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Dokumentenidentifikation DE69927707T2 13.07.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001137768
Titel MENSCHLICHE HYBRID-WIRTSZELLE ZUR EXPRESSION VON SÄUGETIER-GENEN
Anmelder Bayer Corp., Pittsburgh, Pa., US
Erfinder CHO, Myung-Sam, Pinole, US
Vertreter Köhler, F., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 40723 Hilden
DE-Aktenzeichen 69927707
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.12.1999
EP-Aktenzeichen 999630676
WO-Anmeldetag 08.12.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/29332
WO-Veröffentlichungsnummer 2000034462
WO-Veröffentlichungsdatum 15.06.2000
EP-Offenlegungsdatum 04.10.2001
EP date of grant 12.10.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.07.2006
IPC-Hauptklasse C12N 15/01(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Verwandte Anmeldungen: Die Anmeldung an Cho und Chan mit der Signatur MSB-7254 (US Ser.-Nr. 09/209.915), "Vectors Having Terminal Repeat Sequence of Epstein-Barr Virus", und die Anmeldung an Cho et al. mit der Signatur MSB-7255 (US Ser.-Nr. 09/209.916), "Expression system for factor VIII", enthalten verwandte Themen. Beide Anmeldungen wurden am 10. Dezember 1998 eingereicht.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet: Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen die gentechnisch veränderten Säugetierzelllinien zur Herstellung von biologisch aktivem Protein. Insbesondere befasst sich die Erfindung mit menschlichen Hybridzellklonen, die dem Fusionsprozess von menschlichen embryonalen Nieren-(293S-)Zellen und Burkitt-Lymphomzellen entstammen. Diese menschlichen Hybridzellen können zur Herstellung von heterologen Proteinen verwendet werden.

Hintergrund: Bis heute wurden die meisten therapeutischen rekombinanten Proteine aus nicht-menschlichen Säugetierzellen hergestellt. Beispiele hierfür:

Chinahamster-Eierstock-(CHO-)(dhfr-)Zellen (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216–4220 (1980)) mit dem amplifizierbaren Selektionsmarker Dihydrofolatreductase (Kaufman et al., Mol. Biol. 159, 601–621 (1982); Gasser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6522–6526 (1982)) wurden zur Herstellung von therapeutischem rekombinantem Protein verwendet.

Von einer Vielzahl von rekombinanten therapeutischen Proteinen ist bekannt, dass sie in Säugetierzellen produziert werden, wie z.B. rekombinanter Faktor VIII (rFVIII) (Kaufmann et al., J. Biol. Chem. 263, 6352–6362 (1988)), Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) (US-Patent Nr. 4.766.075, erteilt an Goeddel et al. (1988)), Erythropoietin (EPO) (US-Patent Nr. 4.703.008, erteilt an Lin (1987)) und monoklonale Antikörper (mAbs) (US-Patent Nr. 4.816.397, erteilt an Boss et al. (1989)).

Babyhamsternieren-(BHK-)Zellen (BHK21) wurden zur Herstellung von rFVIII nach G418-Selektion und Methotrexat-(MTX-)Amplifikation von G418-resistenten Zellen verwendet (US-Patent Nr. 4.965.199, erteilt an Capon et al. (1990)).

Maus-Myelom-(NS0-)Zellen wurden zur Herstellung von gentechnisch verändertem, menschlichem Anti-TNF-Antikörper (EHAT) verwendet (US-Patent Nr. 4.816.397, erteilt an Boss et al. (1989)). Diese Zelllinie produziert jedoch Proteine, die Mausspezifische Kohlenhydratmuster aufweisen, die zur Verwendung bei Menschen nicht bevorzugt werden.

Eine menschliche Zelllinie, Namalwa (die dem Burkitt-Lymphom entstammt), wurde von Wellcome Research Laboratory zur Herstellung von Alpha-Interferon und von Tokyo Research Laboratories zur Herstellung von Pro-Urokinase (Satoh et al., Cytotechnology 18, 167–185 (1996)), von Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) (Khan et al., Biochem. Soc. Trans. 23, 99 (1995)), von Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor (Okamoto et al., Arch. Biochem. Biophys. 286, 562–568 (1991)), von Interferonen und Lymphotoxin (Hosoi et al., Cytotechnology 5, 17–34 (1991)) und von Granulozytenkolonie-stimulierendem Faktor (Hosoi et al., Cytotechnology 7, 25–32 (1991)) verwendet. Es war jedoch schwierig, diese Zeilen mit DNA zu transfizieren.

Walls et al. (Gene 81, 139–149 (1989)) berichteten über die Verwendung des dhfr/MTX-Co-Amplifikationsverfahrens zur Expression von funktionellem Protein C in menschlichen embryonalen Nierenzellen (293S-Zellen). 293-Zellen (Stillman et al., Mol. Cell Biol. 5, 2051–2060 (1985)) sind dafür bekannt, dass sie große Aggregate in Suspension, insbesondere unter hoher Calciumkonzentration (> 100 &mgr;M), die größere Aggregation und geringere Zelllebensfähigkeit fördert, bilden (Peshwa et al., Biotech. and Bioeng. 41, 179–187 (1993)).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Nun wurden Klone von hybridisierten menschlichen Zellen entwickelt, die mittels Elektroporation oder kationischen Liposoms leicht transfiziert werden können und die leicht an Wachstum in Suspensionskultur angepasst werden können. Neterologe Proteine können unter Verwendung von geringen Mengen (50–100 nM) an MTX-Amplifikation in einer Umgebung von menschlichen Zellen exprimiert werden. Darüber hinaus können die Zellen leicht an Wachstum in serumfreiem Medium angepasst werden.

