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Dokumentenidentifikation DE69434758T2 09.11.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000719335
Titel HYBRIDE TOXINE
Anmelder Syngenta Participations AG, Basel, CH
Erfinder BOSCH, Jan, Hendrik, NL-3572 ZM Utrecht, NL;
STIEKEMA, Johannes, Willem, NL-6708 BG Wageningen, NL
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69434758
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 01.09.1994
EP-Aktenzeichen 949275358
WO-Anmeldetag 01.09.1994
PCT-Aktenzeichen PCT/EP94/02909
WO-Veröffentlichungsnummer 1995006730
WO-Veröffentlichungsdatum 09.03.1995
EP-Offenlegungsdatum 03.07.1996
EP date of grant 07.06.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 09.11.2006
IPC-Hauptklasse C12N 15/32(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07K 14/325(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/82(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A01H 5/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A01N 63/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   
IPC additional class C12N 15/62  (2006.01)  A,  L,  N,  20051017,  B,  H,  EP

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridtoxinfragmente und sie umfassende Toxine, abgeleitet aus insektiziden Kristallproteinen von Bacillus thuringiensis.

Bacillus thuringiensis (nachfolgend B.t.) kann Proteine erzeugen, die sich intrazellulär als Kristalle anreichern. Diese Kristallproteine sind toxisch für eine Anzahl von Insektenlarven. Auf Basis der Sequenzhomologie und insektiziden Spezifität wurden Kristallproteine in unterschiedliche Klassen kategorisiert. Am besten untersucht ist die CryI-Klasse von Proteinen, die als Protoxine mit 140 kDa erzeugt werden und aktiv gegen Lepidoptera-Arten sind.

In einem gewissen Ausmaß wurde der Wirkungsmodus von Kristallproteinen aufgeklärt. Nach oraler Aufnahme lösen sich die Kristalle in der alkalischen Umgebung des Larvenmitteldarms. Die solubilisierten Proteine werden anschließend durch Mitteldarmproteinasen zu einem Proteinaseresistenten toxischen Fragment von ca. 65 kDa verarbeitet, das an Rezeptoren auf den Epithelzellen des Insekten-Mitteldarms bindet und die Zellmembran durchdringt. Dies führt schließlich zum Platzen der Zellen und Tod der Larven.

Honée et al. (Mol. Microbiology (1991), Bd. 5(11), Seiten 2799–2806) offenbart, daß die C-terminale Domäne des toxischen Fragments eines Bacillus thuringiensis-Kristallproteins die Rezeptorbindung bestimmt.

Das Aktivitätsspektrum eines besonderen Kristallproteins wird in einem hohem Ausmaß durch das Auftreten von Rezeptoren auf den Epithelzellen des Mitteldarms von anfälligen Insekten bestimmt. Das Spektrum wird gleichzeitig bestimmt durch die Effizienz der Solubilisierung des Kristallproteins und seine proteolytische Aktivierung in vivo.

Die Bedeutung der Bindung des Kristallproteins an Mitteldarm-Epithelrezeptoren wird ferner gezeigt, wenn Insekten Resistenz gegen eines der Kristallproteine entwickelt haben, indem die Bindung von Kristallproteinen an Mitteldarm-Epithelzellen in resistenten Insekten signifikant reduziert ist.

Es wird angenommen, daß toxische Fragmente von Kristallproteinen aus drei besonderen strukturellen Domänen zusammengesetzt sind. Domäne I, die am stärksten N-terminale Domäne, besteht aus sieben &agr;-Helizes. Domäne II umfaßt drei &bgr;-Faltblätter, und Domäne III (die am meisten C-terminale Domäne) faltet sich zu einem &bgr;-Sandwich. Bei Projektion auf CryI-Sequenzen läuft Domäne I etwa von den Aminosäureresten 28 bis 260, Domäne II von ca. 260 bis 460 und Domäne III von ca. 460 bis 600.

Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridkristallproteine, die insbesondere CryIC und CryIE oder CryIA involvieren. Die Nukleotidsequenz des CryIC-Gens aus B.t. ssp. entomocidus 60.5 ist in SEQ ID NO:1 angegeben, und die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die Nukleotidsequenz codiert wird, ist in SEQ ID NO:2 angegeben. Die Nukleotidsequenz des CryIE-Gens aus B.t. ssp. kenyae F4I ist in SEQ ID NO:3 angegeben, und die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die Nukleotidsequenz codiert wird, ist in SEQ ID NO:4 angegeben. Diese Proteine sind toxisch für Lepidoptera-Arten aber innerhalb dieser Ordnung von Insekten hat jedes Protein eine unterschiedliche Spezifität. CryIC ist besonders aktiv gegen S. exigua und M. brassicae.

Die vorliegende Anmeldung offenbart ein B.t.-Hydridtoxin, das an seinem C-Terminus Domäne III eines ersten Cry-Proteins oder einen Teil der Domäne oder ein der Domäne im wesentlichen ähnliches Protein umfaßt, mit der Maßgabe, daß die N-terminale Region des Fragments die N-terminale Region eines zweiten Cry-Proteins oder eines Teils der Region oder eines mit der Region im wesentlichen ähnlichen Proteins ist. Ein bevorzugtes Fragment ist eines, das nicht an den CryIC-Bindungsort in einem Insektendarm bindet, wenn es an seinem C-Terminus Domäne III von CryIC oder einen Teil der Domäne oder ein der Domäne im wesentlichen ähnliches Protein umfaßt; oder eines, das nicht an einen CryIA-Bindungsort bindet, wenn es an seinem C-Terminus Domäne III von CryIA oder einen Teil der Domäne oder ein der Domäne im wesentlichen ähnliches Protein umfaßt.

Erfindungsgemäß wird ein insektizides Bacillus thuringiensis-(Bt)-Hybridtoxin bereitgestellt, das an seinem C-Terminus Domäne III eines CryIC-Proteins oder einen funktionell äquivalenten Teil von und an seinem N-Terminus Domänen I und II eines zweiten CryI-Proteins umfaßt, das aus er Gruppe ausgewählt ist, die aus CryIA, CryIB, CryID, CryIE, CryIE, CryIG und CryIH besteht, worin die Domäne III von CryIC oder der Teil davon dem Hybridtoxin volle Aktivität für S. exigua und M. brassicae verleiht.

