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Dokumentenidentifikation DE60209722T2 23.11.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001404442
Titel HERSTELLUNG VON POLYMERPARTIKELN
Anmelder Qiagen AS, Oslo, NO
Erfinder SKAGESTAD, Vidar, N-1344 Haslum, NO;
KILAAS, Particle Solution AS, Lars, N-7491 Trondheim, NO
Vertreter Zimmermann & Partner, 80331 München
DE-Aktenzeichen 60209722
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 04.07.2002
EP-Aktenzeichen 027410638
WO-Anmeldetag 04.07.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/IB02/02618
WO-Veröffentlichungsnummer 2003004150
WO-Veröffentlichungsdatum 16.01.2003
EP-Offenlegungsdatum 07.04.2004
EP date of grant 08.03.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.11.2006
IPC-Hauptklasse B01J 20/30(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von magnetischen Polymerpartikeln und die daraus erhältlichen Partikel, besonders für die Verwendung als Trennmedien, insbesondere für das Trennen einer Zielsubstanz von einer Probe, wie zum Beispiel einer biologischen Probe.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Verschiedene Arten von Trennmedien sind für die Verwendung zum Isolieren von Zielsubstanzen in chemischen oder biologischen Proben erhältlich. In der molekularen Biologie werden verschiedene Materialien in Fraktionierungsverfahren verwendet, einschließlich Agarose und Polyacrylamid in der elektrophoretischen Fraktionierung, und Gelpermeation, Ionenaustausch und Affinititätsmaterialien für die Chromatographie. Unter solchen Materialien finden sowohl organische Polymere als auch auf Silizium basierende Partikel Verwendung bei den Trennungen von Zielsubstanzen, wie zum Beispiel Nukleinsäuren. Bei jeder Art von Trennung gibt es ab einem gewissen Punkt eine Notwendigkeit physikalisch eine flüssige Phase von den Partikeln in der festen Phase zu entfernen. Dies kann durch das Immobilisieren von den Partikeln, zum Beispiel in der Form einer Säule oder auf einer Gelplatte, und dem Eluieren der flüssigen Phase oder durch das Aggregieren der Partikel durch das Anwenden von Zentrifugationskräften oder unter Verwendung von Magnetismus erreicht werden. Die Verwendung von Magnetismus, um Partikel von anderen Komponenten der Probe zu trennen, erfordert, dass die Partikel auf ein magnetisches Feld ansprechen. Da organische oder auf Silizium basierende Materialien selbst nicht auf Magnetismus ansprechend sind, gibt es einen Bedarf, um Verfahren zur Herstellung von magnetischen Partikeln, die sowohl eine magnetische Komponente als auch eine Polymerkomponente vereinigen, bereitzustellen.

US 5945525 beschreibt ein Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren unter Verwendung von magnetischen Partikeln, die mit Silika beschichtet sind. Beschichtete Partikel werden durch die Ablagerung von Silika aus einer Teteraethoxysilan/Alkohol-Lösung auf die Oberfläche von Fe(III)-tetraoxid-Partikel, die einen Durchmesser von 200 bis 400 nm aufweisen, gebildet. Magnetische Partikel umfassend einen von Silika umschlossenen magnetischen Kern werden durch eine Reaktion zwischen den beschichteten Partikeln und Natriumsilikat gebildet. US 5352481 beschreibt ein Verfahren zur Bildung von Partikeln mit einer gleichmäßigen Größenverteilung mittels dem sogenannten Sol-Gel-Verfahren.

Pulverisierte Kernpartikel aus Titandioxid werden mit einem Silikagel beschichtet, indem es einer alkoholischen Lösung aus Siliziumtetraethoxid erlaubt wird, hydrolisiert zu werden, so dass ein Sol-Gel aus Silika als eine Beschichtung gebildet wird.

