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Dokumentenidentifikation DE69636040T2 07.12.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000861319
Titel IMMUNITÄT GEGEN RTX TOXINE AUS ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
Anmelder Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation, Campbell, AU;
Pig Research and Development Corp., Barton, AU
Erfinder PRIDEAUX, Thomas, Christopher, Coburg North, VIC 3058, AU;
HODGSON, Leslie, Adrian, Newton, VIC 3220, AU
Vertreter König Szynka Tilmann von Renesse, 40549 Düsseldorf
DE-Aktenzeichen 69636040
Vertragsstaaten DE, DK, ES, FR, GB, IT, NL
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 01.11.1996
EP-Aktenzeichen 969342104
WO-Anmeldetag 01.11.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/AU96/00686
WO-Veröffentlichungsnummer 1997016532
WO-Veröffentlichungsdatum 09.05.1997
EP-Offenlegungsdatum 02.09.1998
EP date of grant 12.04.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.12.2006
IPC-Hauptklasse C12N 1/21(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/31(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 39/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 39/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 39/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 39/102(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte Mikroorganismen, die für die Verwendung als Lebendimpfstoffe geeignet sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch allgemein die Verwendung modifizierter Mikroorganismen als biologische Vektoren. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Impfstoffzusammensetzungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die zum Auslösen einer Immunreaktion gegen RTX-Toxine geeignet sind.

Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) ist ein Mitglied der Familie Pasteurellaceae und der ätiologische Verursacher der Schweinepleuropneumonie, einer akuten oder chronischen Infektion von Schweinen, die von hämorrhagischen, fibrösen und nekrotischen Lungenläsionen gekennzeichnet ist (Pohl et.al. 1983; Kilian and Biberstein, 1984). Die Krankheit ist hoch ansteckend und befällt heranwachsende Schweine aller Altersstufen, was zu schweren wirtschaftlichen Verlusten in der Schweineindustrie führt. Der direkte Weg der Übertragung von APP bedeutet, dass eine Infektion unter intensiven Zuchtbedingungen prävalenter ist, wobei der Wirtsbereich von APP glücklicherweise auf Schweine beschränkt ist, was die möglichen Infektionsquellen reduziert. Bislang sind weltweit zwölf Serovare von APP identifiziert worden (Serovar 1–12), wobei Serovar 1, 7 und 12 etwa 90% der australischen Isolate ausmachen (Kamp and Shope, 1964). Es sind eine Reihe möglicher Virulenzfaktoren identifiziert worden, einschließlich Proteine der äußeren Membran (Mulks and Thacker, 1988; Rapp and Ross, 1988), Lipopolysaccharide (Udeze et al, 1987; Fenwick and Osburn, 1986), Kapsel- (Inzana et al., 1988; Rosendale and Macinnes, 1990; Lenser et. al., 1988) und abgesonderte Toxine (Rycroft et al., 1991; Bhatia et al., 1991; Fedorka-Crey et al., 1990). Die abgesonderten Toxine oder APX-Toxine sind Mitglieder der RTX-Toxinfamilie (Frey et al., 1993, 1994).

RTX-Toxine werden von einer Reihe gramnegativer Bakterien produziert, einschließlich Actinobacillus spp, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Bordetella pertussis, Pasteurella haemolytica, und die am besten charakterisierten der Gruppe werden von E.coli produziert (Welch, 1991). Alle RTX-Toxine arbeiten, indem sie Poren in den Zielzellen produzieren und damit das osmotische Gleichgewicht stören, was zu einer Ruptur der Zielzelle führt.

Obgleich der Wirkmechanismus von RTX-Toxinen identisch ist, variieren Typ und Arten-Kreuzspezifität ihrer Zielzellen erheblich. Strukturell ist diese Familie von Toxinen durch das Vorhandensein glycinreicher Wiederholungsstrukturen innerhalb des Toxins, die Kalzium binden und eine Rolle bei der Zielzellerkennung und -bindung spielen könnten, einer Region hydrophober Domänen, die an der Porenbildung beteiligt sind, die Notwendigkeit posttranslationaler Aktivierung und die Abhängigkeit von einer C-terminalen Signalsequenz für die Sekretion charakterisiert (Übersichtsarbeit: Coote, 1992).

Von APP werden mindesten drei verschiedene APX-Toxine produziert, die als APX1, APX2 und APX3 bezeichnet werden. APX1 zeigt starke und APX2 relativ schwache hämolytische Aktivität, wobei beide gegen eine größere Bandbreite von Zellen verschiedener Typen und Arten zytotoxisch und aktiv sind (Frey and Nicolet, 1988; Rosendale et al., 1988; Kamp et al, 1991). APX3 ist nicht hämolytisch aber stark zytotoxisch, mit einem Wirtsspektrum, das alveoläre Makrophagen des Schweins und neutrophile Leukozyten einschließt (Rycroft et al., 1991; Kamp et al., 1991). Kein APP-Serovar produziert alle drei APX-Toxine, die Mehrzahl produziert zwei (APX 1 und 2: Serovar 1, 5, 9 und 11; APX2 und 3: 2, 3, 4, 6 und 11), wobei eine kleine Anzahl (APX1: 10, APX2: 7 und 12) lediglich ein APX produziert (Frey and Nicolet, 1990; Frey at al., 1992,1993.1994; Kamp et al., 1991; Rycroft et al., 1991). Das Muster der APX-Produktion scheint mit Virulenz assoziiert zu sein, wobei solche Serovare, die APX1 und 2 produzieren, am stärksten virulent sind (Frey et al., 1994; Komal and Mittal, 1990). Die Produktion und Absonderung aktiver RTX-Toxine erfordert die Aktivität von mindestens vier Genen C, A, B und D. Das A-Gen kodiert das strukturelle Toxin, das C-Gen kodiert den posttranslationalen Aktivator und das B- und das D-Gen kodieren Proteine, die zur Absonderung des aktivierten Toxins erforderlich sind (Issartel et al., 1991; Welch, 1991; Felmlee et al., 1985). APX1 und 3 werden von Operons kodiert, die aus vier kontigen Genen (CABD) bestehen, während das APX2-Operon nur die C- und A-Gene und in manchen Fällen Überreste des B-Gens enthält. Absonderung von APX2 ist abhängig von der Aktivität der APX1B- und -D-Genprodukte (Übersichtsarbeit von Frey et al., 1994).

Virulenzanalyse spontaner und chemisch induzierter nicht hämolytischer Mutanten wies auf eine Rolle der APX-Toxine bei der Virulenz hin, was vor Kurzem anhand von Transposon-Mutagenesen bestätigt worden ist (Anderson et al., 1991; Gerlach et al., 1992: Inzana et al., 1991; Rycroft et al., 1991a, b; Tacon et al., 1993, 1994). Ein kompletter Schutz vor der Krankheit und einem Übertrrägerstatus lässt sich mit Impfstoffen, die chemisch inaktivierte Bakterien enthalten, oder mit Impfstoffen aus gereinigten Untereinheiten, die Proteine der äußeren Membran, Lipopolysaccharide oder der Hülle enthalten, nicht erzielen. Dagegen wurde bei Mäusen nach Impfung mit gereinigten APX in Kombination mit formalisierten ganzen Zellen ein vollständiger Schutz vor der Krankheit erhalten, was auf eine Rolle der APX-Toxine bei der protektiven Immunität hinweist (Bhatia et al., 1991).

Bei der Impfung gegen Pleuropneumonie infolge einer APP-Infektion von Schweinen wurden bislang Bakterine oder Untereinheiten-Impfstoffe verwendet, die auf verschiedenen Komponenten der Bakterien basierten. Die mit inaktiven Impfstoffen erzielten Ergebnisse haben bestenfalls homologen Schutz gegen den Serovar geboten, der zur Herstellung des Impfstoffmaterials verwendet wurde. Derzeit sind zwölf Serovare von APP bekannt, die eine unterschiedliche Virulenz aufweisen und von denen jeder eine andere Impfstoffzubereitung erfordert. Bislang wurden handelsübliche Impfstoffe derart formuliert, dass sie eine Reihe von Serovare enthalten und Schutz gegen die am häufigsten beobachteten Serovare an dem jeweiligen geographischen Ort bieten. Im Gegensatz zu inaktiven Impfstoffen bietet eine natürliche Infektion mit einem beliebigen Serovar Schutz vor einer erneuten Infektion mit jedem anderen Serovar, was auf die Möglichkeit hindeutet, dass ein Lebendimpfstoff möglicherweise Kreuzschutz („Cross Protection") gegen APP-Serovare bieten könnte.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eines oder mehrere Probleme im Stand der Technik zu lösen.

Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt einen genetisch modifizierten Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) zur Verfügung, umfassend ein RTX-Toxinoperon, das ein strukturelles RTX-Gen und ein teilweise oder vollständig inaktiviertes posttranslationales RTX-Aktivatorgen aufweist, das ein RTX-Toxin erzeugt, wobei das RTX-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert ist.

Der Begriff „genetisch modifiziert" umfasst Modifikationen durch DNA-Rekombinationstechniken oder andere Techniken, wie beispielsweise chemische oder strahlungsinduzierte Mutagenese. Wenn DNA-Rekombinationstechniken die Einführung fremder DNA in Wirtszellen umfassen, kann die DNA durch jedes geeignete Verfahren eingeführt werden. Geeignete Verfahren umfassen die Transformation kompetenter Zellen, Transduktion, Konjugation und Elektroporation.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein modifizierter Mikroorganismus bereitgestellt, worin ein RTX-Toxingen, einschließlich einem strukturellen RTX-Gen und/oder einem posttranslationalen Aktivator des Organismus, teilweise oder vollständig inaktiviert ist.

Der Begriff „RTX-Toxinoperon", wie hier in den Ansprüchen und der Beschreibung verwendet, soll solche Gene umfassen, die an der Expression eines RTX-Toxins beteiligt sind, welches ein Produkt des RTX-Toxinoperons ist. Die in dem RTX-Toxinoperon enthaltenen Gene umfassen das posttranslationale Aktivatorgen (C), das strukturelle Gen (A) und die B- und D-Gene, die Proteine kodieren, welche für die Absonderung des aktivierten RTX-Toxins erforderlich sind.

Der Begriff „teilweise oder vollständig inaktiviert", wie hier in den Ansprüchen und der Beschreibung verwendet, umfasst die Modifikation eines Gens durch DNA-Rekombinationstechniken, einschließlich der Einführung und Deletion von DNA aus dem Gen, einschließlich einfacher oder mehrfacher Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion, einschließlich vollständige oder teilweiser Deletion des Gens unter Einsatz eines Zielkonstruktes oder Plasmidsegregation sowie durch chemisch induzierte, strahlungsinduzierte oder ortsspezifische Mutagenese.

In einer bevorzugten Ausführungsform induziert der genetisch modifizierte APP in einem Wirt protektive Immunität gegen das strukturelle RTX-Polypeptid und gegen eine Infektion durch Actinobacillus pleuropneumoniae.