Mit im wesentlichen ähnlich sind reine Proteine mit einer Aminosäuresequenz gemeint, die zumindest 75 % ähnlich der Sequenz des erfindungsgemäßen Proteins ist. Es ist bevorzugt, daß der Ähnlichkeitsgrad zumindest 85 % ist, besonders bevorzugt, daß der Ähnlichkeitsgrad zumindest 90 % ist, und noch mehr bevorzugt, daß der Ähnlichkeitsgrad zumindest 95 % ist.

Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung haben zwei Aminosäuresequenzen mit wenigstens 75, 85, 90 oder 95 % Ähnlichkeit zueinander wenigstens 75, 85, 90 oder 95 % identische oder konservativ ausgetauschte Aminosäurereste in einer gleichen Position bei optimaler Angleichung, die bis zu 6 Lücken erlaubt, mit der Maßgabe, daß in bezug auf die Lücken insgesamt nicht mehr als 15 Aminosäurereste betroffen sind. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung können konservative Austauschungen zwischen Aminosäuren innerhalb der folgenden Gruppen vorgenommen werden:

  • (i) Serin und Threonin;
  • (ii) Glutaminsäure und Asparaginsäure;
  • (iii) Arginin und Lysin;
  • (iv) Asparagin und Glutamin;
  • (v) Isoleucin, Leucin, Valin und Methionin;
  • (vi) Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan;
  • (vii) Alanin und Glycin,
mit der Maßgabe, daß in SEQ ID NO:6 Ser und Tyr konservative Austauschungen in Position 620 sind und Ala und Glu konservative Austauschungen in Position 618 sind; und daß in SEQ ID NO:8 Ser und Tyr konservative Austauschungen in Position 627 sind und Ala und Glu konservative Austauschungen in Position 625 sind.

Mit "Teil" eines Proteins ist ein Peptid gemeint, das von dem Protein umfaßt ist und wenigstens 80 % der konsekutiven Sequenz davon aufweist.

Mit "Bindungsort" ist ein Ort auf einem Molekül gemeint, worin die Bindung zwischen dem Ort und dem Toxin reversibel ist, so daß der Ka-Wert zwischen dem Ort und dem Toxin in der Größenordnung von wenigstens 104 dm3 mol–1 ist.

Ein Toxinfragment kann an seinem N-Terminus die N-terminale Region eines insektiziden Proteins aus B.t. umfassen, das allgemein als "Cry" oder "Cyt" bekannt ist, einschließlich: CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c), CryIB, CryIC, CryID, CryIE, CryIF, CryIG, CryIH, CryIIA, CryIIB, CryIIC, CryIIIA, CryIIIB, CryIIIB(b), CryIVA, CryIVB, CryIVC, CryIVD, CYTA, CryXI(IIIC), CryX2(IIID), CryX3, CryV und CryX4; oder einen Teil der Region oder ein im wesentlichen der Region ähnliches Protein, und daß der C-Terminus des Fragments Domäne III von CryIC oder ein Teil der Domäne oder ein der Domäne im wesentlichen ähnliches Protein ist.

Somit kann das Toxin Domäne II von CryIE, CryIB, CryID oder CryIA oder einen Teil der Domäne oder ein der Domäne im wesentlichen ähnliches Protein und Domäne III von CryIC oder einen Teil der Domäne III oder ein der Domäne III im wesentlichen ähnliches Protein umfassen. Es ist insbesondere bevorzugt, daß das Fragment Domänen I und II von CryIE, CryIB, CryID oder CryIA oder einen Teil davon oder ein den Domänen im wesentlichen ähnliches Protein und Domäne III von CryIC oder einen Teil davon oder ein der Domäne III im wesentlichen ähnliches Protein umfaßt.

Es ist höchst bevorzugt, daß das Toxin eine Region an seinem C-Terminus umfaßt, die die Sequenz von Aminosäureposition 454 bis Position 602 von CryIC oder eine der Sequenz im wesentlichen ähnliche Sequenz umfaßt. Das Fragment kann eine Region an seinem C-Terminus umfassen, die die Sequenz von Aminosäureposition 478 bis 602 von CryIC oder eine der Sequenz im wesentlichen ähnliche Sequenz umfassen, mit der Maßgabe, daß dann, wenn die Sequenz, die Aminosäuren 478 bis 602 von CryIC umfaßt, direkt an den C-Terminus von Domäne II von CryIA, CryIB, CryID oder CryIE fusioniert ist, die Faltung des Fusionsprodukts zufriedenstellend ist, um eine insektizide Komponente des Toxins zu liefern. Der Fachmann wird erkennen, daß es notwendig sein kann, eine Peptidregion zum C-Terminus von Domäne II hinzuzufügen, der die C-terminale Region von CryIC beabstandet, wodurch seine Faltung in einer solchen Weise ermöglicht wird, um insektizide Aktivität auszuüben.

Es ist insbesondere höchst bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Hybridtoxin entweder:

  • i) eine Aminosäuresequenz von ca. Aminosäure 1 bis ca. Aminosäure 620 in SEQ ID NO:6 oder eine Aminosäuresequenz von ca. Aminosäure 1 bis ca. Aminosäure 630 in SEQ ID NO:6, worin in bezug auf die Sequenz wenigstens eine der folgenden Veränderungen vorhanden ist:

    Ile an Position 609 ist durch Leu ersetzt;

    Ala an Position 618 ist durch Glu ersetzt;

    Ser an Position 620 ist durch Tyr ersetzt, oder
  • ii) eine Aminosäuresequenz von ca. Aminosäure 1 bis ca. Aminosäure 627 SEQ ID NO:8 oder einer Aminosäuresequenz von ca. Aminosäure 1 bis ca. Aminosäure 627 in SEQ ID NO:8 umfaßt, worin in bezug auf die Sequenz wenigstens eine der folgenden Veränderungen vorhanden ist:

    Ile an Position 616 ist durch Leu ersetzt;

    Ala an Position 625 ist durch Glu ersetzt;

    Ser an Position 627 ist durch Tyr ersetzt.

