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Verfahren zur Protein-Herstellung - Dokument DE69834533T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69834533T2 12.10.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000911416
Titel Verfahren zur Protein-Herstellung
Anmelder DSM IP Assets B.V., Heerlen, NL
Erfinder Hellmuth, Karsten, 79539 Lörrach, DE;
Lopez-Ulibarri, Rual, 4310 Rehinfelden, CH;
Mayer, Anne Francoise, New York, NY 10021, US;
Schlieker, Heinrich Winfried, 79541 Lörrach, DE;
Van Loon, Adolphus, 4310 Rheinfelden, CH
Vertreter Lederer & Keller, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69834533
Vertragsstaaten BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IE, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 25.09.1998
EP-Aktenzeichen 981182413
EP-Offenlegungsdatum 28.04.1999
EP date of grant 17.05.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.10.2006
IPC-Hauptklasse C12P 21/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 9/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 9/16(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Untersuchungen in den letzen Jahren haben ergeben, daß methylotrophe Hefen geeignete Expressionssysteme für heterologe Proteine sind. Insbesondere Hansenula polymorpha und Pichia pastoris sind als leicht zu handhabende Wirtsorganismen für einen breiten Bereich an fremden Genen beschrieben worden (für Übersichten siehe Gelissen & Melber 1996 und Cregg & Madden 1988). Da die Promotoren für die Enzyme, die in den Methanolmetabolismus involviert sind, sehr stark sind, werden diese im allgemeinen zur Kontrolle der heterologen Expression von Proteinen verwendet (siehe EP 0173 378, EP 0299 108, EP 0183 071).

Bekanntermaßen haben Kohlenstoffquellen, die zur Kultivierung dieser Organismen verwendet werden, einen enormen Einfluß auf die Promotorregulierung. Gelissen et al. (1994) beschreibt, daß während des Wachstums auf Methanol die Schlüsselenzyme des Methanolmetabolismus in Hansenula polymorpha in großen Mengen vorhanden sind. Es ist auch herausgefunden worden, daß signifikante Niveaus der Enzyme Methanoloxidase (MOX) und Formiatdehydrogenase (FMDH) in Glycerol-gewachsenen Zellen detektiert werden können, jedoch nicht vorhanden sind, wenn Glukose als Kohlenstoffquelle verwendet wird (siehe z. B. EP 0299 108). Basierend auf diesen Daten wurde geschlußfolgert, daß diese Enzyme durch Methanol induziert werden. Die Expression von MOX und FMDH während des Wachstums auf Glycerol wird mit der Derepression der Promotoren erklärt. In Glukose-begrenzten Chemostatkulturen von Hansenula polymorpha und Kloeckera sp. 2201, wird FMDH nur unter Wachstumsraten von 0,1 h–1 in sehr kleinen Mengen produziert (Egli et al. 1980). Daher sind bisher nicht repressive Kohlenstoffquellen für die heterologe Expression von Proteinen mit methylotrophen Hefen verwendet worden. Hansenula polymorpha wird zur Herstellung einer breiten Vielzahl an pharmazeutischen Proteinen in einem Fed-Batch-Verfahren entweder im Einzelkohlenstoffquellen-Modus mit Glycerol oder im Doppelkohlenstoffquellen-Modus mit Glycerol und zusätzlich Methanol kultiviert (Gelissen & Melber 1996). Die übliche Verfahrensstrategie wird von Weydemann et al. (1995) für die Herstellung von Hirudin ausführlicher beschrieben. Ein Verfahren zur Herstellung von Thrombomodulin mit einem Pichia pastoris-Stamm ebenso unter Verwendung von Glycerol als eine nicht repressive Kohlenstoffquelle wird von Chen et al. (1996) beschrieben.