Diese Zellen sind das Produkt einer Fusion zwischen menschlichen embryonalen Nieren-(293S-)Zellen und Burkitt-Lymphomzellen. Siehe 1 für die Zusammenfassung. Diese Hybridklone, HKBs genannt, umfassen ein defektes EBV-Genom, das von HH514-16 stammt, das eine Zelllinie ist, die aus Burkitt-Lymphomzellen, P3HR1, stammt (Hinuma et al., J. Virol. 1, 1045–1051 (1967)). P3HR1-Zellen umfassen sich nicht unbegrenzt vermehrendes EBV. HH514-16 ist ein Klon von P3HR1 (Hinuma et al., J. Virol. 1, 1045–1051 (1967)), das sich nicht unbegrenzt vermehrendes EBV umfasst. HH514-16 hat eine het-DNA, eine Latenz-unterbrechende DNA, während des Klonierungsprozesses verloren (Rabson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3660–3664 (1983)). Daher ist EBV von HKB-Klonen ein sich nicht unbegrenzt vermehrendes Virus und bleibt als eine Latenz.

HKBs sind menschliche Hybridwirtszellen, die zur rekombinanten Produktion von therapeutischen Proteinen geeignet sind. Diese Wirtszellen werden durch die Hybridisierung von verschiedenen parentalen Zelllinien, die jeweils verschiedene vorteilhafte Eigenschaften aufweisen, gewonnen. Wirtszellen, die vorteilhafte Eigenschaften von jeder der parentalen Zelllinien besitzen, werden aus den aus der Hybridisierung resultierenden Zellen gewonnen.

Die Wirtszellen können gentechnisch so verändert werden, dass sie hohe Konzentrationen an vielen verschiedenen Proteinen exprimieren. Proteine, die von den gentechnisch veränderten Wirtszellen produziert werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, lösliches ICAM-1, rekombinantes Interleukin-4 (IL-4), tPA, EPO, rFVIII und BDD-FVIII (B-Domänen-deletierte Varianten von Faktor VIII) und Derivate von diesen Proteinen. Faktor VIII weist eine Domänenorganisation von A1-A2-B-A3-C1-C2 auf und wird als ein einkettiges Polypeptid mit 2351 Aminosäuren synthetisiert, von dem ein 19 Aminosäuren langes Signalpeptid bei Translokation in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums abgespaltet wird. Aufgrund der Tatsache, dass Faktor VIII stark glykosyliert ist, war bisher hochkonzentrierte Expression (> 0,2 pg/c/d) von Faktor VIII schwer zu erreichen (Lind et al., Eur. J. Biochem. 232, 19–27 (1995); Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 9, 1233–1242 (1989)). Expression von Faktor VIII in Säugetierzellen ist typischerweise um 2–3 Größenordnungen geringer als jene, die bei anderen Genen unter Verwendung von ähnlichen Vektoren und Ansätzen beobachtet wird. Die Produktivität von Produktionszelllinien für Faktor VIII lag bisher im Bereich von 0,5–1 U/c/d (0,1–0,2 pg/c/d).

Es wurde gezeigt, dass die B-Domäne von Faktor VIII für Prokoagulationsaktivität entbehrbar ist. Von verschiedenen Gruppen (Lind et al., Eur. J. Biochem. 232, 19–27 (1995); Tajima et al., Proc. 6th Int. Symp. H. T., 51–63 (1990); US-Patent Nr. 5.661.008, erteilt an Almstedt (1997)) wurde berichtet, dass unter Verwendung von trunkierten Varianten von Faktor VIII verbesserte Expression von Faktor VIII in Säugetierzellen erzielt wird. Das Expressionsniveau der Faktor-VIII-Varianten aus einem stabilen Zellklon blieb jedoch unter 1 pg/c/d. Es wurde auch erkannt, dass, obwohl endogenes Immunglobulin (Ig) nicht exprimiert wurde, rekombinante Ig-Expression aus den gentechnisch veränderten Wirtszellen hoch war. Proteine, die von HKB11-Zellen produziert wurden, weisen menschliches spezifisches Glykosylierungsprofil auf. Daher sind die Klone optimale Wirtszellen für die Herstellung von gentechnisch verändertem Ig und anderen Proteinen.

