzierung zur Verfügung stellt.

Die in der Datenbank gezeigte XPT-Sequenz war 419 Nukleotide lang und codierte für eine Aminosäuresequenz, die den 100 C-terminalen Aminosäuren von VEGF-C ähnlich war, d.h. bei dem Nummerierungssystem von Joukov et al (1996) ungefähr den Resten 250 bis 350. Ähnlich cysteinreiche Regionen sind in anderen Proteinen zu finden, die in ihrer Funktionsweise in absolut keinem Zusammenhang mit der VEGF-Familie stehen, wie beispielsweise das sekretierte seideähnliche Protein sp185, das in den Speicheldrüsen der Mücke Chironomus tentans synthetisiert wurde. Dieses Protein wird vom Gen BR3 codiert, das in einem Balbiani-Ring lokalisiert ist, einem gewebespezifischen Chromosomen-„Puff", der sich auf Polytänchromosomen in den Speicheldrüsen der Mücke findet (Dignam und Chase; Gene, 1990 88 133–140; Paulsson et al J. Mol. Biol., 1990 211 331–349). Joukov et al (1996) stellen fest, daß sich das sp185-ähnliche Strukturmotiv in VEGF-C zu einer unabhängigen Domäne falten kann, die vermutlich nach der Biosynthese wenigstens teilweise abgespalten wird, und daß es wenigstens ein Cysteinmotiv vom Typ sp185 in der C-terminalen Region von VEGF gibt.

3 von Joukov et al zeigt, daß die letzten zwei Drittel der C-terminalen, cysteinreichen Region von VEGF-C kein Alignment mit VEGF oder PlGF bilden und vielmehr als C-terminale Verlängerung von VEGF-C angesehen werden könnten, die in VEGF oder PlGF nicht vorliegt. Die von XPT codierte Sequenz ähnelt dieser Verlängerung. Da die XPT-cDNA an ihrem 5'-Ende trunkiert war, war es nicht möglich, Aminosäuresequenzen für die Regionen, die N-terminal zur cysteinreichen Domäne liegen, abzuleiten oder vorherzusagen. Daher erstreckt sich der Teil von VEGF-C, welcher der von XPT abgeleiteten Sequenz ähnelt, nicht auf Regionen von VEGF-C, die bei anderen Mitgliedern der VEGF-Familie konserviert sind.

Wie oben beschrieben, war es nicht möglich vorherzusagen, ob die N-terminale Region des Polypeptids, welches von einer vollständigen XPT-Nukleinsäure codiert wird (im Unterschied zur trunkierten XPT-cDNA in dbEST), weitere Homologie zu irgendeinem Mitglied der VEGF-Familie zeigen könnte, insbesondere zu VEGF-C, das weitere 250 N-terminale Aminosäuren besitzt. Das natürlich vorkommende Protein, das von einer vollständigen XPT-Nukleinsäure codiert wird, könnte beispielsweise das humane Homologe des Proteins aus der Speicheldrüse der Mücke sein. Alternativ dazu könnte der Typ des cysteinreichen Motivs, das von trunkierter XPT-cDNA codiert wird, bei anderen Proteinen weit verbreitet sein, wie es bei vielen Strukturdomänen der Fall ist. Cluster aus Cysteinresten könnten beispielsweise bei der Bindung von Metallen, an der Bildung intramolekularer Disulfidbrücken zur Förderung exakter Proteinfaltung oder an der Bildung intermolekularer Disulfidbrücken zur Anordnung von Proteinuntereinheiten in Komplexen beteiligt sein (Dignam und Chase, 1990). Um festzustellen, ob die trunkierte XPT-cDNA von Sequenzen abstammte, die für ein mit VEGF verwandtes Molekül codieren, war es notwendig, eine viel längere cDNA zu isolieren.

Beispiel 2 Klonierung von cDNA, die für VEGF-D codiert

Eine Probe der XPT-cDNA, die in dbEST beschrieben ist, wurde von der American Type Culture Collection erhalten, einem registrierten Anbieter von cDNA-Klonen, die vom IMAGE Consortium erhalten wurden. Die Identität der XPT-cDNA wurde durch Nukleotidsequenzierung bestätigt, wobei die Methode der Didesoxy-Kettentermination verwendet wurde (Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977 74 5463–5467).

Die XPT-cDNA wurde als Hybridisierungssonde zum Screenen einer cDNA-Genbank von humaner Brust eingesetzt, die kommerziell von Clontech erhalten wurde. Ein positiver Klon wurde isoliert und dieser Klon wurde anschließend auf beiden Strängen sequenziert. Es wurde die Nukleotidsequenz erstellt und es wurde ein offener Leserahmen identifiziert. Die Nukleinsäuresequenz ist in SEQ ID NO: 1 angegeben. Das Polypeptid, das von dieser Sequenz codiert wird, wurde als VEGF-D bezeichnet, und seine abgeleitete Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 3 bezeichnet wird, ist in 3 angegeben. In 3 sind putative Stellen für eine N-verknüpfte Glykosylierung mit der Konsensussequenz N-X-S/T, wobei X eine beliebige Aminosäure ist, durch die Kästen angezeigt.

Beispiel 3 Eigenschaften von VEGF-D

Die Aminosäuresequenz von VEGF-D wurde mit den Sequenzen von VEGF-A165, VEGF-B, VEGF-C und PlGF verglichen. Diese Vergleiche sind entsprechend in den 1a bis d dargestellt. Der Grad der Sequenzhomologie wurde berechnet, und falls für Alignmentzwecke eingeführte Sequenzlücken („Gaps") nicht in die Berechnung miteinbezogen werden, ist VEGF-D zu 31% mit VEGF identisch, zu 48% mit VEGF-B identisch und zu 32% mit PlGF identisch. Daher war das am engsten verwandte identifizierte Protein VEGF-C.

Computerrecherchen in den Nukleinsäuredatenbanken GenBank, EMBL und SwissPot lieferten keine Proteinsequenzen, die zu VEGF-D identisch waren. Wie aus dem oben angegebenen Sequenzalignment zu erwarten war, war das Protein mit der größten Verwandtschaft, das in diesen Datenbanken zu finden war, VEGF-C. Auch dbEST wurde durchsucht, man fand aber keine Sequenz, die die ganze codierende Region von VEGF-D umfaßte. Die Sequenz von VEGF-D ist mit der vom Tie-2-Liganden 1, der in der WO 96/11269 offenbart ist, nicht verwandt.

Es ist wichtig nicht außer Acht zu lassen, daß die einzigen nachweisbaren Homologien auf der Ebene der Aminosäuresequenz waren. Daher wäre es nicht möglich gewesen, die für VEGF-D codierende cDNA oder gDNA mit Verfahren zu isolieren wie einer Hybridisierung bei niedriger Stringenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein anderes Mitglied der VEGF-Familie codiert.

VEGF-D scheint von allen Mitgliedern der VEGF-Familie mit VEGF-C am engsten verwandt zu sein. Da die VEGF-D-Aminosäuresequenz das cysteinreiche sp185-ähnliche Motiv umfaßt, das bei VEGF-C zu finden ist, könnte das erfindungsgemäße Polypeptid im Lymphendothel eine wichtige Funktion ausüben. Obwohl wir uns nicht auf irgendeinen vorgeschlagenen Mechanismus festlegen möchten, denken wird, daß VEGF-C und VEGF-D eine seideähnliche Matrix ausbilden könnten, über die Endothelzellen wachsen können. Lymphgefäße haben keine Basismembran, und so kann die seideähnliche Matrix ein einer Basismembran ähnliches Material bilden. Dies kann eine wichtige Rolle für die Förderung von Zellwachstum und/oder Zelldifferenzierung spielen und bei Krebs, insbesondere Metastasierung, Medikamententherapie, Krebsprognose usw. von Bedeutung sein.

Beispiel 4 Biologische Eigenschaften von VEGF-D

Die cDNA-Sequenz von VEGF-D wurde verwendet, um die abgeleitete Aminosäuresequenz von VEGF-D, die biochemischen Eigenschaften des codierten Polypeptids, einschließlich der Anzahl stark basischer, stark saurer, hydrophober und polarer Aminosäuren, das Molekulargewicht, den isoelektrischen Punkt, die Ladung bei pH 7 und die Analyse der Zusammensetzung des gesamten Proteins vorherzusagen. Diese Analyse wurde mit Hilfe des Protean-Proteinanalyseprogramms, Version 1.20 (DATASTAR) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt. Tabelle 1 zeigt zudem die Codon Usage.

