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Dokumentenidentifikation DE60209811T2 12.10.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001448592
Titel STEROIDALE VERBINDUNGEN ZUR INHIBIERUNG VON STEROIDSULFATASEN
Anmelder Sterix Ltd., Slough, Berkshire, GB
Erfinder POTTER, Sterix Limited, Barry V. L., Oxford OX4 4GA, GB;
REED, Sterix Limited, Michael J., Oxford OX4 4GA, GB;
WOO, Sterix Limited, Lok Wai L., Oxford OX4 4GA, GB
Vertreter Dr. Weber, Dipl.-Phys. Seiffert, Dr. Lieke, 65183 Wiesbaden
DE-Aktenzeichen 60209811
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 17.10.2002
EP-Aktenzeichen 028014181
WO-Anmeldetag 17.10.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/GB02/04686
WO-Veröffentlichungsnummer 2003033518
WO-Veröffentlichungsdatum 24.04.2003
EP-Offenlegungsdatum 25.08.2004
EP date of grant 08.03.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.10.2006
IPC-Hauptklasse C07J 63/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 31/56(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 35/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen bereit, die befähigt sind, Steroidsulfatase zu hemmen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Brustkrebs ist eine verheerende Erkrankung, die nach wie vor eine Haupttodesursache von Frauen in den meisten westlichen Ländern darstellt. Man schätzt, dass sie etwa 1 Million Frauen pro Jahr weltweit betrifft.1

Großbritannien besitzt eine der höchsten Sterblichkeitsraten für Brustkrebs weltweit, mit über 35.000 Frauen jährlich, bei denen die Diagnose gestellt wird, was nahezu einen von fünf aller Krebsfälle ausmacht. Man schätzt, dass eine von 10 Frauen, die bis zum Alter von 85 in Großbritannien lebt, im Laufe ihres Lebens Brustkrebs entwickeln wird. Obwohl moderne Behandlungsverfahren, sowie eine frühere Erkennung dieser Erkrankung die Überlebensraten stark verbessert haben, bleibt Brustkrebs die führende Todesursache bei Frauen im Alter zwischen 35-54.2

Alle Frauen tragen das Risiko von Brustkrebs, obwohl eine Reihe von Risikofaktoren identifiziert wurde, wovon die meisten in Beziehung stehen zur Hormon- und Reproduktionsgeschichte der Frauen sowie deren familiärem Hintergrund der Erkrankung. Frauen mit höherem Risiko sind allgemein diejenigen mit einer starken familiären Geschichte dieser Erkrankung, einem frühen Einsetzen der ersten Regelblutung, einem späten Einsetzen der Menopause oder einer ersten bis zum Ende verlaufenden Schwangerschaft nach dem Alter von 30.2

In den frühesten Stadien eines Brustkrebses scheint Chirurgie die Behandlung der Wahl zu sein. In den meisten Fällen sind eher brusterhaltende chirurgische Techniken beteiligt, wie etwa der lokale Einschnitt in die Brustmasse(n) als eine Mastektomie. Um jedes Wiederauftreten der Erkrankung zu verhindern, wird oft Radiotherapie verschrieben, insbesondere, wenn brusterhaltende Techniken beteiligt waren.3 Sie wird ebenso verwendet, um große Tumoren auf eine operierbare Größe zu reduzieren, sodass erhaltende Chirurgie durchgeführt werden kann.4

Bei fortgeschrittenen Brustkrebsen, wenn sich der Tumor ausgebreitet hat oder wiedergekehrt ist, so ist das Ziel der Behandlung nicht länger eine Heilung, sondern das Erreichen einer palliativen Kontrolle. Dies ist der Fall, wenn Metastasen des Tumors Orte wie die Knochen, die Haut, Lymphknoten oder Gehirn erreicht haben. Die Behandlung variiert in Abhängigkeit vom Hormonstatus des Patienten (davon, ob eine Frau vor oder nach der Menopause zu behandeln ist) und in Abhängigkeit vom Typ des Tumors. Für bestimmte Tumoren ist tatsächlich nachgewiesen worden, dass sie für ihr Wachstum und ihre Entwicklung Östrogene benötigen, was zu dem führt, was als hormonabhängiger Brustkrebs bezeichnet wird (HDBC, siehe I-1). Während Nicht-HDBC mit Chemotherapie behandelt wird, wobei es das Ziel ist, Tumorzellen in differenzieller Weise unter Verwendung einer Kombination zytotoxischer Mittel zu töten,5 so erwartet man bei HDBC, dass sie auf eine endokrine Therapie ansprechen.

Das Konzept der hormonabhängigen Tumoren erschien in den frühen 1960ern, als das Modell der Östrogenwirkung zum ersten Mal eingeführt wurde.6 Damit Östrogene Zellwachstum und Zellfunktion beim Menschen regulieren, muss ein spezifisches Protein vorhanden sein, das als humaner Östrogen-Rezeptor (hER) bezeichnet wird.7 Dieses Protein, im Zellkern lokalisiert, interagiert mit Östrogenen, was in der Ausbildung eines Bindungskomplexes resultiert. Dieser wirkt als ein Transkriptionsfaktor durch das Aktivieren der Produktion von m-RNA spezifischer Gene, von denen eines oder mehrere wahrscheinlich essentiell für ein effizientes Tumorzellwachstum sind.

Patientinnen mit einem messbaren Spiegel an Rezeptorprotein werden als Östrogenrezeptor-positiv (ER+) klassifiziert, im Gegensatz zu Östrogenrezeptor-negativ (ER–). Etwa 50% der Frauen vor der Menopause und 75% der Frauen nach der Menopause fallen in die ER+-Gruppe,8 wo die Entwicklung von Brustkrebs direkt mit der Anwesenheit von Östrogenen in Verbindung gebracht werden kann. Die endokrine Therapie, bei der die Anwendung von Arzneimitteln in einer Aufhebung der Östrogenstimulation von Zellen resultiert, hat sich als wirkungsvoller Ansatz für die Behandlung von HDBC erwiesen. Ursprünglich wurden zwei Klassen von Arzneimitteln entwickelt, die auf verschiedene Strategien ansprechen: Anti-Östrogene und Aromatase-Hemmer.

Anti-Östrogene als Antagonisten des Östrogenrezeptors stellen eine der ersten Behandlungen dar, die für HDBC in Betrag gezogen wurden. Ihre Wirkung basiert auf ihrer Fähigkeit, kompetitiv an das spezifische Rezeptorprotein hER zu binden und somit den Zugang der endogenen Östrogene zu ihrer spezifischen Bindungsstelle zu verhindern. Infolgedessen ist das natürliche Hormon unfähig, das Tumorwachstum aufrecht zu erhalten.

Von den bei der Brustkrebstherapie üblicherweise verwendeten Antiöstrogenen ist Tamoxifen (unten) aufgrund des sehr niedrigen Toxizitätsprofils des Moleküls das am breitesten verwendete. Trotz seines nicht-steroidalen Skeletts besitzt Tamoxifen eine gemischte Agonisten/Antagonisten-Aktivität, die sein therapeutisches Potential begrenzt.9 Zusätzlich ist bei Patientinnen mit lang andauernder Tamoxifen-Behandlung eine gewisse Form der Arzneimittelresistenz berichtet worden.10

Neue, rein antiöstrogen wirkende Arzneimittel, wie etwa ICI 164384 (unten) sind seitdem entdeckt worden, jedoch hat der Verlust an Wirkungskraft im Vergleich zu der von Tamoxifen die Notwendigkeit nahegelegt, stärker wirksame Targets zu entwerfen.11

Seit inzwischen einigen Jahren ist ein neuer Typ von Anti-Östrogen hervorgetreten, der einen Östrogen-Agonismus auf Zielgewebe, wie etwa Knochen oder Leber, und einen Antagonismus und/oder minimalen Agonismus bei reproduktiven Geweben, wie etwa Brust oder Uterus miteinander kombiniert.12 Diese Verbindungen, als Selektive Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (SERMs) bezeichnet, sind nicht nur potentiell wirksam bei der Verringerung eines Patientenrisikos für Brustkrebs, sondern haben auch gezeigt, dass sie die Knochenmineraldichte erhöhen und Osteoporose bei Frauen nach der Menopause verhindern. Raloxifen ist die erste dieser Klasse von Verbindungen, die klinisch verwendet werden soll.13 Weitere SERMs befinden sich derzeit in klinischen Studien, und diese Moleküle könnten eines Tages Tamoxifen als erste Behandlungslinie für Frauen mit HDBC ersetzen.

Die Verwendung therapeutischer Mittel, die eines oder mehrere Enzyme des Steroid-Biosyntheseweges inhibieren, stellt eine andere wichtige Strategie zur Kontrolle der Entwicklung Östrogen-abhängiger Tumoren dar.14 Das Enzym Aromatase, das androgene C19-Steroide in östrogene C18-Steroide umwandelt, hat dabei als primäres Ziel zur Verringerung der Östrogenspiegel gedient. Dieser Enzymkomplex, der ein Cytochrom P450-Hämoprotein enthält, katalysiert die Aromatisierung des Androgen-A-Rings mit dem nachfolgenden Verlust der C19-Methylgruppe, um Östrogene zu ergeben.

Aminoglutethimid (unten) war der erste Aromatasehemmer, der für die Behandlung von Brustkrebs verwendet wurde. Es zeigte jedoch eine Anzahl unerwünschter Nebenwirkungen angesichts seines breiten Spektrums inhibitorischer Wirkungen auf andere P450-abhängige Enzyme, und Versuche, die Ausgangsstruktur zu verbessern, haben zu einer Anzahl nicht-steroidaler Verbindungen geführt, die in klinische Studien eingetreten sind.15 Die letzte Generation entwickelte Verbindungen, wie etwa Letrozol, die hohe Wirkungskraft und hohe Selektivität für das Enzym kombinieren und außerdem besser vertragen werden.

  • Struktur verschiedener Typen von Aromatasehemmern. Generation I: Aminoglutethimid, AG; Generation III: Letrozol

Traditionell werden die Aromatasehemmer als zweite Behandlungslinie für fortgeschrittene HDBC-Patienten aufgespart, deren Erkrankungen nicht länger durch Tamoxifen kontrolliert werden. Jedoch sind aufgrund des extrem guten Toxizitätsprofils einiger der neusten Aromatasehemmer jüngst klinische Versuche unternommen worden, um deren Eignung als erste Behandlungslinie für HDBC zu bestimmen.

Im Laufe des letzten Jahrzehnts sind starke Anhaltspunkte, sowohl biochemisch als auch klinisch, zutage getreten, dass die alleinige Inhibition des Enzyms Aromatase keine wirksame Reduzierung der östrogenen Stimulation bei HDBC bewirken kann, wobei der Grund hierfür ist, dass andere Wege an der Östrogenbiosynthese beteiligt sind. Der Sulfataseweg wird derzeit als Hauptroute für die Brusttumor-Östrogensynthese betrachtet, da für Sulfataseaktivität herausgefunden wurde, dass sie 10-mal mehr an Östron bereitstellt als die Aromataseaktivität.16

Im Sulfataseweg werden Östrogene aus dem hochgradig verfügbaren Vorläufer Östronsulfat synthetisiert, und zwar über zwei Enzyme (Schema unten): Östronsulfatase (STS), die Östronsulfat zu Östron hydrolysiert, und 17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (17&bgr;-HSD), die Östron zu Östradiol reduziert. Diese beiden Enzyme repräsentieren die neuesten Ziele für Strategien des Östrogen-Entzugs.

Herkunft der Östrogene in normalen Brustzellen und Brusttumorzellen:

  • AR, Aromatase; ST, Steroidsulfotransferase; STS, Steroidsulfatase; 17&bgr;-HSD, 17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase; 3&bgr;-IS, 3R-Hydroxysteroid-Dehydrogenase-&Dgr;5,&Dgr;4-Isomerase; ER, Östrogenrezeptor.

Es sind mehrere potente Inhibitoren für Östronsulfatase identifiziert worden. Sie teilen alle das gemeinsame Strukturmerkmal eines aromatischen Rings, der einen Substituenten trägt, der den phenolischen A-Ring des Enzymsubstrats, Östronsulfat, nachahmt. Bei der Entwicklung der Steroid-Inhibitoren ist eine große Vielzahl chemischer Gruppen an C3 eingeführt worden, von denen das 3-O-Sulfamat als die potenteste für das Östronmolekül ermittelt wurde. Die resultierende Verbindung, Östron-3-O-Sulfamat (unten) führte zu der Identifizierung der Aryl-O-Sulfamatstruktur als einem aktiven Pharmacophor, das für die wirkungsvolle Inhibition der STS benötigt wird. Es wurde für EMATE gezeigt, dass es die Steroidsulfatase-Aktivität in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Weise inhibiert17 und bei der oralen Administration in vivo aktiv war.18 Es wurde jedoch gezeigt, dass es hochgradig östrogen wirkte, was die Notwendigkeit ergab, STS-Inhibitoren zu entwerten, die frei von einer Agonistenaktivität auf den hER sind.

Um die Probleme zu vermeiden, die mit einem aktiven Steroidkern verbunden sind, sind nicht Steroid-basierte Inhibitoren synthetisiert worden. Cumarinsulfamat, wie etwa 4-Methylcumarin-7-O-sulfamat (COUMATE, unten) bei denen das aktive Pharmacophor konserviert ist, waren unter den ersten Inhibitoren dieses Typs, die identifiziert wurden.19 Obwohl COUMATE weniger wirksam als EMATE ist, hat es den Vorteil, nicht östrogen zu sein.20 Einige tricyclische Cumarin-basierte Sulfamate sind ebenfalls entwickelt worden und stellten sich als viel wirksamer als COUMATE heraus, während sie dessen nicht-östrogene Eigenschaft beibehielten.21 667COUMATE, das in vitro etwa 3-mal stärker ist als EMATE, ist nun in der präklinischen Entwicklung für klinische Studien.22

  • Strukturen der Steroidsulfatase-Inhibitoren EMATE, COUMATE und 667COUMATE.

Die PCT/GB92/01587 unterrichtet über neue Steroidsulfatase-Inhibitoren und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten, für die Verwendung bei der Behandlung Östron-abhängiger Tumoren, insbesondere Brustkrebs. Diese Steroidsulfatase-Inhibitoren sind Sulfamatester, wie etwa N,N-Dimethyl-Östron-3-Sulfamat und, bevorzugt, Östron-3-Sulfamat (EMATE). Es ist bekannt, dass EMATE ein wirkungsvoller E1-STS-Inhibitor ist, da er eine mehr als 99% Inhibition der E1-STS-Aktivität von intakten MCF-7-Zellen bei 0,1 mM zeigt. EMATE inhibiert das E1-STS-Enzym auch in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Weise, was anzeigt, dass es als ein auf eine aktive Stelle gerichteter Inaktivator wirkt. Obwohl EMATE ursprünglich im Hinblick auf die Hemmung von E1-STS entworfen wurde, inhibiert es auch Dehydroepiandrosteron-Sulfatase (DHA-STS), die ein Enzym ist, von dem man annimmt, dass es eine wesentliche Rolle dabei spielt, die Biosynthese des östrogenen Steroids Androstendiol zu regulieren. Ebenso gibt es nun Anhaltspunkte, die darauf hindeuten, dass Androstendiol sogar von noch größerer Wichtigkeit als Promotor des Brusttumorwachstums sein kann. EMATE ist auch in vivo aktiv, da eine nahezu vollständige Inhibition der Aktivitäten von Rattenleber-E1-STS (99%) und DHA-STS (99%) erfolgte, wenn es entweder oral oder subkutan verabreicht wurde. Zusätzlich ist für EMATE gezeigt worden, dass es bei Ratten eine Gedächtnis-fördernde Wirkung besitzt. Studien an Mäusen haben eine Assoziation zwischen der DHA-STS-Aktivität und der Regulation eines Teils der Immunantwort nahegelegt. Es wird angenommen, dass dies auch beim Menschen auftreten könnte. Das brückenbildende O-Atom der Sulfamatgruppierung in EMATE ist wichtig für die inhibitorische Aktivität. Daher, wenn das 3-O-Atom durch andere Heteroatome, wie etwa bei Östron-3-N-Sulfamat oder Östron-3-S-Sulfamat ersetzt wird, so sind diese Analoga schwächere, nicht-zeitabhängige Inaktivatoren.

Obwohl die optimale Wirkungskraft für die Inhibition von E1-STS mit EMATE erreicht sein mag, ist es möglich, dass Östron während der Sulfatase-Inhibition freigesetzt werden kann, und dass EMATE und sein Östradiol-Gegenstück östrogene Aktivität besitzen können.

17&bgr;-HSD, das den letzten Schritt der Östrogen- und Androgenbiosynthese katalysiert, erschien ebenfalls als Target für Strategien zum Östrogenentzug. Dieses Enzym ist verantwortlich für die wechselseitige Umwandlung der oxidierten Form (weniger aktiv) und der reduzierten Form (aktiver) der Steroide. Seine Aktivität unterstützt direkt das Wachstum und die Entwicklung östrogenabhängiger Tumore, da es bevorzugt Östron zu Östradiol reduziert,25 und, in einem kleineren Ausmaß, über die Umwandlung des Androgens DHEA zu Androstendiol (Adiol), für das kürzlich bewiesen wurde, dass dieses östrogene Eigenschaften besitzt und in der Lage ist, den Östrogenrezeptor zu binden.26

17&bgr;-HSD gehört zu einer Familie von Isoenzymen, von denen bislang 11 identifiziert und kloniert wurden.27 Jeder Typ besitzt eine selektive Substrataffinität und zielgerichtete Aktivität, was bedeutet, dass Selektivität für die Arzneimittelwirkung erreicht werden muss. Der 17&bgr;-HSD-Typ 1 ist der Isotyp, der die wechselseitige Umwandlung von Östron und Östradiol katalysiert.

Anders als bei den STS-Inhibitoren ist nur über wenige 17&bgr;-HSD-Inhibitoren berichtet worden. Die meisten der steroidalen Inhibitoren für den 17&bgr;-HSD-Typ 1 haben eine D-Ringmodifizierte Struktur gemeinsam. Östradiol-Derivate, die eine Seitenkette mit einer guten Abgangsgruppe an der 16&agr;-Position enthalten, sind als eine potente Klasse von Inhibitoren gezeigt worden. Insbesondere für 16&agr;-(Bromalkyl)-Östradiole28, bei denen die Seitenketten hohe Reaktivität gegenüber nukleophilen Aminosäureresten an der aktiven Stelle des Enzyms zeigen, wurden als vielversprechende irreversible Inhibitoren ermittelt. Analoga, die kurze Bromalkylgruppierungen an der Position 16 enthalten, zeigten die höchste Aktivität mit 16&agr;-(Brompropyl)-Östradiol, gefolgt von 16&agr;-(Brombutyl)-Östradiol, den potentesten der Reihen (3 und 4). Diese jedoch stellten sich als reine Agonisten des Östrogenrezeptors heraus.

  • 17&bgr;-HSD-Typ 1-Inhibitoren: 16&agr;-(Brompropyl)-Östradiol, 3;

    16&agr;-(Brombutyl)-Östradiol, 4; und ein Flavon-Derivat, Apigenin.

Bei einem Versuch, die intrinsische Östrogenwirkung potenter Inhibitoren zu eliminieren und möglicherweise gleichzeitig antiöstrogene Eigenschaften in das Molekül einzubauen, wurden mehrere 16&agr;-(weit gefasst)-Östradiolderivate synthetisiert, die die C7&agr;-Alkylamidseitenkette des bekannten Antiöstrogens ICI 164384 tragen.29 Jedoch wurde eine recht schwache Inhibition für den 17&bgr;-HSD-Typ 1 erhalten, wobei die östrogenen und antiöstrogenen Eigenschaften nicht vollständig aufgehoben bzw. eingeführt wurden.

Parallel hierzu wurden nicht-steroidische Inhibitoren des 17&bgr;-HSD-Typs 1 entworfen. Flavonoide, die den Östrogenen strukturell ähnlich sind, sind in der Lage, den Östrogenrezeptor mit östrogenen oder antiöstrogenen Aktivitäten zu binden.30 Ihre Wirkung auf die Aromataseaktivität ist gut dokumentiert, und in jüngsten Studien wurde für sie herausgefunden, dass sie die Umsetzung von Östron zu Östradiol, katalysiert durch den 17&bgr;-HSD-Typ 1, reduzieren.31 Flavonderivate, wie etwa Apigenin (6), traten bei einer SAR-Studie als vielversprechende Verbindungen mit einiger inhibitorischer Aktivität auf den 17&bgr;-HSD Typ 1 hervor, ohne bei der inhibitorischen Konzentration östrogen zu wirken.32

Ahmed et al (Biochem Biophys Res Commun 1999 Jan 27; 254(3): 811-5) berichten über eine Struktur-Aktivitätsbeziehungsstudie von steroidalen und nicht-steroidalen Inhibitoren der STS.

Steroiddehydrogenasen (DH), wie etwa Östradiol-17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen (E2HSD) besitzen wesentliche Rollen beim Regulieren der Verfügbarkeit von Liganden, die mit dem Östrogenrezeptor interagieren sollen. E2HSD Typ I reduziert Östron (E1) zu dem biologisch aktiven Östrogen, Östradiol (E2), während E2HSD Typ II E2 inaktiviert, indem es dessen Oxidation zu E1 katalysiert. Somit könnte die Identifizierung von Verbindungen mit DH-inhibitorischer Aktivität, insbesondere von Inhibitoren des E2HSD-Typs I, von therapeutischem Wert beim Inhibieren der Bildung von E2 sein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Verbindungen bereit, die befähigt sind, als wirksame Steroidsulfatase-Inhibitoren zu wirken. Die vorliegende Erfindung stellt fest, dass die Verbindungen der vorliegenden Anmeldung wirksame Steroidsulfatase-Inhibitoren sind.

1 zeigt einige der Enzyme, die an der in situ-Synthese von Östron aus Östronsulfat, sowie von Östradiol, beteiligt sind. „STS" bezeichnet Östronsulfatase, „E2DH-Typ I" bezeichnet Östradiol-17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ I oder Östradiol-17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 1, 3, 5 und/oder 7 und „E2DH Typ II" bezeichnet Östradiol-17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ II oder Östradiol-17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 2 und/oder 8.

Wie zu sehen ist, sind zwei Enzyme, die an der peripheren Synthese der Östrogene beteiligt sind, das Enzym Östradiol 17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase und das Enzym Östronsulfatase.

Man nimmt an, dass die in situ-Synthese von Östrogen einen wichtigen Beitrag zu den hohen Östrogenspiegeln in Tumoren leistet, und dass daher spezifische Inhibitoren der Östrogenbiosynthese von potentiellem Wert für die Behandlung endokrin abhängiger Tumore sind.

Darüber hinaus, obwohl die Östrogenerzeugung bei malignen Geweben der Brust und des Endometriums über den Sulfataseweg einen Hauptbeitrag zu der hohen Konzentration der Östrogene leistet, gibt es nach wie vor andere Enzymwege, die zur in vivo-Synthese von Östrogen beitragen.

Es gibt somit einen dringenden Bedarf zur Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung dieser Krebsarten.

Die vorliegende Erfindung versucht daher, eines oder mehrere der Probleme zu überwinden, die mit den im Stand der Technik verfügbaren Verfahren zur Behandlung von Brustkrebs und endometrialem Krebs verbunden sind.

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher eine Verwendung einer Verbindung für die Herstellung eines Medikaments bereit, das den Östronsulfatase-Pathway beeinflussen kann, so etwa im wesentlichen inhibieren kann, wobei dieser Pathway Östron in und aus Östradiol konvertiert – und/oder das den Steroiddehydrogenase-Pathway beeinflussen kann, so etwa im wesentlichen inhibieren kann, wobei dieser Pathway Östron in und aus Östradiol umsetzt.

Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung ist vorteilhaft, da es durch die Verabreichung eines Typs dieser Verbindung möglich ist, die Synthese von Östradiol aus Östron oder E1S zu blockieren. Daher stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen bereit, die beträchtliche therapeutische Vorteile besitzen, insbesondere zur Behandlung von Brustkrebs und endometrialem Krebs.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können andere Substituenten umfassen. Diese anderen Substituenten können z.B. die Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung weiter verstärken und/oder deren Stabilität (ex vivo und/oder in vivo) erhöhen.

DETAILLIERTE ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung der Formel XII bereitgestellt: worin G H oder ein Substituent ist, ausgewählt aus OH oder einer Hydrocarbylgruppe, und wobei R1 eine Sulfamatgruppe ist.

Wie in der Technik wohlbekannt ist, besitzt eine klassische Steroidringstruktur die folgende generische Formel:

In der obigen Formel sind die Ringe in konventioneller Weise gekennzeichnet worden.

Ein Beispiel für eine Bio-Isoform ist, wenn einer oder mehrere der Ringe A, B, C und D einen heterozyklischen Ring darstellen, und/oder, wenn einer oder mehrere der Ringe A, B, C und D substituiert wurden, und/oder, wenn einer oder mehrere der Ringe A, B, C und D modifiziert wurden, wobei die Bio-Isoform jedoch steroidale Eigenschaften besitzt.

In diesem Zusammenhang ist das Ringsystem der vorliegenden Erfindung analog zu einer steroidalen Ringstruktur und kann eine Bio-Isoform einer steroidalen Ringstruktur sein.

Beispielsweise können einer oder mehrere der Ringe A', B', C' und D' unabhängig mit geeigneten Gruppen substituiert sein, wie etwa mit einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Hydroxygruppe, einer Halogengruppe, einer Hydrocarbylgruppe, einer Oxyhydrocarbylgruppe, etc.

Vorzugsweise wird die Verbindung, einschließlich aller Substituenten, nicht mehr als etwa 50 Kohlenstoffatome enthalten, üblicher nicht mehr als etwa 30 bis 40 Kohlenstoffatome.

Gruppe G

G ist ausgewählt aus H, OH und einer Hydrocarbylgruppe.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist G oder die Hydrocarbylgruppe vorzugsweise eine optional substituierte Kohlenwasserstoffgruppe. Mit anderen Worten ist G eine optional substituierte Kohlenwasserstoffgruppe oder ist ausgewählt aus H, OH und einer optional substituierten Kohlenwasserstoffgruppe.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist G oder die Hydrocarbylgruppe vorzugsweise ausgewählt aus einer optional substituierten Alkylgruppe, einer optional substituierten Halogenalkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe, einer Alkylarylalkyl-Gruppe und einer Alkengruppe.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist G oder die Hydrocarbylgruppe vorzugsweise eine optional substituierte Alkylgruppe.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist G oder die Hydrocarbylgruppe vorzugsweise ausgewählt aus einer C1-C10-Alkylgruppe, wie etwa einer C1-C6-Alkylgruppe und einer C1-C3 Alkylgruppe. Typische Alkylgruppen beinhalten C1-Alkyl, C2-Alkyl, C3-Alkyl, C4-Alkyl, C5-Alkyl, C7-Alkyl, and C8-Alkyl.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist G oder die Hydrocarbylgruppe bevorzugt ausgewählt aus einer C1-C10-Halogenalkylgruppe, einer C1-C6-Halogenalkylgruppe, einer C1-C3-Halogenalkylgruppe, einer C1-C10-Bromalkylgruppe, einer C1-C6-Bromalkylgruppe, und einer C1-C3-Bromalkylgruppe. Typische Halogenalkylgruppen beinhalten C1-Halogenalkyl, C2-Halogenalkyl, C3-Halogenalkyl, C4-Halogenalkyl, C5-Halogenalkyl, C1-Halogenalkyl, C8-Halogenalkyl, C1-Bromalkyl, C2-Bromalkyl, C3-Bromalkyl, C4-Bromalkyl, C5-Bromalkyl, C7-Bromalkyl, und C8-Bromalkyl.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung, ist G oder die Hydrocarbylgruppe bevorzugt ausgewählt aus Arylgruppen, Alkylarylgruppen, Alkylarylalkylgruppen, -(CH2)1-10-Aryl, -(CH2)1-10-Ph, (CH2)1-10-Ph-C1-10 Alkyl, -(CH2)1-5-Ph, (CH2)1-5-Ph-C1-5 Alkyl, -(CH2)1-3-Ph, (CH2)1-3-Ph-C1-3 Alkyl, -CH2-Ph, und -CH2-Ph-C(CH3)3.

Wenn G oder die Hydrocarbylgruppe eine Arylgruppe ist oder enthält, so können die Arylgruppe oder eine oder mehrere der Arylgruppen ein Heteroatom enthalten. Somit können die Arylgruppe oder eine oder mehrere der Arylgruppen carbocyclisch oder heterocyclisch sein. Typische Heteroatome beinhalten O, N und S, insbesondere N.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist G oder die Hydrocarbylgruppe bevorzugt ausgewählt aus -(CH2)1-10-Cycloalkyl, -(CH2)1-10-C3-10-Cycloalkyl, -(CH2)1-7-C3-7-Cycloalkyl, -(CH2)1-5-C3-5-Cycloalkyl, -(CH2)1-3-C3-5-Cycloalkyl, und -CH2- C3-Cycloalkyl.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist G oder die Hydrocarbylgruppe bevorzugt eine Alkengruppe. Typische Alkengruppen beinhalten eine C1-C10-Alkengruppe, C1-C6-Alkengruppe, C1-C3-Alkengruppe, wie etwa eine C1, C2, C3, C4, C5, C6, oder C7-Alkengruppe. Bei einem bevorzugten Aspekt enthält die Alkengruppe 1, 2 oder 3 C=C Bindungen. Bei einem bevorzugten Aspekt enthält die Alkengruppe 1 C=C-Bindung. Bei einigen bevorzugten Aspekten liegt wenigstens eine C=C-Bindung oder die einzige C=C-Bindung am terminalen C der Alkenkette, d.h. die Bindung befindet sich am zum Ringsystem distalen Ende der Kette.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist G vorzugsweise H.

R1-Gruppe

Die Gruppe R1 der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist eine Sulfamatgruppe der Formel wobei R4 und R5 unabhängig ausgewählt sind aus H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl oder Kombinationen hiervon, oder zusammen Alkylen darstellen, wobei das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl oder Aryl optional ein oder mehrere Heteroatome oder -Gruppen enthält.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist wenigstens einer von R4 und R5 H.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung sind R4 und R5 bevorzugt H.

SUBSTITUENTEN

Allgemeiner ausgedrückt kann das Ringsystem A'B'C'D' der vorliegenden Verbindungen eine Vielzahl sich nicht behindernder Substitutenten beinhalten. Insbesondere kann das Ringsystem A'B'C'D' einen oder mehrere von Hydroxy, Alkyl, insbesondere niederem (C1-C6)-Alkyl, z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl oder andere Pentylisomere, sowie n-Hexyl und andere Hexylisomere, Alkoxy, insbesondere niederes (C1-C6)-Alkoxy, z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, etc., Alkinyl, z.B. Ethinyl oder Halogen, z.B. Fluorsubstituenten enthalten.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass das Ringsystem mit einer Hydrocarbylsulfanylgruppe substituiert ist. Bevorzugter ist der A'-Ring des Ringsystems mit einer Hydrocarbylsulfanylgruppe substituiert. Der Begriff „Hydrocarbylsulfanyl" bezeichnet eine Gruppe, die wenigstens eine Hydrocarbylgruppe (wie hier definiert) und Schwefel enthält, bevorzugt -S-Hydrocarbyl, bevorzugter -S-Kohlenwasserstoff. Diese Schwefelgruppe kann optional oxidiert sein.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es hochgradig bevorzugt, dass wenigstens die 2-Position des A'-Rings des Ringsystems mit einer Hydrocarbylsulfanylgruppe substituiert ist.

Bevorzugt ist die Hydrocarbylsulfanylgruppe -S-C1-10-Alkyl, bevorzugter -S-C1-5-Alkyl, bevorzugter -S-C1-3-Alkyl, bevorzugter -S-CH2CH2CH3, -S-CH2CH3 oder -SCH3.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es hochgradig bevorzugt, dass der A'-Ring des Ringsystems mit einer Alkoxygruppe substituiert ist.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es hochgradig bevorzugt, dass wenigstens die 2-Position des A'-Rings des Ringsystems mit einer Alkoxygruppe substituiert ist.

Bevorzugt ist die Alkoxygruppe Methoxy.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es hochgradig bevorzugt, dass wenigstens der A'-Ring des Ringsystems mit einer Hydrocarbylgruppe substituiert ist.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es hochgradig bevorzugt, dass wenigstens die 2-Position des A'-Rings des Ringsystems mit einer Alkylgruppe substituiert ist.

Vorzugsweise ist die Alkylgruppe Ethyl.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es hochgradig bevorzugt, dass die Verbindung wenigstens zwei oder mehr von einer Sulfamatgruppe, einer Phosphonatgruppe, einer Thiophosphonatgruppe, einer Sulfonatgruppe oder einer Sulfonamidgruppe umfasst.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es hochgradig bevorzugt, dass die Verbindung wenigstens zwei Sulfamatgruppen umfasst.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es hochgradig bevorzugt, dass die Verbindung wenigstens zwei Sulfamatgruppen umfasst, wobei sich diese Sulfamatgruppen nicht am selben Ring befinden.

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist es hochgradig bevorzugt, dass der A'-Ring des Ringsystems wenigstens eine Sulfamatgruppe umfasst, und wobei der D'-Ring des Ringsystems wenigstens eine Sulfamatgruppe umfasst.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung enthält der A'-Ring bevorzugt einen oder mehrere von einem Alkoxy-Substituenten und einem Alkyl-Substituenten. Somit wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Verbindung der Formel XVI bereitgestellt

Bei einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird eine Verbindung der Formel XIX bereitgestellt: wobei R2 und R3 unabhängig ausgewählt sind aus H und Hydrocarbylgruppen, wobei wenigstens einer von R2 und R3 eine Hydrocarbylgruppe ist.

Bevorzugt ist wenigstens einer von R2 und R3 eine Alkylgruppe. Vorzugsweise ist wenigstens einer von R2 und R3 eine C1-C10-Alkylgruppe, vorzugsweise eine C1-C6-Alkylgruppe, vorzugsweise eine C1-C3-Alkylgruppe. Bevorzugt ist wenigstens einer von R2 und R3 -CH3 oder -CH2CH3.

Bei einem Aspekt ist R2 bevorzugt eine Hydrocarbylgruppe und ist R3 H.

Bei einem weiteren bevorzugten Aspekt ist wenigstens einer von R2 und R3 eine Alkoxygruppe. Vorzugsweise ist wenigstens einer von R2 und R3 Methoxy.

Hochgradig bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ausgewählt werden aus

WEITERE ASPEKTE

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff oder Adjuvans.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Therapie eines Zustands oder einer Erkrankung, die mit STS assoziiert ist, bereitgestellt.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Therapie eines Zustands oder einer Erkrankung, die mit ungünstigen STS-Spiegeln assoziiert ist, bereitgestellt.

Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Steroidsulfatase (STS)-Aktivität bereitgestellt.

Bei einigen Anwendungen besitzen die Verbindungen bevorzugt keinen oder einen minimalen östrogenen Effekt.

Bei einigen Anwendungen besitzen die Verbindungen bevorzugt einen östrogenen Effekt.

Bei einigen Anwendungen besitzen die Verbindungen bevorzugt eine reversible Wirkung.