Die vorliegenden Antragsteller haben festgestellt, dass ein Vorläufer eines RTX-Toxins verringerte toxische Aktivität aufweist. Überraschenderweise haben die vorliegenden Antragsteller auch festgestellt, dass der RTX-Toxinvorläufer in einem Tier eine Immunreaktion auslösen kann, die Kreuzimmunität („Cross Protection") gegenüber einem heterologen Stimulus („Challenge") mit einem Mikroorganismus bietet, der ein RTX-Toxin produziert.

Entsprechend ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das inaktivierte RTX-Toxin ein Vorläufer eines RTX-Toxins. Bei dem Vorläufer kann es sich um ein nicht behandeltes Expressionsprodukt eines strukturellen RTX-Gens handeln. Das strukturelle RTX-Gen kann ein RTX-A-Gen sein. Das RTX-Toxin kann ein APX-Toxin sein. Das APX-Toxin kann APX1, Apx2 oder APX3 sein.

Die vorliegenden Antragsteller haben festgestellt, dass APP, das natürlicherweise ein RTX-Toxin produziert, verändert werden kann, um einen inaktiven RTX-Toxinvorläufer zu produzieren, indem der posttranslationale Aktivator des Vorläuferproduktes eliminiert wird. Entsprechend ist in einer bevorzugten Ausführungsform der genetisch modifizierte APP nicht in der Lage, einen posttranslationalen Aktivator des RTX-Toxinvorläufers herzustellen, oder produziert einen inaktivierten posttranslationalen Aktivator des RTX-Toxinvorläufers. Der posttranslationale Aktivator kann ein Produkt eines RTX-C-Gens sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das RTX-C-Gen des APP inaktiviert oder teilweise oder vollständig deletiert. Das RTX-C-Gen kann durch ortsspezifische Mutagenese inaktiviert sein. Das RTX-C-Gen kann durch einfache oder mehrfache Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion inaktiviert sein. Vorzugsweise ist das RTX-C-Gen durch homologe Rekombination mit einem Targeting-Konstrukt inaktiviert. Das Targeting-Konstrukt kann einen selektierbaren Marker umfassen, der von Sequenzen flankiert ist, welche zu Sequenzen homolog sind, die die gewünschte Insertionsstelle flankieren. Der selektionsfähige Marker kann ein Gen sein, das Resistenz gegen eine toxische Substanz wie beispielsweise Quecksilber vermittelt oder kann eine Antibiotikaresistenzdeterminante sein. Die Antibiotikaresistenzdeterminante kann ein Gen sein, das für eine Ampicillinresistenz, eine Kanamycinresistenz oder eine Streptomycinresistenz kodiert.

Unter manchen Umständen ist es gegebenenfalls nicht wünschenswert, dass ein funktionelles Antibiotikaresistenzgen in einem modifizierten Mikroorganismus eingebaut wird. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Targeting-Konstrukt, das genetische Elemente wie beispielsweise Wiederholungssequenzen enthält, die ein Ausschneiden des Antibiotikaresistenzgens ermöglichen, sobald das Targeting-Konstrukt eine homologe Rekombination mit dem Wirtschromoson vorgenommen hat.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Targeting-Konstrukt, das keinen selektierbaren Marker enthält. Beispielsweise kann das Targeting-Konstrukt ein Segment des RTX-C-gens enthalten, das eine Deletion enthält. Homologe Rekombination des Targeting-Konstruktes mit dem Wirtschromosom kann zur Einführung einer Deletion in das chromosomale RTX-C-Gen führen. Die Auswahl von Rekombinanten kann dann auf der Abwesenheit der Produktion des RTX-Toxins beruhen.

Das Targeting-Konstrukt kann in linearer Form direkt in APP eingeführt werden. Alternativ kann das Targeting-Konstrukt über einen Selbstmord-(„Suicide")-Vektor oder einen nicht replizierenden Vektor eingeführt werden. Der Selbstmord-(„Suicide")-Vektor kann jedes Plasmid sein, das sich in APP nicht repliziert. APP, die natürlicherweise RTX-Toxine produzieren, sind häufig nicht-tolerante Wirte für pEP-Vektoren. Entsprechend sind pEP-Vektoren Beispiele für Selbstmord-(„Suicide")-Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Der Selbstmord-(„Suicide")-Plasmidvektor kann pEP-CAmpr sein.

In einer anderen Ausführungsform kann eine ortsspezifische Mutagenese mittels der Plasmidsegregationstechnik erreicht werden. Beispielsweise kann in einen APP ein Plasmid eingeführt werden, das ein Fragment eines RTX-C-Gens enthält, das von einem selektionsfähigen Markergen unterbrochen ist. APP kann anschließend mit einem zweiten Plasmid transformiert werden, das ein zweites selektionsfähiges Markergen enthält. APP, der beide Plasmide enthält, kann dann durch Medien geleitet werden, welche nur auf das zweite Plasmid hinselektieren. Selektion in Richtung des zweiten Plasmids kann der Erhaltung des ersten Plasmids entgegenwirken. Daher kann das erste Plasmid verloren gehen, aber in manchen Fällen kann eine Rekombination des unterbrochenen RTX-C-Genfragments, welches den auswählbaren Marker enthält, in das Chromosom stattfinden. Dieser Prozess kann daher eine Rekombination des unterbrochenen RTX-Gens in das chromosomale RTX-C-Gen fördern, wodurch das chromosomale RTX-C-Gen inaktiviert wird.

Das RTX-A-Genprodukt kann von einem chromosomalen RTX-A-Gen exprimiert werden.

Das chromosomale RTX-A-Gen kann sich an seiner natürlichen Position auf dem Chromosom befinden oder an einer anderen als seiner natürlichen Position in das Chromosom eingefügt werden. Darüber hinaus kann das RTX-Genprodukt von einem RTX-A-Gen exprimiert werden, das sich auf einem extrachromosomalen Element wie beispielsweise einem Plasmid befindet. Daher kann ein extrachromosomales Element, das ein RTX-A-Gen enthält, in APP eingeführt werden, die ein funktionelles chromosomales RTX-A-Gen und ein inaktiviertes chromosomales RTX-C-Gen aufweisen. Das von dem extrachromosomalen Element exprimierte RTX-A-Produkt kann das RTX-A-Produkt, das von dem chromosomalen Gen exprimiert wird, ergänzen.

Alternativ kann das RTX-A-Genprodukt vollständig von einem RTX-A-Gen oder RTX-A-Genen exprimiert werden, die sich auf extrachromosomalen Elementen wie beispielsweise Plasmiden befinden. Die sich auf extrachromosomalen Elementen befindenden RTX-A-Gene können entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit einer Selektion für das extrachromosomale Element exprimiert werden. Ein extrachromosomales Element, das ein RTX-A-Gen enthält, kann daher in einen APP eingeführt werden, der keine funktionellen chromosomalen RTX-A- und RTX-C-Gene enthält. Der Mikroorganismus, der keine funktionellen RTX-A- und RTX-C-Gene aufweist, kann durch Mutagenese des APP produziert werden. Die Mutagenese kann zur Deletion der RTX-A- und RTX-C-Gene oder Anteilen davon führen.

Das extrachromosomale Element kann ein rekombinanter Expressionsvektor sein, der das RTX-A-Gen enthält. Der rekombinante Expressionsvektor erlaubt die Expression des RTX-A-Gens in APP. Der rekombinante Expressionsvektor kann aus einem pIG-Plasmid abgeleitet sein. Das rekombinante Plasmid kann aus pIG3B abgeleitet sein. Bei dem rekombinanten Plasmid kann es sich um pIG3B-T1K handeln.

Bakterielle Vektorsysteme auf der Basis von APP (Ph) bieten ein alternatives Mittel zum Einbringen von „nackten" DNA-Impfstoffmolekülen in Wirtszellen. Solche nackten DNA-Impfstoff/-Expressionssysteme würden ein Plasmid umfassen, welches sich in dem bakteriellen System replizieren kann, und einen eukaryotischen Promotor, welcher die Expression des fremden/rekombinanten Gens von Interesse steuert.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der genetisch modifizierte APP in der Lage, eines oder mehrere funktionelle Proteine zu produzieren, welche die Sekretion von RTX-Toxinmolekülen unterstützen. Die genetisch modifizierten APP können funktionelle RTX-B-und-/oder RTX-D-Gene aufweisen. In einer anderen Ausführungsform sind die genetisch modifizierten APP nicht imstande, mindestens eines der an der Sekretion von RTX-Toxin-Molekülen beteiligten Proteine oder mindestens ein an der Sekretion von RTX-Toxin-Molekülen beteiligtes inaktives Protein zu produzieren. Der Mikroorganismus kann daher ein inaktives RTX-B- und/oder RTX-D-Gen aufweisen. Der Mikroorganismus ist daher gegebenenfalls nicht in der Lage, aktive oder inaktive RTX-Toxin-Moleküle zu sezernieren.

Zur Expression heterologer Proteine in APP können rekombinante Plasmidvektoren verwendet werden. Vorzugsweise ist der rekombinante Plasmidvektor von einem natürlich vorkommenden Plasmid in Actinobacillus pleuropneumoniae abgeleitet. Das rekombinante Plasmid kann eine DNA-Sequenz enthalten, die einen RTX-Toxinvorläufer kodiert. Das rekombinante Plasmid kann ein RTX-A-Gen enthalten. Alternativ kann das rekombinante Plasmid ein RTX-C-Gen oder ein Fragment davon enthalten. Das RTX-C-Gen oder -Genfragment kann von einer dazwischen geschalteten DNA-Sequenz unterbrochen sein. Die dazwischen geschaltete DNA-Sequenz kann einen selektierbaren Marker kodieren, wie beispielsweise ein Antibiotikaresistenzgen. Bei dem natürlicherweise vorkommenden Plasmid kann es sich um pIG3 handeln. Vorzugsweise umfasst der rekombinante Plasmidvektor des Weiteren Nukleotidsequenzen, welche den Transfer von DNA in E. coli unterstützen. Die Nukleotidsequenzen können mindestens eine multiple Klonierungsstelle und das Lac-Gen oder Anteile davon enthalten. Der rekombinante Plasmidvektor kann aus pIG317, pIG38 oder pIG38-T1K ausgewählt sein.

Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine Impfstoffzusammensetzung zum Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Wirtstier bereit, das mit der Impfstoffzusammensetzung beimpft wurde, wobei die Impfstoffzusammensetzung einen genetisch modifizierten Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) enthält, der ein RTX-Toxinoperon aufweist, einschließlich ein strukturelles RTX-Gen und ein teilweise oder vollständig inaktiviertes posttranslationales RTX-Aktivatorgen, welches ein RTX-Toxin produziert, wobei das RTX-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem inaktivierten RTX-Toxin um einen Vorläufer eines RTX-Toxins. Der Vorläufer kann ein unverarbeitetes Expressionsprodukt eines strukturellen RTX-Gens ein. Das strukturelle RTX-Gen kann ein RTX-A-Gen sein. Vorzugsweise ist das RTX-C-Gen des Mikroorganismus inaktiviert oder deletiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Impfstoffzusammensetzung, die einen genetisch modifizierten APP enthält, um einen Lebendimpfstoff.

