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Dokumentenidentifikation DE69534685T2 07.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000764720
Titel TRANSFERASE UND AMYLASE, VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DIESER ENZYME, IHRE VERWENDUNG UND FÜR DIE KODIERENDE GENE
Anmelder Kirin Beer K.K., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder KATO, Masaru, Takasaki-shi, Gunma 370-12, JP;
MIURA, Yutaka, Takasaki-shi, Gunma 370-12, JP;
KETTOKU, Masako, Takasaki-shi, Gunma 370-12, JP;
IWAMATSU, Akihiro, Kanazawa-ku, Yokohama-shi Kanagawa 236, JP;
KOBAYASHI, Kazuo, Takasaki-shi, Gunma 370-12, JP;
KOMEDA, Toshihiro, Kanazawa-ku, Kanagawa 236, JP
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69534685
Vertragsstaaten CH, DE, DK, FR, GB, IT, LI
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 14.06.1995
EP-Aktenzeichen 959219650
WO-Anmeldetag 14.06.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/JP95/01189
WO-Veröffentlichungsnummer 1995034642
WO-Veröffentlichungsdatum 21.12.1995
EP-Offenlegungsdatum 26.03.1997
EP date of grant 14.12.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.09.2006
IPC-Hauptklasse C12N 9/10(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 9/26(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 19/04(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/54(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/56(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft eine Transferase, ein Verfahren zur Herstellung desgleichen, ein Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharids durch Verwendung dieses Enzyms, ein Gen, welches für das Enzym codiert und deren Verwendung.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Transferase, die auf ein Saccharid als Substrat wirkt; das Saccharid als Substrat setzt sich aus drei Zuckereinheiten zusammen, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-verbunden sind, um &agr;-1,4-Bindungen in &agr;-1,&agr;-1-Bindungen umzuwandeln, und ein Verfahren zur Herstellung der Transferase. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung das oben erwähnte Enzym, das von Archaebakterien hergestellt wird, die der Ordnung Sulfolobales, zum Beispiel Bakterien der Gattung Sulfolobus oder Acidianus zuzuordnen sind.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden oder dgl. unter Verwendung des oben erwähnten Enzyms und insbesondere betrifft sie ein wirksames Verfahren mit hoher Ausbeute zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose unter Verwendung eines Maltooligosaccharids oder dgl. als Rohmaterial.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein DNA-Fragment, das die oben erwähnte Transferase codiert und die Verwendung des DNA-Fragmentes bei der Gentechnik.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose, das durch die Verwendung einer Amylase in Verbindung mit der obigen Transferase gekennzeichnet ist. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose in hoher Ausbeute durch Verwendung einer Stärke, eines Stärkehydrolysats und Maltooligosacchariden oder einer Mischung aus Maltooligosacchariden als Rohmaterial und als Enzyme die erfindungsgemäße Transferase und Amylase.

Hintergrund I. Hintergrund der Erfindung

Bisher wurden in bezug auf Glycosyltransferase, die auf Stärke und Stärkehydrolysate, wie Oligosacchariden, wirkt, verschiedene Glucosyltransferasen, Cyclodextringlucanotransferasen (CGTase) und andere aufgefunden ["Seibutsu-kagaku Jikken-hou" 25 ("Experimental Methods in Biochemistry", Bd. 25), "Denpun·Kanren Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimental Methods in Enzymes for Starch and Relating Saccharides"), veröffentlicht von Gakkaishuppan-sentah, Bioindustry, Bd. 9, Nr. 1 (1992), S. 39-44 und andere]. Diese Enzyme übertragen eine Glucosyl-Gruppe an die &agr;-1,2-, &agr;-1,3-, &agr;-1,4- oder &agr;-1,6-Bindung. Ein Enzym, das das eine Glucosyl-Gruppe an eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung überträgt ist bisher nicht aufgefunden worden. Obgleich Trehalase als Enzym festgestellt wurde, daß auf die &agr;-1,&agr;-1-Bindung wirkt, ist Trehalose absolut das einzige Substrat für das Enzym und das Gleichgewicht oder die Reaktionszeit liegt bei der abbauenden Reaktion.

Unlängst wurden Oligosaccharide ermittelt, die physiochemische Eigenschaften aufweisen, wie Feuchtigkeitserhaltende Fähigkeit, Form-erhaltende Fähigkeit, Viskosefähigkeit und Bräunungs-verhindernde Fähigkeit, und biologische Wirkungen, wie Kalorienarmut, keine Karieserzeugung und Befidus-Vermehrung. Diesbezüglich wurden verschiedene Oligosaccharide, wie Maltooligosaccharide, verzweigte Oligosaccharide, Fructooligosaccharid, Galactooligosaccharid und Xylooligosaccharid entwickelt ["Kammiryo" ("Sweetener") (1989), Medikarurisahchi-sha (Medical Research Co.) (1989), Gekkan Fuhdokemikaru (Monthly Foodchemical) (1993), Feb. S. 21-290 und andere].

Unter den Oligosacchariden können Oligosaccharide, die kein reduzierendes Ende aufweisen Fructooligosaccharide mit einer Struktur, die sich aus Sucrose zusammensetzt, die nicht-reduzierend ist und die aus Fructosyltransferase hergestellt wird, umfassen. Unter Stärkehydrolysaten wie Maltooligosacchariden, d.h. Oligosacchariden, die kein reduzierendes Ende aufweisen, können mittlerweile cyclische Dextrine, die aus der oben erwähnten CGTase hergestellt werden, &agr;,&bgr;-Trehalose (Neotrehalose), und reduzierte Oligosaccharide, die chemisch durch Hydrierung des reduzierenden Endes (Oligosaccharidalkohol) synthetisiert werden, umfassen. Diese Oligosaccharide mit keinem reduzierenden Enden weisen verschiedene physikochemische Eigenschaften und biologische Wirkungen auf, die von herkömmlichen Stärkesirupen und Maltooligosacchariden nicht besitzt werden. Von Maltooligosacchariden, den Sacchariden, deren reduzierende Endgruppe mit einer &agr;-1,&agr;-1-Bindung modifiziert ist, kann folglich außerdem erwartet werden, daß sie ähnliche physikochemische Eigenschaften und biologische Wirkungen haben, wie solche, die von den oben erwähnten Oligosacchariden mit keiner reduzierenden Endgruppe besitzt werden, da solche Oligosaccharide ebenfalls keine reduzierende Endgruppe aufweisen.

Die oben beschriebenen Oligosaccharide, deren reduzierende Endgruppen mit einer &agr;-1,&agr;-1-Bindung modifiziert sind, können hier als Trehaloseoligosaccharid, bei dem &agr;,&agr;-Trehalose mit Glucose verbunden ist oder als Maltooligosaccharid angesehen werden. Folglich kann von einem solchen Trehaloseoligosaccharid erwartet werden, daß es die physikochemischen Eigenschaften und biologischen Wirkungen aufweist, die von einem Oligosaccharid besitzt werden, das keine reduzierende Endgruppe aufweist und zusätzlich kann erwartet werden, daß es spezifische Aktivitäten aufweist, die von &agr;,&agr;-Trehalose entfaltet werden (japanische offengelegte Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 63-500562).

Obgleich darüber berichtet wurde, daß eine äußerst kleine Menge des Trehaloseoligosaccharids in Hefe nachgewiesen werden konnte [Biosci. Biotech. Biochem., 57(7), S. 1220-1221 (1993)], ist dies der einzige Bericht, der über seine Existenz in der Natur berichtet. Obgleich es auf der anderen Seite einen Bericht hinsichtlich seiner Synthese unter Verwendung eines Enzyms gibt [Abstracts of "1992 Nihon Nougei-kagaku Taikai" ("Annual Meeting of the Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry in 1994"), S. 247], verwendet das in dem Bericht beschriebene Verfahren Trehalose, die als Rohmaterial teuer ist. Die Herstellung bei niedrigen Kosten wurde demzufolge bisher nicht erreicht.

Kürzlich haben Lama et al. festgestellt, daß ein Zellextrakt aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm MT-4 (DSM 5833), einer Art von Archaebakterien, wärmestabile Stärke-hydrolysierende Aktivität aufweist [Biotech. Forum. Eur. 8, 4, 2-1 (1991)]. Darüber hinaus berichteten sie, daß die Aktivität ebenfalls auf die Herstellung von Trehalose und Glucose aus Stärke zurückzuführen ist. Der oben erwähnte Bericht bezieht sich jedoch in keiner Weise auf die Existenz von Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose. Darüber hinaus ist keine Untersuchung in Archaebakterien, abgesehen von dem oben erwähnten Stamm, durchgeführt worden.

Mittlerweile sollte ein effizientes Verfahren zum Erhalt der neuen Transferase etabliert worden sein, um effizient Trehaloseoligosaccharide herzustellen.

Demzufolge erfordert die Großherstellung von Trehaloseoligosacchariden den Erhalt dieser neuen Transferase in einer großen Menge. Damit dies erreicht werden kann, ist es bevorzugt ein Gen zu erhalten, das die Transferase codiert und das die Transferase durch gentechnische Art und Weise hergestellt wird. Wenn ein solches Gen erhalten werden kann, ist ebenfalls zu erwarten, daß unter Verwendung von Proteinbiotechnik ein Enzym erhalten werden kann, welches eine verbesserte Wärmestabilität, eine verbesserte pH-Stabilität und eine erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit aufweist. Es gibt bisher jedoch keinen Bericht über die Genklonierung eines solchen Gens.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Transferase bereitzustellen, die prinzipiell die Herstellung von Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose katalysiert und ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms und darüber hinaus ein neues effizientes Verfahren bereitzustellen, das prinzipiell Trehaloseoligosaccharide, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen in großer Ausbeute herstellt, indem ein Enzym verwendet wird und als Ausgangsmaterial Maltooligosaccharide verwendet werden.

Die Erfinder haben ernsthaft die Trehalose-herstellende Aktivität von Archaebakterien untersucht und festgestellt, daß Glucosyltrehalose aus Maltotriose als Substrat aus Zellextrakten verschiedener Archaebakterien, wie solchen die zur Ordnung Sulfolobales gehören und insbesondere der Gattung Sulfolobus, Acidianus und anderen hergestellt werden. Obgleich die Herstellung von Trehalose und Glucose hier unter Verwendung eines Aktivität-messenden Verfahrens, das von Lama et al. beschrieben wurde, bestätigt wurde, wobei das Substrat Stärke ist, haben die Erfinder hier festgestellt, daß der Nachweis von Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose, äußerst schwierig ist. Darüber hinaus haben die Erfinder festgestellt, daß die Trehalose-herstellende Aktivität, wie sie von Lama et al. festgestellt wurde, verschwindet während des Schritts der Reinigung von Zellextrakten aus Archaebakterien. Folglich erkannten die Erfinder daß die Reinigung und Charakterisierung der Enzyme selbst, die solche Aktivitäten aufweisen, fast unmöglich sein würde.

Unter solchen Umständen unternahmen die Erfinder weitere Untersuchungen und konzipierten ein neues Aktivität-messendes Verfahren, bei dem das Substrat ein Maltooligosaccharid ist, wie Maltotriose, und der Index die Aktivität ist mit der ein Trehaloseoligosaccharid, wie Glucosyltrehalose, hergestellt wird. Anschließend wurde durch das Anwenden des Meßverfahrens festgestellt, daß ein Trehaloseoligosaccharid, wie Glucosyltrehalose, leicht nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus versuchten die Erfinder das Enzym mit dieser Aktivität aus verschiedenen Bakterienstämmen zu reinigen und haben überraschenderweise festgestellt, daß das so erhaltene Enzym eine neue Transferase ist, die auf Maltotriose oder ein größeres Saccharid wirkt, wobei mindestens drei Glucosereste von dem reduzierenden Ende &agr;-1,4 verbunden sind und das die Bindung zwischen den Glucoseresten am reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung überführt wird, um Trehaloseoligosaccharide, wie Glucosyltrehalose herzustellen. Im übrigen wurde die Existenz von Trehaloseoligosacchariden, die aus Maltooligosacchariden oder dgl. durch Übertragen der Bindung zwischen Glucoseresten am reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung hergestellt werden durch 1H-NMR und 13C-NMR (siehe Beispiele I-1, 7 und 8) bestätigt.

Die Erfinder stellten darüber hinaus fest, daß ein solches neues Enzym zur Herstellung einer großen Menge von Trehaloseoligosacchariden, zum Beispiel von Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose aus Sacchariden, wie Maltooligosacchariden, verfügbar ist und haben die vorliegende Erfindung vervollständigt.

Darüber hinaus isolierten die Erfinder die Gene, die ein solches neues Enzym codieren, und haben jetzt ein Verfahren zur Herstellung der neuen Transferase etabliert, wobei solche Enzyme auf gentechnische Art und Weise verwendet werden.

II. Hintergrund der Amylase

"Amylase" ist ein generischer Ausdruck für Enzyme die Stärke hydrolysieren. Unter ihnen ist &agr;-Amylase ein Enzym vom Endotyp, das eine &agr;-1,4-Glucosidbindung hydrolysiert. alpha-Amylase ist auf der Welt verbreitet. In Säugern kann &agr;-Amylase im Speichel und der Bauchspeicheldrüsenflüssigkeit festgestellt werden. In Pflanzen besitzt Malz das Enzym in großen Mengen. Darüber hinaus kommt &agr;-Amylase verbreitet in Mikroorganismen vor. Darunter wird &agr;-Amylase oder dgl., die von einigen Pilzen, die zur Gattung Aspergillus oder von einigen Bakterien, die zur Gattung Bacillus gehören, hergestellt werden, in der Industrie auf verschiedenen Gebieten eingesetzt ["Amirahze" ("Amylase"), herausgegeben von Michinori Nakamura, veröffentlicht von Gakkai-shuppansentah, 1986].

Eine solche &agr;-Amylase wird industriell verbreitet für verschiedene Zwecke verwendet, zum Beispiel für Stärke-verflüssigende Verfahren, bei Stärkezuckerindustrien und für Entschlichtungsverfahren in der Textilindustrie und daher ist aus industrieller Sicht das Enzym sehr wichtig. Wichtige Bedingungen für das Stärke-verflüssigende Verfahren sind in "Kouso-Ouyou no Chishiki" (von Toshiaki Komaki geschrieben, veröffentlicht von Sachi-Shobou, 1986) aufgeführt: 1) die Stärkemoleküle sollten so vollständig wie möglich verflüssigt werden, 2) die Produkte, die durch die Verflüssigung hergestellt werden, werden am günstigsten zum Zweck des darauffolgenden saccharifizierenden Verfahrens eingesetzt, 3) der Zustand verursacht keine Retrogradation der Produkte durch die Verflüssigung und 4) das Verfahren sollte in einer so hohen Konzentration wie möglich (30-35 %) zur Reduzierung der Kosten durchgeführt werden. Ein Stärke-verflüssigendes Verfahren kann zum Beispiel durchgeführt werden durch ein kontinuierliches Verflüssigungsverfahren bei einer konstanten Temperatur oder durch das Jet-Cooker-Verfahren. Gewöhnlich wird eine dicke Stärke-Emulsion, die &agr;-Amylase enthält, unmittelbar auf eine hohe Temperatur (85-110°C) erwärmt und anschließend wird die &agr;-Amylase in Wirkung gesetzt, um die Verflüssigung zur gleichen Zeit durchzuführen, zu der die Stärke zu gelatinisieren beginnt und anschwillt. Mit anderen Worten erfordert das Stärke-verflüssigende Verfahren eine Temperatur, die dafür ausreicht, daß die Stärke anschwillt bevor das Enzym wirken kann. Enzyme, die auf solchen Gebieten verwendet werden können, sind zum Beispiel die oben erwähnten wärmestabilen &agr;-Amylasen, die aus Fungi der Aspergillus oryzae-Gruppe, die zur Gattung Aspergillus gehören oder durch Bakterien, die zur Gattung Bacillus gehören, hergestellt werden. In einigen Fällen ist die Zugabe von Calcium erforderlich, um die Wärmestabilität dieser Enzyme weiter zu verbessern. Sobald die Temperatur absinkt, obgleich die &agr;-Amylase noch nicht auf die Stärke-Micellen, die geschwollen und zu spalten sind, eingewirkt hat, häuft sich bei dem Stärke-verflüssigenden Verfahren die Stärke wieder an, um neue Micellen (unlösliche Stärke) zu bilden, die kaum von &agr;-Amylase verflüssigt werden. Als Folge ist der so hergestellte flüssige Zucker trüb und schwer zu filtrieren, was ein bekanntes Problem ist. Einige Verfahren, die den Verflüssigungsgrad erhöhen, d.h. Dextrose-Äquivalent (DE), werden verwendet, um ein solches Vorkommnis zu vermeiden. Allerdings sollte in einigen Fällen, zum Beispiel bei der enzymatischen Herstellung von Maltose, DE so niedrig wie möglich gehalten werden, und zwar sollte der Polymerisierungsgrad der Zuckerkette auf einem hohen Grad gehalten werden, um eine hohe Ausbeute zu erzielen. Wenn ein Enzym weiter bei einem Verfahren, das sich an das Stärke-Verflüssigungsverfahren anschließt, verwendet wird, ermöglicht die Verwendung eines Enzyms, das ausreichend wärmestabil ist, um bei einer Reihe von hohen Temperaturen verwendet zu werden, den weiteren Ablauf der Reaktion ohne ein bißchen lösliche Stärke herzustellen, sogar wenn eine hohe Stärkekonzentration verwendet wird, und zur gleichen Zeit ist eine solche Verwendung hinsichtlich der Verfahrenskontrolle und der Hygienekontrolle vorteilhaft, da das Risiko der Verunreinigung mit Mikroorganismen herabgesetzt werden kann. Indessen, wenn das Enzym in einem Bioreaktor immobilisiert ist, um das Enzym wiederzuverwenden, wird es als wichtig angenommen, daß das Enzym hohe Stabilität aufweist und insbesondere hohe Wärmestabilität, da das Enzym einer verhältnismäßig hohen Temperatur während der Immobilisierung ausgesetzt sein kann. wenn das Enzym eine niedrige Wärmestabilität hat, wird es möglicherweise während des Immobilisierungsverfahrens inaktiviert. Aus dem obigen ist ersichtlich, daß ein Enzym, das eine hohe Wärmestabilität aufweist auf verschiedenen Industriegebieten sehr vorteilhaft eingesetzt werden kann, zum Beispiel bei einem Stärkeverflüssigungsverfahren, und ein solches Enzym ist wünschenswert.

In diesem Zusammenhang wurde in den vergangenen Jahren verbreitet nach thermophilen und hyperthermnophilen Bakterien gescreent, um wärmestabile Enzyme, einschließlich Amylasen, zu erhalten. Archaebakterien, die zur Ordnung Thermococcales gehören und die Gattung Pyrococcus sind ebenfalls Ziele des Screenings und es wurde von ihnen berichtet, daß die &agr;-Amylase herstellen [Applied and Environmental Microbiology, S. 1985-1991 (1990); japanische offengelegte Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 6-62869 und andere]. Darüber hinaus sind Archaebakterien, die zur Gattung Sulfolobus gehören Ziele des Screenings und über die Isolierung von thermostabilen Enzymen wurde berichtet. Hier werden Archaebakterien, die der Gattung Sulfolobus angehören taxonomisch durch die folgenden Kennzeichen definiert:

sehr thermophil sind: können in einem Temperaturbereich von 55°C bis 88°C wachsen;

acidophil sind: können in einem pH-Bereich von 1-6 wachsen;

aerob sind und

Schwefelbakterien sind: Cocci mit irregulärer Form und einem Durchmesser von 0,6-2 &mgr;m. Wenn ein Archaebakterium, das zur Gattung Sulfolobus gehört, eine Amylase herstellt, ist folglich von der Amylase anzunehmen, daß sie wärmestabil ist. Lama et al. stellten fest, daß eine wärmestabile Stärke-hydrolysierende Aktivität in einem Zellextrakt aus den Sulfolobus solfataricus-Stamm MT-4 (DSM 5833) [Biotech. Forum. Eur. 8, 4, 2-1 (1991)] existiert. Dieser Artikel berichtet, daß &agr;,&agr;-Trehalose und Glucose aus Stärke durch diese Aktivität hergestellt werden können. Darüber hinaus wurde die Reinigung der aktiven Substanz nur teilweise durchgeführt und die wahre Substanz, die die Aktivität entfaltet, konnte bis dahin nicht identifiziert werden. Die enzymatischen Kennzeichen dieser Aktivität sind darüber hinaus bis jetzt gar nicht aufgeklärt worden. Die Untersuchungen der Erfinder, deren Einzelheiten nachfolgend beschrieben werden, enthüllten, daß die aktive Substanz, die aus dem oben erwähnten Bakterienstamm abstammt und die auf die Stärke von Lama et al. wirkte, eine Mischung war, die eine Vielzahl von Enzymen enthält, und daß &agr;,&agr;-Trehalose und Glucose die Endprodukte sind, die unter Verwendung dieser Mischung erhalten werden.

Als weiteres Kennzeichen hat &agr;-Amylase im Anfangsstadium eine Aktivität, die die Menge der Iod-Stärkereaktion herabsetzt, und zwar eine Entotyp-hydrolysierende &agr;-1,4-Glucan-Aktivität (verflüssigende Aktivität). Es gibt verschiedene Wege in dem Reaktionsmechanismus einer solchen Amylase vom verflüssigenden Typ. Mit anderen Worten ist bekannt, daß jede Amylase gemeinsame Eigenschaften hinsichtlich Endotyp-hydrolysierende Aktivität hat, aber individuell Eigenschaften hinsichtlich des Hydrolysierungsmusters von Maltooligosacchariden. Zum Beispiel erkennen einige eine spezifische Stelle zur Hydrolyse des Substrats vom nicht-reduzierenden Ende und andere erkennen eine spezifische Stelle zur Hydrolyse des Substrats vom reduzierenden Ende. Darüber hinaus hydrolysieren einige das Substrat, um prinzipiell Glucose herzustellen, andere um prinzipiell Maltose oder Maltooligosaccharide herzustellen. Genauer gesagt hydrolysiert die &agr;-Amylase, die von der Bauchspeicheldrüse abstammt, die &agr;-1,4-Bindung an zweiter oder dritter Stelle vom reduzierenden Ende ["Denpun·Kanren Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimental methods in enzymes for starch and relating saccharides"), geschrieben von Michinori Nakamura und Keiji Kainuma, veröffentlicht von Gakkai-Shuppan-Sentah, 1989]. Die &agr;-Amylase, die von Bacillus subtilis abstammt, hydrolysiert die &agr;-1,4-Bindung an der sechsten Stelle vom nicht-reduzierenden Ende oder an der dritten vom reduzierenden Ende ["Kouso-Ouyou no Chishiki" ("Knowledge in Application of Enzymes"), geschrieben von Toshiaki Komaki, veröffentlicht von Sachi-Shobou, 1986). Es wird angenommen, daß eine solche Differenz zwischen den Reaktionswegen von &agr;-Amylasen auf die Struktur jedes Enzym zurückgeführt werden kann und daß "Subsite theory" zur Erklärung dieser Vorkommnisse vorgeschlagen wurde. Darüber hinaus wurde die Existenz einer Amylase mit übertragenden Aktivitäten oder Kondensierungsaktivitäten bestätigt. Darüber hinaus wurde eine bestimmte &agr;-Amylase, die ein Cyclodextrin herstellt, aufgefunden.

Auf der anderen Seite besteht &agr;,&agr;-Trehalose aus zwei Glucosemolekülen, die an der reduzierenden Gruppe jedes Moleküls &agr;-1,&agr;-1 verbunden sind. Es ist bekannt, daß &agr;,&agr;-Trehalose in vielen lebenden Dingen existiert, in Pflanzen und in Mikroorganismen der Natur, und verschiedenste Wirkungen hat, wie das Verhindern einer Biomembran zu Gefrieren oder zu Trocknen und als Energiequelle von Insekten dient. Vor kurzem wurde &agr;,&agr;-Trehalose in medizinischen Bereichen, Kosmetika und Nahrungsmitteln als Proteinstabilisator gegen Gefrieren und Trocknung erkannt (japanische geprüfte Patentveröffentlichungs-Nr. 5-81232, offengelegte japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 63-500562 und andere). Jedoch wird &agr;,&agr;-Trehalose praktisch so gut wie gar nicht verwendet. Dies ist vielleicht darauf zurückzuführen, daß kein Großherstellungsverfahren bisher etabliert werden konnte.

Als Beispiele des herkömmlichen Verfahrens zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose sind die folgenden zu nennen:

Ein Verfahren, umfassend die Extraktion einer Hefe (offengelegte japanische Patene, Veröffentlichungs-Nrn. 5-91890 und 4-360692 und andere);

ein Verfahren, umfassend die intrazelluläre Herstellung durch Hefe (offengelegte japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 5-292986, europäisches Patent Nr. 0451896 und andere), und

ein Verfahren, umfassend die Herstellung eines Mikroorganismus, der der Gattung Sclerotium oder der Gattung Rhizoctonia (offengelegte japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 3-130084) angehört. Da diese Verfahren die intrazelluläre Herstellung umfassen erfordern sie allerdings ein Reinigungsverfahren, das mehrere Schritte umfaßt, um bakterielle Körper zu zertrümmern und die Trümmer zu entfernen. Mittlerweile wurden etliche Untersuchungen über die extrazelluläre Herstellung durch Fermentierung unter Verwendung eines Mikroorganismus, zum Beispiel eines Mikroorganismus, der der Gattung Arthrobacter angehört (Suzuki T. et al., Agric. Biol. Chem., 33, Nr. 2, 190, 1969) oder der Gattung Nocardia (offengelegtes japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 50-154485) und Glutamat-herstellende Bakterien (französisches Patent Nr. 2671099, offengelegte japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 5-211882 und andere) angehört, unternommen (PCT-Patent Nr. 93-17093). Darüber hinaus wurde die Herstellung eines Gens, das ein Enzym des &agr;,&agr;-Trehalose-Stoffwechsels codiert, versucht. Jedes dieser obigen Verfahren verwendet Glucose oder dgl. als Zuckerquelle und macht sich einem Stoffwechselsystem zu nutze, das ATP und/oder UTP als Energiequelle erfordert. Diese Verfahren erfordern daher ein kompliziertes Reinigungsverfahren, um &agr;,&agr;-Trehalose aus dem Kulturmedium zu erhalten. Einige Untersuchungen wurden in Richtung der Herstellung über ein enzymatisches Verfahren unternommen unter Verwendung von zum Beispiel Trehalosephosphorylase (geprüftes japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 63-60998) oder Trehalase (offengelegtes japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 7-51063). Diese Verfahren beinhalten jedoch einige Probleme bei der Großherstellung der Enzyme, der Stabilität der Enzyme und andere. Sämtliche Verfahren des oben beschriebenen Standes der Technik weisen Probleme auf, wie eine niedrige Ausbeute, Komplexität bei dem Reinigungsverfahren, geringe Herstellung und Komplexität bei der Herstellung des Enzyms. Daher ist bisher kein Verfahren, das industrielle Anwendbarkeit findet, etabliert worden. Unter diesen Umständen besteht das starke Verlangen nach einem Verfahren zur effizienteren Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose.

Wie oben beschrieben, ist &agr;,&agr;-Trehalose verbreitet in der Natur aufgefunden worden und deren Existenz in Archaebakterien wurde ebenfalls bestätigt (System. Appl. Microbiol. 10, 215, 1988). Genauer gesagt, haben Lama et al., herausgefunden, wie oben erwähnt, daß eine wärmestabile Stärke-hydrolysierende Aktivität in einem Zellextrakt aus einer Archaebakterium-Art besteht, und zwar dem Sulfolobus solfataricus-Stamm MT-4 (DSM 5833), und haben die Existenz von &agr;,&agr;-Trehalose in dem hydrolysierten Produkt bestätigt [Biotech. Forum. Eur. 8, 4, 2-1 (1991), zuvor zitiert]. In diesem Artikel wird berichtet, daß die Aktivität auf die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose und Glucose aus Stärke zurückzuführen ist. Dieser Artikel enthält tatsächlich nur ein Beispiel bei dem das Substrat 0,33 % lösliche Stärke war, wobei die dadurch hergestellt &agr;,&agr;-Trehalose-Menge äußerst gering war und dazu das Verhältnis hergestellte &agr;,&agr;-Trehalose zu hergestellter Glucose 1:2 entsprach. Demzufolge ist ein Isolierungsverfahren notwendig, um Glucose, die in einer großen Menge als Nebenprodukt hergestellt wird, zu entfernen und die Absicht, ein Verfahren zur Großherstellung von &agr;,&agr;-Trehalose zu etablieren, ist in keiner Weise erreicht worden.

Die Erfinder haben, wie oben beschrieben, festgestellt, daß Archaebakterien, die der Ordnung Sulfolobales angehören, eine Transferase herstellen, die auf ein Saccharid als Substrat wirkt, wobei das Substrat Saccharid sich aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, um die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen. Darüber hinaus entwickelten die Erfinder ein Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen, aus Maltooligosacchariden unter Verwendung dieses Enzyms. Das Trehaloseoligosaccharid ist hier ein Maltooligosaccharid, dessen reduzierendes Ende mit einer &agr;-1,&agr;-1-Bindung modifiziert ist.

Zwischenzeitlich gibt es keinen Bericht, soweit die Erfinder wissen, über ein zuvor bekanntes Enzym, das auf ein Trehaloseoligosaccharid einwirkt, das von einem Maltooligosaccharid abstammt, durch Übertragen der ersten Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung und das speziell die &agr;-1,4-Bindung neben der &agr;-1,&agr;-1-Bindung hydrolysieren kann, um &agr;,&agr;-Trehalose in hoher Ausbeute freizusetzen. Mit anderen Worten kann eine herkömmliche Amylase kein Trehaloseoligosaccharid speziell an der &agr;-1,4-Bindung zwischen dem zweiten und dritten Glucoserest vom reduzierenden Ende hydrolysieren, um &agr;,&agr;-Trehalose freizusetzen. Es würde daher der Großherstellung von &agr;,&agr;-Trehalose ausgesprochen zunutze kommen, wenn eine Amylase entwickelt werden würde, wobei eine solche Amylase die Reaktion bei der Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose katalysieren kann, sowie auch die &agr;-1,4-Bindung in der Molekularkette von Stärke oder einem Stärke-Hydrolysat hydrolysieren kann.

Darüber hinaus erfordert die Großherstellung von &agr;,&agr;-Trehalose, daß das neue Enzym in einer großen Menge gewonnen wird. Hierfür ist es bevorzugt, ein Gen zu erhalten, das die Amylase codiert und das Enzym auf gentechnische Art und Weise herstellt. Darüber hinaus, wenn ein solches Gen erhalten werden kann, ist ebenfalls zu erwarten, daß unter Verwendung von Proteinbiotechnik ein Enzym erhalten werden kann, das eine verbesserte Wärmestabilität, verbesserte pH-Stabilität und eine erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit aufweist.

Darüber hinaus ist es eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ein neues Verfahren zur effizienten Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose mit hoher Ausbeute aus einem preiswerten Rohmaterial, wie Stärke, einem Stärke-Hydrolysat und Maltooligosacchariden unter Verwendung des Enzyms bereitzustellen.

Die Erfinder haben energisch Stärke-hydrolysierende Aktivität abstammend von Archaebakterien untersucht. Als Ergebnis haben die Erfinder festgestellt, daß eine wärmestabile Stärke-hydrolysierende Aktivität in Zellextrakten aus verschiedenen Archaebakterien vorkommt, die der Ordnung Sulfolobales und genauer gesagt der Gattung Sulfolobus angehören. Es wurde festgestellt, daß die durch Stärkehydrolyse hergestellten Saccharide Glucose und &agr;,&agr;-Trehalose sind, ähnlich wie in der Beschreibung des Artikels von Lama et al. Die Erfinder untersuchten anschließend die Extrakte verschiedener Bakterienstämme auf Eigenschaften der Stärke-hydrolysierenden Aktivität. Als Ergebnis stellten die Erfinder fest, daß die durch solche Stämme hergestellten Enzyme Enzymmischungen sind, die verschieden Amylasen vom Endo- oder Exotyp umfassen, wie verflüssigende Amylase und Glucoamylase und Transferase hinsichtlich der Enzymaktivität, wie Stärke-hydrolysierenden Aktivität und &agr;,&agr;-Trehalose-herstellenden Aktivität. Außerdem wurden solche enzymatischen Aktivitäten dem Synergismus der Aktivitäten dieser gemischten Enzyme zugeordnet. Wenn das von Lama et al. vorgeschlagene Aktivitätsmeßverfahren bei der Reinigung jedes Enzyms eingesetzt wird, wobei der Index die Abnahme der blauen Farbe, die von der Iod-Stärkereaktion abstammt, ist, resultierte die Reinigung jedes Enzyms mit einer solchen Aktivität insgesamt in einer niedrigen Ausbeute und es wurde festgestellt, daß ein solches Reinigungsverfahren sehr schwierig ist. Diese Vorkommnisse könnten einer niedrigen Empfindlichkeit und niedrigen Fähigkeit, die Menge bei dem Aktivitätsmeßverfahren zu bestimmen, zugeordnet werden. Die genaue Untersuchung der Erfinder ergab drüber hinaus, daß die Reinigung und Isolierung gar nicht erreicht werden kann, wenn das Teilreinigungsverfahren, das in dem Artikel von Lama et al. beschrieben ist, für das Protein eingesetzt wird.

Unter solchen Umständen haben die Erfinder weitere Untersuchungen unternommen und herausgefunden, daß ein neues Aktivitätsmeßverfahren, bei dem Substrat ein Trehaloseoligosaccharid, wie Maltotriosyltrehalose ist, und bei dem der Index die Aktivität der Freisetzung von &agr;,&agr;-Trehalose ist. Bei der Anwendung dieses Meßverfahrens wurde erkannt, daß die Amylaseaktivität unter Verwendung eines solchen Verfahrens leicht nachgewiesen werden kann. Die Erfinder versuchten daraufhin die Reinigung des Enzyms zu erreichen, das eine solche Aktivität in verschiedenen Bakterienstämmen aufweist und es gelang ihnen letztlich eine solche Amylase zu reinigen und isolieren. Darüber hinaus untersuchten die Erfinder die Enzymeigenschaften der isolierten und gereinigten Amylase und stellten überraschenderweise fest, daß das so erhaltene Enzym einen neuen Wirkmechanismus aufweist, nämlich den der durch die folgenden Eigenschaften beschrieben werden kann:

Das Enzym entfaltet eine Aktivität Stärke oder Stärkehydrolysat zu hydrolysieren, die vom Endotyp ist;

das Enzym entfaltet Aktivität ein Stärkehydrolysat, ein Maltooligosaccharid oder dgl. vom reduzierenden Ende zu hydrolysieren, um Monosaccharide und/oder Disaccharide herzustellen;

das Enzym entfaltet eine höhere Reaktivität auf ein Saccharid, das sich mindestens aus drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei die Bindung zwischen dem ersten und zweiten Glucoserest vom reduzierenden Ende &agr;-1,&agr;-1 ist und die Bindung zwischen dem zweiten und dritten Glucoserest vom gleichen Ende &agr;-1,4 ist (zum Beispiel Trehaloseoligosaccharide) im Vergleich mit der Reaktivität zu jenem der entsprechenden Maltooligosaccharide; und

das Enzym Aktivität aufweist auf solche Substrat-Saccharide zu wirken, die sich aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzen, um dadurch &agr;,&agr;-Trehalose freizusetzen, indem die &agr;-1,4-Bindung zwischen dem zweiten und dritten Glucoseresten vom reduzierenden Ende hydrolysiert wird.

Offenbarung der Erfindung I. Transferase

Die Erfindung stellt eine Transferase (hiernach als "erfindungsgemäße neue Transferase" oder einfach als "erfindungsgemäßes Enzym" oder "das vorliegende Enzym" bezeichnet), die auf ein Substrat-Saccharid wirkt, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-verbunden sind, um die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist es eine Transferase bereitzustellen, die auf ein Maltooligosaccharid-Substrat wirkt, wobei alle Glucosereste des Maltooligosaccharids &agr;-1,4-verbunden sind, um die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen.

Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Transferase bereit, wobei ein Bakterium, das eine Transferase mit solchen Aktivitäten herstellen kann, in einem Kulturmedium kultiviert wird und die Transferase aus der Kultur auf Basis eines Aktivitätsmeßverfahrens isoliert und gereinigt wird, wobei das Substrat ein Maltooligosaccharid ist und der Index die Aktivität ist, Trehaloseoligosaccharide herzustellen.

Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Saccharids bereit, das sich an einem Ende aus einigen &agr;-1,&agr;-1-verbundenen Zuckereinheiten zusammensetzt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das erfindungsgemäße Enzym verwendet wird und auf ein Substrat-Saccharid wirken kann, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, um ein Zielsaccharid herzustellen, indem mindestens drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,4 ist.

Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Trehaloseoligosaccharids bereit, wobei das erfindungsgemäße Enzym verwendet wird, und das Substrat jeweils Maltooligosaccharide oder eine Mischung davon ist.

Zusätzlich ist es eine erfindungsgemäße Aufgabe ein Gen bereitzustellen, das die Transferase codiert.

Darüber hinaus ist es eine erfindungsgemäße Aufgabe eine rekombinante neue Transferase und ein Verfahren zur Herstellung desselben unter Verwendung des oben erwähnten Gens bereitzustellen.

Darüber hinaus ist es eine erfindungsgemäße Aufgabe ein effizientes Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose und Maltoglucosyltrehalose unter Verwendung einer rekombinanten neuen Transferase bereitzustellen.

Demzufolge umfaßt das DNA-Fragment, das auf der vorliegenden Erfindung basiert, ein Gen, das eine neue Transferase codiert, die auf ein Substrat-Saccharid wirkt, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, um die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen.

Darüber hinaus ist die erfindungsgemäße rekombinante neue Transferase das Produkt, das durch Expression des oben erwähnten DNA-Fragmentes erhalten wird.

Zudem umfaßt das Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen rekombinanten neuen Transferase:

das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit dem oben erwähnten Gen transformiert ist,

das Herstellen der rekombinanten neuen Transferase in Kultur und

das Sammeln der Produkte.

II. Kombination aus der obigen Transferase mit einer Amylase

Darüber hinaus umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose einen Schritt, bei dem eine rekombinante Amylase und die obige Transferase mit einem Saccharid, bei dem mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, in Kontakt gebracht wird, wobei die Transferase auf ein Substrat-Saccharid wirkt, und sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, um die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen.

Die Amylase wirkt auf ein Substrat-Saccharid, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Zuckereinheiten vom reduzierenden Ende Glucosereste sind, um prinzipiell Monosaccharide und/oder Disaccharide durch hydrolysieren des Substrats von der Seite des reduzierenden Endes freizusetzen.

Die Amylase weist hauptsächlich Aktivität auf ein Substrat-Saccharid zu wirken, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,4 ist, um &agr;,&agr;-Trehalose durch hydrolysieren der &agr;-1,4-Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten freizusetzen.

Die Amylase weist Aktivität ein oder mehrere &agr;-1,4-Bindungen in der Molekularkette des Substrat-Endotyps zu hydrolysieren sowie die oben beschriebene Aktivität auf.

Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der zuvor genannten Amylase, wobei ein Bakterium, das die obige erfindungsgemäße Amylase herstellen kann, in einem Kulturmedium kultiviert wird und anschließend die Amylase aus der Kultur auf Basis eines Aktivitätsmeßverfahrens isoliert und gereinigt wird, bei dem das Substrat ein Trehaloseoligosaccharid ist und der Index die Aktivität der Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose ist.

Die Erfinder ermöglichten, daß die erfindungsgemäße obige Amylase zusammen mit der zuvor genannten erfindungsgemäßen Transferase auf ein Glucosid-Rohmaterial, wie Stärke, Stärke-Hydrolysat und Maltooligosaccharide wirken kann und festgestellt, daß &agr;,&agr;-Trehalose dadurch effizient mit hoher Ausbeute hergestellt werden kann.

Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose bereit, wobei die obige erfindungsgemäße Amylase und Transferase zusammen verwendet werden.

Zusätzlich ist es eine erfindungsgemäße Aufgabe eine neue Amylase und ein Gen, das dieselbe codiert, bereitzustellen.

Darüber hinaus ist es eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe eine rekombinante neue Amylase und ein Verfahren zur Herstellung derselben unter Verwendung des zuvor genannten Gens bereitzustellen.

Darüber hinaus ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe eine Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Verwendung einer rekombinanten neuen Amylase bereitzustellen.

Daher umfaßt das Gen, das die erfindungsgemäße Amylase codiert, eine DNA-Sequenz, die die neue Amylase codiert und die die folgenden Aktivitäten aufweist:

  • (1) Aktivität eine &agr;-1,4-Glucosidbindung in einer Zuckerkette Entotyp zu hydrolysieren;
  • (2) Aktivität auf ein Substrat-Saccharid zu wirken, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Zuckereinheiten vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebundene Glucosereste sind, um prinzipiell Monosaccharide oder Disaccharide durch Hydrolysieren des Substrats von der Seite des reduzierenden Endes freizusetzen; und
  • (3) prinzipiell Aktivität auf ein Substrat-Saccharid einzuwirken, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,4 ist, um durch Hydrolysieren der &agr;-1,4-Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten &agr;,&agr;-Trehalose freizusetzen.

Darüber hinaus ist die rekombinante neue erfindungsgemäße Amylase ein Produkt das durch Expression des oben beschriebenen Gens erhalten wird.

Eine thermostabile amylolytische Aktivität aus Sulfolobus solfataricus die Trehalose aus verschiedenen Substraten freisetzten kann, ist von Lama et al. in Biotech, Forum Eur. Bd. 8, Nr. 4, April 1991, S. 201-203 beschrieben worden.

Yong, K. et al., Biotechnology Letters, Bd. 14, Nr. 7, Juli 1992, S. 547-551 beschreiben eine Glusoyltransferase, die einen Glucoserest an der Position &agr;-1,6 überträgt.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

1 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit dem Produkt durchgeführt wurde, das in Beispiel I-1 unter Verwendung des Zellextraktes, das von dem Sulfolobus sulfataricus-Stamm KM1 abstammt, erhalten wurde.

2 ist ein Diagramm, das die die Thermostabilität der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird.

3 ist ein Diagramm, das die pH-Stabilität der vorliegenden Transferase zeigt, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird.

4 ist ein Diagramm, das die Reaktivität der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, bei jeder untersuchten Temperatur zeigt.

5 ist ein Diagramm, das den optimalen pH der Reaktion der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, zeigt.

6 ist ein Diagramm, das das Muster der von Maltotriose abstammenden Reaktionsprodukte unter Verwendung der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, zeigt.

7 ist ein Diagramm, das das Muster der von Maltotetraose abstammenden Reaktionsprodukte unter Verwendung der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, zeigt.

8 ist ein Diagramm, das das Muster der von Maltopentaose abstammenden Reaktionsprodukt unter Verwendung der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, zeigt.

9 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt durchgeführt wird, das aus einer Mischung von Maltooligosacchariden stammt unter Verwendung der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird.

10 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt durchgeführt wird, das von Maltotriosyltrehalose abstammt, wobei es das mit der rohen Enzymlösung, die in Beispiel II-1 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert wird.

11 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt durchgeführt wird, das von löslicher Stärke abstammt, wobei es mit der rohen Enzymlösung, die in Beispiel II-1 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert wird.

12 ist ein Diagramm, das die Thermostabilität der vorliegenden Amylase zeigt, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird.

13 ist ein Diagramm, das die pH-Stabilität der vorliegenden Amylase zeigt, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird.

14 ist ein Diagramm, das die Reaktivität der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, bei jeder untersuchten Reaktionstemperatur zeigt.

15 ist ein Diagramm, das den optimalen pH der Reaktion der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, zeigt.

16 ist ein Diagramm, das die Reaktivität der vorliegenden Amylase bei verschiedenen Substraten zeigt, wobei die Amylase in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird.

17 enthält Diagramme, die die Ergebnisse der Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit den Reaktionsprodukten durchgeführt wird, die von Maltopentaose, Amylose DP-17 und löslicher Stärke jeweils abstammen, wobei diese mit der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert werden.

18 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt durchgeführt wird, das von Maltrotriosyltrehalose abstammt, wobei es mit der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert wird.

19 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, das mit dem Reaktionsprodukt durchgeführt wird, das von Maltopentaosyltrehalose abstammt, wobei es mit der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert wird.

20 ist ein Diagramm, das die Änderungen des Verschwindens der Farbe, die durch Iod erzeugt wird, mit der Zeit zeigt und den Stärke-hydrolysierenden Prozentsatz zeigt, wenn die vorliegende Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, auf lösliche Stärke einwirkt.

21 ist ein Diagramm, das die Änderung der Radioaktivität des Reaktionsproduktes, das von radioaktiv markierter Maltopentaose abstammt, die der Reaktion mit der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, unterworfen wird, mit der Zeit zeigt.

22 ist ein Diagramm, das die Änderung der Radioaktivität des Reaktionsproduktes, das von radioaktiv markierter Maltotriosyltrehalose abstammt, und das mit der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert wird, mit der Zeit zeigt.

23 ist ein Graph, der die Reaktivität von &agr;-Amylase, die aus der Schweinebauchspeicheldrüse abstammt, auf verschiedene Substrate zeigt.

24 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit Reaktionsprodukt, das von Maltopentaosyltrehalose abstammt, durchgeführt wird, wobei dieses mit der &agr;-Amylase, die vom der Schweinebauchspeicheldrüse abstammt, reagiert wird.

25 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt, das von löslicher Stärke abstammt, durchgeführt wird, wobei dieses mit Transferase und der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert wird.

26 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte jedes einzelnen eingeführten Fragmentes pKT1, pKT11 oder pKT21, die ein Gen enthalten, das die neue Transferase codiert und das in Beispiel I-12 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, zeigt.

27 ist eine Darstellung, die ein Verfahren zur Herstellung des Plasmids pKT22 zeigt.

28 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit dem Produkt, das von Maltotriose abstammt, unter Verwendung der rekombinanten neuen Transferase durchgeführt wird.

29 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte des eingeführten Fragmentes pO9T1, enthaltend ein Gen, das die neue Transferase codiert, und das in Beispiel I-16 aus dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 erhalten wird, zeigt.

30 ist eine Darstellung, die ein Verfahren zur Herstellung des Plasmids pO9T1 zeigt.

31 ist eine Darstellung, die die Homologie zwischen der Aminosäuresequenz der neuen Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt und der die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt, zeigt.

32 ist eine Darstellung, die die Homologie zwischen der Basensequenz des Gens, das die neue Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, codiert und der, die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt, zeigt.

33 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit dem Produkt, das von einer Maltooligosaccharid-Mischung abstammt, unter Verwendung der rekombinanten neuen Transferase durchgeführt wird, zeigt.

34 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte des eingeführten Fragmentes pKA1, das ein Gen enthält, das die neue Amylase codiert, und vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, zeigt.

35 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte von pKA2 zeigt.

36(A) ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse zeigt, die mit dem Produkt durchgeführt wird, das von Maltotriosyltrehalose abstammt, unter Verwendung der rekombinanten erfindungsgemäßen neuen Amylase, und 36(B) ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse zeigt, die mit dem Produkt durchgeführt wird, die von löslicher Stärke abstammt, unter Verwendung der rekombinanten erfindungsgemäßen neuen Amylase.

37 ist ein Diagramm, das die Änderungen des Verschwindens der Farbe, die durch Iod erzeugt wird, und den Stärke-hydrolysierenden Prozentsatz mit der Zeit zeigt, wenn die rekombinante erfindungsgemäße neue Amylase auf lösliche Stärke einwirkt.

38 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte des eingeführten Fragmentes p09A1 zeigt, das ein Gen enthält, das die neue Amylase codiert, und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt.

39 ist eine Darstellung dieses Verfahrens, das die Herstellung von p09A1 aus p09A2 zeigt.

40 ist eine Darstellung, die die Homologie zwischen der Aminosäuresequenz der neuen Amylase, die von dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt und der, die von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, zeigt.

41 ist eine Darstellung, die die Homologie zwischen der Basensequenz des Gens, das die neue Amylase codiert, die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt und der, die von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, zeigt.

42 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse zeigt, die mit dem Produkt, das von 10 % löslicher Stärke abstammt, durchgeführt wird, wobei es mit der rekombinanten neuen Amylase, die in Beispiel II-19 erhalten wird, und der rekombinanten neuen Transferase, die in Beispiel I-20 erhalten wird, reagiert wird.

Beste Ausführungsform der Erfindung Hinterlegung der Mikroorganismen

Der nachfolgend genannte neue Bakterienstamm KM1, der aus der Natur durch die Erfinder im wesentlichen rein isoliert wurde, wurde beim National Research Institutes, the Life Science Laboratory for Industry am 1. April 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4626 hinterlegt.

Der Escherichia coli-Stamm JM109/pKT22, der mit dem erfindungsgemäßen Plasmid pKT22 (siehe unten beschriebenes Beispiel I-14) transformiert ist, und der Escherichia coli-Stamm JM109/p09T1, der mit dem Plasmid p09T1 (siehe unten beschriebenes Beispiel I-16) transformiert ist, die erfindungsgemäße neue Transferase codieren, wurden jeweils beim National Research Institute, the Life Science Laboratory for Industry am 21. Oktober 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4843 und am 9. Mai 1995 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5093 hinterlegt.

Der Escherichia coli-Stamm JM109/pKA2, der mit dem erfindungsgemäßen Plasmid pKA2 transformiert ist (siehe unten beschriebenes Beispiel II-19) und der Escherichia coli-Stamm JM109/p09A1, der mit dem Plasmid p09A1 transformiert ist (siehe unten beschriebenes Beispiel II-22), die das Gen enthalten, das die erfindungsgemäße neue Amylase codiert, wurden jeweils beim National Research Institutes, the Life Science Laboratory for Industry am 31. Oktober 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4857 und am 9. Mai 1995 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5092 hinterlegt.

I. Neue Transferase Mikroorganismen, die die erfindungsgemäße neue Transferase herstellen

Die Archaebakterien, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können den Sulfolobus solfataricus-Stamm ATCC 35091 (DSM 1616), den Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833, den Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 (den unten beschriebenen neuen Bakterienstamm, der aus der Natur von den Erfindern im wesentlichen rein isoliert wurde), den Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 (DSM 639) und den Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 umfassen.

Wie oben beschrieben, können eine ziemlich große Anzahl an Archaebakterien, die taxonomisch unter der Ordnung Sulfolobales klassifiziert werden, zu denen die Gattungen Sulfolobus und Acidianus gehören, als Mikroorganismen verstanden werden, die die erfindungsgemäßen neue Transferase herstellen. Hier sind die Archaebakterien, die zur Ordnung Sulfolobales gehören, als acidophil und thermophil definiert, wobei sie aerob sind und Schwefelbakterien sind (Coccen-Bakterien). Der zuvor genannte Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651, der der Gattung Acidianus angehört, wurde zuvor als Sulfolobus brierleyi-Stamm DSM 1651 klassifiziert und der zuvor genannte Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 wurde Caldariella acidophila genannt. Aufgrund dieser Tatsachen können Mikroorganismen, die eng mit den oben beschriebenen Archaebakterien genetisch oder taxonomisch verwandt sind und die das Enzym der gleichen Art herstellen können, erfindungsgemäß verwendet werden.

Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1

Unter den oben aufgeführten Mikroorganismen, ist der Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 der Bakterienstamm, den die Erfinder aus einer heißen Quelle in Gunma Prefecture isolierten und der die folgenden Eigenschaften entfaltet.

(1) Morphologische Eigenschaften

Die Form und Größe des Bakteriums: Coccenähnlich (keine reguläre Form) und einen Durchmesser von 0,6-2 &mgr;m.

(2) Optimale Wachstumsbedingungen
  • pH: Kann bei einem pH von 3-5,5 wachsen und optimal bei einem pH von 3,5-4,5.
  • Temperatur: kann in einem Temperaturbereich von 55-85°C wachsen und optimal in einem Temperaturbereich von 75-80°C.
  • Fähigkeit Schwefel zu metabolisieren.
(3) Klassifizierung im Hinblick auf aerob oder anaerob: Aerob

Gemäß der obigen Eigenschaften wurde die Identifizierung des Bakterienstamms auf Basis von Bergey's Handbuch über systematische Bakteriologie Band 3 (1989) durchgeführt. Der Stamm wurde aufgrund dessen als einer von Sulfolobus solfataricus eingestuft und folglich als Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 benannt.

Beim Kultivieren des obigen Bakterienstammes kann das zu verwendende Kulturmedium entweder flüssig oder fest sein und gewöhnlich wird eine Erschütterungskultivierung oder eine Kultivierung mit Sauerstoff und Rühren unter Verwendung eines flüssigen Kulturmediums durchgeführt. Mit anderen Worten besteht keine Einschränkung bei dem zu verwendenden Kulturmedium solange es sich für das Bakteriumwachstum eignet und geeignete Beispiele solcher Kulturmedien können umfassen das Sulfolobus solfataricus-Medium, das im Katalog von Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC) und im Katalog der Stämme, 5. Ausgabe (1993), veröffentlicht von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) umfassen. Stärke, Maltooligosaccharid und/oder dgl. können als Zuckerquelle zugegeben werden. Darüber hinaus sind die Kulturbedingungen nicht limitiert solange sie auf der oben beschriebenen Temperatur und dem oben beschriebenen pH basieren, der das Wachstum sicherstellt.

Kultivierung der Mikroorganismen, die die neue erfindungsgemäße Transferase herstellen

Die Kulturbedingungen zum Herstellen der erfindungsgemäßen neuen Transferase können geeignet innerhalb eines Bereichs ausgewählt werden, bei dem die Zieltransferase hergestellt werden kann. Wenn eine Erschütterkungskultivierung oder eine Kultivierung unter Sauerstoff und Rühren unter Verwendung eines flüssigen Mediums eingesetzt wird, sollte das Kultivieren 2-7 Tage bei einem pH und einer Temperatur durchgeführt werden, die das Wachstum jedes Mikroorganismus ermöglichen. Das Kulturmedium das sich eignet, ist zum Beispiel das Sulfolobus solfataricus-Medium, das im Katalog über Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC), und im Katalog der Stämme, 5. Ausgabe (1993), veröffentlicht von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), beschrieben ist. Stärke, Maltooligosaccharid und/oder dgl. können als Zuckerquelle darüber hinaus zugegeben werden.

Reinigung der erfindungsgemäßen neuen Transferase

Die erfindungsgemäße neue Transferase, die durch oben beschriebenen Mikroorganismen hergestellt wird, kann wie folgt extrahiert werden. Zunächst werden die Bakterienkörper aus der Kultur gesammelt, die beim Kultivierungsverfahren, das oben beschrieben ist, durch öffentlich bekannte Verfahren erhalten wird, zum Beispiel durch Zentrifugierung; die Resultante wird in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert, die Bakterienkörper werden anschließend durch Gefrierauftauen, eine Ultraschallbehandlung, Zermahlen und/oder dgl. zerstoßen; und die Resultante wird zentrifugiert oder filtriert, um ein Zellextrakt zu erhalten, das die Zieltransferase enthält.

Zum Reinigen der erfindungsgemäßen neuen Transferase, die in dem Zellextrakt enthalten ist, können öffentlich bekannte Verfahren zur Isolierung und Reinigung in geeigneter Kombination eingesetzt werden. Beispiele solcher Verfahren können ein Verfahren umfassen, das die Löslichkeit nutzt, wie Salzausfällung und Lösungsmittelausfällung, ein Verfahren, das den Unterschied im Molekulargewicht nutzt, wie Dialyse, Ultrafiltrierung, Gelfiltrierung und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, ein Verfahren, das den Unterschied der elektrischen Ladung nutzt, wie Ionenaustauscherchromatographie, ein Verfahren, das die spezifische Affinität nutzt, wie Affinitätschromatographie, ein Verfahren, das den Unterschied der Hydrophobie nutzt, wie hydrophobe Chromatographie und Umkehrphasenchromatographie und darüber hinaus ein Verfahren, das den Unterschied des isoelektrischen Punktes nutzt, wie isoelektrische Fokussierung. Praktische Beispiele dieser Verfahren sind in Beispielen I-2 - I-5 nachfolgend gezeigt. Schließlich wird native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese oder isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um ein gereinigtes Enzym zu erhalten, das daran einzelne Bande erscheint.

Hinsichtlich der Messung der Aktivität des Enzyms oder der Enzym-enthaltenden Substanz, die durch die oben beschriebenen verschiedenen Reinigungsverfahren isoliert wurde, wird Stärke als Substrat in dem Aktivitätsmeßverfahren, das von Lama et al. angeboten wird, verwendet. Durch dieses Verfahren kann die Herstellung von Trehaloseoligosacchariden überhaupt nicht nachgewiesen werden, obgleich die Herstellung von Trehalose und Glucose bestätigt werden kann, und ein ernsthaftes Problem ist es, daß sogar die Trehalose-herstellende Aktivität aufgrund ihres Verschwindens während der Reinigung nicht nachweisbar wird. Die Reinigung und Charakterisierung der echten Substanz der Enzymaktivität ist daher im wesentlichen unmöglich gewesen. Unter diesen Umständen setzten die Erfinder ein neues Aktivitätsmeßverfahren ein, bei dem das Substrat ein Maltooligosaccharid, wie Maltotriose, ist und der Index die Aktivität ist, mit der ein Trehaloseoligosaccharid, wie Glucosyltrehalose, hergestellt wird. Als Folge konnte die Isolierung und Reinigung des Zielenzyms zum ersten Mal durch dieses Verfahren erreicht werden und letztlich konnte die echte Substanz der neuen erfindungsgemäßen Transferaseaktivität so gut wie gereinigt und spezifiziert werden.

Eigenschaften der neuen erfindungsgemäßen Transferase

Als Beispiele des erfindungsgemäßen Enzyms sind die Transferasen zu nennen, die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm KM1, von Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833, vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 und vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 hergestellt werden, und die enzymatischen Eigenschaften dieser Transferasen sind unten in der Zusammenfassung in Tabelle 1 gezeigt. Die Daten in der Tabelle basieren hier auf den praktischen Beispielen, die in Beispielen I-6 und I-7 gezeigt sind.

Bemerkung 1: Zeitlicher Verlauf der Änderung

Wenn Maltotriose als Substrat verwendet wurde, wurde Glucosyltrehalose als Produkt bei der Hauptreaktion hergestellt und außerdem wurden gleiche Molmengen an Maltose und Glucose als Erzeugnisse bei einer Nebenreaktion hergestellt.

Wenn ein Saccharid mit einem Polymerisierungsgrad, n, der gleich oder höher als der von Maltotretaose ist, verwendet wurde, wurde ein Saccharid, bei dem der Glucoserest am reduzierenden Ende &agr;-1,&agr;-1-gebunden ist in der Hauptreaktion hergestellt und daneben wurden gleiche Molmengen an Glucose und einem Saccharid, bei dem der Polymerisierungsgrad n-1 ist, in einer Nebenreaktion erzeugt.

Bemerkung 2: Enzymwirkung, Enzymreaktionsweise

Es ist zu berücksichtigen, daß das Enzym Aktivität auf Maltotriose oder auf ein größeres Saccharid zu wirken, aufweist, wobei drei Glucosereste vom reduzierenden Ende des Saccharids &agr;-1,4-gebunden sind, um die erste Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen. Als Nebenreaktion weist das Enzym zudem Aktivität auf Glucose aus einem Glucosepolymer freizusetzen, wenn zum Beispiel die Konzentration des Substrats niedrig ist oder die Reaktionszeit lang ist. Die Einzelheiten sind im Praxisbeispiel von Beispiel I-7 gezeigt.

Die Eigenschaften des vorliegenden Enzyms sind oben beschrieben worden. Wie in dem obigen Punkt mit dem Titel "Enzymwirkung/Enzymwirkungsmechanismus" beschrieben ist, weist das vorliegende Enzym Aktivität auf Maltotriose oder auf ein größeres Saccharid zu wirken, auf, wobei drei Glucosereste vom reduzierenden Ende des Saccharids &agr;-1,4-gebunden sind, um die erste Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen, und eine solche Aktivität ist genaugenommen eine neue Enzymaktivität. Jedoch, wie durch die nachfolgenden Beispiele erkennbar ist, unterscheiden sich die Eigenschaften des vorliegenden Enzyms außer solcher Enzymaktivitäten etwas hinsichtlich der Unterschiede der Gattung oder Art unter den Bakterienstämmen.

Herstellung von Trehaloseoligosacchariden wie Glucosyltrehalose oder Maltooligosyltrehalose

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Saccharides bereit, das ein Ende aufweist, das sich aus ein paar &agr;-1,&agr;-1-gebundenen Zuckereinheiten zusammensetzt, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß das erfindungsgemäße Enzym verwendet wird und auf das Substrat-Saccharid wirken kann, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Zuckereinheiten vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, um das Zielsaccharid herzustellen, bei dem mindestens drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,4 ist. Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend anhand des am meisten typischen Beispiels dargestellt, nämlich durch ein Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen.

Bei dem Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen werden erfindungsgemäß Trehaloseoligosaccharide, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen aus einem Saccharid, wie Maltooligosacchariden üblicherweise aus jedem oder einer Mischung aus Maltooligosacchariden durch das erfindungsgemäße Enzym, das von Archaebakterien abstammt, hergestellt. Folglich ist die Kontaktart zwischen der vorliegenden Transferase und einem Saccharid, wie Maltooligosacchariden, nicht besonders eingeschränkt solange das vorliegende Enzym, das von den Archaebakterien hergestellt wird, auf das Saccharid, wie auf Maltooligosaccharide, in einer solchen Weise wirken kann. In der Praxis kann das folgende Verfahren wie folgt durchgeführt werden: Ein Rohenzym wird aus Bakterienkörpern oder zertrümmerten Bakterienkörpern eines Archaebakteriums erhalten und das gereinigte Enzym, das in jedem der unterschiedlichen Reinigungsschritte erhalten wird, oder das Enzym, das durch verschiedene Reinigungswege isoliert und gereinigt wird, wird direkt auf ein Saccharid, wie auf Maltooligosaccharide eingewirkt. Alternativ kann das oben beschriebene Enzym mit einem Saccharid, wie Maltooligosacchariden in Form eines immobilisierten Enzyms, das auf einem Träger auf eine gewöhnliche Art und Weise immobilisiert ist in Kontakt gebracht werden. Zusätzlich können zwei oder mehrere der vorliegenden Enzyme, die aus zwei oder mehreren Arten von Archaebakterium abstammen, coexistieren und mit einem Saccharid, wie Maltooligosacchariden in Kontakt gebracht werden.

Die Mischung aus Maltooligosacchariden, die ein gewöhnliches Rohmaterial aus dem Substrat in dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren ist, kann zum Beispiel hergestellt werden durch geeignetes Hydrolysieren oder Azidolysieren von Stärke unter Verwendung einer Amylase vom Endotyp, einem Debranching-Enzym oder dgl., so daß mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende des Produktes &agr;-1,4-gebunden sind. Die hier verwendeten Amylasen vom Endotyp können Enzyme umfassen, die von Bakterien abstammen, die zur Gattung Bacillus gehören, Pilze aus der Gattung Aspergillus und Pflanzen, wie Malz und dgl. Auf der anderen Seite können die hier verwendeten Debranching-Enzyme Pullulanase umfassen, die von Bakterien abstammt, die zur Gattung Bacillus, Klebsiella oder dgl. gehören oder Isoamylase, die aus Bakterien, die zur Gattung Pseudomonas gehören, abstammen. Darüber hinaus können diese Enzyme in Kombination verwendet werden.

Die Konzentration eines Saccharids, wie von Maltooligosacchariden, sollte innerhalb eines Bereiches ausgewählt werden, bei dem sich das zu verwendende Saccharid löst, unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität des vorliegenden Enzyms, der Reaktionstemperatur und dgl. Ein Bereich von 0,5-70 % ist gewöhnlich und ein Bereich von 5-40 % ist bevorzugt. Die Reaktionstemperatur und der pH bei der Reaktion des Saccharids mit dem Enzym sollte für die vorliegende Transferase optimal sein. Folglich wird die Reaktion gewöhnlich ungefähr bei 50-85°C und einem pH von 3,5-6,5 und bevorzugt bei 60-80°C und einem pH von 4,5-6,0 durchgeführt.

Die hergestellte Reaktionsmischung, die Trehaloseoligosaccharide enthält, wie Glucosyltrehalose oder Maltooligosyltrehalose kann nach in der Öffentlichkeit bekannten Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel wird die erhaltene Reaktionsmischung mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt; die Zielsaccharidfraktion wird anschließend isoliert und kristallisiert durch Chromatographie unter Verwendung von Aktivkohle, einem Ionenaustauscherharz (HS03-Typ), einem Kationenaustauscherharz (Ca-Typ) oder dgl. als Trennmaterial und durch eine nachfolgende Kondensierung, die optional durchgeführt wird und schließlich können Trehaloseoligosaccharide mit einer hohen Reinheit erhalten werden.

Ein Gen, das die neue Transferase codiert

Erfindungsgemäß wird ein Gen, das die neue Transferase codiert, bereitgestellt. Zum Beispiel können die DNA-Fragmente, die durch die in 26 und 29 gezeigten Restriktionskarten dargestellt sind, als DNA-Fragment auf geführt werden, die ein Gen umfassen, das die neue erfindungsgemäße Transferase codiert.

Dieses DNA-Fragment kann aus einem Archaebakterium erhalten werden, das zur Ordnung Sulfolobales gehört und bevorzugt zur Gattung Sulfolobus gehört. Bevorzugter kann das Fragment aus dem oben beschriebenen Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 isoliert werden. Das geeignete Verfahren zur Isolierung aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 ist im Detail in den unten beschriebenen Beispielen dargestellt.

Die praktischen Beispiele in bezug auf den Ursprung, aus dem die DNA-Fragmente abstammen können, können darüber hinaus umfassen die Sulfolobus solfataricus-Stämme DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092; den Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 49426, den Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, den Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 und andere. Aus den folgenden Fakten ist erkennbar, daß diese Archaebakterien die Ursprünge der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente sein können: Das neue Transferasegen, das vom Sulfolobus solfataricus KM1 abstammt, bildet mit der chromosomalen DNA, die von jedem dieser Archaebakterien abstammt, in dem nachfolgend beschriebenen Hybridisierungstest, der in Beispiel I-17 durchgeführt wird, ein Hybrid und darüber hinaus ähneln sich die Eigenschaften dieser Enzyme selbst sehr stark untereinander, wie oben beschrieben ist. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse in dem zuvor genannten Beispiel andeutungsweise, daß das neue erfindungsgemäße Transferasegen stark konserviert ist, insbesondere in Archaebakterien die zur Ordnung Sulfobales gehören.

Die bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein DNA-Fragment bereit, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die die Aminosäuresequenz codiert, die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, als geeignetes Beispiel des Gens, das die neue erfindungsgemäße Transferase codiert, zeigt. Darüber hinaus kann die Sequenz von der 335. Base bis zur 2518. Base von der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 1 gezeigt ist, als geeignetes Beispiel der DNA-Sequenz genannt werden, die die Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 2 gezeigt ist, codiert. Die Sequenz von der 816. Base zur 2855. Base von der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 3 gezeigt ist, als geeignetes Beispiel der DNA-Sequenz aufgeführt werden, die die Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 4 gezeigt ist, codiert.

Im allgemeinen wenn die Aminosäuresequenz eines Proteins bekannt ist, kann die Basensequenz, die dafür codiert, leicht unter Bezug auf die sogenannte Codon-Tabelle bestimmt werden. Daher können verschiedene Basensequenzen, die für die Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, passend ausgewählt werden. Demzufolge beinhaltet erfindungsgemäß "die DNA-Sequenz, die die in Sequenz Nr. 2 gezeigte Aminosäure codiert, die DNA-Sequenz, umfassend die Sequenz aus der 335. Base bis zur 2518. Base der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 1 gezeigt ist und darüber hinaus die DNA-Sequenzen, die die gleiche Basensequenz umfassen, außer daß ein oder mehrere Codone mit Codonen ausgetauscht werden, die eine Beziehung zur Degeneration aufweisen und die die Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 2 gezeigt ist, immer noch codieren. In ähnlicher Weise beinhaltet "die DNA-Sequenz, die die in Sequenz Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz codiert" die DNA-Sequenz, die die Sequenz aus der 816. Base bis zur 2855. Base der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 3 gezeigt ist, umfaßt und darüber hinaus die DNA-Sequenzen, die die gleiche Basensequenz umfassen, außer daß ein oder mehrere Codone mit Codonen ausgetauscht sind, unter Berücksichtigung der Beziehung der Degeneration und die immer noch die Aminosäure, die in Sequenz Nr. 4 gezeigt ist, codieren.

Darüber hinaus, wie nachfolgend beschrieben, umfaßt die neue erfindungsgemäße Transferase ebenfalls Sequenzen, die mit der Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, äquivalent sind. Das erfindungsgemäße DNA-Fragment umfaßt daher ebenfalls Basensequenzen, die solche äquivalente Sequenzen codieren.

Im übrigen überprüften die Erfinder die Existenz einer Basensequenz, die mit der in Sequenz Nr. 1 oder 3 gezeigten Basensequenz homolog ist in einer Datenbank von Basensequenzen (EMBL) unter Verwendung der Sequenz-analysierenden Software GENETYX (von Software Development Co.). Als Folge haben die Erfinder bestätigt, daß eine solche Basensequenz nicht existiert.

Da die Basensequenz des DNA-Fragmentes, umfassend die Sequenz der 335. Base bis zur 2518. Base der in Sequenz Nr. 1 gezeigten Basensequenz und die Basensequenz des DNA-Fragmentes, umfassend die Sequenz der 816. Base bis zur 2518. Base der in Sequenz Nr. 3 gezeigten Basensequenz, bestimmt wurden, basiert ein Weg dieses DNA-Fragment zu erhalten auf einem Verfahren der Nukleotidsynthese.

Darüber hinaus können diese Sequenzen unter Verwendung eines Verfahrens der Gentechnik aus den oben beschriebenen Archaebakterien erhalten werden, die zur Ordnung Sulfolobales gehören und bevorzugt aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909. Zum Beispiel können sie durch ein Verfahren erhalten werden, das beschrieben ist in Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Sambrook, Maniatis et al., veröffentlicht von Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)] und anderen. Das Praxisverfahren wird in den nachfolgenden Beispielen detailliert dargestellt.

Rekombinante neue Transferase

Da das Gen, das die neue Transferase codiert, wie oben beschrieben bereitgestellt wird, kann das exprimierte Erzeugnis aus diesem Gen, eine rekombinante neue Transferase, erfindungsgemäß erhalten werden.

Geeignete Beispiele der erfindungsgemäßen neuen Transferase können einschließen ein exprimiertes Erzeugnis aus dem DNA-Fragment, das durch die Restriktionskarte, die in 26 oder 29 gezeigt ist, dargestellt ist.

Darüber hinaus können geeignete Beispiele ein Polypeptid einschließen, umfassend die Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 2 oder 4 der Sequenztabelle gezeigt ist, oder die äquivalente Sequenz davon. Hier bedeutet der Ausdruck "äquivalente Sequenz" eine Aminosäuresequenz, die im Prinzip die Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, aufweist, aber die Insertion, Austausch oder Deletion einiger Aminosäuren oder Addition von einigen Aminosäuren an jedem Terminus unterlag und weiterhin die Aktivität der neuen Transferase behält. Das Stadium, bei dem die äquivalente Sequenz die Aktivität der neuen Transferase behält, bedeutet, daß es eine Aktivität behält, die ausreicht um in ähnlicher Weise unter gleichen Bedingungen eingesetzt zu werden im Vergleich zu dem Polypeptid mit der vollständigen Sequenz, die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, wenn die Aktivität auf praktische Weise eingesetzt wird. Selbstverständlich kann der Fachmann eine solche "äquivalente Sequenz" auswählen und herstellen, indem ohne besondere Schwierigkeiten Bezug genommen wird auf Sequenzen, die in Sequenzen Nrn. 2 und 4 gezeigt sind, da in Beispiel I-18 offenbart wird, daß die gleiche Aktivität bei Enzymen beibehalten wird, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammen, obgleich die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen der neuen Transferasen von diesen zwei Stämmen 49 % ist, wenn sie unter Berücksichtigung von Lücken berechnet wird.

Wie in Beispiel I-17 unten verdeutlicht, kann jede der DNA-Fragmente, Sequenzen, die jeweils in Sequenz Nr. 1 und 3 gezeigt sind, aufweisen mit jedem der DNA-Fragmente hybridisieren, die von einigen Bakterienstämmen außer dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 und dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammen, die jeweils die Ursprünge der besagten DNA-Fragmente sind. Indessen, wie oben beschrieben, haben die Erfinder jetzt die Existenz einer neuen Transferase mit sehr engen Eigenschaften in diesen Bakterienstämmen bestätigt. Darüber hinaus, wie in Beispiel I-18 unten verdeutlicht, ist die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen der neuen Transferasen, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammen, 49 %, wenn sie unter Berücksichtigung von Lücken berechnet wurde. Es ist daher für den Fachmann ersichtlich, daß die Aktivität der neuen Transferase beibehalten werden kann in einer Sequenz, die zu einem gewissen Ausmaß mit der Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, homolog ist.