Bei einigen Anwendungen besitzen die Verbindungen bevorzugt eine irreversible Wirkung.

Bei einer Ausführungsform sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung von Brustkrebs.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in Form eines Salzes vorliegen.

Die vorliegende Erfindung deckt auch neue Zwischenprodukte ab, die nützlich sind, um die Verbindungen der vorliegenden Erfindung herzustellen. Beispielsweise deckt die vorliegende Erfindung neue Alkoholvorläufer der Verbindungen ab. Mittels weiteren Beispiels deckt die vorliegende Erfindung bis-geschützte Vorläufer der Verbindungen ab. Beispiele für jeden dieser Vorläufer sind hier dargestellt. Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren, das jeweils einen oder beide dieser Vorläufer für die Synthese der Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhaltet.

Wir haben außerdem identifiziert, dass bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung die vorliegenden Verbindungen auch die Aktivität der Steroid-Dehydrogenase (HSD) inhibieren können.

Mit Steroid-Dehydrogenase oder HSD ist 17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase gemeint. Bei einem Aspekt ist die 17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase EC 1.1.1.62.

Vorzugsweise gehört die HSD zum Typ 1, 3, 5 und/oder 7. Bevorzugt setzt die HSD Östron (Keton) zu Östradiol (Hydroxy) um.

Vorzugsweise gehört die HSD zum Typ 2 und/oder 8. Bevorzugt setzt die HSD Östradiol (Hydroxy) zu Östron (Keton) um.

Somit stellt die vorliegende Erfindung in weiteren Aspekten folgendes bereit:

  • • Die Verwendung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Therapie eines Zustands oder einer Erkrankung, die mit Steroid-Dehydrogenase assoziiert ist.
  • • Die Verwendung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Therapie eines Zustands oder einer Erkrankung, die mit ungünstigen Spiegeln von Steroid-Dehydrogenase assoziiert ist.
  • • Die Verwendung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Pharmazeutikums zum Modulieren von Steroid-Dehydrogenase-Aktivität.
  • • Die Verwendung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Pharmazeutikums zum Inhibieren von Steroid-Dehydrogenase-Aktivität.
  • • Ein Verfahren, umfassend (a) das Durchführen eines Steroid-Dehydrogenase-Assays mit einer oder mehreren Kandidatenverbindungen der vorliegenden Erfindung; (b) Bestimmen, ob eine oder mehrere dieser Kandidatenverbindungen befähigt ist/sind, die Steroid-Dehydrogenase-Aktivität zu modulieren; und (c) Auswählen einer oder mehrerer dieser Kandidatenverbindungen, die befähigt ist/sind, die Steroid-Dehydrogenase-Aktivität zu modulieren.
  • • Ein Verfahren, umfassend (a) das Durchführen eines Steroid-Dehydrogenase-Assays mit einer oder mehreren Kandidatenverbindungen der vorliegenden Erfindung; (b) Bestimmen, ob eine oder mehrere dieser Kandidatenverbindungen befähigt ist/sind, die Steroid-Dehydrogenase-Aktivität zu inhibieren; und (c) Auswählen einer oder mehrerer dieser Kandidatenverbindungen, die befähigt ist/sind, die Steroid-Dehydrogenase-Aktivität zu inhibieren.
  • • Eine Verbindung, die durch die obigen Verfahren identifiziert wurde, deren Verwendung in der Medizin, sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindungen umfasst, optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff oder Adjuvans.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Steroid-Dehydrogenase eine Steroid-Dehydrogenase des Typs I ist.

Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Steroid-Dehydrogenase eine Steroid-Dehydrogenase des Typs II ist.

Bevorzugt gehört die HSD zum Typ 1, 3, 5 und/oder 7. Bevorzugt setzt die HSD Östron (Keton) zu Östradiol (Hydroxy) um.

Bevorzugt gehört die HSD zum Typ 2 und/oder 8. Bevorzugt setzt die HSD Östradiol (Hydroxy) zu Östron (Keton) um.

Wir haben außerdem identifiziert, dass es bei einigen Aspekten für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, mit einer von einer Sulfamatgruppe, einer Phosphonatgruppe, einer Thiophosphonatgruppe, einer Sulfonatgruppe oder einer Sulfonamidgruppe substituiert zu werden, um die Aktivität der Steroid-Dehydrogenase (HSD) zu inhibieren. Somit stellt die vorliegende Erfindung bei einigen Aspekten eine Verbindung bereit, wie hier definiert, wobei R1 ein beliebiger Substituent ist. In diesem Aspekt ist R1 vorzugsweise H, OH oder eine Hydrocarbylgruppe, bevorzugter OH.

Daten, die diese Erkenntnisse bestätigen, sind in der Tabelle 2 unten angegeben.

  • * gemessen bei 10mM

EINIGE VORTEILE

Ein Schlüsselvorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als STS-Inhibitoren wirken können.

Ein weiterer Vorteil der Verbindungen der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie in vivo wirksam sein können.

Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nicht-östrogene Verbindungen sein. Hier bedeutet der Begriff „nicht östrogen", dass diese keine oder im wesentlichen keine östrogene Aktivität zeigen.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass einige der Verbindungen unfähig sein können, zu Verbindungen metabolisiert zu werden, die hormonelle Aktivität zeigen oder induzieren.

Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch insofern vorteilhaft, als sie oral aktiv sein können.

Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nützlich zur Behandlung von Krebs, wie etwa Brustkrebs, sein, sowie ebenso (oder alternativ) von nicht-malignen Zuständen, wie etwa der Verhinderung von Autoimmunerkrankungen, insbesondere, wenn es notwendig sein kann, Pharmazeutika von einem frühen Alter an zu verabreichen.

Somit nimmt man bei einigen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung außerdem an, dass sie weitere therapeutische Nutzen haben als diejenigen für die Behandlung endokrin abhängiger Tumoren, wie etwa die Behandlung von Autoimmunerkrankungen.

STEROID-SULFATASE

Steroidsulfatase – die manchmal als Steroidsulfatase oder Sterylsulfatase oder „STS" als Kurzform bezeichnet wird – hydrolysiert mehrere sulfatierte Steroide, wie etwa Östronsulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und Cholesterolsulfat. STS ist die Enzymnummer EC 3.1.6.2 zugeteilt worden.

STS ist kloniert und exprimiert worden – siehe z.B. Stein et al. (J. Biol. Chem. 264: 13865-13872 (1989) und Yen et al. (Cell 49: 443-454 (1987)).

STS ist ein Enzym, dem eine Beteiligung an einer Reihe von Krankheitszuständen zugeschrieben wurde.

Beispielsweise haben Forscher entdeckt, dass eine völlige Defizienz von STS Ichthyose hervorruft. Gemäß einigen Forschern ist STS-Defizienz in Japan recht verbreitet. Dieselben Forscher (Sakura et al., J Inherit Metab Dis 1997 Nov; 20(6): 807-10) haben auch berichtet, dass allergische Erkrankungen, wie etwa bronchiales Asthma, allergische Rhinitis oder atopische Dermatitis, mit einer Steroidsulfatase-Defizienz assoziiert sein können.

Zusätzlich zu Krankheitszuständen, die durch ein völliges Fehlen von STS-Aktivität mit sich gebracht werden, kann ein erhöhtes Niveau an STS-Aktivität auch Krankheitszustände mit sich bringen. Beispielhaft und wie oben angezeigt, gibt es starke Anhaltspunkte, die eine Rolle von STS beim Wachstum und der Metastasierung von Brustkrebs unterstützen.

STS ist auch in andere Krankheitszustände einbezogen worden. Beispielsweise haben Le Roy et al. (Behav Genet 1999, März; 29(2): 131-6) bestimmt, dass es eine genetische Korrelation zwischen der Steroidsulfatase-Konzentration und der Auslösung von Angriffsverhalten bei Mäusen geben kann. Die Autoren schlussfolgern, dass die Sulfatierung von Steroiden die Haupttriebfeder eines komplexen Netzwerks sein könnte, einschließlich Genen, für die gezeigt wurde, dass sie in Aggression durch Mutagenese verwickelt sind.

STS-Inhibition

Man nimmt an, dass einige Krankheitszustände, die mit STS-Aktivität assoziiert sind, auf der Umwandlung eines nicht aktiven, sulfatierten Östrons zu einem aktiven, nicht sulfatierten Östron beruhen. Bei Krankheitszuständen, die mit STS-Aktivität assoziiert sind, wäre es erstrebenswert, STS-Aktivität zu inhibieren.

Hierbei beinhaltet der Begriff „Inhibieren" ein Reduzieren und/oder Eliminieren und/oder Maskieren und/oder Verhindern der schädlichen Wirkung von STS.

STS-INHIBITOR

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung befähigt, als ein STS-Inhibitor zu wirken.

Hier meint der Begriff „Inhibitor", wie er hier im Hinblick auf die Verbindung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine Verbindung, die STS-Aktivität inhibieren kann – wie etwa ein Reduzieren und/oder Eliminieren und/oder Maskieren und/oder Verhindern der schädlichen Wirkung von STS. Der STS-Inhibitor kann als Antagonist wirken.

Die Fähigkeit von Verbindungen, Östronsulfataseaktivität zu inhibieren, kann unter Verwendung entweder von intakten MCF-7-Brustkrebszellen oder von plazentalen Mikrosomen bestimmt werden. Zusätzlich kann ein Tiermodell verwendet werden. Details über geeignete Assay-Protokolle werden in den folgenden Abschnitten vorgestellt. Es ist anzumerken, dass andere Assays verwendet werden können, um die STS-Aktivität und somit die STS-Inhibition zu bestimmen. Beispielsweise kann auch auf die Lehren der WO-A-99/50453 Bezug genommen werden.

Bevorzugt wird die Verbindung für einige Anwendungen weiter durch das Merkmal charakterisiert, dass, wenn die Sulfamatgruppe durch eine Sulfatgruppe ersetzt werden soll, um ein Sulfatderivat auszubilden, das Sulfatderivat dann durch ein Enzym mit Steroidsulfatase (E.C. 3.1.6.2)-Aktivität hydrolysierbar sein wird, d.h., wenn es mit Steroidsulfatase EC 3.1.6.2 bei pH 7,4 und 37°C inkubiert wird.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform, wenn die Sulfamatgruppe der Verbindung durch eine Sulfatgruppe ersetzt werden soll, um eine Sulfatverbindung auszubilden, so wird diese Sulfatverbindung dann durch ein Enzym mit Steroidsulfatase (E.C. 3.1.6.2)-Aktivität hydrolysierbar sein und wird, wenn sie mit Steroidsulfatase EC 3.1.6.2 bei pH 7,4 und 37°C inkubiert wird, einen Km-Wert von weniger als 200 mmolar, bevorzugt von weniger als 150 mmolar, bevorzugt von weniger als 100 mmolar, bevorzugt von weniger als 75 mmolar, bevorzugt von weniger als 50 mmolar ergeben.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform, wenn die Sulfamatgruppe der Verbindung durch eine Sulfatgruppe ersetzt werden soll, um eine Sulfatverbindung auszubilden, so wird diese Sulfatverbindung dann durch ein Enzym mit Steroidsulfatase (E.C. 3.1.6.2)-Aktivität hydrolysierbar sein und wird, wenn sie mit Steroidsulfatase EC 3.1.6.2 bei pH 7,4 und 37°C inkubiert wird, einen Km-Wert von weniger als 200 &mgr;molar, bevorzugt von weniger als 150 &mgr;molar, bevorzugt von weniger als 100 &mgr;molar, bevorzugt von weniger als 75 &mgr;molar, bevorzugt von weniger als 50 &mgr;molar ergeben.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung durch ein Enzym mit Steroidsulfatase (EC 3.1.6.2)-Aktivität nicht hydrolysierbar.

Bei einigen Anwendungen besitzt die Verbindung der vorliegenden Erfindung bevorzugt eine wenigstens etwa 100-fache Selektivität für das gewünschte Ziel (z.B. STS), bevorzugt eine wenigstens etwa 150-fache Selektivität für das gewünschte Ziel, bevorzugt eine wenigstens etwa 200-fache Selektivität für das gewünschte Ziel, bevorzugt eine wenigstens etwa 250-fache Selektivität für das gewünschte Ziel, bevorzugt eine wenigstens etwa 300-fache Selektivität für das gewünschte Ziel, bevorzugt eine wenigstens etwa 350-fache Selektivität für das gewünschte Ziel.

Es ist anzumerken, dass die Verbindung der vorliegenden Erfindung andere nützliche Eigenschaften zusätzlich zu oder alternativ zu ihrer Fähigkeit, STS-Aktivität zu inhibieren, haben kann.

STEROID-DEHYDROGENASE

Steroid-Dehydrogenase oder „DH" als Abkürzung kann als aus zwei Typen – Typ I und Typ II – bestehend klassifiziert werden. Diese zwei Enzymtypen, wie etwa Östradiol-17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen (E2HSD), besitzen zentrale Rollen beim Regulieren der Fähigkeit von Liganden, mit dem Östrogenrezeptor zu interagieren. Typ I reduziert Östron (E1) zu dem biologisch aktiven Östrogen, Östradiol (E2), während der E2HSD Typ II E2 inaktiviert, indem er dessen Oxidation zu E1 katalysiert.

DH-INHIBITION

Man nimmt an, dass einige Krankheitszustände, die mit DH-Aktivität assoziiert sind, auf der Umsetzung eines nicht-aktiven Östrons zu einer aktiven Form, Östradiol, beruhen. Bei diesen mit DH-Aktivität assoziierten Krankheitszuständen wäre es wünschenswert, DH-Aktivität zu inhibieren.

Hier beinhaltet der Begriff „inhibieren" das Reduzieren und/oder Eliminieren und/oder Maskieren und/oder Verhindern der schädlichen Wirkung von DH.

DH-INHIBITOR

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung befähigt, als ein DH-Inhibitor zu wirken.

Hier bezeichnet der Begriff „Inhibitor", wie er hier im Hinblick auf die Verbindung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine Verbindung, die DH-Aktivität inhibieren kann, so etwa durch Reduzieren und/oder Eliminieren und/oder Maskieren und/oder Verhindern der schädlichen Wirkung von DH. Der DH-Inhibitor kann als ein Antagonist wirken.

Die Fähigkeit von Verbindungen, Steroid-Dehydrogenase-Aktivität zu inhibieren, kann unter Verwendung entweder von T47D-Brustkrebszellen, bei denen E2HSD Typ I-Aktivität reichlich vorhanden ist, oder unter Verwendung von MDA-MB-231-Zellen für Typ II-Inhibitor-Studien bestimmt werden. Bei beiden Zelllinien ist die Bildung der Produkte im Hinblick auf die Zeit und Zellzahl linear. Details über ein geeignetes Assay-Protokoll sind im Abschnitt Beispiele dargestellt.

Es ist anzumerken, dass die Verbindung der vorliegenden Erfindung weitere günstige Eigenschaften zusätzlich oder alternativ zu ihrer Befähigung zur Inhibition der DH-Aktivität aufweisen kann.

SULFAMAT-GRUPPE

Bei einer Ausführungsform besitzt das Ring-X eine Sulfamatgruppe als Substituenten. Der Begriff „Sulfamat", wie er hier verwendet wird, beinhaltet einen Ester von Sulfamidsäure oder einen Ester eines N-substituierten Derivats von Sulfamidsäure oder ein Salz hiervon.

Wenn R1 eine Sulfamatgruppe ist, dann wird die Verbindung der vorliegenden Erfindung als eine Sulfamat-Verbindung bezeichnet.

Typischerweise besitzt die Sulfamatgruppe die Formel: wobei vorzugsweise R4 und R5 unabhängig ausgewählt sind aus H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl, oder Kombinationen hiervon, oder zusammen Alkylen darstellen, wobei das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl oder Aryl optional ein oder mehrere Heteroatome oder Heterogruppen enthält.

Wenn sie substituiert sind, können die N-substituierten Verbindungen dieser Erfindung ein oder zwei N-Alkyl-, N-Alkenyl-, N-Cycloalkyl- oder N-Aryl-Substituenten enthalten, wobei diese bevorzugt ein Maximum von 10 Kohlenstoffatomen oder jeweils ein Maximum von 10 Kohlenstoffatomen enthalten. Wenn R4 und/oder R5 Alkyl ist, so sind die bevorzugten Werte diejenigen, bei denen R4 und R5 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus niederen Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, d.h. Methyl, Ethyl, Propyl, etc. R4 und R5 können beide Methyl sein. Wenn R4 und/oder R5 Aryl ist, so sind typische Werte Phenyl und Tolyl (PhCH3; o). Da, wo R4 und R5 Cycloalkyl darstellen, sind typische Werte Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, etc. Wenn sie miteinander verbunden sind, so repräsentieren R4 und R5 typischerweise eine Alkylengruppe, die eine Kette von 4 bis 6 Kohlenstoffatomen bereitstellt, optional unterbrochen durch ein oder mehrere Heteroatome oder Heterogruppen, um z.B. einen 5-gliedrigen Heterocyclus bereitzustellen, z.B. Morpholino, Pyrrolidino oder Piperidino.

In die Werte einbezogen sind substituierte Gruppen von Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl, die als Substituenten darin eine oder mehrere Gruppen enthalten, die nicht störend in die Sulfatase inhibierende Aktivität der fraglichen Verbindung eingreifen. Beispielhafte nicht störende Substituenten beinhalten Hydroxy, Amino, Halogen, Alkoxy, Alkyl und Aryl.

Bei einigen Ausführungsformen kann die Sulfamatgruppe eine Ringstruktur ausbilden, indem sie mit einem oder mehreren Atomen in oder an der Gruppe X fusioniert (oder damit assoziiert) wird.

Bei einigen Ausführungsformen kann es mehr als eine Sulfamatgruppe geben. Beispielhaft kann es zwei Sulfamate geben (d.h. Bis-Sulfamatverbindungen). Wenn diese Verbindungen auf einem steroidalen Kern basieren, so befindet sich bevorzugt die zweite (oder wenigstens eine der zusätzlichen) Sulfamatgruppen an der Position 17 des steroidalen Kerns. Diese Gruppen müssen nicht gleich sein.

Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist wenigstens einer von R4 und R5 H.

Bei einigen weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist jeder von R4 und R5 H.

PHOSPHONAT-GRUPPE

Typischerweise besitzt die Phosphonatgruppe die folgende Formel: wobei R6 vorzugsweise H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl oder Aryl ist oder Kombinationen hiervon entspricht, wobei das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl oder Aryl optional ein oder mehrere Heteroatome oder Heterogruppen enthält.

Wenn sie substituiert sind, können die N-substituierten Verbindungen dieser Erfindung ein oder zwei N-Alkyl-, N-Alkenyl-, N-Cycloalkyl- oder N-Aryl-Substituenten enthalten, wobei diese bevorzugt ein Maximum von 10 Kohlenstoffatomen oder jeweils ein Maximum von 10 Kohlenstoffatomen enthalten. Wenn R6 Alkyl ist, so kann R6 eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sein, d.h. Methyl, Ethyl, Propyl, etc. Beispielsweise kann R6 Methyl sein. Wenn R6 Aryl ist, so sind typische Werte Phenyl und Tolyl (PhCH3; o). Da, wo R6 Cycloalkyl darstellt, sind typische Werte Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, etc. R6 kann sogar eine Alkylengruppe umfassen, die eine Kette von 4 bis 6 Kohlenstoffatomen bereitstellt, optional unterbrochen durch ein oder mehrere Heteroatome oder Heterogruppen, um z.B. einen 5-gliedrigen Heterocyclus bereitzustellen, z.B. Morpholino, Pyrrolidino oder Piperidino.

In die Werte einbezogen sind substituierte Gruppen von Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl, die als Substituenten darin eine oder mehrere Gruppen enthalten, die nicht störend in die Sulfatase inhibierende Aktivität der fraglichen Verbindung eingreifen. Beispielhafte nicht störende Substituenten beinhalten Hydroxy, Amino, Halogen, Alkoxy, Alkyl und Aryl.

Bei einigen Ausführungsformen kann die Phosphonatgruppe eine Ringstruktur ausbilden, indem sie mit einem oder mehreren Atomen in oder an der Gruppe X fusioniert (oder damit assoziiert) wird.

Bei einigen Ausführungsformen kann es mehr als eine Phosphonatgruppe geben. Beispielhaft kann es zwei Phosphonate geben (d.h. Bis-Phosphonatverbindungen). Wenn diese Verbindungen auf einem steroidalen Kern basieren, so befindet sich bevorzugt die zweite (oder wenigstens eine der zusätzlichen) Phosphonatgruppen an der Position 17 des steroidalen Kerns. Diese Gruppen müssen nicht gleich sein.

THIOPHOSPHONAT-GRUPPE

Typischerweise besitzt die Thiophosphonatgruppe die folgende Formel: wobei R7 vorzugsweise H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl oder Aryl ist oder Kombinationen hiervon entspricht, wobei das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl oder Aryl optional ein oder mehrere Heteroatome oder Heterogruppen enthält.

Wenn sie substituiert sind, können die N-substituierten Verbindungen dieser Erfindung ein oder zwei N-Alkyl-, N-Alkenyl-, N-Cycloalkyl- oder N-Aryl-Substituenten enthalten, wobei diese bevorzugt ein Maximum von 10 Kohlenstoffatomen oder jeweils ein Maximum von 10 Kohlenstoffatomen enthalten. Wenn R7 Alkyl ist, so kann R7 eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sein, d.h. Methyl, Ethyl, Propyl, etc. Beispielsweise kann R7 Methyl sein. Wenn R7 Aryl ist, so sind typische Werte Phenyl und Tolyl (PhCH3; o). Da, wo R7 Cycloalkyl darstellt, sind typische Werte Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, etc. R7 kann sogar eine Alkylengruppe umfassen, die eine Kette von 4 bis 6 Kohlenstoffatomen bereitstellt, optional unterbrochen durch ein oder mehrere Heteroatome oder Heterogruppen, um z.B. einen 5-gliedrigen Heterocyclus bereitzustellen, z.B. Morpholino, Pyrrolidino oder Piperidino.

In die Werte einbezogen sind substituierte Gruppen von Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl, die als Substituenten darin eine oder mehrere Gruppen enthalten, die nicht störend in die Sulfatase inhibierende Aktivität der fraglichen Verbindung eingreifen. Beispielhafte nicht störende Substituenten beinhalten Hydroxy, Amino, Halogen, Alkoxy, Alkyl und Aryl.

Bei einigen Ausführungsformen kann die Thiophosphonatgruppe eine Ringstruktur ausbilden, indem sie mit einem oder mehreren Atomen in oder an der Gruppe X fusioniert (oder damit assoziiert) wird.

Bei einigen Ausführungsformen kann es mehr als eine Thiophosphonatgruppe geben. Beispielhaft kann es zwei Thiophosphonate geben (d.h. Bis-Thiophosphonatverbindungen). Wenn diese Verbindungen auf einem steroidalen Kern basieren, so befindet sich bevorzugt die zweite (oder wenigstens eine der zusätzlichen) Thiophosphonatgruppen an der Position 17 des steroidalen Kerns. Diese Gruppen müssen nicht gleich sein.

SULFONAT-GRUPPE

Typischerweise besitzt die Sulfonatgruppe die folgende Formel: wobei R8 vorzugsweise H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl oder Aryl ist oder Kombinationen hiervon entspricht, wobei das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl oder Aryl optional ein oder mehrere Heteroatome oder Heterogruppen enthält.

Wenn sie substituiert sind, können die N-substituierten Verbindungen dieser Erfindung ein oder zwei N-Alkyl-, N-Alkenyl-, N-Cycloalkyl- oder N-Aryl-Substituenten enthalten, wobei diese bevorzugt ein Maximum von 10 Kohlenstoffatomen oder jeweils ein Maximum von 10 Kohlenstoffatomen enthalten. Wenn R8 Alkyl ist, so kann R8 eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sein, d.h. Methyl, Ethyl, Propyl, etc. Beispielsweise kann R8 Methyl sein. Wenn R8 Aryl ist, so sind typische Werte Phenyl und Tolyl (PhCH3; o). Da, wo R8 Cycloalkyl darstellt, sind typische Werte Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, etc. R8 kann sogar eine Alkylengruppe umfassen, die eine Kette von 4 bis 6 Kohlenstoffatomen bereitstellt, optional unterbrochen durch ein oder mehrere Heteroatome oder Heterogruppen, um z.B. einen 5-gliedrigen Heterocyclus bereitzustellen, z.B. Morpholino, Pyrrolidino oder Piperidino.

In die Werte einbezogen sind substituierte Gruppen von Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl, die als Substituenten darin eine oder mehrere Gruppen enthalten, die nicht störend in die Sulfatase inhibierende Aktivität der fraglichen Verbindung eingreifen. Beispielhafte nicht störende Substituenten beinhalten Hydroxy, Amino, Halogen, Alkoxy, Alkyl und Aryl.

Bei einigen Ausführungsformen kann die Sulfonatgruppe eine Ringstruktur ausbilden, indem sie mit einem oder mehreren Atomen in oder an der Gruppe X fusioniert (oder damit assoziiert) wird.

Bei einigen Ausführungsformen kann es mehr als eine Sulfonatgruppe geben. Beispielhaft kann es zwei Sulfonate geben (d.h. Bis-Sulfonatverbindungen). Wenn diese Verbindungen auf einem steroidalen Kern basieren, so befindet sich bevorzugt die zweite (oder wenigstens eine der zusätzlichen) Sulfonatgruppen an der Position 17 des steroidalen Kerns. Diese Gruppen müssen nicht gleich sein.

KOMBINATION VON SULFONAT/PHOSPHONAT/THIOPHOSPHONAT/SULFAMAT

Bei einigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann eines von einem Sulfonat, wie hier definiert, oder einem Phosphonat, wie hier definiert, oder einem Thiophosphonat, wie hier definiert, oder einem Sulfamat, wie hier definiert, sowie ein weiteres von einem Sulfonat, wie hier definiert, oder einem Phosphonat, wie hier definiert, oder einem Thiophosphonat, wie hier definiert, oder einem Sulfamat, wie hier definiert, vorliegen. Beispielsweise kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung eine Sulfamatgruppe und eine Phosphonatgruppe umfassen.

HYDROCARBYL

Der Begriff „Hydrocarbylgruppe", wie er hier verwendet wird, meint eine Gruppe, die wenigstens C und H umfasst, und die optional ein oder mehrere andere geeignete Substituenten umfassen kann. Beispiele für solche Substituenten können Halogen, Alkoxy, Nitro, eine Alkylgruppe, eine cyclische Gruppe, etc. beinhalten. Zusätzlich zu der Möglichkeit, dass die Substituenten eine cyclische Gruppe sind, kann eine Kombination von Substituenten eine cyclische Gruppe ausbilden. Wenn die Hydrocarbylgruppe mehr als ein C umfasst, dann müssen diese Kohlenstoffatome nicht notwendigerweise miteinander verbunden sein. Beispielsweise können wenigstens zwei der Kohlenstoffatome über ein geeignetes Element oder eine Gruppe verbunden sein. Somit kann die Hydrocarbylgruppe Heteroatome enthalten. Geeignete Heteroatome werden Fachleuten bekannt sein und beinhalten z.B. Schwefel, Stickstoff und Sauerstoff. Ein nicht-einschränkendes Beispiel für eine Hydrocarbylgruppe ist eine Acylgruppe.

Eine typische Hydrocarbylgruppe ist eine Kohlenwasserstoffgruppe. Hier bedeutet der Begriff „Kohlenwasserstoff" ein beliebiges von einer Alkylgruppe, einer Alkenylgruppe, einer Alkinylgruppe, wobei diese Gruppen linear, verzweigt oder cyclisch oder eine Arylgruppe sein können. Der Begriff Kohlenwasserstoff beinhaltet diese Gruppen auch, wenn sie optional substituiert sind. Wenn der Kohlenwasserstoff eine verzweigte Struktur mit daran befindlichem/befindlichen Substituent(en) ist, so kann die Substitution entweder am Kohlenwasserstoff-Rückgrat oder der Verzweigung vorliegen; alternativ können die Substitutionen am Kohlenwasserstoffrückgrat und an der Verzweigung vorliegen.

OXYHYDROCARBYL

Der Begriff „Oxyhydrocarbylgruppe", wie er hier verwendet wird, meint eine Gruppe, die wenigstens C, H und O umfasst, und die optional ein oder mehrere andere geeignete Substituenten umfassen kann. Beispiele für solche Substituenten können Halogen-, Alkoxy-, Nitro-, eine Alkylgruppe, eine cyclische Gruppe, etc. umfassen. Zusätzlich zu der Möglichkeit, dass die Substituenten eine cyclische Gruppe darstellen, kann eine Kombination der Substituenten eine cyclische Gruppe ausbilden. Wenn die Oxyhydrocarbylgruppe mehr als ein C umfasst, dann müssen diese Kohlenstoffatome nicht notwendigerweise miteinander verbunden sein. Beispielsweise können wenigstens zwei der Kohlenstoffatome über ein geeignetes Element oder eine Gruppe verbunden sein. Somit kann die Oxohydrocarbylgruppe Heteroatome enthalten. Geeignete Heteroatome werden Fachleuten bekannt sein und beinhalten z.B. Schwefel und Stickstoff.

Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Oxyhydrocarbylgruppe eine Oxy-Kohlenwasserstoffgruppe.

Hier bedeutet der Begriff „Oxy-Kohlenwasserstoff" ein beliebiges von einer Alkoxygruppe, einer Oxyalkenylgruppe, einer Oxyalkinylgruppe, wobei diese Gruppen linear, verzweigt oder cyclisch sein können, oder eine Oxyarylgruppe. Der Begriff Oxy-Kohlenwasserstoff beinhaltet auch diese Gruppen, wenn sie optional substituiert sind. Wenn der Oxy-Kohlenwasserstoff eine verzweigte Struktur mit daran befindlichem/befindlichen Substituent(en) ist, so kann die Substitution entweder am Kohlenwasserstoff-Rückgrat oder der Verzweigung vorliegen; alternativ können die Substitutionen am Kohlenwasserstoffrückgrat und an der Verzweigung vorliegen.

Typischer Weise besitzt die Oxyhydrocarbylgruppe die Formel C1-6O (wie etwa C1-3O).

ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER STS-AKTIVITÄT UNTER VERWENDUNG VON KREBSZELLEN (PROTOKOLL 1) Inhibition der Steroidsulfatase-Aktivität in MCF-7-Zellen:

Die Aktivität von Steroidsulfatase wird in vitro unter Verwendung von intakten humanen MCF-7-Brustkrebszellen gemessen. Diese hormonabhängige Zelllinie wird in breitem Umfang verwendet, um die Zellwachstumskontrolle bei humanem Brustkrebs zu studieren. Sie besitzt signifikante Steroidsulfatase-Aktivität. (Mac Indoe et al., Endocrinology, 123, 1281-1287 (1988); Purohit & Reed, Int. J. Cancer, 50, 901-905 (1992) und ist erhältlich in den USA bei der American Type Culture Collection (ATCC) und in Großbritannien (z.B. bei dem Imperial Cancer Research Fund).

Die Zellen werden in minimalessentiellem Medium (MEM) (Flow Laboratories, Irvine, Schottland) gehalten, das 20 mM HEPES, 5% fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren und 0,075% an Natriumbicarbonat enthält. Bis zu 30 Mehrfachansätze von 25 cm2 Gewebekulturkolben werden mit etwa 1 × 105 Zellen/Kolben unter Verwendung des obigen Mediums angeimpft. Man lässt die Zellen bis auf 80% Konfluenz wachsen und wechselt das Medium jeden dritten Tag.

Intakte Monolayer von MCF-7-Zellen in dreifachen 25 cm2-Gewebekulturkolben wurden mit Earle's Balanced Salzlösung (EBSS von ICN Flow, High Wycombe, U.K.) gewaschen und für 3-4 Stunden bei 37°C mit 5 pmol (7 × 105 dpm) [6,7-3H]-Östron-3-Sulfat (spezifische Aktivität 60 Ci/mmol von New England Nuclear, Boston, Mass., USA) in serumfreiem MEM (2,5 ml) inkubiert, und zwar zusammen mit Östron-3-Sulfamat (11 Konzentrationen: 0; 1 fM; 0,01 pM; 0,1 pM; 1 pM; 0,01 nM; 0,1 nM; 1 nM; 0,01 mM; 0,1 mM; 1 mM). Nach der Inkubation wird jeder Kolben abgekühlt, und das Medium (1 ml) wird in separate Röhrchen mit [14C]-Östron (7 × 103 dpm) (spezifische Aktivität 97 Ci/mmol, von Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.) pipettiert. Das Gemisch wird sorgfältig für 30 Sekunden mit Toluol (5 ml) geschüttelt. Versuche haben gezeigt, dass >90% an [14C]-Östron und <0,1% an [3H]Östron-3-sulfat durch diese Behandlung aus der wässrigen Phase entfernt werden. Ein Teil (2 ml) der organischen Phase wird entnommen, eingedampft und der 3H- und 14C-Gehalt des Rückstands wird jeweils durch Szintillations-Spektrometrie bestimmt. Die Masse an hydrolysiertem Östron-3-Sulfat wurde aus den erhaltenen 3H-Zählimpulsen (korrigiert für die verwendeten Volumina des Mediums und der organischen Phase und für die Wiedergewinnung von zugegebenem [14C]-Östron) und der spezifischen Aktivität des Substrats berechnet. Jede Versuchs-Charge beinhaltet Inkubationen von Mikrosomen, hergestellt aus einer Sulfatasepositiven humanen Plazenta (Positivkontrolle) und Kolben ohne Zellen (um erkennbare nichtenzymatische Hydrolyse des Substrats zu bestimmen). Die Anzahl an Zellkernen pro Kolben wird unter Verwendung eines Coulter Counters nach Behandeln der Zell-Monolayer mit Zaponin bestimmt. Ein Kolben in jeder Charge wird verwendet, um den Zellmembranstatus und die Lebensfähigkeit unter Verwendung des Trypan Blau-Ausschlussverfahrens (Phillips, H.J. (1973) In: Tissue culture and applications [Herausgeber: Kruse, D.F. & Patterson, M.K.]; S. 406-408; Academic Press, New York) zu bestimmen.

Die Ergebnisse für die Steroidsulfatase-Aktivität werden ausgedrückt als Mittelwert ± 1 Standardabweichung des während der Inkubationsphase (20 Stunden) gebildeten Gesamtprodukts (Östron + Östradiol), berechnet für 106 Zellen und für Werte mit statistischer Signifikanz, wobei die Angabe als Prozentsatz der Reduzierung (Inhibition) gegenüber Inkubationen ohne Östron-3-Sulfamat ausgedrückt wird. Es wurde ein ungepaarter Student t-Test verwendet, um die statistische Signifikanz der Ergebnisse zu testen.

ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER STS-AKTIVITÄT UNTER VERWENDUNG PLAZENTALER MIKROSOMEN (PROTOKOLL 2) Inhibition der Steroidsulfatase-Aktivität in plazentalen Mikrosomen:

Sulfatase-positive humane Plazenta aus normal abgeschlossenen Schwangerschaften wird gründlich mit der Schere zerkleinert, einmal mit kaltem Phosphatpuffer (pH 7,4, 50 mM) gewaschen und dann in kaltem Phosphatpuffer (5 ml/g Gewebe) resuspendiert. Die Homogenisierung erfolgt mit einem Ultra-Turrax-Homogenisator unter Verwendung von drei 10 Sekunden-Stößen, getrennt durch 2-minütige Kühlphasen in Eis. Zellkerne und Zelltrümmer werden durch Zentrifugation (4°C) bei 20008 für 30 Minuten abgetrennt, und Teilvolumina (2 ml) des Überstandes werden bei –20°C gelagert. Die Proteinkonzentration der Überstände wird durch das Verfahren von Bradford (Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)) bestimmt.

Die Inkubationen (1 ml) erfolgen unter Verwendung einer Proteinkonzentration von 100 mg/ml, einer Substratkonzentration von 20 mM [6,7-3H]Östron-3-sulfat (spezifische Aktivität 60 Ci/mmol, von New England Nuclear, Boston, Mass., USA) und einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei 37°C. Wenn nötig, werden acht Konzentrationen von Verbindungen verwendet: 0 (d.h. Kontrolle); 0,05 mM; 0,1 mM; 0,2 mM; 0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM; 1,0 mM. Nach der Inkubation wird jede Probe abgekühlt, und das Medium (1 ml) wird in getrennte Röhrchen mit [14C]-Östron (7 × 103 dpm) (spezifische Aktivität 97 Ci/mmol, von Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.) pipettiert. Das Gemisch wird sorgfältig für 30 Sekunden mit Toluol (5 ml) geschüttelt. Versuche haben gezeigt, dass >90% an [14C]-Östron und <0,1 % an [3H]Östron-3-sulfat durch diese Behandlung aus der wässrigen Phase entfernt werden. Ein Teil (2 ml) der organischen Phase wurde entnommen, eingedampft und der 3H- und 14C-Gehalt des Rückstands werden jeweils durch Szintillations-Spektrometrie bestimmt. Die Masse an hydrolysiertem Östron-3-Sulfat wird aus den erhaltenen 3H-Zählimpulsen (korrigiert für die verwendeten Volumina des Mediums und der organischen Phase und für die Wiedergewinnung von zugegebenem [14C]-Östron) und der spezifischen Aktivität des Substrats berechnet.

TIERVERSUCHSMODELL FÜR DIE BESTIMMUNG VON STS-AKTIVITÄT (PROTOKOLL 3) Inhibition von Östronsulfatase-Aktivität in vivo:

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines Tiermodells, insbesondere unter Verwendung von Ratten mit Ovariektomie, untersucht werden. Bei diesem Modell stimulieren Verbindungen, die östrogen sind, das Uteruswachstum.

Die Verbindung (10 mg/kg/Tag für fünf Tage) wurde oral an Ratten verabreicht, wobei eine weitere Gruppe von Tieren nur den Träger (Propylenglykol) erhielt. Eine weitere Gruppe erhielt die Verbindung EMATE subkutan in einer Menge von 10 &mgr;g/Tag für fünf Tage. Am Ende der Studie wurden Proben von Lebergewebe erhalten, und die Östronsulfatase-Aktivität wurde unter Verwendung von 3H-Östronsulfat als Substrat gemäß vorheriger Beschreibung (siehe PCT/GB95/02638) getestet.

TIERVERSUCHSMODELL ZUR BESTIMMUNG DER ÖSTROGENEN AKTIVITÄT (PROTOKOLL 4) Fehlen von Östrogenität in vivo:

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines Tiermodells, insbesondere unter Verwendung von Ratten mit Ovariektomie, untersucht werden. Bei diesem Modell stimulieren Verbindungen, die östrogen sind, das Uteruswachstum.

Die Verbindung (10 mg/kg/Tag für fünf Tage) wurde oral an Ratten verabreicht, wobei eine weitere Gruppe von Tieren nur den Träger (Propylenglykol) erhielt. Eine weitere Gruppe erhielt die östrogene Verbindung EMATE subkutan in einer Menge von 10 &mgr;g/Tag für fünf Tage. Am Ende der Studie wurden die Uteri erhalten und gewogen, wobei die Ergebnisse als Uterusgewicht/Gesamt-Körpergewicht × 100 ausgedrückt werden.

Verbindungen, die keinen signifikanten Einfluss auf das Uteruswachstum haben, sind nicht östrogen.

BIOTECHNOLOGISCHE ASSAYS FÜR DIE BESTIMMUNG DER STS-AKTIVITÄT PROTOKOLL 5)

Die Fähigkeit von Verbindungen, Östronsulfatase-Aktivität zu inhibieren, kann auch unter Verwendung von Aminosäuresequenzen oder Nukleotidsequenzen, die für STS codieren, oder von aktiven Fragmenten, Derivaten, Homologen oder Varianten hiervon, z.B. durch Hochdurchsatz-Screens, bestimmt werden.

Ein beliebiges oder mehrere der geeigneten Ziele – wie etwa eine Aminosäuresequenz und/oder eine Nukleotidsequenz – können verwendet werden, um ein Mittel zu identifizieren, das befähigt ist, STS in einer beliebigen einer Vielzahl von Arzneistoff-Screening-Techniken zu modulieren. Das bei einem solchen Test verwendete Ziel (Target) kann frei in Lösung vorliegen, an einem festen Träger befestigt sein, sich an einer Zelloberfläche oder intrazellulär befinden. Die Aufhebung der Zielaktivität oder die Bildung von Bindungskomplexen zwischen dem Ziel und dem Mittel, auf die hin getestet wird, kann gemessen werden.

Der Assay der vorliegenden Erfindung kann ein Screen sein, durch den eine Anzahl von Mitteln getestet wird. Bei einem Aspekt ist das Testverfahren der vorliegenden Erfindung ein Hochdurchsatz-Screen.

Techniken zum Durchtesten von Arzneimitteln können auf dem Verfahren basieren, das in Geysen, Europäische Patentanmeldung 84/03564, veröffentlicht am 13. September 1984, beschrieben wurde. Zusammengefasst werden große Zahlen verschiedener kleiner Peptid-Testverbindungen an einem festen Substrat, wie etwa Kunststoffstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Die Peptidtestverbindungen werden mit einem geeigneten Ziel oder Fragment hiervon umgesetzt und gewaschen. Gebundene Einheiten werden dann detektiert, so etwa durch geeignetes Anpassen von in der Technik wohlbekannten Verfahren. Ein gereinigtes Ziel kann auch direkt auf Platten aufgeschichtet werden, um diese in Arzneistoff-Screening-Techniken zu verwenden. Alternativ können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und dieses auf einem festen Träger zu immobilisieren.

Diese Erfindung zieht auch die Verwendung eines kompetitiven Arzneistoff-Screening-Assays in Betracht, bei dem neutralisierende Antikörper, die befähigt sind, ein Ziel spezifisch zu binden, mit einer Testverbindung um das Binden an ein Ziel konkurrieren.

Eine weitere Technik zum Durchtesten stellt ein Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Mitteln bereit, die geeignete Bindungsaffinität für die Substanzen besitzen, basierend auf dem Verfahren, das detailliert in der WO 84/03564 beschrieben ist.

Es wird erwartet, dass die Assay-Verfahren der vorliegenden Erfindung sowohl für ein Screening von Testverbindungen im kleinen als auch im großen Maßstab sowie bei quantitativen Assays geeignet sind.

Bei einem bevorzugten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln, die STS selektiv modulieren, mit Verbindungen, die die Formel (Ia) besitzen.

REPORTER

Es kann eine breite Vielzahl von Reportern bei den Assay-Verfahren (sowie bei den Screens) der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei bevorzugte Reporter praktischerweise detektierbare Signale bereitstellen (z.B. durch Spektroskopie). Beispielhaft kann ein Reportergen für ein Enzym codieren, das eine Reaktion katalysiert, die die Lichtabsorptionseigenschaften verändert.

Andere Protokolle beinhalten Enzym-gekoppelten Immunosorptions-Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Es kann sogar ein bipositioneller, monoklonal basierter Immunoassay, der monoklonale Antikörper benutzt, die reaktiv für zwei sich nicht störende Epitope sind, verwendet werden. Diese und andere Assays sind unter anderem beschrieben in Hampton R et al. (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) und Maddox DE et al. (1983, J Exp Med 15, 8:121 1).

Beispiele für Reportermoleküle beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, &bgr;-Galactosidase, Invertase, Grünes Fluoreszenzprotein, Luciferase, Chloramphenicol-Acetyltransferase, -Glucuronidase, Exo-Glucanase und Glucoamylase. Alternativ können radioaktiv markierte oder mit Fluoreszenz-Tag markierte Nukleotide in die naszierenden Transkripte eingebaut werden, die dann identifiziert werden, wenn sie an Oligonukleotid-Sonden gebunden sind.

In einem weiteren Beispiel stellt eine Anzahl von Firmen, wie etwa Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) und US Biochemical Corp (Cleveland, OH) kommerzielle Kits und Protokolle für Assay-Verfahren bereit. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen beinhalten solche wie Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszierende oder chromogene Mittel, sowie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und dergleichen. Patente, die über die Verwendung solcher Markierungen unterrichten, beinhalten US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 und US-A-4366241.

WIRTSZELLEN

Der Begriff „Wirtszelle", im Bezug auf die vorliegende Erfindung, beinhaltet eine jede Zelle, die das Ziel für das Mittel der vorliegenden Erfindung umfassen kann.

Somit stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Wirtszellen bereit, die mit einem Polynukleotid transformiert oder transfiziert sind, das das Ziel der vorliegenden Erfindung darstellt oder dieses exprimiert. Vorzugsweise wird dieses Polynukleotid in einem Vektor für die Replikation und Expression von Polynukleotiden getragen, die das Ziel darstellen sollen oder dieses exprimieren sollen. Die Zellen werden so ausgewählt, dass sie mit diesem Vektor kompatibel sind, und können beispielsweise prokaryotisch (z.B. bakteriell), pilzlich bzw. Hefe oder Pflanzenzellen sein.

Das gram-negative Bakterium E. coli wird in breitem Umfang als Wirt für die heterologe Genexpression verwendet. Jedoch neigen große Mengen an heterologem Protein dazu, im Inneren der Zelle zu akkumulieren. Die nachfolgende Reinigung des gewünschten Proteins aus der Masse der intrazellulären E. coli-Proteine kann manchmal schwierig sein.

Im Gegensatz zu E. coli sind die Bakterien der Gattung Bacillus als heterologe Wirte sehr geeignet, da sie die Fähigkeit besitzen, Proteine in das Kulturmedium zu sekretieren. Andere als Wirte geeignete Bakterien sind diejenigen der Gattung Streptomyces und Pseudomonas.

In Abhängigkeit von der Natur des Polynukleotids, das für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder der Erwünschtheit einer weiteren Prozessierung des exprimierten Proteins können eukaryotische Wirte, wie etwa Hefen oder andere Pilze bevorzugt sein. Im allgemeinen sind Hefezellen gegenüber Pilz-Zellen bevorzugt, da sie leichter zu manipulieren sind. Jedoch werden manche Proteine entweder schwach aus den Hefezellen sekretiert oder werden in einigen Fällen nicht korrekt prozessiert (z.B. Hyperglykosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein anderer pilzlicher Wirtsorganismus ausgewählt werden.

Beispiele geeigneter Expressionswirte im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind Pilze, wie etwa die Aspergillus-Spezies (wie etwa solche, die beschrieben sind in der EP-A-0184438 und der EP-A-0284603) und Trichoderma-Spezies; Bakterien, wie etwa Bacillus-Spezies (wie etwa solche, die beschrieben sind in der EP-A-0134048 und der EP-A-0253455), Streptomyces-Spezies und Pseudomonas-Spezies; sowie Hefen, wie etwa Kluyveromyces-Spezies (wie etwa diejenigen, die beschrieben sind in der EP-A-0096430 und der EP-A-0301670) und Saccharomyces-Spezies. Beispielhaft können typische Expressionswirte ausgewählt werden aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis and Saccharomyces cerevisiae.

Die Verwendung geeigneter Wirtszellen, wie etwa von Hefe-, Pilz- und Pflanzenwirtszellen, kann posttranslationale Modifikationen bereitstellen (z.B. Myristoylierung, Glykosylierung, Trunkierung, Lipidierung, sowie die Phosphorylierung von Tyrosin, Serin oder Threonin), wie es erforderlich sein mag, um den rekombinanten Expressionsprodukten der vorliegenden Erfindung optimale biologische Aktivität zu verleihen.

ORGANISMUS

Der Begriff „Organismus" im Bezug auf die vorliegende Erfindung beinhaltet jedweden Organismus, der das Ziel gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder davon erhaltene Produkte beinhalten kann. Beispiele von Organismen können einen Pilz, Hefe oder eine Pflanze beinhalten.

Der Begriff „transgener Organismus" im Bezug auf die vorliegende Erfindung beinhaltet jedweden Organismus, der das Ziel gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder erhaltene Produkte umfasst.

TRANSFORMATION VON WIRTSZELLEN/WIRTSORGANISMEN

Wie früher angezeigt, kann der Wirtsorganismus ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Organismus sein. Beispiele geeigneter prokaryotischer Wirte beinhalten E. coli und Bacillus subtilis. Die Lehre über die Transformation prokaryotischer Wirte ist in der Technik gut dokumentiert, siehe z.B. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Wenn ein prokaryotischer Wirt verwendet wird, so kann es nötig sein, die Nukleotidsequenz vor der Transformation in geeigneter Weise zu modifizieren – wie etwa durch die Entfernung von Introns.

Bei einer anderen Ausführungsform kann der transgene Organismus eine Hefe sein. In diesem Zusammenhang sind auch Hefen in breitem Umfang als Vehikel für die heterologe Genexpression verwendet worden. Die Spezies Saccharomyces cerevisiae besitzt eine lange Geschichte der industriellen Verwendung, einschließlich ihrer Verwendung für die heterologe Genexpression. Die Expression heterologer Gene in Saccharomyces cerevisiae ist übersichtsartig von Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al., Herausgeber, S. 401-429, Allen and Unwin, London) und von King et al., (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton und G T Yarronton, Herausgeber, S. 107-133, Blackie, Glasgow) beschrieben worden.

Aus verschiedenen Gründen ist Saccharomyces cerevisiae für die heterologe Genexpression gut geeignet. Zum ersten ist sie für Menschen nicht pathogen und unfähig, bestimmte Endotoxine zu produzieren. Zum zweiten besitzt sie eine lange Geschichte sicherer Verwendung über Jahrhunderte der kommerziellen Nutzung für verschiedene Zwecke. Dies hat zu einer breiten öffentlichen Akzeptanz geführt. Drittens hat die ausgedehnte kommerzielle Nutzung und die Forschung, die diesem Organismus gewidmet wurde, zu einem Schatz an Wissen über die Genetik und Physiologie sowie über die Eigenschaften von Saccharomyces cerevisiae bei der Fermentation im großen Maßstab geführt.

Ein Übersichtsartikel über die Prinzipien der heterologen Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und die Sekretion von Genprodukten wurde geschrieben von E Hinchcliffe, E Kenny (1993, „Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Band 5, Anthony H Rose und J Stuart Harrison, Herausgeber, 2. Auflage, Academic Press Ltd.).

Es sind verschiedene Typen von Hefevektoren verfügbar, einschließlich integrativer Vektoren, die für ihre Aufrechterhaltung die Rekombination mit dem Wirtsgenom benötigen, und sich autonom replizierende Plasmidvektoren.

Um die transgene Saccharomyces herzustellen, werden Expressionskonstrukte erstellt, indem man die Nukleotidsequenz in ein Konstrukt inseriert, das für die Expression in Hefe konzipiert ist. Es sind mehrere Typen von Konstrukten, die für die heterologe Expression verwendet werden, entwickelt worden. Die Konstrukte enthalten einen in Hefe aktiven Promotor, der fusioniert wird mit der Nukleotidsequenz, wobei für gewöhnlich ein Promotor mit Herkunft aus Hefe, wie etwa der GAL1-Promotor, verwendet wird. Gewöhnlich wird eine Signalsequenz mit Herkunft aus Hefe, wie etwa die Sequenz, die für das SUC2-Signalpeptid codiert, verwendet. Ein in Hefe aktiver Terminator steht am Ende des Expressionssystems.

Für die Transformation von Hefe sind diverse Transformationsprotokolle entwickelt worden. Beispielsweise kann eine transgene Saccharomyces gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem man den Lehren der folgenden Veröffentlichungen folgt: Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); und Ito, H et al., (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung verschiedener Selektionsmarker selektiert. Unter den Markern, die für die Transformation verwendet werden, ist eine Reihe auxotropher Marker, wie etwa LEU2, HIS4 und TRP1, sowie dominante Antibiotika-Resistenzmarker, beispielsweise Marker für Aminoglykosid-Antibiotika, z.B. G418.

Ein anderer Wirtsorganismus ist eine Pflanze. Das grundlegende Prinzip bei der Herstellung genetisch modifizierter Pflanzen besteht darin, genetische Information in das Pflanzengenom zu inserieren, um so eine stabile Aufrechterhaltung des inserierten genetischen Materials zu erhalten. Es existieren mehrere Techniken für das Inserieren genetischer Information, mit den beiden Hauptprinzipien einer direkten Einführung der genetischen Information und einer Einführung der genetischen Information unter Verwendung eines Vektorsystems. Eine Übersichtsdarstellung der allgemeinen Techniken ist in den Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994, 17-27) zu finden. Weitere Lehren über die Transformation einer Pflanze sind in der EP-A-0449375 zu finden.

Somit stellt die vorliegende Erfindung außerdem ein Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle mit einer Nukleotidsequenz bereit, die das Ziel sein soll oder das Ziel exprimieren soll. Mit der Nukleotidsequenz transformierte Wirtszellen können unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Expression des codierten Proteins geeignet sind. Das von einer rekombinanten Zelle produzierte Protein kann auf der Oberfläche der Zelle präsentiert werden.

Wenn gewünscht, und wie von Fachleuten verstanden wird, können Expressionsvektoren, die codierende Sequenzen enthalten, mit Signalsequenzen für eine direkte Sekretion der codierten Sequenzen durch eine bestimmte prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran erstellt werden. Andere rekombinante Konstrukte können zu der codierenden Sequenz hinzukommen, etwa eine Nukleotidsequenz, die für eine Polypeptiddomäne codiert, die die Reinigung der löslichen Proteine erleichtern wird (Kroll DJ et al. (1993) DNA Cell Biol. 12: 441-53).

VARIANTEN/HOMOLOGE/DERIVATE

Zusätzlich zu den hier genannten spezifischen Aminosäuresequenzen und Nukleotidsequenzen umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Varianten, Homologen und Derivaten hiervon. Hier kann der Begriff „Homologie" mit „Identität" gleichgesetzt werden.

Im vorliegenden Kontext ist eine homologe Sequenz so zu verstehen, dass sie eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die wenigstens zu 75, 85 oder 90% identisch ist, bevorzugt zu wenigstens 95 oder 98% identisch. Obwohl Homologie auch in Begriffen von Ähnlichkeit (d.h. Aminosäureresten mit ähnlichen chemischen Eigenschaften/Funktionen) betrachtet werden kann, ist es im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bevorzugt, Homologie in Begriffen von Sequenzidentität auszudrücken.

Homologievergleiche können mit dem Auge durchgeführt werden, oder, üblicherer Weise, mit Hilfe eines leicht verfügbaren Sequenzvergleichsprogramms. Diese kommerziell erhältlichen Computerprogramme können die % Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen berechnen.

Die prozentuale Homologie kann über zusammenhängende Sequenzen berechnet werden, d.h. eine Sequenz wird einem Alignment mit der anderen Sequenz unterzogen, und jede Aminosäure in einer Sequenz wird direkt mit der korrespondieren Aminosäure in der anderen Sequenz verglichen, bei jeweils einem Rest zur gleichen Zeit. Dies wird als „lückenloses" Alignment bezeichnet. Typischerweise werden solche lückenlosen Alignments nur über eine relativ kurze Anzahl von Resten durchgeführt.

Obwohl dies ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren ist, berücksichtigt es nicht, dass z.B. bei einem ansonsten identischen Sequenzpaar eine Insertion oder Deletion bewirken wird, dass die folgenden Aminosäurereste aus dem Alignment herausgenommen werden, was potentiell in einer großen Verringerung der prozentualen Homologie resultiert, wenn ein allgemeines Alignment durchgeführt wird. Demzufolge sind die meisten Sequenzvergleichsverfahren so gestaltet, dass sie optimale Alignments produzieren, die mögliche Insertionen und Deletionen berücksichtigen, ohne dabei das allgemeine Homologieergebnis unnötig zu belasten. Dies wird erreicht, indem man „Lücken" in das Sequenz-Alignment einführt, um eine Maximierung der lokalen Homologie zu versuchen.

Jedoch ordnen diese komplexeren Verfahren jeder Lücke, die im Alignment auftritt, „Lückenstrafen" zu, sodass bei der gleichen Anzahl identischer Aminosäuren ein Sequenz-Alignment mit möglichst wenig Lücken – was eine höhere Verwandtschaft zwischen den zwei verglichenen Sequenzen widerspiegelt – ein höheres Ergebnis erzielen wird als ein Alignment mit vielen Lücken. Es werden typischerweise „affine Lückenkosten" verwendet, die für die Existenz einer Lücke relativ hohe Kosten veranschlagen, und eine kleinere Strafe für jeden nachfolgenden Rest in der Lücke. Dies ist das am weitesten verwendete System zur Bewertung von Lücken. Hohe Lückenstrafen werden natürlich optimierte Alignments mit weniger Lücken ergeben. Die meisten Alignmentprogramme erlauben es, dass die Lückenstrafen modifiziert werden. Jedoch ist es bevorzugt, die Default-Werte zu verwenden, wenn solche Software für Sequenzvergleiche verwendet wird. Wenn beispielsweise das GCG Wisconsin Bestfit Paket (siehe unten) verwendet wird, so ist die Default-Lückenstrafe bei Aminosäuresequenzen -12 für eine Lücke und -4 für jede Erweiterung.

Die Berechnung der maximalen prozentualen Homologie erfordert deshalb zunächst die Herstellung eines optimalen Alignments, das Lückenstrafen berücksichtigt. Ein geeignetes Computerprogramm zur Durchführung solcher Alignments ist das GCG Wisconsin Bestfit Paket (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Beispiele für andere Software, die Sequenzvergleiche durchführen kann, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, das BLAST-Paket (siehe Ausubel et al., 1999 ibidem, Kapitel 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 403-410) und die GENEWORKS-Reihe von Vergleichswerkzeugen. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für die Offline- und Online-Suche verfügbar (siehe Ausubel et al., 1999 ibidem, Seiten 7-58 bis 7-60). Es ist jedoch bevorzugt, das GCG Bestfit-Programm zu verwenden.

Eine weitere nützliche Literaturstelle ist diejenige, die sich in FEMS Microbiol. Lett 1999 Mai 15; 174 (2): 247-50 findet (und ein veröffentlichtes Erratum erscheint in FEMS Microbiol Lett 1999 Aug 1; 177(1): 187 8).

Obwohl die endgültige prozentuale Homologie in Begriffen der Identität gemessen werden kann, basiert der Alignment-Prozess selbst typischerweise nicht auf einem Alles-oder-Nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird allgemein eine skalierte Ähnlichkeitsergebnis-Matrix verwendet, die jedem paarweisen Vergleich auf Basis einer chemischen Ähnlichkeit oder einer evolutionären Distanz Ergebniswerte zuordnet. Ein Beispiel für eine solche üblicherweise verwendete Matrix ist die BLOSUM62-Matrix, die Default-Matrix für die Reihe der BLAST-Programme. Die GCG-Wisconsin-Programme verwenden generell entweder die allgemeinen Default-Werte oder eine Gebrauchs-Symbolvergleichstabelle, sofern geliefert (siehe Benutzerhandbuch für weitere Details). Es ist bevorzugt, die allgemeinen Default-Werte für das GCG-Paket zu verwenden, oder, im Falle anderer Software, die Default-Matrix, wie etwa BLOSUM62.

Sobald die Software ein optimales Alignment erstellt hat, ist es möglich, den %-Wert der Homologie, bevorzugt die prozentuale Sequenzidentität, zu berechnen. Die Software tut dies typischer Weise als Teil des Sequenzvergleichs und erzeugt ein numerisches Ergebnis.

Die Sequenzen können auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten aufweisen, die eine stille Veränderung hervorrufen und in einer funktionell äquivalenten Substanz resultieren. Absichtliche Aminosäuresubstitutionen können auf Basis der Ähnlichkeit hinsichtlich der Polarität, der Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur der Reste durchgeführt werden, solange die sekundäre Bindungsaktivität der Substanz erhalten bleibt. Beispielsweise beinhalten negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren beinhalten Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilitätswerten beinhalten Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.

Konservative Substitutionen können z.B. gemäß der folgenden Tabelle durchgeführt werden. Aminosäuren im selben Block in der zweiten Spalte und bevorzugt in derselben Linie in der dritten Spalte können gegeneinander ausgetauscht werden:

EXPRESSIONSVEKTOREN

Die Nukleotidsequenz zur Verwendung als Ziel oder für die Expression des Ziels kann in einen rekombinanten replizierbaren Vektor eingebaut werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nukleotidsequenz in und/oder aus einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren und zu exprimieren. Die Expression kann unter Verwendung von Kontrollsequenzen kontrolliert werden, die Promotoren/Enhancer und/oder andere Expressionsregulationssignale beinhalten. Es können prokaryotische Promotoren und Promotoren, die in eukaryotischen Zellen funktionell sind, verwendet werden. Es können gewebespezifische oder Stimuli-spezifische Promotoren verwendet werden. Es können auch chimäre Promotoren verwendet werden, die Sequenzelemente von zwei oder mehr der oben beschriebenen verschiedenen Promotoren umfassen.

Das durch die Expression der Nukleotidsequenz von einer rekombinanten Wirtszelle erzeugte Protein kann in Abhängigkeit von der verwendeten Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor sekretiert werden oder es kann intrazellulär enthalten sein. Die codierenden Sequenzen können mit Signalsequenzen entworfen werden, die die Sekretion der die Substanz darstellenden Sequenzen durch eine bestimmte prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran steuern.

FUSIONSPROTEINE

Die Zielaminosäuresequenz kann als Fusionsprotein hergestellt werden, beispielsweise um die Extraktion und Reinigung zu erleichtern. Beispiele für Fusionsprotein-Partner beinhalten Glutathion-S-Transferase (GST), 6 × His, GAL4 (DNA-Bindungs- und/oder Transkriptionsaktivierungsdomäne) und &bgr;-Galactosidase. Es kann auch günstig sein, eine proteolytische Spaltstelle zwischen dem Fusionsproteinpartner und der Proteinsequenz von Interesse einzufügen, um eine Entfernung der Fusionsproteinsequenzen zu erlauben. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein die Aktivität des Ziels nicht behindern.

Das Fusionsprotein kann ein Antigen oder eine antigene Determinante umfassen, die mit der Substanz der vorliegenden Erfindung fusioniert ist. Bei dieser Ausführungsform kann das Fusionsprotein ein nicht natürlich vorkommendes Fusionsprotein sein, das eine Substanz umfasst, die als ein Adjuvans in dem Sinne wirken kann, als sie eine generalisierte Stimulation des Immunsystems bereitstellt. Das Antigen oder die antigene Determinante kann entweder an den Amino-Terminus oder an den Carboxy-Terminus der Substanz angefügt werden.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Aminosäuresequenz an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um für ein Fusionsprotein zu codieren. Beispielsweise kann es zum Durchtesten von Peptidbibliotheken auf Mittel, die befähigt sind, die Substanzaktivität zu beeinflussen, nützlich sein, wenn eine chimäre Substanz codiert wird, die ein heterologes Epitop exprimiert, das von einem kommerziell erhältlichen Antikörper erkannt wird.

THERAPIE

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können als therapeutische Mittel, d.h. bei therapeutischen Anwendungen, verwendet werden.

Der Begriff „Therapie" beinhaltet heilende Effekte, lindernde Effekte und prophylaktische Effekte.

Die Therapie kann an Menschen oder Tieren, bevorzugt weiblichen Tieren, erfolgen.

PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN

Bei einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung und optional einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein Verdünnungsmittel oder einen Hilfsstoff (einschließlich Kombinationen hiervon) umfasst.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können für den Gebrauch am Menschen oder Tier in der Human- und Veterinärmedizin sein und werden typischerweise einen oder mehrere von einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsstoff umfassen. Akzeptable Träger oder Verdünnungsmittel für die therapeutische Verwendung sind in der pharmazeutischen Technik wohlbekannt und werden beispielsweise beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro, Herausgeber, 1985). Die Auswahl eines pharmazeutischen Trägers, Hilfsstoffs oder Verdünnungsmittels kann im Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsroute und die pharmazeutische Standardpraxis erfolgen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können als – oder zusätzlich zu – dem Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel (ein) beliebige(s) Bindemittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, Beschichtungsmittel oder Solubilisierungsmittel beinhalten.

Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Farbstoffe und sogar Geschmacksstoffe können in der pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt werden. Beispiele für Konservierungsstoffe beinhalten Natriumbenzoat, Sorbinsäure und Ester von p-Hydroxybenzoesäure. Antioxidantien und Suspendiermittel können ebenfalls verwendet werden.

In Abhängigkeit von den verschiedenen Zufuhrsystemen kann es unterschiedliche Erfordernisse für die verschiedenen Zusammensetzungen/Formulierungen geben. Beispielhaft kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung formuliert werden, um unter Verwendung einer Minipumpe oder über eine Schleimhaut-Route verabreicht zu werden, z.B. als nasales Spray oder Aerosol für die Inhalation oder als einnehmbare Lösung oder parenteral, wobei die Zusammensetzung in einer injizierbaren Form formuliert ist, zur Verabreichung, z.B. über eine intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Route. Alternativ kann die Formulierung so gestaltet sein, dass sie über beide Routen zugeführt wird.

Da, wo das Mittel mukosal über die Magendarm-Schleimhaut zu verabreichen ist, sollte es in der Lage sein, während des Durchgangs durch den Magendarmtrakt stabil zu bleiben; beispielsweise sollte es resistent gegenüber proteolytischem Abbau sein, stabil bei saurem pH und beständig gegenüber den Detergenseffekten von Gallenflüssigkeit.

Wo es passend ist, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Inhalation, in Form eines Zäpfchens oder Pessars, topisch in Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder als Stäubepuder, in der Verwendung als Hautpflaster, oral in Form von Tabletten, die Hilfsstoffe, wie etwa Stärke oder Laktose, enthalten, oder in Kapseln oder Kügelchen entweder alleine oder im Gemisch mit Hilfsstoffen, oder in Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen mit Geschmacks- oder Farbstoffen verabreicht werden, oder sie können parenteral, z.B. intravenös, intramuskulär oder subkutan, injiziert werden. Bei der parenteralen Verabreichung können die Zusammensetzungen am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet werden, die andere Substanzen enthalten kann, z.B. genügend Salze oder Monosaccharide, um die Lösung isotonisch mit Blut zu machen. Für die bukkale oder sublinguale Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Lutschtabletten verabreicht werden, die in konventioneller Weise formuliert werden können.

KOMBINATIONSPHARMAZEUTIKUM

Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit einem oder mehreren anderen Wirkstoffen, wie etwa einem oder mehreren anderen pharmazeutisch aktiven Mitteln, verwendet werden.

Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen STS-Inhibitoren und/oder anderen Inhibitoren, wie etwa einem Aromatasehemmer (wie z.B. 4-Hydroxyandrostendion (4-OHA) und/oder Steroiden, wie etwa den natürlich vorkommenden Sterneuorosteroiden Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS) und Pregnenolonsulfat (PS) und/oder anderen strukturell ähnlichen organischen Verbindungen verwendet werden. Beispiele weiterer STS-Inhibitoren sind in den obigen Literaturstellen zu finden. Beispielsweise beinhalten STS-Inhibitoren für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung EMATE, und eines oder beide der 2-Ethyl- und 2-Methoxy-17-deoxy-Verbindungen, die analog zu der hier dargestellten Verbindung 5 sind.

Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem biologischen Antwortmodifikator verwendet werden.

Der Begriff „biologischer Antwortmodifikator" („BRM") beinhaltet Cytokine, Immunmodulatoren, Wachstumsfaktoren, die Hämatopoese regulierende Faktoren, Koloniestimulierende Faktoren, chemotaktische, hämolytische und thrombolytische Faktoren, Zelloberflächenrezeptoren, Liganden, Leukozyten-Adhäsionsmoleküle, monoklonale Antikörper, präventive und therapeutische Impfstoffe, Hormone, Komponenten der extrazellulären Matrix, Fibronectin, etc. Bei einigen Anwendungen ist der biologische Antwortmodifikator bevorzugt ein Zytokin. Beispiele von Zytokinen beinhalten: Interleukine (IL), wie etwa IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-19; Tumornekrosefaktor (TNF), wie etwa TNF-&agr;; Interferon alpha, beta und gamma; TGF-&bgr;. Bei einigen Anwendungen ist das Zytokin vorzugsweise Tumornekrosefaktor (TNF). Bei einigen Anwendungen kann der TNF irgendein Typ von TNF sein, wie etwa TNF-&agr;, TNF-&bgr;, einschließlich Derivaten oder Gemischen hiervon. Bevorzugter ist das Zytokin TNF-&agr;. Informationen über TNF sind in der Technik zu finden, wie etwa in der WO-A-98/08870 und der WO-A-98/13348.

VERABREICHUNG

Typischerweise wird ein Arzt die tatsächliche Dosis bestimmen, die für ein Individuum am geeignetsten sein wird, und diese wird mit dem Alter, dem Gewicht und der Antwort des spezifischen Patienten variieren. Die unten angegebenen Dosierungen sind Beispiele für den durchschnittlichen Fall. Es kann natürlich individuelle Umstände geben, wo höhere oder niedrigere Dosisbereiche günstig sind.

Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch direkte Injektion verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann für die parenterale, mukosale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraokulare oder transdermale Verabreichung formuliert werden. In Abhängigkeit von der Notwendigkeit kann das Mittel in einer Dosis von 0,01 bis 30 mg/kg Körpergewicht, wie etwa von 0,1 bis 10 mg/kg, bevorzugter von 0,1 bis 1 mg/kg Körpergewicht, verabreicht werden.

In einem weiteren Beispiel können die Mittel der vorliegenden Erfindung in Übereinstimmung mit einem Schema 1 bis 4-mal pro Tag, bevorzugt ein- oder zweimal pro Tag verabreicht werden. Das spezifische Dosierungsniveau und die Häufigkeit der Dosierung für einen bestimmten Patienten können variiert werden und werden von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich der Aktivität der spezifischen verwendeten Verbindung, der metabolischen Stabilität und der Wirkungsdauer dieser Verbindung, dem Alter, Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht, der Ernährung, der Art und Zeit der Verabreichung, der Exkretionsrate, der Wirkstoffkombination, dem Schweregrad des spezifischen Zustands und dem die Behandlung durchmachenden Wirtsindividuum.

Neben den typischen Weisen der Verabreichung – die oben angegeben sind – beinhaltet der Begriff „verabreicht" auch die Verabreichung durch Techniken, wie etwa Lipid-vermittelte Transfektion, Liposomen, Immunliposomen, Lipofectin, kationische faziale Amphiphile (CFAs) und Kombinationen hiervon. Die Routen für solche Verabreichungsmechanismen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die mukosale, nasale, orale, parenterale, gastrointestinale, topische oder sublinguale Route.