Tabelle 1 Translatierte DNA-Sequenz von VEGF-D Contig x (1,978) mit üblichem Genetischen Code
  • Molekulargewicht 37056,60 Dalton
  • 425 Aminosäuren
  • 46 stark basische (+) Aminosäuren (K, R)
  • 41 stark saure (–) Aminosäuren (D, E)
  • 79 hydrophobe Aminosäuren (A, I, L, F, W, V)
  • 108 polare Aminosäuren (N, C, Q, S, T, Y)
  • 7,792 Isoelektrischer Punkt
  • 6,371 Ladung bei pH 7,0
  • Die Gesamtanzahl translatierter Basen beträgt 978
  • % A = 28,73 [281]
  • % G = 23,11 [226]
  • % T = 23,21 [227]
  • % C = 24,95 [244]
  • % unsicher = 0,00 [0]
  • % A + T = 51,94 [508]
  • % C + G = 48,06 [470] Davis, Botstein, Roth-Schmelztemperatur °C 84,09 Wallace-Temperatur °C 3384,00
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Contig 2: Contig-Länge: 2379 Basen Durchschnittliche Länge/Sequenz: 354 Basen Gesamtlänge der Sequenz: 4969 Basen
Tabelle 2 Vorhergesagte Strukturklasse des gesamten Proteins: Deléage & Roux-Modifikation von Nishikawa & Ooi 1987
Tabelle 2 (Fortsetzung) Analyse der Zusammensetzung des gesamten Proteins

Diese Analyse sagt für das unprozessierte VEGF-D-Monomer ein Molekulargewicht von 37 Kilodalton (kD) voraus, im Vergleich zu den experimentell ermittelten Werten (für die vollständig prozessierten Peptide) von 20 bis 27 kD für VEGF-A-Monomere, 21 kD für das VEGF-B-Monomer und 23 kD für das VEGF-C-Monomer.

Beispiel 5

Die ursprüngliche Isolierung einer cDNA für VEGF-D, beschrieben in Beispiel 2, umfaßte ein Hybridisierungsscreening einer cDNA-Genbank von humaner Brust. Da so nur ein einziger cDNA-Klon für VEGF-D isoliert wurde, war es nicht möglich, die Struktur der cDNA durch Vergleich mit anderen unabhängig isolierten VEGF-D-cDNAs zu bestätigen. Die in diesem Beispiel beschriebene Arbeit, die die Isolierung zusätzlicher humaner VEGF-D-cDNA-Klone umfaßte, wurde durchgeführt, um die Struktur der humanen VEGF-D-cDNA zu bestätigen.

Eine cDNA-Genbank, die kommerziell von Stratagene erhalten wurde (Katalognummer 937210) wurde für ein Hybridisierungsscreening mit einer VEGF-D-cDNA-Sonde eingesetzt. Die Sonde, die die Nukleotide 1817 bis 2495 der in Beispiel 2 beschriebenen cDNA für humanes VEGF-D umspannte, wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugt, wobei ein Plasmid eingesetzt wurde, das die VEGF-D-cDNA als Matrize und die folgenden zwei Oligonukleotide enthielt:

Mit dieser Sonde wurden ungefähr zwei Millionen rekombinante Bakteriophagen aus jeder der zwei cDNA-Genbanken gescreent. Neun humane cDNA-Klone von VEGF-D wurden anschließend isoliert.

Zwei der neun humanen cDNA-Klone für VEGF-D wurden vollständig sequenziert, wobei die Methode der Didesoxy-Kettentermination eingesetzt wurde (Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977 74 5463–5467). Die zwei cDNAs enthielten die gesamte für humanen VEGF-D codierende Region und waren bis auf die Ausnahme, daß einer der Klone am 5'-Terminus fünf Nukleotide länger als der andere war, identisch. Die Nukleotidsequenz der kürzeren cDNA ist in 4 gezeigt und wird als SEQ ID NO: 4 bezeichnet. Die Aminosäuresequenz für humanen VEGF-D (hVEGF-D), die sich aus dieser cDNA ableitet, war 354 Reste lang und ist in 5 gezeigt; sie wird als SEQ ID NO: 5 bezeichnet. Die Sequenzen der 5'-Regionen der fünf anderen humanen VEGF-D-cDNA-Klone wurden ebenfalls bestimmt. Für jeden Klon enthielt die Sequenz, die charakterisiert wurde, mehr als 100 DNA-Nukleotide unmittelbar stromabwärts von der Startstelle der Translation der Codierungsregion. In allen Fällen waren die Sequenzen dieser Regionen mit den entsprechenden Regionen der humanen VEGF-D-cDNA, die in 4 gezeigt ist, identisch.

Wie oben beschrieben, wurde die ganze Sequenz des humanen VEGF-D-cDNA-Klons, die in diesem Beispiel beschrieben wird, durch Vergleich mit der Sequenz eines zweiten humanen Klons bestätigt. Daneben stellte man fest, daß die Sequenz des 5'-Endes der codierenden Region mit fünf anderen humanen VEGF-D-cDNA-Klonen identisch war. Im Gegensatz dazu enthielt die in Beispiel 2 beschriebene Sequenz den größten Teil der für VEGF-D codierenden Region, war aber in der Nähe des 5'-Endes dieser Region inkorrekt. Dies rührt wahrscheinlich daher, daß die VEGF-D-cDNA in der Nähe des 5'-Endes der codierenden Region trunkiert war und an dieser Stelle mit einer anderen nicht identifizierten cDNA ligiert war, und dementsprechend waren die ersten 30 Codons der wahren codierenden Sequenz für VEGF-D deletiert und durch einen Methioninrest ersetzt. Dieser Methioninrest wurde als N-terminale Aminosäure der in Beispiel 2 dargestellten VEGF-D-Sequenz definiert.

Die 25 N-terminalen Aminosäuren von humanem VEGF-D bilden eine extrem hydrophobe Region, was mit der Vorstellung konsistent ist, daß ein Teil dieser Region eine Signalsequenz zur Proteinsekretion sein könnte. 6 zeigt das Alignment der humanen VEGF-D-Sequenz mit den Sequenzen anderer Mitglieder der VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren, nämlich humanem VEGF165 (hVEGF165), humanem VEGF-B (hVEGF-B), humanem VEGF-C (hVEGF-C) und humanem Plazentawachstumsfaktor (hPlGF). Wenn man die Lücken in dem Alignment zu Berechnungszwecken außer Acht läßt, stellt man fest, daß humanes VEGF-D in der Aminosäuresequenz zu 31% identisch mit humanem VEGF165, zu 28% identisch mit humanem VEGF-B, zu 48% identisch zu VEGF-C und zu 32% identisch mit humanem PlGF ist. Es ist offensichtlich, daß VEGF-C dasjenige Mitglied dieser Familie ist, das mit VEGF-D am engsten verwandt ist.

Beispiel 6 Expression von VEGF-D in COS-Zellen

Ein Fragment der humanen cDNA für VEGF-D, das sich über die Nukleotide 1 bis 1520 der in 4 gezeigten Sequenz erstreckt und das die ganze codierende Region enthält, wurde in den Expressionsvektor pCDNA1-amp für Säugerzellen inseriert. Der Vektor wurde dazu verwendet, COS-Zellen transient zu transfizieren, wobei das DEAE-Dextran-Verfahren, wie es bereits beschrieben wurde (Aruffo und Seed, 1987), verwendet wurde, und die resultierenden konditionierten Zellkulturmedien, die nach 7 Tagen Inkubation gesammelt wurden, wurden mit Hilfe von Amicon-Konzentratoren (Centricon 10 mit einem Molekulargewichts-Cut off von 10.000) nach Angaben des Herstellers aufkonzentriert. Die für Transfektionen verwendeten Plasmide waren das Expressionskonstrukt für humanen VEGF-D und, als positive Kontrolle, ein Konstrukt, das durch Insertion muriner VEGF-A-cDNA in pCDNA1-amp hergestellt worden war. Die konditionierten Medien wurden in zwei verschiedenen Bioassays, wie unten beschrieben, getestet und die Ergebnisse zeigen, daß die COS-Zellen tatsächlich biologisch aktives VEGF-D exprimierten und sekretierten.