Aufgrund des hohen Preises von Glycerol ist dieses Verfahren bis jetzt nicht für die Herstellung kostengünstiger Proteine wie Futter- oder industrielle Enzyme geeignet.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung solche Schwierigkeiten zu überwinden und ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins durch die Kultivierung einer eukaryotischen Zelle, transformiert durch eine DNA-Sequenz, umfassend eine DNA-Sequenz, die das heterologe Protein codiert, bereitzustellen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die Zelle mit einer DNA-Sequenz, die den Formiatdehydrogenasepromotor (FMD oder FMDH) oder den Methanoloxidasepromotor (MOX) umfaßt, transformiert wird, daß ein repressives Substrat 90 bis 100% der Kohlenstoffquelle ausmacht und das Substrat eine Zucker-enthaltende Verbindung ist; daß die Kohlenstoffquelle während der Fütterungsphase beschränkt ist und daß während der gesamten Kultivierung keine kontinuierliche Sauerstoffbeschränkung auftritt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Enzym ist, insbesondere ein Futterenzym, z. B. Phytase, Celleulase, Xylanase, oder ein industrielles Enzym, z. B. Amylase, Protease, Invertase, Lipase, Catalase, Celleluase, Glukoseoxidase, Alkoholoxidase, Pektinase, Naraginase, Kollagenase, Peroxidase oder Pullalanase.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine methylotrophe Hefe, insbesondere Hansenula, Pichia, Candida oder Torulopsis, z. B. Hansenula polymorpha oder Pichia pastoris, ist.

Das Substrat ist ein Zucker wie Mono-, Di-, Oligo- oder Polysaccharid, z. B. Glukose, Fructose, Saccharose, Maltose, Stärke, Glykogen, Celleulose oder Dextrose oder eine Zuckerenthaltende Verbindung, z. B. Molassen, Glukosesirupe oder Fructosesirupe.

In einer noch anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren in Form von wiederholten Fed-Batches durchgeführt. Überdies ist ein solches Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß der Bereich der Fütterungsrate durch die metabolischen Merkmale der Mikroorganismen und die Stoffübertragungsleistung des Bioreaktors, insbesondere für Sauerstoff, beschränkt ist. Die Fütterungsraten werden bevorzugt zwischen dem zur Herstellung erforderlichen Minimum und dem zur Vermeidung der Sauerstoffbeschränkung in der Kultur günstigen Maximum gehalten.

Die eukaryotische Zelle ist durch eine DNA-Sequenz oder einen Vektor, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein solches heterologes Protein, in den 35 Beispielen des vorliegenden Falles z. B. die Phytase, codiert, transformiert worden. Ein Fachmann für Molekularbiologie ist mit den Verfahren, die zur Herstellung solcher transformierter eukaryotischer Zellen verwendet werden, vertraut, siehe z. B. die speziellen Beispiele des vorliegenden Falles EP 684 313 oder der europäischen Patentanmeldung Nr. 97810175.6.

„Kultivierung" hat im Kontext der vorliegenden Erfindung eine dem Fachmann geläufige Bedeutung. Die spezifischen Kultivierungsbedingungen werden von den verwendeten Zellen und den zu produzierenden Proteinen und ihren Expressionssystemen abhängen. Einem Fachmann für die enzymatische Herstellung von Proteinen sind auch solche Bedingungen geläufig. Überdies ist selbstverständlich, daß für die Praxis der vorliegenden Erfindung während der kurzen Batchphase, nämlich der Wachstumsphase der Zellen, eine repressive oder eine nicht repressive Kohlenstoffquelle, z. B. Glukose bzw. Glycerol, verwendet werden kann. Während der Fed-Batch-Phase, die die Herstellungsphase des gewünschten Proteins ist, wird das Kultivierungsverfahren wie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt durchgeführt.

Überdies können methylotrophe Hefen, die für die Praxis der vorliegenden Erfindung von Interesse sind, z. B. EP 173 378, Seiten 37 und 38, entnommen werden.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung von A. Fumigatusphytase mit Hansenula polymorpha unter Verwendung von Glycerol oder Glukose als Hauptkohlenstoffquelle

Zum Vergleich der Herstellung von Phytase unter Verwendung von Glycerol oder Glukose als Fütterungssubstrate, wurden in 15 l-Reaktoren zwei Fed-Batch-Experimente mit einem Hansenula polymorpha-Stamm, der etwa 80 Kopien des Wildtypphytasegens aus Aspergillus fumigatus (Pasamontes et al., 1997) enthält, unter Kontrolle des FMD-Promotors durchgeführt.