Im übrigen überprüften die Erfinder die Existenz einer Sequenz, die mit der Aminosäuresequenz die mit der Sequenz Nr. 2 oder 3 homolog ist, mittels einer Datenbank über Aminosäuresequenzen (Swiss prot and NBRF-PFB) unter Verwendung einer Sequenz-analysierenden Software GENETYX (von Software Development Co.). Als Ergebnis haben die Erfinder bestätigt, daß eine solche Sequenz nicht existiert.

Extraktion eines Gens, das die neue Transferase codiert

Die erfindungsgemäße rekombinante Transferase kann in einer Wirtszelle durch Transformieren der Wirtszelle mit einem DNA-Molekül hergestellt werden und insbesondere mit einem Expressionsvektor, der sich in der Wirtszelle replizieren kann und das DNA-Fragment das die erfindungsgemäße neue Transferase codiert, enthält, um das Transferasegen zu exprimieren.

Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus ein DNA-Molekül und insbesondere einen Expressionsvektor bereit, der ein Gen enthält, das die neue erfindungsgemäße Transferase codiert. Ein solches DNA-Molekül kann durch Integrieren des DNA-Fragmentes, das die erfindungsgemäße neue Transferase codiert, in ein Vektormolekül erhalten werden. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Vektor ein Plasmid.

Das erfindungsgemäße DNA-Molekül kann auf Basis des Verfahrens hergestellt werden, das im zuvorgenannten Molecular Cloning: Ein Laborhandbuch beschrieben ist.

Der erfindungsgemäße verwendete Vektor kann entsprechend aus Viren, Plasmiden, Cosmid-Vektoren und anderen ausgewählt werden unter Berücksichtigung des zu verwendenden Typs der Wirtszelle. Zum Beispiel kann ein Bakteriophage des &lgr;-Phagen-Typs ein Plasmid des pBR- oder pUC-Typs verwendet werden, wenn die Wirtszelle Escherichia coli ist, ein Plasmid vom pUB-Typ kann verwendet werden, wenn die Wirtszelle Bacillus subtilis ist, und ein Vektor vom YEp- oder YCp-Typ kann verwendet werden, wenn die Wirtszelle Hefe ist.

Das Plasmid kann bevorzugt einen selektiven Marker zum Nachweis der Transformante enthalten, und ein medikamentenresistenter Marker und ein auxotropher Marker können als solcher Selektionsmarker verwendet werden.

Weiterhin sollte das erfindungsgemäße DNA-Molekül als Expressionsvektor bevorzugt DNA-Sequenzen enthalten, die zur Expression des neuen Transferasegens notwendig sind, zum Beispiel ein Transkriptions-Kontrollsignal, ein Translations-Kontrollsignal und/oder dgl. wie ein Promotor, ein Transkriptions-Anfangssignal, eine Ribosomen-Bindungsstelle, ein Translations-Stoppsignal und ein Transkriptions-Endsignal.

Beispiele der Promotoren, die sich eignen sowie ein Promotor, der funktional in dem Wirt ist, der ein Insertionsfragment enthält, können umfassen einen Promotor, wie ein Lactose-Operon (lac) und ein Tryptophan-Operon (trp) bei Escherichia coli, einen Promotor, wie ein Alkoholdehydrogenasegen (ADH), ein Säurephosphatasegen (PHO), ein Galactosegen (GAL) und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasegen (GPD) bei Hefe.

Die Basensequenz, umfassend die Sequenz von der 1. bis zur 2578. Base der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 1 gezeigt ist und die Basensequenz, umfassend die Sequenz von der 1. Base bis zur 3467. Base der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 3 gezeigt ist, sind bekannt die zuvor genannten Sequenzen, die für die Expression notwendig sind, zu enthalten. Diese Sequenzen eignen sich daher, so wie sie sind, verwendet zu werden.

Darüber hinaus, wenn die Wirtszelle Baciullus subtilis oder Hefe ist, würde es von Vorteil sein, einen Sekretionsvektor zu verwenden, um die rekombinante neue Transferase außerhalb des Körpers des Wirts auszuscheiden.

Darüber hinaus können Escherichia coli, Bacillus subtilis und Hefe und hochentwickelten Eukaryonten als Wirtszelle verwendet werden.

Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus gehören, wie Bacillus subtilis, eignen sich. Von einigen Stämmen die zu dieser Gattung gehören ist bekannt, daß sie ein Protein außerhalb des bakteriellen Körpers in einer großen Menge ausscheiden. Eine große Menge der rekombinanten neuen Amylase kann daher in das Kulturmedium unter Verwendung eines Sekretionsvektors ausgeschieden werden. Dies ist bevorzugt, da die Reinigung aus dem Überstand des Kultur leicht sein wird. Darüber hinaus ist von einigen Stämmen, die zur Gattung Bacillus gehören bekannt, daß sie eine kleine Menge einer Protease aus dem bakteriellen Körper ausscheiden. Es ist bevorzugt solche Stämme zu verwenden, da die rekombinante neue Amylase dadurch effizient hergestellt werden kann. Es ist sehr von Vorteil einen Mikroorganismus auszuwählen, der keine Glucoamylase herstellt und diesen als Wirtszelle zu verwenden, da die erfindungsgemäße rekombinante neue Transferase, die in dem Zellextrakt vorhanden ist, oder ein einfach gereinigtes Rohenzym direkt für die nachfolgend beschriebene Herstellung von Trehaloseoligosacchariden verwendet werden kann.

Die rekombinante neue Transferase, die durch den zuvor genannten Transformanten hergestellt wird, kann wie folgt erhalten werden:

Zunächst wird die oben beschriebene Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert, die Bakterienkörper werden aus der resultierenden Kultur durch ein der Öffentlichkeit bekanntes Verfahren gesammelt, zum Beispiel durch Zentrifugierung und in einer geeignete Pufferlösung suspendiert, die Bakterienkörper werden anschließend durch Gefrierauftauen, einer Ultraschallbehandlung, Zermahlen und/oder dgl. zertrümmert und die Resultante wird zentrifugiert oder filtriert, um ein Zellextrakt zu erhalten, das die rekombinante neue Transferase enthält.

Reinigung der rekombinanten neuen Transferase, die dem Zellextrakt existiert, kann durch eine geeignete Kombination von in der Öffentlichkeit bekannten Verfahren zur Isolierung und Reinigung durchgeführt werden. Beispiele der Verfahren können umfassen ein Verfahren, das einen Unterschied in der Wärmestabilität ausnutzt, wie eine Wärmebehandlung, ein Verfahren, das sich den Unterschied in der Löslichkeit zunutze macht, wie Salzausfällung und Lösungsmittelausfällung, ein Verfahren, das einen Unterschied im Molekulargewicht ausnutzt, wie Dialyse, Ultrafiltrierung, Gelfiltrierung und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, ein Verfahren, das einen Unterschied in elektrischer Ladung ausnutzt, wie Ionenaustauscherchromatographie, ein Verfahren, das sich die spezifische Affinität zunutze macht, wie Affinitätschromatographie, ein Verfahren, das einen Unterschied in der Hydrophobizität ausnutzt, wie hydrophobe Chromatographie und Umkehrphasenchromatographie und darüber hinaus ein Verfahren, das einen Unterschied im isoelektrischen Punkt ausnutzt, wie isoelektrisches Fokussieren. Da die rekombinante neue Transferase thermostabil ist, kann die Reinigung sehr leicht unter Verwendung einer Wärmebehandlung durchgeführt werden, wodurch Proteine in dem Wirt denaturiert und einer Ausfällung unterworfen werden können, um die Entfernung zu ermöglichen.

Herstellung von Trehaloseoligosacchariden unter Verwendung der rekombinanten neuen Transferase

Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines sogenannten Trehaloseoligosaccharids, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose bereit, wobei die oben beschriebene rekombinante neue Transferase verwendet wird.

Genauer gesagt ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Herstellung eines Trehaloseoligosaccharids, bei dem mindestens drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,4 ist. Darüber hinaus umfaßt das Verfahren das Inkontaktbringen der oben beschriebenen rekombinanten Transferase mit einem Saccharid, wobei sich das Saccharid zusammensetzt aus mindestens drei Zuckereinheiten, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind.

Obgleich das Saccharid, das sich aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, nicht besonders eingeschränkt ist, können Stärke, Stärkehydrolysat, Maltooligosaccharide und andere als Beispiel eines solchen Saccharids aufgeführt werden. Beispiele des Stärkehydrolysats können umfassen ein Erzeugnis, das hergestellt wird durch geeignetes Hydrolysieren oder Azidolysieren von Stärke unter Verwendung einer Amylase vom Endotyp, eines "Debranching"-Enzyms oder dgl., so daß mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende des Produktes &agr;-1,4 gebunden sind. Beispiele der Amylase vom Endotyp, die hier verwendet wird, können umfassen Enzyme, die von Bakterien abstammen, die zur Gattung Bacillus gehören, Pilze, die zur Gattung Aspergillus gehören und Pflanzen, wie Malz und andere. Auf der anderen Seite können Beispiele des "Debranching"-Enzyms Pullulanase umfassen, die von Bakterien abstammt, die zur Gattung Bacillus, Klebsiella oder dgl. gehören oder eine Isoamylase, die von Bakterien abstammt, die zur Gattung Pseudomonas gehören. Darüber hinaus können diese Enzyme in Kombination verwendet werden.

Der Weg und die Bedingungen des Inkontaktbringens zwischen der rekombinanten erfindungsgemäßen neuen Transferase und dem Saccharid, das sich aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, sind nicht besonders eingeschränkt solange die rekombinante neue Transferase auf das Saccharid wirken kann. Ein Beispiel eines geeigneten Weges zum Durchführen des Inkontaktbringens in einer Lösung ist wie folgt. Die Konzentration eines Saccharids, wie Maltooligosacchariden, sollte passend innerhalb des Bereichs ausgewählt werden, in dem das zu verwendende Saccharid sich auflöst, unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität der rekombinanten neuen Transferase, der Reaktionstemperatur und anderen. Ein Bereich von 0,5-70 % ist gewöhnlich und ein Bereich von 5-40 % ist bevorzugt. Die Reaktionstemperatur und die pH-Bedingung bei der Reaktion des Saccharids mit dem Enzym sollte optimal für die rekombinante neue Transferase sein. Folglich wird die Reaktion gewöhnlich ungefähr bei 50-85°C und pH 3,5-6,5 und bevorzugt bei 60-80°C und pH 4,5-6,0 durchgeführt.

Darüber hinaus kann der Reinigungsgrad der rekombinanten neuen Transferase passend ausgewählt werden. Zum Beispiel kann ein Rohenzym, das von den zetrümmerten Körpern einer Transformante abstammt so wie es ist verwendet werden und das gereinigte Enzym, das bei jedem der verschiedenen Reinigungsschritte erhalten wird, kann ebenfalls verwendet werden und darüber hinaus kann das Enzym, das durch verschiedene Reinigungsschritte isoliert und gereinigt wird, verwendet werden.

Alternativ kann das oben beschriebene Enzym mit einem Saccharid, wie Maltooligosaccharid in einer Form eines immobilisierten Enzyms, das auf einem Träger auf eine gewöhnliche Weise immobilisiert ist, in Kontakt gebracht werden.

Die hergestellten Trehaloseoligosaccharide, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose können durch Reinigung aus der Reaktionsmischung unter Verwendung eines der Öffentlichkeit bekannten Verfahrens gewonnen werden. Zum Beispiel wird die erhaltene Reaktionsmischung mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt, die Zielsaccharidfraktion wird anschließend isoliert und kristallisiert durch Chromatographie unter Verwendung von Aktivkohle, einem Ionenaustauscherharz (HSO3-Typ), einem Kationenaustauscherharz (Ca-Typ) oder dgl. als Trennmaterial, wobei eine anschließende Kondensierung optional durchgeführt werden kann und schließlich werden Trehaloseoligosaccharide in einer hohen Reinheit erhalten.

II. Neue Amylase Mikroorganismen zur Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Amylase

Beispiele von Archaebakterien, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können umfassen den Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 (den oben beschriebenen neuen Bakterienstamm, der aus der Natur von den Erfindern im wesentlichen rein isoliert wurde), den Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 und dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 (DSM 639).

Wie oben beschrieben, kann eine verhältnismäßig große Anzahl an Archaebakterien, die taxonomisch unter der Ordnung Sulfolobales klassifiziert wird, als Mikroorganismen betrachtet werden, die die erfindungsgemäßen neue Amylase herstellen können. Die Archaebakterien, die zur Gattung Sulfolobales gehören, sind hier taxonomisch definiert als daß sie azidophil (in einem Temperaturbereich von 55-88°C wachsen können), thermophil (in einem pH-Bereich von 1-6 wachsen können), aerob und Schwefelbakterien (Coccalbakterien mit keiner regulären Form und einem Durchmesser von 0,6-2 &mgr;m) sind. Der zuvor genannte Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 wurde zuvor als Caldariella acidophila benannt. Aufgrund dieser Tatsachen können Mikroorganismen, die in den zuvor genannten Archaebakterien genetisch oder taxonomnisch eng verwandt sind und die das Enzym von der gleichen Art herstellen können und Mutanten, die von diesen Stämmen durch mit Behandlung mit verschiedenen Mutagenen abstammen, erfindungsgemäß verwendet werden.

Unter den oben erläuterten Mikroorganismen ist der Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 der Bakterienstamm, den die Erfinder aus einer heißen Quelle in Gunma Prefecture isolierten und die Eigenschaften und die Hinterlegung dieses Stammes sind detailliert oben beschrieben worden.

Kultivierung von Mikroorganismen, die die erfindungsgemäße neue Amylase herstellen

Die Kulturbedingungen zur Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Amylase können passend innerhalb der Bereiche ausgewählt werden in denen die Zielamylase hergestellt werden kann. Wenn eine Erschütterungskultivierung oder eine Kultivierung mit Belüftung und Rühren unter Verwendung eines flüssigen Mediums eingesetzt wird, sollte die 2-7-tägige Kultivierung bei einem pH und einer Temperatur in geeigneter Weise durchgeführt werden, die das Wachstum jedes Mikroorganismus ermöglichen. Die Kultur, die sich zur Verwendung eignet, ist zum Beispiel jedes Kulturmedium das beschrieben ist im Katalog über Bakterien und Phagen 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC) und im Katalog über Stämme, 5. Ausgabe (1993), veröffentlicht von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM). Stärke, Maltooligosaccharid und/oder dgl. können als Zuckerquelle darüber hinaus zugegeben werden.

Reinigung der erfindungsgemäßen neuen Amylase

Die erfindungsgemäße neue Amylase, die durch oben beschriebenen Mikroorganismen hergestellt wird, kann wie folgt extrahiert werden. Zunächst werden die Bakterienkörper aus der Kultur gesammelt, die bei den oben beschriebenen der Öffentlichkeit bekannten Kultivierungsverfahren erhalten werden, zum Beispiel durch Zentrifugierung, die Resultante wird in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert, die Bakterienkörper werden anschließend durch Gefrierauftauen, durch eine Ultraschallbehandlung und durch Zermahlen und/oder dgl. zertrümmert und die Resultante wird zentrifugiert oder filtriert, um ein Zellextrakt zu erhalten, das die Zielamylase enthält.

Zur Reinigung der erfindungsgemäßen neuen Amylase, die in dem Zellextrakt enthalten ist, können in der Öffentlichkeit bekannte Verfahren zur Isolierung und Reinigung in einer geeigneten Kombination eingesetzt werden. Beispiele solcher Verfahren können umfassen ein Verfahren, das die Löslichkeit ausnutzt, wie Salzausfällung und Lösungsmittelausfällung, ein Verfahren, das sich einen Unterschied im Molekulargewicht zunutze macht, wie Dialyseultrafiltrierung, Gelfiltrierung und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, ein Verfahren, das sich einen Unterschied in der elektrischen Ladung zunutze macht, wie Ionenaustauscherchromatographie, ein Verfahren, das die spezifische Affinität ausnutzt, wie Affinitätschromatographie, ein Verfahren, das sich einen Unterschied in der Hydrophobizität zunutze macht, wie hydrophobe Chromatographie und Umkehrphasenchromatographie und außerdem ein Verfahren, das sich einen Unterschied im elektrischen Punkt zunutze macht, wie isoelektrische Fokussierung. Die praktischen Beispiele dieser Verfahren sind in den Beispielen II-2 - II-4 unten gezeigt. Letztlich wird native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese oder isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um ein gereinigtes Enzym zu erhalten, das darin als einzelne Bande auftritt.

Hinsichtlich der Messung der Aktivität des Enzyms oder der Enzym-enthaltenden Substanz, die durch die oben beschriebenen Reinigungsverfahren isoliert wird, wird Stärke als Substrat in dem Aktivitätsmeßverfahren, das von Lama et al. angeboten wird, verwendet. Bei diesem Verfahren kann, wenn unterschiedliche Amylasen in dem Reaktionssystem zusammen existieren, die Herstellung von Stärkehydrolysat nachgewiesen werden. Wenn jedes der individuell isolierten Erzeugnisse dieser Amylasen verwendet wird, wird sowohl die Nachweissensitivität als auch die quantifizierende Fähigkeit im Gegensatz dazu niedrig und als schweres Problem wird die Stärke-hydrolysierende Aktivität wegen seines Verschwindens während der Reinigung nicht nachweisbar. Die Reinigung und Charakterisierung der wahren Substanz der Enzymaktivität ist daher fast unmöglich gewesen. Unter solchen Umständen haben die Erfinder ein neues Aktivitätsmeßverfahren eingesetzt, bei dem das Substrat ein Trehaloseoligosaccharid, wie Maltotriosyltrehalose ist und der Index die Aktivität es in &agr;,&agr;-Trehalose und Maltooligosaccharide, wie Maltotriose zu hydrolysieren ist. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß dieses Verfahren eine äußerst hohe Spezifität, Nachweissensitivität und quantifizierende Fähigkeit aufweist und die Isolierung und Reinigung des Zielenzyms konnte zum ersten Mal erreicht werden und schließlich konnte die tatsächliche Substanz der neuen erfindungsgemäßen Amylaseaktivität praktisch gereinigt und spezifiziert werden.

Eigenschaften der neuen erfindungsgemäßen Amylase

Als Beispiele des erfindungsgemäßen Enzyms, werden die Amylasen, die durch den Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, den Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 und dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 (DSM 639) aufgenommen und die Enzymeigenschaften dieser Amylasen sind in Tabelle 2 nachfolgend in der Zusammenfassung gezeigt. Hier basieren die Daten in der Tabelle auf den praktischen Beispielen, die in Beispiel II-5 gezeigt sind.

Bemerkung 1: Zeitlicher Verlauf der Änderung

Wenn lösliche Stärke als Substrat verwendet wurde, verschwindet der Iodstärkekomplex im Anfangsstadium der Enzymreaktion und anschließend verläuft die Hydrolysierungsreaktion weiter, um Maltose und Glucose als Haupterzeugnisse und Maltotriose und Maltotetraose in kleinen Mengen herzustellen.

Bemerkung 2: Enzymwirkung/Enzymreaktionsweise

Das vorliegende Enzym stellt hauptsächlich Glucose und Maltose her und stellt kleine Maltotriose- und Maltotetraosemengen her, wenn Stärke, Stärkehydrolysat und/oder Maltooligosaccharid als Substrat verwendet werden. Hinsichtlich der Wirkmechanismen, hat das vorliegende Enzym eine Amylaseaktivität vom Endotyp, um diese Substrate zu hydrolysieren und eine Aktivität Monosaccharid und/oder Disaccharid von der Seite des reduzierenden Endes hauptsächlich herzustellen.

Insbesondere hat das Enzym eine hohe Reaktivität auf ein Saccharid zusammengesetzt aus drei Zuckereinheiten, wobei die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,4 ist (zum Beispiel Trehaloseoligosaccharid). Wenn diese Saccharide als Substrat verwendet werden, weist das Enzym Aktivität auf, die &agr;-1,4-Bindung zwischen dem zweiten und drittem Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes zu hydrolysieren und insbesondere &agr;,&agr;-Trehalose im Anfangsstadium der Reaktion freizusetzen.

Folglich kann das vorliegende Enzym als eine neue Amylase erkannt werden. Die Details sind praktisch in Beispiel II-5 beschrieben.

Die Eigenschaften des vorliegenden Enzyms sind oben beschrieben worden. Jedoch wie aus Tabelle 2 und den nachfolgenden Beispiele ersichtlich ist, wurde festgestellt, daß sich die Eigenschaften des vorliegenden Enzyms außer den enzymatischen Eigenschaften unterscheiden gemäß den Unterschieden in der Gattung oder der Art unter den Bakterienstämmen.

Zu verwendende Transferase bei der Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose

Die erfindungsgemäße Transferase, die im Detail unter den oben beschriebenen Punkt "I. Neue Transferase" beschrieben ist, kann zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispiele einer solchen Transferase können genauer gesagt Transferasen umfassen, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm ATCC 35091 (DSM 1616), vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833, vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 (DSM 639) und vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 abstammen.

Diese Transferasen können zum Beispiel hergestellt werden gemäß den Verfahren, die nachfolgend in den Beispielen I-2 - I-5 beschrieben sind. Die so erhaltenen Transferasen haben verschiedene Eigenschaften, die in dem nachfolgenden Beispiel I-6 gezeigt sind.

Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose bereit, unter Verwendung der neuen Amylase und Transferase gemäß der Erfindung. Das Verfahren gemäß der Erfindung wird nachfolgend an einem typischen Beispiel dargestellt, nämlich mit einem Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose aus einem Glucid-Rohmaterial wie Stärke, Stärkehydrolysat und/oder Maltooligosaccharid. Die wahrscheinlichen Reaktionsmechanismen der obigen zwei Enzyme sind wie folgt anzusehen: Zunächst wirkt die neue erfindungsgemäße Amylase auf Stärke, Stärkehydrolysat oder Maltooligosaccharid durch ihre Hydrolysierungsaktivität vom Endotyp, um Amylose oder Maltooligosaccharid herzustellen, daraufhin wird die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende der resultierende Amylose oder dem resultierenden Maltooligosaccharid in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung durch die Aktivität der Transferase überführt, weiter wirkt die neue Amylase wieder, um &agr;,&agr;-Trehalose und Amylose oder Maltooligosaccharid, das um einen Polymerisierungsgrad von zwei verringert ist, herzustellen und die Amylase oder das so erhaltene Maltooligosaccharid unterliegt den obigen Reaktionen wiederholt, so daß &agr;,&agr;-Trehalose in einer hohen Ausbeute hergestellt wird.

Solche Reaktionsmechanismen können auf den spezifischen Reaktionsweg, der von der erfindungsgemäßen neuen Amylase besessen wird, wie folgt zugeordnet werden: Das Enzym weist eine höhere Reaktivität auf ein Saccharid zusammengesetzt aus mindestens drei Zuckereinheiten, wobei die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten an der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 gebunden ist, während die Bindung zwischen dem zweiten und dritten Glucoserest vom reduzierenden Ende eine &agr;-1,4-Bindung ist (zum Beispiel Trehaloseoligosaccharid) im Vergleich mit der Reaktivität jedes der entsprechenden Maltooligosaccharide auf, und setzt &agr;,&agr;-Trehalose frei.

Soweit die Erfinder wissen, ist bisher keine Amylase bekannt, die auf Maltooligosyltrehalose, die vom Maltooligosaccharid abstammt durch Modifizieren des reduzierenden Endes mit einer &agr;-1,&agr;-1-Bindung und die eine Aktivität aufweist, speziell die &agr;-1,4-Bindung neben der &agr;-1,4-Bindung zu hydrolysieren, wirkt, um &agr;,&agr;-Trehalose in hoher Ausbeute freizusetzen. Demzufolge ist es fast unmöglich gewesen, &agr;,&agr;-Trehalose in hoher Ausbeute herzustellen.

Bei dem Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose gemäß der Erfindung ist die Art des Inkontaktbringens zwischen der vorliegenden Amylase und Transferase und der Stärke, dem Stärkehydrolysat und/oder Maltooligosacchariden nicht besonders eingeschränkt, solange die Amylase der Erfindung (das vorliegende Enzym) von Archaebakterien hergestellt wird, die auf Stärke, Stärkehydrolysat und/oder Maltooligosaccharid auf eine solche Weise wirken. Praktisch kann das folgende Verfahren wie folgt durchgeführt werden: Ein Rohenzym wird aus Bakterienkörpern oder zertrümmerten Bakterienkörpern eines Archaebakteriums erhalten, und das gereinigte Enzym, das in jedem der verschiedenen Reinigungsschritte erhalten wird, oder das Enzym, das durch verschiedene Reinigungswege isoliert und gereinigt wird, wird direkt auf Glucid, wie Stärke, Stärkehydrolysat und Maltooligosaccharid eingewirkt. Alternativ kann das so erhaltene Enzym mit Glucid wie Stärke, Stärkehydrolysat und Maltooligosaccharid in einer Form eines immobilisierten Enzyms, das auf einem Träger immobilisiert ist, in Kontakt gebracht werden. Zusätzlich können zwei oder mehrere der vorliegenden Enzyme, die von zwei oder mehreren Arten von Archaebakterien abstammen, coexistieren und mit Glucid, wie Stärke, Stärkehydrolysat und Maltooligosaccharid in Kontakt gebracht werden.

Bei dem Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose gemäß der Erfindung sollten die oben beschriebene Amylase und Transferase in Mengen innerhalb der optimalen Bereiche verwendet werden. Eine überschüssige Menge der Amylase wirkt auf Stärke, Stärkehydrolysat oder Maltooligosaccharid auf das die Transferase nicht gewirkt hat, um sein reduzierendes Ende zu modifizieren, während eine überschüssige Menge der Transferase in der Nebenreaktion das Trehaloseoligosaccharid, wie Maltooligosyltrehalose, das durch die Transferase selbst hergestellt wird, hydrolysiert, und Glucose hergestellt.

Die praktischen Konzentrationen der Amylase und Transferase im Verhältnis zu der Menge des Substrats sind jeweils 1,5 E/ml oder mehr und 0,1 E/ml oder mehr. Bevorzugt sollten die Konzentrationen jeweils 1,5 E/ml oder mehr 1,0 E/ml oder mehr und bevorzugter jeweils 15 E/ml oder mehr und 1,0 E/ml oder mehr sein. Währenddessen sollte das Verhältnis der Amylase-Konzentration zu der Transferase-Konzentration 100-0,075 und bevorzugt 40-3 sein.

Die Konzentration des Glucids wie Stärke, Stärkehydrolysat und Maltooligosaccharid sollte passend innerhalb des Bereiches ausgewählt werden, in dem das zu verwendende Glucid aufgelöst wird, unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität jedes zu verwendenden Enzyms, der Reaktionstemperatur und anderen. Ein Bereich von 0,5-70 % ist gewöhnlich und ein Bereich von 5-40 % ist bevorzugt. Die Reaktionstemperatur und die pH-Bedingung bei der Reaktion des Glucids mit dem Enzym sollte für die Amylase und die Transferase optimal sein. Folglich wird die Reaktion gewöhnlich bei 50-85°C und ungefähr pH 3,5-8, und bevorzugter bei 60-75°C und pH 4,5-6,0 durchgeführt.

Wenn das zu verwendende Glucid-Rohmaterial Stärke, Stärkehydrolysat oder dgl. mit einem hohen Polymerisierungsgrad ist, kann darüber hinaus die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose weiter gefördert werden unter Verwendung einer anderen verflüssigenden Amylase vom Endotyp als Zusatz. Ein solches "Debranching"-Enzym als Pullulanase und Isoamylase kann hier verwendet werden. Die Endotypamylase, Pullulanase, Isoamylase oder dgl. kann kein Enzym sein, das von Archaebakterien abstammt, und ist daher nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel kann die Amylase, die von Bakterien abstammt, die zur Gattung Baciullus gehören, Fungi, die zur Gattung Aspergillus gehören und Pflanzen wie Malz und andere verwendet werden. Das "Debranching"-Enzym kann Pullulanase (einschließlich thermostabiler Pullulanase), abstammend von Bakterien, die zur Gattung Bacillus, Klebsiella oder dgl. gehören, sein, oder Isoamylase, abstammend von Bakterien, die zur Gattung Pseudomonas gehören, sein. Diese Enzyme können außerdem in Kombination verwendet werden.

Die Zugabe einer überschüssigen Menge der Amylase verursacht wahrscheinlich die Herstellung von Glucose und Maltose, auf die die Transferase nicht wirkt. In ähnlicher Weise wird die Zugabe einer überschüssigen Menge eines "Debranching"-Enzyms wegen der Spaltung der 1,6-Bindung eine Verringerung der Löslichkeit des Substrats bewirken und zur Herstellung einer hochviskosen und unlöslichen Substanz (Amylose) führen. Aus diesem Grund sollten die Mengen der Amylase und des "Debranching"-Enzyms sorgfältig kontrolliert werden, um keine überschüssige Glucose, Maltose oder unlösliche Substanz herzustellen. Bei den "Debranching"-Enzymen sollte die Konzentration passend innerhalb eines Bereiches ausgewählt werden, indem eine unlösliche Substanz nicht hergestellt wird, unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität der vorliegenden Amylase, der Reaktionstemperatur und dgl. Wenn die Behandlung bei 40°C eine Stunde durchgeführt wird, liegt die gewöhnliche Konzentration im Verhältnis zum Substrat in einem Bereich von 0,01-100 E/ml und bevorzugt innerhalb eines Bereichs von 0,1-25 E/ml. (Hinsichtlich der Definition der Aktivität der "Debranching"-Enzyme wird auf Beispiele II-6, II-13 und II-14 verwiesen.) Das Verfahren zur Behandlung mit einem "Debranching"-Enzym kann eines der folgenden sein: Das Substrat wird mit dem "Debranching"-Enzym vor der &agr;,&agr;-Trehalose-herstellenden Reaktion vorbehandelt, oder dem "Debranching"-Enzym wird ermöglicht, mit der Amylase und Transferase bei einem der Stadien während der &agr;,&agr;-Trehalose-herstellenden Reaktion co-zu-existieren. Bevorzugt sollten die "Debranching"-Enzyme ein oder mehrmals bei jedem der Stadien verwendet werden, und insbesondere sollten sie ein- oder mehrmals bei jedem der frühen Stadien verwendet werden. Wenn ein thermostabiles "Debranching"-Enzym verwendet wird, können ähnliche Wirkungen durch nur einmalige Zugabe bei einem der Stadien oder frühen Stadien während der &agr;,&agr;-Trehalose-herstellenden Reaktion entfaltet werden.

Die erzeugte Reaktionsmischung, die &agr;,&agr;-Trehalose enthält, kann gemäß einem der Öffentlichkeit bekannten Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel wird die erhaltene Reaktionsmischung mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt; die Zielsaccharidfraktion wird anschließend isoliert und durch Chromatographie unter Verwendung von Aktivkohle, einem Ionenaustauscherharz (HS03-Typ), einem Kationenaustauscherharz (Ca-Typ) oder dgl. als Trennmaterial kristallisiert und anschließend optional eine Kondensierung durchgeführt und schließlich wird &agr;,&agr;-Trehalose in hoher Reinheit erhalten.

Gen, das die neue Amylase codiert

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Gen bereit, das die obige neue Amylase codiert.

Die praktischen Beispiele des Gens, die die neue Amylase gemäß der Erfindung codiert, können DNA-Fragmente umfassen, die mit in 34 und 38 gezeigten Restriktionskarten dargestellt sind.

Diese DNA-Fragmente können von Archaebakterien abstammen, die zur Ordnung Sulfolobales gehören und bevorzugt können sie aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder aus dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909, wie unten beschrieben, isoliert werden. Das passende Verfahren zur Isolierung aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 wird nachfolgend in den Beispielen im Detail dargestellt.

Beispiele des Ursprungs aus dem solche DNA-Fragmente erhalten werden können, können außerdem einschließen die Sulfolobus solfataricus-Stämme DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092, den Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 49426. den Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389 und den Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651. Aus den folgenden Tatsachen ist ersichtlich, daß diese Archaebakterien die Ursprünge der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente sein können: Das neue Amylasegen, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 bildet mit der chromosomalen DNA, die von jeder dieser Archaebakterien abstammt, in dem nachfolgend beschriebenen Hybridisierungstest, der in Beispiel II-24 durchgeführt wird, ein Hybrid und außerdem ähneln sich die Eigenschaften dieser Enzyme untereinander, wie oben beschrieben, sehr stark. Die Ergebnisse in dem gleichen Beispiel deuten außerdem an, daß das erfindungsgemäße neue Amylasegen stark konserviert ist, insbesondere in Archaebakterien, die zur Ordnung Sulfolobales gehören.

Der bevorzugte Weg die vorliegende Erfindung auszuführen, stellt ein DNA-Fragment bereit, umfassend eine DNA-Sequenz, die die in Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, als geeignetes Beispiel des Gens, das die neue erfindungsgemäße Amylase codiert. Darüber hinaus kann die Basensequenz von der Base an Position 621 bis zur Base an Position 2315 von der in Sequenz Nr. 5 gezeigten Basensequenz als geeignetes Beispiel der DNA-Sequenz aufgeführt werden, die die in Sequenz Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz codiert. Die Sequenz von der Base an Position 1176 bis zur Base an Position 2843 von der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Basensequenz kann als geeignetes Beispiel der DNA-Sequenz aufgeführt werden, die die in Sequenz Nr. 8 gezeigte Aminosäuresequenz codiert.

Im allgemeinen kann bei Angabe der Aminosäuresequenz eines Proteins die Basensequenz, die dafür codiert, leicht bestimmt werden, indem auf die sogenannten Codontabelle Bezug genommen wird. Unterschiedliche Basensequenzen, die die Aminosäuresequenz, die in Sequenz 6 oder 8 gezeigt ist, können daher passend ausgewählt werden. Folglich bedeutet gemäß der Erfindung: "die DNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz in Sequenz Nr. 6 codiert, die DNA-Sequenz, umfassend die Sequenz von der Base an Position 642 bis zur Base an Position 2315 der in Sequenz Nr. 5 gezeigten Basensequenz und außerdem die DNA-Sequenz, die die gleiche Basensequenz umfaßt, außer daß ein oder mehrere Codone mit Codonen ausgetauscht sind, die mit der Degeneration in Beziehung stehen und die immer noch die in Sequenz Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz codieren. Ähnlich bedeutet "die DNA-Sequenz, die die in Sequenz 8 gezeigte Aminosäuresequenz codiert" die DNA-Sequenz, umfassend die Sequenz von der Base an Position 1176 bis zur Base an Position 2843 der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Basensequenz und außerdem die DNA-Sequenz, die die gleiche Basensequenz umfaßt, außer daß ein oder mehrere Codone mit Codonen ausgetauscht sind, die mit der Degeneration in Beziehung stehen, und immer noch die in Sequenz Nr. 8 gezeigte Aminosäure codiert.

Nachfolgend beschrieben, umfaßt der Umfang der erfindungsgemäßen neuen Amylase außerdem Sequenzen, die mit der Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigt ist, äquivalent sind. Der Umfang des erfindungsgemäßen DNA-Fragments umfaßt daher ebenfalls Basensequenzen, die solche äquivalenten Sequenzen codieren.

Der Umfang der erfindungsgemäßen neuen Amylase umfaßt eine Sequenz, umfassend die Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 6 gezeigt ist und einen Met-Rest zusätzlich am N-Terminus dieser Aminosäuresequenz zeigt. Folglich umfaßt der erfindungsgemäße Umfang des DNA-Fragments, das das Gen enthält, das die erfindungsgemäße neue Amylase codiert, außerdem Sequenzen von der Base an Position 639 bis zur Base an Position 2315 der in Sequenz Nr. 5 gezeigten Basensequenz.

Darüber hinaus überprüften die Erfinder die Existenz einer Basensequenz, die mit der in Sequenz Nr. 5 oder 7 gezeigten Basensequenz homolog ist, in einer Datenbank von Basensequenzen (EMBL) unter Verwendung der Sequenz-analysierenden Software, GENETYX (von Software Development Co.). Als Ergebnis haben die Erfinder bestätigt, daß eine solche Basensequenz nicht existiert.

Da die Basensequenz des DNA-Fragmentes, umfassend die Base an Position 639 oder 642 bis zur Base an Position 2315 der in Sequenz Nr. 5 gezeigten Basensequenz und die Basensequenz des DNA-Fragmentes, umfassend die Sequenz von der Base an Position 1176 bis zur Base an Position 2843 der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Basensequenz bestimmt wurden, ist eine Möglichkeit diese DNA-Fragmente zu erhalten, sie durch ein Polynukleotid-Syntheseverfahren herzustellen.

