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Verbessertes Pflanzgut - Dokument DE102005018862A1
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE102005018862A1 26.10.2006
Titel Verbessertes Pflanzgut
Anmelder Syngenta Participations AG, Basel, CH
Erfinder Blatter, Rahel, Monthey, CH;
Anderau, Urban, Monthey, CH;
Bressoud, Charly, Vionnaz, CH;
Sierotzki, Helge, Dr., Zumikon, CH;
Stalder, Rita, Magden, CH
Vertreter Spott, Weinmiller & Böhm, 80336 München
DE-Anmeldedatum 22.04.2005
DE-Aktenzeichen 102005018862
Offenlegungstag 26.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 26.10.2006
IPC-Hauptklasse A01H 5/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft verbessertes Saat- und Vermehrungsgut der Kartoffel, welches Resistenzen unterschiedlicher Ausprägung gegenüber verschiedenen Pathogenen aufweist, insbesondere aber gegenüber Pilzen aus der Gattung Phytophthora.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einkreuzung der Phytophthora-Resistenz in verschiedene Kulturformen der Kartoffel.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft verbessertes Saat- und Vermehrungsgut der Kartoffel, welches Resistenzen bzw Toleranzen unterschiedlicher Ausprägung gegenüber verschiedenen Pathogenen aufweist, insbesondere aber eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Pilzen aus der Gattung Phytophthora, und hier vorzugsweise gegenüber Phytophthora infestans.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einkreuzung der Phytophthora Resistenz in verschiedene Kulturformen der Kartoffel.

Die Kartoffel gehört zur Familie der Solanaceae (Nachtschattengewächse). Sie vermehrt sich vegetativ durch Ausläuferknollen oder generativ durch die Bildung von Samen. Die Kartoffeln werden in zwei Gruppen eingeteilt: Solanum tuberosum spp. tuberosum und Solanum tuberosum spp. andigena.

Die krautige Pflanze blüht weiss bis violett und kann bis zu einem Meter hoch werden. Die Blätter der Kartoffel sind unpaarig gefiedert.

Die Kartoffel besitzt 12 Chromosomen in den Ploidiegraden diploid (2n) oder tetraploid (4n).

Die domestizierten Arten sind autotetraploid und können sich, im Gegensatz zu den diploiden Wildarten, selbst befruchten. Sie zeigen eine tetrasome Vererbung.

Die Kartoffel gehört auch heute noch zu den wichtigsten Kohlehydratlieferanten der Menschen und gehört daher zu den Grundnahrungsmitteln. Im Jahre 2000 betrug die weltweite Gesamtproduktion 329 Millionen Tonnen. Die Hauptproduzenten sind China und (zusammengefasst) die Staaten der ehemaligen Sowjetunion.

Der Erfolg der Kartoffel hängt auch mit der Anspruchslosigkeit der Pflanze an ihre Umgebung zusammen. Sie kann bis in Höhen von 2000 m.ü.M, bis an den Rand von Polargebieten oder in tropischen Verhältnissen gedeihen.

Das weltweit grösste Problem im Kartoffelbau ist die Kraut- und Knollenfäule als Folge von Phytophthora infestans Infektionen. Ausserdem stellen diverse Virosen, ausgelöst durch zB den Blattrollvirus (PLRV), den Kartoffelvirus X (PVX) und den Kartoffelvirus Y (PVY) sowie Frassschäden, verursacht durch den Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata) ein Problem dar.

Die Virosen der Kartoffel können durch Saatgutzertifizierungen und den Einsatz von Insektiziden gegen den Überträger der Virosen (die Blattlaus) in den Industriestaaten weitgehend kontrolliert werden. Gleiches gilt für den Kartoffelkäfer, welcher ebenfalls durch den Einsatz von Insektiziden gut bekämpft werden kann.

Wirtschaftlich das weitaus grösste Problem, weil bisher grösstenteils ungelöst, stellt aber die durch Infektion mit Phytophthora infestans verursachte Kraut- und Knollenfäule dar. Diese tritt epidemisch auf und ein früher, starker Befall kann zu einem Totalverlust der Ernte führen. In den 80er und 90er Jahren führte der Pilz allein in Nordamerika zu Verlusten in dreistelliger Millionenhöhe. Das „International Potato Center" in Lima schätzt die Ernteverluste, die auf P. infestans Infektionen zurückgehen auf etwa 15% der Weltkartoffelproduktion.

Phytophthora infestans gehört zu den falschen Mehltaupilzen und nutzt neben der Kartoffel noch andere Nachtschattengewächse als Wirtspflanze wie zB die Tomate. Im Verlauf einer typischen Infektion werden zunächst die unteren Blätter der Pflanze befallen, gefolgt von Blattstilen und Stengel und schliesslich auch der Knolle. Auf der Blattunterseite bildet sich der typische grau-weissliche Pilzrasen aus dem die Sporen entlassen werden. Die Sporen breiten sich von wenigen Primärherden insbesondere bei feuchter Witterung innerhalb kurzer Zeit aus und sind in der Lage weite Strecken zurückzulegen. Somit kann ein ganzes Kartoffelfeld innerhalb nur weniger Tage vollständig befallen werden.