Der Begriff „verabreicht" beinhaltet, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Verabreichung über eine mukosale Route, z.B. als Nasenspray oder aerosol zur Inhalation oder als einnehmbare Lösung; sowie eine parenterale Route, bei der die Zufuhr über eine injizierbare Form erfolgt, wie z.B. eine intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Route.

Somit können die STS-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung in einer beliebigen geeigneten Weise für die pharmazeutische Verabreichung formuliert werden, und zwar unter Verwendung konventioneller pharmazeutischer Formulierungstechniken und pharmazeutischer Träger, Adjuvanzien, Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel, etc, und dabei gewöhnlich für die parenterale Verabreichung. Ungefähre wirksame Dosierungsraten können im Bereich von 1 bis 1000 mg/Tag, wie etwa von 10 bis 900 mg/Tag oder sogar von 100 bis 800 mg/Tag liegen, in Abhängigkeit von den individuellen Aktivitäten der fraglichen Verbindungen und für Patienten mit einem durchschnittlichen (70 kg) Körpergewicht. Üblichere Dosierungsraten für die bevorzugten und aktiveren Verbindungen werden im Bereich von 200 bis 800 mg/Tag, bevorzugter von 200 bis 500 mg/Tag, am bevorzugtesten von 200 bis 250 mg/Tag liegen. Diese können in einzelnen Dosierungsschemata, in aufgespalteten Dosierungsschemata und/oder in Schemata mit multiplen Dosen, die über mehrere Tage andauern, verabreicht werden. Für die orale Verabreichung können sie in Tabletten, Kapseln, Lösung oder Suspension formuliert werden, die 100 bis 500 mg der Verbindung pro Dosierungseinheit enthalten. Alternativ und bevorzugt werden die Verbindungen für die parenterale Verabreichung in einem geeigneten parenteral verabreichbaren Träger formuliert und stellen einzelne tägliche Dosierungsraten im Bereich von 200 bis 800 mg, bevorzugt von 200 bis 500 mg, bevorzugter von 200 bis 250 mg, bereit. Solche wirksamen Tagesdosen werden jedoch von der inhärenten Aktivität des Wirkstoffs und dem Körpergewicht des Patienten abhängen, wobei solche Variationen im Bereich der Fähigkeit und Beurteilung des Arztes stehen.

ZELLZYKLUS

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nützlich in einem Verfahren zur Behandlung einer Störung des Zellzyklus sein.

Wie in „Molecular Cell Biology", 3. Auflage, Lodish et al., Seiten 177-181 diskutiert, können verschiedene eukaryotische Zellen mit recht unterschiedlichen Raten wachsen und sich teilen. Hefezellen z.B. können sich alle 120 min teilen, und die ersten Teilungen von befruchteten Eiern in den embryonalen Zellen von Seeigeln und Insekten benötigen nur 1530 min, da eine große bereits bestehende Zelle unterteilt wird. Jedoch benötigen die meisten wachsenden Pflanzen- und Tierzellen 10-20 Stunden, um sich in ihrer Zahl zu verdoppeln, und einige verdoppeln sich mit viel langsamerer Geschwindigkeit. Viele Zellen bei Erwachsenen, wie etwa Nervenzellen und quergestreifte Muskelzellen, teilen sich überhaupt nicht; andere, wie etwa die Fibroblasten, die das Heilen von Wunden unterstützen, vermehren sich bei Bedarf, sind aber ansonsten ruhend.

Nach wie vor muss jede eukaryotische Zelle, die sich teilt, bereit sein, gleichwertiges genetisches Material an zwei Tochterzellen weiterzugeben. Die DNA-Synthese bei Eukaryoten erfolgt nicht während des Zellteilungszyklus, sondern ist auf einen Teil hiervon vor der eigentlichen Zellteilung beschränkt.

Die Beziehung zwischen eukaryotischer DNA-Synthese und Zellteilung ist in Kulturen von Säugerzellen, die alle zu Wachstum und Teilung befähigt waren, gründlich analysiert worden. Im Gegensatz zu Bakterien wurde herausgefunden, dass eukaryotische Zellen nur einen Teil ihrer Zeit mit DNA-Synthese zubringen, und dass diese Stunden vor der Zellteilung (Mitose) abgeschlossen wird. Somit tritt eine zeitliche Lücke nach der DNA-Synthese und vor der Zellteilung auf; das Auftreten einer weiteren Lücke wurde nach der Teilung und vor der nächsten Runde der DNA-Synthese gefunden. Diese Analyse führte zu der Schlussfolgerung, dass der eukaryotische Zellzyklus aus einer M-Phase (mitotischen Phase), einer G1-Phase (der ersten Lücke), der S (DNA-Synthese-)Phase und einer G2-Phase (der zweiten Lücke) besteht, woran sich wieder eine M-Phase anschließt. Die Phasen zwischen den Mitosen (G1, S und G2) sind insgesamt als die Interphase bekannt.

Viele sich nicht teilende Zellen in Geweben (z.B. alle ruhenden Fibroblasten) beenden den Zellzyklus nach der Mitose und gerade vor der DNA-Synthese; von solchen „ruhenden" Zellen sagt man, dass sie den Zellzyklus verlassen haben und sich im G0-Zustand befinden.

Es ist möglich, Zellen zu identifizieren, wenn sie sich in einem der drei Interphase-Stadien des Zellzyklus befinden, und zwar unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS), um deren relativen DNA-Gehalt zu messen: eine Zelle, die sich in G1 (vor der DNA-Synthese) befindet, besitzt eine definierte Menge x an DNA; während S (DNA-Replikation) besitzt sie zwischen x und 2x; und wenn sie sich in G2 (oder M) befindet, besitzt sie 2x an DNA.

Die Stadien der Mitose und Zytokinese in einer Tierzelle sind wie folgt:

  • (a) Interphase: Das G2-Stadium der Interphase geht dem Beginn der Mitose unmittelbar voraus. Die chromosomale DNA hat sich repliziert und hat während der S-Phase an Protein gebunden, jedoch sind die Chromosomen noch nicht als abgegrenzte Strukturen zu erkennen. Der Nukleolus ist die einzige Kernsubstruktur, die unter dem Lichtmikroskop sichtbar ist. Bei einer diploiden Zelle vor der DNA-Replikation gibt es zwei morphologische Chromosomen jedes Typs, und man sagt, die Zelle sei 2n. In G2, nach der DNA-Replikation, ist die Zelle 4n. Dort gibt es vier Kopien jeder chromosomalen DNA. Da sich die Schwesterchromosomen noch nicht voneinander getrennt haben, werden diese als Schwester-Chromatiden bezeichnet.
  • (b) Frühe Prophase: Centriolen, jede mit einer neu gebildeten Tochter-Centriole, beginnen zu den entgegengesetzten Polen der Zelle zu wandern; die Chromosomen sind als lange Fäden zu sehen. Die Kernmembran beginnt, sich zu kleinen Vehikeln aufzulösen.
  • (c) Mittlere und späte Prophase: Die Chromosomen-Kondensation ist abgeschlossen; jede sichtbare Chromosomen-Struktur setzt sich aus zwei Chromatiden zusammen, die an ihren Centromeren zusammengehalten werden. Jede Chromatide enthält eines der zwei neu replizierten Tochter-DNA-Moleküle. Die aus Mikrotubuli bestehende Spindel beginnt, sich von den Regionen in direkter Nachbarschaft der Centriolen, die näher zu ihren Polen hin wandern, strahlenförmig auszudehnen. Einige Spindelfasern reichen von Pol zu Pol; sie müssen die Chromatiden erreichen und sich an den Kinetochoren anheften.
  • (d) Metaphase: Die Chromosomen wandern zum Äquator der Zelle, wo sie in der Äquatorialebene aufgereiht werden. Die Schwesterchromatiden haben sich noch nicht getrennt.
  • (e) Anaphase: Die beiden Schwesterchromatiden trennen sich in unabhängige Chromosomen. Jedes enthält ein Centromer, das über eine Spindelfaser mit einem Pol verbunden ist, zu dem es wandert. Somit wird eine Kopie jedes Chromosoms an jede Tochterzelle weitergegeben. Gleichzeitig verlängert sich die Zelle, ebenso wie die Spindeln von Pol zu Pol. Die Zytokinese beginnt, wenn sich die Spaltungsfurche auszubilden beginnt.
  • (f) Telophase: Es bilden sich neue Membranen um die Tochterkerne; die Chromsomen dekondensieren und werden weniger abgegrenzt, der Nukleolus wird wieder sichtbar, und es bildet sich die Kernmembran um jeden Tochterkern. Die Zytokinese ist nahezu abgeschlossen, und die Spindel verschwindet, wenn die Mikrotubuli und die anderen Fasern depolymerisieren. Im Laufe der Mitose wächst das „Tochter"-Centriol an jedem Pol, bis es seine volle Länge erreicht hat. In der Telophase ist die Verdoppelung jeder der ursprünglichen Centriolen abgeschlossen, und neue Tochter-Centriolen werden während der nächsten Interphase erzeugt.
  • (g) Interphase: Beim Abschluss der Zytokinese tritt die Zelle in die G1-Phase des Zellzyklus ein und durchläuft den Zyklus dann erneut.

Es wird erkennbar sein, dass der Zellzyklus ein extrem wichtiger zellulärer Prozess ist. Abweichungen vom normalen Zellzyklus können in einer Reihe medizinischer Störungen resultieren. Ein gesteigerter und/oder unkontrollierter Zellzyklus kann zu Krebs führen. Ein herabgesetzter Zellzyklus kann zu degenerativen Zuständen führen. Die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann ein Mittel bereitstellen, um solche Erkrankungen und Zustände zu behandeln.

Somit können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung geeignet für die Verwendung bei der Behandlung von Zellzyklus-Störungen, wie etwa Krebs, einschließlich hormonabhängiger und hormonunabhängiger Krebsarten, sein.

Zusätzlich kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung geeignet sein für die Behandlung von Krebs, wie etwa Brustkrebs, Eierstockkrebs, endometrialem Krebs, Sarkomen, Melanomen, Prostatakrebs, Pankreaskrebs etc., sowie weiteren soliden Tumoren.

Bei einigen Anwendungen wird der Zellzyklus inhibiert und/oder verhindert und/oder angehalten, wobei der Zellzyklus bevorzugt verhindert und/oder angehalten wird. Bei einem Aspekt kann der Zellzyklus in der G2/M-Phase inhibiert und/oder verhindert und/oder angehalten werden. Bei einem Aspekt kann der Zellzyklus irreversibel verhindert und/oder inhibiert und/oder angehalten werden, wobei der Zellzyklus bevorzugt irreversibel verhindert und/oder angehalten wird.

Mit dem Begriff „irreversibel verhindert und/oder inhibiert und/oder angehalten" ist gemeint, dass es nach der Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung bei einer Entfernung der Verbindung so ist, dass die Wirkungen der Verbindung, nämlich die Verhinderung und/oder Inhibition und/oder das Anhalten des Zellzyklus, nach wie vor beobachtet werden können. Spezifischer ausgedrückt, ist mit dem Begriff „irreversibel verhindert und/oder inhibiert und/oder angehalten" gemeint, dass, wenn in Übereinstimmung mit dem hier dargestellten Zellzyklustest-Protokoll getestet wird, die mit einer Verbindung von Interesse behandelten Zellen nach dem Stadium 2 des Protokolls I ein geringeres Wachstum als Kontrollzellen zeigen. Details über dieses Protokoll sind unten dargestellt.

Somit stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen bereit, die: eine Inhibition des Wachstums von Östrogenrezeptor-positiven (ER+) und ER-negativen (ER–)-Brustkrebszellen in vitro durch das Verhindern und/oder die Inhibition und/oder das Anhalten des Zellzyklus bewirken; und/oder eine Regression von Nitrosomethyl-Harnstoff (NMU)-induzierten Brusttumoren bei intakten Tieren (d.h. Tieren ohne Ovariektomie) verursachen; und/oder den Zellzyklus bei Krebszellen verhindern und/oder inhibieren und/oder anhalten; und/oder die in vivo wirken, indem sie den Zellzyklus verhindern und/oder inhibieren und/oder anhalten, und/oder die als ein Zellzyklus-Agonist wirken.

ZELLZYKLUS-ASSAY (PROTOKOLL 6) Prozedur: Stufe 1

MCF-7-Brustkrebszellen werden in Multiwell-Kulturplatten mit einer Dichte von 105 Zellen/Well angeimpft. Man lässt die Zellen sich anhaften und bis zu einer Konfluenz von etwa 30% wachsen, wonach sie wie folgt behandelt werden:

Kontrolle – keine Behandlung

Verbindung von Interesse (COI) 20 &mgr;M

Man lässt die Zellen für 6 Tage in Wachstumsmedium, das die COI enthält, wachsen, mit einem Austausch von Medium/COI alle 3 Tage. Am Ende dieser Zeitspanne wurden die Zellzahlen unter Verwendung eines Coulter-Zellzählers ausgezählt.

Stufe 2:

Nach der Behandlung der Zellen für eine 6-tägige Zeitspanne mit der COI werden die Zellen mit einer Dichte von 104 Zellen/Well erneut ausgesät. Es werden keine weiteren Behandlungen zugegeben. Man lässt die Zellen für weitere 6 Tage in Gegenwart von Wachstumsmedium wachsen. Am Ende dieser Zeitspanne werden die Zellzahlen erneut ausgezählt.

ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER DH-AKTIVITÄT UNTER VERWENDUNG VON KREBSZELLEN (PROTOKOLL 7)

Die Umsetzung von Östron zu Östradiol (E1 → E2, E2DH Typ I) und Östradiol zu Östron (E2 → E1, E2DH Typ II) wurde in intakten Zellmonolayern von T47D bzw. MDA-MB-231 Brustkrebszellen gemessen. Die Zellen wurden in Kolben kultiviert, bis sie zu 80-90% konfluent waren. Es wurde 3H-E1 oder 3H-E2 (6 pmol, ~ 90 Ci/mmol) in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit verschiedener Testverbindungen (10 &mgr;M) in 2,5 ml an Medium gegeben. Es wurde außerdem Substrat zu Kolben ohne Zellen hinzugegeben und dies parallel inkubiert (Null-Proben).

Nach der Inkubation mit den T47D-Zellen für 30 min oder mit den MDA-Zellen für 3 h bei 37°C wurden 2 ml des Mediums zu Teströhrchen mit 14C-E2 oder 14C-E1 (~ 5000 cpm) und 50 &mgr;g E2 bzw. E1 hinzugegeben. Die Steroide wurden mit Diethylether (4 ml) aus dem wässrigen Medium extrahiert. Die Etherphase wurde in separate Röhrchen abdekantiert, nachdem die wässrige Phase in einem Gemisch aus Trockeneis/Methanol gefroren worden war. Der Ether wurde unter einem Luftstrom von 40°C bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in einem kleinen Volumen an Diethylether gelöst und auf TLC-Platten aufgetragen, die einen Fluoreszenz-Indikator enthalten. E1 und E2 wurden durch TLC unter Verwendung von DCM-Ethylacetat (4:1 Vol./Vol.) aufgetrennt. Die Position des Produkts aus jedem Inkubationskolben wurde nach dem Sichtbarmachen unter UV-Licht auf der TLC-Platte markiert. Die markierten Regionen wurden ausgeschnitten und in Szintillationsgefäße gegeben, die Methanol (0,5 ml) enthalten, um das Produkt zu eluieren. Die Menge des gebildetem 3H-Produkts und des zurückgewonnenen 14C-E1 oder 14C-E2 wurden nach der Szintillations-Spektrometrie berechnet. Die Menge an gebildetem Produkt wurde im Hinblick auf den Verlust bei der Prozedur und für die Zellzahl in jedem Kolben korrigiert.

KREBS

Wie angezeigt, können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung einer Zellzyklusstörung sein. Eine spezielle Zellzyklusstörung ist Krebs.

Krebs bleibt eine Haupttodesursache in den meisten westlichen Ländern. Bislang entwickelte Krebstherapien haben das Blockieren der Wirkung oder Synthese von Hormonen einbezogen, um das Wachstum hormonabhängiger Tumoren zu inhibieren. Jedoch wird derzeit eine aggressivere Chemotherapie für die Behandlung hormonunabhängiger Tumoren verwendet.

Daher würde die Entwicklung eines Pharmazeutikums für die Antikrebsbehandlung hormonabhängiger und/oder hormonunabhängiger Tumoren, der jedoch einige oder alle der mit Chemotherapie in Zusammenhang stehenden Nebenwirkungen fehlen, einen großen therapeutischen Fortschritt darstellen.

Es ist bekannt, dass Östrogene nach ihrer Synthese eine Anzahl von Hydroxylierungs- und Konjugationsreaktionen durchmachen. Bis vor kurzem wurde angenommen, dass derartige Reaktionen einen Teil eines metabolischen Prozesses darstellen, der Östrogene schließlich wasserlöslich macht und ihre Beseitigung aus dem Körper verstärkt. Es ist nun ersichtlich, dass einige Hydroxymetaboliten (z.B. 2-Hydroxy und 16-alpha-Hydroxy) und Konjugate (z.B. Östronsulfat, E1S) wichtig sind, um einige der komplexen Wirkungen zu bestimmen, die Östrogene im Körper haben.

Forscher haben die Bildung von 2- und 16-hydroxylierten Östrogenen im Zusammenhang mit Bedingungen untersucht, die das Brustkrebsrisiko verändern. Es gibt nun Anhaltspunkte, dass Faktoren, die die Aktivität von 2-Hydroxylase verstärken, mit einem verringerten Krebsrisiko in Zusammenhang stehen, während diejenigen, die die 16-alpha-Hydroxylierung verstärken, das Risiko von Brustkrebs erhöhen können. Ein weiteres Interesse an der biologischen Rolle von Östrogenmetaboliten ist durch das zunehmende Ausmaß an Anhaltspunkten angeregt worden, dass 2-Methoxyöstradiol einen endogenen Metaboliten mit antimitotischen Eigenschaften darstellt. 2-MeOE2 wird aus 2-Hydroxy-Östradiol (2-OHE2) durch Katechol-Östrogen-Methyl-Transferase gebildet, ein Enzym, das im Körper weit verbreitet ist.

Forscher haben gezeigt, dass 2-MeOE2 in vivo das Wachstum von Tumoren hemmt, die aus der subkutanen Injektion von Meth A Sarkom, B16 Melanom oder MDA-MB-435 Östrogen-Rezeptor-negativen (ER)-Brustkrebszellen entstehen. Es inhibiert auch die endotheliale Zellproliferation und -Migration und die in vifro-Angiogenese. Es wurde vorgeschlagen, dass die Fähigkeit von 2-MeOE2, das Tumorwachstum in vivo zu inhibieren, eher auf dessen Fähigkeit zurückgehen könnte, die Tumor-induzierte Angiogenese zu hemmen als auf eine direkte Inhibition der Proliferation von Tumorzellen.

Der Mechanismus, durch den 2-MeOE2 seine potenten anti-mitogenen und anti-angiogenetischen Wirkungen ausübt, wird noch untersucht. Es gibt Anhaltspunkte, dass es bei hohen Konzentrationen die Mikrotubuli-Polymerisation hemmen kann und als ein schwacher Inhibitor der Colchicin-Bindung an Tubulin wirkt. Jüngst jedoch, bei Konzentrationen, die die Mitose blockieren, wurde nicht beobachtet, dass die Tubulinfilamente in den Zellen depolymerisieren, sondern eine identische Morphologie zu derjenigen haben, die nach Taxolbehandlung zu beobachten ist. Es ist daher möglich, dass, ähnlich wie Taxol – ein Arzneistoff, der zur Therapie von Brust- und Eierstockkrebs verwendet wird – 2-MeOE2 dadurch wirkt, indem es die Dynamik der Mikrotubuli stabilisiert.

Obwohl die Identifizierung von 2-MeOE2 als neue Therapie für Krebs einen wichtigen Fortschritt darstellt, ist die Bioverfügbarkeit oral verabreichter Östrogene gering. Weiterhin können sie während ihrer ersten Passage durch die Leber eine ausgedehnte Metabolisierung durchmachen. Als Teil eines Forschungsprogramms zur Entwicklung eines Steroidsulfatase-Inhibitors für die Therapie von Brustkrebs wurde Östron-3-O-Sulfamat (EMATE) als wirkungsstarker auf die aktive Stelle gerichteter Inhibitor identifiziert. Unerwartet zeigte EMATE, dass es starke östrogene Eigenschaften besitzt, wobei seine orale uterotrophe Aktivität bei Ratten 100-mal höher ist als die von Östradiol. Man nimmt an, dass seine gesteigerte Östrogenität aus seiner Absorption durch rote Blutzellen (rbcs) resultiert, die es vor der Inaktivierung während seiner Passage durch die Leber schützen, und die als ein Reservoir für seine langsame Freisetzung über eine verlängerte Zeitspanne fungieren. Es wurde eine Anzahl von A-Ring-modifizierten Analoga synthetisiert und getestet, einschließlich 2-Methoxyöstron-3-O-Sulfamat. Obwohl diese Verbindung als Steroidsulfatase-Inhibitor gleich wirksam wie EMATE war, war es frei von Östrogenität.

Wir nehmen an, dass die Verbindung der vorliegenden Erfindung ein Mittel für die Behandlung von Krebs, und insbesondere von Brustkrebs, bereitstellt.

Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung nützlich für das Blockieren des Wachstums von Krebs, einschließlich Leukämien und soliden Tumoren, wie etwa Brust-, Endometrium-, Prostata-, Eierstock- und Pankreas-Tumoren, sein.

THERAPIE UNTER BERÜCKSICHTIGUNG VON ÖSTROGEN

Wir glauben, dass einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich für die Kontrolle der Östrogenspiegel im Körper sein können, insbesondere bei Frauen. Somit können einige der Verbindungen nützlich sein zur Bereitstellung eines Mittels zur Kontrolle der Fruchtbarkeit, wie etwa einer oralen Verhütungs-Tablette, -Pille, Lösung oder -Lutschtablette. Alternativ kann die Verbindung in Form eines Implantats oder eines Pflasters vorliegen.

Somit können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich sein, mit Östrogen in Zusammenhang stehende hormonelle Zustände zu behandeln.

Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung hormoneller Zustände zusätzlich zu den mit Östrogen assoziierten Zuständen sein. Somit kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung auch befähigt sein, die hormonelle Aktivität zu beeinflussen, und sie kann außerdem befähigt sein, eine Immunantwort zu beeinflussen.

NEURODEGENERATIVE ERKRANKUNGEN

Wir glauben, dass einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen und ähnlicher Zustände sind.

Beispielsweise wird angenommen, dass STS-Inhibitoren nützlich für die Stärkung der Gedächtnisfunktion bei Patienten sein können, die an Krankheiten wie etwa Amnesie, Kopfverletzungen, Alzheimer-Krankheit, epileptischer Demenz, präseniler Demenz, posttraumatischer Demenz, seniler Demenz, vaskulärer Demenz und Demenz nach Schlaganfall leiden, oder für Personen, die ansonsten eine Stärkung des Gedächtnisses suchen.

TH1

Wir glauben, dass einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich bei TH1-Zusammenhängen sein können.

Beispielsweise wird angenommen, dass die Anwesenheit von STS-Inhibitoren in einer Makrophage oder in anderen Antigen-präsentierenden Zellen zu einer verringerten Fähigkeit sensibilisierter T-Zellen führen kann, eine TH1 (hohes IL-2, IFN&ggr;, niedriges IL-4)-Antwort anzubringen. Der normale regulatorische Einfluss von anderen Steroiden, wie etwa von Glucokorticoiden, würde daher vorherrschen.

ENTZÜNDLICHE ZUSTÄNDE

Wir nehmen an, dass einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung entzündlicher Zustände sein können, wie etwa von Zuständen, die mit einem oder mehreren der folgenden assoziiert sind: Autoimmunität, einschließlich z.B. rheumatoider Arthritis, Typ I und II Diabetes, systemischem Lupus erythematodes, multipler Sklerose, Myasthenia gravis, Thyroiditis, Vaskulitis, Colitis ulcerosa und Crohn'scher Erkrankung, Hautkrankheiten, wie z.B. Psoriasis und Kontaktdermatitis; Graft-versus-Host-Krankheit; Ekzem; Asthma und Organabstoßung nach Transplantation.

Beispielsweise wird angenommen, dass STS-Inhibitoren die normale physiologische Wirkung von DHEA oder verwandten Steroiden auf Immun- und/oder Entzündungsantworten verhindern können.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nützlich sein für die Herstellung eines Medikaments zum Offenlegen einer endogenen Glucokortikoid-artigen Wirkung.

ANDERE THERAPIEN

Es versteht sich außerdem, dass die Verbindung/Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung andere wichtige medizinische Implikationen besitzen kann.

Beispielsweise kann die Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung der Erkrankungen sein, die sich aufgezählt finden in der WO-A-99/52890 – viz:

Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung der in der WO-A-98/05635 aufgezählten Erkrankungen sein. Zur Erleichterung der Bezugnahme wird ein Teil dieser Liste nun bereitgestellt: Krebs, Entzündung oder entzündliche Erkrankungen, Hautkrankheiten, Fieber, Kardiovaskuläre Zustände, Hämorrhagie, Koagulation und Akutphasen-Reaktion, Kachexie, Anorexie, akute Infektion, HIV-Infektion, Schockzustände, Wirts-Transplantat-Unverträglichkeit, Autoimmunerkrankungen, Reperfusionsverletzungen, Meningitis, Migräne und Aspirinabhängige Anti-Thrombose; Tumorwachstum, -invasion und -ausbreitung, Angiogenese, Metastasen, maligne Erkrankungen, Aszites und maligne Pleuraleffusion; cerebrale Ischämie, ischämische Herzerkrankungen, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Osteoporose, Asthma, Multiple Sklerose, Neurodegeneration, Alzheimer-Krankheit, Arteriosklerose, Schlaganfall, Vaskulitis, Crohn'sche Erkrankung und Colitis ulcerosa; Periodontitis, Gingivitis; Psoriasis, Neurodermatitis, chronische Geschwüre, Epidermolysis bullosa; Ulzeration der Augenhornhaut, Retinopathie und chirurgische Wundheilung; Rhinitis, allergische Konjunktivitis, Ekzeme, Anaphylaxie; wiederkehrende Stenose, kongestives Herzversagen, Endometriose, Arteriosklerose oder Endosklerose.

Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung von Krankheiten sein, die in der WO-A-98/07859 aufgelistet sind. Zur Erleichterung der Bezugnahme wird ein Teil dieser Liste nun bereitgestellt: Zytokin- und Zellteilungsaktivität und Differenzierungsaktivität; immunsupprimierende oder immunstimulierende Aktivität (z.B. zur Behandlung von Immundefizienz, einschließlich Infektion mit dem humanen Immunschwäche-Virus, Regulation des Lymphozytenwachstums, Behandlung von Krebs und zahlreichen Autoimmunerkrankungen, Verhinderung von Transplantatabstoßung oder Induzieren von Tumor-Immunität); Regulierung der Hämatopoese, z.B. Behandlung von myeloiden oder lymphoiden Erkrankungen; Förderung des Wachstums von Knochen, Knorpel, Sehnen, Bändern und von Nervengewebe, z.B. für die Wundheilung, Behandlung von Verbrennungen, Geschwüren und periodontaler Erkrankung und Neurodegeneration; Inhibition oder Aktivierung des Follikel-stimulierenden Hormons (Modulation der Fertilität); chemotaktische/chemokinetische Aktivität (z.B. zur Mobilisierung spezifischer Zelltypen zu Stellen der Verletzung oder Infektion); hämostatische und thrombolytische Aktivität (z.B. zur Behandlung von Hämophilie und Schlaganfall); entzündungshemmende Aktivität (zur Behandlung z.B. von septischem Schock oder Crohn'scher Erkrankung); als antimikrobielle Mittel; als Modulatoren z.B. des Stoffwechsels oder des Verhaltens; als Analgetika; zur Behandlung spezifischer Defizienz- bzw. Mangelkrankheiten; zur Behandlung z.B. von Psoriasis; in der Human- oder Veterinärmedizin.

Zusätzlich oder alternativ kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung von Krankheiten sein, die in der WO-A-98/09985 aufgelistet sind. Zur Erleichterung der Bezugnahme wird ein Teil dieser Liste nun bereitgestellt: Inhibitorische Aktivität gegenüber Makrophagen und/oder T-Zellen, und somit entzündungshemmende Aktivität; Antiimmunaktivität, d.h. inhibitorische Wirkungen gegenüber einer zellulären und/oder humoralen Immunantwort, einschließlich einer Antwort, die nicht mit Entzündung in Zusammenhang steht; Inhibition der Befähigung von Makrophagen und T-Zellen, sich an Bestandteile der extrazellulären Matrix und an Fibronectin anzuheften, ebenso wie heraufregulierte Fas-Rezeptor-Expression in T-Zellen; Inhibition unerwünschter Immunreaktionen und Entzündungsreaktionen, einschließlich Arthritis, einschließlich rheumatoider Arthritis, mit Überempfindlichkeit verbundene Entzündung, allergische Reaktionen, Asthma, systemischer Lupus erythematodes, Kollagenerkrankungen und andere Autoimmunerkrankungen, mit Arteriosklerose assoziierte Entzündung, Arteriosklerose, arteriosklerotische Herzerkrankung, Reperfusionsverletzung, Herzstillstand, Myocardinfarkt, entzündliche Gefäßerkrankungen, Atemnotsyndrom oder andere cardiopulmonale Erkrankungen, mit peptischem Geschwür assoziierte Entzündung, Colitis ulcerosa und andere Erkrankungen des Magendarmtrakts, Leberfibrose, Leberzirrhose oder andere Lebererkrankungen, Thyroiditis oder andere Drüsenerkrankungen, Glomerulonephritis oder andere renale und urologische Erkrankungen, Otitis oder andere Halsnasenohrenerkrankungen, Dermatitis oder andere dermale Erkrankungen, periodontale Erkrankungen oder andere dentate Erkrankungen, Orchitis oder Epididymoorchitis, Infertilität, Hodentrauma oder andere Hodenerkrankungen mit Immunbezug, Plazentafehlfunktion, Plazentainsuffizienz, habituelle Fehlgeburt, Eklampsie, Prä-Eklampsie und andere Immun- und/oder Entzündungs-bezogene gynäkologische Erkrankungen, posteriore Uveitis, intermediäre Uveitis, anteriore Uveitis, Konjunktivitis, Chorioretinitis, Uveoretinitis, optische Neuritis, intraokulare Entzündung, z.B. Retinitis oder zystoides Maculaödem, sympathische Ophthalmie, Skleritis, Retinitis pigmentosa, Immun- und Entzündungskomponenten der degenerativen Erkrankung des Augenhintergrunds, Entzündungskomponenten bei Augenverletzung, infektionsbedingte Augenentzündung, proliferative Vitreoretinopathien, akute ischämische optische Neuropathie, exzessive Vernarbung, z.B. nach operativer Glaukomfiltration, Immun- und/oder Entzündungsreaktionen gegen Augenimplantate und andere Immun- und Entzündungs-bezogene Augenerkrankungen, mit Autoimmunerkrankungen oder Autoimmunzuständen assoziierte Entzündung, Erkrankungen sowohl des Zentralnervensystems (ZNS) als auch beliebiger anderer Organe, bei denen eine Unterdrückung von Immun- und/oder Entzündungsprozessen sinnvoll wäre, Parkinson-Erkrankung, Komplikationen und/oder Nebenwirkungen bei der Behandlung der Parkinson-Erkrankung, mit AIDS in Zusammenhang stehender Demenz-Komplex, HIV-bedingte Enzephalopathie, Devic-Syndrom, Sydenham-Chorea, Alzheimer-Erkrankung und andere degenerative Erkrankungen, Zustände oder Erkrankungen des ZNS, Entzündungskomponenten bei Schlaganfall, Post-Polio-Syndrom, Immun- und Entzündungskomponenten psychiatrischer Erkrankungen, Myelitis, Enzephalitis, subakute sklerosierende Panenzephalitis, Enzephalomyelitis, akute Neuropathie, subakute Neuropathie, chronische Neuropathie, Guillaim-Barre-Syndrom, Sydenham-Chorea, Myasthenia gravis, Pseudotumor cerebri, Down-Syndrom, Huntington-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Entzündungskomponenten bei ZNS-Quetschung oder ZNS-Verletzung oder bei Infektionen des ZNS, Entzündungskomponenten bei Muskelatrophien und -Dystrophien, und Immun- und Entzündungs-bezogene Erkrankungen, Zustände oder Störungen des zentralen und peripheren Nervensystems, post-traumatische Entzündung, septischer Schock, infektiöse Erkrankungen, Entzündungskomplikationen oder Nebenwirkungen bei Chirurgie, Knochenmarktransplantation oder andere Transplantationskomplikationen und/oder Nebenwirkungen, Entzündungs- und/oder Immunkomplikationen und Nebenwirkungen der Gentherapie, z.B. infolge der Infektion durch einen viralen Träger, oder mit AIDS assoziierte Entzündung, die Unterdrückung oder Inhibition einer humoralen und/oder zellulären Immunantwort zur Behandlung oder Milderung proliferativer Monozyten- oder Leukozyten-Erkrankungen, z.B. von Leukämie, durch die Verminderung der Menge an Monozyten oder Lymphozyten, die Verhinderung und/oder Behandlung der Transplantatabstoßung bei der Transplantation natürlicher oder künstlicher Zellen, Gewebe und Organe, wie etwa Hornhaut, Knochenmark, Organen, Linsen, Schrittmachern, natürlichem oder künstlichem Hautgewebe.

HERSTELLUNG DER SULFAMATVERBINDUNG

Die Sulfamatverbindungen der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem man einen geeigneten Alkohol mit einem geeigneten Chlorid umsetzt. Beispielsweise können die Sulfamatverbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem man einen geeigneten Alkohol mit einem geeigneten Sulfamoylchlorid der Formel R4R5NSO2Cl umsetzt.

Typische Bedingungen für das Durchführen der Reaktion sind wie folgt:

Natriumhydrid und ein Sulfamoylchlorid werden zu einer gerührten Lösung des Alkohols in wasserfreiem Dimethylformamid bei 0°C hinzugegeben. Nachfolgend lässt man den Reaktionsansatz sich auf Raumtemperatur erwärmen, wonach das Rühren für weitere 24 Stunden fortgesetzt wird. Das Reaktionsgemisch wird auf eine kalte gesättigte Lösung von Natriumbicarbonat gegossen, und die resultierende wässrige Phase wird mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte werden über wasserfreiem MgSO4 getrocknet.

Filtration, gefolgt vom Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum und Co-Verdampfen mit Toluol ergab einen Roh-Rückstand, der durch Blitzchromatographie weiter gereinigt wird.

Bevorzugt wird der Alkohol vor der Reaktion mit dem Sulfamoylchlorid, so wie es passend ist, derivatisiert. Da, wo es nötig ist, können funktionelle Gruppen in dem Alkohol in bekannter Weise geschützt und die Schutzgruppe oder -gruppen am Ende der Reaktion entfernt werden.