Eine Impfstoffzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in jedes beliebige pharmazeutisch annehmbare Vehikel mit oder ohne zugefügte Hilfsstoffe oder immunstimulatorische Moleküle eingefügt werden.

Der Hilfsstoff kann von einem beliebigen geeigneten Typ sein. Der Hilfsstoff kann aus Pflanzenölen oder Emulsionen davon, oberflächenaktiven Substanzen, z. B. Hexadecylamin, Octadecylaminosäureester, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dicoctadecyl-N'-N'bis(2-hydroxyethylpropandiamin), Methoxyhexadecylglycerol, und pluronischen Polypolen, Polyaminen, z. B. Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Carbopol, Peptiden wie beispielsweise Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin, Immunstimulierenden Komplexen (ISCOMS), Ölemulsionen sowie Mineralgelen und -suspensionen ausgewählt sein. Eine Mineralsuspension wie beispielsweise Alum, d. h. Aluminiumhydroxid (Al(OH)3), Aluminiumphosphat oder Aluminiumsulfat ist bevorzugt. Der Hilfsstoff kann in Mengen von etwa 1 bis 75 Gew.-%, beruhend auf dem Gesamtgewicht der Impfstoffzusammensetzung, vorhanden sein.

Ein Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung, der einen genetisch modifizierten APP enthält, welcher einen RTX-Toxinvorläufer produzieren kann, hat das Potential, Schutz gegen einer Reihe von Serovaren eines Mikroorganismus bereit zu stellen, der das entsprechende RTX-Toxin produziert.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen biologischen Vektor, einschließlich eines genetisch modifizierten Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) bereit, der ein RTX-Toxinoperon umfasst, einschließlich einem strukturellen RTX-Gen und einem teilweise oder vollständig inaktivierten posttranslationalen RTX-Aktivatorgen, welches ein RTX-Toxin produziert, wobei das RTX-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert ist.

Bei dem RTX-Toxin kann es sich um ein APX-Toxin handeln. Das APX-Toxin kann APX1, APX2 oder APX3 sein. Vorzugsweise ist das inaktive RTX-Toxin ein Vorläufer des RTX-Toxins. Vorzugsweise ist der Vorläufer des RTX-Toxins ein Produkt des RTX-A-Gens.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der genetisch modifizierte APP nicht in der Lage, einen posttranslationalen Aktivator des RTX-Toxinvorläufers zu produzieren oder er produziert einen inaktivierten posttranslationalen Aktivator des RTX-Toxinvorläufers. Der posttranslationale Aktivator kann ein Produkt eines RTX-C-Gens sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das RTX-C-Gen des genetisch modifizierten APP inaktiviert oder deletiert. Das RTX-C-Gen kann durch einfache oder mehrfache Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion inaktiviert sein.

Das RTX-C-Gen kann durch die Einführen eines Targetingkonstruktes, das einen selektierbaren Marker enthält, durch ortsspezifische Rekombination in das chromosomale RTX-Gen inaktiviert sein. Das Targetingkonstrukt kann genetische Elemente wie beispielsweise Wiederholungseinheiten enthalten, welches das Ausscheiden des Antibiotikaresistenzgens ermöglichen, sobald das Targetingkonstrukt eine homologe Rekombination mit dem Wirtschromosom durchgeführt hat. Alternativ kann ein Targetingkonstrukt verwendet werden, das keinen selektierbaren Marker enthält, um eine Deletion in das chromosomale RTX-C-Gen einzuführen.

Das RTX-A-Genprodukt kann von einem chromosomalen RTX-A-Gen exprimiert werden. Das chromosomale RTX-A-Gen kann sich an seiner natürlichen Position auf dem Chromoson befinden oder kann an einer anderen als seiner natürlichen Position in das Chromosom eingesetzt werden. Darüber hinaus kann das RTX-Genprodukt von einem RTX-A-Gen exprimiert werden, das sich auf einem extrachromosomalen Element wie beispielsweise einem Plasmid befindet.

Alternativ kann das RTX-A-Genprodukt vollständig von einem RTX-A-Gen oder -Genen exprimiert werden, die sich auf extrachromosomalen Elementen wie beispielsweise Plasmiden befinden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der genetisch modifizierte APP in der Lage, eines oder mehrere funktionelle Proteine herzustellen, welche die Sekretion von RTX-Toxinmolekülen unterstützen. Der genetisch modifizierte APP kann funktionelle RTX-B- und/oder RTX-D-Gene enthalten. In einer anderen Ausführungsform ist der genetisch modifizierte APP nicht in der Lage, mindestens eines der Proteine zu erzeugen, die an der Sekretion von RTX-Toxingenmolekülen beteiligt sind, oder produziert mindestens ein inaktives Protein, das an der Sekretion von RTX-Toxingenmolekülen beteiligt ist.

Der Begriff „biologischer Vektor" wird in seinem weitesten Sinne verwendet, um ein biologisches Mittel zu umfassen, welches sich zur Expression biologisch aktiver Moleküle eignet. Das biologische Mittel ist vorzugsweise ein lebender Mikroorganismus, obwohl auch tote Organismen verwendet werden können. Der biologische Vektor kann nicht-pathogen sein oder avirulent gemacht worden sein oder kann in nicht-pathogenen oder avirulenten effektiven Mengen gegeben werden. Der Begriff „biologisch aktive Moleküle" umfasst funktionelle Moleküle wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, Antigene oder antigene Teile davon, Zytokine wie beispielsweise Interleukine, Interferone und Tumornekrosefaktoren. Die Moleküle können von dem biologischen Vektor natürlicherweise exprimiert werden. Alternativ kann es sich bei den Molekülen um rekombinante Moleküle handeln, die exprimiert werden, indem der biologische Vektor mit einem Plasmid transformiert wird, der ein Gen oder Gene trägt, welche das biologisch aktive Molekül kodieren, und welches dann exprimiert wird, oder bei dem das Plasmid und/oder Gen oder die Gene und/oder Teile davon in das Wirtsgenom integriert sind, welches das Chromosom und/oder ein beliebiges natürlicherweise oder nicht natürlicherweise vorkommendes extrachromosomales Element mit umfasst, wobei das Gen oder die Gene oder Teile davon exprimiert werden.

Ein biologischer Vektor der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um dem Wirtstier eines oder mehrere nützliche Proteine zu verabreichen. Die derart verabreichten Proteine können synergistisch wirken, um eine verstärkte Reaktion in dem Wirtstier herbeizuführen. Beispielsweise kann der biologische Vektor ein Antigen in Kombination mit einem Molekül produzieren, welches in dem Wirtstier eine immunogene Antwort auf das Antigen verstärkt. Das Molekül, das die immunogene Antwort verstärkt, kann ein Zytokin sein.

Ein biologischer Vektor der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um einen multivalenten Impfstoff bereit zu stellen. Der Begriff „multivalenter Impfstoff" wird in seinem allgemeinsten Sinne verwendet und erstreckt sich auch auf einen modifizierten Mikroorganismus, der eine Immunantwort gegen zwei oder mehrere unterschiedliche antigene Epitope, die sich auf dem modifizierten Mikroorganismus befinden oder von diesem exprimiert werden, wobei die zwei oder mehrere Epitope dem modifizierten Mikroorganismus eigen sind. Allgemeiner jedoch umfasst ein multivalenter Impfstoff einen modifizierten Mikroorganismus, der eine Immunantwort gegen virulente Formen des Mikroorganismus sowie gegen heterologe Antigene induzieren kann, die von dem Mikroorganismus exprimiert werden (wie beispielsweise rekombinante Antigene oder solche, die durch Transduktion, Konjugation oder Transformation eingeführt wurden) und die dem Mikroorganismus nicht eigen sind. Diesbezüglich kann ein multivalenter Impfstoff gegen zwei oder mehrere Krankheitserreger gerichtet sein. Bevorzugte multivalente Impfstoffe sind solche, die eine Immunantwort gegen ein RTX-Toxin und gegen mindestens ein antigenes Epitop eines oder mehrerer Krankheitserreger induzieren kann. Die Krankheitserreger können aus Bakterienkrankheitserregern ausgewählt sind, wie beispielsweise Haemophilus spp, Serpulina hyodysenteriae, Pasteurella spp, Bordetella bronchiseptica, Leptospira spp, Streptococcus spp, Salmonella spp, Escherichia coli, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae. Alternativ können die Krankheitserregner aus Viruskeimerregern einschließlich HVC, PRRSV, PRV, TGEV oder PPV ausgewählt sein.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erzeugung eines genetisch modifizierten Actinobacillus pleuropneumoniae bereit, der ein RTX-Toxin produziert, wobei das RTX-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellen eines Actinobacillus pleuropneumoniae und partielle oder vollständige Inaktivierung eines posttranslationalen RTX-Aktivatorgens in dem RTX-Toxinoperon des Actinobacillus pleuropneumoniae.

Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Impfen eines Tieres gegen einen ein RTX-Toxin produzierenden Mikroorganismus bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge eines Impfstoffes gemäß der vorliegenden Erfindung an das Tier umfasst.

Das Impfverfahren kann bei der Behandlung von Nutztieren wie Schweinen, Rindern, Schafen und Ziegen verwendet werden. Das Impfverfahren kann auch bei der Behandlung von Haustieren wie Pferden, Hunden und Katzen verwendet werden. Das Impfverfahren kann auch bei der Behandlung von Menschen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Impfverfahren bei der Behandlung von Schweinen verwendet. Vorzugsweise wird das Impfverfahren bei der Behandlung von Schweinepleuropneumonie verwendet.

Die Verabreichung eines Impfstoffes oder Impfstoffvektors gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf jedem geeigneten Weg, beispielsweise durch orale oder parenterale Verabreichung, erfolgen. Die Verabreichung kann über Schleimhäute wie nasal oder vaginal erfolgen. Alternativ kann die Verabreichung intramuskulär, intradermal, subkutan oder intraperitoneal erfolgen. Die Zubereitung kann in trockener oder flüssiger Form sein. Der gewählte Verabreichungsweg kann auch zusätzliche Komponenten wie beispielsweise Proteaseinhibitoren, Entzündungshemmer und dergleichen erforderlich machen.

Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Impfen eines Tieres gegen einen pathogenen Organismus bereit, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Impfstoffvektors gemäß der vorliegenden Erfindung an das Tier umfasst, wobei der Impfstoffvektor eine immunologisch wirksame Menge eines Antigens des pathogenen Organismus synthetisiert.

Ein einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines inaktiven RTX-Toxins bereit, wobei das Verfahren die Kultivierung eines genetisch modifizierten APP-Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung und die Wiedergewinnung des von dem Mikroorganismus hergestellten inaktiven Toxins umfasst. Das mit diesem Verfahren hergestellte inaktive RTX-Toxin kann beispielsweise als das aktive Immunogen in einem Impfstoff verwendet werden, um eine protektive Immunantwort gegen ein RTX-Toxin zu stimulieren.