Bisher konnte sich der Schaderreger in Europa und den USA nur asexuell vermehren. Seit der Einschleppung der sexuellen Form wird durch die vermehrten Rekombinationsmöglichkeiten die Entwicklung noch virulenterer Genotypen gefördert, was in der Folge zu Enteausfällen von erheblichem Ausmass führen kann. Entsprechend sind auch die Anpassungszeiten an Kartoffelsorten, die eine Vertikalresistenz aufweisen, um ein Vielfaches verkürzt worden.

Die Kraut- und Knollenfäule wird im konventionellen Ackerbau meist mit Hilfe von Fungiziden bekämpft. Es existieren jedoch schon seit den 80er Jahren Phytophthora- Stämme, die vermehrt Resistenzen gegenüber den gängigen Fungiziden aufweisen. Es ist daher eine dringlich Aufgabe, Alternativen zu entwickeln, die eine effektive Kontrolle der Kraut- und Knollenfäule gewährleisten.

Eine dieser möglichen Alternativen, die Resistenzzüchtung der Kartoffel gegenüber Phytophthora infestans, erweist sich als äusserst schwierig, da nur horizontale Resistenzen dauerhaft sind und der Züchtungsprozess sehr langwierig ist. Die Forschung auf diesem Gebiet wird vor allem vom „International Potato Center" vorangetrieben, wobei jedoch durchgreifende Erfolge bisher ausgeblieben sind.

Eine weitere Möglichkeit liegt in der Anwendung gentechnischer Strategien zur Erzeugung von Resistenzen. Zwar ist es im Prinzip möglich, eine vertikale Resistenz zu erzeugen, diese ist aber nicht dauerhaft und daher wenig effizient. Eine horizontale Resistenz lässt sich dagegen mit Hilfe gentechnischer Methoden bisher noch nicht verwirklichen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird nun erstmals eine Kartoffelpflanze bereitgestellt, welche eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, was zusammen mit anderen Faktoren auf eine horizontale, Pathotypenunabhängige Resistenz schliessen lässt.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine Kartoffelpflanze, welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist.

Insbesondere betrifft die Erfindung eine Kartoffelpflanze, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass das Merkmal der Resistenz durch Einkreuzen einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 (DSMZ 17671 mit Datum vom 22. April 2005) aufweist, erhältlich ist.

Die Erfindung betrifft weither hin eine Kartoffelpflanze, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen enthält, eingekreuzt aus einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 (DSMZ 17671) aufweist.

Ebenfalls umfasst ist eine Kartoffelpflanze, worin sich besagtes Merkmal der Phytophthora-Resistenz dadurch ausprägt, dass der natürliche Infektionsverlauf von Phytophthora infestans unterbrochen ist, indem die Mycelbildung an der Blattunterseite sowie eine Sporulation unterbunden wird.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Einkreuzung einer Resistenz gegenüber Infektionen mit Phytophthora infestans in Kartoffelpflanzen, welche eine solche Resistenz nicht aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man

  • a) eine Kreuzung einer Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSMZ 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze durchführt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen;
  • b) geeignete Massnahmen trifft, um eine Mischbestäubung zu vermeiden;
  • d) Samen aus den erntereifen Früchten isoliert und aussät;
  • e) Pflänzchen heranzieht und diese in einem geeigneten Testsystem auf Resistenz gegenüber Phytophthora infestans testet;
  • f) Pflanzen selektiert, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen.

In einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens werden die aus der Kreuzung resultierenden F1 Hybriden, welche das Merkmal Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen, mit einem Elternteil, vorzugsweise aber mit dem Phytophthora sensitiven Elter, ein- bis mehrfach rückgekreuzt.

Ebenfalls umfasst von der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Kartoffelpflanze welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora Infektionen aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass man

  • a) eine Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSMZ 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze kreuzt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen;
  • b) geeignete Massnahmen trifft, um sowohl während als auch nach dem artifiziell durchzuführenden Bestäubungsvorgang eine Mischbestäubung zu vermeiden;
  • c) Samen der F1 Generation aus den erntereifen Früchten isoliert und aussät;
  • d) Pflänzchen heranzieht und diese auf Resistenz gegenüber Phytophthora infestans testet;
  • e) Phytophthora resistente Pflanzen mit dem Phytophthora anfälligen Elter ein- bis mehrfach rückkreuzt;
  • f) in jeder auf diese Weise erhaltenen Rückkreuzungsgeneration die Pflanzen auf An- oder Abwesenheit des Resistenzmerkmals hin überprüft, g) eine Pflanze heranzieht, welche das gewünschte Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora Infektionen ausprägt.

Die vorliegende Erfindung stellt erstmals eine Kartoffelpflanze bereit, welche eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, insbesondere aber gegenüber Infektionen, welche durch die nachfolgenden Phytophthora Pathotypen verursacht werden, die mehrheitlich die R-Gene der NKL abdecken:

Stamm 96: Standardstamm mit den Virulenzgenen 3, 4, 5, 7 und 9.

Stamm 90128: Stamm aus Ohio mit den Virulenzgenen 1, 3, 4, 7, 8, 9, 10 und 11.

Stamm 91002: Stamm aus den Niederlanden mit den Virulenzgenen 2 und 7.

Stamm 91011: Stamm aus den Niederlanden mit den Virulenzgenen 3, 4, 5 und 11.