Ein Problem bei diesen Verfahren ist, wenn sie verwendet werden, um magnetische Polymerpartikel herzustellen, dass sie mehrere Schritte umfassende Verfahren darstellen, bei denen es sehr schwierig ist, die Menge an magnetischer Komponente und seine Verteilung in den Partikeln zu kontrollieren. Im Allgemeinen weisen solche Partikel eine nichtgleichmäßige Verteilung der magnetischen Komponente auf, da sich die magnetische Komponente nur im Kern des Partikels befindet. Dies beeinflusst nachteilig die Wirksamkeit der Partikel bei den Trennungsverfahren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden. In einem ersten Aspekt stellt entsprechenderweise die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung magnetischer Polymerpartikel zur Verfügung umfassend:

  • (a) Bereitstellung einer wäßrigen Phase enthaltend darin homogen dispergierte magnetische Komponenten;
  • (b) Wobei die wäßrige Phase entweder in Kontakt gebracht wird mit einem polymerisierbaren Metall enthaltenden oder organischem Monomer, das in der wäßrigen Phase löslich ist, oder dieses Monomer enthält und
  • (c) Polymerisieren des Monomers in der Gegenwart der magnetischen Komponenten, um so magnetische Polymerteilchen, in denen die magnetische Komponenten im Wesentlichen gleichmäßig verteilt sind, zu bilden;

    wobei zumindest ein Teil des Polymerisierungsschrittes (c) in einer Wasser-in-Öl-Emulsion durchgeführt wird, in der die wäßrige Phase, enthaltend die darin homogen dispergierten magnetischen Komponenten, als eine diskontinuierliche Phase in einer kontinuierlichen Öl-Phase vorhanden ist.

Es ist überraschenderweise festgestellt worden, dass, falls zumindest ein Teil der Bildung der Polymermatrix der magnetischen Polymerpartikel in einer in Wasser-in-Öl-Emulsion stattfindet, die Kontrolle über die Verteilung der magnetischen Komponenten in den Partikeln erlangt werden kann. Es ist festgestellt worden, dass eine im Wesentlichen gleichmäßige Verteilung der magnetischen Komponente innerhalb des Partikels an den Stellen erfolgt, an denen die magnetische Komponente während der Polymerisation ausreichend homogen in der wäßrigen Phase dispergiert ist.

Es ist möglich, die Polymerisation in der wäßrigen Phase zu starten, und anschließend eine Öl-Phase dazuzugeben, um die Emulsion während der Polymerisation herzustellen. Es wird jedoch bevorzugt, dass die wäßrige Phase als Teil der Wasser-in-Öl-Emulsion zur Verfügung gestellt wird, so dass das Monomer beim Start des Polymerisationsverfahrens direkt mit der Emulsion in Kontakt gebracht werden kann. Zusätzlich kann durch das Ändern der dazugegebenen Menge an Monomer, die Quellfähigkeit des sich bildenden Polymerpartikels, fein eingestellt und kontrolliert werden. Wasser agiert als ein Porogen, und so kann durch das Vergrößern der Menge an Wasser die Porosität des Polymerpartikels vergrößert werden.

In einem Aspekt wird das Monomer mit der wäßrigen Phase in situ in Kontakt gebracht. Dies kann unter Verwendung einer Precursor-Verbindung erreicht werden, die in situ in das Monomer umgewandelt wird. Vorteilhafterweise wird die Emulsion mit einer Öl-löslichen Silizium enthaltenden oder organischen Precursor-Verbindung unter Bedingungen gemischt, unter denen die Precursor-Verbindung in das Monomer umgewandelt wird. Vorzugsweise wird die Precursor-Verbindung durch Hydrolyse in ein Monomer umgewandelt. Entsprechend dieser Ausführungsform umfasst die Precursor-Verbindung funktionelle Gruppen oder Substituenten, die hydrolysierbar sind, um das Monomer zu bilden. Die Precursor-Verbindung kann ein Metallalkoxid umfassen, bei der das Metall vorzugsweise aus Silizium, Bismut, Bor, Titan, Tantal, Zirkon oder Aluminium ausgewählt wird. Silizium ist das bevorzugte Metall. Das Alkoxid kann eine Di-, Tri- oder Tetraalkoxyverbindung, vorzugsweise ein Siloxan, sein. Typische Alkoxide stellen C1-C5 Alkoxide dar, von denen Methoxid und Ethoxid bevorzugt werden, insbesondere Methoxid.