Diese Sequenzen können außerdem unter Verwendung eines Verfahrens der Gentechnik aus den oben beschriebenen Archaebakterien erhalten werden, die zur Ordnung Sulfolobales gehören, und bevorzugt aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909. Zum Beispiel können sie geeignet durch ein Verfahren erhalten werden, das in Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Sambrook, Maniatis et al., veröffentlicht von Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)] beschrieben ist. Das praktische Verfahren ist in den nachfolgend beschriebenen Beispiele im Detail erläutert.

Rekombinante neue Amylase

Da das Gen, das die neue Amylase codiert, wie oben beschrieben bereitgestellt werden kann, kann das exprimierte Erzeugnis dieses Gens, eine rekombinante neue Amylase, gemäß der Erfindung erhalten werden.

Geeignete Beispiele der rekombinanten erfindungsgemäßen neuen Amylase können umfassen ein exprimiertes Produkt aus dem DNA-Fragment, das durch die in 34 oder 38 gezeigten Restriktionskarten dargestellt ist.

Darüber hinaus können geeignete Beispiele ein Polypeptid umfassen, das die Aminosäure, die in Sequenz Nr. 6 oder 8 der Sequenztabelle oder deren äquivalente Sequenz umfaßt. Der Ausdruck "äquivalente Sequenz" steht hier für die Aminosäuresequenz, die praktisch die in Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, aber die einer Insertion, Austausch oder Deletion einiger Aminosäuren unterworfen wurde, oder bei der einige Aminosäuren am Terminus hinzugefügt wurden, die aber weiterhin die Aktivität der obigen neuen Amylase beibehält. Der Zustand, in dem die äquivalente Sequenz die Aktivität der neuen Amylase beibehält, bedeutet daß sie eine Aktivität beibehält, die ausreicht, um in ähnlicher Weise bei ähnlichen Bedingungen im Vergleich zu dem Polypeptid mit der vollständigen in Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigten Sequenz eingesetzt zu werden, wenn die Aktivität bei einem praktischen Verwendungsweg eingesetzt wird. Selbstverständlich kann der Fachmann eine äquivalente Sequenz auswählen und herstellen, indem er auf die Sequenzen, die in Sequenz Nr. 6 und 8 gezeigt sind, Bezug nimmt, ohne spezielle Schwierigkeiten zu überwinden, da in Beispiel II-23 gezeigt wird, daß die gleiche Aktivität in den Enzymen beibehalten wird, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammen, obgleich die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen der neuen Amylasen von diesen beiden Stämmen 59 % beträgt, wenn sie unter Berücksichtigung von Lücken berechnet wird.

Die Aminosäuresequenz, die die Aminosäuresequenz umfaßt, die in Sequenz Nr. 6 gezeigt ist, wobei ein Met-Rest zum Endterminus dieser Aminosäuresequenz hinzugefügt wird, wird außerdem gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung bereitgestellt. Die neue Amylase vom in der Natur vorkommenden Typ hat erfindungsgemäß die in Sequenz Nr. 6 gezeigte Sequenz. Wenn die neue Amylase anhand der Geninformation des isolierten Gens durch rekombinante Gentechnik unter Verwendung dieser Sequenz erhalten wird, wird, wie nachfolgend beschrieben, die erhaltene Sequenz jedoch zusätzlich einen Met-Rest an der in Sequenz Nr. 6 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen. Außerdem ist offensichtlich, daß die erhaltene Sequenz eine Aktivität der neuen Amylase aufweist. Demzufolge ist die Aminosäuresequenz, zu der ein Met-Rest hinzugefügt wurde, ebenfalls vom Umfang der Erfindung eingeschlossen.

Wie in Beispiel II-24 nachfolgend deutlich gemacht wird, kann das DNA-Fragment mit der Sequenz von der Base an Position 1393 bis zu der Base an Position 2116 der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Sequenz mit jedem der DNA-Fragmente hybridisieren, die von Bakterienstämmen abstammen außer von dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 und dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, die die Ursprünge dieser DNA-Sequenz sind. Wie nachfolgend beschrieben, haben die Erfinder unterdessen die Existenz einer neuen Amylase mit sehr ähnlichen Eigenschaften in solchen Bakterienstämmen bestätigt. Wie in Beispiel II-23 unten aufgeführt ist, beträgt die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen der neuen Amylasen, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stam ATCC 33909 abstammen, 59 % wenn sie unter Verwendung von Lücken berechnet wird. Es ist daher für den Fachmann offensichtlich, daß die Aktivität der neuen Amylase in einer Sequenz beibehalten wird, die in einem gewissen Ausmaß homolog ist mit der in Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigten Aminosäuresequenz.

Die Erfinder überprüften die Existenz einer Sequenz die mit der Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigt ist, homolog ist, in einer Datenbank über Aminosäuresequenzen (Swiss prot and NBRF-PFB) unter Verwendung der Sequenz-analysierenden Software GENETYX (von Software Development Co.). Als Ergebnis haben die Erfinder bestätigt, daß eine solche Sequenz nicht existiert.

Expression eines Gens, das die neue Amylase codiert

Die rekombinante erfindungsgemäße neue Amylase kann hergestellt werden in einer Wirtszelle durch Transformieren der Wirtszelle mit einem DNA-Molekül und insbesondere mit einem Expressionsvektor, der sich in der Wirtszelle replizieren läßt und das DNA-Fragment enthält, das die erfindungsgemäße neue Amylase codiert, um das Amylasegen zu exprimieren.

Die Erfindung stellt daher außerdem ein DNA-Molekül und insbesondere einen Expressionsvektor bereit, der ein Gen enthält, das die erfindungsgemäße neue Amylase codiert. Ein solches DNA-Molekül kann erhalten werden durch Integrieren des DNA-Fragmentes, das die erfindungsgemäße neue Amylase codiert, in ein Vektormolekül. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Vektor ein Plasmid.

Das erfindungsgemäße DNA-Molekül kann auf Basis des Verfahrens hergestellt werden, das in dem zuvor genannten Handbuch Molecular Clonings A Laboratory Manual beschrieben ist.

Der erfindungsgemäß verwendete Vektor kann passend aus Viren, Plasmiden, Cosmid-Vektoren und anderen ausgewählt werden, unter Berücksichtigung des Typs der zu verwendenden Wirtszelle. Zum Beispiel kann ein Bakteriophage vom &lgr;-Phagentyp, ein Plasmid vom pBR- oder pUC-Typ verwenden, wenn die Wirtszelle Escherichia coli ist, ein Plasmid vom pUB-Typ kann verwendet werden, wenn die Wirtszelle Bacillus subtilis ist und ein Vektor vom YEp- oder YCp-Typ kann verwendet werden, wenn die Wirtszelle Hefe ist.

Das Plasmid sollte bevorzugt einen Selektionsmarker zum Nachweis der Transformante enthalten; und ein medikamentenresistenter Marker und ein auxotropher Marker können als solcher Selektionsmarker verwendet werden.

Darüber hinaus sollte das DNA-Molekül als erfindungsgemäßer Expressionsvektor bevorzugt DNA-Sequenzen enthalten, die zur Expression des neuen Amylasegens notwendig sind, zum Beispiel ein Transkriptions-Kontrollsignal, ein Translations-Kontrollsignal und/oder dgl., wie einen Promotor, eine Transkriptions-Initiationssignal, eine Ribosomen-Bindungsstelle, ein Translations-Stoppsignal und ein Transkriptions-Endsignal.

Beispiele des sich eignenden Promotors sowie ein Promotor, der mit dem Wirt funktional ist, und der das Insertionsfragment enthält, kann umfassen einen Promotor wie ein Lactose-Operon (lac), ein Tryprophan-Operon (trp) für Escherichia coli, einen Promotor, wie ein Alkoholdehydrogenasegen (ADH), ein Säurephosphatasegen (PHO), ein Galactosegen (GAL) und ein Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasegen (GPD) für Hefe.

Die Basensequenz, umfassend die Sequenz von der Base an Position 1 bis zur Base an Position 2691 der in Sequenz Nr. 5 gezeigten Basensequenz und die Basensequenz, umfassend die Sequenz von der Base an Position 1 bis zur Base an Position 3600 der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Basensequenz wird hier in Escherichia coli exprimiert, um effizient die neue Amylase herzustellen. Folglich ist anzuerkennen, daß die DNA-Sequenzen in Sequenz Nr. 5 und 7 mindestens Sequenzen enthalten, die zur Expression in Escherichia coli notwendig sind. Es ist daher außerdem passend die Sequenzen wie sie sind zu verwenden.

Darüber hinaus wenn die Wirtszelle Bacillus subtilis oder Hefe ist, wird es von Vorteil sein, einen Sekretionsvektor zu verwenden, um die rekombinante neue Amylase außerhalb des Körpers abzusondern.

Zusätzlich zu Escherichia coli, Bacillus subtilis und Hefe können hochentwickelte Eukaryonten als Wirtszelle verwendet werden. Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus wie Bacillus subtilis gehören, eignen sich. Einige Stämme, die zu dieser Gattung gehören, können ein Protein aus dem Bakterienkörper in großer Menge ausscheiden. Daher kann eine große Menge der rekombinanten neuen Amylase in das Kulturmedium unter Verwendung eines Sekretionsvektors ausgeschieden werden. Dies ist von Vorteil, da die Reinigung aus dem Überstand der Kultur leicht sein wird. Darüber hinaus ist von all diesen Stämmen, die zur Gattung Bacillus gehören bekannt, daß sie eine kleine Proteasemenge aus dem Bakterienkörper ausscheiden. Es ist bevorzugt solche Stämme zu verwenden, da die rekombinante neue Amylase dadurch effizient hergestellt werden kann. Es ist darüber hinaus sehr von Vorteil einen Mikroorganismus auszuwählen, der keine Glucoamylase herstellt und ihn als Wirtszelle zu verwenden, da die erfindungsgemäße rekombinante neue Amylase, die als Zellextrakt erhalten wird, oder ein einfach gereinigtes Rohenzym direkt bei der nachfolgend beschriebenen Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose verwendet werden kann.

Die rekombinante neue Amylase, die durch den zuvor genannten Transformanten hergestellt wird, kann wie folgt erhalten werden: Zunächst wird die oben beschriebene Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert, die Bakterienkörper werden aus der resultierenden Kultur durch eines in der Öffentlichkeit bekannten Verfahrens gesammelt, zum Beispiel durch Zentrifugierung, und in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert, die Bakterienkörper werden anschließend durch Gefrierauftauen, durch eine Ultraschallbehandlung, durch Zermahlen und/oder dgl. zertrümmert und die Resultante wird zentrifugiert oder filtriert, um ein Zellextrakt zu erhalten, das die rekombinante neue Amylase enthält.

Die Reinigung der rekombinanten neuen Amylase, die in dem Zellextrakt vorkommt, kann durch eine geeignete Kombination von in der Öffentlichkeit bekannten Verfahren zur Isolierung und Reinigung erreicht werden. Beispiele dieser Verfahren können umfassen ein Verfahren, das einen Unterschied in der Wärmestabilität ausnutzt, wie eine Wärmebehandlung, ein Verfahren, das einen Unterschied in der Löslichkeit ausnutzt, wie Salzausfällung und Lösungsmittelsausfällung, ein Verfahren, das einen Unterschied im Molekulargewicht ausnutzt, wie Dialyse, Ultrafiltrierung, Gelfiltrierung und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, ein Verfahren, das einen Unterschied in der elektrischen Ladung ausnutzt, wie Ionenaustauscherchromatographie, ein Verfahren, das sich die spezifische Affinität zunutze macht, wie Affinitätschromatographie, ein Verfahren, das einen Unterschied in der Hydrophobizität ausnutzt, die hydrophobe Chromatographie und Umkehrphasenchromatographie und außerdem ein Verfahren, das einen Unterschied im Isoelektrischen Punkt ausnutzt, wie isoelektrische Fokussierung. Da die rekombinante neue Amylase wärmestabil ist, kann die Reinigung leicht unter Verwendung einer Wärmebehandlung durchgeführt werden, bei der Proteine in der Wirtszelle denaturiert und ausgefällt werden, um entfernt zu werden.

Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Verwendung der Rekombinanten

Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Verwendung der obigen rekombinanten neuen Amylase und der zuvor genannten rekombinanten neuen Transferase.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose kann die rekombinante neue Amylase und die erfindungsgemäße rekombinante Transferase gemischt werden und zur gleichen Zeit in Kontakt gebracht werden mit Glucid, wie Stärke, Stärkehydrolysat und Maltooligosaccharid. Darüber hinaus ist es bevorzugt, entweder die rekombinante Transferase oder die rekombinante neue Amylase mit einem entsprechenden Enzym auszutauschen, das von der Natur abstammt.

Die Konzentration des Glucids wie Stärke, Stärkehydrolysat und Maltooligosaccharid, sollte innerhalb des Bereiches passend ausgewählt werden, in dem sich das zu verwendenden Glycid auflöst, unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivitäten der vorliegenden Enzyme, der Reaktionstemperatur und anderen. Ein Bereich von 0,5-70 % ist gewöhnlich und ein Bereich von 5-40 % ist bevorzugt. Die Reaktionstemperatur und pH-Bedingung bei der Reaktion des Glucids mit dem Enzym sollte für die rekombinante neue Amylase und die rekombinante neue Transferase optimal sein. Folglich wird die Reaktion gewöhnlich ungefähr bei 50-85°C und pH 3,5-8 und bevorzugt bei 60-75°C und pH 4,5-6,0 durchgeführt.

Wenn das zu verwendende Glucid Stärke, Stärkehydrolysat oder dgl. mit einem hohen Polymerisierungsgrad ist, kann die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose zusätzlich unter Verwendung einer anderen flüssigen Amylase von Endotyp als Zusatzstoff weiter gefördert werden. Zum Beispiel können Enzyme, abstammend von Bakterien, die zur Gattung Bacillus, Pilze, die zur Gattung Aspergillus, und Pflanzen, die zu Malz gehören und andere als eine solche verflüssigende Amylase vom Endotyp verwendet werden. Das zu verwendende "Debranching"-Enzym kann Pullulanase sein, die von Bakterien, die zur Gattung Bacillus, Klebsiella oder dgl. gehören, kann Isoamylase sein, die von Bakterien abstammt, die zur Gattung Pseudomonas gehören oder dgl. Darüber hinaus können diese Enzyme in Kombination verwendet werden.

Die Zugabe einer überschüssigen Menge einer verflüssigenden Amylase vom Endotyp wird jedoch die Herstellung von Glucose und Maltose verursachen, auf die die neue Transferase nicht wirkt. In ähnlicher Weise wird die Zugabe einer überschüssigen Menge an Pullulanase eine Verringerung der Löslichkeit des Substrats verursachen, da die 1,6-Bindung gespalten wird und führt zur Herstellung einer hochviskosen und unlöslichen Substanz, die nicht eingesetzt werden kann. Aus diesem Grund sollten die Mengen an verflüssigender Amylase vom Endotyp und Pullulanase derart kontrolliert werden, daß keine überschüssige Glucose, Maltose oder eine andere unlösliche Substanz hergestellt wird.

Jedes der Verfahren kann eingesetzt werden, wenn Pullulanase verwendet wird, zum Beispiel Vorbehandlung des Substrat mit Pullulanase, oder Zusammenbringen von Pullulanase mit der rekombinanten neuen Amylase und der rekombinanten neuen Transferase bei jedem der Stadien während der &agr;,&agr;-Trehalose-herstellenden Reaktion.

Die erzeugte Reaktionsmischung, die &agr;,&agr;-Trehalose enthält, kann gemäß einem in der Öffentlichkeit bekannten Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel wird die erhaltene Reaktionsmischung mit einem Anionenaustauscherharz entsalzt, die Zielsaccharidfraktion wird anschließend isoliert und durch Chromatographie unter Verwendung von Aktivkohle, einem Anionenaustauscherharz (HSO3-Typ), einem Kationenaustauscherharz (Ca-Typ) oder dgl. als Trennmaterial isoliert und anschließend wird optional eine Kondensierung durchgeführt und schließlich wird &agr;,&agr;-Trehalose in hoher Reinheit erhalten.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend im Detail durch die praktischen Beispiele dargestellt, obgleich es unnötig ist zu sagen, daß der Umfang der Erfindung nicht durch diese Beispiele eingeschränkt ist.

Beispiel I-1: Glucosyltrehalose-herstellende Aktivitäten von Archaebakterien

Die in Tabelle 3 aufgeführten Bakterienstämme wurden auf Glucosyltrehalose-herstellende Aktivität untersucht. Die Untersuchung wurde wie folgt durchgeführt: Die kultivierten Bakterienkörper jeden Stammes wurden durch Ultraschallbehandlung zertrümmert und zentrifugiert, das Substrat, Maltrotriose, wurde zu dem Überstand gegeben, so daß die Endkonzentration 10 % entsprach; die Mischung wurde anschließend bei 60°C 24 Stunden reagiert, woraufhin die Reaktion durch eine 5-minütige Wärmebehandlung bei 100°C gestoppt wurde, und die so hergestellte Glucosyltrehalose wurde einer Messung gemäß HPLC-Analyse unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen unterworfen.

  • Säule: TOSOH TSK-Gel Amid-80 (4,6 × 250 mm)
  • Lösungsmittel: 75 % Acetonitril
  • Fließrate: 1,0 ml/min
  • Temperatur: Raumtemperatur
  • Nachweisvorrichtung: Brechungsindexnachweisvorrichtung

Die Enzymaktivitäten wurden in einer solchen Einheit ausgedrückt, daß eine Einheit der Aktivität entspricht, Maltotriose in 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde umzuwandeln. Nebenbei bemerkt wurde die Aktivität in Tabelle 3 in bezug auf Einheiten pro 1 g Bakterienzelle (Einheiten/g-Zelle) ausgedrückt.

1(B) ist das hierdurch erhaltene Diagramm. Wie aus der Figur ersichtlich ist, erschien das Hauptreaktionsprodukt kurz nach dem nicht-reagierten Substrat in dem HPLC-Diagramm als ein Höhepunkt ohne jedes Anomer. Eine Aliquote dieses Hauptreaktionsprodukts von der TSK-Gel Amid-80-HPLC-Säule wurde der 1H-NMR-Analyse und 13C-NMR-Analyse unterworfen und wurde als Glucosyltrehalose bestätigt. Die chemische Formel ist wie folgt:

Folglich weist jedes Zellextrakt der Bakterienstämme die zur Ordnung Sulfolobales gehören, eine Glucosyltrehalose-herstellende Aktivität auf, nämlich die Transferaseaktivität des erfindungsgemäßes Enzyms.

Tabelle 3

Beispiel I-2: Reinigung der vorliegenden Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt

Der Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC) aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugieren gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle betrug 3,3 g/l.

200 g der Bakterienzellen, die dadurch erhalten wurden, wurden in 400 ml 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung zur Bakteriolyse bei 0°C 15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten und Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand gegeben, bis zu einer Sättigung von 60 %.

Das durch Zentrifugieren erhaltene Präzipitat wurde in einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 1 M Ammoniumsulfat und 5 mM EDTA, aufgelöst und auf eine TOSOH-TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 800 ml), die mit der gleichen Pufferlösung wie oben beschrieben äquilibriert ist, aufgetragen zur Durchführung einer hydrophoben Chromatographie. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit 10 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5) gewaschen und entsalzt.

Anschließend wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unterworfen unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 900 ml Natriumchlorid-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Daraufhin wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen und die Zieltransferase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5) gewaschen und entsalzt.

Anschließend wurde Ammoniumsulfat in der so erhaltenen entsalzten und konzentrierten Lösung aufgelöst, so daß die Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde anschließend hydrophober Chromatographie unterworfen unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel Phenyl-5PW HPLC-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung konzentriert worden war. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 30 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 10 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gewaschen und entsalzt.

Die Resultante wurde weiter einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE 5 PE HPLC-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 30 ml Natriumchlorid-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert.

Letztlich wurde native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande auftrat.

Die Aktivität wurde übrigens auf die gleiche Weise wie in Beispiel I-1 gemessen.

Die Gesamtenzymaktivität, die Gesamtproteinmenge und die spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte ist nachfolgend in Tabelle 4 gezeigt.

Beispiel I-3: Reinigung der vorliegenden Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 abstammt

Der Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC) aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle betrug 1,7 g/l.

56 g so erhaltene Bakterienzellen wurden in 100 ml einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung zur Bakteriolyse bei 0°C 15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten.

Anschließend wurde Ammoniumsulfat in dem Überstand aufgelöst, so daß die Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde anschließend einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 200 ml), die mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 10 mM Tris-HCl Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen und entsalzt.

Daraufhin wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die Zieltransferase wurde mit 900 ml Natriumchlorid-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Dann wurde Ammoniumsulfat in der so erhaltenen entsalzten und konzentrierten Lösung aufgelöst, so daß die Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde anschließend einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 200 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert, und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA gewaschen und entsalzt.

Die so erhaltenen Salze und konzentrierte Lösung wurde daraufhin einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen und die Zieltransferase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung dialysiert (pH 6,7).

Anschließend wurde die Resultante einer Chromatofokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR/5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Sofort nachdem die Probe injiziert wurde, wurde die Zieltransferase mit 10 % Polypuffer 74-HCl (pH 5,0, hergestellt von Pharmacia Co.) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin mit einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung (pH 6,7) dialysiert.

Eine weitere Chromatfokussierung wurde unter Verwendung der gleichen Bedingungen durchgeführt und die Zieltransferase wurde eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Schließlich wurde natives Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyamidgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.

Die Aktivität wurde im übrigen auf die gleiche Weise wie in Beispiel I-1 gemessen.

Die Gesamtenzymaktivität, Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte sind in der nachfolgenden Tabelle 5 gezeigt.

Beispiel I-4: Reinigung der vorliegenden Transferase, die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt

Der Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 in dem Katalog über Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC) aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugieren gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle betrug 2,9 g/l.

92 1/2 g der so erhaltenen Bakterienzellen wurden in 200 ml einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung zur Bakteriolyse bei 0°C 15 min ausgesetzt. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten.

Anschließend wurde Ammoniumsulfat in dem Überstand aufgelöst, so daß die Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde anschließend einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 200 ml), die mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 10 mM Tris-HCl Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen und entsalzt.

Daraufhin wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die Zieltransferase wurde mit 900 ml Natriumchlorid-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Dann wurde Ammoniumsulfat in der so erhaltenen entsalzten und konzentrierten Lösung aufgelöst, so daß die Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde anschließend einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 200 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert, und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Die so erhaltenen Salze und konzentrierte Lösung wurde daraufhin einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen und die Zieltransferase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung dialysiert (pH 6,7).

Anschließend wurde die Resultante einer Chromatfokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR/5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Sofort nachdem die Probe injiziert wurde, wurde die Zieltransferase mit 10 % Polypuffer 74-HCl (pH 5,0, hergestellt von Pharmacia Co.) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin mit einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung (pH 6,7) dialysiert.

Eine weitere Chromatfokussierung wurde durchgeführt unter Verwendung der gleichen Bedingungen, und die Zieltransferase wurde eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Schließlich wurde native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyamidgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.

Die Aktivität wurde im übrigen auf die gleiche Weise wie in Beispiel I-1 gemessen.

Die Gesamtenzymaktivität, Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte sind in der nachfolgenden Tabelle 7 gezeigt.

Beispiel I-5: Reinigung der vorliegenden Transferase, die von dem Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 abstammt

Der Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 wurde bei 70°C 3 Tage in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 150 in dem Katalog über Stämme, 5. Ausgabe (1993), veröffentlicht von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) aufgeführt ist. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle betrug 0,6 g/l.

12 g der so erhaltenen Bakterien wurden in 120 ml einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 3 mM EDTA, suspendiert und anschließend einer Ultraschallbehandlung zur Bakteriolyse bei 0°C 15 min unterworfen.

Anschließend wurde Ammoniumsulfat in dem Überstand aufgelöst, so daß die Endkonzentration des Ammoniumsulfats 1 M sein würde. Die Resultante wurde anschließend hydrophober Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 200 ml), die mit 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen und entsalzt.

Daraufhin wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 900 ml Natriumchlorid-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung wurde weiter einer Gel-Filtrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen und die Zieltransferase wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung (pH 6,7) dialysiert.

Dann wurde die Resultante einer Chromatfokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono PHR/5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Sofort nachdem die Probe injiziert wurde, wurde die Zieltransferase mit 10 % Polypuffer 74-HCl (pH 5,0, hergestellt von Pharmacia Co.) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Schließlich wurde native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.

Die Aktivität wurde im übrigen auf die gleiche Weise wie in Beispiel I-1 gemessen.

Die Gesamtenzymaktivität, Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte sind in der nachfolgenden Tabelle 7 gezeigt.

Beispiel I-6: Untersuchung der vorliegenden Transferase auf verschiedene Eigenschaften

Das in Beispiel I-2 erhaltene Enzym wurde auf Enzymeigenschaften untersucht.

(1) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des gereinigten Enzyms in seinem nativen Zustand wurde durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule gemessen. Markerproteine mit Molekulargewichten von jeweils 200 000, 97 400, 68 000, 43 000, 29 000, 18 400 und 14 300 wurden verwendet.

Als Ergebnis wurde das Molekulargewicht der Transferase auf 54 000 geschätzt.

Währenddessen wurde das Molekulargewicht durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Gelkonzentration: 6 %) gemessen. Markerproteine mit Molekulargewichten von jeweils 200 000, 116 300, 97 400, 66 300, 55 400, 36 500, 31 000, 21 500 und 14 400 wurden verwendet.

Als Ergebnis wurde das Molekulargewicht der Transferase auf 76 000 geschätzt.

Der Unterschied zwischen den Molekulargewichtwerten, die durch Gelfiltrationschromatographie und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gemessen wurde, kann auf eine bestimmte Wechselwirkung zurückgeführt werden, die zwischen dem gepackten Material der Gelfiltrationssäule und den Proteinen erzeugt werden kann. Folglich entspricht das durch Gelfiltration geschätzte Molekulargewicht nicht notwendigerweise dem Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms in seinem nativen Zustand.

(2) Isoelektrischer Punkt

Durch Agarosegel-isoelektrische Fokussierung wurde festgestellt, daß der isoelektrische Punkt bei pH 6,1 liegt.

(3) Stabilität

Die Stabilitätsänderung des erhaltenen Enzyms gemäß der Temperatur- und pH-Werte sind jeweils in 2 und 3 gezeigt. Bei der Messung wurde in einem pH-Bereich von 3-5 eine Glycin-HCl-Pufferlösung verwendet, und in einem pH-Bereich von 4-6 eine Natriumacetatpufferlösung, einem pH-Bereich von 5-8 eine Natriumphosphatpufferlösung, einem pH-Bereich von 8-9 eine Tris-HCl-Pufferlösung, einem pH-Bereich von 9-10 eine Bicarbonatpufferlösung, einem pH-Bereich von 11-13 eine KCl-NaOH-Pufferlösung wurden jeweils ebenfalls verwendet.

Das vorliegende Enzym war über die 6-stündige Behandlung bei 85°C hinweg stabil und war auch über eine 6-stündige Behandlung bei pH 4,0-10,0 und Raumtemperatur hinweg stabil.

(4) Reaktivität

Hinsichtlich des erhaltenen Proteins ist zu sagen, daß die Reaktivität bei verschiedenen Temperaturen und Reaktivitäten bei unterschiedlichem pH jeweils in 4 und 5 gezeigt sind. Bei der Messung wurde eine Glycin-HCl-Pufferlösung im pH-Bereich von 3-5 (☐) verwendet, und in ähnlicher Weise wurden eine Natriumacetatpufferlösung im pH-Bereich von 4-5,5 (•), eine Natriumphosphatpufferlösung im pH-Bereich von 5-7,5 (&Dgr;) und eine Tris-HCl-Pufferlösung im pH-Bereich von 8-9 (♢) jeweils ebenfalls verwendet.

Die optimale Reaktionstemperatur des vorliegenden Enzyms liegt ungefähr innerhalb von 60-80°C und der optimale Reaktions-pH des vorliegenden Enzyms liegt ungefähr innerhalb 5,0-6,0.

(5) Einfluß verschiedener Aktivatoren und Inhibitoren

Der Einfluß jeder Substanz, die in Tabelle 8 aufgeführt ist, wie eine aktivierende oder inhibierende Wirkung, wurden unter Verwendung eines ähnliches Aktivitätmeßverfahrens zudem in Beispiel I-1 beurteilt. Genauer gesagt wurden die aufgeführten Substanzen individuell zusammen mit dem Substrat zu dem gleichen Reaktionssystem wie dem das in dem Verfahren der Messung der Glucosyltrehalose-herstellenden Aktivität, das in Beispiel I-1 eingesetzt worden ist, zugegeben. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß Kupferion und SDS hemmende Wirkungen aufweisen. Obgleich festgestellt worden ist, daß viele Glucid-verwandte Enzyme mit Calciumion aktiviert werden, wurde das vorliegende Enzym nicht mit Calciumion aktiviert.

Tabelle 8

(6) Substratspezifität

Es wurde untersucht ob das vorliegende Enzym auf jedes der nachfolgend in Tabelle 9 aufgeführten Substrate wirkt oder nicht, um sein &agr;-1,&agr;-1-umgewandeltes Isomer herzustellen. Hier wurde die Aktivitätsmessung auf die gleiche Weise wie in Beispiel I-1 durchgeführt.

Tabelle 9

Als Ergebnis wurde festgestellt, daß das vorliegende Enzym Trehaloseoligosaccharide aus den Substraten Maltotriose (G3)-Maltoheptaose (G7) herstellt. Das vorliegende Enzym wirkte nicht auf Isomaltotriose, Isomaltotetraose, Isomaltopentaose oder Panose, die &agr;-1,6-Bindungen an 1 bis 4 Bindungen vom reduzierenden Ende aufweisen oder die &agr;-1,6-Bindungen als zweite Bindung vom reduzierenden Ende aufweisen.

Zu bemerken ist, daß jedes der gereinigten Enzyme, die in Beispielen I-3 - I-5 erhalten wurde, und die aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833, dem Sulfolobus acidocaldarius-Stam ATCC 33909 und dem Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 abstammen, jeweils auf ihre Enzymeigenschaften in ähnlicher Weise geprüft wurden. Die Ergebnisse sind in der obigen Tabelle 1 gezeigt.

Beispiel 1-7: Herstellung von Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose aus Maltooligosacchariden

Als Substrate wurden Maltotriose (G3) – Maltoheptaose (G/) in einer Konzentration von 100 mM verwendet. Das in Beispiel I-2 erhaltene Enzym wurde anschließend auf jedes der obigen Substrate in einer Menge von 13,5 Einheiten/ml (in bezug auf die Enzymaktivität, wenn das Substrat Maltotriose ist) eingewirkt, um ein entsprechendes &agr;-1,&agr;-1-umgewandeltes Isomer herzustellen. Jedes Substrat wurde durch das in Beispiel I-1 analysierte Verfahren untersucht und auf seine Ausbeute und Enzymaktivität geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 unten gezeigt. Anzumerken ist, daß jeder Enzymsaktivitätswert in Tabelle 10 als Einheit ausgedrückt wird, so daß eine Einheit der Aktivität entspricht, das Maltooligosaccharid in 1 &mgr;mol des entsprechenden &agr;-1,&agr;-1-übertragenen Isomers pro Stunde umzuwandeln.

Tabelle 10

Wie in Tabelle 10 gezeigt ist, war die Enzymaktivität am höchsten wenn das Substrat G5 war, das ungefähr 8-mal die Aktivität von G3 entfaltete. Darüber hinaus betrug die Ausbeute 44,6 % bei G3, während sie 63,5-73,1 % oder mehr bei G4 betrug.

Zusätzlich wurde die Zusammensetzung jedes Produkts, das durch sie Substrate G3, G4 oder G5 erhalten wurde, untersucht. Die Ergebnisse sind jeweils in 68 gezeigt.

Genauer gesagt wenn Maltotriose als Substrat verwendet wurde, wurde Glucosyltrehalose als Produkt in der Hauptreaktion hergestellt und zusätzlich wurden gleiche Molmengen Maltose und Glucose als Produkte in der Nebenreaktion hergestellt.

Wenn das Saccharid ein Saccharid war, das einen Polymerisierungsgrad, n, hatte der gleich oder höher als der von Maltotetraose war, war das Produkt bei der Hauptreaktion ein Saccharid, bei dem der Polymerisierungsgrad n ist und der Glucoserest am reduzierenden Ende &agr;-1,&agr;-1-gebunden ist. Zusätzlich wurden gleiche Glucose-Molmengen und ein Saccharid mit einem Polymerisierungsgrad von n-1 in der Nebenreaktion hergestellt. Darüber hinaus wenn die Reaktion dieser Saccharide sich weiter fortsetzte, unterzog sich das Saccharid mit einem Polymerisierungsgrad von n-1 sekundär den Reaktionen ähnlich zu den oben angegebenen.

(Anzumerken ist, daß in den 7 und 8 die Saccharide, die als Trisaccharid und Tetrasaccharid angegeben sind, jeweils nicht-umgesetzte Maltotriose und Maltotetraose umfassen, und außerdem Saccharide umfassen, bei denen die Bindung am Ende &agr;-1,&agr;-1 ist, die hergestellt wurden, wenn die Reaktion ähnlich zu der oben aufgeführten sich sekundär fortsetzte.) Unterdessen wurde keine Herstellung eines solchen Saccharids, das einen Polymerisierungsgrad von n+1 oder höher, nämlich ein intermolekulares übertragenes Isomer nachgewiesen. Anzumerken ist, daß die Hydrolyse als Nebenreaktion weniger häufig auftrat wenn die Kettenlänge die gleiche oder länger als die von G4 war.

Das Trisaccharid, Tetrasaccharid und das Pentasaccharid, die Haupterzeugnisse jeweils der Substrate G3, G4 und G5 sind, wurden mit der TSK-Gel Amid-80 HPLC-Säule als Beispiele der Haupterzeugnisse geprüft und durch 1H-NMR und 13C-NMR analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der Glucoserest am reduzierenden Ende jedes Saccharids &agr;-1,&agr;-1-gebunden wurde und solche Saccharide wurden jeweils als Glucosyltrehalose (&agr;-D-Maltosyl-&agr;-D-glucopyranosid), Maltosyltrehalose (&agr;-D-Maltosyl-&agr;-D-glucopyranosid) und Maltotriosyltrehalose (&agr;-D-Maltotetraosyl-&agr;-D-Glucopyranosid) erkannt. Die chemischen Formeln dieser Saccharide sind wie folgt.

Aus den obigen Ergebnisse kann gefolgert werden, daß das Enzym der vorliegenden Erfindung auf Maltotriose oder ein größeres Glucosepolymer wirkt, wobei die Glucosereste &agr;-1,4-gebunden sind und die erste Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung überführt wird. Weiterhin wurde festgestellt, daß das Enzym der vorliegenden Erfindung die erste Bindung vom reduzierenden Ende hydrolysiert, wobei von einem H2O-Molekül als Rezeptor Gebrauch gemacht wird, um ein Glucosemolekül freizusetzen, was oft bei Glucosyltransferasen beobachtet wird.

Beispiel I-8: Herstellung von Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose aus einer Mischung von Maltooligosacchariden

Die Herstellung von Glucosyltrehalose und verschiedenen Maltooligosyltrehalosen wurde versucht unter Verwendung von 10 Einheiten/ml des gereinigten Enzyms, das in Beispiel I-2 erhalten wurde und unter Verwendung eines Hydrolysats aus einem löslichen Stärkeprodukt (hergestellt von Nacalai tesque Co., spezieller Reinigungsgrad) mit &agr;-Amylase als Substrat, wobei das lösliche Stärkeprodukt in Oligosaccharide hydrolysiert wurde, die keine Farbe bei der Iodstärkereaktion entfalteten, und die &agr;-Amylase die A-0273 war, die vom Aspergillus oryzae-Stamm abstammte, der von Sigma Co. hergestellt wird. Die resultierende Reaktionsmischung wurde durch ein HPLC-Analyseverfahren unter den nachfolgenden Bedingungen analysiert.

  • Säule: BIORAD AMINEX HPX-42A (7,8 × 300 mm)
  • Lösungsmittel: Wasser
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Temperatur: 85°C
  • Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung

9(A) ist ein HPLC-Analysediagramm, das hier erhalten wurde. Das HPLC-Diagramm des Falls der ohne Zugabe der vorliegenden Transferase durchgeführt wurde, ist als Kontrolle in 9(B) gezeigt.