Stamm 880695: Stamm aus Ohio mit den Virulenzgenen 1, 3, 4, 7.

Die Erfindung betrifft insbesondere eine Kartoffelpflanze welche erhältlich ist durch Einkreuzung des Merkmals der Resistenz von einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 aufweist, von der eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSMZ 17671 hinterlegt wurde.

Besagte SCP-02 Kartoffelpflanze ist weissschalig und im Geschmack vergleichbar mit den kommerziellen Sorten „Matilda" und „Bintje".

Die Knollen treiben im Kühllager (5°C) ab Januar leicht Sprosskeime, ab März beginnt deutliches Keimlingswachstum, welches leicht stärker ausfällt als bei der Vergleichssorte "Bintje".

Die ausgepflanzten Knollen treiben in einem vergleichbaren Zeitrahmen wie die Vergleichssorte "Bintje" die ersten Sprossspitzen an die Oberfläche.

Die Entwicklungszeit bis zur Blüte ist ebenfalls mit derjenigen von "Bintje" identisch. Die Pflanzengrösse ist jedoch deutlich geringer als bei dieser Standardsorte.

SCP02 blüht weiss, die Blüten halten gut an der Staude und entwickeln in der Folge auch problemlos Früchte.

Die Lagerfähigkeit ist ebenfalls normal (bis März). Bei Anwendung von Keimhemmitteln sind ähnliche Lagermöglichkeiten realisierbar wie mit der Vergleichssorte "Bintje". Abweichend von der Resistenz gegenüber Phytophthora Infektionen sowohl des Blattes wie der Knolle zeigt die Pflanze eine mittlere bis hohe Anfälligkeit auf Viren, wie zB. den Blattroll-Virus sowie eine mittlere Anfälligkeit gegenüber Alternaria Infektionen. Die Attraktivität der Pflanze für Blattläuse ist mittel, für Kartoffelkäfer gering.

Besagte Kartoffelpflanze SCP-02 zeichnet sich somit insbesondere aus durch das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen, insbesondere aber gegenüber Infektionen, welche durch die Phytophthora Pathotypen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stamm 96; Stamm 90128, Stamm 91002, Stamm 91011; und Stamm 88069S ausgelöst werden, wobei besagtes Merkmal im Rahmen von Kreuzungsversuchen frei auf die Nachkommen besagter Kartoffelpflanze übertragbar ist. Die Vererbung besagten Merkmals auf die Nachkommenpflanzen folgt dabei den Gesetzmässigkeiten eines dominanten bzw semi-dominanten Erbgangs.

Unter einer resistenten Kartoffelpflanze ist im Rahmen dieser Erfindung eine Pflanze zu verstehen, die bei einer artifiziellen Inokulation von Blatt oder Knolle mit einer Sporensuspension von Phytophthora Stämmen, welche mehrheitlich die R-Gene der NKL abdecken, wie zB Stamm 96; Stamm 91002, Stamm 91011; und Stamm 880695, in einer Sporendichte von 50'000 Sporen/ml keine für eine Phytophthora Infektion typischen Symptome zeigt oder aber bei der, sofern solche Symptome doch erkennbar sind, wie zB im Falle der Verwendung hochpathogener Phytophthora Stämme, wie zB Stamm 90128, zumindest kein Mycelwachstum am Blatt oder aber, im Falle einer Knolleninfektion, ein nur atypisches, ballenförmiges Mycelwachstum, in keinem Falle aber eine Sporulation des Pilzes nachweisbar ist. Somit bleiben eventuell auftretende Infektionssymptome lokal auf den Infektionsort begrenzt, ohne dass sich die Infektion jedoch über die ganze Pflanze ausbreiten oder die Infektion auf andere Pflanzen weitertragen kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Kartoffelpflanze, worin besagtes Merkmal der Resistenz sich dadurch ausprägt, dass der natürliche Infektionsverlauf von Phytophthora infestans unterbrochen ist, sodass eine Mycelbildung am Blatt der infizierten Pflanze sowie eine Sporulation unterbleibt.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Einkreuzung des Merkmals der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen, welches im wesentlichen die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellung einer Kartoffelpflanze, welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen besitzt, wie zB, eine Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit besagte Resistenz aufweist, von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSMZ 17671 hinterlegt wurde, (b) Kreuzen dieser Pflanze mit einer anderen Kartoffelpflanze, welche anfällig ist gegenüber Infektionen mit Phytophthora infestans, (c) Herstellung von F1 Hybridpflanzen und (d) Selektion einer Hybridpfanze, welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist.

Um die wünschenswerten Eigenschaften zweier Elternpflanzen miteinander zu kombinieren kann eine sog Kreuzungs- oder Kombinationszüchtung durchgeführt werden.. Dabei werden die Pflanzen der F, Generation, die alle gleich aussehen erneut gekreuzt. Erst in der F2 Generation erfolgt eine Aufspaltung der Merkmale, und man kann sehen, bei welchen Pflanzen die gewünschte Kombination vorliegt. Dies ist bei höchstens einem Viertel der Pflanzen der Fall. Mit diesen Pflanzen wird dann weitergezüchtet, bis nach ca. 7–8 Generationen die Aufspaltungszahlen so gering sind, dass eine neue Sorte mit der gewünschten Merkmalskombination entstanden ist. Die Kreuzungszüchtung ist nach wie vor die meistangewandte Zuchtmethode für Kartoffeln.