In der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen dieser Patentschrift soll das Wort „umfassen" und Varianten des Wortes, wie beispielsweise „umfassend" und „umfasst", andere Zusätze, Komponenten, Ganzzahlen oder Schritte nicht ausschließen.

Damit die Erfindung einfacher verständlich ist, stellen wir die folgenden nicht einschränkenden Beispiele bereit.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1 Partielle Restriktionsenzymkarte von pIG3 (1A), einem 4,2-kb-Plasmid, das eine Streptomycinresistenz kodiert, isoliert von einem australischen Stamm von APP. Ein PstI-Fragment mit 2,3 kb (pIG317; 1B) erwies sich als ausreichend, um eine Plasmidreplikation zu kodieren und eine Streptomycinresistenz zu vermitteln, wenn es durch Selbstligation verbunden und in E. coli von APP transformiert wird. Der Plasmidvektor pIG3B, der eine multiple Klonierungsstelle (Multiple Cloning Site, MCS) und einen Anteil des Lac-Gens aufweist, wurde konstruiert, indem das HaeII-Fragment von pIC19R in die einzige EcoRI-Stelle von pIG317 kloniert wurde (1C). Für pIG3B sind einzigartige Restriktionsenzymschnittstellen (1C) angegeben, mit Ausnahme von PstI, welches in der MCS und dem Plasmid-Gerüst schneidet.

2 Konstruktion einer APX1A-Expressionskassette zur Verwendung in APP. Die APX1A-Expressionskassette, verknüpft mit dem Kanamycinresistenzgen von pQE-T1K, wurde als ein SalI-Restriktionsenzym-Fragment isoliert und in die einzige SalI-Schnittstelle von pIG3B kloniert. Es sind nicht alle einzigartigen Restriktionsenzymschnittstellen in der multiplen Klonierungsstelle von pIG3B angezeigt.

3 Konstruktion der APX1-Expressionskassette für E.coli. Es wurde ein vollständiges APX1A-Gen erzeugt, indem aus einer PCR erhaltenes (∎) Material und ein genomischer Klon an einer einmalig vorhandenen HindIII-Schnittstelle fusioniert wurden. Das komplette Gen wurde in pQE im Leseraster der Poly-His-Leadersequenz kloniert, um eine Reinigung von APX1A zu ermöglichen. Das Kanamycinresistenzgen von pUC4K wurde in eine einmalig vorhandene Xhol-Restriktionsschnittstelle 5' von den pQE-T1K-Promotor-Regulator-Sequenzen kloniert. Das resultierende Plasmid, pQE-T1K enthält das APX1A-Gen unter kontrollierter Expression, verknüpft mit dem Kanamycinresistenzgen.

4 Western-Blot-Analyse von APP-Rekombinanten. Proben des APP Tox-Stammes mit (Tox/317-QET1) und ohne (HS93Tox) der APXA-Expressionskassette wurden durch Western Blotting neben den Elternstämmen HS93 untersucht. Der Blot wurde mit Kaninchen-Antiserum, welches in unserem Labor hergestellt wurde, gegen die APX-Toxine inkubiert. Aus der Fig. ist ersichtlich, dass der Tox Stamm mit Anti-APX-Seren nicht reagiert, während sowohl der Elterstamm HS93 als auch der Tox Stamm, die die APXA-Expressionskassette enthalten, einzelne Polypeptide produzieren, die spezifisch mit dem Serum reagieren.

5 Konstruktion von Rekombinationskassetten, die zur Manipulation des APP-Chromosoms verwendet werden.

5A Das APX1B-Gen wurde auf dem APP-Chromosom anhand des Plasmids pIG-BKr inaktiviert. Ein EcoRI-Restriktionsfragment, welches einen Anteil der APX1B- und -D-Gene enthält, wurde aus dem APP-Chromosom isoliert und in pIC19R kloniert. Das Kanamycingen wurde in die BamHI-Schnittstellen des APX1B-Gens eingefügt. Das APX1B-Gen mit dem internen Kanamycingen wurde als ein EcoRI-Fragment in pIG317 subkloniert, um die Rekombinationskassette pIG-BKr zu bilden. Die Bindungsstellen der Oligonukleotide, die verwendet wurden, um die absonderungsdefekten Mutanten zu charakterisieren, sind angezeigt (B5 und B3). Es wird darauf hingewiesen, dass beide dieser Oligonukleotide außerhalb des in der Rekombinationskassette verwendeten EcoRI-Fragmentes binden.

5B Das APX2C-Gen wurde auf dem Chromosom anhand des Plasmidvektors pEP2C-Ampr inaktiviert. Ein PCR-Fragment, welches das APX2C-Gen und einen Anteil des APX2A-Gens enthält, wurde kloniert und das Ampr-Gen in eine einmalig vorhandene XbaI-Schnittstelle innerhalb des APX2C-Gen kloniert. Das resultierende EcoRI-Fragment wurde in pEP2 subkloniert, um die Selbstmord („Suicide")-Kassette pEP2C-Ampr zu bilden.

6 Eine Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um die chromosomalen Mutanten HS22BKanr (6A) und HS93CAmpr (6B) zu charakterisieren. Von jeder der Mutanten wurde genomische DNA isoliert und als Template für die PCR Reaktion verwendet. Oligonukleotide, welche die Insertionsstelle überspannten (5), produzierten einzelne Banden, welche mit der vorhergesagten Größe jedes Elternstammes und der genomischen Mutanten übereinstimmten. Jede Mutante produzierte ein PCR-Produkt, das größer war als das des Elternstammes und dessen Größe einer Vergrößerung entsprechend dem eingesetzten Antibiotikaresistenzgen entsprach. Die erhaltenen PCR-Produkts wurden auf einen Southern Blot aufgetragen und entweder mit dem APX-Gen, das das Ziel der Insertion war, oder dem zur Selektion verwendeten Antibiotikaresistenzgen inkubiert.

7 Abgesonderte Proteine (sup) und Gesamtkulturproteine (son) des APP-Tox-Stammes (HS93CA) und der HS93CAmpr-Mutante wurden durch Western Blotting neben dem Elternstamm HS93 untersucht. Der Blot wurde mit Kaninchern-Antiserum, das in unserem Labor hergestellt worden ist, gegen die APX-Toxine inkubiert. Aus dieser Fig. ist ersichtlich, dass der ToxStamm nicht mit Anti-APX-Serum reagiert, während sowohl der Elternstamm HA93 als auch die HS93CAmpr-Rekombinante einzelne Polypeptide produzieren, die abgesondert werden und spezifisch mit dem Serum reagieren.

8 pIG-basierte Kassetten für die Expression von Fremdproteinen in APP. Für die Expression von Fremdproteinen von APP wurde eine Reihe pIG-basierter Expressionskassetten konstruiert. Die Gene, die Fremdproteine IL6 (8A) und CAT (8B) kodierten, wurden samt geeigneten Promotoren in pIG-basierte Plasmide kloniert, um eine Expression in APP zu ermöglichen.

9 Expression von Schweine-IL6 von APP.IL6 wurde in einen geeigneten Plasmidvektor (pIG-IL6) kloniert, um eine Expression in E. coli (E.coli/pIG3-IL6) und APP (HS93/pIG-IL6) zu erhalten. Proben von Übernachtkulturen von APP HS93(1), APP HS93/pIG-IL6 (2), E.coli/pIG3-IL6 (3 und 4), gereinigtes IL6 (5 und 6), zusammen mit einer negativen E. coli-Kontrolle (7) wurden durch Western Blotting anhand von monoklonalen IL-6-spezifischen Antikörpern analysiert.

BEISPIEL 1 MATERIALIEN UND METHODEN Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen

Die in dieser Studie verwendeten APP-Bakterienstämme wurden freundlicherweise von Dr. Pat Blackall (Animal Research Institute, Moorooka, QLD, Austr.) zur Verfügung gestellt. APP-Stämme wurden bei 37°C unter kontinuierlichem Schütteln in Hirn-Herz-Medium (brain heart infusion broth) gezüchtet, das mit Nikotinamidadenindinukleotid in einer Endkonzentration von 10 &mgr;g/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, M.O., USA) angereichert war. Blutagar wurde hergestellt, indem 5% sterile entfibrinierte Pferdeerythrozyten zu dem BHI-Agar gegeben wurden. Antibiotika wurde in einer Endkonzentration von 25 &mgr;g/ml Kanamycin, 50 &mgr;g/ml Streptomycin oder 5 &mgr;g/ml Ampicillin verwendet, sofern im Text nicht anders angegeben. In der gesamten Studie wurde der E.coli-Stamm DH5☐ unter Anwendung von Standardtechniken wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben verwendet.

Isolierung von genomischer APP DNA

Die in einem ml einer in BHI-Medium, ergänzt mit NAD (10 &mgr;g/ml), gezüchteten Übernachtkultur von APP-HS25 vorhandenen Bakterien wurden durch Zentrifugation gesammelt und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml TE (10 mM Tris-HCl pH 8,5/1 mM EDTA), enthaltende Lysozym (7,5 mg/ml), resuspendiert und bei 37°C für 2 Std. inkubiert, wobei anschließend die Lösung auf eine Endkonzentration von 0,1 M NaCl, 1% SDS und 2,5 &mgr;g/ml Proteinase K eingestellt und die Inkubation über Nacht bei 50°C fortgesetzt wurde. Am nächsten Tag wurde die Zubereitung auf 0,5 M NaCl eingestellt und zweimal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (100:99:1, Vol./Vol./Vol.) extrahiert. Anschließend wurde die genomische DNA durch Zugabe von 0,6 Volumen Isopropanol ausgefällt.

Isolierung und Klonierung des APX1A-Gens

Amplifikation des APX1A-Gens erfolgte anhand der Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Die Reaktionen erfolgten in 50-&mgr;l-Volumen, umfassend 50 ☐g genomische APP-DNA (HS25), 3 ☐g Oligonukleotidprimer, 50 mM KCL, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 200 mg/ml BSA, je 200 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP plus 1 Einheit einer Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA). Die Reaktionen wurden mit dem gleichen Volumen Paraffinöl überschichtet und 1 Min. auf 94°C erhitzt, 2 Min. auf 55°C abgekühlt und 5 Min. auf 72°C erhitzt. Dieser Zyklus wurde 35 Mal mit einem DNA-Thermocycler von Perkin-Elmer-Cetus wiederholt. Ausgehend von der veröffentlichten Sequenz des APX1-Gens (Frey et al., 1991) wurden spezifische Oligonukleotide entworfen. Die Sequenz der beiden Oligonukleotide war 5'-GGA GGA TCC ATG GCT AAC TCT-3' und 5'-ACC TAC CCG GGA TAG GAT TGC TAT TT-3', und war entworfen, um ein PCR-Produkt mit einer BamHI-Schnittstelle am 5'-Ende und einer SmaI-Schnittstelle am 3'-Ende zu produzieren, um die Klonierung zu erleichtern. Die Oligonukleotide wurden mit einem Gene Assembler Plus DNA Synthesizer (Pharmacia, Schweden) synthetisiert. Produkte der PCR-Reaktionen, die dem vorhergesagten Molekulargewicht des APX1-Gens entsprachen, wurden durch Genreinigung (BRESATech, Australien) aus den Agarosegelen isoliert, mit den Restriktionsenzymen BamHI und SmaI verdaut und in die BamHI- und SmaI-Schnittstellen von pUC18 (Yanish-Perron et al., 1985) kloniert. Die Bestätigung von Klonen, die das APX1-Gen enthielten, erfolgte durch Doppelstrangsequenzierung (Ergebnisse nicht gezeigt).