Unabhängig davon, welche Aminosäureveränderungen erlaubt sind, ist jedoch einer oder mehrere der folgenden Reste – angegeben sequenzweise in bezug auf die CryIC-Sequenz – invariabel: Phe (501); Val (478); Trp (979) und Thr (486).

Die vorliegende Anmeldung offenbart ferner rekombinante DNA, die eine Sequenz umfaßt, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der oben offenbarten Hybridtoxine codiert. Die vorliegende Erfindung offenbart ferner rekombinante DNA, die die Sequenz von ca. Nukleotid 1 bis ca. Nukleotid 1860 umfaßt, angegeben in SEQ ID NO:5, oder dazu ähnliche DNA, die ein im wesentlichen ähnliches Protein codiert, oder rekombinante DNA, die die Sequenz von ca. Nukleotid 1 bis ca. Nukleotid 1881 in SEQ ID NO:7 umfaßt, oder dazu ähnliche DNA, die ein im wesentlichen Protein codiert.

Mit ähnlicher DNA ist eine Testsequenz gemeint, die mit der erfinderischen rekombinanten Sequenz hybridisieren kann. Wenn die Test- und erfinderischen Sequenzen doppelsträngig sind, hat die die Testsequenz darstellende Nukleinsäure bevorzugt einen TM-Wert innerhalb 20°C dessen der erfinderischen Sequenz. Für den Fall, daß die Test- und erfinderischen Sequenzen zusammen vermischt und gleichzeitig denaturiert werden, sind die TM-Werte der Sequenzen bevorzugt innerhalb von 10°C zueinander. Besonders bevorzugt wird die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt, wobei bevorzugt entweder die Test- oder erfinderische DNA geträgert ist. Somit wird entweder eine denaturierte Test- oder erfinderische Sequenz bevorzugt zuerst an einen Träger gebunden, und die Hybridisierung wird für einen angegebenen Zeitraum bei einer Temperatur zwischen 50 und 70°C in einer doppelt konzentrierten citratgepufferten Kochsalzlösung bewirkt, die 0,1 % SDS enthält, gefolgt von Spülen des Trägers bei der gleichen Temperatur, aber mit einem Puffer mit einer reduzierten SC-Konzentration. Abhängig vom erforderlichen Stringenzgrad und somit dem Ähnlichkeitsgrad der Sequenzen sind solche Puffer mit reduzierter Konzentration typischerweise einfach konzentriertes SC, das 0,1 % SDS enthält, halbkonzentriertes SC, das 0,1 % SDS enthält, und 1/10 konzentriertes SC, das 0,1 % SDS enthält. Sequenzen mit dem größeren Ähnlichkeitsgrad sind diejenigen, deren Hybridisierung am wenigsten durch Waschen in Puffern reduzierter Konzentration beeinflußt wird. Es ist höchst bevorzugt, daß die Test- und erfinderischen Sequenzen so ähnlich sind, daß die Hybridisierung zwischen ihnen im wesentlichen unbeeinflußt durch Waschen oder Inkubation in einem 1/10 konzentrierten Natriumcitratpuffer ist, der 0,1 % SDS enthält.

Die rekombinante DNA kann ferner ein Protein mit Herbizidresistenz, pflanzenswachstumsfördernden, Antipilz-, antibakteriellen, antiviralen und/oder Anti-Nematoden-Eigenschaften codieren. Für den Fall, daß die DNA in einen heterologen Organismus eingeführt werden soll, kann sie modifiziert werden, um bekannte mRNA-Instabilitätsmotive (wie AT-reiche Regionen) und Polyadenylierungssignale zu entfernen, und/oder Codonen, die bevorzugt durch den Organismus sind, in den die rekombinante DNA inseriert werden soll, können verwendet werden, so daß die Expression der so modifizierten DNA im Organismus im wesentlichen ähnliches Protein zu demjenigen liefert, das durch Expression der unmodifizierten rekombinanten DNA im Organismus erhalten wird, in dem die Protein-Komponenten des Hybridtoxins oder der Toxinfragmente endogen sind.

Die vorliegende Anmeldung offenbart ferner eine DNA-Sequenz, die komplementär zu einer ist, die unter stringenten Bedingungen mit der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA hybridisiert.

Auch offenbart in der vorliegenden Erfindung werden: ein Vektor, der eine solche rekombinante (oder dazu komplementäre) DNA-Sequenz enthält; eine Pflanze oder ein Mikroorganismus, die/der solche DNA einschließt und deren Expression ermöglicht; mit solcher DNA transformierte Pflanzen; die Nachkommenschaft solcher Pflanzen, die die stabil aufgenommene und in einer Mendelschen Weise vererbbare DNA enthalten, und/oder die Samen solcher Pflanzen und solcher Nachkommenschaft.

Die vorliegende Anmeldung offenbart ferner aus der Expression der DNA stammendes Protein und insektizides Protein, das durch Expression der rekombinanten DNA innerhalb von damit transformierten Pflanzen erzeugt wird.

Die Erfindung schließt ferner eine insektizide Zusammensetzung ein, die ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Hybridtoxine enthält; ein Verfahren zum Bekämpfen von Insekten, das deren Inkontaktbringen mit solchen Toxinen oder Zusammensetzungen umfaßt, und ein Extraktionsverfahren zum Erhalten von insektiziden Proteinen aus organischem Material, das sie enthält, umfassend das Unterwerfen des Materials dem Aufquellen und der Lösungsmittelextraktion.

Die Erfindung wird ferner aus der folgenden Beschreibung ersichtlich werden, die die Herstellung von erfindungsgemäßen B.t.-Hybridtoxinen beschreibt, herangezogen in Verbindung mit den assoziierten Zeichnungen und Sequenzprotokollen.

1 zeigt die Erzeugung von Hybridkristallprotein-Genen über eine in vivo-Rekombination. Tandemplasmide (pBD560 und pBD650), die zwei trunkierte Kristallproteingene in direkter Repeat-Orientierung tragen, werden konstruiert. Dem 5' befindlichen Gen (leerer Balken) fehlt die Protoxin-codierende Region (ausgefüllter Balken), und im 3' befindlichen Gen (gestrichelter Balken) ist ein Teil der die Domäne I codierenden Region deletiert. In-vivo-Rekombination zwischen homologen Regionen (Domäne II und III) erfolgt in recA + Stamm JM101. Selektion gegen Nicht-Rekombinanten durch Verdau mit NotI und BamHI und anschließende Transformation führt zu Sätzen von Plasmiden, die Hybridkristallprotein codieren.