Beispiel 7 Bioassay auf die Fähigkeit von VEGF-D, an VEGF-Rezeptor-2 zu binden

Wie in Beispiel 5 gezeigt, ist VEGF-D in der Primärstruktur eng mit anderen Mitgliedern der VEGF-Familie verwandt. Die meisten Mitglieder dieser Proteinfamilie sind für Endothelzellen mitogen und/oder chemotaktisch (Keck et al 1989; Leung et al, 1989; Joukov et al, 1996; Olofsson et al, 1996). Daneben ist VEGF-A (früher als VEGF bekannt), das erste Mitglied der VEGF-Familie, das in der Literatur beschrieben wurde, ein wirkungsvoller Induktor der Gefäßpermeabilität (Keck et al, 1989). Da die Proteinstruktur eine wichtige Determinante der Proteinfunktion ist, schien es wahrscheinlich, daß VEGF-D auch für Endothelzellen mitogen sein könnte oder Gefäßpermeabilität induzieren könnte. Daher wurde humanes VEGF-D in einem Bioassay auf seine Fähigkeit getestet, an den VEGF-Rezeptor-2 (VEGFR2; auch als Flk-1 bekannt) zu binden, einen endothelzellspezifischen Rezeptor, von dem man annimmt, daß er, wenn er von VEGF-A aktiviert wird, ein mitogenes Signal erzeugt (Strawn et al, 1996).

Ein Bioassay zum Nachweis von Wachstumsfaktoren, die an VEGFR2 binden wurde in der faktorabhängigen Zelllinie Ba/F3 entwickelt und ist in unserer früheren Patentanmeldung PCT/US95/16755 beschrieben. Diese Zellen wachsen in Gegenwart von Interleukin-3 (IL-3); die Entfernung dieses Faktors führt jedoch innerhalb von 48 Stunden zum Zelltod. Wenn ein anderer zur Abgabe eines Wachstumsstimulus fähiger Rezeptor in die Ba/F3-Zellen transfiziert wird, kann ein Rescue der Zellen durch den spezifischen Wachstumsfaktor erfolgen, der diesen Rezeptor aktiviert, wenn die Zellen in Medien ohne IL-3 kultiviert werden. Im speziellen Fall des Typs von Rezeptortyrosinkinasen (z.B. VEGFR2) können chimäre Rezeptoren verwendet werden, die die extrazelluläre Domäne der Rezeptortyrosinkinase und die cytoplasmatischen Domänen des Erythropoietinrezeptors (EpoR) enthalten. In diesem Fall führt die Stimulation mit dem Liganden (z.B. VEGF), der an die extrazelluläre Domäne des chimären Rezeptors bindet, zu einer Signalgebung über die EpoR-Cytoplasmadomäne und zum anschließenden Rescue der Zelllinie im Wachstumsmedium, dem IL-3 fehlt. Die Konstruktion des chimären Rezeptors, der bei dieser Untersuchung verwendet wird und der aus der extrazellulären Domäne von murinem VEGFR2 und der Transmembran- und Cytoplasmadomäne von murinem EpoR besteht, und der Bioassay selbst sind unten beschrieben.

Plasmidkonstruktion i) Konstruktion eines Plasmids zur Erzeugung chimärer VEGFR2-Rezeptoren

Um ein Plasmidkonstrukt zu erhalten, mit dem DNA, die für die extrazelluläre Domäne von murinem VEGFR2 codiert, leicht mit DNA ligiert werden kann, die für andere Proteindomänen codiert, wurde sequenzspezifische Mutagenese benützt, um eine BglII-Restriktionsschnittstelle an der Stelle der murinen VEGFR2-cDNA zu erzeugen, die für die Verbindung zwischen der extrazellulären Domäne und der Transmembrandomäne codiert. Der vollständige Klon der murinen VEGFR2-cDNA, der bei Oelrichs et al (1993) beschrieben ist, wurde in den Expressionsvektor pCDNA1-amp für Säugerzellen subkloniert, wobei die BstXI-Restriktionsschnittstelle verwendet wurde. Einzelsträngige UTP+-DNA wurde mit dem M13-Replikationsursprung erzeugt, und diese wurde als Matrize zur Erzeugung muriner VEGFR2-cDNA verwendet, die die BglII-Schnittstelle an der gewünschten Stelle enthielt. Das Plasmid, das die veränderte VEGFR2-cDNA enthielt, wurde als pVEGFR2Bgl bezeichnet. DNA-Fragmente, die für die Transmembran- und Cytoplasmadomänen eines beliebigen Rezeptors codieren, können in die BglII-Schnittstelle von pVEGFR2Bgl inseriert werden, um chimäre VEFGR2-Rezeptoren zu erzeugen.

ii) Konstruktion von chimärem VEGFR2/EpoR-Rezeptor

Die murine EpoR-cDNA wurde in den Expressionsvektor pCDNA1-amp subkloniert und einzelsträngige DNA wurde als Matrize zur Mutagenese erzeugt. Eine BglII-Restriktionsschnittstelle wurde an der Stelle in die EpoR-cDNA eingebaut, die für die Verbindung zwischen der Transmembrandomäne und der extrazellulären Domäne des EpoR codiert, um eine direkte Ligation dieses DNA-Fragments mit der modifizierten cDNA, die für die extrazelluläre Domäne von VEGFR2 in pVEGFR2Bgl codiert, zu ermöglichen. Daneben wurde eine BglII-Schnittstelle in der Cytoplasmadomäne von EpoR durch eine stille Substitution eines einzelnen Nukleotids entfernt. Das DNA-Fragment, das für die Transmembran- und die Cytoplasmadomäne von EpoR codiert, wurde anschließend dazu verwendet, den Teil von pVEGFR2Bgl zu ersetzen, der für die Transmembran- und Cytoplasmadomänen von VEGFR2 codiert. So wurde ein einziger Leserahmen erzeugt, der für den chimären Rezeptor codierte, der aus der extrazellulären Domäne von VEGFR2 und den Transmembran- und Cytoplasmadomänen von EpoR bestand.

Das DNA-Fragment, das für den chimären Rezeptor codiert, wurde in den Expressionsvektor pBOS subkloniert und in die Ba/F3-Zelllinie mit dem Plasmid pgk-neo in einem Verhältnis von 1:20 cotransfiziert. Zellen, die das VEGFR2-EpoR-Protein exprimierten, wurden durch durchflußzytometrische Analyse mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen die extrazelluläre Domäne von VEGFR2 (MAb 4H3) selektiert. Dieser monoklonale Antikörper ist in der Australischen Patentanmeldung PM 3794, eingereicht am 10. Februar 1994, beschrieben. Zelllinien, die größere Mengen VEGFR2-EpoR exprimieren, wurden selektiert, indem man die Zellen in 5 &mgr;g/ml MAb 4H3 oder 25 ng/ml rekombinantem VEGF wachsen ließ. Eine Zelllinie, die große Menge VEGFR2-EpoR exprimierte, bezeichnet als Ba/F3-NYK-EpoR, wurde für den Bioassay verwendet.

Der Bioassay

Die oben beschriebenen Ba/F3-NYK-EpoR-Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen, um IL-3 vollständig zu entfernen, und in einer Konzentration von 1000 Zellen pro 13,5 &mgr;l Kulturmedium resuspendiert, und 13,5 &mgr;l wurden in jede Vertiefung einer Terasaki-Platte mit 60 Vertiefungen aliquotiert. Konditionierte Medien von transfizierten COS-Zellen wurden anschließend in den Zellkulturmedien verdünnt. Zellen, die einen chimären Rezeptor exprimierten, der aus der extrazellulären Domäne des Endothelzellrezeptors Tie-2 und den Transmembran- und Cytoplasmadomänen von EpoR bestand, wurden als nicht ansprechende Kontroll-Zelllinie verwendet. Die Zellen wurden 48–96 Stunden lang inkubiert, wonach die Zellen, die nur in Zellkulturmedium inkubiert wurden, gestorben waren, und das Verhältnis von Überleben/Proliferation, das in den anderen Vertiefungen zu sehen war (d.h. in Gegenwart von COS-Zellen-konditionierten Medien) wurde durch Auszählen der lebensfähigen Zellen pro Vertiefung ausgewertet.

Das konditionierte Medium von den COS-Zellen, die mit Expressionsplasmiden transient transfiziert worden waren, wurde 30fach konzentriert und im VEGFR2-Bioassay verwendet. Konzentriertes konditioniertes Medium von COS-Zellen, die mit pCDNA1-amp transfiziert waren, wurde als negative Kontrolle verwendet.

Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt, wobei der Prozentsatz an 30fach konzentriertem, COS-Zellen-konditioniertem Medium im Inkubationsmedium (Vol/Vol) gegen die Anzahl lebensfähiger Zellen in der Vertiefung nach 48 Stunden Inkubation aufgetragen ist. Es ist offensichtlich, daß das konditionierte Medium, das entweder VEGF-A oder VEGF-D enthielt, bei diesem Test in der Lage war, das Überleben der Zellen zu fördern, was anzeigt, daß beide Proteine an VEGFR2 binden können und VEGFR2 aktivieren können.

Beispiel 8 Test auf Gefäßpermeabilität

Humaner VEGF-D, der wie in Beispiel 6 hergestellt worden war und 30fach konzentriert war, wurde im Miles-Test auf Gefäßpermeabilität getestet (Miles und Miles, 1952), der an betäubten Meerschweinchen (Albino/weiß, 300–400 g) durchgeführt wurde. Konzentriertes konditioniertes Medium für COS-Zellen, die mit pCDNA1-amp transfiziert waren, wurde erneut als negative Kontrolle verwendet. Die Meerschweinchen wurden mit Chloralhydrat (3,6 g/100 ml; 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht) betäubt. Der Rücken der Tiere wurden anschließend vorsichtig mit einem Haarschneider rasiert. Den Tieren wurde eine intrakardiale Injektion des Farbstoffs Evans Blue (0,5% in MT PBS, 0,5 ml) verabreicht, wobei eine 23G-Nadel verwendet wurde, und anschließend wurden ihnen intradermal 100–150 &mgr;l konzentriertes COS-Zellen-konditioniertes Medium injiziert. Nach 15–20 min wurden die Tiere getötet und die Hautschicht auf dem Rücken entfernt, um die darunterliegenden Blutgefäße freizulegen. Zur Quantifizierung wurde jeder Injektionsbereich exzidiert und in 2–5 ml Formamid auf 45°C erhitzt. Die resultierenden Überstände, die extravasierten Farbstoff enthielten, wurden anschließend spektrophotometrisch bei 620 nm untersucht.

Für Tier 1 betrug die Extinktion bei 620 nm, die sich aus der Injektion des 30fach konzentrierten mit VEGF-A konditionierten Mediums ergab, 0,178, die bei 30fach konzentriertem, mit VEGF-D konditioniertem Medium 0,114 und die bei 30fach konzentriertem Medium von Zellen, die mit pCDNA1-amp transfiziert waren, 0,004. Für Tier 2 wurden die 30fach konzentrierten Medien vor der intradermalen Injektion 4fach in Zellkulturmedium verdünnt. Die Extinktion bei 620 nm für die mit VEGF-A konditionierte Probe betrug 0,141, die für die mit VEGF-D konditionierte Probe 0,116, und die für eine Probe, die als negative Kontrolle in ihrem Serumgehalt angepaßt wurde, 0,017. Die verstärkte Farbstoffextravasation, die bei beiden Tieren in Gegenwart von VEGF-A oder VEGF-D beobachtet wurde, zeigte, daß beide Proteine Gefäßpermeabilität stark induzierten.

Die hier beschrieben Daten zeigen an, daß VEGF-D ein sekretiertes Protein ist, das wie VEGF-A an VEGFR2 bindet und VEGFR2 aktiviert und Gefäßpermeabilität induzieren kann.

Beispiel 9 Bioaktivitäten interner VEGF-D-Polypeptide

Die abgeleitete Aminosäuresequenz für VEGF-D umfaßt eine zentrale Region, die in ihrer Sequenz allen anderen Mitgliedern der VEGF-Familie ähnelt (ungefähr die Reste 101 bis 196 der Aminosäuresequenz von humanem VEGF-D, wie sie im Alignment in 6 gezeigt ist). Daher wurde vermutet, daß sich der bioaktive Teil des VEGF-D in der konservierten Region befindet. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Biosynthese von VEGF-D untersucht, und die konservierte Region von humanem VEGF-D wurde wie unten beschrieben in Säugerzellen exprimiert, gereinigt und in den Bioassays getestet.

Plasmidkonstruktion

Ein DNA-Fragment, das für den Teil des humanen VEGF-D von Rest 93 bis 201 codiert, d.h. wo die N- und C-terminalen Regionen entfernt wurden, wurde durch Polymerasekettenreaktion mit Pfu-DNA-Polymerase amplifiziert, wobei ein Plasmid als Matrize verwendet wurde, das die vollständige humane VEGF-D-cDNA enthielt. Das amplifizierte DNA-Fragment, dessen Sequenz durch Nukleotidsequenzierung bestätigt worden war, wurde anschließend in den Expressionsvektor pEFBOSSFLAG inseriert, was ein als pEFBOSVEGFD&Dgr;N&Dgr;C bezeichnetes Plasmid lieferte. Der pEFBOSSFLAG-Vektor enthält DNA, die für die Signalsequenz zur Proteinsekretion aus dem Interleukin-3(IL-3)-Gen und für das FLAGTM-Octapeptid codiert. Das FLAGTM-Octapeptid kann von kommerziell erhältlichen Antikörpern, wie dem monoklonalen Antikörper M2 (IBI/Kodak), erkannt werden. Das VEGF-D-PCR-Fragment wurde so in den Vektor inseriert, daß die IL-3-Signalsequenz unmittelbar stromaufwärts von der FLAGTM-Sequenz lag, welche sich wiederum unmittelbar stromaufwärts zur VEGF-D-Sequenz befand. Alle drei Sequenzen befanden sich im gleichen Leserahmen, so daß eine Translation der mRNA, die aus der Transfektion von pEFBOSVEGFD&Dgr;N&Dgr;C in Säugerzellen resultierte, zu einem Protein führen sollte, das die IL-3-Signalsequenz an seinem N-Terminus haben sollte, gefolgt von dem FLAGTM-Octapeptid und der VEGF-D-Sequenz. Abspaltung der Signalsequenz und anschließende Sekretion des Proteins aus der Zelle sollte zu einem VEGF-D-Polypeptid führen, das mit dem FLAGTM-Octapeptid, das sich in der Nähe vom N-Terminus befindet, markiert ist. Dieses Protein wurde als VEGFD&Dgr;N&Dgr;C bezeichnet.

Daneben wurde ein zweites Plasmid konstruiert, bezeichnet als pEFBOSVEGFDfullFLAG, in welches die vollständige codierende Sequenz des humanen VEGF-D inseriert wurde, so daß die Sequenz für das FLAGTM-Octapeptid unmittelbar stromabwärts von der und im gleichen Leserahmen wie die Codierungsequenz von VEGF-D lag. Dem Plasmid pEFBOSIFLAG fehlt die IL-3-Signalsequenz, daher wurde die Sekretion des VEGF-D/FLAG-Fusionsproteins durch die Signalsequenz von VEGF-D getrieben. pEFBOSVEGFDfullFLAG wurde konstruiert, um die Expression von vollständigem VEGF-D, der am C-Terminus mit dem FLAGTM-Octapeptid markiert war, in Säugerzellen zu erlauben. Dieses Protein wird als VEGFDfullFLAG bezeichnet und ist für die Untersuchung der VEGF-D-Biosynthese geeignet.

Analyse der post-translationalen Prozessierung von VEGF-D

Um zu untersuchen, ob das VEGF-D-Polypeptid zu einem reifen und vollständig aktiven Protein prozessiert wird, wurde pEFBISVEGFDfullFLAG transient in COS-Zellen transfiziert (Aruffo und Seed, 1987). Die Expression in COS-Zellen mit anschließender biosynthetischer Markierung mit 35S-Methionin/Cystein und Immunpräzipitation mit M2-Gel zeigte Spezies von etwa 43 kD (fA) und 25 kD (fB) (8A). Diese Banden stimmen mit der Vorstellung überein, daß VEGF-D zu einem C-terminalen Fragment (mit FLAGTM markiert) und einem internen Peptid (entsprechend ungefähr dem VEGFD&Dgr;N&Dgr;C-Protein) gespalten wird. Eine Reduktion der Immunpräzipitate (M2*) führt zu einer gewissen Reduktion der fA-Bande, was die Möglichkeit einer Disulfidbrücke zwischen den zwei Fragmenten anzeigt.