Die Schüttelkolbenkulturen begannen mit der Inokulierung von 1 ml einer Glycerolstammzellsuspension, die bei –70°C gehalten wurde, in 50 ml Medium mit der folgenden Zusammensetzung: 30,0 g/l Glycerol; 2,5 g/l KH2PO4; 5 g/l NH4H2PO4; 2,25 g/l MgSO4·7H2O; 2,5 g/l (NH4)2SO4; 1,15 g/l KCl; 0,25 g/l NaCl; 0,375 g/l CaCl2·2H2O; 0,25 mg/l H3BO3; 0,05 g/l (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O; 4 mg/l CuSO4·5H2O; 15 mg/l ZnSO4·7H2O; 20 mg/l MnSO4·H2O; 0,05 g/l Na-EDTA; 0,5 mg/l NiSO4·6H2O; 0,5 mg/l CoCl2·6H2O; 0,5 mg/l Na2MoO4·2H2O; 0,5 mg/l KI; 0,05 g/l Thiamin·HCl; 0,15 mg/l Biotin. Sie wurden bei 30°C und 200 U/min 24 Stunden kultiviert, 30 ml wurden in eine zweite Schüttelkolbenstufe mit 300 ml desselben Mediums übertragen, bei 30°C und 200 U/min 24 h kultiviert.

300 ml dieser Impfkultur wurden als Impfstoff für einem 15 l Fermenter mit 5 l Ausgangsmedium, das sich wie folgt zusammensetzte, verwendet: 10,0 g/l Glycerol; 5,0 g/l KH2PO4; 10 g/l NH4H2PO4; 4,5 g/l MgSO4·7H2O; 5,0 g/l (NH4)2SO4; 2,3 g/l KCl; 0,5 g/l NaCl; 0,2 ml/l Schaumhemmer; 0,75 g/l CaCl2·2H2O; 0,5 mg/l H3BO3; 0,1 g/l (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O; 8 mg/l CuSO4·5H2O; 30 mg/l ZnSO4·7H2O; 40 mg/l MnSO4·H2O; 0,1 g/l Na-EDTA; 1,0 mg/l NiSO4·6H2O; 1,0 mg/l CoCl2·6H2O; 1,0 mg/l Na2MoO4·2H2O; 1,0 mg/l KI; 0,1 g/l Thiamin·HCl; 0,3 mg/l Biotin. Während des gesamten Verfahrens wurden die Temperatur, der pH und die Belüftung bei 30°C, pH 4,6 bzw. 5 l/h konstant gehalten. Der pH wurde durch die Zugabe von NH3 (25%) kontrolliert. Die Sauerstoffsättigung wurde bei einem minimalen Wert von 20% Sättigung in dem Reaktor gehalten, indem die Rührergeschwindigkeit und der Druck (0–0,5 bar) kontrolliert wurden. Der Gesamtverbrauch an anfänglichem Glycerol in dem Medium führte zu einer schnellen Erhöhung des pO2-Wertes und zeigte das Ende der Batchphase an. Zu diesem Zeitpunkt begann die Speisung mit 700 g/l Lösungen entweder aus Glycerol oder Glukose. Eine anfängliche Fütterungsrate von 25 g Lösung pro Stunde wurde für die erste 18stündige Fütterung verwendet und dann wurde die Rate auf 50 g/h erhöht. Das Kulturvolumen erhöhte sich aufgrund der Fütterung von etwa 6 Liter Kohlenstoffquellenlösung auf bis zu etwa 11 Liter am Ende der Kultivierung.