2 zeigt die Angleichung der Aminosäurereste 420 bis 630 von CryIE und CryIC. Die Grenze zwischen Domäne n und in ist angegeben. Nur Aminosäurereste von CryIC, die sich von CryIE unterscheiden, sind angegeben, identische Reste sind mit einem Punkt angegeben. Die Positionen der Überkreuzung (G27, H13, H7, H8, H17 und H21) in den erfindungsgemäßen CryIE-CryIC-Hybridtoxinfragmenten sind in der Figur angegeben.

3 zeigt die Angleichung der Aminosäurereste 420 bis 630 von CryIE und CryIC. Die Grenze zwischen Domäne II und in ist angegeben. Nur die Aminosäurereste von CryIC, die sich von CryIE unterscheiden, sind dargestellt, identische Reste sind mit einem Punkt angegeben. Die Positionen der Überkreuzung (F59, F71, F26 und E7) in den CryIC-CryIE-Hybridtoxinfragmenten sind in der Figur angegeben.

4 zeigt die Ergebnisse einiger heterologer Konkurrenzexperimente. Biotinyliertes CryIC (Feld A) und G27 (Feld B) werden mit S. exigua-BBMV-Vesikeln in Abwesenheit (Bahnen a) oder Gegenwart eines Überschusses von unmarkiertem Protein wie angegeben inkubiert. Nach der Inkubation werden die Vesikel gewaschen, auf ein SDS-Polyacrylamidgel geladen und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Biotinylierte Kristallproteine, die mit den Vesikeln erneut isoliert werden, wurden unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase-Konjugat visualisiert und sind in der Figur mit einem Pfeilkopf angegeben.

5 zeigt die Plasmidkarte von pSB456, das das G27-Hybridtoxinfragment codiert und zur Transformation des Kristalltoxins minus Stamm B.t. 51 verwendet wird.

SEQ ID NO:1 zeigt die Nukleotidsequenz des CryIC-Gens aus B.t. ssp. entomocidus 60.5.

SEQ ID NO:2 zeigt die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch das in SEQ ID NO:1 gezeigte CryIC-Gen codiert wird.

SEQ ID NO:3 zeigt die Nukleotidsequenz des CryIE-Gens aus B.t. ssp. kenyae 4FI.

SEQ ID NO:4 zeigt die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch das in SEQ ID NO:3 gezeigte CryIE-Gen codiert wird.

SEQ ID NO:5 zeigt die Nukleotidsequenz, die ein bevorzugtes erfindungsgemäßes CryIE/CryIC-B.t.-Hybridtoxinfragment codiert.

SEQ ID NO:6 zeigt die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die in SEQ ID NO:5 gezeigte Nukleotidsequenz codiert wird.

SEQ ID NO:7 zeigt die Nukleotidsequenz eines erfindungsgemäßen CryIA/CryIC-Hybridtoxinfragments.

SEQ ID NO:8 zeigt die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die in SEQ ID NO:7 dargestellte Nukleotidsequenz codiert wird.

Produktion von Plasmiden, die Hybridtoxinfragmente codieren

Bei der Herstellung von Plasmiden, die die CryIC- oder CryIE-Gene tragen, wird Escherichia coli XLI-blue (Stratagene Inc.) als Plasmidwirt verwendet, ausgenommen in den Fällen, in denen JM101 als recA+-Hintergrund verwendet wird. Ein Vektor zur Expression von Kristallproteinen in E. coli stammt aus pKK233-2 (Pharmacia LKB Biotechnology). Die Größe von pKK233-2 wird durch Deletieren eines EcoRI-PuvII-Fragments reduziert, das das Gen trägt, das Tetracyclinresistenz codiert. Anschließend wird ein XhoI-Linker mit 6 bp in den HindIII-Ort ligiert, was zu pBD10 führt. Plasmid BK+ wird durch Insertion eines BglII-Linkers in den SacI-Ort von Bluescript SK+ (Stratagene Inc.) geschaffen. Der Polylinker von BK+ aus BglII bis XhoI wird zwischen den NcoI-XhoI-Ort in pBD10 eingeführt. Der resultierende Expressionsvektor pBD11 enthält den hochexprimierten trc-Promotor, den lacZ-Ribosombindungsort und das ATG-Startcodon. Das Startcodon überlappt mit einem NcoI-Ort und wird gefolgt vom Polylinker, um Insertionen in den Vektor zu erleichtern. Die Transkription wird durch den rrnB-Transkriptionsterminator beendet.

Die Klonierung der CryIC- und CryIE-Gene aus B.t. ssp. entomocidus 60.5 bzw. kenya 4F1 ist wie zuvor beschrieben (Honée et al., 1990 (Appl. Environ. Microbiol. 56, S. 823–825); Visser et al., 1990 (J. Bacteriol. 172, S. 6783–6788)). Für Klonierungszwecke wird ein NcoI-Ort, der mit dem Startcodon von CryIC überlappt, durch In-vitro-Mutagenese geschaffen. Ein BglII-Ort wird direkt stromabwärts des Translationsterminationscodons von CryIC durch ortsgerichtete Mutagenese geschaffen, was zur Sequenz ATAAGATCTGTT (Stoppcodon unterstrichen) führt. Das NcoI-BglII-Fragment, das die CryIC-codierende Region enthält, wird in pBD11 ligiert, was zum CryIC-Expressionsplasmid pBD150 führt. pBD155 ist ein Derivat von pBD150, in dem die Polylinkersequenzen 3' von CryI deletiert sind.

Ein DraI-Fragment aus pEM14 (Visser et al., 1990), das das vollständige CryIE-Gen enthält, wird in den EcoRV-Ort von SK+ kloniert, was zu Plasmid pEM15 führt. Anschließend wird ein NcoI-Ort durch ortsgerichtete Mutagenese am Startcodon des Gens eingeführt, und CryIE wird als NcoI-XhoI-Fragment auf pBD11 übertragen, was zu CryIE-Expressionsplasmid pBD160 führt.