Wie hierin verwendet ist eine von Burkitt-Lymphom abstammende Zelle eine Zelle, die eine Burkitt-Lymphomzelle ist, die von einer Burkitt-Lymphomzelle abstammt, die von einer anderen von Burkitt-Lymphom stammenden Zelle abstammt, oder sie ist eine Zelle, die aus mitotischer Teilung von einer der oben genannten Zellen resultiert. "Abstammen von" in diesem Zusammenhang soll normale mitotische Zellteilung und Vorgänge wie Transfektionen, Zellfusionen oder andere gentechnische Veränderungen oder zellbiologische Verfahren, die verwendet werden, um Zellen zu verändern oder um Zellen mit neuen Eigenschaften zu produzieren, umfassen, ist jedoch nicht beschränkt darauf. Demähnlich ist eine Zelle, die von menschlicher embryonaler Niere abstammt, eine Zelle, die eine menschliche embryonale Nierenzelle ist, abstammend von einer menschlichen embryonalen Nierenzelle ist, abstammend von einer anderen Zelle ist, die von menschlicher embryonaler Niere abstammt, oder eine Zelle ist, die aus der mitotischen Teilung von einer der oben genannten Zellen resultiert. So ist auch eine von 293S abstammende Zelle eine Zelle, die eine 293S-Zelle ist, abstammend von einer 293S-Zelle ist, abstammend von einer anderen Zelle mit 293S-Ursprung ist oder eine Zelle ist, die aus der mitotischen Teilung von einer der oben genannten Zellen resultiert. Diesem Muster entsprechend ist eine von 2B8 abstammende Zelle eine Zelle, die eine 2B8-Zelle ist, abstammend von einer 2B8-Zelle ist, abstammend von einer anderen Zelle mit 2B8-Ursprung ist oder eine Zelle ist, die aus der mitotischen Teilung von einer der oben genannten resultiert. Ein heterologes Protein ist ein Protein, für dessen Produktion eine Zelle gentechnisch verändert wurde.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt eine Zusammenfassung der Abstammung der HKB-Zellen.

2 zeigt physikalische Karten von Expressionsvektoren, die im Text erwähnt werden. Alle Plasmide werden auf Grundlage einer pBR322-Hauptkette konstruiert und enthalten eine dhfr-Expressionseinheit. Alle Gene, die für Proteine von Interesse kodieren, stehen unter der Steuerung von CMV-Enhancer/Promotor (CMVe/p); 5'-Intron (MIS oder CIS) wurde am 5'-Ende der Gene positioniert, unter Ausnahme von BZLF1. Poly-A-Signalregion wird als pA angegeben. Beide Plasmide, pSH157 und pCIS25DTR, enthalten eine Sequenz von EBV-TR (402 bp).

3 zeigt einen Vergleich von Wirtszelllinien für Genexpression im Übergangstransfektionstest. Die Transfektionen wurden unter denselben Bedingungen durchgeführt: dieselbe Anzahl an Zellen von 293S, 2B8 und HKB11 wurden mit derselben Menge an Plasmid-DNAs unter Verwendung desselben Transfektionsmittels transfiziert. Gewebekulturflüssigkeiten wurden 2 Tage nach erfolgter Transfektion geerntet. Proteinproduktionsniveaus wurden durch ELISA (IgG und ICAM-1; gemessen als ng Protein/106 Zellen/2 Tage) und durch Coatest®-Testset (rFVIII; gemessen als Millieinheiten/107 Zellen/2 Tage) bestimmt.

SPEZIFISCHE AUSFÜHRUNGSFORMEN Materialien und Verfahren

HH514-16 wurde freundlicherweise von Dr. George Miller (Yale University) zur Verfügung gestellt. 293S-Zellen wurden von Dr. Brad Zerler (Molecular Therapeutic Institute, West Heaven, CT) erhalten, 293S-Zellen sind 293-Zellen (ATCC CRL-1573), die an Wachstum in Suspensionskultur angepasst sind (Stillman et al., Mol. Cell Biol. 5, 2051–2060 (1985)).

Plasmide

Alle Expressionsvektoren, die in diesem Bericht verwendet wurden, waren im Grunde auf pBR322 basierendes Plasmid mit Funktions-dhfr-Genexpressions-Segment. Physikalische Karten von Expressionsvektoren sind in 2 beschrieben. Plasmide, pSH157 und pCIS25DTR, weisen auch terminate Wiederholungssequenz von Epstein-Barr-Virus (EBV-TR) auf. Siehe die Patentanmeldung an Cho und Chan mit der Signatur MSB-7254, "Terminal repeat sequence of Epstein-Barr virus enhances drug selection ratio", für die EBV-TR-Sequenz. Der Vektor pSH131, der bei der American Type Culture Collection unter ATCC 98879 hinterlegt ist, kann verwendet werden, um Expressionsvektoren für ein ausgewähltes Protein wie in Cho und Chan (MSB-7254, s.o.) beschrieben herzustellen.

ELISA

Um tICAM-1-Sekretion zu messen, wurde ein monoklonaler Antikörper gegen ICAM-1, C92.5 (McClelland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7993–7997 (1991)), an Mikrotiterplatten mit rundem Boden adsorbiert. Die Platten wurden durch Behandlung mit einer Lösung von phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, blockiert und dann mit tICAM-1-hältigen Proben inkubiert. Die Platten wurden anschließend mit Waschpuffer (PBS plus 0,005% Tween 20) gewaschen und mit biotinyliertem C78.5, einem zweiten monoklonalen Antikörper gegen ein anderes Epitop auf tICAM-1, inkubiert (McClelland et al. (1991), s.o.). Nach dem Waschen wurden die Platten mit HRP-Streptavidin inkubiert. Die Platten wurden dann mit Waschpuffer gewaschen, mit Tetramethylbenzidin (TMB) umgesetzt, und die Reaktion wurde mit 1 N HCl gestoppt. Die Konzentration von tICAM-1 wurde durch Lesen der OD bei 450/570 nm und Vergleichen mit einer Standardkurve von gereinigtem tICAM-1 bestimmt.