Wenn es Ziel des Züchtungsprogramms ist, eine ausgewähltes Merkmal, wie zB eine Resistenz, in eine ansonsten bereits optimierte Hochleistungssorte mit gewünschten Eigenschaften einzukreuzen, bietet sich als eine Variante dieser Kreuzungs- oder Kombinationszüchtung die sog. Rückkreuzungszüchtung an. Dabei wird die F1 Nachkommenschaft mit derjenigen Elternpflanzen ein- bis mehrmals rückgekreuzt, welche die gewünschten Eigenschaften aufweist, in der Regel also mit der Hochleistungssorte. Ziel dieser Rückkreuzung ist es, den Genotyp der Hochleistungssorte möglichst vollständig wiederherzustellen mit Ausnahme eines oder mehrerer Gene, die für die Ausprägung des ausgewählten Merkmals verantwortlich sind. Bei der Rückkreuzung handelt es sich um eine Form der Inzucht, womit automatisch sichergestellt ist, dass mit zunehmender Anzahl von Rückkreuzungsschritten die Eigenschaften der Hochleistungssorte sukzessive wiederhergestellt werden. Das einzige zur Anwendung kommende Selektionskriterium betrifft dabei das ausgewählte Merkmal, zB eine Resistenz, die sich in der Regel leicht anhand geeigneter Testverfahren nachweisen lässt. Die Anzahl der Rückkreuzungsschritte liegt in der Regel bei 1 bis 4, oder mehr, abhängig davon, wie vollständig der Genotyp der Hochleistungssorte wiederhergestellt werden soll.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann zB eine Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSMZ 17671 hinterlegt wurde, im Rahmen eines Rückkreuzungsprogramms zunächst mit einer Phytophthora sensitiven Kartoffelpflanze, welche wünschenswerte Eigenschaften aufweist, wie zB eine Hochleistungssorte gekreuzt werden, welche als der wiederholt zur Rückkreuzung verwendete Elter (recurrent parent) eingesetzt wird. Bei einer solchen Kreuzung kann der resistente Elter entweder als weiblicher oder als männlicher Kreuzungspartner dienen.

Die resultierende F1 Pflanze wird dann ein bis mehrmals mit der Phytophthora sensitiven Elternpflanze, wie zB eine der Hochleistungssorten (recurrent parent), rückgekreuzt, um den Genomanteil der resistenten Elternpflanze weiter zu reduzieren und sukzessive durch das Genom der Phytophthora sensitiven Elternpflanze zu ersetzen. Angestrebt wird eine Pflanze zu erhalten, welche zwischen 80% und 99.5%, besser zwischen 90% und 99%, insbesondere aber zwischen 95% und 98% des Genoms der sensitiven, aber ansonsten mit wünschenswerten Eigenschaften ausgestatteten Elternpflanze (wie zB einer Hochleistungssorte) aufweist, darüber hinaus aber noch das Merkmal der Resistenz exprimiert. In jeder auf diese Weise erhaltenen Rückkreuzungsgeneration müssen die Pflanzen auf An- oder Abwesenheit des Resistenzmerkmals hin überprüft werden. Dies kann im Falle der Resistenz sehr einfach durch Anwendung der in den Beispielen im Einzelnen beschriebenen Testverfahren erfolgen.

Nach der letzten Rückkreuzung wird vorzugsweise ein Selbstung durchgeführt.

Da die Kartoffel zur Selbstbefruchtung befähigt ist, bedarf es, um die Verfahren zur Kreuzungs- oder Kombinationszüchtung erfolgreich durchführen zu können, einer kontrollierten und zielgerichteten Prozessführung, welche eine Übertragung von Pollen vom väterlichen Elter auf die Mutterpflanze gewährleistet unter gleichzeitigem Ausschluss von unerwünschten Mischbestäubungen.

Dies macht die Anwendung technischer Massnahmen notwendig, wie zB das manuelle Herausschneiden der Staubbeutel aus der Blüte der Mutterpflanze sowie das gezielte Übertragen von Pollen des väterlichen Elter auf die Narbe der Mutterpflanze. Anschliessend müssen weitere Massnahmen getroffen werden um Mischbestäubungen der zuvor artifiziell bestäubten Blüte zu verhindern, wie zB durch Eintüten der bestäubten Blüte.

Da die Keimungsrate von Kartoffelsamen insbesondere im Fall von Hochleistungssorten oft nur gering ist, muss diese gegebenenfalls durch Anwendung geeigneter Massnahmen erhöht werden. Eine mögliche Massnahme besteht dabei darin, die Samen nach Aufschneiden der Frucht dort für einen Zeitraum von wenigen Stunden bis zu 4 Tagen, insbesondere aber für einen Zeitraum von 1 bis 2 Tagen zu belassen, bevor dann die Aussaat in ein geeignetes Kulturmedium erfolgt. Alternative kann die Inkubation der isolierten Samen in dem zuvor genannten Zeitrahmen auch in einem Pflanzenextrakt erfolgen, der aus den reifen Kartoffelfrüchten gewonnen werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit weiterhin ein Verfahren zur Einkreuzung einer Resistenz gegenüber Infektionen mit Phytophthora infestans in Kartoffelpflanzen, welche eine solche Resistenz nicht aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man

  • a) eine Kreuzung einer Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSMZ 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze durchführt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen;
  • b) geeignete Massnahmen trifft, um eine Mischbestäubung zu vermeiden;
  • g) Samen aus den erntereifen Früchten isoliert und aussät;
  • h) Pflänzchen heranzieht und diese auf Resistenz gegenüber Phytophthora infestans testet
  • i) Pflanzen selektiert, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen.