Im Falle der Kultivierungsspeisung mit Glukose sind 98% der gesamten Kohlenstoffquelle, die während des Verfahrens metabolisiert wird, Glukose und der Rest von 2% entspricht Glycerol, das während der Batchphase verwendet wird. Während des gesamten Verfahrens konnte in dem Überstand keine Glukose gemessen werden.

Nach 165 h Verfahrenszeit wurden 5,86 g/l Phytase in Proben, die aus der Kultivierung mit Glycerol genommen wurden, unter Verwendung des Bradford-Verfahrens für die Proteinbestimmung gemessen. Aus der Kultivierung mit Glukose enthielten die Proben nach 160 h Verfahrenszeit 7,12 g/l Phytase, bestimmt durch dasselbe Verfahren. Diese Ergebnisse bestätigten, daß die repressive Wirkung von Glukose mit einer Fütterungsstrategie, die eine strikte Kohlenstoffbeschränkung während der Fütterungsphase sicherstellt, vermieden werden kann. 1 zeigt die Vergleichszeitkurve für die Kultivierungen, die mit Glycerol und Glukose als Hauptkohlenstoffquelle vorgenommen wurden.

Beispiel 2 Herstellung von A. Fumigatusphytase mit Hansenula polymorpha unter Verwendung von Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle

In diesem Beispiel wurde eine Kultivierung in einem 15 l Bioreaktor unter Verwendung desselben Stammes wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Impfkultur und die Hauptkultivierungsbedingungen waren exakt dieselben wie in Beispiel 1, außer der Fütterungslösung, die 700 g/l Saccharose enthielt. Während des Verfahrens waren die Saccharosekonzentrationen in den überständigen Proben nie höher als 1 g/l, wohingegen weder Glukose noch Fructose in denselben Proben detektiert werden konnten. Nach 167 h Kultivierungszeit konnten 5,27 g/l Phytase in dem Medium durch das Bradford-Verfahren zur Proteinbestimmung gemessen werden.

Beispiel 3 Herstellung von A. Fumigatusphytase mit Hansenula polymorpha unter Verwendung von Glukose als die alleinige Kohlenstoffquelle

In diesem Beispiel wurde eine Kultivierung mit demselben Stamm wie in den Beispielen 1 und 2 in einem 15 l Bioreaktor durchgeführt. Die Impfkultur wurde unter denselben Bedingungen wie in den Beispielen 1 und 2 erhalten. Die Hauptkultivierung wurde ausgehend von 5 l Ausgangsmedium in dem Bioreaktor mit derselben Zusammensetzung, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, außer daß die anfänglichen 10 g/l Glycerol durch 10 g/l Glukose ausgetauscht wurden. Die Fütterungslösung bestand aus 700 g/l Glukose und wurde zu der Kultivierung unter exakt denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben zugegeben. Nach 160 h Verfahrenszeit konnten 7,21 g/l Phytase in dem Medium, gemessen durch das Bradford-Verfahren, detektiert werden.

Beispiel 4 Herstellung von A. Fumigatusphytase mit Hansenula polymorpha in einem wiederholten Fed-Batch-Modus