Um Immunglobulin-(Ig-)Sekretion zu messen, wurde Anti-Ig-Antikörper verwendet, um die Platte zu beschichten, und biotinylierter Anti-Ig-Antikörper wurde als ein Detektionsantikörper verwendet. Eine bekannte Konzentration von Ig-Molekül wurde als Standard verwendet. Abgesehen davon blieb das Verfahren dasselbe.

Um Interleukin-4-(IL-4-)Sekretion zu messen, wurde Anti-IL-4-Antikörper verwendet, um die Platte zu beschichten, und biotinylierter Anti-IL-4-Antikörper wurde als ein Detektionsantikörper verwendet. Ein gereinigtes IL-4-Molekül wurde als Standard verwendet.

Test zur Messung von rFVIII-Sekretion

Das rFVIII-Molekül wurde mit Reagenzien aus dem Coatest®-VIII:C/4-Set (Chromogenix, Mölndal, Schweden) quantifiziert. Ein US-Standard-Anti-Blutgerinnungsfaktor (Faktor VIII), bekannt als MEGA 1 (Office of Biologics Research and Review, Bethesda, MD), wurde als Messstandard auf EIA/RIA-A/2-Platten (Corning, Corning, NY), vorgewärmt auf 37°C auf Select Heat Blocks (VWR Scientific, San Francisco, CA), verwendet. Faktor IXa, Faktor X, Phospholipid und CaCl2 wurden zu jeder Probe zugesetzt und 10 Minuten lang zur Aktivierung von Faktor X inkubiert. Ein chromogenes Substrat (S2222) wurde dann zugesetzt und 10 Minuten lang inkubiert, um die chromogene Gruppe pNA freizusetzen. Diese Reaktion wurde durch den Zusatz von 50% Essigsäure gestoppt. Die kolorimetrische Absorption wurde dann bei 405/450 nm an einem SPECTRAmax®-250-Spektralphotometer-Mikroplattenleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen, und die Daten wurden mittels der SOFTmax®-PRO-Software, bereitgestellt von Molecular Devices, berechnet.

Herleitung von HAT-empfindlicher und G418-resistenter Burkitt-Lymphomzelllinie

Um HAT-empfindliche Zellen zu erhalten, wurden Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-(HGPRT-)defiziente Zelllinien (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 2026–2034 (1962); Littlefield, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50, 568–576 (1963)) gemäß den Standard-Arbeitsvorschriften, die von Siadak et al. (US-Patent Nr. 4.834.975 (1989)) beschrieben werden, etabliert.

HH514-16-Zellen (erhalten von Dr. G. Miller, Yale University), die frei von EBV-het-DNA sind (Rabson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3660–3664 (1983)), wurden mit 300 &mgr;m/ml Methansulfonsäureethylester (MSE) (Sigma, St. Louis, MO) in RPMI-1640-Suspensionsmedium (Life Science, Gaithersburg, MD), ergänzt mit 15 fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 24 Stunden lang behandelt. Nach Waschen der Zellen mit Medium wurden die Zellen in Medium, das 6-Thioguanin (6TG) (Sigma) (5 &mgr;m/ml) enthielt, ausgestrichen, um auf HGPRT-negative Zellen zu selektieren. Die Konzentration von 6TG wurde während der sechsmonatigen Selektionsphase von 5 &mgr;m/ml auf 30 &mgr;m/ml erhöht. Die Zellen wurden dann auf ihre Empfindlichkeit auf HAT-hältiges Medium getestet. Einzellenklone (SCCs) wurden durch Grenzwert-Klonieren (eine Zelle pro Well in 96-Well-Platten) von HAT-empfindlicher Population A5 gewonnen. Einer der SCCs, A5/1D7, wurde mit pSV2neo, das neo-Gen unter SV40-Promotor in pBR-Vektor aufweist, transfiziert, um G418-resistente Zellen zu gewinnen. Einer der G418-(1,5 mg/ml)resistenten SCCs, bezeichnet als 2B8 (hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Nr. CRL-12569), wurde zur Fusion verwendet.