Expression und Reinigung des internen VEGF-D-Polypeptids

Plasmid pEFBOSVEGFD&Dgr;N&Dgr;C wurde dazu verwendet, COS-Zellen transient zu transfizieren, wobei das DEAE-Dextran-Verfahren, wie es früher beschrieben wurde (Aruffo und Seed, 1987), eingesetzt wurde. Das resultierende konditionierte Zellkulturmedium (ungefähr 150 ml), das nach 7 Tagen Inkubation gesammelt wurde, wurde einer Affinitätschromatographie unterzogen, wobei ein Harz verwendet wurde, an welches der monoklonale Antikörper M2 gekoppelt worden war. Kurz gesagt wurde das Medium chargenweise etwa 4 Stunden bei 4°C über eine 1 ml M2-Antikörpersäule laufen gelassen. Die Säule wurde anschließend ausgiebig mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl gewaschen, bevor mit freiem FLAGTM-Peptid bei 25 &mgr;g/ml im gleichen Puffer eluiert wurde. Das resultierende Material wurde in den unten beschriebenen Bioassays verwendet.

Um den gereinigten VEGFD&Dgr;N&Dgr;C nachzuweisen, wurden die von der M2-Affinitätssäule eluierten Fraktionen einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Aliquots der Säulenfraktionen wurden mit 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer gemischt, zum Sieden erhitzt und auf ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen. Die aufgetrennten Fraktionen wurden auf eine Nitrocellulosemembran überführt und nicht spezifische Bindungsstellen durch Inkubation in Tris/NaCl/Tween 20 (TST) und 10% Magermilchpulver (BLOTTO) blockiert. Die Membranen wurden anschließend mit dem monoklonalen Antikörper M2 oder dem Kontrollantikörper mit 3 &mgr;g/ml für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend ausgiebig mit TST gewaschen. Die Membranen wurden anschließend mit einem sekundären Ziege-anti-Maus-HRP-konjugierten Antiserum 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit TST-Puffer gewaschen. Der Nachweis der Proteinspezies erfolgte mit einem Chemilumineszenzreagens (ECL, Amersham) (8B).

Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurde durch den M2-Antikörper eine Molekulargewichtsspezies von etwa 23 kD (VEGFD&Dgr;N&Dgr;C) nachgewiesen. Dies stimmt mit dem vorhergesagten Molekulargewicht für dieses interne Fragment (12.800) plus N-verknüpfte Glykosylierung überein; VEGFD&Dgr;N&Dgr;C enthält zwei potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen. Eine Spezies von etwa 40 kD wurde ebenfalls nachgewiesen und könnte ein nicht-kovalentes Dimer des 23 kD-Proteins (VEGFD&Dgr;N&Dgr;C) darstellen.

Bioassays

Der Bioassay für die Fähigkeit von Polypeptiden, an VEGF-Rezeptor-2 zu binden, ist ausführlich in Beispiel 7 beschrieben. Aliquots von Fraktionen, die aus der M2-Affinitätssäule eluiert worden waren und die das VEGFD&Dgr;N&Dgr;C-Protein enthielten, wurden in Medium verdünnt und im VEGFR2-Bioassay wie zuvor beschrieben getestet. Fraktion #3 von der Affinitätssäule, welche nachweislich das gereinigte VEGFD&Dgr;N&Dgr;C-Protein enthielt (8B), zeigt eine deutliche Fähigkeit, die Proliferation der Zelllinie des Bioassays bis zu einer Verdünnung von 1/100 der gereinigten Fraktion zu induzieren (9). Im Vergleich dazu zeigte das Porenvolumen der Affinitätssäule (Fraktion #1) keine Aktivität, wohingegen das ursprünglich mit VEGFD&Dgr;N&Dgr;C konditionierte Medium eine nur schwache Aktivität aufwies.

Der Test auf Gefäßpermeabilität (Miles und Miles, 1952) ist kurz in Beispiel 8 beschrieben. Aliquots von gereinigtem VEGFD&Dgr;N&Dgr;C und Proben des Porenvolumens der M2-Affinitätssäule (negative Kontrolle) wurden mit Medium vermischt und intradermal in die Haut von Meerschweinchen injiziert. Die Hautbereiche an den Injektionsstellen wurden exzidiert und extravasierter Farbstoff wurde eluiert. Die Extinktion des extravasierten Farbstoffs bei 620 nm, die sich aus der Injektion von gereinigtem VEGFD&Dgr;N&Dgr;C ergab, lag bei 0,131 ± 0,009. Im Vergleich dazu liegt der Extinktionswert, der sich bei der Injektion einer Probe des Porenvolumens ergibt, bei 0,092 ± 0,020. Daher induzierte VEGFD&Dgr;N&Dgr;C Gefäßpermeabilität, aber der Effekt war nur marginal.

Aufgrund seiner Fähigkeit, an VEGFR2 zu binden, und seiner im Vergleich zu vollständigem VEGF-D geringeren Induktion von Gefäßpermeabilität kann man von VEGFD&Dgr;N&Dgr;C sagen, daß er die Induktion von Gefäßpermeabilität durch VEGF-D durch kompetitive Inhibierung relativ erniedrigt. In diesem Sinne könnte man vermuten, daß das VEGFD&Dgr;N&Dgr;C-Fragment, was die Induktion der Gefäßpermeabilität betrifft, ein Antagonist für VEGF-D ist.

Zusammenfassung

Zwei Faktoren haben dazu geführt, daß wir die internen Fragmente von VEGF-D auf verstärkte Aktivität untersuchten. Erstens ist es die zentrale Region von VEGF-D, die eine Aminosäurehomologie mit allen anderen Mitgliedern der VEGF-Familie zeigt. Und zweitens erfolgt eine proteolytische Prozessierung, durch welche interne bioaktive Polypeptide erzeugt werden, bei anderen Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise PDGF-BB, auf. Daneben war die Aktivität, die bei dem vollständigen VEGF-D-Protein in COS-Zellen zu sehen war, geringer als beim entsprechend konditionierten Medium von mit VEGF-A transfizierten COS-Zellen.

Es wurde vorhergesagt, daß die reife VEGF-D-Sequenz von einem Fragment stammen sollte, das in den Resten 92–205 erhalten ist, wobei eine Spaltung an FAA^TFY und IIRR^SIQI erfolgt. Eine Immunpräzipitationsanalyse des in COS-Zellen exprimierten VEGF-DfullFLAG erzeugte Spezies, die mit der internen proteolytischen Spaltung des VEGF-D-Polypeptids an diesen Stellen mit konsistent waren. Daher wurde eine trunkierte Form von VEGF-D, bei der die N- und C-terminalen Regionen entfernt waren (VEGFD&Dgr;N&Dgr;C) hergestellt und in COS-Zellen exprimiert. Dieses Protein wurde identifiziert und mit Hilfe des Antikörpers M2 gereinigt. Das VEGFD&Dgr;N&Dgr;C-Protein wurde auch mit dem A2-Antikörper nachgewiesen, welcher ein Peptid innerhalb des Fragments von 92–205 von VEGF-D erkennt (nicht gezeigt). VEGFD&Dgr;N&Dgr;C wurde mit dem VEGFR2-Bioassay und dem Test zur Gefäßpermeabilität von Miles geprüft und es wurde gezeigt, daß er bei einem Bioassay, der zum Nachweis der Vernetzung der extrazellulären Domäne von VEGFR2 entwickelt worden war, an den VEGFR2-Rezeptor bindet und diesen aktiviert. Die Induktion der Gefäßpermeabilität durch dieses Polypeptid war bei einem Miles-Test bestenfalls marginal und im Gegensatz zu dem Effekt von VEGF-A.

Beispiel 10 VEGF-D bindet und aktiviert VEGFR-3

Die humane VEGF-D-cDNA wurde zur Produktion von rekombinantem VEGF-D in Baculovirus-Shuttlevektoren kloniert. Neben den baculoviralen Shuttlevektoren, die die nicht-modifizierte VEGF-D-cDNA enthielten (als "vollständiger VEGF-D" bezeichnet), wurden zwei baculovirale Shuttlevektoren zusammengebaut, bei denen die VEGF-D-cDNA auf folgende Weise modifiziert war.

Bei einem Konstrukt (als "vollständiger VEGF-D-H6" bezeichnet) wurde ein C-terminales Histidin-Tag angefügt. Bei dem anderen Konstrukt wurden die putativen N- und C-terminalen Propeptide entfernt, das Melittin-Signalpeptid wurde in-frame an den N-Terminus fusioniert, und an den C-Terminus der verbleibenden Domäne mit VEGF-Homologie wurde ein Histidin-Tag angefügt (als "&Dgr;N&Dgr;C-MELsp-VEGF-D-H6" bezeichnet).