Als Ergebnis wurde festgestellt, daß jedes der Oligosaccharide als Reaktionserzeugnis eine Retentionszeit hatte die kürzer als die des Kontrollproduktes war, das unter Verwendung von Amylase allein hergestellt wurde, wobei die kürzere Retentionszeit auf die &agr;-1,&agr;-1-Überführung des reduzierenden Endes der Oligosaccharide zurückzuführen ist. Ähnlich zu Beispiel I-7 wurden das Trisaccharid, das Tetrasaccharid und das Pentasaccharid entnommen und durch 1H-NMR und 13C-NMR untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der Glucoserest am reduzierenden Ende jedes Saccharids &agr;-1,&agr;-1-gebunden war und solche Saccharide wurden erkannt jeweils als Glucosyltrehalose (&agr;-D-Maltosyl-&agr;-D-Glucopyranosid), Maltosyltrehalose (&agr;-D-Maltotriosyl-&agr;-D-Glucopyranosid) und Maltotriosyltrehalose (&agr;-D-Maltotetraosyl-&agr;-D-glucopyranosid). Die chemischen Formeln dieser Saccharide sind wie folgt.

Die nachfolgend beschriebenen Reagenzien und Materialien, die in Beispiel II-1 – II-14 (einschließlich der Vergleichsbeispiele II-1 und II-2 und dem Referenzbeispiel II-1 - II-4) verwendet wurden, wurden jeweils von den nachfolgend beschriebenen Herstellern erhalten.

  • &agr;,&agr;-Trehalose: hergestellt von Sigma Co.
  • Lösliche Stärke: hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller Reinigungsgrad
  • Pullulanase abstammend von Klebsiella pneumoniae: hergestellt von Wako Pure Chemical Co., #165-15651
  • Pine-dex #1 und Pine-dex #3: hergestellt von Matsutani Kagaku Co.
  • Maltose (G2): hergestellt von Wako Pure Chemicals Co.
  • Maltotriose (G3), Maltotetraose (G4) Maltopentaose (G5), Maltohexaose (G6), Maltoheptaose (G7) und Amylose DP-17: hergestellt von Hayashibara Biochemical Co.
  • Amylopectin: hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller Reinigungsgrad
  • Isomaltose: hergestellt von Wako Pure Chemical Co.
  • Isomaltotriose: hergestellt von Wako Pure Chemical Co.
  • Isomaltotetraose: hergestellt von Seikagaku Kougyou Co.,
  • Isomaltopentaose: hergestellt von Seikagaku Kougyou Co.,
  • Panose: hergestellt von Tokyo Kasei Kougyou Co.

Beispiel II-1: Messung der Trehaloseoligosaccharid-hydrolysierenden Aktivität und der Stärke-verflüssigenden Aktivität, die von Archeabakterien besessen wird

Die in der nachfolgenden Tabelle 11 aufgeführten Bakterienstämme wurde auf Enzymaktivität untersucht. Die Messung wurde wie folgt durchgeführt: Die kultivierten Zellen jedes Bakterienstammes wurden durch Ultraschallbehandlung zertrümmert und zentrifugiert, Maltotriosyltrehalose als Substrat wurde zu dem resultierenden Überstand gegeben, nämlich, einer rohen Enzymlösung, so daß die Endkonzentration der Maltotriosyltrehalose 10 mM sein würde, die so erhaltene Mischung wurde anschließend der Reaktion bei 60°C und pH 5,5 (50 mM Natriumacetatpufferlösung) unterworfen, die Reaktion wurde anschließend durch 5-minütige Wärmebehandlung bei 100°C gestoppt und die so hergestellte &agr;,&agr;-Trehalose wurde durch ein HPLC-Verfahren unter den nachfolgenden Bedingungen analysiert.

  • Säule: TOSOH TSK-Gel Amid-80 (4,6 × 250 mm)
  • Lösungsmittel: 72,5 % Acetonitril
  • Fließrate: 1,0 ml/min
  • Temperatur: Raumtemperatur
  • Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung

Die Trehaloseoligosaccharid-hydrolysierende Aktivität wird als Einheit ausgedrückt, so daß 1 Einheit der Aktivität entspricht 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotrioxyltrehalose freizusetzen. Zu erwähnen ist, daß in Tabelle 11 die Aktivität in bezug auf Einheit pro 1 g Bakterienzellen ausgedrückt wird. Maltotriosyltrehalose wurde hier wie folgt hergestellt: Die gereinigte Transferase, die von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 stammte, wurde zu einer 10%igen Maltopentaose-Lösung, enthaltend 50 mM Essigsäure (pH 5,5) gegeben, so daß die Endkonzentration der Transferase 10 Einheiten/ml sein würde. Die so erhaltene Mischung wurde einer Reaktion bei 60°C 24 Stunden unterworfen, und die Resultante wurde der obigen TSK-Gel Amid-80 HPLC-Säule unterworfen, um Maltotriosyltrehalose zu erhalten. Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, wird 1 Einheit definiert als die Aktivität, die der entspricht 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei 60°C und pH 5,5 herzustellen, wenn Maltotriose als Substrat verwendet wird.

10 ist das hier erhaltene HPLC-Diagramm. Wie aus der Figur ersichtlich ist, erschien auf dem Diagramm ein Peak, der die gleiche Retentionszeit wie &agr;,&agr;-Trehalose ohne jedes Anomer entfaltete und ein Peak, der die gleiche Retentionszeit wie Maltotriose entfaltete. Zusätzlich wurde das Produkt des ersten Peaks auf der TSK-Gel Amid-80 HPLC-Säule laufen gelassen und durch 1H-NMR und 13C-NMR überprüft. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das Produkt &agr;,&agr;-Trehalose ist.

2 % lösliche Stärke, die in einer 100 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5) enthalten sind, wurden außerdem einer Reaktion mit der obigen Rohenzymlösung (dem Überstand) bei 60°C durch Zugabe von 0,5 ml des Überstandes zu 0,5 ml der Stärkelösung unterworfen. Die Entnahme von Proben mit Ablauf der Zeit wurde durchgeführt und zum Beenden der Reaktion wurde zu jeder Probe das Doppelte 1 N HCl-Volumen gegeben. Zwei Drittel des Volumens einer 0,1 % Natriumiodlösung, enthaltend 0,01 % Iod, wurden danach zugegeben und darüber hinaus wurde das 1,8-fache Wasservolumen zugegeben. Letztlich wurde die Absorption bei 620 nm untersucht und die Aktivität wurde durch die Änderung der Absorption mit dem Verlauf der Zeit eingeschätzt.

Die in der Reaktion hergestellten Saccharide wurden durch ein HPLC-Analyseverfahren unter den nachfolgend gezeigten Bedingungen durchgeführt nachdem die Reaktion durch 5-minütige Behandlung bei 100°C gestoppt wurde.

  • Säule: BIORAD AMINEX HPX-42A (7,8 × 300 mm)
  • Lösungsmittel: Wasser
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Temperatur: 85°C
  • Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung

Bei der Stärke-hydrolysierenden Aktivität, wird 1 Einheit definiert als die Enzymmenge mit der sich die Absorption bei 620 nm entsprechend der violetten Farbe des Stärke-Iod-Komplexes bei einer Rate von 10 % pro 10 min verringert. Anzumerken ist, daß in Tabelle 11 die Aktivität in bezug auf Einheiten pro 1 g Bakterienzelle ausgedrückt wird.

11 zeigt die Ergebnisse einer Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC, die bei Produkten durch die Reaktion mit der von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammenden Rohenzymlösung durchgeführt wurde.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das Zellextrakt eines Bakterienstammes, der zur Gattung Sulfolobus gehört, eine Aktivität aufweist Trehaloseoligosaccharide zu hydrolysieren, um &agr;,&agr;-Trehalose freizusetzen und eine Aktivität aufweist Stärke zu hydrolysieren, um hauptsächlich Monosaccharide oder Disaccharide freizusetzen.

Beispiel II-2: Reinigung der vorliegenden Amylase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt

Der Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle betrug 3,3 g/l.

200 g der oben erhaltenen Bakterienzellen wurde in 400 ml einer 50 mm Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA suspendiert, und einer Ultraschallbehandlung zur Bakteriolyse bei 0°C 15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, und Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand bis zu einer Sättigung von 60 % gegeben.

Der durch Zentrifugieren erhaltene Niederschlag wurde in einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5) enthaltend 1 M Ammoniumsulfat und 5 mM EDTA aufgelöst und hydrophober Chromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 800 ml), die mit der gleichen Pufferlösung wie oben äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zielamylase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfatlösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen und entsalzt.

Die Resultante wurde anschließend einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der Pufferlösung gewaschen und die Zielamylase wurde mit 900 ml Natriumchloridlösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5) enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Daraufhin wurde die so erhalten entsalzte und konzentrierte Lösung einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen und die Zielamylase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung (pH 6,3) gewaschen und entsalzt.

Die so erhaltenen Salze und konzentrierte Lösung wurde dann einer Chromatfokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR/5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Zielamylase wurde anschließend mit 10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia Co., und auf einen pH von 4,0 mit HCl eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin mit einer 10 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 6,8) gewaschen und entsalzt.

Zu dieser entsalzten und konzentrierten Lösung wurden weiter ein Viertel Volumen eines Probenpuffers [62,5 mM Tris-HCl-Puffer-Lösung (pH 6,8), 10 Glycerin, 2 % SDS und 0,0125 % Bromophenolblau] gegeben und einer 10%igen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unterworfen (Vorrichtung: BIO-RAD Prep Cell Model 491), um die Zielamylase zu eluieren. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) getrennt und konzentriert und danach mit einer 10 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5) gewaschen und entsalzt.

Letztlich wurden native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.

Anzumerken ist, daß bei der Aktivitätsmessung bei diesem Reinigungsverfahren Maltotriosyltrehalose als Substrat verwendet und die gleiche Vorgehensweise wie bei dem TSK-Gel Amid 80 HPLC-Analyseverfahren, das in Beispiel II-1 gezeigt ist, eingesetzt wurde.

Die Gesamtenzymaktivität, Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte sind in der Tabelle 12 unten gezeigt.

Beispiel II-3: Reinigung der vorliegenden Amylase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 abstammt

Der Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 wurde bei 75°C 3 Tag in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992) veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzellen betrug 1,2 g/l.

25 g der so erhaltenen Bakterienzellen wurden in 50 ml einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung zur Bakteriolyse bei 0°C 15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschießend zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten.

Zu diesem Überstand wurde Ammoniumsulfat gegeben, um 1 M zu betragen. Die Resultante wurde anschließend einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 100 ml), die mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert worden war, suspendiert. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zielamylase wurde mit 300 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen und entsalzt.

Die Resultante wurde anschließend einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 100 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zielamylase wurde mit 300 ml Natriumchlorid-Lösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Anschließend wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen und die Zielamylase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mM Bis-Tris-Iminodiessigsäurepufferlösung (pH 7,1) gewaschen und entsalzt.

Dann wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer Chromatofokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Zielamylase wurde anschließend mit 10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia, und auf einen pH von 4,0 mit Iminodiessigsäure eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mM Bis-Tris-Iminodiessigsäurepufferlösung (pH 7,1) gewaschen und entsalzt.

Die erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung wurde weiter einer Chromatofokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Zielamylase wurde anschließend mit 10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia, und auf einen pH von 4,0 mit Iminodiessigsäure eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden konzentriert unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Darüber hinaus wurde die so erhaltene entsalzte und gewaschene Lösung Gelfiltrierungschromatographie unter Verwendung der TSK-Gel G3000SW HPLC-Säule unterworfen und die Zielamylase wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Schließlich wurden native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.

Im übrigen wurde für die Aktivitätsmessung, in diesem Reinigungsverfahren Matltotriosyltrehalose als Substrat verwendet und die gleiche Vorgehensweise wie bei dem TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren, das in Beispiel II-1 gezeigt ist, wurde durchgeführt.

Gesamtenzymaktivität, Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte sind in Tabelle 13 unten gezeigt.

Beispiel II-4: Reinigung der vorliegenden Amylase, die aus dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt

Der Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 in dem Katalog über Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992) veröffentlicht von der American Typ Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzellen betrug 2,7 g/l.

25 g der so erhaltenen Bakterienzellen wurden in 50 ml einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung zur Bakteriolyse bei 0°C 15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten.

Zu diesem Überstand wurde Ammoniumsulfat gegeben, so daß 1 M sein würde. Die Resultante wurde anschließend durch hydrophobe Chromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 100 ml), die mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zielamylase wurde mit 300 ml Ammoniumsulfatlösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen und entsalzt.

Anschließend wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 100 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zielamylase wurde mit 300 ml Natriumchloridlösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, entsalzt.

Anschließend wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung Gelfiltrierungschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen und Zielamylase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5) gewaschen und entsalzt.

Anschließend wurde Ammoniumsulfat in der entsalzten und konzentrierten Lösung aufgelöst, so daß die Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M sein würde. Die Resultante wurde anschließend einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel Phenyl-5PW HPLC-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und die Zielamylase wurde mit 30 ml Ammoniumsulfat bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mm Bis-Tris-Iminodiessigsäurepufferlösung (pH 7,1) gewaschen und entsalzt.

Weiter wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer Chromatofokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Zielamylase wurde anschließend mit 10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia und auf einen pH von 4,0 mit Iminodiessigsäure eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.

Schließlich wurden native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.

Zur Aktivitätsmessung bei diesem Reinigungsverfahren wurde im übrigen Maltotriosyltrehalose als Substrat verwendet und die gleiche Vorgehensweise wie bei dem TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren, das in Beispiel II-1 gezeigt ist, eingesetzt.

Gesamtenzymaktivität, Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte sind unten in Tabelle 14 gezeigt.

Beispiel II-5: Untersuchung der vorliegenden Amylase auf verschiedene Eigenschaften

Das in Beispiel II-2 erhaltene gereinigte Enzym wurde auf Enzymeigenschaften untersucht.

(1) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Gelkonzentration: 6 %) gemessen. Markerproteine mit Molekulargewichten von 200 000, 116 300, 97 400, 66 300, 55 400, 36 500, 31 000, 21 500 und 14 400 wurden jeweils verwendet.

Als Ergebnis wurde das Molekulargewicht der Amylase auf 61 000 eingeschätzt.

(2) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt wurde durch isoelektrische Agarosegel-Fokussierung auf pH 4,8 bestimmt.

(3) Stabilität

Die Stabilitätsänderungen des erhaltenen Enzyms hinsichtlich der Temperatur und dem pH-Wert sind jeweils in 12 und 13 gezeigt. Die Messung der Enzymaktivität wurde gemäß dem Meßverfahren in Beispiel II-1 unter Verwendung von Maltotriosyltrehalose durchgeführt, und eine Glycin-HCl-Pufferlösung wurde in einem pH-Bereich von 3-5 verwendet und ähnlich wurde eine Natriumacetatpufferlösung in einem pH-Bereich von 4-6 verwendet, eine Natriumphosphatpufferlösung in einem pH-Bereich von 5-8, eine Tris-HCl-Pufferlösung in einem pH-Bereich von 8-9, eine Natriumbicarbonatpufferlösung in einem pH-Bereich von 9-10 und eine KCl-NaOH-Pufferlösung in einem pH-Bereich von 11-13,5 hier ebenfalls verwendet.

Das vorliegende Enzym war über eine 6-stündige Behandlung bei 85°C hinweg stabil und war ebenfalls über eine 6-stündige Wärmebehandlung bei pH 3,5-10,0 und Raumtemperatur hinweg stabil.

(4) Reaktivität

Hinsichtlich des erhaltenen Enzyms sind in den 14 und 15 jeweils die Reaktivität bei verschiedenen Temperaturen und die Reaktivität bei verschiedenen pH gezeigt. Die Messung der Enzymaktivität wurde gemäß den Meßverfahren in Beispiel II-1 unter Verwendung von Maltotriosyltrehalose durchgeführt und eine Natriumcitratpufferlösung wurde in einem pH-Bereich von 2-4 (☐) verwendet, und ähnlich wurden jeweils eine Natriumacetatpufferlösung in einem pH-Bereich von 4-5,5 (•), eine Natriumphosphatpufferlösung in einem pH-Bereich von 5-7,5 (&Dgr;) und eine Tris-HCl-Pufferlösung in einem pH-Bereich von 8-9 (♢) verwendet.

Die optimale Reaktionstemperatur des vorliegenden Enzyms lag ungefähr innerhalb 70-85°C und der optimale Reaktions-pH des vorliegenden Enzyms ist ungefähr innerhalb 4,5-5,5.

(5) Einfluß verschiedener Aktivatoren und Inhibitoren

Ob die in Tabelle 15 aufgeführten Substanzen, eine aktivierende Aktivität oder inhibierende Aktivität aufwiesen, wurde unter Verwendung eines ähnlichen Aktivitätsmeßverfahrens wie dem in Beispiel II-1 beurteilt. Genauer gesagt wurden die aufgeführten Substanzen individuell zusammen mit dem Substrat zu dem Reaktionssystem gegeben, wie bei dem Verfahren zur Messung der Maltrotriosyltrehalosehydrolysierenden Aktivität, das in Beispiel II-1 eingesetzt wurde. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß Kupferion und Natriumdodecylsulfat (SDS) inhibierende Wirkungen aufweisen. Bei der inhibierenden Wirkung von SDS kehrte die inhibierende Wirkung durch SDS jedoch zurück, nachdem SDS durch Dialyse, Ultrafiltrierung oder dgl. entfernt wurde. Obgleich festgestellt wurde, daß viele Glucid-verwandte Enzyme durch Calciumion aktiviert werden, wurde das vorliegende Enzym nicht durch Calciumion aktiviert.

Tabelle 15

(6) Substratspezifität

Die hydrolysierenden Eigenschaften wurden untersucht, indem 25,0 Einheiten/ml (in bezug auf die Enzymaktivität wenn Maltotriosyltrehalose als Substrat verwendet wird) des vorliegenden gereinigten Enzyms auf verschiedene 10 mM Substrate (außer Amylopectin und lösliche Stärke, die als 2,8 % Lösung verwendet wurden), die unten in Tabelle 16 aufgeführt sind, gewirkt wurde und die hydrolysierten Produkte auch analysiert wurden. Die Analyse wurde durch TSK-Gel Amid-80 HPLC, das in Beispiel II-1 beschrieben ist, durchgeführt, wobei der Index die Aktivität war sowohl Monosaccharid als auch Disaccharid herzustellen, wenn das Substrat eines der verschiedenen Maltooligosaccharide: Amylose DP-17, Amylopectin, lösliche Stärke, verschiedene Isomaltooligosaccharide und Panose war, die Aktivität &agr;,&agr;-Trehalose herzustellen war, wenn das Substrat eines der verschiedenen Trehaloseoligosaccharide und &agr;-1,&agr;-1-übertragenes Isomer von Amylose DP-17 (das Oligosaccharid, das von Amylose DP-17 abstammt, durch Übertragen der Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten vom reduzierenden Ende in einer &agr;-1,&agr;-1-Bindung) war und die Aktivität Glucose herzustellen war, wenn das Substrat Maltose oder &agr;,&agr;-Trehalose war.

Jede Enzymaktivität in Tabelle 16 wurde im übrigen als Einheit ausgedrückt, wobei 1 Einheit der Aktivität entspricht 1 &mgr;mol von jedem der Monosaccharide und Disaccharide pro Stunde freizusetzen.

Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 16 und in den 1619 aufgeführt.

Tabelle 16

Bemerkungen: Glucosyltrehalose, Maltosyltrehalose, Maltotetraosyltrehalose, Maltopentasyltrehalose und das &agr;-1,&agr;-1-übertragene Isomer von Amylose DP-17 wurden alle gemäß dem Verfahren zur Herstellung von Maltotriosyltrehalose in Beispiel II-1 hergestellt.

Die Ergebnisse der Analysen durch AMINEX HPX-42A HPLC, durchgeführt auf Reaktionsprodukte von Maltopentaose, Amylose DP-17 und lösliche Stärke, sind jeweils in A, B und C der 17 gezeigt. Der Ergebnisse der Amylasen durch TSK-Gel Amid-80 HPLC, durchgeführt auf Reaktionsprodukte von Maltotriosyltrehalose und Maltopentaosyltrehalose sind jeweils in 18 und 19 gezeigt.

Durch die Ergebnisse wurde bestätigt, daß das vorliegende gereinigte Enzym sehr wirksam auf ein Trehaloseoligosaccharid wirkt, wobei der Glucoserest am reduzierenden Ende &agr;-1,&agr;-1-gebunden ist, wie Maltotriosyltrehalose, um ein entsprechendes Maltooligosaccharid, das einen Polymerisierungsgrad der auf zwei reduziert ist, freizusetzen. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß das vorliegende gereinigte Enzym hauptsächlich Glucose oder Maltose aus Maltose (G2)-Maltoheptaose (G7), Amylose und lösliche Stärke freisetzt. Das vorliegende gereinigte Enzym wirkte jedoch nicht auf &agr;,&agr;-Trehalose, das eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung aufweist, Isomaltose, Isomaltotriose, Isomaltotetraose und Isomaltopentaose, bei denen alle Zuckereinheiten &agr;-1,6-gebunden sind und Panose, bei dem die zweite Bindung vom reduzierenden Ende &agr;-1,6 ist.

(7) Amylaseaktivität vom Endotyp

200 Einheiten/ml (in bezug auf die Enzymaktivität wenn Maltotriosyltrehalose als Substrat verwendet wird) des gereinigten Enzyms wurden auf lösliche Stärke eingewirkt und die Änderung im Färbungsgrad durch die Iodreaktion mit dem Zeitverlauf und die Stärke-hydrolysierende Rate, die durch die hergestellten Mengen an Monosaccharid und Disaccharid geschätzt wurden, wurden unter Verwendung des Verfahrens zur Messung der Stärke-hydrolysierenden Aktivität, die in Beispiel II-1 beschrieben ist, und durch das AMINEX HPX-42A HPLC-Analyseverfahren untersucht.

Wie in 20 gezeigt, verringerte sich die hydrolysierende Rate des vorliegenden gereinigten Enzyms zu dem Punkt wenn sich der Färbungsgrad durch die Iodreaktion auf 50 % verringerte, und betrug so wenig wie 3,7 %. Folglich wurde bestätigt, daß das vorliegende gereinigte Enzym eine Eigenschaft einer Amylase von Endotyp aufweist.

(8) Untersuchung des Wirkmechanismus

Uridindiphosphoglucose [Glucose-t-3H] und Maltotetraose wurden in Reaktion gesetzt mit Glycogensynthase (abstammend von dem Skelettmuskel des Kaninchens, G-2259, hergestellt von Sigma Co.) um Maltopentaose zu synthetisieren, wobei der Glucoserest des nicht-reduzierenden Endes mit 3H radioaktiv markiert wurde und die Maltopentaose isoliert und gereinigt wurde. Zu 10 mM dieser mit 3H radioaktiv markierten Maltopentaose als Substrat, wurden 10 Einheiten/ml (in bezug auf die Enzymaktivität wenn Maltotriose als Substrat verwendet wird) der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 zugegeben und in Reaktion bei 60°C 3 Stunden gesetzt. Maltotriosyltrehalose, dessen Glucoserest am nicht-reduzierenden Ende mit 3H radioaktiv markiert wurde, wurde dadurch synthetisiert und das Produkt wurde isoliert und gereinigt. [Anzumerken ist, daß durch den folgenden Verfahrensablauf bestätigt wurde, daß der Glucoserest vom nicht-reduzierenden Ende radioaktiv markiert worden ist: Das obige Produkt wurde vollständig in Glucose und &agr;,&agr;-Trehalose durch Glucoamylase (abstammend vom Rhizopus, hergestellt von Seikagaku Kougyou Co.) zersetzt, die Resultanten wurden durch Dünnschichtchromatographie geprüft und ihre Aktivitäten wurden durch einen flüssigen Szintillationszähler gemessen. Als Ergebnis wurde keine Radioaktivität in der &agr;,&agr;-Trehalose-Fraktion aber in der Glucose-Fraktion beobachtet.]

Die oben hergestellte Maltopentaose und Maltotriosyltrehalose, deren Glucosereste der nichtreduzierenden Enden mit 3H radioaktiv markiert wurden, wurden als Substrate verwendet, und in Reaktionen mit jeweils 50 Einheiten/ml und 5 Einheiten/ml des in Beispiel II-2 erhaltenen gereinigten Enzyms gesetzt. Proben wurden vor der Reaktion und 0,2, 1 und 3 Stunden nach dem Beginn der Reaktion bei 60°C durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Dünnschichtchromatographie (Kieselgel 60, hergestellt von Merck Col, Lösungsmittel: Butanol/Ethanol/Wasser = 5/5/3) entwickelt. Jeder so erhaltene Punkt, der jedem Saccharid entspricht, wurde gesammelt und seine Reaktivität wurde mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Die Ergebnisse sind jeweils in 21 und 22 dargestellt.

Wie aus den 21 und 22 ersichtlich ist, wurde wenn Maltopentaose als Substrat verwendet wurde, keine Radioaktivität in den Fraktionen der Hydrolysate, d.h. Glucose und Maltose, aber in den Fraktionen von Maltotetraose und Maltotriose nachgewiesen. Auf der andere Seite wurde wenn Maltotriosyltrehalose als Substrat verwendet wurde, keine Radioaktivität in der Fraktion des Hydrolysats, d.h. &agr;,&agr;-Trehalose, aber in der Fraktion von Maltotriose nachgewiesen.

Folglich wurde in bezug auf den Wirkmechanismus, das vorliegende gereinigte Enzym Amylaseaktivität der Funktion von Endotyp und zusätzlich Aktivität hauptsächlich Monosaccharid und Disaccharid von der reduzierenden Seite aufweist.

Zusätzlich wurde jedes der in Beispielen II-3 und II-4 erhaltenen gereinigten Enzyme, d.h. solche die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stam ATCC 33909 abstammen, jeweils ebenfalls auf die Enzymeigenschaften in dieser Art und Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind oben in Tabelle 2 gezeigt.

Vergleichsbeispiele II-1: Eigenschaften pankreatischer &agr;-Amylase verschiedene Oligosaccharide zu hydrolysieren und Analysen der Hydrolysate

Pankreatische &agr;-Amylase vom Schwein ist bekannt dafür, Maltooligosaccharid vom reduzierenden Ende durch zwei oder drei Zuckereinheiten zu hydrolysieren ["Denpun·Kanren Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimentelles Verfahren in Enzymen für Stärke und verwandte Saccharide"), S. 135, geschrieben von Michinori Nakamura und Keiji Kainuma, veröffentlicht von Gakkai-Shuppan-Sentah]. Daraufhin wurde pankreatische &agr;-Amylase vom Schwein (hergestellt von Sigma Co., &agr;-6255) auf hydrolysierende Eigenschaften untersucht und die Hydrolysate als Vergleichsbeispiel der erfindungsgemäßen neuen Amylase verwendet. Genauer gesagt wurden 1 Einheit/ml pankreatische &agr;-Amylase vom Schwein auf 10 mM jedes der in der nachfolgend beschriebenen Tabelle 17 aufgeführten Substrate bei pH 6,9 und 20°C gewirkt, wobei 1 Einheit definiert ist als die Enzymmenge mit der 1 mg pro 3 min eines reduzierenden Saccharids, entsprechend Maltose, bei pH 6,9 und 20°C aus Stärke, die als Substrat benutzt wird, hergestellt wird. Die Aktivität Disaccharid und Trisaccharid herzustellen wurde als Index der Enzymaktivität eingesetzt und die Analyse wurde durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren durchgeführt.

Anzumerken ist, daß die Enzymaktivitätswerte in Tabelle 17 in einer solchen Einheit ausgedrückt sind, daß eine Einheit der Aktivität 1 &mgr;ml jedes Oligosaccharid pro Stunde freizusetzen, entspricht.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 17 unten und in 23 und 24 gezeigt.

Tabelle 17

Bemerkungen: Glucosyltrehalose, Maltosyltrehalose, Maltotetraosyltrehalose und Maltopentaosyltrehalose wurden gemäß dem Verfahren zur Herstellung von Maltotriosyltrehalose in Beispiel II-1 hergestellt.

Die Ergebnisse der Analysen durch TSK-Gel Amid-80 HPLC, die mittels Reaktionsprodukten von Maltopentaosyltrehalose durchgeführt wurden, sind in 24 gezeigt.

So wurde bestätigt, daß die pankreatische Amylase aus Maltotetraose (G4) – Maltoheptaose (G7) Maltose oder Maltotriose und ein entsprechendes Maltooligosaccharid, das einen Polymerisierungsgrad aufweist, der um zwei oder drei reduziert ist, herstellt aber keine &agr;,&agr;-Trehalose aus Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose, bei dem der Glucoserest am reduzierenden Ende &agr;-1,&agr;-1-gebunden ist, freisetzt und zusätzlich geringe Reaktivitäten auf solche Trehaloseoligosaccharide aufweist.

Beispiel II-6: Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose aus löslicher Stärke und verschiedenen Stärkehydrolysaten

Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose wurde wie folgt versucht, wobei der Synergismus zwischen Enzymen ausgenutzt wird.

Als Enzyme wurden verwendet 150 Einheiten/ml des in Beispiel II-2 erhaltenen vorliegenden gereinigten Enzyms und 10 Einheiten/ml der gereinigten Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt.

Substrate waren eine lösliche Stärke (hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller Reinigungsgrad), als ein Stärkehydrolysat, eine lösliche Stärke, die zuvor der Hydrolyse der &agr;-1,6-Bindungen bei 40°C 1 Stunde mit 25 Einheiten/ml Pullulanase (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), abstammend von Klebsiella pneumoniae, unterworfen worden war, als weiteres Stärkehydrolysat, eine lösliche Stärke, die vorher Teilhydrolysen unter Bedingungen von 30°C 2,5 Stunden mit 12,5 Einheiten/ml &agr;-Amylase (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.), abstammend vom Bacillus amylolichefaciens, Pine-dex #1 und Pine-dex #3 (beide hergestellt von Matsutani Kagaku Co.), unterworfen worden war, wobei jedes Maltooligosaccharid von G3-G7 (hergestellt von Hayashibara Biochemical Co.) und Amylose DP-17, (hergestellt von Hayashibara Biochemical Co.) war,

die Endkonzentration jedes Substrats betrug 10 %, und

jede Reaktion wurde ungefähr unter Bedingungen von 60°C bei pH 5,5 100 Stunden durchgeführt.

Jede Reaktionsmischung wurde mit in Beispiel II-1 beschriebenen AMINEX HPX-42A HPLC-Verfahren analysiert, gemäß dem Fall, bei dem lösliche Stärke als Substrat verwendet wird.

Nachdem das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, wurde die &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert.

Hinsichtlich der Aktivität der neuen erfindungsgemäßen Amylase ist festzuhalten, daß 1 Einheit als Enzymaktivität definiert ist 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in Beispiel II-1.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 ist festzuhalten, daß 1 Einheit definiert ist, als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat verwendet wurde, freizusetzen.

Hinsichtlich der Pullulanaseaktivität ist festzuhalten, daß 1 Einheit definiert ist als die Enzymaktivität 1 &mgr;m Maltotriose pro Minute bei pH 6,0 und 30°C aus Pullulan, das als Substrat eingesetzt wurde, freizusetzen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 unten gezeigt.

Tabelle 18

Die Ergebnisse der Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC, die mit dem Reaktionsprodukt von löslicher Stärke durchgeführt wurde, sind in 25 gezeigt.

Genauer gesagt wurde, wenn lösliche Stärke als Substrat verwendet wurde, &agr;,&agr;-Trehalose in einer Ausbeute von 37,0 % hergestellt. Hinsichtlich der verschiedenen Stärkehydrolysate betrug die Ausbeute 62,1 % wenn lösliche Stärke der Hydrolyse der &agr;-1,4-Bindung unterworfen worden war und als Substrat verwendet wurde. Darüber hinaus betrugen bei verschiedenen Maltooligosacchariden und Amylose DP-17, bei denen alle Bindungen &agr;-1,4-Bindungen sind, die Ausbeuten jeweils 36,4-67,1 % und 83,5 %. Diese Ergebnisse deuten an, daß die Ausbeute des Endproduktes, d.h. &agr;,&agr;-Trehalose, höher wird wenn ein solches Substrat verwendet wird, das eine längere &agr;-1,4-gebundene gerade Kette aufweist.

Beispiel II-7: Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose aus löslicher Stärke bei verschiedenen Enzymkonzentrationen

Die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose wurde versucht durch Ausnutzen des Synergismus zwischen Enzymen, wobei die Enzyme mit Konzentrationen, die in Tabelle 19 aufgeführt sind, jeweils zu einem Substrat (Endkonzentration: 10 %) gegeben wurden. Genauer gesagt entsprachen die Enzyme dem in Beispiel II-2 erhaltenen Enzym und der gereinigten Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, das Substrat war eine lösliche Stärke, die unter Bedingungen von 40°C 1 Stunde mit 25 Einheiten/ml Pullulanase vorbehandelt worden war (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), abstammend von Klebsiella pneumoniae, und die Reaktion wurde unter Bedingungen von 60°C bei pH 5,5 100 Stunden durchgeführt. Nachdem das nicht-reagierte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das wie in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Ami-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten &agr;,&agr;-Trehalose zu überprüfen.

In bezug auf die Aktivität der neuen erfindungsgemäßen Amylase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in Beispiel II-1.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat angesetzt wird, herzustellen.

Hinsichtlich der Aktivität von Pullulanase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Maltotriose pro Minute bei pH 6,0 und 30°C aus Pullulan, das als Substrat verwendet wird, herzustellen.

Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 19 gezeigt.

Tabelle 19 &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute (%)

Wie aus den Ergebnissen in der gezeigten Tabelle ersichtlich ist, erreichte die &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute ihr Maximum, d.h. 65,1 %, in einem Fall mit 20 Einheiten/ml Transferase und 150 Einheiten/ml Amylase.

Vergleichsbeispiel II-2: Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Verwendung von Amylase, die von anderen Organismen abstammt

Die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose, die den Synergismus zwischen Enzymen ausnutzt, wurde wie folgt unternommen:

Amylasen, abstammend von Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis und Aspergillus oryzae (jeweils 100200 hergestellt von Seikagaku Kougyou Co., &agr;-3403 und &agr;-0273, hergestellt von Sigma Co., wobei alle bei 60°C aktiv sind) wurden gemäß der vorliegenden Erfindung als Vergleichssubstitutionen der neuen Amylasen verwendet, die zusammen verwendete gereinigte Transfervase stammte vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 ab,

das Substrat war ein lösliche Stärke (Endkonzentrations 10 %), die unter Bedingungen von 40°C 1 Stunde mit 25 Einheiten/ml Pullulanase (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), abstammend von Klebsiella pneumoniae, behandelt worden war,

die Enzyme mit jeweils den in Tabelle 20 aufgeführten Konzentrationen wurden zu dem Substrat gegeben, und

die Reaktion wurde unter Bedingungen bei 60°C, pH 5,5 ungefähr 100 Stunden durchgeführt. Nachdem nicht-umgesetztes Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten &agr;,&agr;-Trehalose zu überprüfen.

Hinsichtlich der Enzymaktivität jeder Amylase ist 1 Einheit definiert, als die Absorption bei 620 nm bei der sich die violette Farbe des Stärke-Iod-Komplexes um 10 % pro 10 min verringert, wobei die gleichen Herstellungsbedingungen, wie in Beispiel II-1, eingesetzt wurden.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat verwendet wird, herzustellen.

Hinsichtlich der Aktivität von Pullulanase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Maltotriose pro Minute bei pH 6,0 und 30°C aus Pullulan, das als Substrat verwendet wird, herzustellen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 unten gezeigt.

Tabelle 20 &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute (%)

Wie aus den Ergebnissen in der Tabelle ersichtlich wird, ist obgleich &agr;,&agr;-Trehalose unter Verwendung von Amylasen, die von anderen Organismen abstammt, hergestellt wird die Ausbeute in jedem Fall niedriger als in dem Fall, in dem das neue erfindungsgemäße Enzym verwendet wird.

Beispiel II-8: Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose aus Amylose DP-17 in verschiedenen Enzymkonzentrationen

Die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde angestrebt durch Zugabe der Enzyme jeweils in den in Tabelle 21 aufgeführten Konzentrationen (Endkonzentration: 10 %). Genauer gesagt waren die Enzyme das in Beispiel II-2 erhaltene gereinigte Enzym und die gereinigte Transferase, abstammend von Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, das Substrat war Amylose DP-17 (hergestellt von Hayashibara Biochemical Co.), und die Reaktion wurde unter Bedingungen bei 60°C bei pH 5,5 ungefähr 100 Stunden durchgeführt. Nachdem das nicht-reagierte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten &agr;,&agr;-Trehalose zu überprüfen.

Hinsichtlich der Aktivität der neuen erfindungsgemäßen Amylase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, nämlich wie in Beispiel II-1.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, ist 1 Einheit definiert als Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stundee bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat verwendet wird, herzustellen.

Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 21 gezeigt.

Tabelle 21 &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute (%)

Wie aus den Ergebnissen in der Tabelle ersichtlich ist, erreichte die &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute ihr Maximum, d.h. 83,4 %, in einem Fall mit 10 Einheiten/ml Transferase und 150 Einheiten/ml Amylase wenn Amylose DP-17, das aus einer geraden Kette konstruiert mit &agr;-1,4-Bindungen besteht als Substrat verwendet wurde.

Beispiel II-9: &agr;,&agr;-Trehaloseherstellung bei verschiedenen Konzentrationen wie löslicher Stärke

Die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde angestrebt durch Zugabe der Enzyme mit jeweils den in Tabelle 22 aufgeführten Konzentrationen zu einem Substrat, deren Endkonzentration auf 5 %, 10 %, 20 % oder 30 % eingestellt wurde. Genauer gesagt waren die Enzyme das in Beispiel II-2 erhaltene vorliegende gereinigte Enzym und die gereinigte Transferase, abstammend von Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, das Substrat war lösliche Stärke, und die Reaktion wurde unter Bedingungen von 60°C bei pH 5,5 ungefähr 100 Stunden durchgeführt. Während der Reaktion wurde nach dem Start eine Behandlung bei 40°C 1 Stunde unter Zugabe von Pullulanase (ein Produkt, abstammend von Klebsiella pneumoniae, hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), um 5 Einheiten/ml zu übertragen, alle 12 Stunden, nämlich insgesamt 9-mal einschließlich der Behandlung bei 0 Stunden durchgeführt.

Nachdem das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase umgesetzt wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das wie in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten &agr;,&agr;-Trehalose zu überprüfen.

Hinsichtlich der Aktivität der erfindungsgemäßen neuen Amylase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in Beispiel II-1.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, ist 1 Einheit definiert als die enzymatische Aktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen. Hinsichtlich der Aktivität der Pullulanase ist 1 Einheit definiert als die enzymatische Aktivität 1 &mgr;mol Maltotriose pro Minute bei pH 6,0 und 30°C aus Pullulan, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.

Die Resultate sind unten in Tabelle 22 gezeigt.

Tabelle 22

Wie aus den Ergebnissen in der Tabelle ersichtlich ist, kann sogar wenn die Konzentration der löslichen Stärke als Substrat in einem Bereich von 5-30 % variiert wurde die &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute 70 % oder höher sein, vorausgesetzt daß die Konzentrationen der Amylase und Transferase auf optimale Bedingungen eingestellt sind.

Beispiel II-10: Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose aus löslicher Stärke mit verschiedenen Pullulanase-Behandlungen

Die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Ausnutzung der Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt angestrebt:

Die Enzyme waren das in Beispiel II-2 erhaltene vorliegende gereinigte Enzym und die gereinigte Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus KM1,

das Substrat war lösliche Stärke (Endkonzentration: 10 %), die Enzyme wurden jeweils in den in Tabelle 23 aufgeführten Konzentrationen zu dem Substrat gegeben, und

die Reaktion wurde unter den Bedingungen von 60°C bei pH 5,5 ungefähr 120 Stunden durchgeführt. Während der Reaktion wurden ein oder mehrere Pullulanasebehandlungen unter einem der folgenden Zeitpläne durchgeführt: 1-mal 24 Stunden nach dem Start (a) (hiernach "nach dem Start" wird weggelassen), 1-mal bei 48 Stunden (b), 1-mal bei 72 Stunden (c), 1-mal bei 96 Stunden (d), alle 24 Stunden von 24 bis 96 Stunden, insgesamt 4-mal (e), alle 12 Stunden von 0 bis 96 Stunden, insgesamt 7-mal, einschließlich der Behandlung bei 0 Stunden (f) und alle 3 Stunden zu Beginn der Reaktion (d.h. von 0 bis 12 Stunden, insgesamt 5-mal einschließlich der Behandlung bei 0 Stunden und zusätzlich alle 12 Stunden von 24 bis 96 Stunden, insgesamt 7-mal (g). Alle Pullulanasebehandlungen wurden unter Bedingungen von 40°C 1 Stunde nach der Zugabe von Pullulanase (ein Produkt, abstammend von Klebsiella pneumoniae) durchgeführt, so daß die Konzentrationen jeweils den Konzentrationen der Tabelle 23 entsprechen.

Nachdem das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten &agr;,&agr;-Trehalose zu überprüfen.

Hinsichtlich der Aktivität der vorliegenden neuen Amylase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in Beispiel II-1.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.

Hinsichtlich der Aktivität von Pullulanase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Maltotriose pro Minuten bei pH 6,0 und 30°C aus Pullulan, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 unten gezeigt.

Wie aus den in der Tabelle gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, kann die Ausbeute durch Einführen einer Pullulanasebehandlung während der Reaktion verbessert werden. Insbesondere kann die &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute weiter verbessert werden durch ein Verfahren, bei dem eine Vielzahl von Pullulanasebehandlungen durchgeführt wird oder durch ein Verfahren, bei dem eine Vielzahl von Pullulanasebehandlungen zu Beginn der Reaktion durchgeführt wird. Die &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute erreichte ihr Maximum d.h. 80,9 % unter den Bedingungen mit 10 Einheit/ml Transferase, 150 Einheiten/ml Amylase, der Pullulanasebehandlung nach (g) und 5 Einheiten/ml Pullulanase.

Beispiel II-11: &agr;,&agr;-Trehaloseherstellung bei verschiedenen Amylose DP-17-Temperaturen und verschiedenen Reaktionstemperaturen

Die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Ausnützung des Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt angestrebt:

Das in Beispiel II-2 erhaltene vorliegende gereinigte Enzym und die gereinigte Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, wurden jeweils zugegeben, um 320 Einheiten/g Substrat und 20 Einheiten/g Substrat zu ergeben,

das Substrat war Amylose DP-17, und

die Reaktion wurde ungefähr 100 Stunden mit der Substratkonzentration und Reaktionstemperatur, die in Tabelle 24 oder 25 gezeigt sind, durchgeführt.

Nachdem das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten &agr;,&agr;-Trehalose und die Reaktionsrate zu überprüfen.

Hinsichtlich der Aktivität der neuen erfindungsgemäßen Amylase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in Beispiel II-1.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.

Die Ergebnisse sind unten in den Tabellen 24 und 25 gezeigt.

Anzumerken ist, daß hinsichtlich der Reaktionsrate, die in Tabelle 24 gezeigt ist, 1 Einheit definiert ist als die Rate 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde freizusetzen.

Tabelle 24 Reaktionsrate (Einheiten/ml)
Tabelle 25 Reaktionsausbeute (%)

Aus den in den Tabellen gezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, daß sich die Reaktionsrate in Abhängigkeit von der Temperatur erhöht, wenn die Reaktionstemperatur auf einen Bereich von 40-80°C heraufgesetzt wird. Bei einer hohen Substratkonzentration (30-40 %) wird das Substrat darüber hinaus unlöslich und die Ausbeute verringert sich deutlich wenn die Temperatur niedrig ist (40-50°C), wohingegen das Substrat löslich wird und die Ausbeute hoch bleiben kann, wenn die Temperatur hoch ist. Die Ausbeute erreichte 75,1 %.

Den Ergebnissen dieses Beispiels ist zu entnehmen, daß ein Präparat bei einer hohen Temperatur in einer hohen Konzentration möglich sein wird, indem die sehr wärmestabile erfindungsgemäße Amylase verwendet wird und daher kann ein Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose bereitgestellt werden, das hinsichtlich der Kosten und leichten Handhabung vorteilhaft ist.

Beispiel II-12: Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Verwendung von wärmestabiler Pullulanase bei verschiedenen Konzentrationen löslicher Stärke und verschiedenen Reaktionstemperaturen

Die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt angestrebt:

Das vorliegende in Beispiel II-2 erhaltene gereinigte Enzym, die gereinigte Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, und eine herkömmlich erhältliche wärmestabile Pullulanase wurden zugegeben, so daß sie jeweils 1280 Einheiten/g/Substrat, 80 Einheiten/g/Substrat und 32 Einheiten/g/Substrat betrugen, wobei die Pullulanase ("Debranching Enzyme Amano, ein Produkt abstammend von Bacillus sp., hergestellt durch Amano Pharmaceutical Co.) TOSHO TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 6505 hydrophober Chromatographie unterworfen worden ist, um co-existierende Glucoamylaseaktivität und &agr;-Amylaseaktivität zu entfernen,

das Substrat war lösliche Stärke, und

die Reaktion wurde ungefähr 100 Stunden mit der Substratkonzentration und Reaktionstemperatur, die in Tabelle 26 oder 27 gezeigt sind, durchgeführt.

Nachdem das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten &agr;,&agr;-Trehalose und die Reaktionsrate zu überprüfen.

Hinsichtlich der Aktivität der erfindungsgemäßen neuen Amylase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in Beispiel II-1.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen. Hinsichtlich der Aktivität von Pullulanase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Maltotriose pro Minute bei pH 5,5 und 60°C aus Pullulan, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.

Die Ergebnisse sind in Tabellen 26 und 27 unten gezeigt. Anzumerken ist, daß hinsichtlich der Reaktionsrate, die in Tabelle 26 gezeigt ist, eine Einheit definiert ist als die Rate 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde freizusetzen.

Tabelle 26 Reaktionsrate (evtl. Reaktionsgeschwindigkeit) (Einheiten/ml)
Tabelle 27 Reaktionsausbeute (%)

Anzumerken ist, daß wenn die Reaktion mit einer Substratkonzentration von 10 % und einer Reaktionstemperatur von 60°C unter den gleichen Bedingungen wie oben durchgeführt wurde, außer daß keine wärmestabile Pullulanase zugegeben wurde, die Ausbeute 35,0 % betrug.

Durch die in den Tabellen gezeigten Ergebnisse wurde festgestellt, daß nur durch Zugabe der wärmestabilen Pullulanase während der Reaktion eine Ausbeute-verbessernde Wirkung erbracht wird und daß sich die Reaktionsrate im Abhängigkeit von der Temperatur erhöht, wenn die Reaktionstemperatur auf einen Bereich von 40-60°C heraufgesetzt wird. Mit einer hohen Substratkonzentration (20-30 %) wird das Substrat darüber hinaus unlöslich und die Ausbeute verringert sich deutlich, wenn die Temperatur niedrig ist (40-50°C), wohingegen das Substrat löslich wird und die Ausbeute hoch bleiben kann, wenn die Temperatur hoch ist (60°C). Die Ausbeute erreichte 74,1 %.

Beispiel II-13: Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose aus löslicher Stärke mit Isoamylasebehandlungen

Die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt angestrebt:

Das in Beispiel II-2 erhaltene vorliegende gereinigte Enzym und die gereinigte Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, wurden zugegeben, um jeweils 1280 Einheiten/g/Substrat und 80 Einheiten/g/Substrat zu ergeben,

das Substrat war lösliche Stärke (Endkonzentration: 10 %), und

die Reaktion wurde bei 60°C und einem pH von 5,0 ungefähr 100 Stunden durchgeführt. Während der Reaktion wurde ein Isoamylasebehandlung alle 3 Stunden in einem frühen Stadium der Reaktion durchgeführt, d.h. von 0 Stunden bis 12 Stunden nach dem Start (hiernach "nach dem Start" wird weggelassen), insgesamt 5-mal einschließlich der Behandlung bei 0 Stunden und zusätzlich alle 24 Stunden von 24 Stunden bis 96 Stunden, insgesamt 3-mal. Jede Isoamylase-Behandlung wurde unter den Bedingungen von 40°C 1 Stunde nach der Isoamylasezugabe (ein Produkt abstammend von Pseudomonas amylodermaosa, hergestellt von Seikagaku Kougyou Co.), so daß sich die in Tabelle 28 gezeigte Konzentration ergab, durchgeführt.

Nachdem das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten &agr;,&agr;-Trehalose zu überprüfen.

Hinsichtlich der Aktivität der erfindungsgemäßen neuen Amylase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in Beispiel II-1.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, wird 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.

Die Isoamylaseaktivität wurde wie folgt gemessen: Ein halber Milliliter 1%iger löslicher Stärke, abstammend von unlöslicher Reisstärke, wurde mit 0,1 ml einer 0,5 M Essigsäurepufferlösung (pH 3,5) und 0,1 ml Enzymlösung gemischt, und bei 40°C umgesetzt, das Absorptionsvermögen bei 610 nm entsprechend der violetten Farbe des Amylose-Iod-Komplexes wurde mit einer Küvette mit einer Breite von 1 cm bestimmt ["Denpun·Kanren Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimentelle Verfahren in Enzymen bei Stärke und verwandten Sacchariden"), geschrieben von Michinori Nakamura und Keiji Kainuma, veröffentlicht von Gakkai-Shuppan-Sentah, 1989]; und 1 Einheit ist definiert als die Enzymmenge bei der sich das Absorptionsvermögen um 0,1 pro Stunde erhöht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 28 unten gezeigt.

Tabelle 28

Aus den in den Tabellen gezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Ausbeute durch Einführen von Isoamylasebehandlungen während der Reaktion verbessert werden kann, ähnlich wie bei Pullulanase (ein Produkt abstammend von Klebsiella pneumoniae). Die &agr;,&agr;-Trehaloseausbeute erreicht 75,7 %.

Beispiel II-14: Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose aus löslicher Stärke mit einer Behandlung unter Verwendung eines "Debranching"-Enzyms, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1

Die Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt angestrebt:

Das vorliegende in Beispiel II-2 erhaltene gereinigte Enzym, die gereinigte Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, und ein "Debranching"-Enzym, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 (das Enzym wurde aus dem Zellextrakt gemäß dem Verfahren in Referenzbeispiel II-3 isoliert und gereinigt), wurden zugegeben, um jeweils 1280 Einheiten/g/Substrat, 80 Einheiten/g/Substrat und die in der nachfolgend beschriebenen Tabelle gezeigten Konzentrationen zu ergeben,

das Substrat war lösliche Stärke (Endkonzentration: 10 %), und

die Reaktion wurde bei 60°C und einem pH von 5,0 ungefähr 100 Stunden durchgeführt.

Nachdem das nicht-reagierte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten &agr;,&agr;-Trehalose zu überprüfen.

Hinsichtlich der Aktivität der erfindungsgemäßen neuen Amylase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in Beispiel II-1.

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.

Die Aktivität des "Debranching"-Enzyms, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, wurde wie folgt gemessen: Ein halber Milliliter 1%iger löslicher Stärke, abstammend von unlöslichem Reis, wurde mit 0,1 ml einer 0,5 M Essigsäurepufferlösung (pH 5,0) und 0,1 ml Enzymlösung gemischt und bei 60°C umgesetzt, das Absorptionsvermögen bei 610 nm, entsprechend der violetten Farbe des Amylose-Iod-Komplexes, wurde mit einer Küvette mit einer Breite von 1 cm gemessen, und 1 Einheit ist definiert als die Enzymmenge, bei der sich das Absorptionsvermögen um 0,1 pro Stunde erhöht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 29 unten gezeigt.

Tabelle 29

Wie aus den in den Tabellen gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, kann die Ausbeute verbessert werden durch nur einmalige Zugabe des "Debranching"-Enzyms, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, während der Reaktion, ähnlich wie bei Pullulanase (Debranching Enzyme Amano, ein Produkt abstammend von Bacillus sp.) ist. Die &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute erreichte 69,8 %.

Referenzbeispiel II-1: Herstellung von übertragenen Oligosaccharid durch Transferase bei verschiedenen Amylose DP-17-Konzentrationen und verschiedenen Reaktionstemperaturen

Unter Verwendung von Amylose DP-17 als Substrat, wurde das entsprechende Trehaloseoligosaccharid, wobei der Glucoserest an der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1-gebunden ist, hergestellt, und zwar durch Zugabe der gereinigten Transferase abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, um 20 Einheiten/g Substrat zu ergeben, und durch Durchführen der Reaktion bei den in Tabelle 30 oder 31 gezeigten Substratkonzentrationen und Reaktionstemperaturen ungefähr 100 Stunden.

Hinsichtlich des entsprechenden Trehaloseoligosaccharids, bei dem der Glucoserest am reduzierenden Ende &agr;-1,&agr;-1-gebunden ist, wurden die Ausbeute und die Reaktionsrate bestimmt durch die Abnahme der Menge der reduzierenden Enden, die durch das Dinitrosalicylat-Verfahren gemessen wurde ["Denpun·Kanren Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimentelle Verfahren in Enzymen bei Stärke und verwandten Sacchariden"), geschrieben von Michinori Nakamura und Keiji Kainuma, veröffentlicht von Gakkai-Shuppan-Sentah, 1989].

Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.

Die Ergebnisse sind in Tabellen 30 und 31 unten gezeigt.

Hinsichtlich der in Tabelle 30 gezeigten Reaktionsrate ist anzumerken, daß 1 Einheit definiert ist als die Rate 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde freizusetzen.

Tabelle 30 Reaktionsrate (Einheiten/ml)
Tabelle 31 Reaktionsausbeute (%)

Durch das in den Tabellen gezeigte Ergebnis wurde festgestellt, daß sich die Reaktionsrate in Abhängigkeit von der Temperatur erhöhte, wenn die Reaktionstemperatur auf einen Bereich von 40-80°C heraufgesetzt wird. Bei einer hohen Substratkonzentration (insbesondere 40 %) wird das Substrat darüber hinaus unlöslich und die Ausbeute verringert sich deutlich, wenn die Temperatur niedrig ist (40-50°C), wohingegen das Substrat löslich wird und die Ausbeute hoch bleiben kann, wenn die Temperatur hoch ist. Die Ausbeute erreichte 76,6 %.

Referenzbeispiel II-2: Messung der Löslichkeit von Amylose DP-17 in Wasser

Die Löslichkeit von Amylose DP-17 wurde wie folgt gemessen: Durch Wärmeauflösung wurden 5, 10, 20, 30 und 40%ige Amylose DP-17-Lösungen hergestellt und in temperierten Bädern gehalten, die jeweils auf 35, 40, 50, 70 und 80°C eingestellt wurden, Probeentnahmen wurden im Zeitablauf durchgeführt und die unlöslichen Materien, die in den Proben erzeugt wurden, wurden filtriert, jede der so erhaltenen Überstände wurden auf Amylose DP-17-Konzentration untersucht und die Löslichkeit bei jeder Temperatur wurde bestimmt gemäß dem Sättigungspunkt, bei dem die Konzentration das Gleichgewicht erreicht hatte.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 32 unten gezeigt.

Tabelle 32

Referenzbeispiel II-3: Reinigung des "Debranching"-Enzyms abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1

Der Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nummer 1304 im Katalog über Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle betrug 3,3 g/l.

82 g der oben erhaltenen Bakterienzellen wurden in 400 ml einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung zur Bakteriolyse bei 0°C 15 Minuten unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten.

Zu diesem Überstand wurde Ammoniumsulfat gegeben, um 1 M zu ergeben. Die Resultante wurde anschließend einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 800 ml), die mit 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und das "Debranching"-Enzym wurde in der durch die Säule geleiteten Fraktion gewonnen. Da Amylase, Transferase und Glucoamylase, die in dem Überstand enthalten sind, zurückgehalten wurden und an das Packmaterial der Säule, Phenyl-TOYOPEARL 6505, adsorbierten, konnte das "Debranching"-Zielenzym daraus getrennt werden.

Die Fraktion, die Aktivität entfaltete, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen und entsalzt.

Dann wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und das "Debranching"-Zielenzym wurde anschließend mit 900 ml Natriumchloridlösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mm EDTA, gewaschen und entsalzt.

Daraufhin wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen, und das "Debranching"-Zielenzym wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mM Bis-tris-iminodiessigsäure-Pufferläsung (pH 7,1) gewaschen und entsalzt.

Anschließend wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer Chromatofokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Das "Debranching"-Zielenzym wurde anschließend mit 10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia, und mit Iminodiessigsäure auf einen pH 4,0 eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen und entsalzt.

Die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung wurde weiterhin einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DATE 5PW HPLC-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen. Die Säule wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und das "Debranching"-Zielenzym wurde mit 30 ml Natriumchloridlösung bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert, um das teilgereinigte Produkt (flüssiges Produkt) des "Debranching"-Zielenzyms zu erhalten.

Anzumerken ist, daß bei diesem Reinigungsverfahren der Nachweis des "Debranching"-Zielenzyms durchgeführt wurde durch Mischen der Probelösung mit 2 Einheiten/ml der gereinigten Amylase und 32 Einheiten/ml der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, und in dem die die Mischung bei 60°C und pH 5,5 umgesetzt wurde, wobei der Index die Aktivität ist, eine höhere Ausbeute von &agr;,&agr;-Trehalose im Vergleich zu der Reaktion ohne Probelösung zu erreichen.

Die Aktivität des teilgereinigten "Debranching"-Enzyms, das durch das oben beschriebene Reinigungsverfahren erhalten wird und das vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, wurden wie folgt gemessen: Ein halber Milliliter 1%iger löslicher Stärke, abstammend von unlöslichem Reis, wurde mit 0,1 ml einer 0,5 M Essigsäurepufferlösung (pH 5,0) und 0,1 ml einer Enzymlösung gemischt und bei 60°C umgesetzt, das Absorptionsvermögen bei 610 nm entsprechend der violetten Farbe des Amylose-Iod-Komplexes wurde mit einer Küvette mit einer Breite von 1 cm gemessen und 1 Einheit ist definiert als die Enzymmenge, bei der sich das Absorptionsvermögen um 0,1 pro Stunde erhöht.

Die spezifische Aktivität des teilgereinigten "Debranching"-Enzyms, das durch das obige Reinigungsverfahren erhalten wurde, betrug 495 Einheiten/mg.

Referenzbeispiel II-4: Untersuchung des "Debranching"-Enzyms, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, auf verschiedene Eigenschaften

Das teilgereinigte "Debranching"-Enzym, das in Referenzbeispiel II-3 erhalten wurde, wurde auf seine Enzymeigenschaften untersucht.

(1) Wirkung und Substratspezifität

Die Reaktivität und Wirkung jedes Substrats wurde untersucht unter Verwendung jedes Substrats und der in Tabelle 33 unten gezeigten Aktivitätsmeßverfahren.

Das Dinitrosalicylat-Verfahren ["Denpun·Kanren Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimentelle Verfahren in Enzymen bei Stärke und verwandten Sacchariden"), geschrieben von Michinori Nakamura und Keiji Kainuma, veröffentlicht von Gakkai-Shuppan-Sentah, 1989] ist ein Verfahren zum Quantifizieren der erhöhten Menge der reduzierenden Enden, die durch Hydrolyse &agr;-1,6-Bindungen erzeugt werden.

Das Iodfärbungsverfahren wird auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel II-3 beschrieben, durchgeführt. Genauer gesagt ist dies das Verfahren zum Quantifizieren der erhöhten Menge der geradkettigen Amylose, die durch Hydrolyse von &agr;-1,6-Bindungen erzeugt wird auf Basis des erhöhten Absorptionsvermögens bei 610 nm entsprechend der violetten Farbe des Amylose-Iod-Komplexes.

Die Analyse der hydrolysierten Produkte durch flüssige Chromatographie (HPLC-Verfahren) wurde durchgeführt, um die hergestellten Oligosaccharide zu untersuchen, indem das Bio-Rad AMINEX HPX-42A HPLC-Analyseverfahren, das in Beispiel II-1 beschrieben ist, eingesetzt wurde.

Tabelle 33

Wie aus den obigen Ergebnissen ersichtlich ist, kann das vorliegende "Debranching"-Enzym 1) reduzierende Enden in Pullulan und verschiedenen Arten von Stärke erzeugen, 2) den Färbungsgrad bei der Iod-Stärke-Reaktion erhöhen, 3) Maltotriose aus Pullulan herstellen und darüber hinaus 4) wie in Beispiel II-14 gezeigt, die Ausbeute von &agr;,&agr;-Trehalose aus löslicher Stärke, das als Substrat verwendet wird, wenn das vorliegende "Debranching"-Enzym in Reaktion mit der gereinigten Amylase und Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 gebracht wird, im Vergleich zu der Reaktion ohne Zugabe des vorliegenden "Debranching"-Enzyms deutlich erhöhen. Als Konsequenz dieser Tatsachen ist anerkannt, daß das vorliegende Enzym &agr;-1,6-Bindungen in Stärke oder Pullulan hydrolysiert.

(2) Stabilität

Die Stabilität des erhaltenen teilgereinigten Enzyms, wenn es bei verschiedenen Temperaturen 3 Stunden behandelt wurde, ist in Tabelle 34 gezeigt.

Tabelle 34

Das vorliegende Enzym, das 3 Stunden bei 60°C behandelt wurde, behält immer noch 73,3 % der Anfangsaktivität.

(3) Reaktivität

Hinsichtlich des erhaltenen teilgereinigten Enzyms, sind die Reaktivität bei verschiedenen Temperaturen und Reaktivität bei verschiedenen pH-werten jeweils in den Tabellen 35 und 36 gezeigt. Bei der Messung der Enzymaktivität wurde eine Glycin-HCl-Pufferlösung in einem pH-Bereich von 3-5 verwendet und ähnlich wurden jeweils eine Natriumactat-Pufferlösung in einem pH-Bereich von 4-5,5 und eine Natriumphosphatpufferlösung in einem pH-Bereich von 5-7,5 außerdem verwendet.

Tabelle 35
Tabelle 36

Die optimale Reaktionstemperatur des vorliegenden Enzyms liegt ungefähr innerhalb 60-65°C und der optimale Reaktions-pH des vorliegenden Enzyms liegt ungefähr innerhalb 4,0-5,5.

(4) Isoelektrischer Punkt

Durch das Ergebnis der pH-Messung, die mit der "Debranching"-Enzymfraktion, die durch Chromatofokussierung isoliert wurde, durchgeführt wurde, wurde festgestellt, daß der isoelektrische Punkt bei pH 4,4 liegt.

(5) Einfluß verschiedener Aktivatoren und Inhibitoren

Der Einfluß jeder der in Tabelle 37 aufgeführten Substanz wurde auf aktivierende Wirkung oder inhibierende Wirkung untersucht, und zwar durch Zugabe der Substanz zusammen mit dem Substrat und durch Messung der Aktivität auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel II-3. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß Kupferion inhibierende Wirkungen aufweist. Obgleich festgestellt wurde, daß viele Glucid-verwandte Enzyme mit Calciumion aktiviert werden, wurde das vorliegende Enzym nicht mit Calciumion aktiviert.

Tabelle 37

Beispiel I-9: Bestimmung der der Teilaminosäuresequenzen der neuen Transferase abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1

Die Teilaminosäuresequenzen des in Beispiel I-2 erhaltenen Enzyms wurden durch das Verfahren untersucht, das von Iwamatsu et al. [Seikagaku (Biochemistry) 63, 139 (1991)] offenbart wurde. Genauer gesagt wurde die gereinigte neue Transferase in einer Pufferlösung zur Elektrophorese [10 % Glycerin, 2,5 % SDS, 2 % 2-Mercaptoethanol, 62 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 6,8)] suspendiert und eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Enzym von dem Gel auf eine Polyvinylidendilorido-(PVDF)-Membran (ProBlot, hergestellt von Applied Biosystems Co.) durch Elektroblottieren (SartoBlot Typ IIs, hergestellt von Sartorius Co.) bei 160 mA 1 Stunde übertragen.

Nach der Übertragung wurde der Teil auf den das Enzym übertragen worden war aus der Membran ausgeschnitten und in ungefähr 300 &mgr;l einer Pufferlösung zur Reduktion eingetaucht [6 M Guanidin-HCl, 0,5 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 3,5), enthaltend 0,3 % EDTA und 2 % Acetonitril]. 1 mg Dithiothreitol wurde zugegeben und die Reaktion wurde unter Argonatmosphäre bei 60°C ungefähr eine Stunde durchgeführt. Zu der Resultanten wurden 2,4 mg Monoiodessigsäure, aufgelöst in 10 &mgr;l 0,5 N Natriumhydroxid gegeben und 20 min in der Dunkelheit gerührt. Die PVDF-Membran wurde anschießend herausgenommen und ausreichend mit einer 2%igen Acetonitrillösung gewaschen und daraufhin in einer 0,1 % SDS-Lösung 5 min gerührt. Nach dem kurzen Waschen mit Wasser wurde die PVDF-Membran anschließend in 0,5 % Polyvinylpyrrolidon-40, aufgelöst in 100 mM Essigsäure, eingetaucht und 30 min stehengelassen. Anschließend wurde die PVDF-Membran mit Wasser gewaschen und ungefähr in 1 mm2-große Stücke geschnitten. Diese Stücke wurden anschließend in einer Pufferlösung eingetaucht, um verdaut zu werden [8 % Acetonitril, 90 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 9,0)], und nach der Zugabe von 1 pmol Achromobacter Protease I (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) bei Raumtemperatur 15 Stunden verdaut. Die verdauten Produkte wurde durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer C8-Säule (&mgr;-Bondashere 5C8, 300A, 2,1 × 150 mm, hergestellt von Millipore Ltd. Japan) getrennt, um 12 oder mehr Arten von Peptidfragmenten zu erhalten. Unter Verwendung des Lösungsmittels A (0,05 % Trifluoressigsäure) und des Lösungsmittels B (2-Propanol:Acetonitril = 7:3, enthaltend 0,02 % Trifluoressigsäure) als Elutionslösungsmittel, wurden die Peptide mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 2 bis 50 % im Verhältnis zu Lösungsmittel B und einer Fließrate von 0,285 ml/min 40 min eluiert. Die Aminosäuresequenzen der so erhaltenen Peptidfragmente wurden durch das automatische Edman-Zersetzungsverfahren unter Verwendung eines Gasphasen-Peptidsequenzierers (Modell Typ 470, hergestellt von Applied Biosystems Co.) bestimmt.

Die mit der Achromobacter Protease I verdauten Peptidfragmente wurden darüber hinaus einem zweiten Verdau mit Asp-N unterworfen und die resultierenden Peptidfragmente wurden unter den gleichen Bedingungen wie oben isoliert, um ihre Aminosäuresequenzen zu bestimmen.

Durch die Ergebnisse wurde festgestellt, daß die Teilaminosäuresequenzen wie folgt sind.

Peptidfragmente, die mit Achromobacterprotease verdaut wurden
  • AP-1: Val Ile Arg Glu Ala Lys (Sequenz Nr. 9)
  • AP-2: Ile Ser Ile Arg Gln Lys (Sequenz Nr. 10)
  • AP-3: Ile Ile Tyr Val Glu (Sequenz Nr. 11)
  • AP-4: Met Leu Tyr Val Lys (Sequenz Nr. 12)
  • AP-5: Ile Leu Ser Ile Asn Glu Lys (Sequenz Nr. 13)
  • AP-6: Val Val Ile Leu Thr Glu Lys (Sequenz Nr. 14)
  • Ap-7: Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg Val Lys (Sequenz Nr. 15)
  • AP-8: Met Ile Ile Gly Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys (Sequenz Nr. 16)
  • AP-9: Val Ala Val Leu Phe Ser Pro Ile Val (Sequenz Nr. 17)
  • AP-10: Ilse Asn Ile Asp Glu Leu Ile Ile Gln Ser Lys (Sequenz Nr. 18)
  • AP.11: Glu Leu Gly Val Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile (Sequenz Nr. 19)
Peptidfragmente die mit Asp-N verdaut wurden
  • DN-1: Asp Glu Val Phe Arg Glu Ser (Sequenz Nr. 20)
  • DN-2: Asp Tyr Phe Lyse (Sequenz Nr. 21)
  • DN-3: Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys (Sequenz Nr. 22)
  • DN-4: Asp Ile Asn Gly Ile Arg Glu Cys (Sequenz Nr. 23)
  • DN-5: Asp Phe Glu Asn Phe Glu Lys (Sequenz Nr. 24)
  • DN-6: Asp Leu Leu Arg Pro Asn Ile (Sequenz Nr. 25)
  • DN-7: Asp Ile Ile Glu Asn (Sequenz Nr. 26)
  • DN-8: Asp Asn Ile Glu Tyr Arg Gly (Sequenz Nr. 27)
Beispiel I-10: Herstellung der chromosomalen DNA des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1

Bakterienzellen des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1 wurden gemäß dem in Beispiel I-2 beschriebenen Verfahren erhalten.

Zu 1 g Bakterienzellen wurden 10 ml 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 25 % Suchrose, 1 mg/ml Lysozym, 1 mM EDTA und 150 mM NaCl zur Herstellung einer Suspension gegeben und die Suspension wurde 30 min stehengelassen. Zu dieser Suspension wurden 0,5 ml 10 % SDS und 0,2 ml 10 mg/ml Proteinase K (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) zugegeben und die Mischung wurde bei 50°C 2 Stunden stehengelassen. Die Mischung wurde anschließend mit einer Phenol/Chloroform-Lösung extrahiert. Die resultierende wäßrige Phase wurde anschließend getrennt und mit Ethanol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde um einen sterilisierten Glasstock gedreht und nach Waschen mit einer 70%igen Ethanollösung vakuumgetrocknet. Als Endprodukt wurden 1,5 mg chromosomale DNA erhalten.

Beispiel I-11: Herstellung von DNA-Sonden auf Basis der Teilaminosäuresequenzen und Beurteilung der Sonden durch das FCR-Verfahren

Gemäß der Informationen über die Teilaminosäuresequenzen der neuen Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, und die in Beispiel 1-9 erhalten wurden, wurden Oligonukleotid-DNA-Primer unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers (Modell 381, hergestellt von Applied Biosystems Co.) hergestellt. Ihre Sequenzen waren wie folgt.

DN-1
Aminosäuresequenz
DN-8
Aminosäuresequenz

PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von 100 pmol jedes Primers und 100 ng chromosomaler DNA, die in Beispiel 2-10 hergestellt wurde und vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt. Die PCR-Vorrichtung, die hier verwendet wurde, war GeneAmp PCR-System Modell 9600, hergestellt von Perkin Elmer Co. Bei der Reaktion wurden 30 Cyclen mit 100 &mgr;l Gesamtreaktionsmischung durchgeführt, wobei sich der 1.

Cyclus aus Schritten bei 94°C 30 s, bei 50°C 1 min und bei 72°C 2 min zusammensetzte.

10 &mgr;l der resultierenden Reaktionsmischung wurden durch 1 % Agarosegelelektrophorese analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß ein DNA-Fragment mit einer Länge von ungefähr 1,2 kB besonders amplifiziert wurde.

Das durch die obige PCR erhaltene Produkt wurde mit glatten Enden versehen und in pUC118 an der HincII-Stelle subkloniert. Die DNA-Sequenz des Insertionsfragmentes in diesem Plasmid wurde unter Verwendung einer DNA-Sequenzierers, GENESCAN Modell 373A, hergestellt von Applied Biosystems Co., bestimmt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die DNA-Sequenz der in Beispiel I-9 erhaltenen Aminosäuresequenz entspricht.

Beispiel I-12: Klonierung eines Gens, das die neue Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, codiert

100 &mgr;g chromosomale DNA des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1, hergestellt in Beispiel I-10, wurden mit einem Restriktionsenzym, Sau3AI verdaut. Die Reaktionsmischung wurde mit einem Suchrose-Dichtegradienten ultrazentrifugiert, um DNA-Fragmente von 5-10 kB zu isolieren. Anschließend unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden die obigen chromosomalen DNA-Fragmente mit Längen 5-10 kB und die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammen, mit einem modifizierten Vektor, der aus einem Plasmidvektor pUC118 hergestellt worden ist, durch Verdau mit BamHI und Dephosphorylierung der Enden mit alkalischer Phosphatase ligiert. Anschließend wurden Zellen des E. coli-Stammes JM109 mit einer Mischung transformiert, die die modifizierten pUC118-Plasmidvektoren enthielt, wobei jedes der Fragmente inseriert worden ist. Diese Zellen wurden anschießend auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 &mgr;g/ml Ampicillin kultiviert, so daß ihre Kolonien wachsen konnten und eine DNA-Bibliothek hergestellt werden konnte.

Hinsichtlich dieser DNA-Bibliothek, Screenen der rekombinanten Plasmide, enthaltend ein Gen, das die neue Transferase codiert, wurde unter Einsatz eines PCR-Verfahrens wie folgt durchgeführt.

Als erstes wurden die Kolonien abgeschabt und in einer TE-Pufferlösung suspendiert. Die Suspension wurde anschließend bei 100°C 5 min behandelt, um Bakterienkörper zu zertrümmern und einer PCR auf die gleiche Verfahrensweise wie in Beispiel I-11 beschrieben unterworfen.