HINTERLEGUNG

Eine Probe von SCP-02 wurde in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSMZ 17671 hinterlegt.

Der Hinterleger und Anmelder von DSMZ 17671 ermächtigt hiermit die Hinterlegungsstelle unwiderruflich, vermehrungsfähige Proben des hinterlegten pflanzlichen Materials auszuhändigen an

  • a) die Patenterteilungsbehörde und zwar jederzeit auf Anforderung und
  • b) jeden Dritten vom Zeitpunkt der ersten Veröffentlichung der Patentanmeldung an, also vom Zeitpunkt der Offenlegung oder vom Zeitpunkt der Erteilung des Patents an, wenn die Erteilung vor der Offenlegung erfolgen sollte.

Es wird weiterhin bestätigt, dass der Hinterleger und Anmelder für die Dauer der Hinterlegung auf jeden Anspruch auf Rückgabe des hinterlegten Biologischen Materials gegenüber der Hinterlegungsstelle verzichtet.

Die Freigabe einer Probe des hinterlegten Biologischen Materials an Dritte erfolgt jedoch nur dann, wenn diese sich verpflichten, die Probe einschließlich einer von ihr abgeleiteten Kultur während der Anhängigkeit der Anmeldung und der Dauer des Patentschutzes weder an andere Personen weiterzugehen noch aus dem Geltungsbereich des Patentgesetzes zu verbringen. Als abgeleitete Kultur ist jede Kultur anzusehen, die noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merkmale des hinterlegten Biologischen Materials hat.

Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration der vorliegenden Erfindung und sind in keiner Weise beschränkend für den Umfang der Erfindung.

Pflanzenmaterialien: Kommerzielle Kartoffelsorten [Sortenratgeber Kartoffeln für den ökologischen Landbbau http://www.uni-giessen.de/orglandbau/moeller-sorten-beschreibung.htm]: Bintje:

Diese weissschalige, alte Sorte ist sowohl auf Viren, wie auch auf Phytophthora infestans extrem anfällig.

Désirée:

Sehr anfällig gegenüber Viren. Jedoch ziemlich resistent gegenüber P. infestans. Rotschalig.

Sirtema:

Sehr anfällig gegenüber Phytophthora und Viren. Weisschalig.

Fontane:

Die P. infestans Anfälligkeit von Fontane ist mittelmässig. Die Virusgesundheit ist jedoch gut. Weissschalig.

Agria:

Agria ist mittelanfällig gegenüber P. infestans. Gegen PVY und PLRV ist sie sehr resistent. Weissschalig.

Agata:

Eine neue Sorte die gegen Viren ziemlich resistent, gegenüber P. infestans jedoch anfällig ist. Weissschalig.

Blue Congo:

Alte Sorte die auch Blauer Schwede genannt wird und deren Herkunft nicht bekannt ist. Wahrscheinlich die einzige Wildsorte die im Mitteleuropa angebaut wird. Über die Krautfäule- und Virenanfälligkeit ist nichts bekannt. Die Schale und das Fruchtfleisch sind violett-blau.

Im Rahmen der nachfolgenden Beispiele wurden häufig angebaute Standardsorten verwendet; die Sorte Blue Congo wird als Wildsorte miteinbezogen. Die Kartoffeln wurden nicht aufgezogen, sondern als Knollen weiterverwendet.

Kartoffeln aus Testsystemen: Niederländische Kartoffel Linien (NKL):

Die Niederländischen Linien sind ein Testsystem von 11 Bintje- Pflanzen. Jede Pflanze des Systems besitzt ein R-Gen. Dadurch können die Virulenzgene eines Pilzes bestimmt werden. Die Pflänzchen werden in Gewebekulturen vermehrt und bei Bedarf in Erde eingepflanzt.

Die SCP-02 Kartoffel:

Die SCP-02 erwies sich in den nachfolgenden Testsystemen als resistent gegenüber P. infestans. Sie konnte aus einem Versuchsfeld isoliert werden, welches artifiziell mit P infestans infiziert wurde. Gegenüber den verschiedenen Kartoffelviren ist sie sehr anfällig. Sie ist gut geniessbar (ähnlich wie Agria und Bintje) und weissschalig. Sie wird sowohl als Knolle wie als auch als Ganzpflanze für Versuche verwendet.

Agronomische Beschreibung:

Die Knollen treiben im Kühllager (5°C) ab Januar leicht Sprosskeime, ab März beginnt deutliches Keimlingswachstum, welches leicht stärker ausfällt als bei der Vergleichssore "Bintje".

Eine Vorkeimung zur Auspflanzung erfolgt während 1 Woche unter grosser Lichtintensität.