Bevorzugt werden die Sulfamatverbindungen gemäß der Lehre von Page et al. (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) hergestellt.

Die Phosphonatverbindungen können hergestellt werden, indem man die Lehren von Page of al. (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) und der PCT/GB92/01586 in geeigneter Weise kombiniert.

Die Sulfonatverbindungen können hergestellt werden, indem man die Lehren von Page et al. (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) und der PCT/GB92/01586 in geeigneter Weise anpasst.

Die Thiophosphonatverbindungen können hergestellt werden, indem man die Lehren von Page et al. (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) und der PCT/GB91/00270 in geeigneter Weise anpasst.

Bevorzugte Herstellungen werden auch im folgenden Text vorgestellt.

ZUSAMMENFASSUNG

Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen zur Verwendung als Steroidsulfatase-Inhibitoren und/oder Steroid-Dehydrogenase-Inhibitoren und pharmazeutische Zusammensetzungen für diese bereit.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird nun rein beispielhaft beschrieben.

Beispiel

Es wurde die Inhibition von E1S → E1 für eine Anzahl von Verbindungen untersucht. Das Ausmaß der Inhibition wurde in Übereinstimmung mit den hier definierten Protokollen bestimmt.

Die erhaltenen Daten sind unten in Form der Tabelle 1 dargestellt. Bei jedem Test ließ man auch Coumate 667 als Kontrolle mitlaufen. Das entsprechende Ausmaß der Inhibition für diese Verbindung ist ebenfalls angegeben.

Die Strukturen weiterer Verbindungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung und mit Bezugnahme in der vorliegenden Anmeldung sind unten angegeben.

Es wurden weitere Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert, und biologische Daten wurden in den folgenden Studien erhalten.

WEITERE STUDIEN

Es wurden auch Moleküle entwickelt, die sowohl die Merkmale von STS-Inhibitoren als auch von HSD-Inhibitoren (und in einigen Aspekten Antiöstrogenen) kombinieren. Sich auf die Tatsache stützend, dass eine Alkylamid-Seitenkette die Aktivierung des Östrogen-Rezeptors blockieren kann23, sind 3-O-Sulfamat-Derivate von Östradiol synthetisiert worden, die 17&bgr;-(N-Alkylcarbamoyl)- und 17&bgr;-(N-Alkanoyl)-Seitenketten tragen. Die Alkyl/Alkanoyl-Gruppe ist als Membran-Insertionsregion gestaltet, die die Affinität für das Enzym steigern und die Östrogenität des Steroids verringern soll. Diese neuartigen Moleküle stellen potentielle therapeutische Mittel für die Behandlung von HDBC bereit, da für die Aktivität der Heptylanaloga 1 und 2 (unten) herausgefunden wurde, dass diese im Hinblick auf die Inhibition der Östronsulfatase EMATE ähnlich sind, ohne dabei östrogen zu sein.

  • Strukturen von 3-O-Sulfamat-C17-Derivaten von Östron, die N-Alkylcarbamoyl-Seitenketten tragen.

Obwohl die Forschung auf dem Gebiet der STS mehrere hochwirksame Inhibitoren hervorgebracht hat, ist ein Inhibitor, der bis in die Klinik gelangt, ist die Erstellung eines 17&bgr;-HSD-Inhibitors nach wie vor ein Gebiet, das noch reif ist für Entwicklung. Nach unserem besten Wissen ist 16&agr;-(Brompropyl)-Östradiol der wirkungsstärkste Inhibitor von 17&bgr;-HSD Typ 1, was nahelegt, dass der D-Ring des Steroidskeletts eine wesentliche Rolle bei der Erkennung des Substrats durch das Enzym spielen könnte. Jedoch ist 16&agr;-(Brompropyl)-Östradiol östrogen, und die meisten Versuche, seine Östrogenität zu verringern, sind entweder fehlgeschlagen oder führten zu einer Abnahme seiner Aktivität.

Ein potenter 17&bgr;-HSD Typ 1-Inhibitor, der frei von Agonistenaktivität ist, sondern sogar antiöstrogene Aktivität besitzt, wäre ein neuer Typ von Mittel für die Behandlung von HDBC. da er als dualer Suppressor der Östrogen-Synthese und Östrogen-Wirkung wirken würde. Es wird daher vorgeschlagen, dass Anstrengungen zur Entwicklung eines solchen Mittels auf die Strukturmerkmale von 3 (oder 4) fokussiert werden könnten, zusätzlich zu einigen spezifischen Modifikationen, die darauf abzielen, nicht-östrogene oder antiöstrogene Eigenschaften hervorzurufen.

Um die Affinität des Zielmoleküls für den Östrogenrezeptor zu verringern und die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass durch den Arzneistoff ein Östrogen-Agonismus induziert wird, wurde vorgeschlagen, die 17&bgr;-Hydroxylfunktion durch eine Carbonylgruppe zu ersetzen. Östradiol besitzt tatsächlich einen 10-fach größeren proliferativen Effekt auf Brustkrebszellen als Östron, was die Östrogenität der 17&bgr;-hydroxylierten Verbindungen nahelegt.33 Die Optimierung der nicht-östrogenen Eigenschaften dieser Verbindungen kann auch realisiert werden durch Einführen einer Methoxyfunktion an der Position 2 des A-Rings, da 2-Methoxyöstrogene dafür bekannt sind, dass sie weniger östrogen sind als ihre Eltern-Östrogene. Dies kann den Zielverbindungen auch zusätzliche Eigenschaften verleihen, da sie Tumorwachstum und Angiogenese hemmen können.34

Während die Seitenkette an dem D-Ring erhalten werden musste, da sie für die Aktivität verantwortlich ist, ließ die Strategie der Einführung eine größere Vielfalt zu, was die Notwendigkeit andeutet, den D-Ring selbst zu modifizieren. Einzuführende Seitenketten beinhalten kurze bis lange Alkylgruppierungen oder räumlich ausladende hydrophobe Substituenten, deren Wirkung auf die Aktivität des Enzyms mit dem Vorhandensein/Fehlen einer hydrophoben Tasche in Beziehung gesetzt werden kann. Andere Typen von Seitenketten, wie etwa Bromalkyl- oder Cyclopropyl-Gruppierungen könnten potentiell mit einem nukleophilen Aminosäurerest der aktiven Stelle wechselwirken, und ungesättigte Elemente könnten der Seitenkette Rigidität verleihen, deren Orientierung in der aktiven Stelle ein bestimmender Faktor für die Inhibition des Enzyms sein könnte.

Um diese oben zusammengefassten Erfordernisse zu erreichen, wurde die Verbindung 5 (unten) als guter Kandidat postuliert. Mit einem strukturell modifizierten D-Ring leistet sie einen neuen Ansatz für die 17&bgr;-HSD Typ 1-Inhibition, die auch den Vorteil gegenüber dem obigen Derivat von Östradiol hat, eine sehr leichte Einführung von Seitenketten an dem N-Imidoatom des D-Rings zu erlauben. Sie kann außerdem in einem Schritt aus Benzyl-Marrianolsäure35 erreicht werden, die in unserer Gruppe bei einem anderen Projekt synthetisiert worden ist.

  • 3-Hydroxy-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid, 5 (R = R' = H) und seine Elternverbindungen (R = Seitenkette and R' = H oder SO2NH2)

SYNTHESESTRATEGIEN

Um eine Struktur/Aktivitäts-Beziehung für die Familie von Molekülen zu etablieren, die aus 5 abgeleitet werden, musste ein effizienter Syntheseweg entwickelt werden, der eine leichte und effektive Einführung einer breiten Vielzahl an Seitenketten an dem D-Ring ermöglicht.

Der logischste Ansatz, der Vielseitigkeit bei der Synthese der Ziele erlaubt, besteht darin, das Einführen von Seitenketten an dem D-Ring in Betracht zu ziehen, nachdem dieser in eine Piperidin-Dion-Einheit umgewandelt wurde. Es wurde daher vorgeschlagen, dass, sobald ein Schutz an ihrer C3-Position erfolgt ist, die Verbindung 5 ein Schlüsselzwischenprodukt für die Synthese der Ziele darstellen würde, da die Einführung der Seitenketten leicht in einem Schritt über N-Alkylierung durchgeführt werden kann. Die nachfolgende Entschützung und Sulfamoylierung würde dann die endgültigen phenolischen Verbindungen und Sulfamat-Derivate ergeben. Unter der Annahme, dass das Schlüsselzwischenprodukt (eingerahmt) ausgehend von Östron erreichbar ist, wird im Schema 1 ein grober Syntheseweg vorgeschlagen.

  • P = Schutzgruppe, R = Seitenkette, R' = H oder SO2NH2.
  • (a) Modifizieren des D-Rings, Schützen; (b) Alkylierung; (c) Entschützen, Sulfamoylierung.

Die Verwendung von Umlagerungen, um den D-Ring von Steroiden zu modifizieren, ist in der Literatur oft beschrieben worden. Jindal et al. haben vorgeschlagen, das acetylierte Derivat von 5 über eine Beckmann-Umlagerung des 16-Oximino-Östrons 6 (Schema 2) zu erreichen,37 ein Ansatz, zu dessen Untersuchung wir uns entschieden haben.

  • Reagenzien: (a) KOC(CH3)3, (CH3)2CH(CH2)2ONO; (b) Ac2O/ACOH, Rückfluss.

Die Deprotonierung von Östron erfolgte bei Raumtemperatur unter Einwirkung von Kalium-tert-Butoxid, frisch hergestellt durch Auflösen von Kaliummetall in wasserfreiem 2-Methyl-propan-2-ol. Die Zugabe eines Überschusses an Isoamylnitrit ergab das Ketooxim 6 bei einer Ausbeute von 63%. Die Beckmann-Umlagerung des letzteren erfolgte unter Rückflussbedingung eines Gemischs aus Essigsäure und Essigsäureanhydrid, um 7 zu ergeben, isoliert mit einer Ausbeute von 57%.

Die D-Ring-modifizierte Struktur von 7 wurde unter Verwendung spektroskopischer Verfahren in vollem Umfang ermittelt und bestätigt. Charakteristische Schwingungsbanden für das Imidsystem zeigten sich bei 1725 und 1690 cm–1 im IR-Spektrum der Verbindung, und das austauschbare Proton von NH erschien bei 10,64 ppm als Singulett im 1H-NMR-Spektrum. Die quaternären Kohlenstoffe C17 und C18 zeigten charakteristische feldabwärts gerichtete chemische Verschiebungen bei 171,9 und 178,7 ppm im 13C-NMR-Spektrum.

Obwohl die Beckmann-Umlagerung von 6 den Vorteil hat, das Zwischenprodukt 7 in zwei Schritten aus Östron zu gewinnen, ist die Gesamtausbeute (36%) eher gering, obwohl vergleichbar mit dem, was in der Literatur beschrieben wurde. Es wurde daher entschieden, eine weitere Strategie zu entwickeln, die 7 in viel höheren Ausbeuten liefern würde.

Modifikationen des D-Rings durch dessen nachfolgende Spaltung und Ringschluss wurde als Alternative vorgeschlagen, um Derivate von 5 zu gewinnen. Das Öffnen des D-Rings des geschützten Östrons kann tatsächlich über die Haloform-Reaktion35 erfolgen, wobei der Ringschluss durch thermische Kondensation mit einem Amin erfolgt, um Piperidin-Dion-D-Ring-Derivate von Östron zu gewinnen. Schema 3 fasst diesen Weg zusammen, der ebenso wie die durch N-Alkylierung einzuführenden Seitenketten ins Auge gefasst wird.

  • Reagenzien: (a) NaH/DMF, BnBr, 80°C; (b) I2, KOH, MeOH dann KOH Rückfluss; (c) Harnstoff, 180°C; (d) NaH/DMF, RX; (e) RNH2, 180°C; (f) Pd/C, H2, MeOH/THF; (g) ClSO2NH2/DMA.

Durch Umsetzen von Benzyl-Östron 8, das durch die Benzylierung von Östron leicht hergestellt wurde, mit einem Überschuss an Base (Kaliumhydroxid) und Iod wurde die Methylen-Keton-Funktion bis-halogeniert und dann gespalten. Eine vollständige Umsetzung zur Dicarbonsäure wurde erreicht, indem man eine Rückflussbehandlung in einer konzentrierten Lösung von KOH durchführte. Benzyl-Marrianolsäure 9, die mit einer optimierten Ausbeute von 75% isoliert wurde, wurde dann einer thermischen Cyclisierung in Gegenwart von Harnstoff unterzogen. Diese Kondensationsreaktion, die zur Bildung eines favorisierten 6-gliedrigen Rings führt, erfolgt, wenn die Reagenzien für eine kurze Zeitspanne auf 180°C erhitzt werden. Das resultierende D-Ring-modifizierte Steroid 10 wurde mit hoher Ausbeute erhalten (80-89%), was eine Gesamtausbeute für die Synthese des Zwischenprodukts 10 von 55% ergibt. Somit stellt dieses alternative Verfahren trotz des Vorliegens eines zusätzlichen Schritts eine signifikante Verbesserung gegenüber dem Literaturverfahren dar.

Da Imide zu schwache Basen sind, um Alkylhalogenide anzugreifen, müssen sie zunächst in ihre konjugierten Basen umgewandelt werden, bevor sie eine N-Alkylierung durchmachen. Zu diesem Zweck wurde 10 unter Verwendung von Natriumhydrid in DMF deprotoniert, bevor es, am wahrscheinlichsten über eine SN2-Reaktion, mit verschiedenen Alkylierungsmitteln umgesetzt wurde. Durch Nachvollziehen dieses Verfahrens ist eine große Anzahl von Seitenketten erfolgreich eingeführt worden. Die Verbindungen 11-21 wurden mit Ausbeuten erhalten, die von 75 bis 97% reichen, bei einer durchschnittlichen Reaktionsdauer von 2 Stunden.

N-alkylierte Verbindungen können auch direkt aus Benzyl-Marrianolsäure gewonnen werden, wenn letztgenannte in Gegenwart eines Alkylamins erhitzt wird. Das Derivat 21 (R = Benzyl) wurde auf diese Weise synthetisiert, jedoch war die Reaktionsausbeute mäßig (65%). Es wurde daher vorgeschlagen, dass das direkte Verfahren aus BMA angewendet wird, wenn die Alkylhalogenide ausnahmsweise kommerziell nicht erhältlich sind oder gegenüber der N-Alkylierung von 10 unreaktiv bleiben müssen.

Der Benzylether der Verbindungen 11-21 wurde dann durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Pd/C gespalten, um eine Reihe hydroxylierter Ziele 22-32 mit hohen Ausbeuten zu gewinnen.

Für die Einführung ungesättigter Seitenketten musste eine andere Strategie entwickelt werden, da der letzte Schritt von Schema 3 eine Hydrogenolyse beinhaltet, die wahrscheinlich zu einer konkurrierenden Debenzylierung und Hydrierung der ungesättigten Gruppe führt. Obwohl über einige selektive Verfahren für die Reduktion der Benzyl-geschützten Hydroxylfunktion berichtet wurde,38 ist der Schutz von 5 mit einer tert-Butyl-Dimethylsilylgruppe vor der N-Alkylierung ein einfaches und wirkungsvolles Alternativverfahren.

Der Schutz der Phenolfunktion von 5 wurde in Gegenwart von tert-Butyl-Dimethylsilylchlorid und Imidazol über die Bildung einer reaktiven Zwischenprodukt-Spezies durchgeführt. Die Alkylierung der resultierenden geschützten Verbindung 33 mit Allylbromid ergab in einfacher Weise 34, das mit Tetrabutylammoniumfluorid entschützt wurde. Dieser spezielle Ansatz (Schema 4), entwickelt für die Einführung einer Allylgruppierung, sollte auch anwendbar sein, um andere ungesättigte Gruppen an dem N-Atom einzuführen.

  • Reagenzien: (a) TBDMSCI/Imidazol, DMF; (b) NaH/DMF, CH2CHCH2Br; (c) TBAF/THF.

Die Sulfamoylierung der hydroxylierten Verbindungen wurde gemäß einem neuen Verfahren, das von Okada et al.39 beschrieben worden ist, durchgeführt, wobei die Sulfamoylierung von phenolischen Verbindungen in dem aprotischen Lösungsmittel Dimethylacetamid in Abwesenheit von Base durchgeführt wurde. Im allgemeinen ergibt dieses Verfahren, das nur einen geringen Überschuss an Sulfamoylchlorid erfordert, eine bessere Ausbeute an Sulfamaten als das gewöhnliche Verfahren, bei dem NaH/DMF verwendet wird. Es wird vorgeschlagen, dass DMF eine Nebenreaktion mit Sulfamoylchlorid durchmachen könnte, die mit DMA aufgrund der mangelnden Verfügbarkeit eines Formylprotons nicht auftreten kann. Es wurde außerdem herausgefunden, dass die Eliminierung einer Base bei den Reaktionsbedingungen zu den höchsten Ausbeuten führte, und dass DMA vermutlich als milde Base wirkte.

Wenn man einer Prozedur folgt, die in unserer Gruppe entwickelt wurde, wurden die hydroxylierten Derivate 5, 22-32 und 35 in Gegenwart von 2,2 Äquivalenten an Sulfamoylchlorid in DMA sulfamoyliert. Die Verbindungen 36-48 wurden nach kurzer Reaktionszeit meist in hohen Ausbeuten erhalten. Jedoch musste die Sulfamoylierung von 28 gemäß dem anfänglichen NaH/DMF-Verfahren durchgeführt werden, da eine Nebenreaktion zwischen der Brombutyl-Seitenkette und Sulfamoylchlorid auftrat, wenn DMA das Lösungsmittel war. Unerwarteter Weise wurde das Nebenprodukt als ein Sulfamat von 5 ermittelt, das eine Chlorbutylseitenkette trägt. Die HPLC-Analyse des Rohprodukts zeigte, dass das Nebenprodukt in den gleichen Mengenverhältnissen wie das erwartete Produkt 43 gebildet wurde. Trotz des Vorliegens zweier gut voneinander getrennter Peaks bei 5,5 min und 6,50 min (Elution mit MeOH/H2O 68:32) im HPLC-Lauf, scheiterte der Versuch, die beiden Produkte durch Blitz-Chromatographie oder Umkristallisieren zu trennen. Sie wurden daher unter Verwendung präparativer HPLC isoliert und mittels 1H-NMR und präziser Massenspektroskopie charakterisiert.

Wenn die Reaktion unter Verwendung von NaH/DMF und 6 Äquivalenten an Sulfamoylchlorid durchgeführt wurde, so wurde 43 mit einer Ausbeute von 81 % als einziges Reaktionsprodukt isoliert. Bei dieser Reaktion wird Chlor, das aus dem nukleophilen Angriff des Phenolat-Ions auf Sulfamoylchlorid resultiert, als HCl eingefangen und ist daher nicht in der Lage, mit der Brombutylseitenkette zu reagieren.

Schließlich wurden ein 2-Methoxyderivat von 5 und dessen Sulfamat mittels der gleichen Reaktionsabfolge wie der im Schema 3 beschriebenen synthetisiert, und zwar ausgehend von 2-Methoxyöstron. Das letztere wurde unter Verwendung einer effizienten Zweischrittsynthese, die in unserer Gruppe entwickelt worden war, hergestellt, wobei sich die Einführung einer Methoxygruppe an der Position 2 auf den nukleophilen Austausch eines Halogenatoms durch ein Methoxid-Anion stützt.

Zu diesem Zweck wurde 2-Iod-Östron 49 hergestellt, indem man Östron mit Quecksilber(II)-Acetat und Iod in Essigsäure behandelte.40 Die selektive Halogenierung an Position 2 war innerhalb von 2 Stunden bei Raumtemperatur abgeschlossen, mit einer allgemeinen Ausbeute von 56% nach sukzessivem Umkristallisieren. 2-Iod-Östron wurde dann mit einem großem Überschuss einer frisch hergestellten Lösung von Natriummethoxid in Gegenwart von Kupferchlorid in Pyridin am Rückfluss umgesetzt41, was 2-Methoxyöstron 50 mit einer Ausbeute von 75% ergab. Dieses Verfahren besitzt den Vorteil, keinerlei Schutzgruppen einzubeziehen und für die Synthese von 2-Methoxyöstron aus Östron in zwei Schritten eine gute allgemeine Ausbeute (42%) zu erbringen.

Nach der Benzylierung wurde die resultierende Verbindung 51 der Haloform-Reaktion unterzogen. Eine begrenzte Löslichkeit von 51 in Methanol führte zu einer geringen, nicht optimierten Ausbeute von 18% für die Synthese von 52. Der Ringschluss in Gegenwart von Harnstoff ergab 53 mit einer Ausbeute von 59%, und die nachfolgende Entschützung ergab Endprodukt 54. Die Sulfamoylierung von 54 musste unter Verwendung von NaH/DMF mit einem großen Überschuss an Sulfamoylchlorid durchgeführt werden, da ein Fehlen von Reaktivität beobachtet wurde, wenn die Reaktion in DMA durchgeführt wurde. Dies kann auf der sterischen Behinderung an Position 3 beruhen, die aus der Gegenwart der Methoxygruppe an Position 2 resultiert.

  • Reagenzien: (a) Hg(OAc)2, I2, AcOH/THF; (b) CuCl2/Pyridin, NaOMe, Rückfluss; (c) KOC(CH3)3/DMF, BnBr; (d) I2, KOH, MeOH dann KOH Rückfluss; (e) Harnstoff, 180°C; (f) Pd/C, H2, MeOH/THF; (g) ClSO2NH2/DMA.

Ergebnisse und Diskussion

Die Daten der in vitro-Inhibition der Sulfataseaktivität für die Verbindungen 36, 37, 39, 41, 45 und 47 sind unten dargestellt. Für die verbleibenden Verbindungen wird ermittelt, dass sie STS-Inhibitoren sind. Für jede der hier beschriebenen Verbindungen wird außerdem herausgefunden, dass sie HSD inhibiert.

Die Fähigkeit der Verbindungen 36, 37, 39, 41, 45 und 47, Östronsulfatase-Aktivität zu inhibieren, wurde an humanen plazentalen Mikrosomen untersucht. Die Inkubation von [3H]-Östron mit plazentalen Mikrosomen mit oder ohne den Inhibitor bei verschiedenen Konzentrationen, gefolgt von der Isolierung des Produkts durch Extraktion in Toluol ergab die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse. Zum Zwecke des Vergleichs wurde die Aktivität von EMATE bei den verschiedenen Assays ebenfalls einbezogen. Die IC50-Werte, die verwendet werden, um die inhibitorische Potenz dieser D-Ring-modifizierten Steroide zu vergleichen, wurden ebenfalls berechnet.

Von den verschiedenen getesteten Verbindungen waren die Steroide, die eine Propyl-, eine Benzyl- und eine 2-Methylpyridyl-Gruppierung an dem Stickstoffatom des Piperidindion-D-Rings tragen, die am stärksten wirksamen, mit einer IC50 zwischen 1 nM und 3 nM. Sie sind somit wirkungsstärker als EMATE, insbesondere die Verbindung 45, die 18-mal wirksamer ist. Die Verbindung 36, die keine Substitution am N-Atom aufweist, und 37, das N-Methyl-Derivat, waren nicht so wirkungsvoll wie 39. Ihre IC50-Werte von 20 nM bzw. 12 nM legen jedoch nahe, dass ihre Wirkungsstärken ähnlich der von EMATE sind. Unerwartet zeigt die Verbindung 41, deren Seitenkette eine n-Pentylgruppierung ist, eine dramatische Abnahme der Wirkungsstärke mit einem IC50-Wert von 150 nM. Dieser Abfall der Wirkungsstärke, der recht steil ist, deutet darauf hin, dass das Enzym alle langen hydrophoben N-Substituenten nicht aufnehmen kann und sehr empfindlich für Änderungen von deren Größe ist.

Aus den unterschiedlichen Daten, die für die linearen Alkylseitenketten erhalten wurden, ist ein limitierter Struktur/Aktivitäts-Beziehungs-Graph erstellt worden (2 – Struktur-Aktivitäts-Beziehung für verschiedene Seitenkettenlängen versus der Inhibition der Umsetzung von Östronsulfat zu Östron, katalysiert durch Steroidsulfatase) wobei der IC50-Wert jeder Verbindung als Funktion der Anzahl der Kohlenstoffatome in der Seitenkette aufgetragen wird. Dies unterstreicht klar den Aktivitätsunterschied zwischen der Verbindung 41 und der Gruppe der Verbindungen 36, 37 und 39.

Der für 41 beobachtete Aktivitätsverlust ist recht unerwartet, da die meisten der wirkungsvollen steroidalen Inhibitoren der STS, ebenso wie 41, Derivate von EMATE sind und räumlich ausladende hydrophobe Seitenketten enthalten. Das jüngste Beispiel sind die 3-O-Sulfamatderivate von Östradiol, die eine 17&bgr;-Alkylamid-Seitenkette tragen (1 und 2), und für deren Aktivität ermittelt wurde, dass diese optimal war, wenn die Alkylgruppe eine Heptylgruppierung war. Ihre Wirkungsstärke, ähnlich der von EMATE, unterstreicht klar das Vorliegen einer hydrophoben Tasche an der aktiven Stelle des Enzyms, die der Ausrichtung des 17&bgr;-Substituenten entspricht.

Die schwächere Inhibition der STS durch 41 legt daher nahe, dass die Orientierung seiner Seitenkette, befindlich am N-Atom des D-Rings (6-gliedrig), hinreichend verschieden von der Orientierung der 17&bgr;-Seitenkette von 1 oder 2 (5-gliedriger D-Ring) ist, um eine Abnahme der Affinität zu der aktiven Stelle des Enzyms zu induzieren. Es kann vorgeschlagen werden, dass, obwohl es eine hydrophobe Tasche an der aktiven Stelle des Enzyms für 17&bgr;-Substituenten gibt, die Topologie der aktiven Stelle im Bereich der N-Position eines 6-gliedrigen Rings gegenüber räumlich ausladenden Substituenten restriktiver sein könnte. Um diese Hypothese zu bestätigen, wäre molekulare Modellbildung (Molecular Modelling) ein Werkzeug der Wahl.

Um die Orientierung der Atome in dem D-Ring und in der Seitenkette aufzuklären, sowie außerdem zum Sammeln von Daten für mögliche zukünftige Studien des Molecular Modellings, wurde die Kristallstruktur des hochwirksamen Östronderivats 39 bestimmt. Ein Kristall (ungefähre Dimensionen 0,20 × 0,17 × 0,08 mm), erhalten aus langsamer Umkristallisierung in Aceton/Hexan, wurde für das Sammeln der Daten verwendet.

Die ORTEP-Auftragung der asymmetrischen Einheit von 41 ist unten zusammen mit dem verwendeten Markierungsschema dargestellt. Die Sulfamatgruppe, alle vier Ringe und die Schlüsselmerkmale des modifizierten D-Rings sind klar erkennbar. Wie erwartet, befindet sich der D-Ring in einer Halbsessel-Konformation, da die Imidfunktion die Position der Atome C13, C17, N und C1', ebenso wie von C15, C16, N und C1' in derselben Ebene mit sich bringt.

ORTEP-Auftragung der Röntgenkristallstruktur von 41. Ellipsoide sind mit dem Wahrscheinlichkeitsniveau von xx% dargestellt.

Im Vergleich zu der ORTEP-Auftragung der Röntgenkristallstruktur von EMATE42 wird klar ersichtlich, dass die C17&bgr;-Orientierung von EMATE und die N-Alkyl-Orientierung des 6-gliedrigen Rings von 41 verschieden sind und daher mit verschiedenen Bereichen der aktiven Stelle von STS interagieren.

Eine gute Inhibition der STS durch 45, und, in einem geringeren Maße, durch 47, scheint das Vorliegen einer hydrophoben Bindungsregion in der aktiven Stelle anzuzeigen, obwohl diese eine Pentylgruppierung nicht aufzunehmen scheint. Es ist jedoch auch bekannt, dass Benzylgruppen (und mit Benzyl verwandte Gruppen) hydrophober und mit einer Gesamtheit von 7 Kohlenstoffen sterisch weniger restriktiv sind als es eine lineare Heptylseitenkette wäre. Dies könnte den Unterschied der Wirkungsstärke zwischen den Verbindungen 45 oder 47 und 41, sämtlich mit hydrophoben Substituenten, erklären. Die für 45 gefundene höhere Aktivität könnte auch das Vorkommen von Wasserstoffbindungs-Donoren unter den Aminosäureresten der aktiven Stelle nahe legen.

Es werden jedoch zusätzliche biologische Ergebnisse benötigt, um die bislang erhaltenen Daten vollständig zu interpretieren. Die Aktivitäten der Verbindungen 38, 40 und 42 (Ethyl-, Butyl- bzw. Hexyl-Derivate) würden nützliche Daten darstellen, die die Interpretation der bislang erhaltenen IC50-Werte in Begriffen der Topologie der aktiven Stelle ermöglichen könnten.

Zur Zeit werden die Kristallstrukturparameter von 41 nützlich bei der Untersuchung der Interaktionen dieses Typs von Molekül mit Proteinen mittels computergestützter molekularer Modellbildung sein und das Design von neuen potenten Molekülen unterstützen.

Zusammenfassung

Brustkrebs ist eine Erkrankung von großer Bedeutung in Europa und Nordamerika. In Großbritannien tötet er mehr Menschen als jeder andere Typ von Krebs. Hormonabhängiger Brustkrebs stellt etwa zwei Drittel dieser Fälle bei Frauen nach der Menopause dar; er entspricht einem Typ von Brustkrebs, bei dem die Tumoren sich für ihr Wachstum und ihre Entwicklung auf Östrogene stützen.

Die endokrine Therapie, bei der im Kreislauf befindliche Östrogenspiegel über die Verwendung von Arzneimitteln kontrolliert werden, die einen oder mehrere enzymatische Wege der Östrogenbiosynthese hemmen, ist die Antwort auf HDBC. Es können verschiedene Ziele ins Auge gefasst werden, und das meiste der Arbeit erfolgte im Bereich der Antiöstrogene und Aromatasehemmer. Die Enzyme Steroidsulfatase und 17&bgr;-HSD Typ 1 sind später als potente Ziele ersichtlich geworden.

Obwohl mehrere wirkungsstarke Inhibitoren für STS entwickelt wurden, hat 17&bgr;-HSD Typ 1 nicht so viel Interesse geweckt, und es ist nur über einige wenige Wirkstoffe berichtet worden. Sich auf die Tatsache stützend, dass D-Ring-Derivate von EMATE wirkungsvolle Inhibitoren von 17&bgr;-HSD Typ 1 sind, haben wir das Design und die Synthese von Analoga von EMATE mit verringerter Östrogenität initiiert. Dies hat zu einer Reihe von Verbindungen geführt, bei denen der D-Ring eine Piperidindion-Gruppierung ist und bei denen das N-Atom eine Vielzahl von Seitenketten trägt.

Biologisches Testen gegen STS, das an Brustkrebszellen durchgeführt wurde, zeigte eine sehr hohe Aktivität für Derivate, die eine Propyl- oder eine Picolyl-Seitenkette tragen. Mit einer IC50 von 1 nM sind sie viel wirkungsvoller als EMATE.

Experimentalteil 1 – Allgemeine Verfahren

Alle Chemikalien wurden entweder bei Aldrich Chemical Co. (Gillingham, Dorset, UK) oder bei Lancaster Synthesis (Morecambe, Lancashire, U.K.) erworben. Alle organischen Lösungsmittel von A.R.-Qualität wurden von Fisons Plc (Loughborough, U.K.) geliefert. Wasserfreies N,N-Dimethylformamid (DMF) bzw. N,N-Dimethylacetamid (DMA), verwendet für alle N-Alkylierungs- und Sulfamoylierungs-Reaktionen, wurden bei Aldrich erworben und wurden nach der Verwendung unter einem positiven N2-Druck gelagert. Sulfamoylchlorid wurde durch eine Anpassung des Verfahrens von Apel und Berger48 hergestellt und wurde als Lösung in Toluol, wie von Woo et al.16 beschrieben, gelagert. Ein geeignetes Volumen dieser Lösung wurde unmittelbar vor der Verwendung im Vakuum frisch konzentriert.

E1S und E1 wurden bei Sigma Chemical Co. (Poole, U.K.) erworben. [6,7-3H]E1S (spezifische Aktivität 50 Ci/mmol) und [4-14C]E1 (spezifische Aktivität, 52 mCi/mmol) wurden bei New England Nuclear (Boston, MA) erworben. [6,7-3H]E1 (spezifische Aktivität 97 Ci/mmol) wurde von Amersham International Radiochemical Centre (Amersham, U.K.) erhalten.

Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde auf vorbeschichteten Platten (Merck TLC „Aluminium sheets silica gel 60 F254", Artikelnr. 5554) durchgeführt. Die Detektion des Produkts bzw. der Produkte und des Ausgangsmaterials (SM) erfolgte entweder durch Ansicht unter UV-Licht oder durch Behandlung mit einer methanolischen Lösung von Phosphomolybdänsäure, gefolgt von Erhitzen. Die Blitzsäulenchromatographie erfolgte auf Kieselgel (Sorbsil C60). Die IR-Spektren wurden durch KBr-Scheiben unter Verwendung eines Perkin-Elmer Spectrum RXI FT-IR bestimmt, und die Peak-Positionen wurden in cm–1 ausgedrückt. Die Aufnahme der 1H-NMR-Spektren und der DEPT-editierten 13C-NMR-Spektren erfolgte mit JMN-GX 400 NMR-Spektrometern, und die chemischen Verschiebungen wurden in Teilen pro Million (ppm, 6) relativ zu Tetramethylsilan (TMS) als einem internen Standard ausgedrückt. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet, um die Resonanzen in den Spektren der 1H-NMR und der 13C-NMR zu beschreiben: br, breit; s, Singulett; d, Dublett; t, Triplett; q, Quartett; m, Multiplett und Kombinationen, wie etwa dd, Dublett von Dubletts. Die chemischen Verschiebungen für die AB-Systeme (&dgr;A und &dgr;B) wurden näherungsweise bestimmt, indem man die Mitte jedes Dubletts und die korrespondierende Kopplungskonstante, markiert als JAB oder JBA, verwendete. Als Beispiel wurden &dgr;A und &dgr;B gemäß der Formeln berechnet, die im Anhang 2 für die Verbindung 21 dargestellt sind. Die HPLC-Analyse erfolgte auf einem Waters Millenium32 Instrument, ausgestattet mit einem Waters 996 PDA Detektor. Die Aufzeichnung der Spuren erfolgte auf einer Waters Radialpack C18, 8 × 100 mm Säule bei Elution mit einem Methanol/Wasser-Gradienten bei 2 ml/min. Die Massenspektren wurden am Massenspektrometrie Service-Center der University of Bath aufgezeichnet. FAB-MS erfolgte unter Verwendung von m-Nitrobenzyl-Alkohol (NBA) als Matrix, und die Elementaranalysen wurden vom Mikroanalyse-Service der University of Bath durchgeführt. Die Bestimmung der Schmelzpunkte erfolgte unter Verwendung eines Reichert-Jung Thermo Galen Kofler-Blocks, wobei diese unkorrigiert sind.

Die röntgenkristallographische Studie von 39 wurde durchgeführt von Dr. M. Mahon vom Chemie-Department der University of Bath.