In den Fällen, in denen die Precursor-Verbindung durch Hydrolyse in das Monomer umgewandelt wird, kann ein pH-Wert in einem Bereich von 1 bis 14, typischerweise von 1,5 bis 12, vorzugsweise von 1,5 bis 11, verwendet werden. Es wird bevorzugt, dass die wäßrige Phase sauer oder alkalisch ist, um so die Hydrolyse zu erleichtern. Geeignete pH-Werte liegen in einem Bereich von 1 bis 5 und von 8 bis 14. Ein saurer pH-Wert wird bevorzugt, besonders in einem Bereich von 1 bis 2. Es ist ebenfalls möglich, einen Katalysator in die wäßrige Phase für das Erleichtern der Hydrolyse einzufügen, wie zum Beispiel eine organische oder anorganische Säure oder ein Amin. Ein Reagens für das Unterstützen der Kondensation oder der Polymerisation kann ebenfalls eingefügt werden.

Es wird, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, als möglich angenommen, dass die Umwandlung der Precursor-Verbindung in das Monomer entweder innerhalb der wäßrigen Phase oder an der Grenzfläche zwischen der wäßrigen Phase und der kontinuierlichen Öl-Phase stattfindet. Es wird angenommen, dass diese in situ Herstellung des reaktiven Monomeren es der Polymerbildung ermöglicht, in dem innigen Gemisch mit der magnetischen Komponente vorzukommen, um so die gleichmäßige Verteilung der magnetischen Komponente in dem so gebildeten Polymerpartikel zu erleichtern.

Die Verteilung der magnetischen Komponente in den Polymerpartikeln kann durch jedes dem Fachmann auf diesem Gebiet bekanntes Verfahren ausgewertet werden.

In einem weiteren Aspekt wird die wäßrige Phase mit einem polymerisierbaren Metall enthaltenden oder organischem Monomer, das darin aufgelöst ist, zur Verfügung gestellt, und die wäßrige Phase enthält darin homogen dispergierte magnetische Komponenten. Die wäßrige Phase kann zur Verfügung gestellt werden, indem zuerst das Monomer aufgelöst wird, und dann die magnetische Komponente dazugegeben wird oder indem zuerst die magnetische Komponente dazugegeben wird, und dann das Monomer aufgelöst wird. An einem geeigneten Punkt, in der Regel nach der Bildung der wäßrigen Phase, wird eine Ölphase, und wahlweise ein Stabilisator, wie zum Beispiel ein Detergens, zusammen gemischt, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion zu bilden. Dann wird das Monomer in der Gegenwart der magnetischen Komponenten polymerisiert, typischerweise durch das Anpassen der Bedingungen, an die Bedingungen, unter denen die Polymerisation gestartet wird. Die Polymerisation kann durch das Dazugeben der Komponenten, wie zum Beispiel sauren oder basischen Komponenten oder einem Katalysator, durch die kontinuierliche Phase hindurch gestartet werden.

Die wäßrige Phase der Emulsion umfasst vorzugsweise Wassertropfen. Die Größe der Wassertropfen kann während der Emulsionsbildung leicht kontrolliert werden, zum Beispiel durch die Geschwindigkeit und Kraft des Mischens der Öl-Phase mit der wäßrigen Phase, durch die Viskosität der kontinuierlichen/diskontinuierlichen Phase, durch die Art und Menge des Stabilisators und durch die Temperatur. Das Mischen der Wassertropfen mit der Öl-Phase kann durch jedes geeignete Verfahren bewerkstelligt werden, einschließlich der Homogenisierung, der Ultraschallbe-handlung und der Verwendung von Hochgeschwindigkeitsmischern. Es ist durch das Kontrollieren der Größe der Wassertropfen unter Verwendung der Mischbedingungen möglich, die Größe des magnetischen Polymerpartikelprodukts, das durch das Verfahren gebildet wird, zu kontrollieren. Je größer die Wassertropfen-größe, umso größer ist das Partikelprodukt. Entsprechend der Erfindung sind die Partikel typischerweise im Wesentlichen sphärisch. Im Allgemeinen weisen sie einen Durchmesser in einem Bereich von 0,1 bis 100 µm, vorzugsweise in einem Bereich von 0,5 bis 50 µm, und am bevorzugtesten in einem Bereich von 1 bis 10 µm, auf.