Plasmide, die nur toxisches Fragment codierende Regionen der CryI-Gene tragen, werden konstruiert. BglII-Linker werden an XmnI-Orte ligiert, die bei Basenposition 1835 von CryIC vorhanden sind, und an den HgiAI-Ort bei Position 1839 von CryIE. Anschließend werden NcoI-BglII-Fragmente, die die toxisches Fragment codierenden Regionen von CryIC (1835 bp) und CryIE (1839 bp) enthalten, in pBD11 ligiert, was zu pBD151 bzw. pBD161 wie unten beschrieben führt.

Für die Erzeugung von CryIC-CryIE-Hybridgenen verwendete Tandemplasmide werden wie folgt konstruiert. BamHI-Linker werden an mit HpaI verdautes pBD160 ligiert. Diese DNA wird mit BamHI und XhoI inkubiert, und das trunkierte CryIE-Gen, das ab bp 704 läuft, wird in pBD151 ligiert, was zu pBD560 führt. Zur Konstruktion eines Tandemplasmids zur Erzeugung von CryIE-CryIC-Hybriden wird pBD155 mit NsiI und XhoI verdaut. Das Fragment, das das trunkierte CryIC-Gen trägt, das ab bp 266 läuft, wird in PstI/XhoI-verdautes pBD161 ligiert, was zu Plasmid pBD650 führt. Aufgrund von Polylinkersequenzen sind besondere NotI- und BamHI-Restriktionsorte zwischen den trunkierten CryI-Genen vorhanden, die in den Tandemplasmiden pBD560 und pBD650 vorhanden sind.

DNA-Manipulationen und Konstruktion von Hybridtoxinen

Alle rekombinanten DNA-Techniken sind wie von Sambrook et al. 1989 beschrieben (in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour), DNA-Sequenzierung wird durch das Didesoxytriphosphat-Verfahren mit Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt, die an die Didesoxynukleotide gebunden sind. Die Analyse wird unter Verwendung eines Applied Biosystems 370A Nukleotidsequenzanalysators automatisiert.

Die zwischen CryI-Genen vorhandene Homologie erlaubt die intramolekulare Kombination in vivo. Zwei Tandemplasmide werden geschaffen, die jeweils zwei trunkierte Kristallproteingene tragen, die nur in Domänen II und III überlappen. Deshalb erfolgt die Rekombination nur in Regionen, die Domänen II und III codieren. Rekombinationen im Raster, die durch Restriktionsenzymverdau selektiert werden können, erzeugen Plasmide, die Hybridprotoxine voller Größe mit 140 kDa exprimieren. Zur Erzeugung von Rekombinanten in vivo wird ein Tandemplasmid (entweder pBD560 oder pBD650; (2) auf JM101 übertragen. 5 &mgr;g DNA werden aus unabhängig erzeugten Rekombinanten isoliert und mit NotI und BamHI verdaut, wobei zwischen den zwei trunkierten CryI-Genen geschnitten wird, um gegen Nicht-Rekombinanten zu selektieren, und die DNA wird auf E. coli XL1-blue transformiert. 5 einzelne Kolonien werden kultiviert, und Proteinmuster und Plasmidgehalt werden analysiert.

CryIC-CryIE- und CryIE-CryIC-Hybridtoxine werden unter Verwendung der Tandemplasmide pBD560 bzw. pBD650 erzeugt, die man in einem recA+-Hintergrund rekombinieren läßt, DNA wird isoliert, verdaut und auf recA-Stamm wie oben beschrieben übertragen.

100 Kolonien von 20 unabhängigen Experimenten werden an SDS-PAGE analysiert. 85 % dieser Klone erzeugen ein 140 kDa-Protein, was Rekombinationen im Raster zwischen CryIC und CryIE bzw. CryIE und CryIC anzeigt. In E. coli werden CryI-Proteine als Kristalle erzeugt, die in vitro bei hohem pH solubilisiert werden können. Ca. 15 % der wie oben erzeugten Hybridtoxine werden bei hohem pH solubilisiert. Die Rekombinanten, die lösliche Hybridtoxine erzeugen, werden zuerst unter Verwendung von Restriktionsenzymen klassifiziert, anschließend wird für jede Klasse der Überkreuzungspunkt der selektierten Hybride durch DNA-Sequenzanalyse bestimmt. Alle Überkreuzungen, die zu löslichen Hybridtoxinen führten, erfolgen in oder sehr nahe zu Domäne III.

Protein-Reinigung und -Analyse

Kristallproteine werden im wesentlichen wie von Convents et al. beschrieben isoliert (J. Biol. Chem. 265, S. 1369–1375; Eur. J. Biochem., 195, S. 631–635). Kurz gesagt wird rekombinantes E. coli bei 30°C in 250 ml TB-Medium auf einen OD660-Wert von 10–15 kultiviert. Aus dem E. coli-Lysat isolierte Kristalle werden während der Inkubation für 2 h in 20 mM Na2CO3, 10 mM Dithiothreit, 100 ml NaCl, pH 10 bei 37°C solubilisiert. Der pH der Lösung wird auf 8 mit Tris-HCl abgesenkt und mit Trypsin inkubiert. Die Toxinlösung wird gegen 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl pH 9 dialysiert. Anschließend wird das Toxinfragment an einer Mono Q 5/5-Säule gereinigt, die mit einem Fast-Protein-Flüssigchromatographie-(FPLC)-System (Pharmacia LKB Biotechnology) verbunden ist. Proteine werden durch 7,5 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen getrennt.

Biochemische Analyse und Isolierung von toxischen Fragmenten mit 65 kDa

Isolierte Kristalle aus gereinigtem CryIC, CryIE und die Hybridproteine werden bei hohem pH solubilisiert und mit Trypsin inkubiert. Wie CryIC und CryIE werden alle löslichen Hybridtoxine mit Überkreuzungen in Domäne III zu stabilen 65 kDa-Fragmenten umgewandelt. Die 65 kDa-Fragmente können unter Verwendung von Anionenaustauschchromatographie unter ähnlichen Bedingungen wie die Mutterproteine gereinigt werden. Hybride F59 und F71, die Überkreuzungen in Domäne II haben, werden vollständig durch Trypsin abgebaut. Obwohl diese Hybride nicht als unlösliche Aggregate ausfallen, können in den Mutterproteinen verborgene Trypsin-Spaltorte offensichtlich für Trypsin freigelegt werden. Wegen dieses Phänomens werden keine 65 kDa-Fragmente aus F59 und F71 isoliert.