1 – 1 – Biologische Tests

Alle Assays wurden durchgeführt am Department für Endokrinologie und Stoffwechselmedizin, Imperial College School of Medicine, St. Mary's Hospital, London, und in Zusammenarbeit mit Dr. A. Purohit und Pr. M. Reed.

Die Fähigkeit der synthetisierten Verbindungen, die Steroidsulfatase-Aktivität zu hemmen, wurde unter Verwendung von plazentalen Mikrosomen-Präparationen untersucht. Plazentale Mikrosomen (100 000 g-Fraktion) wurden aus einer positiv-positiven humanen Plazenta einer normal beendeten Schwangerschaft hergestellt.49 Um de IC50-Werte für die Inhibition von Östronsulfatase zu bestimmen, wurde die Aktivität in Gegenwart eines Inhibitors (0,05-1,0 &mgr;M) unter Verwendung von [3H]E1S (4 × 105 dpm), eingestellt auf 20 &mgr;M mit unmarkiertem Substrat, gemessen.14 Nach der Inkubation von Substrat ± Inhibitor mit plazentalen Mikrosomen (125 &mgr;g an Protein/ml) für 30 Minuten, wurde das gebildete Produkt durch Extraktion mit Toluol (4 ml) aus dem Gemisch isoliert, wobei [4-14C]E1 dafür verwendet wurde, um verfahrensbedingte Verluste zu überwachen.

1 – 2 – Herstellung von Sulfamoylchlorid

Ameisensäure (6 ml, 150 mM) wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von Chlorsulfonylisocyanat (25 g, 150 mmol) in 150 ml frisch destilliertem Toluol bei 0°C unter N2-Atmosphäre gegeben. Die resultierende weiße Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter N2 gerührt, und die unlöslichen Bestandteile wurden unter N2 mittels Verwendung einer Kanüle aus der Lösung herausgefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, um ein hellbraunes Rohprodukt von Sulfamoylchlorid zu ergeben. Eine Standardlösung (ca. 0,70 M) von Sulfamoylchlorid wurde dann hergestellt, indem man das kristalline Rohprodukt in frisch destilliertem Toluol löste und es im Kühlschrank unter N2 lagerte. Vor der Reaktion wurde die Ameisensäure über Nacht mit Borsäureanhydrid gerührt und frisch unter N2 destilliert.

1 – 3 – Allgemeines Verfahren für die Alkylierung

Natriumhydrid (60% Dispersion in Mineralöl, 1,2 Äquivalente) wurde zu einer gerührten Lösung von 10 in wasserfreiem DMF (15 ml) bei 0°C unter N2-Atmosphäre hinzugegeben. Nachdem die Bildung von Wasserstoff aufgehört hatte, wurde das Eltern-Alkylierungsmittel (2 Äquivalente) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt und in Wasser (50 ml) gegossen. Die resultierende Lösung wurde in Ethylacetat (50 ml) extrahiert. Nach weiterem ausgedehntem Waschen mit Salzlake (4 × 25 ml) wurde die organische Schicht getrocknet (MgSO4), gefiltert und im Vakuum eingedampft. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie ergab die Elternverbindungen 11-21.

1 – 4 – Allgemeines Verfahren für die Hydrogenolyse

Pd-C (10%) wurde zu einer Lösung von 10-21 in MeOH/THF gegeben, und die resultierende Suspension wurde unter Verwendung eines mit Wasserstoff gefüllten Ballons bei Raumtemperatur hydriert. Nach dem Entfernen des trägergebundenen Katalysators durch Filtration und dem Eindampfen des Filtrats im Vakuum wurde das erhaltene Produkt teilweise (analytische Probe) oder vollständig gereinigt, um die Elternverbindungen 5 und 22-32 zu ergeben.

1 – 5 – Allgemeines Verfahren der Sulfamoylierung

Zu einer gerührten Lösung von Sulfamoylchlorid (2,2 Äquivalente) in DMA bei 0°C unter N2-Atmosphäre wurden 5, 22-32 und 35 hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter N2 gerührt, wobei man es in dieser Zeit sich auf Raumtemperatur erwärmen ließ. Es wurde dann in kalte Salzlake (15 ml) gegossen, und die resultierende Lösung wurde mit Ethylacetat (2 × 20 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereint, mit Salzlake (6 × 20 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das derart erhaltene Rohprodukt wurde durch Blitzchromatographie fraktioniert und/oder umkristallisiert.

2-Synthesen 2-1-Synthese der D-Ring modifizierten steroidalen Gruppierung 16-Oximino-Östron 6

Zu einer gerührten Lösung von Kalium-tert-Butoxid unter N2-Atmosphäre, frisch hergestellt durch Lösen von Kaliummetall (80 mg, 2,05 mmol) in 2 ml tert-Butanol, wurde Östron (200 mg, 740 mmol) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter N2 gerührt, und Isoamylnitrit (180 &mgr;mol, 1,34 mmol) wurde tropfenweise hinzugegeben. Das erhaltene tiefrote Gemisch wurde über Nacht gerührt und dann in Wasser (20 ml) gegossen. Die resultierende Lösung wurde mit Ether (2 × 20 ml) extrahiert, und die wässrige Schicht wurde mit Eisessigsäure (10 ml) angesäuert, um ein hellgelbes Präzipitat zu ergeben. Dieses ließ man sich für zwei Stunden abscheiden, wonach der Feststoff filtriert wurde (140 mg, 63%): SP 223-225°C (Lit, 220-227°C);43 TLC (Chloroform/Aceton, 9:1) Rf 0,27 cf, Rf 0,69 (E1); IR (KBr) 3385 (NOH), 2920-2860 (aliph CH), 1735 (C=O), 1605-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 0,89 (3H, s, C-18-H3), 1,30-2,85 (11H, m), 2,70-2,81 (2H, m, C-6-H2), 6,46 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,52 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H), 7,05 (1 H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,2 Hz, C-1-H), 9,05 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH) und 12,39 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, NOH); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz) 14,09 (q, C-18), 25,09 (t), 25,46 (t), 26,18 (t), 29,02 (t), 30,92 (t), 37,20 (d), 43,20 (d), 44,59 (d), 48,50 (s, C-13), 112,70 (d), 114,83 (d), 125,82 (d), 129,59 (s), 136,88 (s), 154,84 (s, C-3 oder C-16), 155,23 (s, C-3 oder C-16) und 204,64 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 453,2 [30, (M+H+NBA)+], 300,1 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 451,3 [38, (M-H+NBA)], 298,2 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 300,15963, C18H22NO3 erfordert 300,15997. CHN.

3-Acetoxy-16-Oximino-Östron

Eine Suspension von 6 (150 mg, 501 mmol) in einem Gemisch von 4,5 ml Eisessig und 7,5 ml Essigsäureanhydrid wurde für 20 Stunden unter N2-Atmosphäre am Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittelgemisch wurde dann unter reduziertem Druck entfernt, und es wurde Wasser hinzugegeben. Nach dem Basischmachen mit wässriger NaOH wurde die resultierende Lösung mit Ethylacetat (2 × 20 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Wasser (2 × 15 ml) und dann mit Salzlake (2 × 15 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 7 als hellgelben Feststoff (97 mg, 57%): SP 189-193°C (Lit, 196-198°C);43 CHN TLC (Chloroform/Aceton, 9:1) Rf 0,68 cf, Rf 0,31 (6); IR (KBr) 3205 (NH), 2940-2860 (aliph CH), 1760 (OCOCH3), 1725 (C=O), 1690 (C=O), 1610-1495 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,11 (3H, s, C-18-H3), 1,20-2,72 (11H, m), 2,77-2,84 (2H, m, C-6-H2), 2,23 (3H, s, OAc), 6,81 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,87 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,5 Hz, C-2-H), 7,32 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,2 Hz, C-1-H) und 10,64 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, NH); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz)c 15,96 (q, C-18), 20,68 (q, COCH3), 24,76 (t), 24,86 (t), 28,79 (t), 32,18 (t), 32,55 (t), 37,29 (d), 40,30 (d), 41,89 (d), 118,62 (d), 120,94 (d), 125,91 (d), 136,46 (s), 137,12 (s), 147,91 (s, C-3), 168,85 (s, COCH3), 171,93 (s, C=O) und 178,71 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)+], 342,1 [100, (M+H)+], 299,1 [40, (M+H-Ac)+]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)], 493,2 [34, (M-H+NBA)], 340,1 (100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C20H24NO4 erfordert 342,17053. Das cC-13 Signal ist unter den Lösungsmittelpeaks verborgen.

Östron-3-Benzylether (8)

Natriumhydrid (60% Dispersion in Mineralöl, 0,68 g, 20,34 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung von E1 (5,0 g, 18,49 mmol) in wasserfreiem DMF (50 ml) bei 0°C unter N2-Atmosphäre gegeben. Nachdem das resultierende Gemisch für weitere 15 Minuten gerührt worden war, wurde Benzylbromid (2,42 ml, 20,34 mmol) hinzugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde für 4 Stunden auf 80°C erhitzt. Der Überschuss an verbleibendem Natriumhydrid wurde gequencht, indem das Reaktionsgemisch in Eis/Wasser gegossen wurde. Die sich abtrennende organische Fraktion wurde in Ethylacetat (150 ml) extrahiert und des weiteren ausgiebig mit Wasser (4 × 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene blassgelbe Rückstand wurde aus Isopropylalkohol umkristallisiert, um 8 als weiße flockige Kristalle zu erhalten. (4,73 g, 71%): SP 129-131°C (Lit, 130-131°C)ref; TLC (Chloroform/Ethylacetat, 4:1) Rf 0,83 cf, Rf 0,61 (E1); IR (KBr) 3100 (arom CH), 2950-2840 (aliph CH), 1730 (C=O), 1600, 1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,91 (3H, s, C-18-H3), 1,41-2,54 (13H,m), 2,86-2,93 (2H, m, C-6-H2), 5,04 (2H, s, OCH2Ar), 6,73 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,20 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,30-7,44 (5H, m, C6H5).

3-Benzyl-Marrianolsäure (9)

Eine Iodlösung (7,6 g, 29,94 mmol) in 95 ml MeOH und eine Lösung von KOH (13,7 g) in 27 ml Wasser und 61 ml MeOH wurden tropfenweise und alternativ zu einer gerührten Lösung von Östron-3-Benzylether (8) (3,8 g, 10,54 mmol) in MeOH (1 Liter) hinzugegeben, sodass die Farbe des Gemischs orange/braun blieb. Die Zugabe erfolgte über 45 Minuten, und die resultierende hellgelbe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter N2-Atmosphäre gerührt, um eine klare hellgelbe Lösung zu ergeben. Das Gemisch wurde dann im Vakuum konzentriert und in Wasser (800 ml) gegossen. Nach dem Ansäuern mit 5 M HCl wurde die organische Fraktion in Ether (600 ml) extrahiert, und die Etherschicht wurde mit wässrigem Natriumthiosulfat (4 × 100 ml) und dann mit Wasser (4 × 100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und im Vakuum eingedampft. Der resultierende gelbe Schaum (4,54 g) wurde dann in einer Lösung von KOH (7,6 g) in MeOH/H2O (1:2, 228 ml) gelöst und am Rückfluss für 4 Stunden erhitzt. Das dabei erhaltene orange Gemisch wurde in Wasser (800 ml) gegossen, und nach dem Ansäuern mit 5M HCl wurden die organischen Fraktionen in Ethylacetat (300 ml) extrahiert. Nach weiterem ausgedehnten Waschen mit Salzlake (4 × 200 ml) wurde die organische Schicht getrocknet (MgSO4), gefiltert und im Vakuum eingedampft, um einen gelben Rückstand zu ergeben (4,32 g). Dieser wurde aus CHCl3/Hexan 5:3 umkristallisiert, um 9 als cremiges Pulver zu ergeben (2,291 g, 53%). Ein weiterer Ertrag des Produkts (958 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus CHCl3/Hexan 5:3 erhalten (Gesamtausbeute: 75%): SP 212-215°C (Lit, 226-227°C);42 TLC (Chloroform/Methanol, 5:1) Rf 0,37 cf, Rf 0,88 (8); IR (KBr) 3050-2650 (CO2H), 1700 (C=O), 1600-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,02 (3H, s, C-18-H3), 1,20-2,78 (11H, m), 2,72-2,76 (2H, m, C-6-H2), 5,05 (2H, s, OCH2Ar), 6,68 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,75 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H), 7,18 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,9 Hz, C-1-H), 7,30-7,42 (5H, m, C6H5) und 12,14 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, CO2H); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz) 15,37 (q, C-18), 25,84 (t), 26,53 (t), 29,73 (t), 35,77 (t), 36,10 (t), 40,73 (d), 41,84 (d), 42,55 (d), 46,21 (s, C-13), 68,93 (t, OCH2Ar), 112,35 (d), 114,02 (d), 126,32 (d), 127,29 (2 × d), 127,49 (d), 128,19 (2 × d), 131,64 (s), 137,18 (2 × s), 155,96 (s, C-3), 173,93 (s, CO2H) und 178,60 (s, CO2H); MS m/z (FAB+) 408,2 [41, M+], 91,1 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 408,19404, C25H28O5 erfordert 408,19367.

3-Benzyloxy-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (10)

3-Benzyl-Marrianolsäure (9) (3,25 g, 7,96 mmol) und Harnstoff (3,25 g, 54,11 mmol) wurden bei 180°C unter N2-Atmosphäre für 45 Minuten erhitzt. Der resultierende braune Rückstand wurde dann zerstoßen, und es wurde Aceton (200 ml) hinzugegeben, um eine braune Suspension zu erhalten. Dieses Gemisch wurde auf etwa 100 ml konzentriert, es wurde Kieselgel hinzugegeben, und das Lösungsmittel wurde entfernt, um ein homogenes beiges Pulver zu ergeben, das auf eine feucht gepackte (Chloroform) Blitzchromatographiesäule übertragen wurde. Die Elution mit Chloroform/Aceton (96:4) ergab 10 als einen weißen Rückstand (2,75 g, 89%): SP 225-226°C; TLC (Chloroform/Aceton, 9:1) Rf 0,62 cf, Rf 0,14 (9); IR (KBr) 3260 (NH), 2900-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1700 (C=O), 1600-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,09 (3H, s, C-18-H3), 1,20-2,72 (11H, m), 2,76-2,80 (2H, m, C-6-H2), 5,05 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,76 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,5 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,19 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 9,0 Hz, C-1-H), 7,31-7,44 (5H, m, C6H5) und 10,63 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, NH); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz) 16,16 (q, C-18), 25,06 (t), 25,25 (t), 29,25 (t), 32,37 (t), 32,72 (t), 37,82 (d), 40,32 (d), 40,49 (s), 41,91 (d), 68,89 (t, OCH2Ar), 112,25 (d), 114,08 (d), 126,00 (d), 127,27 (2 × d), 127,45 (d), 128,16 (2 × d), 131,51 (s), 137,01 (s), 137,12 (s), 155,97 (s, C-3), 172,09 (s, C=O) und 178,89 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 543,3 [8, (M+H+NBA)+], 390,2 [58, (M+H)+], 91,1 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 390,20586, C25H28NO3 erfordert 390,20692. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um farblose Nadeln zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 85:15; &lgr;max = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Gefunden: C, 76,90; H, 6,99; N, 3,73. C25H27NO3 erfordert: C, 77,09; H, 6,99; N, 3,60.

2 – 2 – Einführung verschiedener Seitenketten am D-Ring über N-Alkylierungen 3-Benzyloxy-N-methyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (11)

Unter Nachvollziehen der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3), wurde 10 (500 mg, 1,28 mmol) mit NaH (62 mg, 1,54 mmol) behandelt und die nachfolgende Reaktion mit Methyliodid (160 &mgr;l, 2,57 mmol) war innerhalb von 45 Minuten abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 11 als weißen Rückstand (432 mg, 83%): SP 118-121°C; IR (KBr) 3160-3060 (arom CH), 2920-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1600-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,17 (3H, s, C-18-H3), 1,26-3,00 (11H, m), 2,86-2,91 (2H, m, C-6-H2), 3,15 (3H, s, N-CH3), 5,04 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,32-7,45 (5H, m, C6H5); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 16,64 (q, C-18), 25,58 (t), 25,83 (t), 26,98 (q, C-1'), 29,73 (t), 33,50 (t), 33,83 (t), 38,55 (d), 40,42 (d), 41,53 (s, C-13), 42,57 (d), 69,95 (t, OCH2Ar), 112,56 (d), 114,51 (d), 126,14 (d), 126,29 (2 × d), 127,75 (d), 128,42 (2 × d), 131,49 (s), 137,01 (s), 137,16 (s), 156,82 (s, C-3), 171,81 (s, C=O) und 178,68 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 404,4 [79, (M+H)+], 91,1 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 404,22174, C26H30NO3 erfordert 404,22257. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um farblose Kristalle zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 278,1 nm) Rt = 3,93 min, 100%. Gefunden: C, 77,30; H, 7,22; N, 3,48. C26H29NO3 erfordert: C, 77,39; H, 7,24; N, 3,47.

3-Benzyloxy-N-ethyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (12)

Unter Befolgung der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3) wurde 10 (500 mg, 1,28 mmol) mit NaH (62 mg, 1,54 mmol) behandelt, und die nachfolgende Reaktion mit Ethyliodid (205 &mgr;l, 2,57 mmol) war innerhalb von 1 Stunde abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 12 als einen weißen Rückstand (502 mg, 94%): SP 93-95°C; IR (KBr) 2975-2865 (aliph CH), 1715 (C=O), 1665 (C=O), 1605-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,11 (3H, t, J = 7,2 Hz, C-2'-H3), 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,31-2,98 (11H, m), 2,85-2,90 (2H, m, C-6-H2), 3,81 (2H, m, N-CH2), 5,04 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,22 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,30-7,44 (5H, m, C6H5); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 13,15 (q, C-2'), 16,43 (q, C-18), 25,49 (t), 25,69 (t), 29,61 (t), 33,52 (t), 33,63 (t), 35,03 (t, C-1'), 38,54 (d), 40,22 (d), 41,28 (s, C-13), 42,42 (d), 69,84 (t, OCH2Ar), 112,44 (d), 114,41 (d), 126,00 (d), 127,15 (2 × d), 127,61 (d), 128,28 (2 × d), 131,41 (s), 136,91 (s), 137,05 (s), 156,70 (s, C-3), 171,15 (s, C=O) und 178,03 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 418,3 [90, (M+H)+], 91,0 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 417,23061, C27H31NO3 erfordert 417,23039. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 85:15; &lgr;max = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Gefunden: C,; H,; N,. C27H31NO3 erfordert: C, 77,67; H, 7,48; N, 3,35.

3-Benzyloxy-N-propyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (13)

Unter Befolgung der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3) wurde 10 (500 mg, 1,28 mmol) mit NaH (62 mg, 1,54 mmol) behandelt, und die nachfolgende Reaktion mit Propyliodid (250 &mgr;l, 2,57 mmol) war innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 13 als einen weißen Rückstand (524 mg, 94%): SP 95-98°C; IR (KBr) 3035 (arom CH), 2960-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,89 (3H, t, J = 7,6 Hz, C-3'-H3), 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,32-2,98 (13H, m), 2,83-2,88 (2H, m, C-6-H2), 3,64-3,80 (2H, m, N-CH2), 5,03 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1 H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,30-7,44 (5H, m, C6H5); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 11,44 (q, C-3'), 16,65 (q, C-18), 21,30 (t), 25,63 (t), 25,83 (t), 29,76 (t), 33,68 (t), 33,81 (t), 38,68 (d), 40,37 (d), 41,50 (s, C-13), 41,56 (t, C-1'), 42,54 (d), 69,97 (t, OCH2Ar), 112,56 (d), 114,52 (d), 126,15 (d), 127,29 (2 × d), 127,76 (d), 128,42 (2 × d), 131,54 (s), 137,03 (s), 137,20 (s), 156,83 (s, C-3), 171,49 (s, C=O) und 178,43 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 432,4 [88, (M+H)+], 91,1 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 432,25223, C28H34NO3 erfordert 432,25387. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 278,1 nm) Rt = 5,50 min, 100%. Gefunden: C, 77,60; H, 7,68; N, 3,26, C28H33NO3 erfordert: C, 77,93; H, 7,71; N, 3,25.

3-Benzyloxy-N-butyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (14)

Unter Befolgung der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3) wurde 10 (500 mg, 1,28 mmol) mit NaH (62 mg, 1,54 mmol) behandelt, und die nachfolgende Reaktion mit Brombutan (276 &mgr;l, 2,57 mmol) war innerhalb von 4 Stunden abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 14 als einen weißen Rückstand (513 mg, 90%): SP 100-103°C; IR (KBr) 2960-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1665 (C=O), 1615-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,92 (3H, t, J = 7,2 Hz, C-4'-H3), 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,28-2,99 (15H, m), 2,84-2,89 (2H, m, C-6-H2), 3,75 (2H, m, N-CH2), 5,04 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,22 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,29-7,45 (5H, m, C6H5); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 13,76 (q, C-4'), 16,48 (q, C-18), 20,15 (t), 25,49 (t), 25,69 (t), 29,60 (t), 30,01 (t), 33,54 (t), 33,67 (t), 38,54 (d), 39,75 (t, C-1'), 40,24 (d), 41,35 (s, C-13), 42,40 (d), 69,83 (t, OCH2Ar), 112,42 (d), 114,40 (d), 126,00 (d), 127,14 (2 × d), 127,60 (d), 128,28 (2 × d), 131,41 (s), 136,90 (s), 137,05 (s), 156,69 (s, C-3), 171,30 (s, C=O) und 178,25 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 446,3 [97, (M+H)+], 91,0 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 446,26912, C29H36NO3 erfordert 446,26952. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um weiße Nadeln zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 85:15; &lgr;max = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Gefunden: C, 77,80; H, 7,89; N, 3,13, C29H35NO3 erfordert: C, 78,17; H, 7,92; N, 3,14. (geringfügig außerhalb)

3-Benzyloxy-N-pentyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (15)

Unter Befolgung der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3) wurde 10 (500 mg, 1,28 mmol) mit NaH (62 mg, 1,54 mmol) behandelt, und die nachfolgende Reaktion mit Pentylbromid (318 &mgr;l, 2,57 mmol) war innerhalb von 5 Stunden abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 15 als einen weißen Rückstand (550 mg, 93%): SP 104-107°C; IR (KBr) 3100-3000 (arom CH), 2960-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,89 (3H, t, J = 7,2 Hz, C-5'-H3), 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,20-2,98 (17H, m), 2,83-2,89 (2H, m, C-6-H2), 3,66-3,82 (2H, m, N-CH2), 5,03 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,30-7,44 (5H, m, C6H5); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 14,10 (q, C-5'), 16,63 (q, C-18), 22,46 (t), 25,63 (t), 25,81 (t), 27,72 (t), 29,16 (t), 27,75 (t), 33,68 (t), 33,79 (t), 38,68 (d), 40,10 (t, C-1'), 40,35 (d), 41,48 (s, C-13), 42,54 (d), 69,96 (t, OCH2Ar), 112,55 (d), 114,51 (d), 126,15 (d), 127,29 (2 × d), 127,76 (d), 128,42 (2 × d), 131,54 (s), 137,02 (s), 137,20 (s), 156,81 (s, C-3), 171,45 (s, C=O) und 178,39 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 460,2 [78, (M+H)+], 91,1 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 460,28447, C30H38NO3 erfordert 460,28517. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um farblose Nadeln zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 92:8; &lgr;max = 276,9 nm) Rt = 6,46 min, 97,7%. Gefunden: C, 78,20; H, 8,08; N, 3,01. C30H37NO3 erfordert: C, 78,40; H, 8,11; N, 3,05.

3-Benzyloxy-N-hexyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (16)

Unter Befolgung der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3) wurde 10 (500 mg, 1,28 mmol) mit NaH (62 mg, 1,54 mmol) behandelt, und die nachfolgende Reaktion mit Hexylbromid (360 &mgr;l, 2,57 mmol) war innerhalb von 1,5 Stunden abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 16 als einen weißen Rückstand (575 mg, 94%): SP 108-111°C; IR (KBr) 2960-2860 (aliph CH), 1720 (C=O), 1665 (C=O), 1615-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,87 (3H, t, J = 6,6 Hz, C-6'-H3), 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,28-2,98 (19H, m), 2,84-2,89 (2H, m, C-6-H2), 3,74 (2H, m, N-CH2), 5,04 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,22 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,29-7,44 (5H, m, C6H5); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 14,13 (q, C-6'), 16,63 (q, C-18), 22,63 (t), 25,64 (t), 25,84 (t), 26,69 (t), 27,99 (t), 29,76 (t), 31,56 (t), 33,69 (t), 33,82 (t), 38,70 (d), 40,14 (t, C-1'), 40,39 (d), 41,50 (s, C-13), 42,55 (d), 69,99 (t, OCH2Ar), 112,58 (d), 114,55 (d), 126,15 (d), 127,29 (2 × d), 127,76 (d), 128,42 (2 × d), 131,57 (s), 137,05 (s), 137,20 (s), 156,84 (s, C-3), 171,44 (s, C=O) und 178,38 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 474,3 [68, (M+H)+], 91,0 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 473,29238, C31H39NO3 erfordert 473,29299. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um weiße Nadeln zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 85:15; &lgr;max = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Gefunden: C, 78,10; H, 8,16; N, 2,98, C31H39NO3 erfordert: C, 78,61; H, 8,30; N, 2,96. (geringfügig außerhalb)

3-Benzyloxy-N-brombutyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (17)

Unter Befolgung der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3) wurde 10 (500 mg, 1,28 mmol) mit NaH (62 mg, 1,54 mmol) behandelt, und die nachfolgende Reaktion mit 1,4-Dibrombutan (310 &mgr;l, 2,57 mmol) war innerhalb von 1,5 Stunden abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 17 als einen weißen Rückstand (569 mg, 84%): SP 113-116°C; IR (KBr) 2935-2860 (aliph CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1605-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,17 (3H, s, C-18-H3), 1,30-3,00 (15H, m), 2,84-2,90 (2H, m, C-6-H2), 3,42 (2H, t, J = 6,8 Hz, CH2Br), 3,79 (2H, m, N-CH2), 5,04 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,30-7,45 (5H, m, C6H5); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 17,02 (q, C-18), 25,92 (t), 26,14 (t), 27,12 (t), 30,08 (t), 30,51 (t), 33,54 (t), 33,95 (t), 34,08 (t), 38,96 (d), 39,35 (t, C-1'), 40,62 (d), 41,85 (s, C-13), 42,85 (d), 70,27 (t, OCH2Ar), 112,88 (d), 114,83 (d), 126,45 (d), 127,64 (2 × d), 128,12 (d), 128,77 (2 × d), 131,77 (s), 137,30 (s), 137,50 (s), 157,12 (s, C-3), 171,83 (s, C=O) und 178,76 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 524,1 [42, (M+H)+], 91,0 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 525,17157, C29H34 81BrNO3 erfordert 525,17016 und 524,17384. C29H34BrNO3 erfordert 524,18003. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 278,1 nm) Rt = 6,04 min, 99,7%. Gefunden: C, 66,30; H, 6,51; N, 2,56. C29H34BrNO3 erfordert: C, 66,41; H, 6,53; N, 2,67.

3-Benzyloxy-N-cyclopropylmethyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (18)

Unter Befolgung der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3) wurde 10 (500 mg, 1,28 mmol) mit NaH (62 mg, 1,54 mmol) behandelt, und die nachfolgende Reaktion mit Brommethyl-Cyclopropan (246 &mgr;l, 2,57 mmol) war innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 18 als einen weißen Rückstand (536 mg, 94%): SP 96-99°C; IR (KBr) 2920-2860 (aliph CH), 1720(C=O), 1670(C=O), 1610-1495 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,29-0,34 (2H, m, C-3'-H2), 0,40-0,45 (2H, m, C-4'-H2), 1,15 (1H, m, C-2'-H), 1,18 (3H, s, C-18-H3), 1,25-3,01 (11H, m), 2,85-2,90 (2H, m, C-6-H2), 3,67 (2H, m, N-CH2), 5,04 (2H, s, OCH2Ar), 6,73 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,22 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,29-7,45 (5H, m, C6H5); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 3,94 (t, C-3'), 4,02 (t, C-4'), 10,52 (d, C-2'), 16,96 (q, C-18), 25,96 (t), 26,15 (t), 30,08 (t), 34,03 (t), 34,14 (t), 39,06 (d), 40,65 (d), 41,86 (s, C-13), 42,86 (d), 44,59 (t, C-1'), 70,31 (t, OCH2Ar), 112,90 (d), 114,87 (d), 126,45 (d), 127,60 (2 × d), 128,06 (d), 128,73 (2 × d), 131,91 (s), 137,37 (s), 137,52 (s), 157,16 (s, C-3), 171,99 (s, C=O) und 178,98 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 887,3 [58, (2M+H)+], 444,1 [98, (M+H)+], 91,0 (100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 443,24533, C29H33NO3 erfordert 443,24604. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um weiße Nadeln zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 85:15; &lgr;max = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Gefunden: C, 78,30; H, 7,47; N, 3,18. C29H33NO3 erfordert: C, 78,52; H, 7, 50; N, 3,16.

3-Benzyloxy-N-(3-picolyl)-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (19)

Natriumhydrid (60% Dispersion in Mineralöl, 31 mg, 770 &mgr;mol) wurde zu einer gerührten Lösung von 10 (250 mg, 642 &mgr;mol) in wasserfreiem DMF (10 ml) bei Raumtemperatur unter N2-Atmosphäre hinzugegeben. Nachdem die Bildung von Wasserstoff aufgehört hatte, wurde 3-(Brommethyl)pyridin-Hydrobromid (325 mg, 1,28 mmol) hinzugegeben, um ein tief-oranges Gemisch zu ergeben. Dieses wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann wurden zwei weitere Äquivalente an Natriumhydrid (52 mg, 1,28 mmol) zu dem Gemisch hinzugegeben. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und in Wasser (40 ml) gegossen. Das resultierende dunkelrote Gemisch wurde in Ethylacetat (40 ml) extrahiert. Nach weiterem umfänglichem Waschen mit Salzlake (4 × 20 ml) wurde die organische Schicht getrocknet (MgSO4), gefiltert und im Vakuum eingedampft. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (9:1) als Elutionsmittel ergab 19 als einen weißen Rückstand, der durch eine zweite Blitzsäule mit Chloroform/Aceton (95:5) weiter gereinigt wurde. Es wurde ein weißes Pulver erhalten. (230 mg, 75%): SP 170-172°C; IR (KBr) 2925-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1610-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,14 (3H, s, C-18-H3), 1,28-3,04 (11H, m), 2,84-2,88 (2H, m, C-6-H2), 4,92 (1H, d, JBA = 13,7 Hz, N-CH AHBPy), 4,98 (1H, d, JAB = 14,1 Hz, N-CHA H BPy), 5,03 (2H, s, OCH2Ar), 6,71 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,79 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,17-7,45 (7H, m, C6H5, C-1-H und C-4''-H), 7,69 (1H, td, JC-4''-H,C-3''-H = 7,8 Hz, JC-5''-H,C-3''-H = JC-1''-H,C-3''-H = 1,9 Hz, C-2''-H), 8,50 (1H, dd, JC-4''-H,C-5''-H = 5,1 Hz, JC-3''-H,C-5''-H = 1,6 Hz, C-5''-H) und 8,63 (1H, d, JC-3''-H,C-1''-H = 1,9 Hz, C-1''-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 16,49 (q, C-18), 25,51 (t), 25,77 (t), 29,68 (t), 33,56 (t), 33,66 (t), 38,52 (d), 40,14 (d), 40,85 (t, C-1'), 41,58 (s, C-13), 42,43 (d), 69,93 (t, -OCH2Ar), 112,55 (d), 114,47 (d), 123,19 (d), 126,12 (d), 127,26 (2 × d), 127,75 (d), 128,41 (2 × d), 131,35 (s), 132,80 (s), 136,37 (d), 137,10 (2 × s), 148,59 (d), 150,03 (d), 156,80 (s, C-3), 171,36 (s, C=O) und 178,31 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 481,3 [100, (M+H)+], 91,1 [47, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 481,25036, C31H33N2O3 erfordert 481,24912. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um farblose Nadeln zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C, 77,00; H, 6,75; N, 5,73. C32H33N2O3 erfordert: C, 77,47; H, 6,71; N, 5,83.

3-Benzyloxy-N-tert-butyl-benzyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (20)

Unter Befolgung der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3) wurde 10 (500 mg, 1,28 mmol) mit NaH (62 mg, 1,54 mmol) behandelt, und die nachfolgende Reaktion mit 1-Brommethyl-4-tert-Butylbenzol (472 &mgr;l, 2,57 mmol) war innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 20 als einen weißen Rückstand (667 mg, 97%): SP 199-200°C; IR (KBr) 2965-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1670(C=O), 1605-1505 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,28 (9H, s, C(CH3)3), 1,30-3,01 (11H, m), 2,84-2,90 (2H, m, C-6-H2), 4,88 (1H, d, JBA = 13,7 Hz, N-CH ACHB), 4,94 (1H, d, JAB = 14,1 Hz, N-CHACH B), 5,03 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,24-7,44 (9H, m, C6H5, C-2''-H, C-3''-H, C-5''-H und C-6''-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 16,60 (q, C-18), 25,60 (t), 25,79 (t), 29,73 (t), 31,40 (3 × q, C(CH3)3), 33,67 (t), 33,77 (t), 34,53 (s, C(CH3)3), 38,63 (d), 40,15 (d), 41,55 (s, C-13), 42,48 (d), 42,88 (t, C-1'), 69,93 (t, OCH2Ar), 112,53 (d), 114,47 (d), 125,20 (2 × d), 126,15 (d), 127,30 (2 × d), 127,77 (d), 128,02 (2 × d), 128,42 (2 × d), 131,48 (s), 134,20 (s), 136,98 (s), 137,17 (s), 149,91 (s), 156,79 (s, C-3), 171,42 (s, C=O) und 178,37 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 1071,5 [32, (2M+H)+], 536,2 [80, (M+H)+], 91,0 [100, (CH2Ar)+]; MS m/z (FAB-) 534,3 [72, (M-H)], 195,0 [100], 276,0 [100] Acc MS m/z (FAB+) 535,30865, C36H41NO3 erfordert 535,30864. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus EtOH umkristallisiert, um weiße Nadeln zu ergeben. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C,; N,; N,. C29H35NO3 erfordert: C, 80,71; H, 7,71; N, 2,61.