Es ist ebenfalls festgestellt worden, dass durch das Kontrollieren der Größe der Wassertropfen auf diese Art und Weise eine relativ enge Verteilung der Partikelgröße erhalten werden kann. Vorzugsweise werden Verteilungen der Partikelgröße mit einem CD von weniger als 30 % erhalten, wie mittels Lichtstreuung unter Verwendung von zum Beispiel einem Coulter-Zähler (LS 230) gemessen.

Die Kontrolle der Partikelgröße und die Enge der Verteilung der Partikelgröße stellen wichtige Aspekte der vorliegenden Erfindung dar. Es ist schwierig, unter Verwendung der Verfahren des Standes der Technik eine enge Verteilung der Partikelgröße zu erreichen. Außerdem können Silikapartikel, die entsprechend dem Stand der Technik aus Magnetitkörnern gemacht wurden, keine Größe aufweisen, die kleiner ist als die Größe der ursprünglichen Körner.

Die magnetische Komponente der vorliegenden Erfindung ist ein Material, das in der Lage ist, in der Gegenwart eines magnetischen Feldes magnetisiert zu werden, aber die Komponente ist in der Abwesenheit von solch einem Feld bei der Einsatztemperatur der magnetischen Polymerpartikel selber nicht magnetisch. Die magnetischen Komponenten sollten deshalb keine verbleibende Magnetisierung oder Remanenz besitzen, nachdem sie dem magnetischen Feld ausgesetzt wurden. Solche Materialien schließen paramagnetische und superparamagnetische Materialien ein. Sie schließen ebenfalls ferromagnetische und ferrimagnetische Materialien ein, vorausgesetzt, dass sie eine ausreichend niedrige Curie Temperatur aufweisen, so dass beim Einsatz, die magnetischen Polymerpartikel in der Abwesenheit eines angelegten magnetischen Feldes nicht magnetisch sind. Typische Materialien umfassen magnetische Metalloxide, vorzugsweise ein Eisenoxid, wie zum Beispiel Fe(III)-tetraoxid oder Eisensesquioxid. Nützliche magnetische Metalloxide umfassen Eisenoxide, in denen wahlweise das ganze oder ein Teil des Eisen(II) durch ein zweiwertiges Übergangsmetall, wie zum Beispiel Cadmium, Chrom, Kobalt, Kupfer, Magnesium, Mangan, Nickel, Vanadium und/oder Zink ersetzt ist.

Ganz gleich, welche magnetische Komponente verwendet wird, sie muss in der wäßrigen Phase dispergiert sein.

Die homogene Dispersion kann visuell durch Lichtmikroskopie oder durch UV-Absorptionsspektroskopie an kleinen Proben bewertet werden, um die Veränderung an dem Gehalt der magnetischen Komponente zu quantifizieren. Die homogene Dispersion wird am besten mit magnetischen Komponenten erreicht, deren Größe im Vergleich mit der typischen Tropfengröße für Wasser klein ist. Ein vorteilhafter Größenbereich für die magnetische Komponente beträgt nicht mehr als 100 nm, vorzugsweise nicht mehr als 50 nm, bevorzugter nicht mehr als 25 nm, und liegt am bevorzugtesten in einem Bereich von 1 bis 15 nm. Im Allgemeinen sind die magnetischen Komponentenpartikel mit einer Größe von 200 nm oder größer so groß, dass sie nicht in der wäßrigen Phase der Wasser-in-Öl-Emulsionen, die typischerweise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, homogen dispergiert werden können. Größere ferromagnetische Partikel können ebenfalls eine Remanenz aufweisen.