Die ausgepflanzten Knollen treiben in einem vergleichbaren Zeitrahmen wie die Vergleichssorte "Bintje" die ersten Sprossspitzen an die Oberfläche.

Die Entwicklungszeit bis zur Blüte ist ebenfalls mit derjenigen von "Bintje" identisch. Die Pflanzengrösse ist jedoch deutlich geringer als bei der Standardsorte "Bintje".

SCP02 blüht weiss, die Blüten halten gut an der Staude und entwickeln in der Folge auch problemlos Früchte.

Die durchgeführten Tests beschränkten sich auf Kulturzeiten, die für Speisekartoffeln typisch sind (100–120 Tage). Eignung als Frühkartoffel oder Industriekartoffel wurde nicht getestet.

Lagerfähigkeit: Normal (bis März). Bei Anwendung von Keimhemmittel sind ähnliche Lagermöglichkeiten realisierbar wie mit der Vergleichssorte "Bintje". Anfälligkeit auf Virus (Blattroll-V): Mittel bis hoch Anfälligkeit auf Phythophthora Blatt: Keine Anfälligkeit auf Phythophthora Knollen: Keine Anfälligkeit auf Alternaria Mittel Attraktivität für Blattläuse Mittel Attraktivität für Kartoffelkäfer Klein

Weitere Angaben bezüglich der Speisequalität von SCP-02 im Vergleich mit den Hochleistungssorten „Bintje" und „Matilda" differenziert nach Kochtyp finden sich in der nachfolgenden Tabellen 2.

Phytouhthora-Stämme:

Im Rahmen der nachfolgend beschriebenen Infektionsstudien wurden die folgenden Phytophthora Stämme verwendet:

Stamm 96:

  • Standardstamm mit den Virulenzgenen 3,4,5,7 und 9. [gemäss Abgleich mit den Niederländischen Linien]

Stamm 90128

  • Stamm aus Ohio mit den Virulenzgenen 1,3,4,7,8,9,10 und 11.

Stamm 91002

  • Stamm aus den Niederlanden mit den Virulenzgenen 2 und 7.

Stamm 91011

  • Stamm aus den Niederlanden mit den Virulenzgenen 3,4,5 und 11.

Stamm 880695

  • Stamm aus Ohio mit den Virulenzgenen 1.3.4.7.
  • (Die obigen Stämme sind bei der Universität von Wageningen erhältlich, Francine Govers Laboratory of Phytopathology, Wageningen Agricultural University, Binnenhaven 9,6709 PD Wageningen, The Netherlands; Graduate School Experimental Plant Sciences, The Netherlands)

Alle Pilzstämme werden auf Roggenagar kultiviert [Beyer K. et al, Characterization of Phytophthora infestans genes regulated during the interaction with potato. Molecular Plant Pathology 2002, 3(6), 473–85.].

Beispiel 1: Verwandtschaftsbestimmung

Zur Bestimmung der Verwandtschaftsverhältnisse von Organismen gibt es verschiedene Möglichkeiten, welche zB auf der Verwendung von Simple Sequence Repeats (SSR), Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase-Chain-Reaction (RAPD-PCR) und Amplified-Fragment-Length-Polymorphism (AFLP) basieren. Für alle vier Methoden muss zuerst DNA extrahiert, aufgereinigt und quantifiziert werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die Verwandtschaftsbestimmung mittels AFLPs durchgeführt (G. Knapova and U. Gisi, Phenotypic and genotypic structure of Phytophthora infestans populations on potato and tomato in France and Switzerland, Plant Pathology Volume 51, Issue 5, Page 641 – October 2002)

Die AFLP- Technik basiert auf der Amplifikation der Produkte eines Restriktionsverdaus und anschliessenden selektionierenden PCR's. Die aus diesen Reaktionen entstehenden Produkte werden anschliessend auf ein Polyacrylamidgel geladen und 4 Stunden unter Hochspannung aufgetrennt.

Die durch die selektive PCR „farbig" markierten DNA- Fragmente durchlaufen am unteren Ende des Gels einen Sensor der ihr Ankommen aufzeichnet. Sämtliche Aufzeichnungen kombiniert ergeben dann das Bandenschema welches ausgewertet wird.

Der genetische Fingerabdruck der Phytophthora-resistenten SCP-02 Kartoffel ähnelt keinem der kommerziellen Sorten so stark, als dass sie durch eine Punktmutation aus ihr hätte entstehen können. Die SCP-02 ist also mit keiner der getesteten Sorten Mitteleuropas nahe verwandt. Bei weitem am meisten Ähnlichkeit zeigt die SCP-02 (wie in Tabelle 1 ersichtlich) mit Désirée, am wenigsten mit der Wildsorte Blue Congo (= Blauer Schwede). Die Tabelle 1 ist eine Zusammenfassung der Binärauswertung nach Anzahl übereinstimmender Bandenmerkmale.

Infektionsstadien

Der Infektionsverlauf wurde anhand der resistenten Kartoffel SCP-02 sowie einer „Bintje" als Kontrollpflanze untersucht. Die Knollen der beiden Kartoffelpflanzen wurden dabei zehn Wochen lang bei einer Temperatur von 4° C gelagert und unter Ausbildung von Stolonen gekeimt. Aus den Stolonen wurden dann die Pflänzchen herangezogen.