3-Benzyloxy-N-benzyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (21)

3-Benzyl-Marrianolsäure (9) (500 mg, 1,22 mmol) wurde mit Benzylamin (6,25 ml, 57,22 mmol) gerührt und unter N2-Atmosphäre für 3 Stunden auf 180°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das resultierende braune Gemisch in Wasser (250 ml) gegossen, mit 5M HCl angesäuert, und die organischen Fraktionen wurden in Ethylacetat (50 ml) extrahiert. Nach weiterem ausgedehntem Waschen mit Wasser (1 × 25 ml) und dann mit Salzlake (3 × 25 ml) wurde die organische Schicht getrocknet (MgSO4), filtriert und im Vakuum eingedampft. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Hexan (8:2) als Elutionsmittel ergab 21 als ein cremiges Pulver (385 mg, 65%): SP 144-146°C; IR (KBr) 3100 (arom CH), 2940-2850 (aliph CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1615-1560 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,15 (3H, s, C-18-H3), 1,25-3,01 (11H, m), 2,84-2,89 (2H, m, C-6-H2), 4,91 (1H, d, JBA = 13,7 Hz, N-CH AHBAr), 4,98 (1H, d, JAB = 13,7 Hz, N-CHA H BAr), 5,03 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,2 Hz, C-1-H) und 7,24-7,43 (10H, m, 2 × C6H5); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 16,54 (q, C-18), 25,59 (t), 25,80 (t), 29,73 (t), 33,66 (t), 33,75 (t), 38,64 (d), 40,17 (d), 41,54 (s, C-13), 42,48 (d), 43,22 (t, C-1'), 69,93 (t, OCH2Ar), 112,54 (d), 114,48 (d), 126,14 (d), 127,19 (d), 127,29 (d), 127,76 (d), 128,27 (d), 128,39 (d), 128,42 (d), 131,47 (s), 136,98 (s), 137,16 (s), 137,25 (s), 156,80 (s, C-3), 171,39 (s, C=O) und 178,31 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 480,2 [52, (M+H)+], 91,1 [100, (CH2Ar)+]; Acc MS m/z (FAB+) 480,25223, C32H34NO3 erfordert 480,25387. Für die HPLC- und CHN-Analyse wurde eine Probe aus MeOH umkristallisiert, um farblose Nadeln zu erhalten. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 220,0 nm) Rt = 5,83 min, 99,0%. Gefunden: C, 80,10; H, 6,91; N, 2,94. C32H33NO3 erfordert: C, 80,14; H, 6,94; N, 2,92.

2 – 3 – Entschützen der Vorläufer 3-Hydroxy-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (5) (STX 187)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe 1-4), wurde eine Suspension von 10 (350 mg, 899 &mgr;mol) und Pd-C (10%, 100 mg) in MeOH/THF 1:1 (50 ml) für 5 Stunden hydriert, um 5 als einen weißen Feststoff (246 mg, 91 %) zu erhalten. Eine analytische Probe wurde aus CHCl3/Hexan 2:1 umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben: SP 297-300°C; TLC (Chloroform/Aceton, 8:2) Rf 0,39 cf, Rf 0,58 (10); IR (KBr) 3410 (OH), 3180-3085 (arom CH), 2955-2870 (aliph CH), 1715 (C=O), 1680 (C=O), 1615-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,09 (3H, s, C-18-H3), 1,15-2,66 (11H, m), 2,69-2,73 (2H, m, C-6-H2), 6,44 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,52 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,07 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H), 9,05 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH) und 10,63 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, NH); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz) 16,21 (q, C-18), 25,17 (t), 25,38 (t), 29,19 (t), 32,40 (t), 32,77 (t), 38,00 (d), 40,36 (d), 40,53 (s, C-13), 41,45 (d), 112,74 (d), 114,51 (d), 125,88 (d), 129,48 (s), 136,71 (s), 154,81 (s, C-3), 172,16 (s, C=O) und 178,97 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 453,1[17, (M+H+NBA)+], 300,0 [100, (M+H)+], 213,1 [16], 159,1 [20], 133,0 [29], 111,1 [36], 97,1 (60]; MS m/z (FAB-) 605,4 [20, (M+2NBA)], 451,3 [58, (M-H+NBA)], 298,2 (100, (M-H)], 276,1 [21], 188,1 [25], 139,1 [19]; Acc MS m/z (FAB+) 300,15853, C18H22NO3 erfordert 300,15997. HPLC (Methanol/Wasser, 60:40; &lgr;max = 279,3 nm) Rt = 3,06 min, 100%, Gefunden: C, 61,80; H, 5,85; N, 3,86. C18H21NO3 + (CHCl3)1/2 erfordert: C, 61,88; H, 6,04; N, 3,90.

3-Hydroxy-N-methyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (22) (STX 188)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-4), wurde eine Suspension von 11 (400 mg, 992 &mgr;mol) und Pd-C (10%, 200 mg) in MeOH/THF 2:1 (30 ml) für 2 Stunden hydriert, um 22 als einen weißen Feststoff (253 mg, 81 %) zu erhalten. Eine analytische Probe wurde aus Ethylacetat umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben: SP 328-330°C; IR (KBr) 3460 (OH), 2940-2860 (aliph CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1510 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,09 (3H, s, C-18-H3), 1,19-2,97 (11H, m), 2,68-2,73 (2H, m, C-6-H2), 2,98 (3H, s, N-CH3), 6,44 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,52 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H), 7,06 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 9,05 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz)a 16,32 (q, C-18), 25,19 (t), 26,37 (q, C-1'), 29,11 (t), 32,78 (t), 33,55 (2 × t), 37,83 (d), 40,90 (d), 41,86 (d), 112,71 (d), 114,50 (d), 125,81 (d), 129,40 (s), 136,68 (s), 154,80 (s, C-3), 171,35 (s, C=O) und 178,24 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 314,1 [78, (M+H)+], 97,1 [100]; Acc MS m/z (FAB+) 314,17487, C19H24NO3 erfordert 314,17562. HPLC (Methanol/Wasser, 70:30; &lgr;max = 279,3 nm) Rt = 3,24 min, 100%. Gefunden: C, 72,60; H, 7,16; N, 4,35. C19H23NO3 erfordert: C, 72,82; H, 7,40; N, 4,47.

aDas C-13-Signal ist unter den Lösungsmittelpeaks verborgen.

3-Hydroxy-N-ethyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (23) (STX 275)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 12 (470 mg, 1,13 mmol) und Pd-C (10%, 200 mg) in MeOH/THF 2:1 (30 ml) für 4,5 Stunden hydriert, um 23 als einen weißen Feststoff (183 mg, 50%) zu erhalten. Dieser wurde in Aceton gewaschen, um ein weißes Pulver (121 mg, 33%) zu ergeben: SP 306-308°C; IR (KBr) 3450 (OH), 2915-2860 (aliph CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1505 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,11 (3H, t, J = 7,0 Hz, C-2'-H3), 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,22-2,98 (11H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H2), 3,82 (2H, m, N-CH2), 4,62 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 6,57 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,17 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 328,2 [100, (M+H)+], 481,2 [13, (M+H+NBA)+]; Acc MS m/z (FAB+) 328,19062, C20H26NO3 erfordert 328,19127. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C, 72,90; H, 7,68; N, 4,09. C20H25NO3 erfordert: C, 73,37; H, 7,70; N, 4,28. (geringfügig außerhalb)

3-Hydroxy-N-propyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (24) (STX 189)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 13 (400 mg, 927 &mgr;mol) und Pd-C (10%, 100 mg) in MeOH/THF 2:1 (30 ml) für 3 Stunden hydriert, um 24 als einen weißen Feststoff (256 mg, 81 %) zu erhalten. Es wurde eine analytische Probe aus Methanol umkristallisiert, um farblose Kristalle zu ergeben: SP 183-186°C; IR (KBr) 3445 (OH), 3050 (arom CH), 2940-2860 (aliph CH), 1725 (C=O), 1655 (C=O), 1585-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,90 (3H, t, J = 7,4 Hz, C-3'-H3), 1,17 (3H, s, C-18-H3), 1,30-2,98 (13H, m), 2,82-2,86 (2H, m, C-6-H2), 3,64-3,80 (2H, m, N-CH2), 4,73 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 6,58 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,66 (1 H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,17 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 11,43 (q, C-3'), 16,64 (q, C-18), 21,29 (t), 25,62 (d), 25,76 (t), 29,56 (t), 33,65 (t), 33,75 (t), 38,66 (d), 40,32 (d), 41,51 (s, C-13), 41,63 (t, C-1'), 42,48 (d), 112,97 (d), 114,98 (d), 126,30 (d), 131,15 (s), 137,39 (s), 153,66 (s, C-3), 171,76 (s, C=O) und 178,59 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 342,3 [100, (M+H)+], 133,2 [17], 111,2 [23], 97,2 [45]; MS m/z (FAB-) 494,4 [43, (M+NBA)], 340,3 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 342,20756, C21H28NO3 erfordert 342,20692. HPLC (Methanol/Wasser, 70:30; &lgr;max = 279,3 nm) Rt = 6,55 min, 100%. Gefunden: C, 73,90; H, 7,98; N, 4,20. C21H27NO3 erfordert: C, 73,87; H, 7,97; N, 4,10.

3-Hydroxy-N-butyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (25) (STX 277)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 14 (480 mg, 1,08 mmol) und Pd-C (10%, 200 mg) in MeOH/THF 2:1 (30 ml) für 2 Stunden hydriert, um 25 als einen weißen Feststoff (361 mg, 94%) zu erhalten. Dieser wurde aus Methanol umkristallisiert, um farblose Nadeln (193 mg, 50%) zu ergeben, und ein weiterer Ertrag des Produkts (49 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Methanol erhalten (Gesamtausbeute 63%): SP 212-214°C; IR (KBr) 3445 (OH), 2940-2870 (aliph CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1585-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,92 (3H, m, C-4'-H3), 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,26-2,99 (15H, m), 2,81-2,88 (2H, m, C-6-H2), 3,75 (2H, m, N-CH2), 4,75 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 6,58 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,66 (1 H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,17 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 13,76 (q, C-4'), 16,49 (q, C-18), 20,15 (t), 25,51 (t), 25,66 (t), 29,43 (t), 30,01 (t), 33,54 (t), 33,66 (t), 38,57 (d), 39,83 (t, C-1'), 40,24 (d), 41,39 (s, C-13), 42,37 (d), 112,86 (d), 114,86 (d), 126,16 (d), 131,08 (s), 137,26 (s), 153,54 (s, C-3), 171,54 (s, C=O) und 178,40 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 509,3 [5, (M+H+NBA)+], 356,2 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 508,2 (35, (M+NBA)], 354,2 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 356,22247, C22H30NO3 erfordert 356,22257. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C, 74,20; H, 8,21; N, 3,88. C22H29NO3 erfordert: C, 74,33; H, 8,22; N, 3, 94.

3-Hydroxy-N-pentyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (26) (STX 190)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 15 (520 mg, 1,13 mmol) und Pd-C (10%, 100 mg) in MeOH/TNF 2:1 (30 ml) für 3 Stunden hydriert, um 26 als einen weißen Feststoff (347 mg, 83%) zu erhalten. Es wurde eine analytische Probe aus Methanol umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben: SP 181-184°C; IR (KBr) 3445 (OH), 2955-2870 (aliph CH), 1715 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1505 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,89 (3H, t, J = 7,4 Hz, C-5'-H3), 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,20-2,98 (17H, m), 2,81-2,86 (2H, m, C-6-H2), 3,65-3,82 (2H, m, N-CH2), 4,77-4,79 (1H, m, ausgetauscht mit D2O, OH), 6,58 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,65 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,2 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,17 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,2 Hz, C-1-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 14,10 (q, C-5'), 16,63 (q, C-18), 22,46 (t), 25,64 (t), 25,77 (t), 27,71 (t), 29,15 (t), 29,75 (t), 33,66 (t), 33,76 (t), 38,67 (d), 40,16 (t, C-1'), 40,32 (d), 41,50 (s, C-13), 42,49 (d), 112,97 (d), 114,98 (d), 126,31 (d), 131,19 (s), 137,40 (s), 153,65 (s, C-3), 171,67 (s, C=O) und 178,52 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 739,1 [50, (2M+H)+], 523,0 [20, (M+H+NBA)+], 370,1 [100, (M+H)+], 97,0 [15]; MS m/z (FAB-) 737,6 [20, (2M-H)], 675,4 [8, (M+2NBA)], 522,4 [30, (M+NBA)], 368,3 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 370,23940, C23H32NO3 erfordert 370,23822. HPLC (Methanol/Wasser, 80:20; &lgr;max = 279,3 nm) Rt = 5,42 min, 100%. Gefunden: C, 74,90; H, 8,38; N, 3,73. C23H31NO3 erfordert: C, 74,96; H, 8,46; N, 3,79.

3-Hydroxy-N-hexyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (27) (STX 276)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 16 (540 mg, 1,14 mmol) und Pd-C (10%, 200 mg) in MeOH/THF 2:1 (45 ml) für 3 Stunden hydriert, um 27 als einen weißen Feststoff (384 mg, 88%) zu erhalten. Dieser wurde aus Methanol umkristallisiert, um weiße Kristalle (218 mg, 50%) zu ergeben, und ein weiterer Ertrag des Produkts (45 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Methanol erhalten (Gesamtausbeute 60%): SP 157-159°C; IR (KBr) 3435 (OH), 2930-2865 (aliph CH), 1715 (C=O), 1660 (C=O), 1585-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,87 (3H, t, J = 6,8 Hz, C-6'-H3), 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,23-2,98 (19H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H2), 3,74 (2H, m, N-CH2), 4,68 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 6,58 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,2 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,17 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 14,00 (q, C-6'), 16,48 (q, C-18), 22,48 (t), 25,46 (t), 25,59 (t), 26,53 (t), 27,82 (t), 29,41 (t), 31,39 (t), 33,49 (t), 33,58 (t), 38,48 (d), 40,06 (t, C-1'), 40,12 (d), 41,33 (s, C-13), 42,31 (d), 112,81 (d), 114,82 (d), 126,16 (d), 130,98 (s), 137,23 (s), 153,48 (s, C-3), 171,58 (s, C=O) und 178,40 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 767,6 [48, (2M+H)+], 384,3 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 765,5 [8, (2M-H)], 536,3 [10, (M+NBA)], 382,2 [100, (M-H) ]; Acc MS m/z (FAB+) 384,25350, C24H34NO3 erfordert 384,25387. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C, 75,40; H, 8,65; N, 3,71. C24H33NO3 erfordert: C, 75,16; H, 8,67; N, 3,65.

3-Hydroxy-N-brombutyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (28) (STX235)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 17 (210 mg, 381 &mgr;mol) und Pd-C (10%, 100 mg) in MeOH/THF 2:1 (30 ml) für 2 Stunden hydriert, um 28 als einen weißen Feststoff (146 mg, 84%) zu erhalten. Dieser wurde aus Methanol umkristallisiert, um weiße Kristalle (98 mg, 57%) zu ergeben: SP 165-167°C; IR (KBr) 3450 (OH), 2910-2860 (aliph CH), 1715 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1505 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,18 (3H, s, C-18-H3), 1,29-3,01 (15H, m), 2,82-2,88 (2H, m, C-6-H2), 3,42 (2H, t, J = 6,6 Hz, CH2Br), 3,72-3,87 (2H, m, N-CH2), 4,63 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 6,58 (1 H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H) und 7,17 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz) 17,01 (q, C-18), 25,92 (t), 26,09 (t), 27,11 (t), 29,87 (t), 30,51 (t), 33,47 (t), 33,94 (t), 34,06 (t), 38,96 (d), 39,38 (t, C-1'), 40,62 (d), 41,86 (s, C-13), 42,80 (d), 113,29 (d), 115,28 (d), 126,62 (d), 131,53 (s), 137,73 (s), 153,87 (s, C-3), 171,93 (s, C=O) und 178,81 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 869,2 [64], 587,1 [46, (M+H+NBA)+], 434,1 [100, (M+H)+]; Acc MS m/z (FAB+) 436,12874, C22H29 81BrNO3 erfordert 436,13103 und 434,12822, C22H29BrNO3 erfordert 434,13308. HPLC (Methanol/Wasser, 70:30; &lgr;max = 279,3 nm) Rt = 7,73 min, 98,3%. Gefunden: C, 61,30; H, 6,60; N, 3,17. C22H28BrNO3 erfordert: C, 60,83; H, 6,50; N, 3,22.

3-Hydroxy-N-cyclopropylmethyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (29) (STX 278)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 18 (500 mg, 1,13 mmol) und Pd-C (10%, 200 mg) in MeOH/THF 2:1 (45 ml) für 2,5 Stunden hydriert, um 29 als einen weißen Feststoff (356 mg, 89%) zu erhalten. Dieser wurde aus Methanol umkristallisiert, um farblose Kristalle (181 mg, 45%) zu ergeben, und ein weiterer Ertrag des Produkts (73 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Methanol erhalten (Gesamtausbeute 64%): SP 238-240°C; IR (KBr) 3440 (OH), 2940-2865 (aliph CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1505 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,29-0,34 (2H, m, C-3'-H2), 0,40-0,45 (2H, m, C-4'-H2), 1,13 (1H, m, C-2'-H), 1,19 (3H, s, C-18-H3), 1,30-3,02 (11H, m), 2,82-2,89 (2H, m, C-6-H2), 3,66 (2H, m, N-CH2), 4,70 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 6,58 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,2 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,17 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 3,95 (t, C-3'), 4,03 (t, C-4'), 10,51 (d, C-2'), 16,95 (q, C-18), 25,97 (t), 26,10 (t), 29,88 (t), 31,10 (t), 34,00 (t), 39,05 (d), 40,62 (d), 41,88 (s, C-13), 42,81 (d), 44,65 (t, C-1'), 113,30 (d), 115,31 (d), 126,61 (d), 131,56 (s), 137,73 (s), 153,96 (s, C-3), 172,21 (s, C=O) und 179,10 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 707,3 [29, (2M+H)+], 507,1 [72, (M+H+NBA)+], 354,1 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 658,3 [13, (M-H+2NBA)], 505,2 [32, (M-H+NBA)], 352,1 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 354,20686, C22H28NO3 erfordert 354,20692. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C,; H,; N,. C22H27NO3 erfordert: C, 74,76; H, 7,70; N, 3,96.

3-Hydroxy-N-(3-picolyl)-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (30) (STX 234)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 19 (190 mg, 395 &mgr;mol) und Pd-C (10%, 100 mg) in MeOH/THF 2:1 (30 ml) für 20 Stunden hydriert, um 30 als einen cremigen Feststoff (141 mg, 91 %) zu erhalten. Eine analytische Probe wurde aus Ethylacetat präzipitiert, um ein weißes Pulver zu ergeben: SP; IR (KBr) 3380 (OH), 2940-2865 (aliph CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1610-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,11 (3H, s, C-18-H3), 1,14-2,94 (11H, m), 2,67-2,75 (2H, m, C-6-H2), 4,82 (1H, d, JBA = 14,8 Hz, N-CH AHB), 4,87 (1H, d, JAB = 14,8 Hz, N-CHA H B), 6,44 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,52 (1 H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H), 7,07 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H), 7,33 (1 H, dd, JC-3''-H,C-4''-H = 7,8 Hz, JC-5''-H,C-4''-H = 4,7 Hz, C-4''-H), 7,59 (1H, m, C-3''-H), 8,42-8,47 (2H, m, C-1''-H und C-5''-H) und 9,05 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH); MS m/z (FAB+) 544,3 [6, (M+H+NBA)+], 391,2 [88, (M+H)+], 273,1 [18], 156,1 [40], 135,1 [46], 119,1 [48], 95,1 [70]; MS m/z (FAB-) 542,3 [50, (M-H+NBA)], 389,3 [100, (M-H)], 276,1 [43], 258,1 [37], 195,1 [42], 124,1 [34], 92,0 [27] Acc MS m/z (FAB+) 391,20190, C24H27N2O3 erfordert 391,20217.

3-Hydroxy-N-tert-butyl-benzyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (31) (STX 279)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 20 (620 mg, 1,16 mmol) und Pd-C (10%, 200 mg) in MeOH/THF 2:1 (30 ml) für 5 Stunden hydriert, um 31 als einen cremigen Feststoff (550 mg) zu erhalten. Dieser wurde aus Methanol umkristallisiert, um weiße, flockige Kristalle (417 mg, 81 %) zu ergeben, und ein weiterer Ertrag des Produkts (31 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Methanol erhalten (Gesamtausbeute 87%): SP 128-130°C; IR (KBr) 3415 (OH), 2955-2870 (aliph CH), 1725 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1505 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,28 (9H, s, C(CH3)3), 1,30-3,02 (15H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H2), 4,77 (1 H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 4,88 (1 H, d, JBA = 14,0 Hz, N-CH AHB), 4,95 (1H, d, , JAB = 14,0 Hz, N-CHA H B), 6,57 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,65 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,2 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,16 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,24-7,32 (4H, m, C-2''-H, C-3''-H, C-5''-H und C-6''-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 16,93 (q, C-18), 25,94 (t), 26,07 (t), 29,88 (t), 31,74 (3 × q, C(CH3)3), 33,99 (t), 34,07 (t), 34,87 (s, C(CH3)3), 38,96 (d), 40,44 (d), 41,90 (s, C-13), 42,76 (d), 43,27 (t, C-1'), 113,30 (d), 115,30 (d), 125,55 (2 × d), 126,64 (d), 128,35 (2 × d), 131,45 (s), 134,44 (s), 137,71 (s), 150,30 (s), 153,95 (s, C-3), 172,01 (s, C=O) und 178,85 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 891,4 [80, (2M+H)+], 599,2 [35, (M+H+NBA)+], 446,2 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 889,5 [42, (2M-H)], 751,4 [87, (M+2NBA)], 598,3 [30, (M+NBA)], 444,2 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 445,26176, C29H35NO3 erfordert 354,20692. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C,; H,; N,. C22H27NO3 erfordert: C, 74,76; H, 7,70; N, 3,96.

3-Hydroxy-N-benzyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (32) (STX 233)

Unter Befolgung der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-5), wurde eine Suspension von 21 (230 mg, 479 &mgr;mol) und Pd-C (10%, 100 mg) in MeOH/THF 2:1 (30 ml) für 2 Stunden hydriert, um 32 als einen weißen Feststoff (170 mg, 91 %) zu erhalten. Dieser wurde mit kochendem MeOH gewaschen, um ein weißes Präzipitat zu ergeben (122 mg, 65%): SP 298-301°C; IR (KBr) 3430 (OH), 2950-2890 (aliph CH), 1720 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1505 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,12 (3H, s, C-18-H3), 1,18-2,92 (11H, m), 2,68-2,75 (2H, m, C-6-H2), 4,79 (1H, d, JBA = 14,8 Hz, N-CH AHB), 4,85 (1H, d, JAB = 14,8 Hz, N-CHA H R), 6,45 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,53 (1H, dd,JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H), 7,07 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H), 7,17-7,32 (5H, m, C6H5) und 9,05 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz)b 16,27 (q, C-18), 25,16 (2 × t), 29,12 (t), 32,88 (t), 33,46 (t), 37,96 (d), 40,98 (s, C-13), 41,75 (d), 42,30 (t, C-1'), 112,72 (d), 114,51 (d), 125,82 (d), 126,63 (d), 126,84 (2 × d), 128,08 (2 × d), 129,41 (s), 136,69 (s), 137,36 (s), 154,81 (s, C-3), 172,21 (s, C=O) und 177,97 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 390,3 (30, (M+H)+], 133,2 [43], 111,2 [57], 97,2 [100], 80,1 [23]; Acc MS m/z (FAB+) 390,20622, C25H28NO3 erfordert 390,20692. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C,75,60; H, 7,01; N, 3,34. C25H27NO3+(H2O)1/2 erfordert: C, 75,35; H, 7,08; N, 3,51.

bEin Dublett unter Lösungsmittelpeaks verborgen.

2 – 4 – Synthese der N-Allyl-Derivate 3-tert Butyl-dimethylsilyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (33)

Zu einer gerührten Lösung von 5 (350 mg, 1,17 mmol) in DMF (20 ml) bei Raumtemperatur unter N2 wurden Imidazol (96 mg, 1,40 mmol) und tert-Butyl-dimethylsilylchlorid (194 mg, 1,29 mmol) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter N2 für 2 Stunden gerührt, und es wurden weitere 2 Äquivalente an Imidazol und TBDMSCI hinzugegeben, um eine Vervollständigung der Reaktion nach weiteren zwei Stunden bei Raumtemperatur zu ermöglichen. Das Gemisch wurde dann in Wasser (150 ml) gegossen, und die resultierende Lösung wurde mit Ethylacetat (150 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Wasser (4 × 80 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der erhaltene weiße Feststoff wurde aus EtOH/H2O umkristallisiert, um 33 als weiße Kristalle (336 mg, 70%) zu ergeben, und ein weiterer Ertrag des Produkts (40 mg) wurde beim Umkristallisieren aus EtOH/H2O aus dem Rückstand der Mutterlösung erhalten (Gesamtausbeute 78%): SP 261-264°C; TLC (Chloroform/Aceton, 8:2) Rf 0,65 cf, Rf 0,40 (5); IR (KBr) 3210 (NH), 3090 (arom CH), 2950-2860 (aliph CH), 1730 (C=O), 1680 (C=O), 1610-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,19 (6H, s, Si(CH3)2), 0,97 (9H, s, C(CH3)3), 1,23 (3H, s, C-18-H3), 1,31-2,96 (11H, m), 2,80-2,87 (2H, m, C-6-H2), 6,57 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 6,64 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,13 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,72 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, NH); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) –4,23 (2 × q, Si(CH3)2), 16,55 (q, C-18), 18,28 (s, C(CH3)3), 25,37 (t), 25,78 (3 × q, C(CH3)3), 26,06 (t), 29,55 (t), 32,84 (t), 32,92 (t), 38,55 (d), 41,22 (s, C-13), 41,61 (d), 42,67 (d), 117,50 (d), 119,67 (d), 125,97 (d), 131,52 (s), 136,92 (s), 153,53 (s, C-3), 171,61 (s, C=O) und 178,36 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 827,6 [50, (2M+H)+], 414,2 [100, (M+H)+], 356,2 [45, (M-C(CH3)3)+], 72,9 [50]; MS m/z (FAB-) 719,4 [10, (M+2NBA)], 565,3 [24, (M-H+NBA)], 412,2 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 414,24527, C24H36NO5Si erfordert 414,24645. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C, 69,60; N, 8,46; N, 3,40. C24H35NO5Si erfordert: C, 69,69; H, 8,53; N, 3,39.

3-tert Butyl-dimethylsilyl-N-allyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (34)

Unter Befolgen der Alkylierungsbedingungen (siehe VI-1-3) wurde 33 (300 mg, 725 &mgr;mol) mit NaH (35 mg, 870 &mgr;mol) behandelt, und die nachfolgende Reaktion mit Allylbromid (126 &mgr;l, 1,45 mmol) war innerhalb von 7 Stunden abgeschlossen. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform als Elutionsmittel ergab 34 als ein cremiges Öl (302 mg, 92%): TLC (Chloroform/Aceton, 8:2) Rf 0,86 cf, Rf 0,66 (33); IR (KBr) 2930-2860 (aliph CH), 1725 (C=O), 1676 (C=O), 1610-1500 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,19 (6H, s, Si(CH3)2), 0,98 (9H, s, C(CH3)3), 1,19 (3H, s, C-18-H3), 1,29-3,02 (11H, m), 2,80-2,86 (2H, m, C-6-H2), 4,37 (2H, m, N-CH2), 5,16 (2H, m, C-3'-H2), 5,80 (1H, m, C-2'-H), 6,56 (1 H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,64 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,13 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,2 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 454,3 [100, (M+H)+], 396,2 [35, (M+H-C(CH3)3)+], 72,9 [54]; MS m/z (FAB-) 606,3 [32, (M+NBA)], 452,2 [100, (M-H)], 412,2 [56, (M-H-C3H4)]; Acc MS m/z (FAB+) 454,27597, C27H40NO5Si erfordert 454,27775. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. CHN

3-Hydroxy-N-allyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (35) (STX 274)

Tetrabutylammoniumfluorid-Hydrat (183 mg, 701 &mgr;mol) wurde zu einer gerührten Lösung von 34 (265 mg, 584 &mgr;mol) in wasserfreiem DMF (10 ml) bei Raumtemperatur unter N2-Atmosphäre hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, und es wurden weitere 1,2 Äquivalente an TBAF hinzugegeben, um eine Vervollständigung der Reaktion zu ermöglichen. Nach 5 Stunden wurde das Gemisch in Wasser (40 ml) gegossen, und das gebildete weiße Präzipitat wurde filtriert, gewaschen und an der Luft getrocknet, um ein weißes Pulver (172 mg, 87%) zu ergeben. Die Reinigung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Umkristallisieren aus Ethylacetat ergab 35 als weiße Kristalle (101 mg, 51 %), und ein weiterer Ertrag des Produkts (13 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Ethylacetat erhalten (Gesamtausbeute 58%): SP 147-149°C; TLC (Chloroform/Aceton, 8:2) Rf 0,63 cf, Rf 0,80 (34); IR (KBr) 3445 (OH), 2920-2860 (aliph CH), 1720 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1505 (arom C=C) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,18 (3H, s, C-18-H3), 1,30-3,02 (11 H, m), 2,82-2,87 (2H, m, C-6-H2), 4,37 (2H, ddt, 4JC-3'-H,C-1'-H = 1,4 Hz, JC-2'-H,C-1'-H = 5,5 Hz, JC-1'-H,C-1'-H = 14,8 Hz, N-CH2), 4,72 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 5,11-5,21 (2H, m, C-3'-H2), 5,80 (1H, m, C-2'-H), 6,58 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 6,65 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,17 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,2 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 340,2 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 491,1 [50, (M-H+NBA)], 338,1 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 340,19159, C21H26NO5 erfordert 340,19127, HPLC (Methanol/Wasser, 70:30; &lgr;max = 279,3 nm) Rt = 3,91 min, 100%. Gefunden: C, 73,90; H, 7,37; N, 4,11. C21H25NO5 erfordert: C, 74,31; H, 7,42; N, 4,13.

2 – 5 – Synthese der sulfamoylierten Elternverbindungen 3-Sulfamoyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (36) (STX 211)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 5 (100 mg, 334 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 1 ml DMA nach 4 Stunden das Rohprodukt 36 (94 mg). Dieses wurde mit kochendem Aceton gewaschen, und der unlösliche weiße Feststoff wurde filtriert (56 mg, 44 %): SP 242-244°C; TLC (Chloroform/Aceton, 9:1) Rf 0,09 cf, Rf 0,17 (5); IR (KBr) 3250 (NH2), 3090 (arom CH), 2940-2850 (aliph CH), 1690 (C=O), 1695 (C=O), 1640-1560 (arom C=C), 1370 (SO2), 1170 (SO2) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,10 (3H, s, C-18-H3), 1,19-2,72 (11H, m), 2,81-2,85 (2H, m, C-6-H2), 6,98 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,03 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H), 7,38 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H), 7,91 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2) und 10,65 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, NH); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz) 16,18 (q, C-18), 24,97 (t), 25,03 (t), 29,05 (t), 32,38 (t), 32,72 (t), 37,50 (d), 40,31 (d), 40,49 (s, C-13), 42,10 (d), 119,19 (d), 121,46 (d), 126,43 (d), 137,54 (s), 137,62 (s), 147,82 (s, C-3), 172,11 (s, C=O) und 178,87 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 532,3 [23, (M+H+NBA)+], 379,3 [94, (M+H)+], 157,2 [32], 133,2 [56], 97,2 [100], 82,2 [28]; MS m/z (FAB-) 531,2 [37, (M+NBA)], 377,2 [100, (M-H)], 78 [17]; Acc MS m/z (FAB+) 379,13314, C18H23N2O5S erfordert 379,13277. HPLC (Methanol/Wasser, 50:50; &lgr;max = 266,3 nm) Rt = 5,70 min, 100%. Gefunden: C, 56,80; H, 5,83; N, 7,19. C18H22N2O5S erfordert: C, 57,13; H, 5,86; N, 7,40.

3-Sulfamoyl-N-methyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (37) (STX 212)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 22 (100 mg, 319 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 1 ml DMA nach 3 Stunden das Rohprodukt 37 (102 mg). Dieses wurde aus Chloroform umkristallisiert, um 37 als weiße Kristalle (60 mg, 48%) zu erhalten, und ein weiterer Ertrag des Produkts (24 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Chloroform gewonnen (Gesamtausbeute 67%): SP 219-222°C; IR (KBr) 3300 (NH2), 3230 (NH2), 3100 (arom CH), 2945-2865 (aliph CH), 1710 (C=O), 1655 (C=O), 1605-1500 (arom C=C), 1390 (SO2), 1190 (SO2) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,18 (3H, s, C-18-H3), 1,32-3,02 (11H, m), 2,89-2,93 (2H, m, C-6-H2), 3,16 (3H, s, N-CH3), 4,85 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2), 7,06 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,11 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,8 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H) und 7,33 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,2 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 546,0 [10, (M+H+NBA)+], 393,0 [100, (M+H)+], 313,0 [12, (M+H-NH2SO2)+], 165,0 [25], 133,0 [22], 109,0 [43], 81,0 [64, (SO2NH2+H)+]; MS m/z (FAB-) 783,4 [9, 2M-H)], 545,3 [38, (M+NBA)], 391,2 [100, (M-H)], 78,0 [16]; Acc MS m/z (FAB+) 393,14718, C19H25N2O5S erfordert 393,14842. HPLC (Methanol/Wasser, 60:40; &lgr;max = 266,3 nm) Rt = 4,72 min, 100%. Gefunden: C, 58,30; H, 6,17; N, 7,19. C19H24N2O5S erfordert: C, 58,15; H, 6,16; N, 7,14.

3-Sulfamoyl-N-ethyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (38) (STX 281)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 23 (70 mg, 214 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 1 ml DMA nach 1,5 Stunden das Rohprodukt 38 (86 mg). Dieses wurde aus Ethylacetat/Hexan 1:2 umkristallisiert, um 38 als cremige Kristalle (72 mg, 83%) zu erhalten: SP 215-217°C; IR (KBr) 3415 (NH2), 3305 (NH2), 2970-2870 (aliph CH), 1715 (C=O), 1665 (C=O), 1375 (SO2), 1190 (SO2) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,11 (3H, t, J = 7,0 Hz, C-2'-H3), 1,17 (3H, s, C-18-H3), 1,24-2,99 (11H, m), 2,88-2,95 (2H, m, C-6-H2), 3,74-3,88 (2H, m, N-CH2), 4,89 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2), 7,06 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,12 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,5 Hz, C-2-H) und 7,33 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 813,2 [40, (2M+H)+], 560,1 [70, (M+H+NBA)+], 407,1 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 811,4 [72, (2M-H)], 712,3 [47, (M+2NBA)], 559,2 [30, (M+NBA)], 405,1 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 407,16455, C20H27N2O5S erfordert 407,16407. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C,; H,; N,. C20N27N2O5S erfordert: C, 59,09; H, 6,45; N, 6,89.