In diesem Beispiel wurden wiederholte Fed-Batch-Kultivierungen in einem 15 l-Reaktor mit demselben Hansenula polymorpha-Stamm wie in den Beispielen 1, 2 und 3 durchgeführt. Bei der ersten Kultivierung wurde eine Impfkultur durch die Inokulierung von 1 ml Glycerolstammzellensuspension, die bei –70°C gehalten wurde, in 300 ml Medium mit der folgenden Zusammensetzung erhalten: 30,0 g/l Glycerol; 13,3 g/l NH4H2PO4; 3,0 g/l MgSO4·7H2O; 6,7 g/l (NH4)2SO4; 3,3 g/l KCl; 0,33 g/l NaCl; 1,0 g/l CaCl2·2H2O; 0,67 mg/l H3BO3; 0,067 g/l (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O; 5,3 mg/l CuSO4·5H2O; 20 mg/l ZnSO4·7H2O; 26 mg/l MnSO4·H2O; 0,067 g/l Na-EDTA; 0,67 mg/l NiSO4·6H2O; 0,67 mg/l CoCl2·6H2O; 0,67 mg/l Na2MoO4·2H2O; 0,67 mg/l KI; 0,13 g/l Thiamin·HCl; 0,4 mg/l Biotin. Der Schüttelkolben wurde bei 30°C und 200 U/min 30 h kultiviert, 300 ml wurden als Impfstoff für die Hauptkultur in einem 15 l Bioreaktor verwendet, der folgendes enthält: 150,0 g Glycerol; 100,0 g NH4H2PO4; 22,5 g MgSO4·7H2O; 50,0 g (NH4)2SO4; 25 g KCl; 2,5 g NaCl; 7,5 g CaCl2·2H2O; 5 mg H3BO3; 0,5 g (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O; 40 mg CuSO4·5H2O; 150 mg ZnSO4·7H2O; 40 mg MnSO4·H2O; 0,5 g Na-EDTA; 5,0 mg NiSO4·6H2O; 5,0 mg CoCl2·6H2O; 5,0 mg Na2MoO4·2H2O; 5,0 mg KI; 1 g Thiamin·HCl; 3 mg Biotin, für ein Ausgangsvolumen von 7,5 l Medium.

Während des gesamten Verfahrens wurden die Temperatur, der pH und die Belüftung bei 30°C, 5,0 bzw. 9,0 l/min konstant gehalten. Der pH wurde durch die Zugabe von NH3 (25%) kontrolliert. Die Sauerstoffsättigung wurde bei einem minimalen Wert von 20% Sättigung in dem Reaktor gehalten, indem die Rührergeschwindigkeit und der Druck (0–0,5 bar) kontrolliert wurden. Der Gesamtverbrauch an anfänglichem Glycerol in dem Medium führte zu einer schnellen Erhöhung des pO2-Wertes und zeigte das Ende der Batchphase an. Zu diesem Zeitpunkt begann die Speisung mit einer Lösung, die 40% Glukose und 60% Glycerol enthielt, auf eine Gesamtkonzentration der Kohlenstoffquelle von 700 g/l. Die Fütterungsrate wurde bei 45 g/h während der gesamten Fütterungsphase kontrolliert.

Für die folgenden wiederholten Fed-Batch-Kultivierungen wurden 0,5 bis 1 l Kulturbrühe aus dem vorherigen Durchlauf in dem Bioreaktor am Ende des Verfahrens als Impfstoff für den nächsten Durchlauf gehalten. Neues steriles Medium, das dieselbe Gesamtmenge an den oben beschriebenen Salzen aber keine Kohlenstoffquelle enthielt, wurde zu dem Bioreaktor bis zu einem definierten Ausgangsvolumen gegeben. Daher gab es keine Batchphase und die Fütterung begann unmittelbar wie oben beschrieben. Die Fütterungslösungen enthielten insgesamt 700 g/l Kohlenstoffquelle. Die unterschiedlichen Anteile von Glycerol und Glukose sowie das Ausgangsvolumen wurden wie nachstehend angegeben verwendet:

  • 2. Kreislauf – 66% Glukose, 34% Glycerol, 7,5 l Ausgangsvolumen
  • 3. Kreislauf – 90% Glukose, 10% Glycerol, 7,5 l Ausgangsvolumen
  • 4. und 5. Kreislauf – 100% Glukose, 5 l Ausgangsvolumen

Die Konzentrationen an Phytase, die am Ende jedes Kreislaufes erhalten wurden, betrugen 4,7 g/l, 3,9 g/l, 4,3 g/l, 6,0 g/l bzw. 4,4 g/l für den 1. bis 5. Kreislauf, wie in 2 gezeigt. Im 4. Kreislauf führte ein langsamerer, ausgedehnterer Fütterungsmodus am Ende der Wachstumsphase zu einer höheren Produktkonzentration.