Es wird bevorzugt, dass die magnetische Komponente als eine magnetische Flüssigkeit geliefert wird, am bevorzugtesten als ein Ferrofluid. Ferrofluide weisen typischerweise eine durchschnittliche Partikelgröße von ungefähr 8,5 nm auf.

Makroskopisch betrachtet, all die Wassertropfen der Emulsion der Erfindung beachtend, sind diese sehr klein und können durch das Mischen mit Geschwindigkeit in einem Bereich von 0,1 bis 100 µm, vorzugsweise von 0,1 bis 10 µm, fein eingestellt werden. Diese kleinen Wassertropfen mit kleinen magnetischen Partikeln (wie zum Beispiel Ferrofluide) in einem Bereich von 1 bis 15 nm werden letztendlich immer eine homogene und kontrollierte Konzentration an magnetischen Partikeln in im Wesentlichen allen Wassertropfen der gesamten Emulsion aufweisen. Es wird im Gegensatz dazu bei magnetischen Partikeln mit einer Größe von 200 – 400 nm in der gleichen Wasser-in-Öl-Emulsion keine Kontrolle über die gesamte Anzahl an magnetischen Partikeln in jedem Wassertropfen der Emulsion geben, da die Größe der magnetischen Partikel im Vergleich zu der des Wassertropfens groß ist. Makroskopisch betrachtet, wird es eine nicht-homogene Verteilung der magnetischen Partikel geben, da offensichtlich jeder dieser Wassertropfen nicht eine einheitliche Konzentration an magnetischen Partikeln enthalten wird.

Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist in dem Falle eines 1,0 µm großen Wassertropfens die Größe der magnetischen Partikel in diesem Tropfen klein im Vergleich mit dem Tropfenvolumen, wodurch eine statistisch einheitliche Konzentration an magnetischen Partikeln in allen Tropfen der gleichen Größe zugelassen wird. Entsprechend dem Stand der Technik von US 5945525 beträgt die Größe des magnetischen Partikels tatsächlich nicht mehr als 1/5 der Tropfengröße. Für diesen Fall wird man in einigen Tropfen x magnetische Partikel finden, in einigen Tropfen wird man 2x magnetische Tropfen finden und in einigen Tropfen wird man keine magnetischen Partikel finden; es wird deshalb kein statistisch einheitliches Konzentrationsverhältnis an magnetischen Partikeln in allen Wassertropfen geben.

Deshalb ist ein kleines magnetisches Partikel (Ferrofluid) für das Kontrollieren der magnetischen Ladung (Menge an Ferrofluid) in den endgültigen Polymerpartikeln vorteilhaft. Mikroskopisch betrachtet, sich nur auf einen Wassertropfen konzentrierend, werden die magnetischen Partikel (z.B. 10 nm) entsprechend der vorliegenden Erfindung homogen in dem Wassertropfen (z.B. 0,5 µm) mit einem Verhältnis von 1/50 (10 nm magnetische Partikel/0,5 µm Wassertropfen) dispergiert sein. Im Gegensatz dazu beträgt in US 5,945,525 das Verhältnis ungefähr S (0,2 µm magnetische Partikel/0,5 µm Wassertropfen). So werden die magnetischen Partikel viel weniger homogen in dem Wassertropfen dispergiert sein, und der Effekt wird bei abnehmender Größe der Wassertropfen ausgeprägter sein, und in der Tat für sehr kleine Tropfen (0,1 bis 0,2 µm) unmöglich. In einem relativ großen Abschnitt des Tropfens wird man einen magnetischen Partikel vorfinden, und in einem anderen Abschnitt des gleichen Tropfens wird es keine Partikel geben. Deshalb wird der endgültige Partikel keine gleichmäßige Verteilung an Eisen aufweisen. Im Gegensatz dazu werden entsprechend der vorliegenden Erfindung sogar kleine Abschnitte des Tropfens magnetische Partikel enthalten, und der endgültige Partikel wird dann eine gleichmäßige Verteilung an Eisen in der gesamten Polymermatrix aufweisen.