3-Sulfamoyl-N-propyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (39) (STX 213)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 24 (100 mg, 293 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 1 ml DMA nach 6 Stunden das Rohprodukt 39 (156 mg). Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (95:5) als Elutionsmittel ergab 39 als weißen Rückstand (107 mg, 87%). Es wurde eine analytische Probe aus Aceton/Hexan (1:2) umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben: SP 202-204°C; IR (KBr) 3365 (NH2), 3255 (NH2), 3095 (arom CH), 2965-2880 (aliph CH), 1710 (C=O), 1660 (C=O), 1600-1500 (arom C=C), 1380 (SO2), 1180 (SO2) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,90 (3H, t, J = 7,4 Hz, C-3'-H3), 1,17 (3H, s, C-18-H3), 1,32-3,00 (13H, m), 2,88-2,93 (2H, m, C-6-H2), 3,64-3,80 (2H, m, N-CH2), 4,90 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2), 7,06 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,11 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,33 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,2 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 574,0 [8, (M+H+NBA)+], 421,0 [100, (M+H)+], 341,0 [12, (M+H-NH2SO2)+], 109,0 [52], 97,0 [45], 81,0 [74, (SO2NH2+H)+], 67,0 [60]; MS m/z (FAB-) 573,3 [34, (M+NBA)], 419,3 [100, (M-H)], 276,2 [10], 78 [16]; Acc MS m/z (FAB+) 421,18002, C21H29N2O5S erfordert 421,17972. HPLC (Methanol/Wasser, 70:30; &lgr;max = 266,3 nm) Rt = 4,61 min, 100%. Gefunden: C, 60,00; H, 6,60; N, 6,49. C21H28N2O5S erfordert: C, 59,98; H, 6,71; N, 6,66.

3-Sulfamoyl-N-butyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (40) (STX 283)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 25 (90 mg, 253 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 1 ml DMA nach 1,5 Stunden das Rohprodukt 40 (109 mg). Das erhaltene Rohprodukt wurde aus Aceton/Hexan 1:2 umkristallisiert, um 40 als weiße Kristalle zu ergeben (67 mg, 61%), und ein weiterer Ertrag des Produkts (11 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung durch Umkristallisieren aus Aceton/Hexan 1:2 gewonnen (Gesamtausbeute: 71%): SP 194-196°C; IR (KBr) 3335 (NH2), 3250 (NH2), 2940-2870 (aliph CH), 1710 (C=O), 1650 (C=O), 1385 (SO2), 1190 (SO2) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,92 (3H, t, J = 7,2 Hz, C-4'-H3), 1,17 (3H, s, C-18-H3), 1,25-2,99 (15H, m), 2,88-2,92 (2H, m, C-6-H2), 3,75 (2H, m, N-CH2), 4,91 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2), 7,06 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,12 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,8 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H) und 7,34 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 869,2 [78, (2M+H)+], 588,1 [78, (M+H+NBA)+], 435,1 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 587,2 (32, (M+NBA)], 433,2 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 435,19598, C22H31N2O5S erfordert 435,19537. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C,; H,; N,. C22H30N2O5S erfordert: C, 60,81; H, 6,96; N, 6,45.

3-Sulfamoyl-N-pentyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (41) (STX 214)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 26 (100 mg, 271 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 1 ml DMA nach 3,5 Stunden das Rohprodukt 41 (120 mg). Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (95:5) als Elutionsmittel ergab 41 als weißen Schaum (111 mg, 92%). Es wurde eine analytische Probe aus Ethylacetat/Hexan (1:2) umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben: SP 159-161°C; IR (KBr) 3345, 3255 (NH2), 3095 (arom CH), 2930-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1655 (C=O), 1600-1500 (arom C=C), 1385 (SO2), 1190 (SO2) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 100 MHz) 0,89 (3H, t, J = 7,4 Hz, C-5'-H3), 1,17 (3H, s, C-18-H3), 1,21-2,98 (17H, m), 2,90-2,94 (2H, m, C-6-H2), 3,66-3,81 (2H, s, N-CH2), 4,94 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2), 7,06 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 7,11 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H) und 7,33 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 13,95 (q, C-5'), 16,44 (q, C-18), 22,31 (t), 25,33 (2 × t), 27,54 (t), 29,00 (t), 29,32 (t), 33,46 (t), 33,55 (t), 38,06 (d), 40,02 (t, C-1'), 40,19 (d), 41,24 (s, C-13), 42,52 (d), 119,02 (d), 121,59 (d), 126,47 (d), 137,98 (s), 138,13 (s), 147,82 (s, C-3), 171,28 (s, C=O) und 178,09 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 602,0 (8, (M+H+NBA)+], 449,0 [100, (M+H)+], 369,1 [12, (M+H-NH2SO2)+], 133,0 [33], 111,0 [32], 97,0 [46]; MS m/z (FAB-) 601,4 [34, (M+NBA)], 447,3 [100, (M-H)], 276,2 [18]; Acc MS m/z (FAB+) 449,21109, C23H33N2O5S erfordert 449,21102. HPLC (Methanol/Wasser, 80:20; &lgr;max = 266,3 nm) Rt = 3,70 min, 97,9%, Gefunden: C, 61,70; H, 7,30; N, 6,22, C23H32N2O5S erfordert: C, 61,58; H, 7,19; N, 6,24.

3-Sulfamoyl-N-hexyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (42) (STX 282)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 27 (130 mg, 339 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 2,5 ml DMA nach 2 Stunden das Rohprodukt 42 (157 mg). Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (9:1) als Elutionsmittel ergab einen weißen Schaum (127 mg, 81 %). Dieser wurde aus Ethylacetat/Hexan 1:2 umkristallisiert, um 42 als farblose Kristalle (77 mg, 49%) zu ergeben: SP 112-115°C; IR (KBr) 3310 (NH2), 3190 (NH2), 2925-2860 (aliph CH), 1720 (C=O), 1655 (C=O), 1390 (SO2), 1185 (SO2) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,88 (3H, t, J = 6,6 Hz, C-6'-H3), 1,19 (3H, s, C-18-H3), 1,24-2,99 (19H, m), 2,88-2,94 (2H, m, C-6-H2), 3,66-3,82 (2H, m, N-CH2), 4,91 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2), 7,06 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,11 (1 H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,33 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 14,15 (q, C-6'), 16,58 (q, C-18), 22,63 (t), 25,46 (t), 26,67 (t), 27,95 (t), 29,46 (t), 31,53 (2 × t), 33,59 (t), 33,68 (t), 38,18 (d), 40,19 (t, C-1'), 40,32 (d), 41,37 (s, C-13), 42,65 (d), 119,18 (d), 121,74 (d), 126,61 (d), 138,12 (s), 138,26 (s), 147,94 (s, C-3), 171,46 (s, C=O) und 178,24 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 925,3 [64, (2M+H)+], 616,2 [20, (M+H+NBA)+], 463,1 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 1077,5 [70, (2M+NBA)], 615,3 [70, (M+NBA)], 462,2 [100, M]; Acc MS m/z (FAB+) 463,22629, C24H35N2O5S erfordert 463,22667. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C, 62,60; N, 7,43; N, 6,20. C24H34N2O5S erfordert: C, 62,31; H, 7,41; N, 6,06.

3-Sulfamoyl-N-brombutyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (43) (STX 286)

Natriumhydrid (60% Dispersion in Mineralöl, 14 mg, 359 &mgr;mol) wurde zu einer gerührten Lösung von 28 (130 mg, 299 &mgr;mol) in wasserfreiem DMF (2 ml) bei 0°C unter N2-Atmosphäre hinzugegeben. Nachdem die Bildung von Wasserstoff aufgehört hatte, wurde Sulfamoylchlorid (6 Äquivalente) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann für 2 Stunden unter N2 gerührt, wobei man es in dieser Zeit sich auf Raumtemperatur erwärmen ließ. Das Gemisch wurde in Salzlake (30 ml) gegossen, und die resultierende Lösung wurde mit Ethylacetat (2 × 30 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Salzlake (5 × 25 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts (188 mg) durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (9:1) als Elutionsmittel ergab 43 als einen weißen Schaum (154 mg, 100%). Dieser wurde aus Ethylacetat/Hexan 1:2 umkristallisiert, um weiße Kristalle (113 mg, 73%) zu ergeben. Ein weiterer Ertrag des Produkts (12 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Ethylacetat/Hexan 1:2 erhalten (Gesamtausbeute: 81 %): SP 162-165°C; IR (KBr) 3380 (NH2), 3260 (NH2), 2945-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1650 (C=O), 1565-1495 (arom C=C), 1388 (SO2), 1180 (SO2) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,18 (3H, s, C-18-H3), 1,22-3,00 (15H, m), 2,86-2,97 (2H, m, C-6-H2), 3,42 (2H, t, J = 6,6 Hz, CH2Br), 3,79 (2H, m, N-CH2), 4,89 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2), 7,06 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,12 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,33 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 16,63 (q, C-18), 25,42 (t), 25,46 (t), 26,74 (t), 29,44 (t), 30,14 (t), 33,20 (t), 33,55 (t), 33,66 (t), 38,16 (d), 39,07 (t, C-1'), 40,29 (d), 41,41 (s, C-13), 42,64 (d), 119,18 (d), 121,73 (d), 126,62 (d), 138,09 (s), 138,20 (s), 147,95 (s, C-3), 171,42 (s, C=O) und 178,24 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 513,1 [100, (M+H)+], 435,2 [46, (M-Br+H)+]; Acc MS m/z (FAB+) 513,10382, C22H30 79BrN2O5S erfordert 513,10588 und 515,10385, C22H30 81BrN2O5S erfordert 515,10383. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C,; N,; N,. C22H29BrN2O5S erfordert: C, 51,46; H, 5,69; N, 5,46.

3-Sulfamoyl-N-cyclopropylmethyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (44) (STX 284)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 29 (100 mg, 283 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 1 ml DMA nach 1,5 Stunden das Rohprodukt 44 (127 mg). Dieses wurde aus Aceton/Hexan 1:2 umkristallisiert, um 44 als weiße Kristalle (84 mg, 69%) zu ergeben, und ein weiterer Ertrag des Produkts (28 mg) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Aceton/Hexan 1:2 erhalten (Gesamtausbeute: 92%): SP 202-204°C; IR (KBr) 3280 (br, NH2), 2960 (aliph CH), 1700 (C=O), 1660 (C=O), 1395 (SO2), 1185 (SO2) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,29-0,34 (2H, m, C-3'-H2), 0,40-0,45 (2H, m, C4'-H2), 1,08-1,16 (1H, m, C-1'-H), 1,19 (3H, s, C-18-H3), 1,32-3,02 (11H, m), 2,88-2,96 (2H, m, C-6-H2), 3,66 (2H, m, N-CH2), 4,93 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2), 7,07 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,12 (1 H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,34 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 865,1 [55, (2M+H)+], 586,1 [45, (M+H+NBA)+], 433,0 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 863,4 [13, (2M-H)], 585,2 [30, (M+NBA)], 431,2 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 433,17944, C22H29N2O5S erfordert 433,17972. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C, 61,00; H, 6,85; N, 5,91. C22H28N2O5S erfordert: C, 61,09; H, 6,52; N, 6,48.

3-Sulfamoyl-N-(3-picolyl)-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (45) (STX 237)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 30 (55 mg, 154 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 0,5 ml DMA nach 2 Stunden das Rohprodukt 45 (50 mg). Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (7:3) als Elutionsmittel ergab 45 als weißes Pulver (27 mg, 41 %). Dieses wurde mit kochendem Aceton gewaschen, und das weiße Präzipitat wurde filtriert (10 mg, 15%): SP 215-218°C; IR, 6H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,10 (3H, s, C-18-H3), 1,15-2,97 (11H, m), 2,79-2,84 (2H, m, C-6-H2), 4,81 (1H, d, JBA = 14,8 Hz, N-CH AHB), 4,86 (1H, d, JAB = 14,8 Hz, N-CHA-H B), 6,96 (1 H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,7 Hz, C-4-H), 7,01 (1 H, dd, JC-4-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,31 (1H, dd, JC-3''-H,C-4''-H = 7,8 Hz, JC-5''-H,C-4''-H = 4,7 Hz, C-4''-H), 7,36 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H), 7,57 (1H, m, C-3''-H), 7,89 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2) und 8,41-8,44 (2H, m, C-1''-H und C-5''-H); MS m/z (FAB+) 470,3 [48, (M+H)+], 133,2 [38], 111,2 [52], 97,1[100]; MS m/z (FAB-) 622,3 (52, (M+NBA)], 468,3 [100, (M-H)], 276,2 [62], 198 [48], 139,1 [46], 93,1 [40]; Acc MS m/z (FAB+) 470,17666, C24H28N3O5S erfordert 470,17497. HPLC (Methanol/Wasser, 60:40; &lgr;max = 260,4 nm) Rt = 4,84 min, 100%. Gefunden: C, 60,00; H, 5,86; N, 8,57. C24H27N3O5S+(H2O)1/2 erfordert: C, 60,03; H, 5,90; N, 8,78.

3-Sulfamoyl-N-tert-butyl-benzyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (46) (STX 285)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 31 (200 mg, 449 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 2 ml DMA nach 6,5 Stunden das Rohprodukt 46 (235 mg). Dieses wurde aus Ethylacetat/Hexan 1:2 umkristallisiert, um 46 als weiße Kristalle zu ergeben (199 mg, 85%): SP 227-230°C; IR (KBr) 3320 (NH2), 3240 (NH2), 2960-2870 (aliph CH), 1720 (C=O), 1660 (C=O), 1385 (SO2), 1180 (SO2) cm–1; &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,16 (3H, s, C-18-H3), 1,29 (9H, s, C(CH3)3), 1,30-3,02 (H, m), 2,87-2,93 (2H, m, C-6-H2), 4,87 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2), 4,87-4,96 (2H, m, N-CHAHB) 7,06 (1 H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,11 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H) und 7,24-7,34 (5H, m, C-1-H, C-2''-H, C-3''-H, C-5''-H und C-6''-H); &dgr;C (CDCl3, 100,4 MHz) 16,39 (q, C-18), 25,31 (t), 25,28 (t), 29,29 (t), 31,24 (3 × q, C(CH3)3), 33,46 (t), 33,53 (t), 34,39 (s, C(CH3)3), 38,02 (d), 40,02 (d), 41,31 (s, C-13), 42,47 (d), 42,78 (t, C-1'), 119,03 (d), 121,58 (d), 125,07 (2 × d), 126,46 (d), 127,84 (2 × d), 133,93 (s), 137,94 (s), 138,07 (s), 147,80 (s), 149,85 (s, C-3), 171,23 (s, C=O) und 178,06 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 1049,3 [70, (2M+H)+], 678,1 [20, (M+H+NBA)+], 525,1 [100, (M+H)+]; MS m/z (FAB-) 1047,5 [80, (2M-H)], 677,3 [22, (M+NBA)], 523,2 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 524,23309, C29H36N2O5S erfordert 524,23449. HPLC (Methanol/Wasser, 90:10; &lgr;max = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Gefunden: C,; H,; N,. C29H36N2O5S erfordert: C, 66,39; H, 6,92; N, 5,34.

3-Sulfamoyl-N-benzyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (47) (STX 236)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 32 (150 mg, 385 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 1,5 ml DMA nach 3 Stunden das Rohprodukt 47 (205 mg). Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (9:1) als Elutionsmittel ergab 47 als weißes Pulver (151 mg, 84%). Dieses wurde aus Aceton/Hexan 1:2 umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben (133 mg, 74%): SP 208-210°C; IR (KBr) 3340 (NH2), 3230 (NH2), 3100-3050 (arom CH), 2950-2870 (aliph CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1495 (arom C=C), 1385 (SO2), 1195 (SO2) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,13 (3H, s, C-18-H3), 1,17-2,96 (11H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H2), 4,80 (1H, d, JBA = 14,8 Hz, N-CH AHB), 4,86 (1H, d, JAB = 14,4 Hz, N-CHA H B), 6,99 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,04 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,4 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,3 Hz, C-2-H), 7,19-7,40 (6H, m, C6H5 und C-1-H) und 7,92 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2); MS m/z (FAB+) 469,2 [100, (M+H)+], 389,2 [7, (M+H-SO2NH2)+], 97,1 [17]; MS m/z (FAB-) 935,3 [10, (2M-H)], 621,3 [38, (M+NBA)], 467,2 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 469,17892, C25H29N2O5S erfordert 469,17972. HPLC (Methanol/Wasser, 70:30; &lgr;max = 266,3 nm) Rt = 5,14 min, 100%. Gefunden: C, 63,90; H, 6,12; N, 5,86. C25H28N2O5S erfordert: C, 64,08; H, 6,02; N, 5,98.

3-Sulfamoyl-N-allyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (48) (STX 280)

Unter Befolgung der Sulfamoylierungsbedingungen (siehe VI-1-5) ergab die Reaktion von 35 (150 mg, 345 &mgr;mol) mit Sulfamoylchlorid in 2 ml DMA nach 3 Stunden das Rohprodukt 48 (85 mg). Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (9:1) als Elutionsmittel ergab 48 als weißen Schaum (85 mg, 99%). Dieses wurde aus Aceton/Hexan 1:2 umkristallisiert, um weiße Kristalle zu ergeben (75 mg, 87%): SP 210-213°C; TLC (Chloroform/Aceton, 9:1) Rf 0,33 cf, Rf 0,52 (35); IR (KBr) 3385 (NH2), 3275 (NH2), 2935-2870 (aliph CH), 1715 (C=O), 1670 (C=O), 1600-1495 (arom C=C), 1385 (SO2), 1185 (SO2) cm–1; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,13 (3H, s, C-18-H3), 1,25-2,89 (11H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H2), 4,24 (2H, m, N-CH2), 4,97-5,08 (2H, m, C-3'-H2), 5,75 (1H, m, C-2'-H), 6,99 (1H, d, JC-2-H,C-4-H = 2,3 Hz, C-4-H), 7,04 (1H, dd, JC-1-H,C-2-H = 8,6 Hz und JC-4-H,C-2-H = 2,7 Hz, C-2-H), 7,38 (1H, d, JC-2-H,C-1-H = 8,6 Hz, C-1-H) und 7,91 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2); &dgr;C (DMSO-d6, 100,4 MHz)c 16,33 (q, C-18), 24,85 (t), 25,04 (t), 29,04 (t), 32,83 (t), 33,46 (t), 37,45 (d), 40,93 (s, C-13), 41,08 (t, C-1'), 41,99 (d), 115,58 (t, C-3'), 119,22 (d), 121,51 (d), 126,44 (d), 132,75 (d), 137,49 (s), 137,63 (s), 147,83 (s, C-3), 170,81 (s, C=O) und 177,56 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 837,4 [48, (2M+H)+], 725,3 [12, (M+H+2NBA)+], 572,2 [68, (M+H+NBA)+], 419,1 [100, (M+H)+], 80,9 [18, (SO2NH2+H)+]; MS m/z (FAB-) 571,1 [30, (M+NBA)], 417,1 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 419,16347, C21H27N2O5S erfordert 419,16407. HPLC (Methanol/Wasser, 70:30; &lgr;max = 266,3 nm) Rt = 3,25 min, 100%. Gefunden: C, 60,30; H, 6,32; N, 6,56. C21H26N2O5S erfordert: C, 60,27; H, 6,26; N, 6,69.

cEin Dublett unter Lösungsmittelpeaks verborgen.

2 – 6 – Synthese der sulfamoylierten Elternverbindungen 2-Iod-Östron (49)

Zu einer gerührten Lösung von Östron (10 g, 36,98 mmol) in einem Gemisch aus Essigsäure (570 ml) und Tetrahydrofuran (280 ml), erwärmt auf 55°C, wurde Quecksilber(II)acetat (5,89 g, 18,49 mmol) hinzugegeben. Nach 15 Minuten wurde Iod (8,70 g, 34,37 mmol) hinzugegeben, um eine klare orange Lösung zu ergeben, die für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das resultierende hellgelbe Gemisch wurde dann unter reduziertem Druck konzentriert, und eine Lösung von Kaliumiodid (5% wässrig, 300 ml) wurde hinzugegeben. Die organische Fraktion wurde mit Ethylacetat (2 × 300 ml) extrahiert, mit wässrigem Natriumthiosulfat (3 × 200 ml) und Salzlake (1 × 200 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und im Vakuum eingedampft. Der derart erhaltene braune Rohfeststoff wurde zunächst aus Essigsäure umkristallisiert, um 49 als einen blauen Feststoff (6,42 g, 44%) zu erhalten, und ein weiterer Ertrag des Produkts (3,00 g) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Ethanol erhalten (Gesamt-„Rohausbeute": 64%). Beide Erträge wurden weiter aus Ethanol umkristallisiert, um hellgraue flockige Kristalle zu ergeben (8,20 g, Gesamtausbeute 56%): SP 213-215°C (dec) (Lit. °C);43 &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,91 (3H, s, C-18-H3), 1,36-2,57 (13H, m), 2,83-2,86 (2H, m, C-6-H2), 5,09 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 6,74 (1H, s, C-4-H) und 7,52 (1H, s, C-1-H).

2-Methoxy-Östron (50)

2-Iodöstron 49 (4 g, 10,09 mmol) und Kupferchlorid (452 mg, 3,365 mmol) wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter N2-Atmosphäre in wasserfreiem Pyridin (35 ml) gerührt. Eine frisch hergestellte 5,1 M Lösung von Natriummethoxid (0,101 mol, 19,7 ml) wurde dann zu dem Gemisch hinzugegeben, und die blaue Lösung wurde für 45 Minuten unter N2 am Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die resultierende orange Lösung in Eis gegossen und mit 5M HCl angesäuert. Die organische Schicht wurde mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert, mit einer gesättigten Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 200 ml) und Salzlake (2 × 200 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und im Vakuum eingedampft. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Ethylacetat/Hexan (3:17 bis 5:15) als Elutionsmittel ergab 50 als einen cremigen Rückstand (2,58 g, 78%): SP 167-170°C (Lit. °C);43 &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,92 (3H, s, C-18-H3), 1,38-2,54 (13H, m), 2,80-2,84 (2H, m, C-6-H2), 3,86 (3H, s, OCH3), 5,45 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH), 6,66 (1H, s, C-4-H) und 6,79 (1H, s, C-1-H).

2-Methoxy-3-benzyloxy-östron (51)

Zu einer gerührten Lösung von 50 (1,91 g, 6,36 mmol) in DMF (20 ml) bei 0°C unter N2-Atmosphäre wurde portionsweise Kalium-tert-Butoxid (1,07 g, 9,54 mmol) hinzugegeben. Die resultierende orange Suspension wurde unter N2 für zwei Stunden gerührt, wobei man sie in dieser Zeit sich auf Raumtemperatur erwärmen ließ. Es wurde dann Benzylbromid (1,13 ml, 9,54 mmol) hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter N2 für zwei Stunden gerührt. Die resultierende orange Lösung wurde in Wasser (50 ml) gegossen, und die organische Fraktion wurde mit Ethylacetat (2 × 50 ml) extrahiert, mit Wasser (2 × 50 ml) und Salzlake (2 × 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und im Vakuum eingedampft. Das erhaltene Rohprodukt wurde aus Ethanol umkristallisiert, um 51 als ein hell oranges Pulver zu ergeben (2,3 g). Dieses wurde weiter aus Ethanol umkristallisiert, um ein cremiges Pulver zu ergeben (1,52 g, 61 %), und ein weiterer Ertrag des Produkts (0,29 g) wurde aus dem Rückstand der Mutterlösung beim Umkristallisieren aus Ethanol erhalten (Gesamtausbeute 73%): SP 120-123°C (Lit. °C);43 &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 0,92 (3H, s, C-18-H3), 1,36-2,55 (13H, m), 2,74-2,85 (2H, m, C-6-H2), 3,86 (3H, s, OCH3), 5,11 (2H, s, OCH2Ar), 6,64 (1H, s, C-4-H), 6,84 (1H, s, C-1-H) und 7,29-7,46 (5H, m, C6H5); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)+], 342,1 [100, (M+H)+], 299,1 [40, (M+H-Ac)+]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)], 493,2 [34, (M-H+NBA)], 340,1 (100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C20H24NO4 erfordert 342,17053.

2-Methoxy-3-benzyloxy-marrianolsäure (52)

Diese wurde in einer ähnlichen Weise wie Benzyl-Marrianolsäure 9 hergestellt. Eine Iodlösung (2,81 g, 11,07 mmol) in 35 ml MeOH und eine Lösung von KOH (5,05 g) in 10 ml Wasser und 22 ml MeOH wurden tropfenweise und alternativ zu einer gerührten Lösung von 2-Methoxy-3-benzyloxy-Östron (51) (1,52 g, 3,89 mmol) in MeOH (700 ml) hinzugegeben. Der resultierende orange Rohprodukt-Schaum (1,80 g) wurde dann in einer Lösung von KOH (2,8 g) in MeOH/H2O (1:2, 84 ml) gelöst und am Rückfluss für 4 Stunden erhitzt. Der derart erhaltene orange Rückstand (4,32 g) wurde durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Methanol (95:5) als Elutionsmittel aufgetrennt und ergab 52 als orangen Rückstand (311 mg, 18%): &dgr;H (CDCl3, 400 MHz) 1,02 (3H, s, C-18-H3), 1,21-2,38 (11H, m), 2,64-2,70 (2H, m, C-6-H2), 3,72 (3H, s, OCH3), 5,01 (2H, s, OCH2Ar), 6,70 (1H, s, C-4-H), 6,85 (1H, s, C-1-H), 7,30-7,45 (5H, m, C6H5) und 12,20 (2H, br, s, ausgetauscht mit D2O, CO2H); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)+], 342,1 [100, (M+H)+], 299,1 [40, (M+H-Ac)+]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)], 493,2 [34, (M-H+NBA)], 340,1 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C20H24NO4 erfordert 342,17053.

2-Methoxy-3-Benzyloxy-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (53)

Dieses wurde in einer ähnlichen Weise wie 10 durch Umsetzen von 2-Methoxy-3-benzyloxy-Marrianolsäure (52) (300 mg, 684 mmol) mit Harnstoff (300 mg, 4,99 mmol) bei 180°C hergestellt. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (95:5) als Elutionsmittel ergab 53 als hellgelbes Pulver (170 mg, 59%): SP 84-87°C; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,10 (3H, s, C-18-H3), 1,14-2,66 (11H, m), 2,67-2,72 (2H, m, C-6-H2), 3,73 (3H, s, OCH3), 5,02 (2H, s, OCH2Ar), 6,73 (1H, s, C-4-H), 6,86 (1H, s, C-1-H), 7,30-7,46 (5H, m, C6H5) und 10,64 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, NH); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)+], 342,1 [100, (M+H)+], 299,1 [40, (M+H-Ac)+]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)], 493,2 [34, (M-H+NBA)], 340,1 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C20H24NO4 erfordert 342,17053.

2-Methoxy-3-hydroxy-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (54) (STX 325)

Unter Befolgen der Hydrierungsbedingungen (siehe VI-1-4) wurde eine Suspension von 53 (150 mg, 357 &mgr;mol) und Pd-C (10%, 80 mg) in MeOH/THF 2:1 (15 ml) für 4 Stunden hydriert, um 54 als hellgelbes Pulver zu ergeben (115 mg, 97%). Es wurde eine analytische Probe aus Methanol umkristallisiert, um weiße Kristalle zu erhalten: SP 202-205°C; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,10 (3H, s, C-18-H3), 1,13-2,42 (11H, m), 2,63-2,69 (2H, m, C-6-H2), 3,71 (3H, s, OCH3), 6,45 (1H, s, C-4-H), 6,78 (1H, s, C-1-H), 8,67 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, OH) und 10,63 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, NH); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)+], 342,1 [100, (M+H)+], 299,1 [40, (M+H-Ac)+]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)], 493,2 [34, (M-H+NBA)], 340,1 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C20H24NO4 erfordert 342,17053.

2-Methoxy-3-Sulfamoyl-16,17-seco-östra-1,3,5(10)-trien-16,17-imid (55) (STX 326)

Natriumhydrid (60% Dispersion in Mineralöl, 8 mg, 200 &mgr;mol) wurde zu einer gerührten Lösung von 54 (55 mg, 167 &mgr;mol) in wasserfreiem DMF (1 ml) bei 0°C unter N2-Atmosphäre hinzugegeben. Nachdem die Bildung von Wasserstoff aufgehört hatte, wurde Sulfamoylchlorid (6 Äquivalente) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann über Nacht unter N2 gerührt, wobei man es in dieser Zeit sich auf Raumtemperatur erwärmen ließ. Das Gemisch wurde in Salzlake (20 ml) gegossen, und die resultierende Lösung wurde mit Ethylacetat (2 × 20 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Salzlake (4 × 20 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Die Auftrennung des derart erhaltenen Rohprodukts durch Blitzchromatographie mit Chloroform/Aceton (8:2) als Elutionsmittel ergab 55 als einen weißen Schaum (30 mg, 48%). Dieser wurde aus Aceton/Hexan 1:2 umkristallisiert, um weiße Kristalle (23 mg, 37%) zu ergeben: SP 225-230°C; &dgr;H (DMSO-d6, 400 MHz) 1,11 (3H, s, C-18-H3), 1,21-2,47 (11H, m), 2,71-2,75 (2H, m, C-6-H2), 3,77 (3H, s, OCH3), 7,00 (1H, s, C-4-H oder C-1-H), 7,02 (1H, s, C-1-H oder C-4-H), 7,84 (2H, s, ausgetauscht mit D2O, NH2) und 10,65 (1H, s, ausgetauscht mit D2O, NH); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)+], 342,1 [100, (M+H)+], 299,1 [40, (M+H-Ac)+]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)], 493,2 [34, (M-H+NBA)], 340,1 [100, (M-H)]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C20H24NO4 erfordert 342,17053.

Abkürzungen

  • Å
    Angström
    Ac
    Acetyl
    Acc
    MS Genaue („akkurate") Massenspektrometrie
    Adiol
    Androstendiol
    Adione
    Androstendion
    AG
    Aminogluthethimid
    aq
    wässrig
    Ar
    Aryl
    arom
    aromatisch
    BMA
    3-Benzyl-Marrianolsäure
    Bn
    Benzyl
    br
    breit
    °C
    Grad Celsius
    13C NMR
    Kohlenstoff-NMR
    ca
    ungefähr
    cm
    Zentimeter
    COUMATE
    4-Methylcoumarin-7-O-sulfamat
    &dgr;
    chemische Verschiebung in ppm
    d
    Dublett
    dd
    Dublett von Dubletts
    DHEA
    Dehydroepiandrosteron
    DMF
    N,N-Dimethylformamid
    DMSO
    Dimethylsulfoxid
    E1
    Östron
    E2
    Östradiol
    EMATE
    Östron-3-O-sulfamat
    ER
    Östrogen-Rezeptor
    eq
    äquivalent
    FAB
    Bombardierung mit schnellen Atomen
    g
    Gramm
    h
    Stunde(n)
    hER
    humaner Östrogen-Rezeptor
    1H NMR
    Protonen-NMR
    HPLC
    Hochdruckflüssigchromatographie
    17&bgr;-HSD
    17&bgr;-Hydroxysteroid-Dehydrogenase
    Hz
    Hertz
    IC50
    Konzentration, die 50% Inhibition bewirkt
    IR
    Infrarot
    J
    Kopplungskonstante in Hz
    &lgr;max
    Wellenlänge der maximalen Absorption
    Lit.
    Literaturverweis
    &mgr;
    Mikro-
    m
    Multiplett
    M
    Mol pro Liter
    m-NBA
    Meta-Nitrobenzylalkohol
    m-RNA
    Boten-Ribonukleinsäure
    MHz
    Megahertz
    min
    Minute
    mmol
    Millimol
    mol
    Mol
    mp
    siehe: SP
    MS
    Massenspektrometrie
    m/z
    Verhältnis von Masse zu Ladung
    NADPH
    Nikotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat
    nM
    Nanomol
    NMR
    Kernmagnetische Resonanz
    ppm
    Anteile pro Million
    Rf
    Retentionsfaktor
    r.t.
    Raumtemperatur
    S.D.
    Standardabweichung
    Pd-C
    Palladium-Kohle(nstoff)
    SP
    Schmelzpunkt
    TBAF
    Tetrabutylammoniumfluorid
    TBDMS
    tert-Butyl-dimethylsilyl
    THF
    Tetrahydrofuran
    TLC
    Dünnschichtchromatographie
    TMS
    Tetramethylsilan
    &ngr;
    Frequenz eines Signals in Hz
    vs
    versus

Literaturstellen:

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Anspruch[de]
Verbindung der Formel XII worin R1 eine Sulfamatgruppe der Formel (R4)(R5)NSO2-O- ist,

R4 und R5 unabhängig voneinander unter Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl oder Kombinationen davon ausgewählt sind oder zusammen Alkylen repräsentieren, wobei das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl optional ein(e) oder mehrere Heteroatome oder -gruppen enthält,

G H oder ein Substituent, ausgewählt unter OH oder einer Hydrocarbylgruppe, ist, wobei das Ringsystem optional mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt unter Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkinyl und Halogen, substituiert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei G oder die Hydrocarbylgruppe eine optional substituierte Kohlenwasserstoffgruppe ist. Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei G oder die Hydrocarbylgruppe eine optional substituierte Alkylgruppe ist. Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei G oder die Hydrocarbylgruppe unter einer C1-C10-Alkylgruppe, wie z.B. einer C1-C6-Alkylgruppe, und einer C1-C3-Alkylgruppe ausgewählt ist. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei G oder die Hydrocarbylgruppe unter einer C1-C10-Haloalkylgruppe, einer C1-C6-Haloalkylgruppe, einer C1-C3-Haloalkylgruppe, einer C1-C10-Bromalkylgruppe, einer C1-C6-Bromalkylgruppe und einer C1-C3-Bromalkylgruppe ausgewählt ist. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei G oder die Hydrocarbylgruppe unter -(CH2)1-10-Aryl, -(CH2)1-10-Ph, (CH2)1-10-Ph-C1-10-Alkyl, -(CH2)1-5-Ph, (CH2)1-5-Ph-C1-5-Alkyl, -(CH2)1-3-Ph, (CH2)1-3-Ph-C1-3-Alkyl, -CH2-Ph und -CH2-Ph-C(CH3)3 ausgewählt ist. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei G oder die Hydrocarbylgruppe unter -(CH2)1-10-Cycloalkyl, -(CH2)1-10-C3-10-Cycloalkyl, -(CH2)1-7-C3-7-Cycloalkyl, -(CH2)1-5-C3-5-Cycloalkyl, -(CH2)1-3-C3-5-Cycloalkyl und -CH2-C3-Cycloalkyl ausgewählt ist. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei G oder die Hydrocarbylgruppe eine Alkengruppe ist. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei G oder die Hydrocarbylgruppe unter einer C1-C10-Alkengruppe, einer C1-C6-Alkengruppe und einer C1-C3-Alkengruppe ausgewählt ist. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei G H ist. Verbindung nach Anspruch 1, wobei wenigstens einer von R4 und R5 H ist. Verbindung nach Anspruch 11, wobei R4 und R5 H sind. Verbindung, die ist. Verbindung, die ist. Verbindung der Formel XII worin G unter H, OH, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Haloalkyl, -(CH2)1-10-Aryl, -(CH2)1-10-Cycloalkyl und C1-C10-Alken ausgewählt ist,

worin R1 OH ist,

worin R4 und R5 unabhängig voneinander unter H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl oder Kombinationen davon ausgewählt sind oder zusammen Alkylen repräsentieren, worin das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl optional ein(e) oder mehrere Heteroatome oder -gruppen enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Bindemittel oder Hilfsmittel enthält. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Verwendung in der Medizin. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Therapie eines Zustands oder einer Krankheit, der bzw. die mit Steroidsulfatase (STS) assoziiert ist. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Therapie eines Zustands oder einer Krankheit, der bzw. die mit ungünstigen STS-Mengen assoziiert ist. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen von Steroidsulfatase- (STS-) Aktivität. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs. Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Krebs Brustkrebs ist.






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