Für die Infektionsstudien wurden 2 Wochen alte Phytophthora- Stämme (Stamm 96 und Stamm 90128) verwendet um eine gute Sporulation zu gewährleisten.

Für den Vorbereitungstest werden je drei Blattsegmente der SCP-02, der Bintje und einer geselbsteten SCP-02 F1-Hybrid Pflanze mit der Blattunterseite nach oben in Petrischalen mit feuchten Filterpapieren gelegt und mit einer Sporensuspensionen der beiden Pilz-Stämme inokuliert. Die Schalen werden einen Tag im Dunklen und anschliessend vier Tage unter Licht inkubiert. Nach fünf Tagen werden die Blätter visuell nach der An der Resistenz (resistent, sensitiv oder vertikalresistent) ausgewertet.

Die Sporendichte beträgt 50'000 Sporen/ml. Für eine optimale Zoosporenfreisetzung wird die Suspension für mindestens 30 Minuten bei 4°C gekühlt. Die Sporensuspension wird nun auf die Blattunterseite gesprayt und das Blatt inkubiert. Nach einem Tag wird jeweils ein Blatt von jeder Kombination zerschnitten, in der erwärmten Färbelösung gekocht und einen Tag darin inkubiert. Am nächsten Tag wird das Blatt entfärbt und unter dem Mikroskop betrachtet. Die anderen beiden Blätter werden am dritten beziehungsweise am fünften Tag dementsprechend ausgewertet. Die Beobachtungen werden sowohl in Text- als auch in Bildform dokumentiert und verglichen.

Bei den Färbungen zeigten sich kein Anzeichen einer Infektionshyphe. Die Zoospore keimte aus, bildete einen Keimschlauch und ein Appressorium, starb dann aber sehr schnell ab. Der Pilz kann also nur oberflächlich in das Blatt eindringen, dort aber keine Infektion auslösen (keine Mycel- und Sporenbildung). Die sensitive und die vertikalresistente Pflanze zeigten den erwarteten Infektionsverlauf.

Besipiel 2: Resistenzmechanismen

Zur Differenzierung zwischen verschiedenen möglichen Resistenzmechanismen (Horizontalresistenz oder Vertikalresistenz) in der SCP-02, muss die Kartoffel mit hochvirulenten Phytophthora- Stämmen getestet werden. Um auszuschliessen, dass die Resistenz der SCP-02 mit einem R-Gen begründet werden kann, wurden zunächst Blattsegmente und Kartoffelscheiben mit Phytophthora- Stämmen inokuliert, die mehrheitlich die R-Gene der NKL abdecken. Dazu wurden Blattsegmente bzw. die gewaschenen Kartoffelscheiben in Petrischalen plaziert, die mit feuchten Filterpapieren ausgelegt waren, und 10 Tröpfchen der gekühlten Sporensuspension (50'000 Sporen/ml) auf die Blattunterseite bzw. die Scheiben pipettiert. Anschliessend wurden die Schalen fünf Tage lang inkubiert und danach nach Symptomen ausgewertet. Derselbe Test wurde noch mit hochvirulenten Stämmen aus der Schweiz und aus Israel (Standardstamm der Bar-Ilan University, Israel. Verantwortlich für den Versuch: Prof. Dr. Y. Cohen) durchgeführt.

Während 7 jährigem Feldanbau an Orten mit natürlichem Phytophthora-Inokulum blieb SCP-02 immer frei von Infektionssymptomen sowohl an den Blätter wie auch an den Knollen. SCP-02 erwies sich auch in den hier durchgeführten Tests als resistent gegenüber allen bisher getesteten Phytopthora infestans Pathotypen. Die Pathotypen, welche die differenziellen Kartoffellinien (R1-R11, R6 wurde noch nicht getestet) befallen konnten, haben bei SCP-02 keine Infektion auszulösen vermocht. Auch bei Inokulation mit einem Stammgemisch von mehr als 200 Isolaten blieb SCP-02 Symptom frei.

Inokuliert man hingegen Blattsegmente oder Kartoffelscheiben mit dem hochpathogenen Phytophthora- Stamm 90128 ist eine abweichende Reaktion zu beobachten. Es zeigen sich die typischen Symptome einer Phytophthorainfektion Die Blätter werden wässerig, riechen schlecht und zersetzen sich langsam, alles Symptome wie sie für eine Phytophthora- Infektion typisch sind. Im Unterschied zu einer die Kraut- und Wurzelfäule auslösenden Infektion wird jedoch im Fall der SCP-02 Kartoffel kein Myzel an der Oberfläche der Blattunterseite gebildet und der Pilz sporuliert nicht.

Ein ähnliches Bild entsteht bei einer Knolleninfektion. Auf der Knolle wird Myzel gebildet. Dieses wächst aber ballenförmig und sporuliert nicht. Der Pilz kann demnach wohl oberflächlich in die Pflanze eindringen, sich aber nicht weitervermehren und keine krankheitsversursachende Infektion auslösen.

Beispiel 3: Resistenzvererbung

Da die Kartoffel zur Selbstbestäubung fähig ist, wurden frisch geöffnete Blüten der SCP-02 Pflanze, deren Staubbeutel noch nicht geöffnet waren und ältere Blüten einer kommerziellen Sorte (Agria und Fontane) für die Vererbungsversuche verwendet. Die Blüten von Agria und Fontane wurden auf Kartoffelfeldern der Umgebung von Stein gesammelt.