Tabelle 1 zeigt den Aufbau von 5 CryIE-CryIC-Hybridtoxinen (G27; H8; H17; H7 und H21) und 4 CryIC-CryIE-Hybridtoxinen (F59; F71; F26; E7) mit Verweis auf die CryIC- und CryIE-Proteine, aus denen sie stammen. Die Aminosäuresequenzen der CryIE-CryIC-Toxine, die die erfindungsgemäßen toxischen Fragmente umfassen, laufen bis Aminosäure 1189 des CryIC-Mutterproteins. Die Aminosäuresequenzen der CryIC-CryIE-Hybridtoxine laufen bis Aminosäure 1171 des CryIE-Mutterproteins. Tabelle 1 zeigt auch die relative insektizide Wirksamkeit dieser verschiedenen Hybridtoxine in bezug auf die CryIC- und CryIE-Proteine.

Tabelle 1. Aufbau und Toxizität von Hybridtoxinen in bezug auf die Mutterproteine. Die meisten Bioassays wurden mit gereinigten Toxinfragmenten durchgeführt. Im Fall von CryIC laufen diese von ca. Aminosäure 28 bis ca. Aminosäure 627, und im Fall von CryIE bis 612. Die Länge der vollständigen Protoxine ist in Klammern angegeben.

Insektentoxizitätstests und insektizide Aktivität von CryI/CryIE-Hybridgenprodukten

Bakterielle Kulturen werden auf einen OD660-Wert von 6,0 auf konzentriert, und 100 &mgr;l werden auf 2 cm2 von künstlicher Nährlösung in einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen plaziert. Alternativ werden verdünnte Proben von gereinigten Toxinen auf die Nährlösung aufgetragen. Larven der zweiten Erscheinungsform von entweder S. exigua, M. brassicae oder M. sexta werden auf dieser Nährlösung (16 pro Probenverdünnung) für 5 Tage gefüttert, worauf das Larvengewicht bewertet wird. Das relative Wachstum (EC50, die Konzentration, die 50 % Wachstumsreduzierung ergibt) wird durch Berechnung des Verhältnisses zwischen dem mittlerem Gewicht der Larven, die auf mit Toxin ergänzter Nährlösung gezüchtet wurden, und dem mittleren Gewicht von Kontrollarven bestimmt, die auf einer Nährlösung ohne Toxin gezüchtet wurden. M. sexta-Eilagen werden von Carolina Biological Supply Company, North Carolina, US geliefert.

Die durch die Hybridgenprodukte codierten toxischen Fragmente werden auf Aktivität gegen drei unterschiedliche Insektenarten wie oben beschrieben getestet. M. sexta ist anfällig für sowohl CryIC als auch CryIE. Wie aus ihrer Empfindlichkeit gegenüber Trypsin vorhergesehen werden kann, sind die Hybride F59 und F71 nicht aktiv gegen dieses Insekt (Tabelle 1). Obwohl H7 durch Trypsin zu stabilen 65 kDa-Proteinen umgewandelt wird, ist es nicht toxisch für M. sexta. Alle anderen in Tabelle 1 angegebenen Hybride sind toxisch und sind offensichtlich in der nativen, biologisch aktiven Konformation.

Das 65 kDa-Fragment von CryIC ist hochtoxisch für S. exigua und M. brassicae, wohingegen CryIE nicht toxisch ist. G27 (Tabelle 1; 2), ein CryIE-CryIC-Hybrid mit einer Überkreuzung an der Verbindung von Domäne II und III, ist aktiv für beide Insekten. Dies zeigt, daß Domäne III von CryIC volle Aktivität für S. exigua und M. brassicae verleiht. Hybrid H8, das sich in nur drei Aminosäureresten (siehe 3) von G27 unterscheidet, ist nicht aktiv gegen S. exigua und M. brassicae, obwohl es aktiv gegen M. sexta ist.

F26 (Tabelle 1, 3), das reziproke Hybrid von G27, in dem Domäne III von CryIC gegen Domäne III von CryIE ausgetauscht wurde, ist nicht aktiv gegen S. exigua oder M. brassicae. Obwohl das Protein toxisch für M. sexta ist, sind die CryIC-Sequenzen, die von Aminosäure 28–462 laufen, offensichtlich nicht ausreichend, um S. exigua und M. brassicae abzutöten. Nur wenn CryIC-Sequenzen bis zu Aminosäurerest 602 im Hybrid vorhanden sind (E7), wird insektizide Aktivität gegen diese Insekten wiederhergestellt.

Die vorliegende Offenbarung zeigt, daß Aminosäurereste von 478–602 von CryIC hohe insektizide Aktivität auf CryIE gegen S. exigua und M. brassicae übertragen können.

Biotinylierung von Kristallproteinen und Bindungsassays

Die Biotinylierung wird unter Verwendung von Biotin-N-hydroxysuccinimidester im wesentlichen wie vom Hersteller (Amersham) beschrieben durchgeführt. 1 mg Kristallprotein wird mit 40 &mgr;l Biotinylierungsreagens in 50 mM NaHCO3, 150 mM NaCl pH 8 für 1 Stunde bei 20°C inkubiert. Die Lösung wird auf eine Sephadex 25-Säule aufgetragen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde, der 0,1 % BSA enthält, um ungebundenes Biotin zu entfernen, und Proben der Fraktionen werden auf eine Nitrocellulose-Membran getüpfelt. Fraktionen, die biotinylierte Kristallproteine enthalten, werden unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Amersham) visualisiert, das die Oxidation von Luminol katalysiert, was zu Chemilumineszenz führt (ECL, Amersham), und vereinigt.