Für jedes der drei Konstrukte wurden baculovirale Klone aus zwei oder drei unabhängigen Transfektionen amplifiziert. Der Überstand von High Five-(HF)Zellen wurde 48 h nach Infektion mit hochtitrigem Virus geerntet. Der Überstand wurde mit NaOH auf pH 7 eingestellt und mit einem Volumen D-MEM verdünnt (0,2% FCS).

Die Proben wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Tyrosinphosphorylierung von VEGFR-3 (Flt4-Rezeptor) in NIH3T3-Zellen zu stimulieren, wie es bei Joukov et al, 1996, beschrieben ist. Der Überstand nicht-infizierter Zellen und der Überstand von Zellen, die mit der kurzen Spleißvariante von VEGF-C infiziert waren, die die Tyrosinphosphorylierung von VEGFR3 nicht stimuliert, wurden als negative Kontrollen verwendet. VEGF-C, der auf gleiche Weise wie &Dgr;N&Dgr;C-melSP-VEGF-D-H6 modifiziert worden war, wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.

Das Auftreten neuer Banden bei 125 und 195 kD zeigt die Phosphorylierung und somit die Aktivierung des Rezeptors an.

Beispiel 11 VEGF-D bindet und aktiviert VEGFR-2

Modifizierte und nicht-modifizierte VEGF-D-cDNA wurde zur Produktion von rekombinantem VEGF-D, wie in Beispiel 10 beschrieben, in Baculovirus-Shuttlevektoren kloniert.

Für jedes der drei Konstrukte, vollständiger VEGF-D, vollständiger VEGF-D-H6 und &Dgr;N&Dgr;C-melSP-VEGF-D-H6, wurden Baculovirus-Klone aus zwei oder drei unabhängigen Transfektionen amplifiziert. Der Überstand von High Five-(HF)Zellen wurde 48 h Stunden nach Infektion mit hochtitrigem Virus geerntet. Der Überstand wurde mit NaOH auf pH 7 eingestellt und mit einem Volumen D-MEM (0,2% FCS) verdünnt.

Die Überstände, die mit den mit Histidin markierten Proteinen konditioniert waren, wurden gemäß Joukov et al, 1996, auf ihre Fähigkeit getestet, die Tyrosinphosphorylierung des KDR-Rezeptors zu stimulieren. KDR ist das humane Homologe von flk1(VEGFR-2).

Der Überstand nicht-infizierter Zellen und der Überstand von Zellen, die mit der VEGF-C-156 S-Mutante, die KDR nicht stimuliert, infiziert waren, wurden als negative Kontrollen verwendet. VEGF165 und VEGF-C, die in gleicher Weise wie &Dgr;N&Dgr;C-melSP-VEGF-D-H6 modifiziert waren, wurden als positive Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.

Das Auftreten einer neuen Bande bei etwa 210 kD zeigt Phosphorylierung und somit Aktivierung des Rezeptors an.

Beispiel 12 Analyse der VEGF-D-Genexpression

Um das Muster der VEGF-D-Genexpression in Menschen- und Mäuseembryos zu charakterisieren, wurden VEGF-D-cDNAs als Hybridisierungssonden zur Northern-Blot-Analyse polyadenylierter humaner RNA und zur in situ-Hybridisierungsanalyse mit Mäuseembryos verwendet.

Genexpression im adulten Menschen

Ein 1,1 kb-Fragment der humanen VEGF-D-cDNA, die in 4 gezeigt ist (SEQ ID NO: 4) und von der EcoRV-Schnittstelle bis zum 3'-Terminus (Nukleotide 911 bis 2029) reicht, wurde mit [&agr;-32P]dATP markiert, wobei das Megaprime-DNA-Markierungssystem (Amersham) nach den Angaben des Herstellers verwendet wurde. Diese Sonde wurde dazu verwendet, um durch Hybridisierung humane „Multiple Tissue Northern Blots" (Clontech) zu screenen, wobei man sich ebenfalls an die Angaben des Herstellers hielt. Diese Blots enthielten polyadenylierte RNA, die aus Geweben adulter Menschen, die offensichtlich an keiner Erkrankung litten, erhalten wurde. Eine Autoradiographie mit den markierten Blots zeigte, daß die VEGF-D-mRNA am häufigsten im Herzen, in der Lunge und im Skelettmuskel vorkam. Die VEGF-D-mRNA war in mittleren Mengen in Milz, Ovarien, Dünndarm und Kolon und in geringen Mengen in Niere, Pankreas, Thymus, Prostata und Hoden zu finden. Keine VEGF-D-mRNA wurde in RNA aus Hirn, Plazenta, Leber oder peripheren Blutleukozyten nachgewiesen. In den meisten Geweben, in denen VEGF-D-mRNA nachgewiesen wurde, hatte das Transkript eine Größe von 2,3 kb. Die einzige Ausnahme bildete der Skelettmuskel, wo zwei VEGF-D-Transkripte mit 2,3 kb und 2,8 kb nachgewiesen wurden. Im Skelettmuskel kam das 2,3 kb-Transkript häufiger vor als das 2,8 kb-Transkript.

Zusammenfassung

Das VEGF-D-Gen wird im adulten Menschen weitverbreitet exprimiert, wird aber sicherlich nicht ubiquitär exprimiert. Die stärkste Expression wurde im Herzen, in der Lunge und im Skelettmuskel nachgewiesen. Diese Daten legen nahe, daß VEGF-D bei der Entwicklung der Lunge eine Rolle spielen könnte und daß die Expression des VEGF-D-Gens in der Lunge bei einem adulten Menschen bestehen bleibt. Die Expression des Gens in anderen Geweben beim adulten Menschen legt nahe, daß VEGF-D in anderen adulten Geweben andere Funktionen erfüllen könnte.

Beispiel 13 VEGF-D ist für Endothelzellen mitogen

Einige Mitglieder der VEGF-Familie von Proteinen, nämlich VEGF-A (Leung et al, 1989) und VEGF-B (Oloffson et al, 1996) sind für Endothelzellen mitogen. Um die mitogene Fähigkeit von VEGFD&Dgr;N&Dgr;C auf Endothelzellen zu testen, wurde dieses Protein wie in Beispiel 9 beschrieben exprimiert und durch Affinitätschromatographie gereinigt. Fraktion #3, die aus der M2-Affinitätssäule eluiert wurde und VEGFD&Dgr;N&Dgr;C enthielt, wurde 1 zu 10 in Zellkulturmedium verdünnt, das 5% Serum enthielt, und auf Endothelzellen der Rinderaorta (BAEs) appliziert, die in Medium mit 10% Serum vermehrt worden waren. Die BAEs wurden am Tag vor Zugabe von VEGFD&Dgr;N&Dgr;C in Platten mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät und 3 Tage nach der Zugabe dieses Polypeptids wurden die Zellen mit Trypsin abgelöst und ausgezählt. Gereinigtes VEGF-A diente bei diesem Experiment als positive Kontrolle. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die Zugabe von Fraktion #3 zum Zellkulturmedium führte zu einem 2,4fachen Anstieg bei der Zahl der BAEs nach 3 Tagen Inkubation, ein Ergebnis, das sich mit dem Ergebnis vergleichen lässt, das mit VEGF-A erhalten wurde. Offensichtlich ist VEGFD&Dgr;N&Dgr;C für Endothelzellen mitogen.

Beispiel 14 Lokalisierung des VEGF-D-Gens auf humanen Chromosomen

Um Hybridisierungssonden zur Lokalisierung des VEGF-D-Gens auf humanen Chromosomen zu erzeugen, wurde ein humaner genomischer DNA-Klon für VEGF-D aus einer humanen genomischen DNA-Genbank (Clontech) isoliert. Die genomische Genbank wurde durch Hybridisierung mit der in 4 gezeigten humanen VEGF-D-cDNA mit Standardverfahren (Sambrook et al, 1989) gescreent. Durch Hybridisierung an verschiedene Oligonukleotide, die sich in ihrer Sequenz von der humanen VEGF-D-cDNA ableiteten, wurde gezeigt, daß einer der auf diese Weise isolierten Klone einen Teil des VEGF-D-Gens enthielt. Eine Region des genomischen Klons, ungefähr 13 kb groß, wurde aus Agarosegel gereinigt, durch Nick-Translation mit Biotin-14-dATP markiert und in situ bei einer Endkonzentration von 20 ng/&mgr;l an Metaphasen von zwei normalen humanen Männern hybridisiert. Die Methode der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungs-(FISH) wurde im Unterschied zu dem bereits beschriebenen Verfahren (Callen et al, 1990) so modifiziert, daß die Chromosomen vor der Analyse mit Propidiumiodid (als Kontrastfärbung) und DAPI (zur Identifizierung der Chromosomen) gefärbt wurden. Bilder der Metaphasepräparate wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera aufgenommen, wobei die CytoVision Ultra-Bildersammlung und das Verstärkungssystem (Applied Imaging Int. Ltd.) verwendet wurden. FISH-Signale und die DAPI-Bandenmuster wurden für die Analyse zusammengeführt.