Durch das Erhöhen der Konzentration an magnetischen Komponenten in der wäßrigen Phase kann die Konzentration an magnetischer Komponente in dem Polymerpartikelprodukt kontrolliert werden. Dies ist dadurch vorteilhaft, dass einige Anwendungen dieser Partikel erfordern können, dass sie stärker auf ein angelegtes magnetisches Feld ansprechen als andere Partikel. In einigen Fällen ist eine langsame Absetzzeit für in Lösung befindliche Partikel erforderlich. In Überein-stimmung mit der vorliegenden Erfindung ist dies leicht erreichbar und dies stellt einen weiteren Vorteil über den Stand der Technik dar, bei welchem größere Metallkorngrößen in schweren Partikeln resultieren.

Von den durch das vorliegende Verfahren erhältlichen magnetischen Polymerpartikeln, in denen die magnetische Komponente im Wesentlichen gleichmäßig verteilt ist, wird angenommen, dass sie gegenüber jenen magnetischen Polymerpartikeln, die gegenwärtig erhältlich sind, überlegen sind. Es ist unter Verwendung der Lichtmikroskopie festgestellt worden, dass magnetische Polymerpartikel, die momentan erhältlich sind, Magnetit oder andere Metalloxide nur in einer aggregierten nicht-homogenen Form als sichtbare Metallkerne, die mit Schichten von Silika beschichtet sind, einbauen. Im Gegensatz dazu stellt die vorliegende Erfindung eine magnetische Komponente zur Verfügung, die über die gesamte Partikelmatrix hinweg homogen und gleichmäßig verteilt ist. Dies weist einen wichtigen Vorteil gegenüber den magnetischen Partikeln des Standes der Technik auf, indem eine einheitliche und potentiell schnelle Reaktion auf ein magnetisches Feld, sobald es verwendet wird, zur Verfügung gestellt wird. Dies macht die Aggregation der Partikel auf die Oberfläche mit einer einheitlichen Geschwindigkeit durch das Anlegen eines magnetischen Feldes möglich, was eine wesentliche Eigenschaft darstellt, wenn solche Partikel, zum Beispiel in einem automatisierten Trennungssystem, verwendet werden.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Nur beispielsweise wird nun die Erfindung genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben werden.

Beispiele 1. Partikelbildung bei einem niedrigen pH-Wert:

  • a) Ein saures wäßriges Ferrofluid (5,0 g, pH-Wert 1,4, 177 mg Magnetit/g) wird mit einem Paraffinöl oder Toluol(50 g), welche 3 Gew.-% Span 65 enthalten, gemischt. Die Mischung wurde unter Verwendung eines Ultraturax für 2 Min. emulgiert, resultierend in einer W/O Emulsion, bei der das Magnetit homogen über das gesamte Volumen der Wassertropfen hinweg verteilt ist. Die Emulsion wird ausreichend gerührt, um das Absetzen der magnetischen Tropfen zu verhindern, und TMOS (Tetramethosysilan, 9 g) in Toluol wird nach und nach dazugegeben. Nach dem kontinuierlichen Rühren für l0 Std. bei 30°C wird eine Base (0,1 M NaOH oder 0,5 M wäßriges Ammoniak) dazugegeben. Das Rühren wird für weitere 3 Std. fortgesetzt, und die magnetischen Partikel werden unter Verwendung einer magnetischen Vorrichtung isoliert. Anschließend werden die magnetischen Polymerpartikel mit Toluol, Methanol und Wasser gewaschen. Die Partikel können z.B. direkt zum Isolieren von DNA verwendet werden oder ein Trockungsschritt, gefolgt von einer Resuspension in Wasser, kann eingefügt werden.
  • b) Während des Rührens bei 0°C wird TMOS (9 g) zu einer sauren Ferrofluid (4,5 g, pH-Wert 1,2, 205 mg Magnetit/g) gegeben. Die Suspension wird für weitere 15 Min. bei Raumtemperatur gerührt, bevor ein Paraffinöl oder Toluol(50 g), welche 3 Gew.-% Span 65 enthalten, dazugegeben wird. Die Mischung wurde unter Verwendung eines Ultraturax für 3 Min. emulgiert, resultierend in einer W/O Emulsion, bei der das Magnetit homogen über das gesamte Volumen der Wassertropfen hinweg verteilt ist. Das Rühren wird für 10 Std. bei 30°C mit einer Geschwindigkeit durchgeführt, die ausreichend ist, damit sich die Wassertropfen nicht absetzen, wonach eine Base (0,1 M NaOH oder 0,5 M wäßrigen Ammoniak) dazugegeben wird. Das Rühren wird für weitere 3 Std. fortgesetzt, und die magnetischen Polymerpartikel werden unter Verwendung einer magnetischen Vorrichtung isoliert. Anschließend werden die magnetischen Polymerpartikel mit Toluol, Methanol und Wasser gewaschen. Die magnetischen Polymerpartikel können z.B. direkt zum Isolieren von DNA verwendet werden oder ein Trockungsschritt, gefolgt von einer Resuspension in Wasser, kann eingefügt werden.