BEISPIEL 1 Zellfusion und Derivatbildung von Einzellklonen

Zellfusion erfolgte primär gemäß dem von Kennett (Meth. Enzymol. 58, 5–359 (1979)) beschriebenen Polyethylenglykol-(PEG-)Fusionsverfahren. Jeweils fünf Millionen von 293S- und 2B8-Zellen in logarithmischem Wachstum wurden mit PBS ohne Ca++ und Mg++ (Life Technologies, Rockville, MD) gewaschen und auf einen Well auf einer 6-Well-Platte, die mit Erdnuss-Agglutinin (Sigma) (5 &mgr;m/ml) vorbehandelt worden war, ausgesät. Die mit Zellen beladenen 6-Well-Platten wurden bei 400 g 6 Minuten lang in einer Beckman-J-6M/E-Zentrifuge (Beckman, Palo Alto, CA) zentrifugiert. Nach Entfernen der PBS aus dem Well wurden die Zellen eine Minute lang mit 2 ml von 40% (Gew./Vol.) PEG (Sigma) behandelt. Als eine Kontrolle wurde ein Well nicht mit PEG behandelt. Die Zellen wurden dreimal mit 5 ml PBS, die 5% DMSO enthielt, gewaschen, gefolgt von drei PBS-Waschschritten. Die Zellen wurden mit frischem Medium, ergänzt mit 15% FBS, 25 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden auf 96-Well-Platten (1,2 × 106 Zellen pro Platte) unter Verwendung von frischem Medium, das G418 (1 mg/ml) und HAT (Life Technology) ergänzt mit 15% FBS enthielt, ausgesät. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich unter Verwendung des Selektionsmediums gefüttert. In diesem Beispiel hatten die 293S-Zellen für die anfängliche Selektion die wünschenswerte Eigenschaft von fehlender Empfindlichkeit gegenüber HAT-hältigem Medium, und demähnlich wiesen die 2B8-Zellen die wünschenswerte Eigenschaft auf, gegenüber G418 resistent zu sein.

Während die fusionierten Zellen unter selektiven Bedingungen wuchsen, wuchsen die gemischten Zellen nicht unter denselben Bedingungen. Drei Wochen nach der Selektion wurden die anfänglichen Populationen auf größere Formate übertragen. Um SCCs zu gewinnen, wurden die stabil wachsenden zwanzig anfänglichen Populationen vermischt und unter Verwendung des selektiven Mediums Grenzwert-Klonierung (eine Zelle pro Well) unterzogen. Neunzehn SCCs wurden aus 15 × 96-Well-Platten nach sorgfältiger Beobachtung der einzelnen Klone unter Verwendung eines Mikroskops ausgewählt. Die aus dem Fusionsversuch stammenden SCCs wurden als HKB-Zellen (Hybridzellen von menschlichen Nieren- und B-Zellen) bezeichnet. Sieben SCCs wurden aus der Transfektionsstudie ausgewählt. Diese sieben SCCs wurden weiter auf die stabile Produktion verschiedener Proteine getestet. Einer der sieben SCCs, HKB11, wurde als ein bevorzugter Säugetierzellwirt zur Herstellung von heterologen Proteinen ausgewählt. Siehe die Zusammenfassung in 1.

BEISPIEL 2 Charakterisierung der HKB-Klone

Obwohl alle Hybridzellen unter selektiven Bedingungen ausgewählt wurden, wurde der Hybridstatus durch Zählen der Chromosomenanzahl in den Zellen bestätigt. Tatsächlich zeigten alle der HKBs eine modale Chromosomenanzahl von 90–110. Diese Chromosomenzahlen waren der Summe modaler Chromosomenzahlen von 293S und 2B8 (64 bzw. 47 gemäß den Daten der ATCC) ähnlich. 293S (Stillman et al., Mol. Cell Biol. 5, 2051–2060 (1985)) ist Suspensions-angepasste 293 (ATCC CRL-1573).

Alle Hybridzellklone wurden durch direkten Immunfluoreszenztest unter Verwendung von Methanol-fixierten Zellen auf endogene Ig-(mu und kappa)Expression getestet, um zu bestimmen, welche Zellklone endogenes Ig sekretieren. In wiederholten Versuchen über eine längere Zeitspanne hinweg wurde basierend auf Immunfluoreszenztest (Tabelle 1) und ELISA (Daten nicht dargestellt) beobachtet, dass diese Zellen in Bezug auf mu- und kappa-Kettenexpression negativ waren.

Tabelle 1. Detektion von Ig-Genexpression

Tabelle 1 zeigt die in den Immunfluoreszenztests beobachteten Resultate von drei Zelltypen. Die Zellen wurden in PBS resuspendiert und als ein Abstrich auf einen Glasobjektträger aufgetragen. Nach Trocknen der Zellen wurden die Objektträger in kaltem Methanol (–20°C) 5 Minuten lang fixiert. Die Zellen wurden mit menschlichen FITC-Anti-kappa- und -Anti-mu-Ketten (1:20-Verdünnung) (Zymed Laboratories, Inc., So. San Francisco, CA) in einer befeuchteten Kammer bei 37°C 45 Minuten lang gefärbt. Nach 10-minütigem Spülen der Objektträger mit PBS wurden die Objektträger unter Verwendung von PBS/Glycerin (1:1) mit Deckgläsern versehen. Die Zellen wurden in einem Fluoreszenz-Mikroskop (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY) beobachtet.

Das menschliche spezifische Muster von Sialsäurebindung, alpha(2-6)-Sialyltransferase, wurde durch eine FACS-Analyse der HKB-Zellen unter Verwendung von FITC-konjugiertem Sambucus-nigra-Lectin (SNA) (Sigma, St. Louis, MO) bestätigt. Protein, das aus den HKB-Zellen (Klon 1G2) sekretiert wurde, zeigte alpha(2-3)- und alpha(2-6)-Bindung von Sialsäure mit Glykosylierungsprofil, das durch Oligosaccharid-Fingerprinting-Verfahren analysiert wurde (Daten nicht dargestellt). Diese Beobachtung weist darauf hin, dass HKB-Zellen, die der Fusion von 293S- und 2B8-Zellen entstammen, menschliche spezifische Glykosylierungsenzyme aufrechterhielten.