Beispiel 5 Herstellung von Consensus-Phytase mit Hansenula polymorpha

In diesem Beispiel wurde ein Stamm von Hansenula polymorpha, der etwa 40 Kopien eines Consensus-Phytasegens (europäische Patentanmeldung Nr. 97810175.6) enthält, unter der Kontrolle des FMD-Promotors in einem 15 l Bioreaktor mit demselben Medium und unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung einer Einspeisungslösung, die 700 g/l Glukose für die Fed-Batch-Phase enthält, kultiviert. Nach 165 h Kultivierungszeit betrug die Phytasekonzentration in dem Medium 13,1 g/l, wie durch das Bradford-Verfahren bestimmt.

Literatur

  • J. M. Cregg und K. R. Madden (1988): Development of methylotrophic yeast, Pichia pastoris, as a host system for the production of foreign proteins, Developments in Industrial Microbiology 29, 33–41;
  • Gelissen und K. Melber (1996): Methylotrophic yeast Hansenula polymorpha as production organism for recombinat pharmaceuticals, Drug Res. 46, 943–948;
  • G. Gelissen, C. P. Hollenberger, Z. A. Janowicz (1994): Gene expression in methylotrophic yeasts. In: Smith A. (Hrsg.): Gene expression in recombinant microorganisms, Dekker, New York, 195–239;
  • Weydemann, P. Keup, M. Piontek, A. W. M. Strasser, J. Schweden, G. Gelissen, Z. A. Janowicz (1995): High-level secretion of hirudin by Hansenula polymorpha, Appl Microbiol Biotechnol 44, 377–385;
  • Th. Egli, J. P. Van Dijken, M. Veenhuis, W. Harder, A. Fiechter (1980): Methanol metabolism in yeasts: Regulation of the synthesis of catabolic enzymes, Arch. Microbiol. 124, 115–121;
  • Y. Chen, J. Krol, und D. Freedman (1996): Continuous production of Thrombomodulin from a Pichia pastoris fermentation, J. Chem. Tech. Biotechnol. 67, 143–148;
  • L. Pasamontes, M. Haiker, M. Wyss, M. Tessier, A. P. G. M. Van Loon (1997): Gene cloning, purification, and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus, Appl. Environ. Microbiol. 63, 1696–1700


Anspruch[de]
Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins durch die Kultivierung einer eukaryotischen Zelle, transformiert durch eine DNA-Sequenz, umfassend eine DNA-Sequenz, die das heterologe Protein codiert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß

– die Zelle mit einer DNA-Sequenz, die den Formiatdehydrogenasepromotor (FMD- oder FMDH-Promotor) oder den Methanoloxidasepromotor (MOX-Promotor) umfaßt, transformiert wird,

– ein repressives Substrat 90 bis 100% der Kohlenstoffquelle ausmacht und das Substrat eine Zucker-enthaltende Verbindung ist;

– die Kohlenstoffquelle während der Fütterungsphase limitierend ist und

– während der gesamten Kultivierung keine kontinuierliche Sauerstoffbeschränkung auftritt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Protein ein Enzym ist, insbesondere ein Futterenzym, z. B. Phytase, Cellulase, Xylanase, oder ein industrielles Enzym, z. B. Amylase, Protease, Invertase, Lipase, Catalase, Cellulase, Glukoseoxidase, Alkoholoxidase, Pektinase, Naraginase, Kollagenase, Peroxidase oder Pullulanase. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die eukaryotische Zelle eine methylotrophe Hefe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hansenula, insbesondere Hansenula polymorpha, Pichia, insbesondere Pichia pastoris, Candida oder Torulopsis. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das repressive Substrat die alleinige Kohlenstoffquelle ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das repressive Substrat aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mono-, Di-, Oligo- oder Polysaccharid, Glukose, Fructose, Saccharose, Maltose, Stärke, Glykogen, Cellulose oder Dextrose oder Molassen und Glukosesirupen oder Fructosesirupen. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren in Form von wiederholten Fed-Batches durchgeführt wird.






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