Isolierung des APX1A-Gens aus dem APP-Chromosom

Ausgehend von den veröffentlichten Daten sind die 3' liegenden 2 kb des APX1A-Gens auf einem HindIII-Fragment von etwa 5 kb kodiert (Frey et al., 1993). Um dieses Fragment zu isolieren, wurde die genomische APP-HS25-DNA vollständig mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und auf einem Agarosegel nach Fragmentgröße aufgetrennt. Verdaute DNA wurde durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht, und die Region, die etwa 5 kb entsprach, wie mittels DNA-Molekulargewichtsstandards (Progen, Australien) geschätzt, ausgeschnitten und die DNA mit Gene Clean (BRESATech, Australien) gereinigt. Die nach Größe selektierte genomische DNA wurde in pUC18 kloniert und in E.coli transformiert. Die resultierende E.coli-Bibliothek wurde mit dem APX1A-PCR-Fragment als Sonde inkubiert, und positive Klone wurden ausgewählt. Die Authentizität der durch Hybridisierung identifizierten Klone erfolgte mittels Restriktionsenzymverdau.

Transformation von APP mit Plasmidvektoren

Die Erzeugung elektrokompetenter APP und die Bedingungen zum Einführen von Plasmid-DNA in diese Zellen durch Elektroporation (0,2-cm-Küvetten, 400 SL, 1,25 kV und 25 &mgr;F) erfolgte, wie von Frey (1992) beschrieben, mit der Ausnahme, dass 200-&mgr;l-Aliquots kompetenter Zellen für die Elektroporation verwendet wurden. Aus Übernacht-Kulturen die unter Selektionsbedingungen mit Antibiotikagewachsen waren, wurde mittels Magic Minipreps (Promega) Plasmid-DNA von APP isoliert.

Isolation von Regionen des APP-Chromosoms mittels PCR

Amplifikation von Regionen des APP-Chromosoms erfolgte mittels der Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Die Reaktionen wurden in 50-&mgr;l-Volumen, umfassend 50 ☐g genomische DNA, 3 ☐g Oligonukleotidprimer, 50 mM KCL, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 200 mg/ml BSA, je 200 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP plus 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA), durchgeführt. Die Präparation von genomischer APP-DNA war wie in Prideaux et al. (1995) beschrieben, wobei SDS und Proteinase K verwendet wurden. Die Reaktionen wurden mit dem gleichen Volumen Paraffinöl überschichtet und 1 Min. auf 94°C erhitzt, 2 Min. auf 55°C abgekühlt und 5 Min. auf 72°C erhitzt. Spezifische Oligonukleotide wurde mit einem Gene Assembler Plus DNA Synthesizer (Pharmacia, Schweden) synthetisiert. Produkte der PCR-Reaktionen wurden auf Agarosegelen aufgetrennt und durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Mutagenese des APP-Chromosoms innerhalb des APX1B-Gens

Das Rekombinationsplasmid pIG3-BKr, das zur Inaktivierung des APX1B-Gens konzipiert war, wurde durch Elektroporation in APP HS22 eingebracht, wie von Prideaux et al. (1997) beschrieben, und Transformanden wurden auf BHI/NAD-Agar, der Kanamycin enthielt, selektiert. In APP-Transformanden, welche das Rekombinationsplasmid enthielten, wurde dann pIG3-Ampr, isoliert aus APP, durch Elektroporation eingeführt, und die Transformanden wurden auf BHI/NAD-Agar, der Kanamycin und Ampicillin enthielt, selektiert. Das Vorhandensein beider Plasmide wurde durch erneute Isolierung von Plasmiden bestätigt, indem Magic-Miniprep-Protokolle (Promega) verwendet und Restriktionsenzymanalyse durchgeführt wurde. Ein Transformand, der beide Plasmide enthielt, wurde über Nacht durch Schütteln in Ampicillin- und Kanamycin-haltigem BHI/NAD gezüchtet. Die Kultur wurde 1:100 in 10 ml BHI/NAD enthaltend Ampicillin (50 &mgr;g/ml) verdünnt und über Nacht geschüttelt. Die Subkultivierung wurde insgesamt 6 Mal wiederholt, wonach Verdünnungen der Kultur auf Kanamycin-haltigen BHI/NAD-Blutagarplatten ausgestrichen wurden. Kolonien, die keine Nämolysezonen auf Blutagarplatten produzierten, wurden identifiziert und zur weiteren Charakterisierung isoliert.

Southern-Blot-Analyse von PCR-Produkten

Produkte von PCR-Reaktionen wurden auf 1 %igen Agarosegelen neben DNA-Molekulargewichtsmarkern (Progen, Australien) aufgetrennt, damit nach Anfärben mit Ethidiumbromid eine Größenschätzung durchgeführt werden konnte. Die aufgetrennte DNA wurde mit einem Vakuum-Blot-System (Pharmacia) entsprechend den Anleitungen des Herstellers auf Hybond-N-Membranen (Amersham) übertragen. Membranen wurden über Nacht bei 65°C in Puffer mit 5x SSPE (1xSSPE: 0,18 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH 7,7), 5 × Denhardt's-Lösung (1 × Denhardt's: 0,02 % BSA, 0,02 % Ficoll und 0,02 % Polyvinylpyrrolidon) und 0,5 % SDS hybridisiert. Die Hybridisierungssonden wurden mit dem Random-Hexamer-Primer-System (BRESATech, Adelaide, Australien) nach den Anleitungen des Herstellers markiert. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen mit einer abschließenden Stringenz von 0,1 % SDS/0,1 × SSPE bei 65°C für 10 Min. gewaschen und einem Röntgenfilm (Fuji RX) ausgesetzt.

Produktion von Antiseren

Übernachtkulturen von APP HS25 wurden 1 zu 20 verdünnt und bei 37°C unter Schütteln gezüchtet, bis ein OD600 von 0,8 erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen bei 12.000 Umdrehungen pro Minute 12 Min. lang bei 4°C zentrifugiert und die Proteine im Überstand mit dem Verfahren von Fedorka-Cray et al. (1990) gereinigt. Kaninchen erhielten insgesamt drei Dosen gereinigten Proteins (100 &mgr;g) in Abständen von zwei Wochen, von denen die erste in komplettem Freund-Adjuvans erfolgte und anschließende Impfungen in inkomplettem Freund-Adjuvans. Zwei Wochen lang nach der letzten Verstärkungsimpfung (Boost) wurde Serum abgenommen.

Western-Blot-Analyse

Eine Western-Blot-(Immunblot)-Analyse wurde nach dem Verfahren von Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Zum Nachweis von APX-Proteinen wurde Kaninchenserum in einer Verdünnung von 1:50 verwendet, das gegen APP-HS25-Proteine aus Kulturüberstand hergestellt worden ist. Das Kaninchenserum wurde gegen APP Tox voradsorbiert, um Kreuzreaktionen und nicht gegen APX gerichtete Antikörper vor dem Gebrauch zu entfernen. Das in einer Verdünnung von 1:1000 verwendete Konjugat war Schaf-Anti-Kaninchen-Ig-Antiserum, konjugiert mit affinitätsgereinigter HRP (Silenus), mit Tetramethylbenzidin (McKimm-Breschkin, 1990) als Substrat. Bakterienproben für die Western-Blot-Analyse wurden hergestellt, indem Übernachtkulturen 1 zu 20 in dem geeigneten Wachstumsmedium verdünnt und bei 37°C unter kräftigem Schütteln inkubiert wurden, bis ein OD600 von 0,8 erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt wurden Proben, die 20 &mgr;l Gesamtkultur enthielten, durch SDS-PAGE analysiert, und Proteine wurden mit einer Bio-Rad Transblot Cell wie in den Spezifikationen des Herstellers beschrieben, auf Nitrocellulose (Bio-Rad) übertragen.

Impfung und Challenge-Infektion von Mäusen

Sechs Wochen alte weibliche Balb/C-Mäuse, erhalten vom Walter and Elisa Hall Institute of Medical Research (Parkville, Vic, Australien), wurden in der CSIRO Division of Animal Health (Parkville, Vic, Australien) in PC2-Einrichtungen mit Wasser und Futter ad libitum gehalten. Den Mäusen wurde am Tag 0 und 14 intraperitoneal (IP) eine 200 &mgr;l APP-Zubereitung injiziert und sie erhielten an Tag 28 eine Challenge-Infektion IP. Kontrollmäuse erhielten 200 &mgr;l BHI-Bouillon IP. Die Anzahl der Mäuse, die 24 Stunden nach der Challenge-Infektion überlebten, wurde protokolliert und wurden als geschützt vor einer Challenge-Infektion oder mit einer subletalen Dosis geimpft betrachtet.

Antikörperassay

Allen Mäusen wurde vor der Impfung und vor der Verstärkungsimpfung (Boost) oder der Challenge-Infektion Blut aus der Schwanzvene abgenommen. Die Antikörperantwort auf APX1A oder 2A wurde durch einen ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) mit 0,5 &mgr;g Poly-His-gereinigtem APX je Well, wie von Prideaux et al. (1995) beschrieben, durchgeführt. Titer sind ausgedrückt als die höchste Verdünnung, die noch optische Dichten über denen von Seren von unbehandelten Mäusen ergaben.

BEISPIEL 2 ENTWICKLUNG EINES PLASMIDVEKTORS FÜR APP

Eine Übersicht über 14 APP-Stämme (zur Verfügung gestellt von Dr. Pat Blackall; Animal Research Institute, Moorooka, QLD, Aust.) identifizierte zwei Stämme, die Plasmide aufwiesen, welche durch Magic-Miniprep-Plasmidisolierung (Promega) kombiniert mit Agarosegel/Ethidiumbromidnachweis detektiert werden konnten (Ergebnisse nicht gezeigt). Einer dieser Stämme, HS205, erwies sich als resistent gegen Streptomycin. Plasmid-DNA, die aus diesen Bakterien isoliert wurde, konnte sowohl E. coli als auch APP eine Streptomycinresistenz vermitteln, wenn sie durch Elektroporation eingeführt wurde.