Fünfzehn Metaphasen vom ersten normalen Mann wurden auf Fluoreszenzsignale untersucht. Zehn der Metaphasen zeigten ein Signal auf einem Chromatid (3 Zellen) oder beiden Chromatiden (7 Zellen) des X-Chromosoms in Bande p22.1.

Bei diesen 15 Metaphasen wurden insgesamt 9 unspezifische Backgroundsignale beobachtet. Ein ähnliches Ergebnis wurde bei der Hybridisierung der Sonde an 15 Metaphasen des zweiten normalen Mannes erhalten, wo ein Signal bei Xp22.1 auf einem Chromatid in 7 Zellen und auf beiden Chromatiden in 4 Zellen beobachtet wurde. Schlußfolgernd läßt sich sagen, daß das humane VEGF-D-Gen auf dem X-Chromosom in Bande p22.1 lokalisiert ist.

Bioassays zur Bestimmung der Funktion von VEGF-D

Andere Tests werden durchgeführt, um nachzuweisen, ob VEGF-D bezüglich Endothelzellfunktion, Angiogenese und Wundheilung ähnliche Aktivität wie VEGF aufweist. Abhängig von den Ergebnisse der Untersuchungen zur Verteilung der Rezeptorbindung können noch weitere Tests durchgeführt werden.

I. Tests der Endothelzellfunktion a) Endothelzellproliferation

Tests des Endothelzellenwachstums werden mit im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahren durchgeführt, z.B. denjenigen von Ferrara & Henzel (1989), Gospodarowicz et al (1989) und/oder Claffey et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1246 1–9.

b) Zelladhäsionstest

Die Wirkung von VEGF-D auf die Adhäsion polymorphkerniger Granulozyten an Endothelzellen wird getestet.

c) Chemotaxis

Der Standardtest auf Chemotaxis mit der Boyden-Kammer wird verwendet, um die Wirkung von VEGF-D auf die Chemotaxis zu testen.

d) Plasminogenaktivatortest

Endothelzellen werden nach der Methode von Pepper et al (1991) auf die Wirkung von VEGF-D auf die Produktion von Plasminogenaktivator und Plasminogenaktivator-Inhibitor gestestet.

e) Test der Endothelzellenmigration

Die Fähigkeit von VEGF-D, Endothelzellen zur Migration und zur Röhren-Bildung zu stimulieren, wird wie bei Montesano et al (1986) beschrieben getestet. Alternativ dazu kann der bei Joukov et al (1986) beschriebene dreidimensionale Collagengel-Test oder eine mit Gelatine überzogene Membran in einer modifizierten Boyden-Kammer (Glaser et al, 1980) verwendet werden.

II Angiogenesetest

Die Fähigkeit von VEGF-D, eine angiogene Antwort in der Chorioallantoismembran von Küken zu induzieren, wird wie bei Leung et al (1989) beschrieben getestet. Alternativ dazu kann der Ratten-Corneatest von Rastinejad et al (1989) verwendet werden; dies ist ein anerkanntes Verfahren zum Test von in vivo-Angiogenese, und die Ergebnisse sind leicht auf andere in vivo-Systeme übertragbar.

III Wundheilung

Die Fähigkeit von VEGF-D, die Wundheilung zu stimulieren, wird mit dem klinisch relevantesten zur Verfügung stehenden Modell getestet, wie es bei Schilling et al (1959) beschrieben und von Hunt et al (1967) eingesetzt wird.

IV Das Hämatopoietische System

Eine Vielzahl von in vitro- und in vivo-Tests, welche spezifische Zellpopulationen des hämatopoietischen Systems verwenden, sind im Stand der Technik bekannt und unten dargelegt. Insbesondere sind zahlreiche in vitro-Tests mit murinen Stammzellen besonders geeignet, bei denen Zellen verwendet werden, die im fluoreszenzaktivierten Zellsortierer gereinigt wurden.

a) Neu besiedelnde Stammzellen

Dies sind Zellen, die in der Lage sind, das Knochenmark letal bestrahlter Mäuse neu zu besiedeln und die den Lin, Rhh1, Ly-6A/E+, c-kit+-Phänotyp aufweisen. VEGF-D wird auf diesen Zellen entweder allein oder durch Co-Inkubation mit anderen Faktoren und anschließende Messung der Zellproliferation durch Einbau von 3H-Thymidin getestet.

b) Stammzellen im späten Stadium

Dies sind Zellen, die eine vergleichsweise geringe Fähigkeit besitzen, das Knochenmark neu zu besiedeln, die aber D13-CFU-S bilden können. Diese Zellen zeigen den Lin, Rhh1, Ly-6A/E+, c-kit+-Phänotyp. VEGF-D wird eine bestimmte Zeit mit diesen Zellen inkubiert, letal bestrahlten Rezipienten injiziert, und es wird die Anzahl von D13-Milz-Kolonien ausgezählt.

c) Progenitor-angereicherte Zellen

Dies sind Zellen, die in vitro auf einzelne Wachstumsfaktoren ansprechen und den Lin, Rhh1, Ly-6A-E+, c-kit+-Phänotyp aufweisen. Dieser Test zeigt, ob VEGF-D direkt auf hämatopoietische Progenitorzellen wirken kann. VEGF-D wird mit diesen Zellen in Agarkulturen inkubiert und die Anzahl an Kolonien nach 7–14 Tagen wird ausgezählt.

V Arteriosklerose

Glatte Muskelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung oder Initiation von Arteriosklerose, bei der ein Phänotypwechsel von einem kontraktilen in einen synthetischen Zustand erforderlich ist. Makrophagen, Endothelzellen, T-Lymphozyten und Blutplättchen spielen alle eine Rolle bei der Entwicklung von arteriosklerotischen Plaques, indem sie das Wachstum und die phänotypischen Modulationen glatter Muskelzellen beeinflussen. Ein in vitro-Test mit einer modifizierten Rose-Kammer, in der verschiedene Zelltypen auf gegenüberliegenden Coverslips angesät werden, mißt die Proliferationsgeschwindigkeit und die phänotypischen Modulationen glatter Muskelzellen in einer multizellulären Umgebung und wird dazu verwendet, die Wirkung von VEGF-D auf glatte Muskelzellen festzustellen.

VI Metastasierung

Die Fähigkeit von VEGF-D, Metastasierung zu inhibieren, wird mit Hilfe des Lewis-Modells eines Lungenkarzinoms, beispielsweise mit dem Verfahren von Cao et al (1995), untersucht.

VII VEGF-D in anderen Zelltypen

Die Wirkungen von VEGF-D auf die Proliferation, Differenzierung und Funktion anderer Zelltypen, wie beispielsweise Leberzellen, Herzmuskelzellen und anderen Zellen, endokrine Zellen und Osteoblasten, kann leicht mit im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise der Aufnahme von 3H-Thymidin durch in vitro-Kulturen, untersucht werden. Die Expression von VEGF-D in diesen und anderen Geweben kann mit Methoden wie Northern Blot und Hybridisierung oder durch in situ-Hybridisierung, gemessen werden.

VIII Konstruktion von VEGF-D-Varianten und -Analogen

VEGF-D ist ein Mitglied der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren, der einen hohen Grad an Homologie mit den anderen Mitgliedern der PDGF-Familie aufweist. VEGF-D enthält acht konservierte Cysteinreste, die für diese Familie von Wachstumsfaktoren charakteristisch sind. Diese konservierten Cysteinreste bilden Disulfidbrücken innerhalb der Ketten, wodurch die Cysteinknoten-Struktur entsteht, und Disulfidbrücken zwischen den Ketten, wodurch Proteindimere entstehen, die für Mitglieder der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren charakteristisch sind. VEGF-D wird mit den Rezeptoren der Proteintyrosinkinase-Wachstumsfaktoren in Wechselwirkung treten.