Um zu testen, ob diese Hybridzellen die Fähigkeit haben, fremde Gene zu exprimieren, wurden die Zellen mit Expressionsvektoren für ICAM-1 und IgG (Anti-TNF-Antikörper) transfiziert. Um Sekretion von IgG zu testen, wurden HKB-Zellen (5 × 106 Zellen) mittels Elektroporation mit 10 &mgr;m Plasmid-DNA transfiziert, was für funktionelle Expression von Schwer-(gamma-) und Leicht-(kappa-)Ketten sorgte. Um Sekretionsniveaus von löslichem ICAM-1 zu testen, wurden HKB-Zellen (5 × 106 Zellen) mittels Elektroporation mit 10 &mgr;m Plasmid-DNA transfiziert, was für funktionelle Expression von löslichem ICAM-1 sorgte. Sekretionsniveaus wurden durch einen ELISA auf IgG oder ICAM-1 bestimmt. Alle 19 SCCs sekretierten relativ hohe Konzentrationen an ICAM-1 (100–500 ng/ml/2d) und IgG (30–200 ng/ml/2d) in einem Übergangstransfektionstest (Tabelle 2). Diese Daten weisen darauf hin, dass die Hybridzellen die Expression von transfizierten Ig-Genen unterstützen, obwohl endogene Ig-Gen-Expression ausgelöscht war.

Tabelle 2. Übergangstransfektionstest auf die Sekretion von IgG und löslichem ICAM aus HKB-Klonen, die früh nach dem Klonierungsverfahren gewonnen wurden. Die Werte sind Sekretionsniveaus von Protein (ng/ml/2d).
nd
= nicht durchgeführt

Epstein-Barr-Virus (EBV) besteht in Form von Episomen in 2B8-Zellen. Alle SCCs waren bezüglich EBNA-1-Expression positiv (Daten nicht dargestellt), was darauf hinweist, dass sie in Bezug auf EBV positiv sind. Es war jedoch nicht bekannt, ob in den Hybridzellen noch ein vollständiges EBV-Genom existierte. Daher wurde der Status des EBV-Genoms in den Hybridzellen durch Transfizieren der Zellen mit dem EBV-Genomfragment BZLF1, einem Latenz-unterbrechenden trans-aktivierenden Gen, getestet. HKB-Zellen (5 × 106 Zellen) wurden mit 10 &mgr;G von Plasmid-DNA (pSH121) transfiziert, was funktionelle Expression von BZLF1 ermöglichte. Die Detektion von EBV-Capsid-Antigen (EBV-VCA) erfolgte durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von menschlichem Serum, das Anti-EBV-VCA-Titer und FITC-konjugiertes Anti-Mensch-IgG enthielt. Technische Details des Immunfluoreszenztests wurden bereits zuvor beschrieben. Wie in Tabelle 3 gezeigt waren scheinbar transfizierte Zellen bezüglich Expression von EBV-Capsid-Antigen (EBV-VCA) negativ, was darauf hinwies, dass sie für EBV-Replikation negativ waren. Ein geringer Prozentsatz der transfizierten Zellen war jedoch bezüglich der Antigenexpression positiv. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Hybridzellen EBV-Genom in seiner latenten Form in sich tragen.

Tabelle 3. Induktion von EBV-Replikation durch Transfektion mit BZLF1

Die Hybridzellen wurden durch serielle zweifache Reduktion von FBS in Schüttelkolben an serumfreies Medium angepasst. Nach zwei Wochen wuchsen die Zellen im Medium ohne FBS. Die Zellen wuchsen als kleine Aggregate in Schüttelkolben. Im Gegensatz zu 293S-Zellen waren die Hybridzellen leicht an serumfreie Suspensionskulturen anpassbar. Hybridzellen in serumfreiem und albuminfreiem Medium, ergänzt mit Transferrin und Insulin, konnten länger als ein Jahr in Suspensionskultur unter Verwendung von Schüttelkolben erhalten werden.

Um Sekretionsniveaus von transfizierten Genprodukten zu vergleichen, wurden einer der Klone, HKB11, und parentale Zellen, 293S und 2B8, mit pSM98 (lösliches ICAM-1), pSH125 (Anti-TNF-IgG) und pCISF8 (rFVIII) transfiziert. Wie in 3 gezeigt waren Sekretionsniveaus von ICAM-1 und IgG in HKB11-Zellen viel höher (etwa 10fach) als in 293S-Zellen. Sekretionsniveaus von beiden Proteinen aus 2B8 waren nicht nachweisbar. Sekretionsniveaus von rFVIII in HKB11-Zellen waren ähnlich wie jene von 293S-Zellen. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Transfektionswirksamkeit von HKB11-Zellen viel besser ist als von parentalen Zellen.