Restriktionsenzymanalyse von Plasmid-DNA, die aus E. coli isoliert wurde, welche mit Plasmid-DNA, isoliert aus HS205, transformiert und auf Streptomycin selektiert wurden, identifizierte ein 4,2-kb-Plasmid (pIG3), das seine eigene Replikation und eine Streptomycinresistenz kodiert (1A). Für pIG3 wurde eine Restriktionsenzymkarte erstellt, und durch einen Prozess des Restriktionsenzymverdaus und Ligation wurde festgestellt, dass, wenn ein 2,3-kb-PstI-0-Subfragment von pIG3 selbst-ligiert (pIG317) und in E. coli transformiert wurde, die resultierenden Transformanden streptomycinresistent waren (1B).

Um die Einsatzflexibilität dieses Plasmids zur Übertragung von Fremd-DNA in E. coli und APP zu erhöhen, wurde das 450-bp-HaeII-Fragment von pIC19R, welches die multiple Klonierungsstelle und das Lac-Gen enthält (Marsh et al., 1984), in die einzige EcoRI-Schnittstelle von pIG317 subkloniert, die sich 300 bp nachgeschaltet (downstream) zur PstI-Schnittstelle befindet (pIG3B, 1B). Das resultierende Plasmid pIG38 (Abbildung 1C) weist eine multiple Klonierungsstelle auf, die sich für das Einsetzen von Fremd-DNA in das Plasmid eignet, und ein Lac-Gen zur schnellen Selektion von Plasmiden, die Fremd-DNA tragen, basierend auf der Blau/Weiß-Selektion in Gegenwart von X-gal in E. coli.

BEISPIEL 3 EXPRESSION DES APX1A-GENS in E. COLI

Um etwaige Fehler zu minimieren, die während der PCR in das offene Leseraster (ORF) von APX1A eingeführt worden sein könnten, und um eine korrekte Ausrichtung des ORF in dem Expressionsvektor zu ermöglichen, wurde das genomische Fragment in Verbindung mit dem PCR-Fragment verwendet, um das Expressionsplasmid pQE-T1 zu konstruieren, wie in 2 skizziert. Diese Strategie ermöglichte, dass der APX1A-ORF im Leseraster mit dem Poly-His-Reinigungssignal in pQE30 (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA, USA) eingeführt werden konnte und überwiegend aus genomischer DNA bestand.

Die Expression von APX1A von pQE-T1 stand unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotor-/Operatorelementes, bestehend aus dem Promotor des E. coli-Phagen T5 und zwei Lac-Operatorsequenzen. Optimale Expression von APX1A von pQE-T1 wurde erreicht, indem eine Übernachtkultur von E. coli, die den Expressionsvektor enthielt, in Gegenwart von Ampicillin (100 &mgr;g/ml) gezüchtet wurde. Am folgenden Tag wurde die Kultur 1 zu 50 verdünnt und bei 37°C unter starkem Schütteln inkubiert, bis eine OD600 von 0,8 erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Induktion des Toxins erreicht, indem IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben wurde und die Kultur für weitere 5 Stunden gezüchtet wurde, wobei E. coli anschließend durch Zentrifugation bei 8.000 Umdrehungen pro Minute für 12 Minuten gesammelt wurden.

Die Reinigung von APX1A wurde durch immobilisierte Ni-Chelat-Affinitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen nach Anleitung des Herstellers (QIAGEN Inc. Kalifornien, USA) erreicht. Dieses System nutzt den 6-His-Marker, der auf Proteinen vorhanden ist, die mit dem pQE-System exprimiert werden.

BEISPIEL 4 KONSTRUKTION EINER APX1A-EXPRESSIONSKASSETTE FÜR APP

Um die Konstruktion von pIG-basierten APX1-Expressionskassetten zu erleichtern, wurde das Kanamycinresistenzgen aus pUC4K (Pharmacia) isoliert und über pIC20R in pQE-T1 kloniert, wie in 3 gezeigt. Das resultierende Plasmid, pQET1K, enthielt das Kanamycinresistenzgen und das APX1A-Gen, verknüpft mit dem T5-Promotor, beide flankiert von SalI-Restriktionsenzymschnittstellen. Das SalI-Fragment wurde isoliert und mit pIG3B, welches zuvor mit SalI verdaut wurde, ligiert und in E. coli transformiert. Der gewünschte Klon wurde identifiziert, indem Transformanden ausgewählt wurden, die kanamycinresistent waren und in Gegenwart von X-Gal weiße Kolonien produzierten. Plasmid-DNA wurde isoliert und anhand einer Restriktionsenzymanalyse wurde das vorhergesagte Profil von pIG3B-T1K bestätigt (3).

BEISPIEL 5 KONSTRUKTION DES APP-IMPFSTOFFSTAMMES

Während der Durchführung einer ortsspezifischen Mutagenese des Chromosoms von HS93 APP (Serovar 7; nur Produktion von APX2), darauf ausgerichtet, einen kleinen Abschnitt des APX2C-Gens zu deletieren, wurde ein Isolat erhalten, dass auf Blutagarplatten keine Hämolysezone produzierte. Die weitere Charakterisierung dieses Isolates (APP Tox) zeigte, dass ihm ein großer Abschnitt des Chromosoms in der Umgebung der vorgesehenen Deletionsstelle fehlte. Der resultierende Stamm APP Tox enthält keine strukturellen oder aktivierenden APX-Gene, obgleich er noch die zur APX-Sekretion erforderlichen Proteine produziert, da diese Gene sich an anderer Stelle auf dem APP-Chromosom befinden.

Der Stamm APP Tox wurde mit pIG3B-T1K wie im Abschnitt „Materialien und Methoden" beschrieben unter Verwendung einer Kanamycin-Selektion transformiert. Aus kanamycinresistenten Kolonien wurde Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsenzymverdau analysiert, um die vorhergesagten Profile von pIG3B-T1K zu bestätigen.

BEISPIEL 6 CHARAKTERISIERUNG DES APP-IMPFSTOFFSTAMMES

Übernachtkulturen des Stammes APP Tox, der pIG3B-T1K enthielt, sowie der Stamm APP Tox und HS93 wurde durch Western Blotting untersucht, wobei Antiseren verwendet wurden, die in Kaninchen gegen die abgesonderten Proteine von HS25 (d. h. APX1 und 2) hergestellt wurden. Aus dem Western Blot (4) ist ersichtlich, dass der Stamm APP Tox die in dem Serum vorhandenen Antikörper nicht bindet, während sowohl Wildtyp-HS93 als auch APP Tox/pIG3B-T1K eine einzelne Bande aufwiesen. Die mit Tox/pIG3B-T1K detektierte Bande ist größer als die mit dessen Elternstamm HS93 erhaltene, da der Elternstamm APX2 (offensichtliches MW von 103–105 kDa) exprimiert, während Tox/pIG3B-T1K APX1 produziert (offensichtliches MW von 105–110 kDa).

BEISPIEL 7 VERGLEICH DER VIRULENZ VON APP-STÄMMEN BEI MÄUSEN

Übernachtkulturen von APP HS93, HS25 und Tox wurden unter kräftigem Schütteln bei 37°C in BHI-Bouillon, ergänzt mit NAD (10 &mgr;g/ml), gezogen. Am folgenden Tag wurden die Kulturen 1:20 verdünnt und die neuen Kulturen inkubiert, bis ein OD600 von 0,8 erreicht war. Bei diesem OD600-Wert beträgt die Anzahl der lebenden APP 1 × 109 je ml (Daten nicht gezeigt). In mit NAD (10&mgr;g/ml) versetzter BHI-Bouillon wurden verschiedene Verdünnungen der Kulturen hergestellt und 200 &mgr;l den Mäusen IP verabreicht. Die Mäuse wurden nach der Challenge-Infektion beobachtet und die Gesamtanzahl der verstorbenen Mäuse nach 24 Stunden notiert. Unter unseren Bedingungen starben in diesem Zeitraum keine Mäuse an der APP-Infektion, wobei die erhaltenen Ergebnisse in Tabelle 1 präsentiert sind. Ein Vergleich der mit jedem Serovar erhaltenen toten Mäuse würde anzeigen, dass HS25, der zu Serovar 1 gehört und sowohl APX1 als auch APX2 produziert, der virulenteste APP-Stamm ist (100% Todesfälle bei 1 × 107), gefolgt von HS93 (100% Todesfälle bei 1 × 108), der zu Serovar 7 gehört und nur APX2 produziert, während der Stamm Tox (Serovar 7) selbst bei der höchsten verwendeten Dosis keine Mäuse tötete. Dieses Ergebnis stimmt mit Beobachtungen aus Pleuropneumonie-Ausbrüchen bei Schweinen überein, in denen die schwersten Ausbrüche mit APP-Serovaren verbunden waren, die APX1 und 2 produzieren.

Tabelle 1: Mäusen wurden 200 &mgr;l einer Bakteriensuspension injiziert, die verschiedene Mengen von APP-Stämmen, d. h. der Stämme HS25, HS93 oder Tox, enthielt. Nach 24 Stunden wurde die Anzahl der verstorbenen Tiere notiert und als Prozentanteil der Gesamtpopulation ausgedrückt.

BEISPIEL 8 SCHUTZ DER MÄUSE VOR EINER TÖDLICHEN APP-CHALLENGE-INFEKTION

Es wurden Übernachtkulturen von HS93 und Tox hergestellt; am nächsten Tag wurde eine Verdünnung von 1:20 hergestellt und bis zu einem OD600 von 0,8 gezüchtet. Es wurden Verdünnungen aller Bakterien hergestellt, so dass eine Impfung mit 200 &mgr;l entweder 2 × 107 HS93 oder 2 × 108 Tox enthielt. Diese Werte wurden gewählt, um die Impfdosis zu maximieren, aber noch eine subletale Challenge-Infektion aufrecht zu erhalten. Kontrollmäuse erhielten 200 &mgr;l BHI-Bouillon. Die Mäuse wurden IP an Tag 0 und 14 geimpft und erhielten an Tag 28 als Challenge-Infektion entweder 2 × 108 HS25 oder 5 × 108 HS93, wobei nach 24 Stunden die Zahl der verstorbenen Mäuse notiert wurde (Tabelle 2). Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass sowohl HS93 als auch Tox vollständigen Schutz vor einer homologen Challenge-Infektion boten, während HS93 einen gewissen Schutz vor einer heterologen Challenge-Infektion lieferte. Der Tox-Stamm bot keinen Schutz vor einer heterologen Challenge-Infektion, was auch bei Bakterin-basierten inaktivierten Impfstoffen beobachtet wird und auf eine Rolle von APX-Toxinen als Serotyp-kreuzprotektive Antigene hinweist.