Membranvesikel mit Bürstensaum werden wie von Wolfersberger et al. (1987) beschrieben isoliert (Comp. Biochem. Physiol. 86a, S. 301–308), außer daß die Vesikel ein weiteres Mal mit Isolierungspuffer gewaschen werden, der 0,1 % Tween 20 enthält. Die Bindung von biotinylierten Kristallproteinen an Membranvesikel mit Bürstensaum (100 &mgr;g/ml) wird in 100 &mgr;l PBS durchgeführt, das 1 % BSA, 0,1 % Tween 20 enthält (pH 7,6). Vesikel (20 &mgr;g Vesikelprotein) werden mit 10 ng biotinylierten Kristallproteinen in Gegenwart oder Abwesenheit eines 1000-fachen Überschusses von unmarkierten Kristallproteinen für 1 Stunde bei 20°C inkubiert. Anschließend werden die Vesikel durch Zentrifugieren für 10 min bei 14 000 g in eine Eppendorf-Zentrifuge erneut isoliert, zweimal mit Bindungspuffer gewaschen, in Probenpuffer resuspendiert, durch Erwärmen denaturiert und auf 7,5 % Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach Elektrophorese werden Proteine auf Nitrocellulosemembranen geblottet, und biotinylierte Kristallproteine, die mit den Vesikeln erneut isoliert werden, werden durch Inkubation der Nitrocellulose mit Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Amersham) visualisiert, das die Oxidation von Luminol katalysiert, was zu Chemilumineszenz führt (ECL, Amersham).

Da die Bindung an Darmepithelzellen ein Schlüsselschritt im Wirkungsmodus von Kristallproteinen ist, wird die Bindung von Kristallproteinen an Bürstensaum-Membranvesikel von S. exigua in heterologen kompetitiven Experimenten untersucht. Die kompetitiven Experimente zeigen, daß die Bindung von markiertem CryIC (4A, Bahn a) und markiertem F26 (nicht gezeigt) durch einen Überschuß von sowohl unmarkiertem CryIC (Bahn b) oder F26 (Bahn e) geschlagen werden kann, aber nicht mit einem Überschuß von G27 (Bahn c) oder CryIE (Bahn d). Außerdem kann die Bindung von markiertem G27 (4B, Bahn a) und markiertem CryIE (nicht gezeigt) durch einen Überschuß von G27 (Bahn b) oder CryIE (Bahn d) geschlagen werden, aber nicht mit einem Überschuß von CryIC (Bahn a) oder F26 (Bahn e). Aus diesen Ergebnissen wird geschlossen, daß G27 und CryIE die gleichen Bindungsorte auf Mitteldarmmembranen aus S. exigua erkennen und daß sich diese Orte von denjenigen unterscheiden, die durch CryIC und F26 erkannt werden. Die Toxizität- und Bindungsassays in Kombination zeigen, daß G27 so toxisch wie CryIC ist, aber daß es einen davon verschiedenen Rezeptor bindet. Da Insekten Resistenz gegen ein Kristallprotein durch Veränderung der Rezeptorbindungseigenschaften entwickeln können, kann G27 in Resistenzhandhabungsprogrammen als Alternative zu CryIC verwendet werden.

Expression von CryIE/CryIC-Hybridtoxingenen in heterologen Systemen

Das G27 CryIE/CryIC-Hybridtoxingen wird in E. coli exprimiert, und das Genprodukt weist zumindest die gleiche Insektizide Aktivität (zumindest gegen Spodoptera) wie CryIC auf. Außerdem weist das Produkt eine erhöhte Aktivität bei Expression in einem Bacillus thuringiensis-Stamm auf (siehe unten). Das Gen, das das G27-Hybridtoxin codiert, wird in ein geeignetes Shuttle-Vektorsystem eingeführt, das dann in einen geeigneten B.t.-Wirt eingeführt wird. Solche transformierten Zellen werden dann kultiviert, und das resultierende Toxin aus sowohl Vollkulturen als auch gereinigten Kristallen wird auf insektizide Aktivität getestet.

Konstruktion eines G27-haltigen Shuttle-Vektors, Transformation von B.t. 51 und Reinigung von Toxinprotein daraus

Das Gen, das Hybrid G27 codiert (3,4 kbp), wird aus einem pKK233 E. coli-Expressionsplasmid unter Verwendung von NcoI und XhoI gespalten. Der XhoI-Ort wird unter Verwendung des Klenow-Fragments von E. coli-DNA-Polymerase I aufgefüllt. Das resultierende Fragment wird an NcoI/SmaI-verdautes pSB635 ligiert (pBluescriptKS+, PcryIC und der CryIA(c)-Transkriptionsterminator). Das resultierende Plasmid pSB453 wird mit ApaI und NotI verdaut, was ein 4,2 kbp-Fragment liefert, das den Promotor, das offene Leseraster von Hybrid G27 und den Terminator trägt. Dieses Fragment wird an ApaI/NotI-verdautes pSB634 (Shuttle-Vektor, der pBC16.1 und pBluescriptKS+ enthält) ligiert, was pSB456 liefert (siehe 5). Plasmid-DNA, die aus E. coli DH10B isoliert wird, wird zur Transformation des Kristalltoxins minus B.t. Stamm, Bt51, verwendet. Positive Isolate sind tetracyclinresistent, zeigen die Gegenwart von pSB456 und enthalten große Einschlüsse, die einem 135 kDa-Protein entsprechen (gemäß Bestimmung durch SDS-PAGE). G27-Hybridtoxinproben werden aus Kulturen von transformiertem B.t.51 hergestellt, das durch Sporenbildung bei 30°C in CYS-Tc10-Medien gezüchtet wird. Insektizide Bioassays (Tabelle 2) werden sowohl an ganzen Vollkulturen als auch an gewaschenen Kristallproteinzubereitungen durchgeführt. Kontrollen schließen Bt51 (pSB440), das das CryIC-Toxin enthält, und Bt51 (pSB636), das CryIE enthält, ein. Toxinkonzentrationen werden durch SDS-PAGE abgeschätzt.

Tabelle 2. Bioassay des Hybridtoxins G27 im Vergleich mit CryIC und CryIE. Die Anzahl der Proben ist in Klammern angegeben. Das Hybridtoxin G27 ist ca. 50 % effektiver als CryIE oder CryIC in bezug auf die Toxizität zumindest gegenüber Spodoptera sp.