Im Gegensatz zu Proteinen, bei denen man wenig oder nichts über die Proteinstruktur und die aktiven Zentren weiß, die für die Rezeptorbindung und die daraus folgende Aktivität benötigt werden, wird die Konstruktion aktiver Mutanten von VEGF-D dadurch stark erleichtert, daß sehr viel über die aktiven Zentren und die wichtigen Aminosäuren der Mitglieder der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren bekannt ist.

Veröffentlichte Artikel, die die Zusammenhänge zwischen Struktur/Aktivität der Mitglieder der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren beinhalten, umfassen für PDGF: Oestman et al, J. Biol. Chem., 1991 266 10073–10077; Andersson et al, J. Biol. Chem., 1992 267 11260–11266; Oefner et al, EMBO J., 1992 11 3921–3926; Flemming et al, Molecular and Cell Biol., 1993 13 4066–4076 und Andersson et al, Growth Factors, 1995 12 159–164; und für VEGF: Kim et al, Growth Factors, 1992, 7 53–64; Pötgens et al, J. Biol. Chem., 1994 269 32879–32885 und Claffey et al, Biochem, Biophys. Acta, 1995 1246 1–9. Aus diesen Veröffentlichungen geht hervor, daß die Mitglieder der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren wegen der acht konservierten Cysteinreste eine charakteristisch geknotete Faltstruktur und Dimerisierung aufweisen, was zur Bildung drei exponierter Loop-Regionen an jedem Ende des dimerisierten Moleküls führt, von denen zu erwarten ist, daß dort die Rezeptorbindungsstellen lokalisiert sind.

Ausgehend von diesen Informationen kann ein Fachmann aus dem Bereich der Biotechnologie VEGF-D-Mutanten konstruieren, die mit einer sehr hohen Wahrscheinlichkeit die VEGF-D-Aktivität behalten, indem er die acht Cysteinreste, die für die geknotete Faltstruktur und für die Dimerisierung verantwortlich sind, konserviert, und indem er auch die wahrscheinlichen Rezeptorsequenzen in den Loop 1-, Loop 2- und Loop 3-Regionen der Proteinstruktur konserviert oder dort nur konservative Aminosäuresubstitutionen vornimmt.

Die Bildung erwünschter Mutationen an spezifisch gezielten Stellen in einer Proteinstruktur ist als Standardmethode im Arsenal der Proteinchemiker anzusehen (Kunkel et al, Methods in Enzymol., 1987 154 367–382). Beispiele einer solchen sequenzspezifischen Mutagenese mit VEGF sind bei Pötgens et al, J. Biol. Chem., 1994 269 32879–32885 und Claffey et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1–9 zu finden. Eine sequenzspezifische Mutagenese ist in der Tat so allgemein üblich, daß es kommerziell erhältliche Kits gibt, die solche Verfahren erleichtern (z.B. Promega-Katalog 1994–1995, Seiten 142–145).

Die Aktivität auf die Endothelzellproliferation von VEGF-D-Mutanten kann leicht mit allgemein etablierten Screening-Verfahren festgestellt werden. Beispielsweise kann ein Verfahren verwendet werden, das zu dem Endothelzellmitosetest, der bei Claffey et al (Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1–9) beschrieben ist, analog ist. In ähnlicher Weise können die Wirkungen von VEGF-D auf die Proliferation anderer Zelltypen, auf die Zelldifferenzierung und auf humane Metastasierung mit Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, getestet werden.

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SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die für ein Polypeptid codiert, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäureresten 93 bis 201 der SEQ ID NO: 5 besteht.
  2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure cDNA ist.
  3. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure genomische DNA ist.
  4. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Polypeptid ferner eine Peptidsequenz als Affinitäts-Tag umfaßt.
  5. Vektor, der ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–4 umfaßt.
  6. Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 5 transformiert oder transfiziert ist.
  7. Polypeptid, das aus den Aminosäureresten 93 bis 201 der SEQ ID NO: 5 besteht.
  8. Polypeptid nach Anspruch 7, das ferner eine Peptidsequenz als Affinitäts-Tag umfaßt.
  9. Antikörper, der spezifisch mit einem Polypeptid reagiert, das aus den Aminosäureresten 93 bis 201 der SEQ ID NO: 5 besteht.
  10. Antikörper nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
  11. Antikörper nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
  12. Antikörper nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
  13. Antikörper nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.
  14. Antikörper nach einem der Ansprüche 9–13, wobei der Antikörper mit einem detektierbaren Marker markiert ist.
  15. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

    i) Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transfiziert oder transformiert ist, der eine für das Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz umfaßt, die funktionsfähig mit einer Promotorsequenz verbunden ist, so daß die für das Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz exprimiert wird; und

    ii) Isolieren des Polypeptids aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium, in dem die Wirtszelle kultiviert wird.
  16. Verfahren zur Isolierung eines Polypeptids nach Anspruch 7 oder 8, welches die Schritte umfaßt:

    i) Aussetzen des Polypeptids mit Heparin, um die Freisetzung des Polypeptids aus einer das Polypeptid exprimierenden Zelle zu erleichtern; und

    ii) Reinigen des freigesetzten Polypeptids.
  17. Verfahren, um einen Vektor zu befähigen, ein von einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–4 codiertes Polypeptid zu exprimieren, wobei das Verfahren das Inserieren des Nukleinsäuremoleküls in einen Vektor an einer Stelle umfaßt, an der das Nukleinsäuremolekül mit wenigstens einem Promotor funktionsfähig verknüpft ist.
  18. Vektor, der eine antisense-Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die antisense-Nukleotidsequenz zu wenigstens einem Teil einer genomischen DNA-Sequenz, einer RNA-Sequenz oder einer cDNA-Sequenz komplementär ist, die für ein Polypeptid nach Anspruch 7 oder 8 codiert, das wenigstens eine Bioaktivität fördert, die ausgewählt ist aus Gefäßpermeabilität, Endothelzellproliferation und Endothelzelldifferenzierung, wobei der Vektor verwendet werden kann, um wenigstens eine Aktivität zu inhibieren.
  19. In vitro-Verfahren zur Stimulierung der Endothelzell-proliferation, umfassend das In-Kontakt-Bringen von Endothelzellen mit einer für eine Endothelzell-proliferation effektiven Menge eines Polypeptids nach Anspruch 7 oder 8.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Endothelzellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Gefäß-endothelzellen und Lymphendothelzellen.
  21. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 7 oder 8 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, ferner umfassend wenigstens eine Substanz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PIGF, PDGF, FGF und Heparin.
  23. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 9 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff.
  24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem monoklonalen Antikörper; einem humanisierten Antikörper; oder einem chimären Antikörper.
  25. Proteindimer, umfassend ein erstes Polypeptid nach Anspruch 7 oder 8 und ein zweites Polypeptid.
  26. Proteindimer nach Anspruch 25, wobei das Dimer ein Homodimer ist, in dem das zweite Polypeptid mit dem ersten Polypeptid identisch ist.
  27. Proteindimer nach Anspruch 25, wobei das Dimer ein Heterodimer ist, in dem das zweite Polypeptid ausgewählt ist aus VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PIGF und PDGF.
  28. Verfahren zum Nachweis eines Polypeptids nach Anspruch 7 oder 8 in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte: In-Kontakt-bringen der Probe mit einem Antikörper, der in der Lage ist, das Polypeptid zu binden, und Nachweis, daß Bindung dieses Reaktanten erfolgt.
  29. In vitro-Verfahren zur Aktivierung von VEGF-Rezeptor 2, umfassend das Aussetzen von Zellen, die diesen Rezeptor tragen, einer effektiven rezeptor-aktivierenden Dosis eines Polypeptids nach Anspruch 7 oder 8.
  30. In vitro-Verfahren zur Aktivierung von VEGF-Rezeptor 3, umfassend das Aussetzen von Zellen, die diesen Rezeptor tragen, einer effektiven rezeptor-aktivierenden Dosis eines Polypeptids nach Anspruch 7 oder 8.
  31. Diagnostischer oder prognostischer Test-Kit, der einen Antikörper nach Anspruch 9 und Mittel zum Nachweis der Bindung dieses Antikörpers umfaßt.
  32. Diagnostischer oder prognostischer Test-Kit, umfassend ein für ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–3 spezifisches Primerpaar, das funktions-fähig an eine Polymerase gekoppelt ist, wodurch die Polymerase befähigt wird, dieses Nukleinsäuremolekül selektiv aus einer DNA-Probe zu amplifizieren.
Es folgen 12 Blatt Zeichnungen






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