BEISPIEL 3 Derivatbildung von stabilen HKB-Klonen, die heterolocge Proteine sekretieren

Hybride Klone wurden auf die stabile Expression von Proteinen in einem Genamplifizierbaren System (dhfr/MTX) getestet. Die Zellen wurden zuerst mit einem geeigneten Expressionsvektor transfiziert, und dann wurden die transfizierten Zellen (üblicherweise 106 Zellen pro 96-Well-Platte) ausgesät und mit dem Selektionsmedium, dem Hypoxanthin und Thymidin fehlte, jedoch mit FBS und MTX (50 nM) ergänzt war, selektiert/amplifiziert. Nach dem ersten Screenen der Platten wurden die Zellen aus den stark sekretierenden Wells ausgewählt und auf die 6-Well-Platten übertragen. Die Zellen in den 6-Well-Platten wurden weiter mit steigenden Konzentrationen von MTX (100, 200 und 400 nM) in Medium amplifiziert. Die anfänglichen Populationen der 6-Well-Platten wurden weiter gescreent, um die beste Population abzuleiten. Schließlich wurden diese Populationen zum Klonieren von von einzelnen Zellen abgeleiteten Klonen verwendet. Wie in Tabelle 4 gezeigt waren HKB11-Zellen optimal zur Herstellung von hohen Konzentrationen an heterologen menschlichen Proteinen. Zur Herstellung von ICAM-1, Ig und einem IL-4-Derivat waren HKB11-Zellen ebenso gut geeignet wie CHO-Zellen (Daten nicht dargestellt). HKB-Klone wuchsen jedoch schneller als CHO-Klone und konnten leicht an Suspensionskultur und an serumfreie Bedingungen angepasst werden. Im Falle von BDD-FVIII-Herstellung zeigten HKB11-Klone etwa eine zehnfach höhere Produktivität als CHO-Klone. Die obigen Resultate weisen darauf hin, dass HKB11-Zellen einen optimalen menschlichen Zellwirt darstellen, der zur Expression von menschlichen therapeutischen Proteinen nützlich ist.

Tabelle 4. Herstellung von heterologem Protein aus HKB-Klonen.
  • 1) ICAM-1-Produktionsniveau von HKB-Klonen war jenem von 293S-Zellen ähnlich. ICAM-1-sekretierender HKB-Klon war leicht an Suspensionskultur anpassbar, während 293S-Klone sehr schwierig an Suspensionskultur anzupassen waren.
  • 2) Das Sekretionsniveau von BDD-FVIII-Sekretion war etwa zehnmal höher als jenes aus den Klonen, die von CHO-Zellen, transfiziert mit demselben Expressionsvektor, abstammten.
  • 3) Gramm-Menge von IL-4SA-(T13D/R121E)Produktion war 6 Monate nach Transfektion unter Verwendung von HKB11 möglich, während es unter Verwendung von CHO-Zellen in gleichzeitigen Versuchen unter Verwendung desselben Expressionsvektors und eines ähnlichen Verfahrens einige Monate länger dauerte.

Die mittels des obigen Verfahrens hergeleiteten Zelllinien umfassten (i) lösliches ICAM-1 sekretierende Klone (10 pg/Zelle/Tag), abstammend von HKB11-Zellen, die nach Amplifikation in 100 nM MTX mit pSM98 transfiziert waren, (ii) monoklonalen Antikörper (Anti-TNF) sekretierende einzellige Klone (12 pg/Zelle/Tag), abstammend von HKB13, transfiziert mit pSS125 nach Amplifikation in 50 nM MTX und Grenzwert-Klonierung ohne MTX, (iii) trunkiertes rFVIII (BDD-FVIII) sekretierende einzellige Klone (5–10 &mgr;U/c/d, in serumfreien Bedingungen), abstammend von HKB11-Zellen, transfiziert mit pCIS25DTR nach Amplifikation (400 nM MTX) und Grenzwert-Klonierung ohne MTX, und (iv) IL4-Derivat (IL-4-selektiver Agonist, IL-4SA; zwei mutierte Positionen von Aminosäure, T13D und R121E) sekretierende Klone (5 pg/c/d), abstammend von HKB11, transfiziert mit pSH157 nach MTX-Amplifikation. Der IL-4SA-sekretierende HKB-Klon, 1G2, wurde für relativ rasche Herstellung von geringen Mengen an Protein (Gramm-Menge) verwendet. Siehe die physikalischen Karten der oben erwähnten Expressionsvektoren in 2.

DISKUSSION

Die hierin beschriebenen, hybriden menschlichen Zelllinien weisen wünschenswerte Eigenschaften auf, die auch ihre parentalen Zelllinien besaßen. HKB-Zelllinien, die durch die Fusion von menschlichen embryonalen Nierenzellen (oder Zellen, die von menschlichen embryonalen Nierenzellen abstammen) mit Burkitt-Lymphomzellen (oder Zellen, die von Burkitt-Lymphomzellen abstammen) produziert werden, sind zur Entwicklung von Zelllinien zur Expression von heterologen Proteinen nützlich.