2. Partikelbildung bei einem hohen pH-Wert

Ein wäßriges Ferrofluid (5,0 g, pH-Wert 11, 50 mg Magnetit/g) wird mit einem Paraffinöl oder Toluol(50 g), welche 3 Gew.-% Span 65 enthalten, gemischt. Die Mischung wurde unter Verwendung eines Ultraturax für 2 Min. emulgiert, resultierend in einer W/O Emulsion, bei der das Magnetit homogen über das gesamte Volumen der Wassertropfen hinweg verteilt ist. Die Emulsion wird ausreichend gerührt, um das Absetzen der magnetischen Tropfen zu verhindern, und TMOS (Tetramethosysilan, 9 g) in Toluol wird nach und nach dazugegeben. Nach dem kontinuierlichen Rühren für 5 Std. bei 30°C wird 1 g einer Base (0,1 M NaOH oder 0,5 M wäßriges Ammoniak) dazugegeben. Das Rühren wird für eine weitere Std. fortgesetzt, und die magnetischen Polymerpartikel werden unter Verwendung einer magnetischen Vorrichtung isoliert. Anschließend werden die magnetischen Polymerpartikel mit Toluol, Methanol und Wasser gewaschen. Die magnetischen Polymerpartikel können z.B. direkt zum Isolieren von DNA verwendet werden oder ein Trockungsschritt, gefolgt von einer Resuspension in Wasser, kann eingefügt werden.

3. Verwendung von Natriumsilikat als Monomer

Eine Suspension eines wäßrigen Ferrofluids (7,5 g, pH-Wert 11) in Natriumsilikat (Natronwasserglas) (7,5 g) wird gemischt, um ein anderes Ferrofluid zu erhalten. Toluol oder ein Norpar-Öl (die kontinuierliche Phase), welche z.B. 3 % Stabilisator (Span 65 oder Span 80) enthalten, wird zu der Ferrofluid gegeben, und eine W/O Emulsion wird mittels Ultraschallbehandlung oder Verwendung eines Ystral (Ultraturax) hergestellt. Unter Verwendung eines Lichtmikroskops kann man klar verifizieren, dass das Magnetit homogen über das gesamte Volumen der Wassertropfen hinweg verteilt ist. Die Emulsion wird für 4 Std. bei 25°C (150 Upm) gerührt, wonach eine Emulsion aus 1 ml 25%-igem NH4OH in 10 ml kontinuierlicher Phase dazugegeben wird. Nach 5-minütigem Rühren werden 2 ml einer 20%-igen Lösung aus H2O in EtOH dazugegeben. Die Emulsion wurde für 12 Std. bei 50°C gerührt, und die magnetischen Polymerpartikel wurden mehrere Male mit MeOH unter Verwendung einer magnetischen Vorrichtung gewaschen.