Bei der eigentlichen Kreuzung wurden zuerst die Staubbeutel der Mutterpflanze aus der Blüte herausgeschnitten und dann mit einer Präparationsnadel Pollen der Vaterpflanze auf ihre Narbe übertragen. Die bestäubte Blüte wurde mit einem Papiersäckchen eingetütet um eine Mischbestäubung zu vermeiden. Nach etwa acht Wochen waren die gebildeten Früchte erntereif. Zusätzlich zu den gekreuzten Früchten wurden auch noch selbstbestäubte Früchte geerntet um die beiden Erbgänge zu vergleichen. Die Beeren wurden aufgeschnitten und zwei Tage lang in ihrem eigenen Saft inkubiert um die Keimfähigkeit der Samen zu erhöhen. Danach wurden die Samen ausgesät und die Pflänzchen aufgezogen. Sobald die Pflänzchen genug gross sind (nach ungefähr acht Wochen), werden sie auf ihre Resistenz gegenüber Phytophthora infestans getestet (gemäss oben beschriebener Methode). Die jeweilige Anzahl Pflanzen mit den verschiedenen Resistenzmerkmalen wird als Verhältnis angegeben und danach mit bestehenden Verhältnissen verglichen..

Die F1 Pflanzen können durch Einlagerung der gebildeten Knollen bzw durch Anlage von Meristemkulturen erhalten werden.

Testet man die durch Kreuzung entstandenen Nachkommen auf ihre Resistenzeigenschaften, splitten sich die Phänotypen in drei Gruppen auf. Es gibt resistente, vergleichbar mit SCP-02, HR sowie sensitive Phänotypen. Das Verhältnis dieser Phänotypen (6:58:1, bei der Kreuzung mit Fontane) lässt auf tetraploide Kreuzungspartner schliessen. (Genaue Daten siehe Anhang) Deren Erbgänge sind sehr schwer nachvollziehbar und die Phänotypenverteilung ist oft nicht logisch. Dies gilt vor allem, wenn die Kreuzungspartner heterozygot sind. Die durch Selbstbestäubung entstandenen F 1 Pflanzen sind allesamt resistent gegenüber dem Stamm 96, segregieren aber gegenüber einem Stammgemisch in sensitive und resistente Phönotypen. Die Morphologie ist jedoch stark unterschiedlich. Es gibt Zwerge und normal grosse Pflanzen mit unterschiedlicher Behaarung und Blattfarbe. Aufgrund des Selbstbestäubungsversuchs kann ausgeschlossen werden, dass die Resistenz rezessiv vererbt wird. Die Resistenz wird demnach dominant vererbt.


Anspruch[de]
Kartoffelpflanze, welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist. Kartoffelpflanze gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Merkmal der Resistenz durch Einkreuzen ein Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 (DSMZ 17671 mit Datum vom 22. April 2005) aufweist, erhältlich ist. Kartoffelpflanze gemäss Anspruch 2, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen enthält, eingekreuzt aus einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 (DSMZ 17671). aufweist. Kartoffelplanzen gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Merkmal sich dadurch ausprägt, dass der natürliche Infektionsverlauf von Phytophthora infestans unterbrochen ist, indem die Mycelbildung an der Blattunterseite sowie eine Sporulation unterbunden wird. Verfahren zur Einkreuzung einer Resistenz gegenüber Infektionen mit Phytophthora infestans in Kartoffelpflanzen, welche eine solche Resistenz nicht aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) eine Kreuzung einer Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSMZ 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze durchführt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen;

b) geeignete Massnahmen trifft, um eine Mischbestäubung zu vermeiden;

c) Samen aus den erntereifen Früchten isoliert und aussät;

d) Pflänzchen heranzieht und diese in einem geeigneten Testsystem auf Resistenz gegenüber Phytophthora infestans tested;

e) Pflanzen selektiert, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen.
Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die aus der Kreuzung resultierende F1 Hybriden, welche das Merkmal Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen, mit einem Elternteil ein- bis mehrfach rückgekreuzt werden. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem Elternteil um den Phytophthora sensitiven Elter handelt. Verfahren zur Herstellung einer Kartoffelpflanze welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora Infektionen aufweist, dadurch gekennzeichnet. dass man

a) eine Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSMZ 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze kreuzt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen;

b) geeignete Massnahmen trifft, um sowohl während als auch nach dem artifiziell durchzuführenden Bestäubungsvorgang eine Mischbestäubung zu vermeiden;

c) Samen der F1 Generation aus den erntereifen Früchten isoliert und aussät;

d) Pflänzchen heranzieht und diese auf Resistenz gegenüber Phytophthora infestans testet;

e) Phytophthora resistente Pflanzen mit dem Phytophthora anfälligen ein- bis mehrfach rückkreuzt;

f) in jeder auf diese Weise erhaltenen Rückkreuzungsgeneration die Pflanzen auf An- oder Abwesenheit des Resistenzmerkmals hin überprüft,

g) eine Pflanze heranzieht, welche das gewünschte Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora Infektionen ausprägt.






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