Obwohl die vorliegende Erfindung insbesondere unter Verweis auf die Herstellung des G27-Hybridtoxins beschrieben wurde, wird der Fachmann einsehen, daß viele andere Hybridtoxine mit verbesserten insektiziden Eigenschaften gemäß der vorliegenden Offenbarung hergestellt werden können. SEQ ID NO:7 und 8 zeigen zum Beispiel weitere erfindungsgemäße Hybridtoxine, die verbesserte insektizide Aktivität besitzen. Hybridtoxine können hergestellt werden, die Domäne III von CryIC und einen N-Terminus eines anderen Cry-Proteins umfassen. In bezug auf Bioassays können Transformanten, die das Hybridtoxin tragen, in SOP-Medien kultiviert werden, um die Testverfahren zu beschleunigen und die erforderlichen Materialvolumina zu reduzieren. Außerdem kann das Gen, das G27 und/oder andere erfindungsgemäße Hybridtoxine codiert, in Toxin-codierende Stämme von B.t. übertragen und/oder in das Chromosom von ausgewählten Stämmen von B.t. integriert oder tatsächlich in pflanzliche Genome eingeführt werden, um insektizide Aktivität in situ innerhalb der Pflanze als solche vorzusehen. In dieser Hinsicht ist es besonders bevorzugt, daß die rekombinante DNA, die die Toxine codiert, modifiziert ist, indem Codonen, die von der Pflanze bevorzugt sind, in die die rekombinante DNA inseriert werden soll, verwendet werden, so daß die Expression der so modifizierten DNA in der Pflanze im wesentlichen ähnliches Protein zu demjenigen liefert, das durch Expression der unmodifizierten rekombinanten DNA im Organismus erhalten wird, in dem die Proteinkomponenten des Hybridtoxins oder der Toxinfragmente endogen sind.


Anspruch[de]
Insektizides Bacillus thuringiensis-(Bt)-Hybridtoxin, das an seinem C-Terminus Domäne IIII eines CryIC-Proteins oder einen funktionell äquivalenten Teil davon und an seinem N-Terminus Domänen I und II eines zweiten CryI-Proteins umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus CryIA, CryIB, CryID, CryIE, CryIF, CryIG und CryIH besteht, worin die Domäne III von CryIC oder der Teil davon dem Hybridtoxin volle Aktivität für S. exigua und M. brassicae verleiht. Bt-Hybridtoxin gemäß Anspruch 1, worin das zweite CryI-Protein CryIA ist. Bt-Hybridtoxin gemäß Anspruch 1, worin das zweite CryI-Protein CryIE ist. Bt-Hybridtoxin gemäß Anspruch 1, worin das zweite CryI-Protein CryIG ist. Bt-Hybridtoxin gemäß Anspruch 1, worin der C-Terminus die Sequenz von Aminosäure Position 454 bis Position 602 von SEQ ID NO: 2 umfaßt. Bt-Hybridtoxin gemäß Anspruch 1, worin der C-Terminus die Sequenz von Aminosäure Position 478 bis Position 602 von SEQ ID NO: 2 umfaßt. Bt-Hybridtoxin gemäß Anspruch 1, das eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus:

a) Aminosäuren 1–620 von SEQ ID NO: 6 und

b) Aminosäuren 1–620 von SEQ ID NO: 6, worin wenigstens eine der folgenden Substitutionen vorhanden ist:

Ile an Position 609 ist durch Leu ersetzt,

Ala an Position 618 ist durch Glu ersetzt,

Ser an Position 620 ist durch Tyr ersetzt, besteht.
Bt-Hybridtoxin gemäß Anspruch 1, das eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus:

a) Aminosäuren 1–627 von SEQ ID NO: 8 und

b) Aminosäuren 1–627 von SEQ ID NO: 8, worin wenigstens eine der folgenden Substitutionen vorhanden ist:

Ile an Position 617 ist durch Leu ersetzt,

Ala an Position 625 ist durch Glu ersetzt,

Ser an Position 627 ist durch Tyr ersetzt,

besteht.
Bt-Hybridtoxin gemäß Anspruch 1, das Aminosäuren 1–602 von SEQ ID NO: 2 umfaßt. Bt-Hybridtoxin gemäß Anspruch 1, worin das Hybridtoxin an einen Bindungsort in einem Insektendarm bindet, der sich vom Ort unterscheidet, der durch das CryIC-Protein gebunden wird. Polypeptid, das das Hybridtoxin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 umfaßt. Insektizide Zusammensetzung, die das Hybridtoxin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 umfaßt. Verfahren zum Bekämpfen von Insekten, das das Inkontaktbringen der Insekten mit dem Hybridtoxin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 umfaßt. Verfahren zum Bekämpfen von Insekten, das das Inkontaktbringen der Insekten mit dem Polypeptid gemäß Anspruch 11 umfaßt. Verfahren zum Bekämpfen von Insekten, das das Inkontaktbringen der Insekten mit der insektiziden Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 umfaßt. Pflanze, die eine DNA einschließt und deren Expression ermöglicht, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz eines Bt-Hybridtoxins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 codiert. Pflanze gemäß dem vorhergehenden Anspruch, worin die DNA ferner ein Protein mit Herbizidresistenz, pflanzenwachstumsfördernden, Antipilz-, antibakteriellen, antiviralen und/oder nematiziden Eigenschaften codiert. Pflanze gemäß Anspruch 16 oder 17, worin die DNA modifiziert ist, indem bekannte mRNA-Instabilitätsmotive oder Polyadenylierungssignale entfernt sind und/oder Codonen, die von der Pflanze bevorzugt sind, in die die rekombinante DNA inseriert werden soll, verwendet werden, so daß die Expression der so modifizierten DNA in der Pflanze substantiell ähnliches Protein zu demjenigen liefert, das durch Expression der unmodifizierten rekombinanten DNA in dem Organismus erhalten wird, in dem die Proteinkomponenten des Hybridtoxins oder der Toxinfragmente endogen sind. Pflanze gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, deren Nachkommenschaft die DNA stabil aufgenommen und in einer Mendelschen Weise vererbbar enthält. Samen einer Pflanze gemäß Anspruch 19, der noch die DNA umfaßt.






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