Um die Fähigkeit von APP Tox zu untersuchen, die eine inaktivierte Form von APX1 von einem Plasmid exprimieren, Mäuse vor einer letalen heterologen Challenge-Infektion mit APP, wurden Mäuse mit APP Tox oder mit APP Tox/pIG3B-T1K nach folgendem Schema geimpft. Am Tag 1 wurde den Mäusen aus der Schwanzvene Blut entnommen und anschließend wurden die Tiere IP mit 200 &mgr;l BHI geimpft, das 2 × 108 Tox oder Tox/pIG3B-T1K enthielt. Der Vorgang wurde am Tag 14 wiederholt, und am Tag 28 wurde den Mäusen aus der Schwanzvene Blut entnommen, und den Tieren wurde 5 × 108 oder 1 × 108 APP HS25 als Challenge-Infektion injiziert. Die von den Mäusen abgenommenen Seren wurden in einem ELISA verwendet, um gegen APX1 gerichtete Antikörper zu bestimmen, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden" beschrieben ist. Kontrollseren stammten von Mäusen, die zwei Dosen von HS93 (2 × 108) oder HS25 (2 × 106) IP in zweiwöchigen Abständen erhalten hatten.

Die in Tabelle 3 präsentierten ELISA-Ergebnisse zeigen, dass eine einzige Dosis von Tox/pIG3B-T1K ausreicht, um bei Mäusen eine gute Antikörperantwort zu induzieren, die auf einer niedrigeren Ebene äquivalent zu der Antwort ist, die nach zwei Dosen von HS25 erreicht wird. Die Anti-APX1-Antwort war nach einer zweiten Impfung mit Tox/pIG3B-T1K erheblich stärker, während Mehrfachimpfungen mit HS93 oder Tox keine Antikörperwerte über dem Hintergrund produzierten. Die Unfähigkeit, Antikörper zu detektieren, die nach Mehrfachimpfungen mit HS93, der APX2 produziert, APX1 erkennen, würde darauf hinweisen, dass gegen APX2 gerichtete Antikörper nicht mit APX1 kreuzreagieren können. Dies widerspricht der Fähigkeit von HS93, welcher APX2 exprimiert, einen gewissen Schutz vor einer heterologen Challenge-Infektion zu bieten und könnte den Unterschied zwischen einem von E. coli exprimierten Antigen und einem von APP stammenden widerspiegeln.

Mäuse, die als Challenge-Infektion 10 ID50 von HS25 erhalten haben, zeigten keinen Schutz nach Impfung mit Tox, während solche, die mit Tox/pIG3B-T1K geimpft wurden, einen Schutz von 60% zeigten. Wenn das Niveau der Challenge-Infektion auf 5 ID50 von HS25 reduziert wurde, wurde wiederum kein Schutz mit Tox alleine beobachtet, während Tox, welcher das APX1A-Gen von einem Plasmid exprimierte (Tox/pIG3B-T1K), einen Schutz von 100% zeigte (Tabelle 4).

Tabelle 2. Mäuse wurden zweimal in zweiwöchigen Abständen intraperitoneal mit 2 × 108 APP Tox oder 2 × 107 des Elternstammes HS93 geimpft und erhielten anschließend zwei Wochen später eine Challenge-Infektion mit HS93 (homolog) oder HS25 (heterolog). Kontrollmäuse erhielten 200 ml BHI-Bouillon. Die nach der Challenge-Infektion auftretenden Todesfälle wurden notiert als Prozentanteil von Mäusen in jeder Gruppe, die innerhalb von 24 Stunden verstarben.

Tabelle 3. Mäuse wurden zweimal in zweiwöchigen Abständen intraperitoneal mit 2 × 108 Tox oder Tox/pIG3B-T1K geimpft, und vor und zwei Wochen nach dem Boosting wurde Serum abgenommen. Kontrollmäuse erhielten zwei Dosen mit 2 × 107 HS93 oder 2 × 106 HS25. APX1A-spezifische Antikörper wurden in einem ELISA gemessen und der Titer ausgedrückt als Kehrwert der letzten Verdünnung, die Absorptionswerte über dem Hintergrund ergab.

Tabelle 4. Mäuse wurden zweimal in zweiwöchigen Abständen intraperitoneal mit dem Tox Stamm von APP mit und ohne Plasmid pIG3B-T1K geimpft, welches die Expression des APX1A-Proteins kodiert. Kontrollmäuse erhielten zwei Dosen vmn BHI-Medium. Zwei Wochen nach der letzten Impfung erhielten die Mäuse eine heterologe Challenge-Infektion mit APP HS25.

BEISPIEL 9 MUTAGENESE DES APX18-GENS Konstruktion von Rekombinationsplasmiden

Es wurde eine Rekombinationskassette, die eine ortsspezifische Mutagenese des APX1 B-Gens ermöglicht, konstruiert, in dem ein 2,4-kb-EcoRI-Fragment, das das APXB-Gen trägt (Frey et al., 1993), in pIC19R (Marsh et al., 1984) kloniert wurde. In das APX1B-Gen, das mit BamHI deletiert war, wurde ein 1,2-kb-BamHI-Fragment kloniert, welches das Kanamycin-Resistenzgen (Kanr) von pUC4K (Pharmacia) trägt (5A). Das APX1B-Gen mit dem internen Kanr-Gen wurde als ein EcoRI-Fragment isoliert und in die EcoRI-Stelle des APP-Plasmidvektors pIG317 (Prideaux et al., 1995) kloniert, um die Rekombinationskassette pIG3-BKr zu bilden.

Für die Plasmidsegregation wurde das Plasmid pIG3-AMPr verwendet, um die Rekombination zwischen pIG3-BKr und dem APP-Chromosom zu erleichtern. Dieses Plasmid wurde konstruiert, indem das Ampicillin-Resistenzgen (AMPr) (Murphy et al.) in die multiple Klonierungsstelle von pIG317 kloniert wurde.

Zur Mutagenese des APX1B-Gens wurde die Rekombinationskassette pIG3-BKr, die ein EcoRI-Fragment des APX1B-Gens, unterbrochen von einem Kanr-Genmarker, umfasste, in dem APP-Plasmidvektor pIG317 verwendet (5A). Wildtyp-APP-HS22 (Serovar 1: APX1 und APX2) wurde mit pIG3-BKr und anschließend mit einem Ampicillin-resistenten Derivat von pIG317 (pIG3-Ampr) transformiert. Mit beiden Plasmiden transformierte Zellen wurden auf Medium selektiert, das sowohl Ampicillin und Kanamycin enthielt. Zur Erhaltung von pIG3-AMPr und zur Förderung des Verlustes von pIG3-BKr durch Plasmidsegregation wurden Zellen, die beide Plasmide enthielten, durch ein Medium geführt, das nur Ampicillin enthielt. Zur Identifizierung von Zellen, bei denen eine Rekombination zwischen pIG3-BKr und dem APP-Chromosom stattgefunden hatte, wurden Kulturen auf BHI/NAD-Blutagarplatten ausgestrichen, die Kanamycin enthielten. Jede Bakterienkolonie, die keine Hämolysezonen auf Blutagarplatten produzierte, wurde auf eine frische Blutagarplatte aufgetragen, die Kanamycin enthielt. Es wurde eine einzige Kolonie identifiziert (HS22B), die sowohl gegen Kanamycin resistent war, als auch keine Hämolysezone produzierte. Diese Kolonie wurde in Kanamycin-haltiger BHI/NAD-Bouillon gezüchtet und genomische DNA wurde wie zuvor beschrieben gewonnen (Prideaux at al., 1997).

Aus HS22B und dem Wirtsstamm HS22, der pIG3-BKr enthielt, wurde genomische DNA isoliert und durch PCR mit Oligonukleotiden (B5'-GCATTTTGGAACAAG; B3'-CGGTGATCAAATAGC) untersucht, die so gestaltet waren, dass sie sich an das APP-Genom außerhalb der Region innerhalb der Rekombinationskassette anlagern (5A). Die Produkte der PCR wurden durch Southern-Blot-Analyse, wie unter „Materialien und Methoden" beschrieben, analysiert, indem die isolierten Gene Kanr oder APX1B als Sonden verwendet wurden (6A). Aus 6A ist ersichtlich, dass die Region des APP-Chromosoms, die das APX1B-Gen enthält und in der PCR amplifiziert wurde, in dem nicht-hämolytischen/Kanamycin-resistenten rekombinanten HS22B etwa 1,2 kb größer ist (äquivalent zur Größe des Kanr-Gens) als im Elternstamm HS22. Die Analyse der PCR-Produkte durch Southern-Blot-Analyse bestätigte, dass die amplifizierten Produkte die Region des APP-Chromosoms wiedergeben, welche das APX1B-Gen enthält, und im Falle von HS22B hybridisierte diese vergrößerte Region außerdem spezifisch mit dem Kanr-Gen. Diese Ergebnisse bestätigen, dass zwischen dem APP-Chromosom und pIG3-BKr eine homologe Rekombination stattgefunden hat, die in einem ortsspezifischen Transfer des Kanr-Gens auf das APP-Chromosom resultierte.

BEISPIEL 10 MUTAGENESE DES APX2C-GENS

Zur Verwendung bei einer ortsspezifischen Mutagenese des APP-APX2C-Gens wurde das Plasmid pEC-CAmpr (5B) konstruiert. Ein 3,4-kb-Fragment, welches das APX2C-Gen enthielt, die ersten 700 bp des APX2A-Gens, sowie die Region unmittelbar 5' zum APX2-Operon wurden mittels PCR isoliert, und mit einem Pharmacia Gene Assembler Plus DNA Synthesizer wurden Oligos (5'-CGCACCATGGTCGGGC, 3'-ACGTGATCGACAATC) ausgehend von veröffentlichten Sequenzen (Frey et al., 1991) synthetisiert. Das PCR-Fragment wurde in den Mycobacterium/E.coli-Shuttlevektor pEP2 (Radford and Hodgson, 1991) kloniert. Das resultierende Plasmid pEP2-CA enthält eine einmalig vorhandene XbaI-Restriktionsschnittstelle, die sich etwa in der Mitte des offenen Leserasters von APXC befindet, in den das Ampicillin-Resistenzgen eingesetzt wurde, um das Rekombinationsplasmid pEP-CAmpr zu erzeugen.

Ortsspezifische Mutagenese des APX2C-Gens nutzte die Rekombinationskassette pEP-CAmpr (5B). Diese Kassette beruht auf dem Corynebacterium-E. coli-Shuttlevektor pEP2. In unserem Labor schlug eine Reihe von Versuchen der Transformation von APP mit pEP2 fehl, was uns zu der Schlussfolgerung veranlasste, dass APP ein nicht-zulässiger Wirt für diesen Plasmidvektor und daher ein geeigneter Selbstmord-(„Suicide")-Vektor zur Verwendung in APP ist. DNA von aus E. coli isolierten und mit Cäsiumchlorid gereinigtem pEP-C-Ampr wurde mit ClaI linearisiert. Nach dem Verdau wurde die DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt und mit Ethanol ausgefällt. Insgesamt 3 &mgr;g der linearisierten DNA wurde durch Elektroporation in APP HS93 (Serovar 7: APX2) mit dem zuvor von Prideaux et al. (1997) beschriebenen Protokoll eingebracht, und die Produkte der Elektroporation auf BHI/NAD-Blutagarplatten ausgestrichen, die Ampicillin in einer Konzentration von 1 &mgr;g/ml enthielten. Es wurde eine einzige Kolonie isoliert, die sowohl Ampicillin-resistent war als auch keine Hämolysezone auf Blutagarplatten produzierte.