Der anfängliche Zweck des Etablieren der hybriden Zelllinien von 293S und 2B8 war, eine Lösung für das Aggregationsproblem von 293S-Zellen zu finden, die dazu neigen, Klumpen zu bilden, wenn sie in Suspensionskultur gezüchtet werden (eine unerwünschte Eigenschaft). Die HKB-Zellen, die aus dem Hybridisierungsprozess entwickelt wurden, wachsen in Form eines Monolayers, wenn sie in T-Kolben kultiviert werden. Diese Zellen wachsen jedoch als Suspensionszellen (bilden keine größeren Aggregate), wenn sie in Suspension kultiviert werden. HKB-Zellen sind im Zusammenhang mit Transfektion leicht zu handhaben, und ihre Transfektionswirksamkeit ist viel höher als jene von 293S-Zellen.

Obwohl das Transformations- oder Hybridisierungsereignis, das in den meisten Fällen zur Herstellung einer stabilen Zelllinie erforderlich war, zu veränderten Glykosylierungsprofilen führen könnte (Yamashita, J. Biol. Chem. 264, 2415–2423 (1989)), wurde erkannt, dass HKB11, das eine somatische Hybridzelllinie ist, typische menschliche Glykosylierungsenzyme aufweist, z.B. alpha(2-3)- und alpha(2-6)-Sialyltransferasen. Darüber hinaus weisen Proteine, die aus transfizierten HKB-Zellen hergestellt wurden, normale menschliche Glykosylierungsmuster von alpha(2-3)- und alpha(2-6)-Sialsäurebindungen auf.

Zusammenfassend sind HKBs hybride menschliche Zellen mit wünschenswerten Eigenschaften aus jeder der parentalen Zelllinien; diese sind, dass sie leicht in Suspensionskultur ohne Aggregation (wie für 2B8-Zellen beobachtet) wachsen und dass Transfektion einfach vonstatten geht sowie dass sie wünschenswerte Sekretionseigenschaften (wie für 293S-Zellen beobachtet) aufweisen. Die bevorzugte hybride menschliche Zelllinie, HKB11, ist wie 293S-Zellen bezüglich Immunglobulin-Genexpression negativ. Diese Eigenschaft ist in Fällen vorteilhaft, in denen es wünschenswert ist, monoklonale Antikörper aus menschlichen Zellen mittels Rekombinationsverfahren herzustellen. Die Entdeckung, dass Fusion von menschlichen Zellen in Zellen mit vorteilhaften Eigenschaften resultierte, dient dazu, weitere Fusionsstudien unter Verwendung von 293S- und anderen Zelllinien mit B-Zell-Abstammung, z.B. Namalwa und 6F11, zu fördern, um neue Kombinationen von Eigenschaften in den Hybridzellen aus Fusionen verschiedener parentaler Zelllinien zu erhalten.

Die obigen Beispiele sollen zur Veranschaulichung der Erfindung dienen, und es wird angenommen, dass Fachleute auf Variationen stoßen werden. Demgemäß wird verstanden, dass der Schutzumfang der Erfindung ausschließlich durch die beiliegenden Patentansprüche eingeschränkt wird.


Anspruch[de]
  1. Zelle (ATCC-Hinterlegungsnummer: CRL-12568), die der Fusion einer 293-Zelle mit einer 2B8-Zelle (ATCC-Hinterlegungsnummer: CRL-12569) entstammt.
  2. Zelle nach Anspruch 1, die ein heterologes Protein exprimiert.
  3. Zelle nach Anspruch 2, worin das heterologe Protein aus der aus FVIII, BDD-FVIII, monoklonalen Antikörpern, Anti-TNF-Antikörpern, rIL4, tPA und EPO bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  4. HKB11-(ATCC-Hinterlegungsnummer: CRL-12568)Zelllinie, die gentechnisch so verändert worden ist, dass sie ein heterologes Protein exprimiert.
  5. Zelllinie nach Anspruch 4, worin das Protein ICAM-1 ist.
  6. Zelllinie nach Anspruch 4, worin das Protein BDD-FVIII ist.
  7. Zelllinie nach Anspruch 4, worin das Protein ein monoklonaler Antikörper ist.
  8. Zelllinie nach Anspruch 7, worin der monoklonale Antikörper Anti-TNF ist.
  9. Zelllinie nach Anspruch 4, worin das Protein rIL4 ist.
  10. Zelllinie nach Anspruch 4, worin das Protein FVIII ist.
  11. Zelllinie nach Anspruch 4, worin das Protein tPA ist.
  12. Zelllinie nach Anspruch 4, worin das Protein EPO ist.
  13. Zelllinie nach Anspruch 4, worin das Protein IL-4SA (T13D/R121E) ist.
  14. Zelllinie nach Anspruch 4, worin das Protein ein menschliches Protein mit einem menschlichen Glykosylierungsprofil ist.
  15. Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Humanzellen, die zur Expression eines heterologen Proteins dienen, folgende Schritte umfassend:

    a) Gewinnung von 293-Zellen,

    b) Gewinnung von 2B8-Zellen (ATCC-Hinterlegungsnummer CTRL-12569),

    c) Kontaktieren der Zellen aus Schritt a) mit den Zellen aus Schritt b) unter Bedingungen, die das Auftreten von Zellfusion ermöglichen,

    d) Screenen der aus Schritt c) resultierenden Zellen auf Zellen, die ein heterologes Protein in größeren Mengen exprimieren als Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen).
  16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die aus menschlichen embryonalen Nieren stammenden Zellen 293S-Zellen sind.
Es folgen 3 Blatt Zeichnungen






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