Anschließend wurden 10 &mgr;l der bei der PCR erhaltenen Reaktionsmischung durch ein 1 % Agaroseelektrophorese analysiert und die Klone, von denen 1 DNA-Fragment mit einer Länge von ungefähr 1,2 kB amplifiziert werden konnte, wurden als positiv angesehen.

Als Ergebnis wurde 1 positiver Klon aus 600 der Transformanten erhalten. Gemäß der Analyse des aus dem Klon extrahierten Plasmids hatte es ein Insertionsfragment von ungefähr 8 kB. Dieses Plasmid wurde pKT1 genannt.

Darüber hinaus wurde das Insertionsfragement gekürzt durch Teilverdau mit Sau3AI und PCR auf die gleiche Weise wie oben. Als Ergebnis wurde solche Transformanten, die Plasmide enthalten, die Insertionsfragmente von ungefähr 3,8 kB und ungefähr 4,5 kB aufweisen, erhalten. Diese Plasmide wurden jeweils pKT21 und pKT11 genannt.

Die Restriktionskarten der Insertionsfragmente dieser Plasmide sind in 26 gezeigt.

Anzumerken ist, daß alle in den obigen Beispielen verwendeten Restriktionsenzyme im Handel herkömmlich erhältlich sind (erworben von Takara Shuzou Co.).

Beispiel I-13. Bestimmung des Gens, das die neue Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, codiert

Die Basensequenz der Teil-DNA, die beide Insertionsfragmente, d.h. die in Beispiel I-12 erhaltenen Plasmide pKT11 und pKT21 gemein hatten, wurden untersucht.

Zunächst wurden Deletionsplasmide hergestellt aus diesen Plasmid-DNA unter Verwendung eines Deletionskits zum Kilo-Sequenziern, das von Takara Shuzou Co. hergestellt wurde. Danach wurden die DNA-Sequenzen der Insertionsfragmente in diesen Plasmiden bestimmt unter Verwendung eines Sequenase-Farbstoffprimersequenzierungskits, PRISM, eines Terminationscyclus-Sequenzierungskits, Tag Dye DeoxyTM, beide hergestellt von Perkin Elmer Japan Co. und eines DNA-Sequenzierers, GENESCAN Modell 373A, hergestellt von Applied Biosystems Co.

Unter der gemeinen Sequenz sind die Basensequenz von der SphI-Stelle vom Ende von pKT21 (von A bis B in 26) und die Aminosäuresequenz, die sich daraus ergibt, jeweils in Sequenzen Nr. 1 und 2 gezeigt.

Sequenzen entsprechend einem der in Beispiel I-9 erhaltenen Teilaminosequenzen wurden jeweils in der obigen Aminosäuresequenz erkannt. Es wurde angenommen, daß diese Aminosäuresequenz 728 Aminosäurereste aufweist und ein Protein codiert, dessen Molekulargewicht auf 82 kDa geschätzt wurde. Dieser Molekulargewichtswert entspricht fast dem Wert, der durch SDS-PAGE-Analyse der gereinigten neuen Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, erhalten wurde.

Beispiel I-14: Herstellung der neuen Transferase in einem Transformanten

Ein Plasmid, genannt pKT22, wurde erhalten durch Schneiden von pKT21, das in Beispiel I-12 erhalten wurde, mit SphI und XbaI und durch Ligieren der Resultante mit pUC119 (hergestellt von Takara Shuzou Co.), das mit den Restriktionsenzymen verdaut worden war (die Verfahren sind in 27 gezeigt). Außer der Multi-Klonierungsstelle, entsprach die Basensequenz des Fragments, die in pKT22 eingeführt wurde und das neue Transferasegen enthält, der Sequenz von der 1. Base bis zur 2578. Base der Sequenz Nr. 1.

Die Aktivität der neuen Transferase in dem Transformanten, enthaltend dieses Plasmid, wurde wie folgt untersucht. Zunächst wurde die Transformante über Nacht in einer LB-Brühe, enthaltend 100 &mgr;g/ml Ampicillin, bei 37°C kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzellen betrug 10 g/l.

10 g der oben erhaltenen Bakterienzellen wurden anschließend in 40 ml einer 50 mM-Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA suspendiert, der Bakteriolyse durch eine Ultraschallzertrümmerungsbehandlung bei 0°C 3 min unterworfen und weiter zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Dieser Überstand wurde bei 75°C 30 min wärmebehandelt, weiter zentrifugiert und anschließend mit einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert, um eine Rohenzymlösung (6 Einheiten/ml) herzustellen. Maltotriose, als Substrat, wurde zugegeben, so daß die Endkonzentration 10 % sein würde. Die Reaktion wurde bei pH 5,5 (50 mM Natriumacetat) und bei 60°C 24 Stunden durchgeführt und durch 5-minütige Wärmebehandlung bei 100°C gestoppt. Die hergestellte Glucosyltrehalose wurde durch das gleiche HPLC-Analyseverfahren, das in Beispiel I-1 verwendet wurde, analysiert.

Die Ergebnisse der HPLC-Analyse sind in 28 gezeigt. Das Hauptreaktionsprodukt erschien in dem HPLC-Diagramm als Peak ohne Anomere, entfaltete eine solche Retentionszeit, die kurz hinter der des nicht-reagierten Substrat war. Das Hauptprodukt wurde weiter unter Verwendung einer TSK-Gel Amid-80 HPLC-Säule isoliert und durch 1H-NMR und 13C-NMR analysiert, um als Glucosyltrehalose bestätigt zu werden.

Folglich wurde festgestellt, daß die Transformante die Aktivität der neuen Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, aufwies. Anzumerken ist, daß keine Aktivität der neuen Transferase in der Transformante nachgewiesen wurde, die durch Transformieren von JM109 mit pUC119 allein hergestellt wurde.

Beispiel I-15: Bestimmung der Teilaminosäuresequenzen der neuen Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1

Die Teilaminosäuresequenzen der neuen Transferase, die in Beispiel I-4 erhalten wurden, wurden gemäß den in Beispiel I-9 beschriebenen Verfahren bestimmt. Nachfolgend sind die Teilaminosäuresequenzen aufgeführt.

Peptidfragmente, die mit Achromobacter-Protease verdaut wurden
  • AP-6: Arg Asn Pro Glu Ala Tyr Thr Lys (Sequenz Nr. 30)
  • AP-8: Asp His Val Phe Gln Glu Ser His Ser (Sequenz Nr. 31)
  • AP-10: Ile Thr Leu Asn Ala Thr Ser Thr (Sequenz Nr. 32)
  • AP-12: Ile Ile Ile Val Glu Lys (Sequenz Nr. 33)
  • AP-13: Leu Gln Gln Tyr Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys (Sequenz Nr. 34)
  • AP-14: Asn Met Leu Glu Ser (Sequenz Nr. 35)
  • AP-16: Lys Ile Ser Pro Asp Gln Phe His Val Phe Asn Gln (Sequenz Nr. 36)
  • AP-18: Gln Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys (Sequenz Nr. 37)
  • AP-19: Lys Ile Leu Gly Phe Gln Glu Glu Leu Lys (Sequenz Nr. 38)
  • AP-20: Ile Ser Val Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu (Sequenz Nr. 39)
  • AP-23: Leu Lys Leu Glu Glu Gly Ala Ile Tyr (Sequenz Nr. 40)
  • AP-28: Glu Val Gln Ile Asn Glu Leu Pro (Sequenz Nr. 41)
Peptidfragmente, die mit Asp-M verdaut wurden
  • DN-1: Asp His Ser Arg Ile (Sequenz Nr. 42)
  • DN-5: Asp Leu Arg Tyr Tyr Lys (Sequenz Nr. 43)
  • DN-6: Asp Val Tyr Arg Thr Tyr Ala Asn Gln Ile Val Lys Glu Cys (Sequenz Nr. 44)
Beispiel I-16: Klonierung eines Gens, das die neue Transferase, abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 339009, codiert

Die chromosomale DNA des Sulfolobus acidocaldarius-Stammes ATCC 33909 wurde gemäß dem in Beispiel I-10 beschriebenen Verfahren aus Bakterienzellen erhalten, die gemäß dem in Beispiel I-4 beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Die obige chromosomale DNA wurde teilverdaut mit Sau3AI und anschließend an einen BamHI-verdauten Arm von EMBL3 (hergestellt von STRATAGENE Co.) unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert. Das Packen wurde unter Verwendung von Gigapack II Gold, hergestellt von STRATAGENE Co. durchgeführt. Mit der oben erhaltenen Bibliothek wurde der E. coli-Stamm LE392 bei 37°C 15 min infiziert, auf NZY-Agarplatten geimpft und bei 37°C ungefähr 8-12 Stunden zur Bildung von Plaques inkubiert. Nach dem Aufbewahren bei 4°C für ungefähr 2 Stunden, adsorbierte die DNA an eine Nylonmembran (Hybond N+, hergestellt von Amersham Co.). Das Backen wurde bei 80°C 2 Stunden nach kurzem Waschen mit 2 × SSPE durchgeführt. Unter Verwendung des EcoRI-XbaI-Fragmentes (entsprechend der Sequenz von der 824. Base bis zur 2578. Base der Sequenz Nr. 1) von dem in Beispiel I-14 erhaltenen pKT22 wurde die Sonde mit 32P markiert, wobei das Megaprime DNA-Markierungssystem, das von Amersham Co. hergestellt wird, eingesetzt wurde.

Die Hybridisierung wurde über Nacht bei Bedingungen von 60°C mit 6 × SSPE, enthaltend 0,5 % SDS, durchgeführt. Das Waschen wurden durch zweimaliges Behandeln mit 2 × SSPE, enthaltend 0,5 % SDS, bei Raumtemperatur 10 min durchgeführt.

Das Screenen wurde mit ungefähr 5000 Klonen begonnen und 8 positive Klone wurden erhalten. Aus diesen Klonen wurde ein BamHI-Fragment von ungefähr 7,6 kBp erhalten und das Fragment wurde in pUC118 an der entsprechenden Restriktionsstelle eingeführt. Das so erhaltene Plasmid wurde p09T3 genannt. Die Insertionsfragmente der obigen Klone wurden weiter mit Sau3AI teilverdaut und das erhaltene Fragment von ungefähr 6,7 kBp wurde in pUC18 an der BamHI-Stelle eingeführt. Das so erhaltene Plasmid wurde p09T2 genannt. Das XbaI-Fragment, das von diesem Plasmid abstammte und ungefähr 3,8 kBp aufwies, wurde an der entsprechenden Restriktionsstelle in pUC118 eingeführt. Das so erhaltene Plasmid wurde p08T1 genannt. Die Restriktionskarte dieses Plasmids ist in 29 gezeigt und deren Herstellungsverfahren ist in 30 gezeigt. Hinsichtlich des obigen Plasmids p09T1 wurde die Basensequenz, hauptsächlich der Bereich der die neue Transferase codiert, gemäß dem in Beispiel I-13 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die so bestimmte Basensequenz und die Aminosäuresequenz, die sich daraus ergibt, sind jeweils in den Sequenzen Nr. 3 und Nr. 4 gezeigt. Sequenzen, entsprechend einer der in Beispiel I-15 erhaltenen Teilaminosäuresequenzen wurden jeweils in dieser Aminosäuresequenz erkannt. Es wurde angenommen, daß diese Aminosäuresequenz 680 Aminosäurereste aufweist und ein Protein codiert, dessen Molekulargewicht auf 80,1 kDa geschätzt wurde. Dieser Molekulargewichtswert entspricht fast dem Wert, der durch SDS-PAGE-Analyse der gereinigten neuen Transferase, abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909, entspricht. Zusätzlich wurde die Existenz der Aktivität der neuen Transferase in einem Transformanten, der das Plasmid p01T1 enthält, gemäß den in Beispiel I-14 beschriebenen Verfahren bestätigt.

Beispiel I-17: Sybridisierungstests zwischen dem Gen, das die neue Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, codiert und der chromosomalen DNA, die von anderen Organismen abstammen

Die chromosomalen DNA wurden aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833, dem Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389 und dem E. coli-Stamm JM109 erhalten und mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI verdaut.

Diese verdauten Produkte wurden durch 1%ige Agarosegelelektrophorese getrennt und unter Verwendung der Southern-Blot-Technik auf eine Hybon-N-Membran, hergestellt von Amersham Japan Co., übertragen. Das SphI-XbaI-Fragment von ungefähr 2,6 kBp (entsprechend der in Sequenz Nr. 1 gezeigten Sequenz oder entsprechend des Bereichs von A-B in 26), das vom pKT21, erhalten in Beispiel I-12 abstammte, wurde unter Verwendung eines DIG-System-Kits, hergestellt von Boehringer Mannheim co-markiert und die Resultante wurde einem Hybridisierungstest mit der oben hergestellten Membran unterworfen.

Diese Hybridisierung wurde unter den Bedingungen von 40°C 2 Stunden mit 5 × SSC durchgeführt und Waschen wurde durch zweimalige Behandlung mit 2 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS bei 40°C 5 min und zweimal mit 0,1 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS bei 40°C 5 min durchgeführt.

Als Ergebnis konnte das SphI-XbaI-Fragment mit einem Fragment von ungefähr 5,9 kBp, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 und mit Fragmenten von jeweils ungefähr 5,0 kBp und ungefähr 0,8 kBp, abstammend vom Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, hybridisieren. Auf der anderen Seite wurde keine Hybridbildung bei Fragmenten beobachtet, die vom E. coli-Stamm JM109 abstammen, der als negative Kontrolle verwendet wurde.

Weiter wurden chromosomale DNA gemäß den in Beispiel I-10 beschriebenen Verfahren erhalten aus dem Sulfolobus solfataricus-Stämmen KM1, DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092; dem Sulfolobus acidocaldarius-Stämmen ATCC 33909 und ATCC 49426, dem Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, dem Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 und dem E. coli-Stamm JM109 und mit den Restriktionsenzymen HindII, XbaI und EcoRV verdaut.

Diese verdauten Produkte wurden durch 1%ige Agarosegelelektrophorese getrennt und unter Verwendung der Southern-Blot-Technik auf eine Hybon-N+-Membran, hergestellt von Amersham Japan Co., übertragen. Der Bereich (378 bp) von der 1880. Base zur 2257. Base der Sequenz Nr. 1 wurde durch PCR amplifiziert und mit 32P gemäß dem in Beispiel I-16 beschriebenen Verfahren markiert und die Resultante wurde einem Hybridisierungstest mit der oben hergestellten Membran unterworfen.

Die Hybridisierung wurde über Nacht unter den Bedingungen von 60°C mit 6 × SSPE, enthaltend 0,5 % SDS, durchgeführt und das Waschen wurde durch zweimalige Behandlung mit 2 × SSPE, enthaltend 0,1 % SDS, bei Raumtemperatur 10 min durchgeführt.

Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die folgenden Fragmente Hybride bildeten: die Fragmente von ungefähr 4,4 kBp, ungefähr 3,7 kBp, ungefähr 3,7 kBp, ungefähr 0,8 kBp und ungefähr 3,9 kBp, abstammend von den Sulfolobus solfataricus-Stämmen KM1, DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092, den Fragmenten von ungefähr 0,8 kBp und ungefähr 0,8 kBp, jeweils abstammend von den Sulfolobus acidocaldarius-Stämmen ATCC 33909 und ATCC 49426, dem Fragment von ungefähr 4,4 kBp, abstammend vom Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389 und dem Fragment von ungefähr 2,1 kBp, abstammend vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651. Auf der anderen Seite wurde keine Hybridbildung bei der Genom-DNA des Stammes JM109 beobachtet.

Durch Datenbanken von Aminosäuresequenzen (Swiss prot und NBRF-PDB) und einer Datenbank über Basensequenzen (EMBL) und unter Verwendung der Sequenzanalyse-Software GENETYX (hergestellt von Software Development Co.) wurde darüber hinaus bestätigt, daß es keine Sequenz gibt, die homolog zu einer der Aminosäuresequenzen und Basensequenzen innerhalb des Umfangs der Sequenzen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4 homolog ist. Folglich wurde festgestellt, daß die Gene, die die neue Transverase codieren, stark konserviert sind, insbesondere in Archaebakterien, die zur Ordnung Sulfolobales gehören.

Beispiel I-18: Vergleich der Basensequenzen und Aminosäuresequenzen der neuen Transferasen, abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm KM1 und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909

Unter Berücksichtigung von Lücken und unter Verwendung der Sequenzanalyse-Software GENETYX (hergestellt von Software Development Co.), wurden Vergleichsanalysen mit der Aminosäuresequenz der neuen Transferase, die vom Stamm KM1 abstammt, d.h. Sequenz Nr. 2, und mit der, die vom Stamm ATCC 33909 abstammt, d.h. Sequenz Nr. 4, und mit der Basensequenz, die die neue Transferase, abstammend vom Stamm KM1, d.h. Sequenz Nr. 1 codiert, und mit der, die vom Stamm ATCC 33909 abstammt, d.h. Sequenz Nr. 3, durchgeführt. Die Ergebnisse hinsichtlich der Aminosäuresequenzen sind in 31 und die Ergebnisse hinsichtlich der Basensequenzen sind in 32 gezeigt. Bei der Figur zeigt die obere Linie die Sequenz an, die vom Stamm 33909 abstammt, die untere Linie zeigt die Sequenz an, die vom Stamm KM1 abstammt und das Symbol "*" in der mittleren Linie zeigt die Teile, die in beiden Stämmen gleich sind, an. Jedes der Paare, das mit dem Symbol "." in 31 angezeigt ist, sind ein paar Aminosäurereste, die ähnliche Eigenschaften aufweisen. Die Homologiewerte sind 49 % und 57 % jeweils auf Basis der Aminosäuresequenzen und Basensequenzen.

Beispiel I-19: Herstellung von Trehaloseoligosacchariden aus einer Maltooligosaccharidmischung unter Verwendung der rekombinanten neuen Transferase, abstammend vom einem Transformanten

Das alpha-Amylase-Hydrolysat, das durch Hydrolysieren von löslicher Stärke (hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller Reinigungsgrad) in Oligosaccharide, die keine Iod-Stärke-Reaktion verursachen, als Substrat verwendet, wobei die &agr;-Amylase A-0273, die von Sigma Co. hergestellt wird, und vom Aspergillus oryzae abstammt, war. Die Herstellung von Glucosyltrehalose und verschiedenen Maltooligosyltrehalosen wurde unter Verwendung der rohen Enzymlösung, die in Beispiel I-14 erhalten wurde und dem obigen Substrat und gemäß der Reaktionsbedingungen, die in Beispiel I-14 beschrieben sind, unternommen. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde durch ein HPLC-Verfahren unter den folgenden Bedingungen analysiert.

  • Säule: BIORAD AMINEX HPX-42A (7,8 × 300 mm)
  • Lösungsmittel: Wasser
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Temperatur: 85°C
  • Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung

Die Ergebnisse der HPLC-Analyse sind in 33(A) gezeigt und die Ergebnisse der HPLC-Analyse in dem Fall, der ohne die rekombinante neue Transferase durchgeführt wurde, sind in 33(B) gezeigt. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß jedes der Oligosaccharide als Reaktionsprodukte eine Retentionszeit entfaltete, die kürzer war die von Reaktionsprodukten, die in der Kontrollgruppe hergestellt wurden, nämlich, die nur mit Amylase hergestellt wurden. Anschließend wurden die Hauptprodukte, d.h. Trisaccharid, Tetrasaccharid und Pentasaccharide, abstammend jeweils von den Substraten, d.h. Maltotriose (G3), Maltotetraose (G4) und Maltopentaose (G5) (alle hergestellt von Hayashibara Biochemical Co.) unter Verwendung der TSK-Gel Amid-80 HPLC-Säule isoliert und durch 1H-NMR und 13C-NMR analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß alle diese Produkte eine Struktur aufweisen, bei der der Glucoserest am reduzierenden Ende &agr;-1,&agr;-1-gebunden ist und die Produkte wurden jeweils als Glucosyltrehalose (&agr;-D-Maltosyl-&agr;-D-glucopyranosid), Maltosyltrehalose (&agr;-D-Maltotriosyl-&agr;-D-glucopyranosid)) und Maltotriosyltrehalose (&agr;-D-Maltotetraosyl-&agr;-D-glucopyranosid) bestätigt.

Beispiel I-20: Herstellung von Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose unter Verwendung der neuen Transferase, abstammend von einer Tranformanten

Maltotriose (G3)-Maltoheptaose (G7) (alle hergestellt von Hayashibara Baiokemikaru Co.) wurden als Substrat verwendet. Die in Beispiel I-14 erhaltene rohe Enzymlösung wurde lyophilisiert und anschließend in eine 50 mM Natriumacetatlösung (pH 5,5) suspendiert, um eine konzentrierte Enzymlösung herzustellen. Jedes der Substrate wurde mit 12,7 Einheiten/ml (in bezug auf die Enzymaktivität wenn Maltotriose als Substrat verwendet wurde) der konzentrierten Enzymlösung umgesetzt, um ein entsprechende &agr;-1,&agr;-1-übertragenes Isomer herzustellen. Jedes Reaktionsprodukt wurde durch das in Beispiel I-1 beschriebene Verfahren analysiert, um die Ausbeute und die Enzymaktivität zu überprüfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 38 gezeigt. Hinsichtlich der in Tabelle 38 gezeigten Enzymaktivität ist anzumerken, daß eine Einheit definiert ist als Enzymaktivität Maltooligosaccharid zu übertragen, um 1 &mgr;mol pro Stunde eines entsprechenden &agr;-1,&agr;-1-übertragenen Isomers herzustellen.

Tabelle 38

Beispiel II-15: Bestimmung der Teilaminosäuresequenzen der neuen Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1

Die Teilaminosäuresequenzen des in Beispiel II-2 erhaltenen gereinigten Enzyms wurden durch das Verfahren bestimmt, das von Iwamatsu et al. [Seikagaku (Biochemistry) 63, 139 (1991)] beschrieben wird und die Aminosäuresequenz der N-Terminusseite wurde durch das Verfahren bestimmt, das in Matsudaira T. offenbart ist [J. Biol. chem. 262, 10035-10038 (1987)].

Zunächst wurde die gereinigte neue Amylase in einer Pufferlösung zur Elektrophorese [10 % Glycerin, 2,5 % SDS, 2 % 2-Mercaptoethanol, 62 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 6,8)] suspendiert und eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden das Enzym aus dem Gel auf eine Polyvinylidendifluor (PVDF)-Membran (ProBlot, hergestellt von Applied Biosystems Co.) durch Elektroblottieren (SartoBlot Typ IIs, hergestellt von Sartorius Co.) bei 160 mA 1 Stunde übertragen.

Nach der Übertragung wurde der Teil, in den das Enzym überführt wurde, aus der Membran geschnitten und in 300 &mgr;l Pufferlösung zur Reduzierung [6 M Guanidin-HCl, 0,5 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 3,5), enthaltend 0,3 % EDTA und 2 % Acetonitril] eingetaucht. 1 mg Dithiothreitol wurde dazugegeben und die Reduzierung wurde unter Argonatmosphäre bei 60°C ungefähr 1 Stunde durchgeführt. Zu der Resultante wurden 2,4 mg Monoiodessigsäure, in 10 &mgr;l 0,5 N Natriumhydroxid gelöst, gegeben und 20 min in der Dunkelheit gerührt. Die PVDF-Membran wurde anschließend herausgenommen und ausreichend mit einer 2%igen Acetonitrillösung gewaschen und daraufhin in einer 0,1%igen SDS-Lösung 5 min gerührt. Nach dem kurzen Waschen mit Wasser wurde die PVDF-Membran in einer 100 mM Essigsäurelösung, enthaltend 0,5 % Polyvinylpyrrolidon-40, eingetaucht und 30 min stehengelassen. Als nächstes wurde die PVDF-Membran mit Wasser kurz gewaschen und ungefähr in 1 mm2 große Stücke geschnitten. Zur Bestimmung der Aminosäuresequenz der N-Terminusseite wurden die Stücke direkt von der Membran mit einem Gasphasen-Sequenzierer untersucht. Zur Bestimmung der Teilaminosäuresequenzen wurden diese Stücke weiter in einer Pufferlösung [8 % Acetonitril, 90 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 9.0)] zum Verdau eingeweicht und nach der Zugabe von 1 pmol Achromobacter Protease I (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) bei Raumtemperatur 15 Stunden verdaut. Die verdauten Produkte wurden anschließen durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer C8-Säule (&mgr;-Bondashere 5C8, 300A, 2,1 × 150 mm, hergestellt von Millipore Ltd., Japan) getrennt, um ein Dutzend oder mehr Arten von Peptidfragmenten zu erhalten. Unter Verwendung eines Lösungsmittels A (0,05 % Trifluoressigsäure) und eines Lösungsmittels B (2-Propanol:Acetonitril = 7:3, enthaltend 0,02 % Trifluoressigsäure) als Elutionslösungsmittel wurden die Peptide in einem linearen Konzentrationsgradienten von 2 bis 50 % im Verhältnis zum Lösungsmittel B und bei einer Fließrate von 0,25 ml/min 40 min eluiert. Die Aminosäuresequenzen der so erhaltenen Peptidfragmente wurden durch das automatische Edman-Degrationsverfahren unter Verwendung eines Gasphasen-Peptidsequenzierers bestimmt (Modell 470, hergestellt von Applied Biosystems Co.).

Die so erhaltene Aminosäuresequenz des N-Terminus und die Teilaminosäuresequenzen waren die folgenden:

Teilaminosäuresequenz der N-Terminusseite
  • Thr Phe Ala Tyr Lys Ile Asp Gly Asn Glu (Sequenz Nr. 45)
Teilaminosäuresequenzen
  • P-6: Leu Gly Pro Tyr Phe Ser Gln (Sequenz Nr. 46)
  • P-7: Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly (Sequenz Nr. 47)
  • P-10: Tyr Asn Arg Ile Val Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asp Pro Arg Val Val Asn Pro (Sequenz Nr. 48)
Beispiel II-16: Herstellung der chromosomalen DNA des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1

Der Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American Type Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle betrug 3,3 g/l.

Zu 1 g Bakterienkörper wurden 10 ml einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 25 % Sucrose, 1 mg/ml Lysozym, 1 mM EDTA und 150 mM NaCl, zur Herstellung einer Suspension gegeben und die Suspension wurde 30 min stehengelassen. Zu dieser Suspension wurden 0,5 ml 10 % SDS und 0,2 ml 10 mg/ml Proteinase K (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) gegeben und die Mischung wurde 2 Stunden bei 37°C stehengelassen. Die Mischung wurde anschließend mit einer Phenol/Chloroform-Lösung extrahiert und anschließend wurde eine Ethanol-Ausfällung durchgeführt. Die ausgefällte DNA wurde zweimal um einen sterilisierten Glasstab gedreht und nach dem Waschen mit einer 70%igen Ethanollösung unter Vakuum getrocknet. Als Endprodukt wurden 1,5 mg chromosomale DNA erhalten.

Beispiel II-17: Expressionsklonierung eines Gens, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, codiert durch ein Aktivitätsfärbungsverfahren

100 mg chromosomale DNA des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1, hergestellt in Beispiel II-16, wurden mit einem Restriktionsenzym, Sau3AI, verdaut. Die Reaktionsmischung wurde mit einem Suchrose-Dichtegradienten ultrazentrifugiert, um DNA-Fragmente von 5-10 kB Länge zu isolieren und zu reinigen. Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden anschließend die obigen chromosomalen DNA-Fragmente mit Längen 5-10 kB mit einem modifizierten Vektor ligiert, der aus einem Plasmidvektor pUC118 (hergestellt von Takara Shuzou Co.) hergestellt worden war, durch Verdau mit BamHI und durch Dephosphorylierung der Enden mit alkalischer Phosphatase. Als nächstes wurden die Zellen des E. coli-Stammes JM109 (hergestellt von Takara Shuzou Co.) mit einer Mischung, enthaltend die modifizierten pUC118-Plasmidvektoren, in die jedes der Fragmente eingeführt worden war, transformiert. Diese Zellen wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 &mgr;g/ml Ampicillin kultiviert, so daß ihre Kolonien wachsen und eine DNA-Bibliothek wurde hergestellt.

Screenen der Transformanten, die mit einem rekombinanten Plasmid, enthaltend ein Gen, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 codiert, wurde mittels eines Aktivitätsfärbungsverfahrens durchgeführt.

Zunächst wurden die erhaltenen Transformanten auf Filterpapier repliziert und auf einer LB-Agarplatte zur Kolonisierung kultiviert. Das Filterpapier wurde in eine 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5), enthaltend 1 mg/ml Lysozym (hergestellt von Seikagaku Kougyou Co.) und 1 mM EDTA, eingetaucht und 30 min stehengelassen. Das Filterpapier wurde in eine 1%ige Triton-X100-Lösung 30 min zur Bakteriolyse eingetaucht und bei 60°C 1 Stunde wärmebehandelt, um die von dem Wirt abstammenden Enzyme zu inaktivieren. Das so behandelte Filterpapier wurde dann auf eine Agarplatte, enthaltend 0,2 % lösliche Stärke, gelegt, um die Reaktion bei 60°C über Nacht fortzusetzen. Die der Reaktion ausgesetzte Platte wurde Iod-Dampf-Atmosphäre ausgesetzt, so daß sich die Stärke färbte. Die Kolonien, die ein Halo entfalten wurden als Kolonien positiver Klone angesehen. Fünf positive Klone wurden im Ergebnis aus 6000 Transformanten erhalten. Gemäß der Analyse der aus diesen Klonen extrahierten Plasmide war ein Insertionsfragment von ungefähr 4,3 kBp in einem Plasmid als kürzestes Insertionsfragment enthalten.

Darüber hinaus wurde das Insertionsfragment durch Verdau mit BamHI und dem gleichen Verfahren wie oben gekürzt. Eine Transformante, enthaltend ein Plasmid, das ein Insertionsfragment von ungefähr 3,5 kB aufwies, wurde im Ergebnis erhalten. Dieses Plasmid wurde pKA1 genannt.

Die Restriktionskarte des Insertionsfragments dieses Plasmids ist in 34 gezeigt.

Beispiel II-18: Bestimmung des Gens, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 codiert

Die Basensequenz des Insertionsfragmentes in dem Plasmid pKA1, das in Beispiel II-17 erhalten wurde (d.h. die DNA des Bereichs entsprechend des nachfolgend beschriebenen Plasmids pKA2) wurde bestimmt.

Als erstes wurde ein Deletionsplasmid aus der obigen Plasmid-DNA unter Verwendung eines Deletionskits zur Kilo-Sequenzierung, das von Takara Shuzou Co. hergestellt wurde, hergestellt. Danach wurde die DNA-Sequenz des Insertionsfragments in das Plasmid unter Verwendung eines Sequenase-Farbprimer-Sequenzierungskits, PRISM, eines Terminatorcyclus-Sequenzierungskits, Tag Dye DeoxyTM, beide hergestellt von Perkin Elmer Japan Co. und eines DNA Sequenzierers, GENESCAN Model 373A, hergestellt von Applied Biosystems Co. bestimmt.

Die Basensequenz und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz sind jeweils in den Sequenzen Nr. 5 und Nr. 6 gezeigt.

Die Sequenzen entsprechend jedem der in Beispiel II-15 erhaltenen Teilaminosequenzen wurden jeweils in der obigen Aminosäuresequenz erkannt. Es wurde vermutet, daß diese Aminosäuresequenz 558 Aminosäurereste aufweist und ein Protein codiert, dessen Molekulargewicht auf 64,4 kDa geschätzt wurde. Dieser Molekulargewichtswert entspricht fast dem Wert 61,0 kDa, der durch SDS-PAGE-Analyse der gereinigten neuen Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, erhalten wurde.

Beispiel II-19: Herstellung der rekombinanten neuen Amylase in einer Transformante

Ein Plasmid pKA2, wurde durch Teilverdau des Plasmides pKA1, das in Beispiel II-17 erhalten wurde, mit einem Restriktionsenzym PstI erhalten. 35 zeigt die entsprechende Restriktionskarte. Die Enzymaktivität der Transformanten, die pKA2 enthält, wurde wie folgt untersucht. Zunächst wurde die obige Transformante über Nacht in einer LB-Brühe, enthaltend 100 &mgr;g/ml Ampicillin, bei 37°C kultiviert. Die durch Zentrifugierung gesammelten Zellen wurden in 4 ml/g/Zelle einer 50 mM Natriumacetatlösung (pH 5,5) suspendiert und eine Ultraschall-Zertrümmerungsbehandlung und Zentrifugierung durchgeführt. Der so erhaltene Überstand wurde bei 70°C 1 Stunde wärmebehandelt, um die von den Wirtszellen abstammende Amylase zu inaktivieren. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugierung entfernt und die Resultante wurde mit einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert, um eine Rohenzymlösung zu erhalten, die bei den folgenden Experimenten verwendet wird.

(1) Substratspezifität

Die hydrolysierenden Eigenschaften und die hydrolysierten Produkte wurden analysiert, indem 35,2 Einheiten/ml der obigen rohen Enzymlösung auf verschiedene 10 mM Substrate (außer Amylopectin und lösliche Stärke, die als 3,0%ige Lösung verwendet wurden), die in Tabelle 39 unten gezeigt sind, eingewirkt wurden. 1 Einheit wurde hier definiert als Enzymaktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose, das als Substrat dient, unter den in Beispiel II-1 aufgeführten Bedingungen herzustellen. Die Analyse wurde durch TSK-Gel Amid-80 HPLC, beschrieben in Beispiel II-1, durchgeführt, wobei der Index wie folgt war: die Aktivität sowohl Monosaccharid als auch Disaccharid herzustellen, wenn das Substrat eines der folgenden war Maltooligosaccharide, Amylose DP-17, Amylopectin, lösliche Stärke, verschiedene Isomatooligosaccharide und Panose, die Aktivität &agr;,&agr;-Trehalose herzustellen, wenn das Substrat eines der folgenden war Trehaloseoligosaccharide und &agr;-1,&agr;-1-überführtes Isomer von Amylose DP-17 (das Oligosaccharid abstammend von Amylose Dp-17 durch Übertragen der Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung) und die Aktivität Glucose herzustellen; wenn das Substrat Maltose oder &agr;,&agr;-Trehalose war.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 39 unten gezeigt.

Anzumerken ist, daß jeder Enzymaktivitätswert in der Tabelle als eine solche Einheit ausgedrückt ist, daß eine Einheit der Aktivität entspricht 1 &mgr;mol jedes Monosaccharids und Disaccharids pro Stunde freizusetzen.

Tabelle 39

Die analytischen Ergebnisse der Reaktionsprodukte von Maltotriosyltrehalose durch TSK-Gel Amid-80 HPLC unter Bedingungen, die auf denen von Beispiel II-1 basieren, sind in 36(A) gezeigt. Darüber hinaus sind die analytischen Ergebnisse der Reaktionsprodukte aus löslicher Stärke durch AMINEX HPX-42A HPLC unter den unten beschriebenen Bedingungen in 36(B) gezeigt.

  • Säule: AMINEX HPX-42A (7,8 × 300 mm)
  • Lösungsmittel: Wasser
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Temperatur: 85°C
  • Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung

Durch die obigen Ergebnisse wurde bestätigt, daß das vorliegende Enzym sehr wirksam wirkt auf ein Trehaloseoligosaccharid, dessen Glucoserest am reduzierenden Ende &agr;-1,&agr;-1-gebunden ist, wie Maltotriosyltrehalose, um &agr;,&agr;-Trehalose freizusetzen und auf ein entsprechendes Maltooligosaccharid, das einen Polymerisierungsgrad aufweist, der durch zwei verringert ist. Es wurde weiterhin bestätigt, daß das vorliegende erfindungsgemäße Enzym hauptsächlich Glucose oder Maltose aus Maltose (G2) – Maltopentaose (G5), Amylose und lösliche Stärke freisetzt. Das vorliegende Enzym wirkte jedoch nicht auf &agr;,&agr;-Trehalose, Isomaltose, Isomaltotriose, Isomaltotetraose und Isomaltopentaose und Panose.

(2) Amylaseaktivität vom Endotyp

150 Einheiten/ml [in bezug auf die gleiche Einheit wie die von oben (1)] der obigen Rohenzymlösung wurden auf lösliche Stärke eingewirkt. Die Änderung im Zeitablauf des Färbungsgrades durch die Iodstärkereaktion wurde unter den gleichen Bedingungen gemessen wie bei dem Verfahren zur Messung der Stärke-hydrolysierenden Aktivität in Beispiel II-1. Hergestellte Monosaccharid- und Disaccharidmengen wurden außerdem unter Bedingungen gemessen, die auf denen des unter (1) beschriebenen HPLC-Analyseverfahrens basieren, nämlich auf solchen, die bei der Untersuchung der Substratspezifität eingesetzt wurden. Durch die so erhaltenen Daten wurde die Stärke-hydrolysierende Rate bestimmt.