Anspruch[de]
Verfahren zur Herstellung magnetischer Polymerpartikel umfassend:

a) Bereitstellung einer wäßrigen Phase enthaltend darin homogen dispergierte magnetische Komponenten;

b) Wobei die wäßrige Phase entweder in Kontakt gebracht wird mit einem polymerisiserbaren, Metall enthaltenden oder organischen Monomer, das in der wäßrigen Phase löslich ist, oder dieses Monomer enthält und

c) Polymerisieren des Monomers in Gegenwart der magnetischen Komponenten, um magnetische Polymerteilchen, in denen die magnetischen Komponenten im Wesentlichen gleichmäßig verteilt sind, zu bilden;

wobei zumindest ein Teil des Polymerisierungsschrittes (c) in einer Wasser-in-Öl-Emulsion durchgeführt wird, in der die wäßrige Phase, enthaltend die darin homogen dispergierten magnetischen Komponenten, als eine diskontinuierliche Phase in einer kontinuierlichen Öl-Phase vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die in Schritt (a) bereitgestellte wäßrige Phase in der Wasser-in-Öl-Emulsion vorliegt und die Emulsion mit dem Monomer aus Schritt (b) in Kontakt gebracht wird. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Monomer mit der wäßrigen Phase in Kontakt gebracht wird, indem die Emulsion mit einer Öl-löslichen Metall enthaltenden oder organische Precursor-Verbindung unter Bedingungen gemischt werden, unter denen die Precursor-Verbindung in das Monomer umgewandelt wird. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Precursor-Verbindung durch Hydrolyse in das Monomer umgewandelt wird. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die wäßrige Phase eine pH-Wert in einem Bereich von 1 bis 5 oder 8 bis 14 aufweist. Verfahren einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Precursor-Verbindung ein Metallalkoxid enthält. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Metall Silizium ist. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Metallalkoxid ein Di-, Tri- oder Tetraalkoxysiloxan ist. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Alkoxid ein Methoxid ist. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Monomer ein Metalloxid oder -hydroxid enthält. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Metalloxid oder -hydroxid ein Siliziumoxid oder -hydroxid ist. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die maxmale Größe der magnetischen Komponenten in einem Bereich von 1 bis 15 nm liegt. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die magnetischen Komponenten ein magnetisches Metalloxid enthalten. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das magnetisches Metalloxid ein Eisenoxid oder ein Eisenoxid in dem das ganze oder ein Teil des Eisen(II) durch ein zweiwertiges Übergangsmetall ausgewählt aus Cadmium, Chrom, Kobalt, Kupfer, Magnesium, Magna, Nickel, Vanadium und Zink, ersetzt ist. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das magnetische Metalloxid ein Eisenoxid ist. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das magnetische Metalloxid als magnetische Flüssigkeit bereitgestellt wird. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die magnetische Flüssigkeit ein Ferrofluid enthält. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wäßrige Phase der Emulsion Wassertropfen enthält. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Größe der Wassertropfen, durch die Mischbedingungen, die zur Bildung der Emulsion verwendet werden, kontrolliert wird. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Größe der Wassertropfen in einem Bereich von 0,1 bis 100 µm liegt. Magnetische Polymerteilchen erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, in dem deren magnetische Komponente im Wesentlichen gleichmäßig verteilt ist. Magnetische Polymerteilchen gemäß Anspruch 21, die im Wesentlichen sphärisch sind und einen Durchmesser in einem Bereich von 0,1 bis 100 µm aufweisen. Magnetische Polymerteilchen gemäß Anspruch 22, wobei der Durchmesser in einem Bereich von 0,5 bis 50 µm liegt. Magnetische Polymerteilchen gemäß Anspruch 22, wobei der Durchmesser in einem Bereich von 1 bis 10 µm liegt. Verwendung von magnetische Polymerteilchen gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24, um ein Zielsubstanz von einer Probe zu trennen.






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