Die Änderung im Zeitablauf ist in 37 gezeigt. Wie in der Figur gezeigt ist, war die hydrolysierende Rate zu dem Zeitpunkt, zu dem sich der Färbungsgrad der Iodstärkereaktion auf 50 % verringerte, so niedrig wie 4,5 %. Folglich wurde bestätigt, daß das vorliegende Rohenzym eine Eigenschaft aufweist, die einer Amylase vom Endotyp entspricht.

(3) Untersuchung des Wirkmechanismus

Uridindiphosphoglucose [Glucose-6-3H] und Mealtotetraose wurden in Reaktion gesetzt mit Glycogensynthase (abstammend vom Skelettmuskel des Kaninchens, G-2259, hergestellt von Sigma Co.), um Maltopentaose zu synthetisieren, dessen Glucoserest vom nicht-reduzierenden Ende mit 3H markiert wurde, und die Maltopentaose wurde isoliert und gereinigt. Zu 10 mM dieser mit 3H radioaktiv markierten Maltopentaose als Substrat wurden 10 Einheiten/ml (in bezug auf die in Beispiel I-1 verwendete Einheit) der rekombinanten neuen Transferase, die in Beispiel I-20 erhalten wurde, zugegeben und 3 Stunden bei 60°C in Reaktion gesetzt. Maltotriosyltrehalose, dessen Glucoserest vom nicht-reduzierenden Ende mit 3H radioaktiv markiert wurde, wurde hierdurch synthetisiert und das Erzeugnis wurde isoliert und gereinigt. Anzumerken ist, daß durch das folgende Verfahren bestätigt wurde, daß der Glucoserest vom nicht-reduzierenden Ende radioaktiv markiert worden ist: Das obige Produkt wurde vollständig zu Glucose und &agr;,&agr;-Trehalose durch Glucoamylase (abstammend von Rhizopus, hergestellt von Seikagaku Kougyou Co.) zersetzt, die Resultanten wurden durch Dünnschichtchromatographie untersucht und ihre Radioaktivitäten wurden durch einen flüssigen Szintillationszähler gemessen, keine Radioaktivität wurde als Ergebnis in der &agr;,&agr;-Trehalosefraktion aber in der Glucosefraktion festgestellt.

Die oben hergestellte Maltopentaose und Maltotriosyltrehalose, deren Glucosereste von den nicht-reduzierenden Enden mit 3H radioaktiv markiert wurden, wurden als Substrate verwendet und jeweils in Reaktionen gesetzt mit 30 Einheiten/ml und 10 Einheiten/ml der obigen Rohenzymlösung. Proben wurden vor der Reaktion und 3 Stunden nach Beginn der Reaktion, die bei 60°C durchgeführt wurde, entnommen. Die Reaktionsprodukte wurden durch Dünnschichtchromatographie entwickelt (Kieselgel 60, hergestellt von Merk Co., Lösungsmittel: Butanol/Ethanol/Wasser = 5/5/3). Jeder so erhaltenen Punkte, der jedem Saccharid entspricht, wurde gesammelt und deren Radioaktivität mit einem flüssigen Szintillationszähler gemessen. Wenn Maltopentaose als Substrat verwendet wurde, wurde keine Radioaktivität in den Fraktionen der Hydrolysate, d.h. Glucose und Maltose, aber in den Maltotetraose und Maltotriosefraktionen festgestellt. Auf der anderen Seite, wenn Maltotriosyltrehalose als Substrat verwendet wurde, wurde keine Radioaktivität in der Fraktion des Hydrolysats, d.h. &agr;,&agr;-Trehalose, aber in der Maltotriosefraktion festgestellt.

Hinsichtlich des Wirkungsmechanismus wurde folglich festgestellt, daß die rekombinante neue Amylase eine Amylase ist, die Aktivität vom Endotyp aufweist und zusätzlich Aktivität aufweist, hauptsächlich Monosaccharid und Disaccharid von der Seite des reduzierenden Endes herzustellen.

Anzumerken ist, daß die Hersteller der in den obigen Experimenten verwendeten Reagenzien die folgenden sind:

  • &agr;,&agr;-Trehalose: Sigma Co.
  • Maltose (G2): Wako Junyaku Co.
  • Maltotriose – Maltopentaose (G3-G5): Hayashibara Baiokemikaru Co.
  • Amylose DP-17: Hayashibara Biochemical Co.
  • Isomaltose: Wako Pure Chemical Co.
  • Isomaltotriose: Wako Pure Chemical Co.
  • Isomaltotetraose: Seikagaku Kougyou Co.
  • Isomaltopentaose: Seikagaku Kougyou Co.
  • Panose: Tokyo Kasei Kougyou Co.
  • Amylopectin: Nacalai Tesque Co.

Beispiel II-20: Bestimmung der Teilaminosäuresequenzen der neuen Amylase, abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909

Die Teilaminosäuresequenzen des in Beispiel II-4 erhaltenen gereinigten Enzyms wurden gemäß dem in Beispiel II-15 beschriebenen Verfahren bestimmt.

Die Teilaminosäuresequenzen sind wie folgt:

  • AP-9: Leu Asp Tyr Leu Lys (Sequenz Nr. 49)
  • AP-10: Lys Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Gln Pro Leu Gly Val His (Sequenz Nr. 50)
  • AP-11: Lys Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys (Sequenz Nr. 51)
  • AP-12: His Ile Leu Gln Glu Ile Ala Glu Lys (Sequenz Nr. 52)
  • AP-16: Lys Leu Trp Ala Pro Tyr Val Asn Ser Val (Sequenz Nr. 53)
  • AP-17: Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn (Sequenz Nr. 54)
  • AP-18: Asp Tyr Try Tyr Gln Asp Phe Gly Arg Ile Glu Asp Ile Glu (Sequenz Nr. 55)
  • AP-21: Lys Ile Asp Ala Gln Trp Val (Sequenz Nr. 56)

Beispiel II-21: Herstellung von DNA-Sonden auf Basis der Teilaminosäuresequenzen der neuen Amylase, abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909

Gemäß der Informationen über die Teilaminosäuresequenzen, die in Beispiel II-20 bestimmt wurden, wurden Oligonukleotid-DNA-Primer unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers (Modell 381, hergestellt von Applied Biosystems Co.) hergestellt. Ihre Sequenzen waren wie folgt.

AP-10
Aminosäuresequenz
AP-11
(Komplementärer Strang) Aminosäuresequenz

PCR wurde unter Verwendung von 100 pmol jedes Primers und ungefähr 100 ng der in Beispiel II-16 hergestellten chromosomalen DNA, die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt, durchgeführt. Die hier verwendete PCR-Vorrichtung war das Gene Amp PCR-System Model 9600, hergestellt von Perkin Elmer Co. Bei der Reaktion wurden 30 Zyklen an Schritten mit 100 &mgr;l Gesamtreaktionsmischung durchgeführt, wobei sich der 1. Zyklus aus den Schritten zusammensetzte: 30 Sek. bei 94°C, bei 30 Sek. bei 54°C und 30 Sek. bei 72°C. Das amplifizierte Fragment von ungefähr 830 Bp wurde in ein Plasmid, pT7 Blue T-Vector (hergestellt von Novagen Co.) subkloniert. Die Bestimmung der Basensequenz des Insertionsfragmentes in diesem Plasmid wurde durchgeführt, um Sequenzen aufzufinden, die einer der in Beispiel II-20 erhaltenen Aminosäuresequenzen entsprechen.

Beispiel II-22: Klonierung eines Gens, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 codiert

Die chromosomale DNA des Sulfolobus acidocaldarius-Stammes ATCC 33909 wurde gemäß dem in Beispiel II-16 beschriebenen Verfahren aus Bakterienzellen, die gemäß dem in Beispiel II-4 beschriebenen Verfahren erhalten wurden, erhalten. Die obige chromosomale DNA wurde mit Sau3AI teilverdaut und anschließend an einen BamHI-gekürzten Arm von EMBL3 (hergestellt von STRATAGENE Co.) unter Verwendung der T3 DNA-Ligase ligiert. Das Packen wurde unter Verwendung von Gigapack II Gold, hergestellt von STRATAGENE Co. durchgeführt. Mit der oben erhaltenen Bibliothek wurde der E. coli-Stamm LE392 bei 37°C 15 min infiziert und auf NZY-Agarplatten geimpft und bei 37°C ungefähr 8-12 Stunden unter Bildung von Plaques inkubiert. Nach dem Aufbewahren bei 4°C für ungefähr 2 Stunden, wurde die DNA auf eine Nylon-Membran (Hybonde N+, hergestellt von Amersham Co.) adsorbiert. Das Packen wurde bei 80°C 2 Stunden nach dem kurzen Waschen mit 2 × SSPE durchgeführt. Unter Verwendung des in Beispiel II-21 erhaltenen PCR-Fragmentes wurde die Sonde mit 32P unter Einsatz des Megaprime DNA-Labelingsystems, hergestellt von Amersham Co., markiert.

Die Hybridisierung wurde über Nacht unter den Bedingungen von 65°C mit 6 × SSPE, enthaltend 0,5 % SDS, durchgeführt. Waschen wurde durchgeführt durch zweimaliges Behandeln mit 2 × SSPE, enthaltend 0,1 % SDS, bei Raumtemperatur für 10 min.

Das Screenen wurde mit ungefähr 8000 Klonen begonnen, und 17 positive Klone wurden erhalten. Aus diesen Klonen wurde ein BamHI-Fragment von ungefähr 5,4 kBp erhalten und das Fragment wurde in pUC118 an der entsprechenden Restriktionsstelle eingeschleust. Das so erhaltene Plasmid wurde p09A2 genannt. Die DNA dieses Plasmids wurde außerdem mit Sau3AI verdaut, um ein Plasmid, genannt p09A1, zu erhalten. Die Restriktionskarte des Insertionsfragmentes in p09A1 ist in 38 gezeigt und das Verfahren zur Herstellung von p09A1 ist in 39 gezeigt. Hinsichtlich des obigen Plasmids p09A1 wurde ein Deletionsplasmid hergestellt unter Verwendung des Double-standard-Nested Delation Kits, hergestellt von Pharmacia Co. Die Basensequenz, hauptsächlich von dem Bereich, der dem Strukturgen der neuen Amylase entspricht, wurde gemäß dem in Beispiel II-18 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die so bestimmte Basensequenz und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz sind jeweils in den Sequenzen Nr. 7 und Nr. 8 gezeigt. Sequenzen, die einer der in Beispiel II-20 erhaltenen Teilaminosäuresequenzen entsprechen, wurden in dieser Aminosäuresequenz erkannt. Es wurde angenommen, daß diese Aminosäuresequenz 556 Aminosäurereste aufweist und ein Protein codiert, dessen Molekulargewicht auf 64,4 kDa geschätzt wurde. Dieser Molekulargewichtswert entspricht fast dem Wert, der durch SDS-PAGE-Analyse der gereinigten neuen Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm ATCC 33909, erhalten wurde. Darüber hinaus wurde gemäß dem in Beispiel II-19 beschriebenen Verfahren die Existenz der Aktivität der neuen Amylase in einer Transformanten bestätigt, die das Plasmid p09A1 enthält.

Beispiel II-23: Homologie zwischen den Basensequenzen und den Aminosäuresequenzen der neuen Amylasen, abstammend vom Stamm KM1 und vom Stamm ATCC 33909

Unter Berücksichtigung von Lücken und unter Verwendung der Sequenz-Analyse Software GENETYX (hergestellt von Software Development Co.), wurden Vergleichsanalysen mit den Aminosäuresequenzen der neuen Amylase, die vom Stamm KM1, d.h. Sequenz Nr. 6, abstammt und mit der, die vom Stamm ATCC 33909, d.h. Sequenz Nr. 8, abstammt und mit der Basensequenz, die die neue Amylase, abstammend vom Stamm KM1, codiert, d.h. Sequenz Nr. 5, und mit der, die vom Stamm ATCC 33909, d.h. Sequenz Nr. 7, abstammt, durchgeführt. Die Ergebnisse hinsichtlich der Aminosäuresequenzen sind in 40 gezeigt und die Ergebnisse hinsichtlich der Basensequenzen sind in 41 gezeigt. In jeder Figur bedeutet die obere Linie die Sequenz, abstammend vom Stamm 33909 und die untere Linie zeigt die Sequenz, abstammend vom Stamm KM1 an, und das Symbol "*" in der mittleren Linie zeigt die Teile an, die in beiden Stämmen gleich sind. Jedes der Paare, das mit dem Symbol "." in 40 gekennzeichnet ist, entspricht einem Paar von Aminosäureresten, die gegenseitig ähnliche Kennzeichen aufweisen. Die Homologiewerte betragen auf dem Niveau der Aminosäuresequenzen und dem der Basensequenzen jeweils ungefähr 59 % und 64 %.

Beispiel II-24: Hybridisierungstests zwischen dem Gen, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 codiert und der chromosomalen DNA, abstammend von anderen Organismen.

Chromosomale DNA wurden vom Sulfolobus solfataricus-Stam DSM 5833, vom Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 und vom E. coli-Stamm JM109 erhalten und mit dem Restriktionsenzym HindIII gemäß dem in Beispiel II-16 beschriebenen Verfahren verdaut.

Die verdauten Produkte wurden durch 1%ige Agarosegelelektrophorese getrennt und unter Verwendung der Southern-Blot-Technik auf eine Hybond-N-Membran, hergestellt von Amersham Japan Co., übertragen. Das PstI-Fragment von ungefähr 1,9 kBp (entsprechend der Sequenz von der 1. bis zur 1845. Base der Sequenz Nr. 5), das von pKA1 abstammt, wurde unter Verwendung eines DIG-Systemkits, hergestellt von Boehringer Mannheim Co., markiert und mit der Resultanten wurde ein Hybridisierungstest mit der oben hergestellten Membran durchgeführt.

Die Hybridisierung wurde unter Bedingungen von 40°C 3 Stunden mit 5-mal SSC durchgeführt und Waschen wurden durch zweimaliges Behandeln mit 2-mal SSC, enthaltend 0,1 % SDS, bei 40°C 5 min und zweimal mit 0,1 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS, bei 40°C 5 min durchgeführt.

Das PstI-Fragment konnte als Folge mit einem Fragment von ungefähr 13,0 kBp, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833, einem Fragment von 9,8 kBp, abstammend vom Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, und einem Fragment von ungefähr 1,9 kBp, abstammend vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651, hybridisieren. Auf der anderen Seite wurde keine Hybridbildung bei Fragmenten festgestellt, die vom E. coli-Stamm JM109 abstammen, der als negative Kontrolle fungierte.

Chromosomale DNA wurde darüber hinaus gemäß dem in Beispiel II-16 beschriebenen Verfahren von den Sulfolobus solfataricus-Stämmen KM1, DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092, von den Sulfolobus acidocaldarius-Stämmen ATCC 33909 und ATCC 49426, vom Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 und vom E. coli-Stamm JM109 erhalten und mit den Restriktionsenzymen XbaI, HindIII und EcoRV verdaut. Diese verdauten Produkte wurden durch 1 % Agarosegelelektrophorese getrennt und unter Verwendung der Southern-Blot-Technik auf eine Hybond-N+-Membran, hergestellt von Amersham Japan Co., übertragen. Der Bereich von der 1393. Base bis zur 2121. Base der Sequenz Nr. 7 (erhalten durch den Verdau mit p09A1, hergestellt in Beispiel II-22, mit den Restriktionsenzymen EcoT22I und EcoRV, gefolgt von der Trennung in einem Gel) wurde mit 32P gemäß dem in Beispiel II-22 beschriebenen Verfahren unter Herstellung einer Sonde markiert und mit dieser Sonde wurde ein Hybridisierungstest mit der oben hergestellten Membran durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht unter Bedingungen von 60°C mit 6-mal SSPE, enthaltend 0,5 % SDS, durchgeführt und das Waschen wurde durch zweimalige Behandlung mit zweimal SSPE, enthaltend 0,1 % SDS, bei Raumtemperatur 10 min durchgeführt. Als Folge wurde festgestellt, daß die folgenden Fragmente Hybride bilden: die Fragmente von ungefähr 3,6 kBp, ungefähr 1,0 kBp, ungefähr 0,9 kBp, ungefähr 0,9 kBp und ungefähr 1,0 kBp, abstammend von den Sulfolobus solfataricus-Stämmen KM1, DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092, die Fragmente von ungefähr 0,9 kBp und ungefähr 0,9 kBp, abstammend von den Sulfolobus acidocaldarius-Stämmen ATCC 33909 und ATCC 49426, das Fragment von ungefähr 1,4 kBp, abstammend vom Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, und das Fragment von ungefähr 0,9 kBp, abstammend vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651. Auf der anderen Seite wurde keine Hybridbildung bei der chromosomalen DNA des E. coli-Stammes JM109 festgestellt. Darüber hinaus wurde durch Datenbanken über Aminosäuresequenzen (Swiss prot und NBRF-PDB) und einer Datenbank über Basensequenzen (EMBL) und unter Verwendung der Sequenzanalyse-Software, GENETYX (hergestellt von Software Development Co.) zudem bestätigt, daß es keine Sequenz gibt, die mit einer der Aminosäuresequenzen und Basensequenzen innerhalb der Bereiche der Sequenzen Nr. 5, Nr. 6, Nr. 7 und Nr. 8 homolog ist. Folglich wurde festgestellt, daß die Gene, die die neuen Amylasen codieren, stark konserviert sind, insbesondere in Archaebakterien, die zur Ordnung Sulfolobales gehören.

Beispiel III-1: Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose unter Verwendung der rekombinanten neuen Amylase und der rekombinanten Transferase

Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose wurde angestrebt unter Verwendung der rohen rekombinanten neuen Amylase, erhalten in Beispiel II-19, der konzentrierten rekombinanten neuen Transferase, erhalten in Beispiel I-20, und 10 % löslicher Stärke (hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller Reinigungsgrad) und durch zusätzliche Zugabe von Pullulanase. Die Reaktion wurde wie folgt durchgeführt.

Zunächst wurde 10%ige lösliche Stärke mit 0,5-50 Einheiten/ml Pullulanase (abstammend von Klebsiella pneumoniae, hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) bei 40°C 1 Stunde behandelt. Zu der Resultanten wurde die oben erwähnte rekombinante Transferase (10 Einheiten/ml) und die oben erwähnte rekombinante neue Amylase (150 Einheiten/ml) gegeben und die Mischung wurde bei pH 5,5 und 60°C 100 Stunden reagiert. Die Reaktion wurde durch 5-minütige Wärmebehandlung bei 100°C gestoppt und das nicht-umgesetzte Substrat wurde mit Glucoamylase hydrolysiert. Die Reaktionsmischung wurde durch ein HPLC-Analyseverfahren unter den in Beispiel II-1 beschriebenen Bedingungen analysiert.

Die Analyseergebnisse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC sind in 42 gezeigt.

Hinsichtlich der Enzymaktivität der rekombinanten neuen Amylase ist hier 1 Einheit definiert als die Aktivität 1 &mgr;mol &agr;,&agr;-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen. Hinsichtlich der Enzymaktivität der rekombinanten neuen Transferase ist eine Einheit definiert als die Aktivität 1 &mgr;mol Glucosyltrehalose pro Stunde aus Maltotriose herzustellen. Hinsichtlich der Enzymaktivität der Pullulanase ist eine Einheit definiert als die Aktivität 1 &mgr;mol Maltotriose pro Minute bei pH 6,0 und 30°C aus Pullulan herzustellen.

Die &agr;,&agr;-Trehalose-Ausbeute betrug 67 % wenn 50 Einheiten/ml Pullulanase zugegeben wurden. Dieser Wert deutet darauf hin, daß die rekombinante neue Amylase fast die gleiche Ausbeute als die gereinigte neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, unter den obigen Reaktionsbedingungen erbringen kann.

Industrielle Anwendbarkeit

Ein neues effizientes Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosaccharid, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosaccharid und anderen Sacchariden aus einem Rohmaterial, wie Maltooligosaccharid, in hoher Ausbeute kann bereitgestellt werden durch Verwendung einer neuen Transferase, die durch ein Enzymreinigungsverfahren gemäß dem erfindungsgemäßen neuen Reinigungsverfahren erhalten wird und die auf Saccharide, wie Maltooligosaccharid, wirken kann, um Trehaloseoligosaccharid, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose, und andere Saccharide herzustellen.

Ein neues effizientes Verfahren zur Herstellung von &agr;,&agr;-Trehalose aus einem Glucidrohmaterial, wie Stärke, Stärkehydrolysat und Maltooligosaccharid in hoher Ausbeute kann bereitgestellt werden durch die Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Amylase in Kombination mit der neuen erfindungsgemäßen Transferase.

SEQUENZPROTOKOLL


Anspruch[de]
  1. Transferase, die auf ein Saccharidsubstrat einwirkt, wobei das Saccharidsubstrat aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, um die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 oder 4 gezeigt, oder ein Sequenzäquivalent zur Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 oder 4 gezeigt ist, solange sie in der Lage ist, die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende des Saccharids in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen.
  2. Transferase, die auf ein Malto-Oligosaccharid einwirkt, wobei alle Glucosereste des Malto-Oligosaccharids &agr;-1,4-gebunden sind, so daß die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung überführt wird, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 oder 4 gezeigt, oder ein Sequenzäquivalent zur Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 oder 4 gezeigt ist, solange sie in der Lage ist, die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende dieses Saccharids in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen.
  3. Transferase wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei deren Molekulargewicht 74.000 bis 76.000 ist, wenn es mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese gemessen wird.
  4. Transferase wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei die Transferase die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften hat:

    (1) optimaler pH innerhalb eines Bereichs von 4,5 bis 6,0;

    (2) optimale Temperatur innerhalb eines Bereichs von 60 bis 80°C;

    (3) pH-Stabilität innerhalb eines Bereichs von 4,5 bis 10,0; und

    (4) Thermostabilität, die ermöglicht, daß selbst nach Exposition bei 80°C für 6 Stunden 90 % oder mehr der enzymatischen Aktivität bleibt.
  5. Transferase wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, wobei der isoelektrische Punkt, der durch isoelektrische Fokussierung gemessen wird, pH 5,3 bis pH 6,3 ist.
  6. Transferase wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, wobei deren Aktivität bei 5 mM CuSO4 vollständig gehemmt wird.
  7. Transferase wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, wobei die Transferase aus einem Archaebakterium stammt, das zur Ordnung der Sulfolobales gehört.
  8. Transferase wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die Transferase aus einem Archaebakterium stammt, das zum Genus Sulfolobus gehört.
  9. Transferase wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die Transferase aus einem Archaebakterium stammt, das zum Genus Acidianus gehört.
  10. Transferase wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei das Archaebakterium, das zum Genus Sulfolobus gehört, Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 (FERM BP-4626) ist.
  11. Transferase wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei das Archaebakterium, das zum Genus Sulfolobus gehört, Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 ist.
  12. Transferase wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei das Archaebakterium, das zum Genus Sulfolobus gehört, Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 ist.
  13. Transferase wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei das Archaebakterium, das zum Genus Acidianus gehört, der Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 ist.
  14. Verfahren zum Herstellen der Transferase, die in einem der Ansprüche 1 bis 13 beansprucht ist, wobei dieses Verfahren das Kultivieren eines Bakteriums mit der Fähigkeit zum Herstellen der Transferase, die in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht ist, in einem Kulturmedium umfaßt, und das Isolieren und die Reinigung dieser Transferase aus der Kultur gemäß einem Aktivitätsmeßverfahren, bei dem der Index die Aktivität der Herstellung eines Trehalose-Oligosaccharids aus einem Malto-Oligosaccharidsubstrat ist.
  15. Verfahren zum Herstellen eines Saccharids, wobei einige der Zuckereinheiten an einem Ende des Saccharids &agr;-1,&agr;-1-gebunden sind, wobei die Transferase, die in einem der Ansprüche 1 bis 13 beansprucht ist, verwendet wird und ihr ermöglicht wird, auf ein Saccharidsubstrat einzuwirken, wobei das Saccharidsubstrat aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, um ein Saccharid herzustellen, in dem mindestens drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,4 ist.
  16. Verfahren wie in Anspruch 15 beansprucht, wobei das Substrat jeweils ein Gemisch aus Malto-Oligosacchariden ist.
  17. Verfahren wie in Anspruch 16 beansprucht, wobei ein Trehalose-Oligosaccharid wie Glucosyltrehalose und Malto-Oligosyltrehalose hergestellt werden.
  18. DNA-Fragment, umfassend eine DNA-Sequenz, die für die Transferase codiert, die in Anspruch 1 beansprucht wird.
  19. DNA-Fragment wie in Anspruch 18 beansprucht, wobei die optimale Temperatur dieser Transferase 60 bis 80°C ist.
  20. DNA-Fragment wie in Anspruch 18 beansprucht, umfassend eine Basensequenz von der Base an Position 335 bis zur Base an Position 2.518 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Basensequenz.
  21. DNA-Fragment wie in Anspruch 18 beansprucht, umfassend eine Basensequenz von der Base an Position 1 bis zur Base an Position 2.578 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Basensequenz.
  22. DNA-Fragment wie in Anspruch 18 beansprucht, umfassend eine Basensequenz von der Base an Position 816 bis zur Base an Position 2.855 der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Basensequenz.
  23. DNA-Fragment wie in Anspruch 18 beansprucht, umfassend eine Basensequenz von der Base an Position 1 bis zur Base an Position 3.467 der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Basensequenz.
  24. DNA-Fragment wie in einem der Ansprüche 18 bis 23 beansprucht, welches aus einem Archaebakterium stammt, das zur Ordnung der Sulfolobales gehört.
  25. DNA-Fragment wie in Anspruch 24 beansprucht, das aus einem Archaebakterium stammt, das zum Genus Sulfolobus gehört.
  26. DNA-Fragment wie in Anspruch 25 beansprucht, das aus Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 (FERM BP-4626) stammt.
  27. DNA-Fragment wie in Anspruch 25 beansprucht, das aus Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 stammt.
  28. DNA-Fragment, das mit der Basensequenz von der Base an Position 335 bis zur Base an Position 2.518 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Basensequenz bei 40°C unter einer ionischen Stärke von 5 × SSC hybridisiert und das für eine Transferase codiert, die auf ein Saccharidsubstrat einwirkt, wobei das Saccharidsubstrat aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, so daß die erste &agr;-1,4-gebundene Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung überführt wird, und ein DNA-Fragment, das für die Aminosäuresequenz codiert, die das vorher erwähnte DNA-Fragment codiert.
  29. DNA-Fragment, das mit der Basensequenz von der Base an Position 1.880 bis zur Base an Position 2.257 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Basensequenz bei 60°C unter einer ionischen Stärke von 6 × SSPE hybridisiert und das für eine Transferase codiert, die auf ein Saccharidsubstrat einwirkt, wobei das Saccharidsubstrat aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, so daß die erste &agr;-1,4-gebunden Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung überführt wird, und ein DNA-Fragment, das für die Aminosäuresequenz codiert, die das vorher erwähnte DNA-Fragment codiert.
  30. Verfahren, das rekombinante Mittel zum Erhalt eines DNA-Moleküls verwendet, das ein DNA-Fragment umfaßt, das in einem der Ansprüche 18 bis 29 beansprucht wird.
  31. Verfahren wie in Anspruch 30 beansprucht, wobei dieses DNA-Fragment, das in einem der Ansprüche 18 bis 29 beansprucht wird, mit einem Plasmidvektor kombiniert wird.
  32. Verfahren wie in Anspruch 30 oder 31 beansprucht, wobei dieses Molekül das Plasmid pKT22 (FERM BP-4843) ist.
  33. Verfahren wie in Anspruch 30 oder 31 beansprucht, wobei dieses Molekül das Plasmid p9T01 (FERM BP-5093) ist.
  34. Wirtszelle, die mit einem DNA-Molekül transformiert ist, das durch das Verfahren, wie in einem der Ansprüche 30 bis 33 beansprucht, gewonnen wurde.
  35. Wirtszelle wie in Anspruch 34 beansprucht, wobei die Wirtszelle ein Mikroorganismus ist, der zum Genus Escherichia oder Bacillus gehört.
  36. Wirtszelle wie in Anspruch 35 beansprucht, wobei die Wirtszelle der Escherichia coli-Stamm JM109 (FERM BP-5093) ist.
  37. Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Transferase, die auf ein Saccharidsubstrat einwirkt, wobei das Saccharidsubstrat aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, um die erste &agr;-1,4-Bindung vom reduzierenden Ende in eine &agr;-1,&agr;-1-Bindung zu überführen, wobei dieses Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle umfaßt, die in einem der Ansprüche 34 bis 36 beansprucht wird, um diese rekombinante Transferase in der Kultur herzustellen und die Transferase einzusammeln.
  38. Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Transferase, die durch ein DNA-Fragment codiert wird, das in einem der Ansprüche 18 bis 29 beansprucht wird, oder welches eine Aminosäuresequenz enthält, die in einem der Ansprüche 1 und 2 beansprucht wird, wobei dieses Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die in einem der Ansprüche 34 bis 36 beansprucht wird, umfaßt, um diese rekombinante Transferase in der Kultur herzustellen und die Transferase einzusammeln.
  39. Verfahren zum Herstellen eines Trehalose-Oligosaccharids, in dem mindestens drei Zuckereinheiten vom reduzierenden Ende Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen dem zweiten und dritten Glucoserest vom reduzierenden Ende &agr;-1,4 ist, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der rekombinanten Transferase, die in dem Verfahren, wie in Anspruch 37 oder 38 beansprucht, erhalten wird, mit einem Saccharid umfaßt, wobei das Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind.
  40. Verfahren zum Herstellen von &agr;,&agr;-Trehalose, wobei das Verfahren umfaßt:

    a) Inkontaktbringen der Transferase, die in Ansprüchen 1 bis 13 beansprucht ist, oder

    b) der rekombinanten Transferase, die durch das Verfahren, das in Anspruch 37 oder 38 beansprucht ist, erhalten wird, und

    c) einer rekombinanten Amylase, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, die in SEQ ID NO: 6 oder 8 gezeigt ist, oder ein Aminosäureäquivalent zur Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 6 oder 8 gezeigt ist, solange dieses in der Lage ist, die &agr;-1,4-Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes zu hydrolysieren, welche durch ein Verfahren gewonnen wird, das umfaßt:

    – Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, umfassend ein DNA-Fragment, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die für eine Amylase codiert, mit der Aktivität des Einwirkens auf ein Saccharidsubstrat, wobei das Saccharidsubstrat aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,4 ist, durch Hydrolysieren der &agr;-1,4-Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes, um diese rekombinante Amylase in Kultur herzustellen, und umfassend eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 6 oder 8 gezeigt wird, oder ein Aminosäuresequenzäquivalent zur Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 6 oder 8 gezeigt ist, solange dieses in der Lage ist, die &agr;-1,4-Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes zu hydrolysieren,

    mit einem Saccharid, wobei das Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt wird, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind.
  41. Verfahren zum Herstellen von &agr;-&agr;-Trehalose, wobei das Verfahren umfaßt:

    a) Inkontaktbringen der rekombinanten Transferase, die durch das Verfahren, das in Anspruch 37 oder 38 beansprucht ist, erhalten wird, und

    b) einer Amylase mit Aktivität des Einwirkens auf ein Saccharidsubstrat, wobei das Saccharidsubstrat aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,&agr;-1 ist, während die Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes &agr;-1,4 ist, durch Hydrolysieren der &agr;-1,4-Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes, umfassend eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 6 oder 8 gezeigt ist, oder ein Aminosäuresequenzäquivalent zur Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 6 oder 8 gezeigt ist, solange dieses in der Lage ist, die &agr;-1,4-Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes zu hydrolysieren, oder

    c) einer rekombinanten Amylase, die durch ein Verfahren gewonnen wird, das das Kultivieren einer Wirtszelle umfaßt, welche mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, umfassend ein DNA-Fragment, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die für eine Amylase mit der Aktivität von b) codiert, um diese rekombinante Amylase in der Kultur herzustellen und die rekombinante Amylase einzusammeln,

    mit einem Saccharid, wobei das Saccharid zumindest aus drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind.
  42. Verfahren wie in einem der Ansprüche 40 und 41 beansprucht, wobei die Amylase oder die rekombinante Amylase ein Molekulargewicht von ungefähr 61.000 bis 64.000 hat, wenn es mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese gemessen wird.
  43. Verfahren wie in einem der Ansprüche 40 bis 42 beansprucht, wobei die Amylase oder rekombinante Amylase die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften hat:

    (1) optimaler pH innerhalb eines Bereichs von 4,5 bis 5,5;

    (2) optimale Temperatur innerhalb eines Bereichs von 60 bis 85°C;

    (3) pH-Stabilität innerhalb eines Bereichs von 4,0 bis 10,0; und

    (4) Thermostabilität, die ermöglicht, daß selbst nach Exposition bei 80°C für 6 Stunden eine 100 %ige enzymatische Aktivität bleibt.
  44. Verfahren wie in einem der Ansprüche 40 bis 43 beansprucht, wobei die Amylase oder rekombinante Amylase einen isoelektrischen Punkt hat, der durch isoelektrische Fokussierung bei pH 4,3 bis 5,4 gemessen wird.
  45. Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei die Amylase- oder rekombinante Amylase-Aktivität durch 5 mM CuSO4 vollständig gehemmt werden kann.
  46. Verfahren gemäß Anspruch 40 oder 41, wobei dieses DNA-Fragment die Basensequenz von der Base an Position 642 bis zur Base an Position 2.315 der in SEQ ID NO: 5 gezeigten Basensequenz hat.
  47. Verfahren wie in Anspruch 40 oder 41 beansprucht, wobei dieses DNA-Fragment die Basensequenz von der Base an Position 639 bis zur Base an Position 2.315 der in SEQ ID NO: 5 gezeigten Basensequenz hat.
  48. Verfahren wie in Anspruch 40 oder 41 beansprucht, wobei dieses DNA-Fragment die Basensequenz von der Base an Position 1 bis zur Base an Position 2.691 der in SEQ ID NO: 5 gezeigten Basensequenz hat.
  49. Verfahren wie in Anspruch 40 oder 41 beansprucht, wobei dieses DNA-Fragment die Basensequenz von der Base an Position 1.176 bis zur Base an Position 2.843 der in SEQ ID NO: 7 gezeigten Basensequenz hat.
  50. Verfahren wie in Anspruch 40 oder 41 beansprucht, wobei dieses DNA-Fragment die Basensequenz von der Base an Position 1 bis zur Base an Position 3.600 der in SEQ ID NO: 7 gezeigten Basensequenz hat.
  51. Verfahren wie in einem der Ansprüche 40 bis 50 beansprucht, wobei dieses DNA-Fragment aus einem Archaebakterium stammt, das zur Ordnung Sulfolobales gehört.
  52. Verfahren wie in einem der Ansprüche 40 bis 50 beansprucht, wobei dieses DNA-Fragment aus einem Archaebakterium stammt, das zum Genus Sulfolobus gehört.
  53. Verfahren wie in Anspruch 52 beansprucht, wobei das Archaebakterium, das zum Genus Sulfolobus gehört, Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 (FERM BP-4626) oder eine Variante davon ist.
  54. Verfahren wie in Anspruch 52 beansprucht, wobei das Archaebakterium, das zum Genus Sulfolobus gehört, Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 oder eine Variante davon ist.
  55. Verfahren wie in Anspruch 52 beansprucht, wobei das Archaebakterium, das zum Genus Sulfolobus gehört, Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 oder eine Variante davon ist.
  56. Verfahren wie in Anspruch 40 oder 41 beansprucht, wobei das Saccharid, das aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, Stärke oder ein Stärkehydrolysat ist.
  57. Verfahren wie in Anspruch 56 beansprucht, wobei dieses Stärkehydrolysat aus Stärke durch Säurehydrolyse oder enzymatische Hydrolyse hergestellt wird.
  58. Verfahren wie in Anspruch 57 beansprucht, wobei dieses Stärkehydrolysat durch Hydrolysieren von Stärke mit einem aufzweigenden Enzym hergestellt wird.
  59. Verfahren wie in Anspruch 58 beansprucht, wobei dieses aufzweigende Enzym Pullulanase oder Isoamylase ist.
  60. Verfahren wie in Anspruch 40 oder 41 beansprucht, wobei das Saccharid, das aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammengesetzt ist, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende &agr;-1,4-gebunden sind, jedes oder ein Gemisch aus Malto-Oligosaccharid ist, in dem alle Glucosereste &agr;-1,4-gebunden sind.
  61. Verfahren wie in einem der Ansprüche 40 bis 45 beansprucht, wobei dieses Verfahren bei einer Temperatur von 50 bis 85°C durchgeführt wird.
Es folgen 44 Blatt Zeichnungen






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