Aus der keine Zonen bildenden/Ampicillin-resistenten Mutante HS93CAr und dem Elternstamm HS93 wurde genomische DNA extrahiert. Mittels Polymerasekettenreaktion wurde die Region des APP-Chromosoms untersucht, welche das APX2C-Gen enthielt, indem Oligonukleotide (5'-TACAGAACGTTGGTA, 3'-ACGTGATCGACAATC) verwendet wurden, die an das APX2-Operon an den in 5B gezeigten Stellen binden. Produkte der PCR-Reaktionen wurden durch Southern-Blot-Hybridisierung, wie in „Materialien und Methoden" beschrieben, charakterisiert, indem das isolierte Ampr oder APX2C-Gen als Sonde verwendet wurde (6). Die in 6B gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Mutante HS93CAr ein PCR-Produkt produziert, das etwa 1,5 kb (die Größe des Ampr-Gens) größer ist als im Elternstamm HS93. Produkte der PCR von beiden Bakterien hybridisierten mit dem APX2C-Gen, aber nur die des Mutantenstammes hybridisierten mit dem Ampr-Gen. Diese Ergebnisse zeigten an, dass zwischen dem APP-HS93-Chromosom und dem Selbstmord-(„Suicide")-Plasmidvektor pEP-C-Ar homologe Rekombination stattgefunden hat, die zum ortsspezifischen Transfer des Ampr-Gens auf das APP-Chromosom führte.

Logarithmische Kulturen eines jeden Mutantenstammes und deren Elternstämme wurden unter Verwendung von in Kaninchen gegen die Absonderungsproteine von APP HS25 (d. h. Serovar 1: APX1 und 2) erzeugten Antiseren durch Western Blotting untersucht, wie unter „Materialien und Methoden" beschrieben.

BEISPIEL 11 VERGLEICH DER VIRULENZ VON APP-STÄMMEN BEI MÄUSEN

Übernachtkulturen von APP HS93, HS22 und den beiden Mutantenstämmen wurden über Nacht unter kräftigem Schütteln bei 37°C in BHI-Bouillon, ergänzt mit NAD (10 &mgr;g/ml), gezüchtet. Am folgenden Tag wurden die Kulturen 1:20 verdünnt, und die neuen Kulturen inkubiert, bis eine OD600 von 0,8 erreicht war. Bei diesem OD600-Wert beträgt die Anzahl an lebendigen APP 1 × 109 Kolonie bildende Einheiten/ml (Daten nicht gezeigt). In BHI-Bouillon wurden verschiedene Verdünnungen der Kulturen hergestellt, und 200 &mgr;l 6 Wochen alten Mäusen intraperitoneal an verabreicht. Die Mäuse wurden anschließend 24 Stunden lang beobachtet, wonach der prozentuale Anteil der verstorbenen Mäuse notiert wurde. Unter unseren Bedingungen war nach diesem Zeitraum keine Maus an der APP-Infektion verstorben. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Mäuse wurden intraperitoneal mit verschiedenen Mengen von APP-Eltern – und -Mutantenstämmen inokuliert. Bei Mäusen, die nicht innerhalb von 24 Stunden an der Infektion verstarben, wurden davon ausgegangen, dass sie eine subletale Dosis erhalten hatten. Die Ergebnisse sind notiert als Prozentanteil der Population, der nicht an der Infektion verstarb.

BEISPIEL 12 SCHUTZ VON SCHWEINEN GEGEN EINE HETEROLOGE CHALLENGE-INFEKTION MIT APP

Sechs Wochen alten Schweinen wurde im Voraus Blut abgenommen, um auf vorhandene Antikörper gegen APP HS83 (Serovar 7) und APX2 zu testen, bevor die Tiere in experimentelle Gruppen aufgenommen wurden. Neun 6 Wochen alte Schweine erhielten 1 × 109 Kolonie bildende Einheiten von APP HS93CAr in 1 ml Wachstumsmedium über intranasale Inokulierung am Tag 0. Der Impfstoff wurde hergestellt, indem 10 ml BHI/NAD (10 &mgr;g/ml) mit einer einzelnen Kolonie von NS93CAr inokuliert und unter kräftigem Schütteln bei 37°C gezüchtet wurde, bis ein OD600 von 0,8 erreicht war. Das Impfschema wurde am Tag 14 entsprechend Tag 0 wiederholt.

Am Tag 28 wurden die Schweine in zwei Gruppen aufgeteilt (wie oben beschrieben) und erhielten entweder 2 × 109 APP HS25 (Serovar 1) in 2 ml Wachstumsmedium intranasal oder 2 ml BHI-Bouillon auf die gleiche Weise. Der Challenge-Stamm wurde hergestellt, indem eine einzelne Kolonie von HS25 in BHI/NAD (10 &mgr;g/ml)-Bouillon inokuliert wurden, bis ein OD600 von 0,8 erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt lag die Anzahl der lebenden Bakterien bei 1 × 109 Kolonie bildenden Einheiten/ml.

Die Anzahl der Schweine in jeder Gruppe und das Impf-/Challenge-Profil waren: Gruppe 1 Nicht geimpft und ohne Challenge-Infektion 3 Schweine Gruppe 2 Geimpft und ohne Challenge-Infektion 3 Schweine Gruppe 3 Nicht geimpft und mit Challenge-Infektion 6 Schweine Gruppe 4 Geimpft und mit Challenge-Infektion 6 Schweine

Anzahl und Schweregrad der Lungenläsionen, die bei der Autopsie 5 Tage nach der Challenge-Infektion in jeder Gruppe vorhanden waren, sind in Tabelle 6 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass eine Impfung mit HS93CAr Schweine vor einer Challenge-Infektion mit dem heterologen Stamm von APP HS25 schützte. Die drei Schweine, die weder geimpft noch infiziert wurden, hatte bei der Autopsie keine feststellbaren Lungenläsionen, was anzeigt, dass die in anderen Schweinegruppen zum Zeitpunkt der Autopsie vorhandenen Lungenläsionen aus der Behandlung nach Beginn der Impfstoffstudie resultierten. Die drei Schweine, die geimpft und nicht infiziert wurden, hatten bei der Autopsie ebenfalls keine Lungenläsionen, was anzeigt, dass der Impfstoffstamm keine Lungenläsionen in Schweinen induziert, die 2 Wochen nach der Inokulierung nachweisbar sind. Zuvor hatten wir toxindefiziente APP-Stämme in den gleichen Dosen wie bei der in diesem Experiment verwendeten Challenge-Infektion an Schweine verabreicht, die Schweine an Tag 5 einer Autopsie unterzogen und keine Läsionen beobachtet. Die sechs nicht geimpften Schweine, die eine Challenge-Infektion mit HS25 erhielten, zeigten alle bei der Autopsie zahlreiche Lungenläsionen, was anzeigt, dass das in diesen Versuchen verwendete Challenge-Niveau ausreichend war, um in ungeschützten Tieren Läsionen zu induzieren. Im Gegensatz zu den sechs nicht geimpften Kontrollen zeigte nur ein Schwein der sechs Schweine, die vor der Challenge-Infektion mit HS93CAr geimpft wurden, bei der Autopsie Anzeichen einer Läsion. Diese hatte die Form einer einzelnen Adhäsion zwischen Lunge und Rippenkäfig in dem einen Schwein, wobei die Adhäsion bei näherer Untersuchung älter erschien als die fünf Tag seit der Challenge-Infektion. Aus dieser Adhäsion wurden Bakterien isoliert, die sich als Nicht-APP erwiesen (d. h. kein NAD zum Wachstum benötigten). Unabhängig davon, ob diese Läsion aus der Challenge-Infektion mit APP HS25 resultierte, zeigt dieses Ergebnis klar das Potential von HS93CAr, Schweine vor einer heterologen Challenge-Infektion mit virulentem APP zu schützen.

DISKUSSION

Der Serovar-7-APP-Stamm HS93 wurde durch ortsspezifische Mutagenese modifiziert, um das APXC-Gen durch Insertion des Ampr-Gens zu inaktivieren, ohne die Expression der APX-A, -B- oder -D-Gene zu unterbrechen, wodurch der Impfstoffstamm HS93CAr erzeugt wurde. Prüfung des Impfstoffstammes in Mäusen zeigte, dass er gegenüber dem Elternstamm HS93 reduzierte Virulenz aufweist (Tabelle 5). Die einzige wahre Evaluierung eines Impfstoffes ist seine Fähigkeit, die Zielart vor einer Krankheit zu schützen. Um dies zu zeigen, impften wir Schweine intranasal mit BS93CAr und verabreichten eine Serovar-übergreifende Challenge-Infektion. Der für die Challenge-Infektion verwendete Stamm war HS25, welcher zu Serovar 1 gehört und sowohl APX 1 als auch APX 2 produziert. Diese Kombination der APX-Produktion ist bekannterweise mit den schwersten Ausbrüchen einer Pleuropneumonie verbunden. Ungeimpfte Schweine hatten zahlreiche Anzeichen einer APP-Infektion bei der Autopsie, wobei sowohl Lungenadhäsionen als auch -läsionen vorhanden waren (Tabelle 6). Dagegen zeigte nur eines der sechs geimpften Schweine ein Anzeichen einer Infektion, wobei es sich dabei um eine einzelne Lungenadhäsion handelte, die wahrscheinlich nicht das Ergebnis der Challenge-Infektion war. Dieses Ergebnis zeigt deutlich die Eignung des Stammes HS93CAr zur Verwendung als Lebendimpfstoff gegen Schweine-Pleuropneumonie. Es wurde auch gezeigt, dass der Impfstoff intranasal verabreicht werden kann und dieser die Fähigkeit hat, Schweine vor einer Serovar-übergreifenden Challenge-Infektion zu schützen. Dies ist der erste Bericht eines Lebendimpfstoffstammes von APP, der zur Verwendung bei Schweinen geeignet ist, um Serovar-übergreifenden Schutz zu bieten.

BEISPIEL 13 EXPRESSION VON FREMDPROTEINEN VON APP-VEKTOREN

Das Potential zur Expression von Fremdgenen von APP wurde oben in diesem Dokument gezeigt, als das APX1-Gen aus einem Serovar-1-Stamm von APP HS25 isoliert und aus einem Plasmid in dem modifizierten Serovar-7-Stamm von APP HS93-Toxin exprimiert wurde. Serovar-7-Stämme von APP kodieren keine APX1-Gene und die Konstruktion des Tox/pIG3B-T1K-Stammes und anschließende Evaluierung gibt die Fremdgenexpression von APP wieder (4). Dieser Stamm wurde weiter charakterisiert und es erwies sich, im Vergleich zu Wildtyp HS93 oder dem modifizierten HS93 Toxin (Tabelle 3), als fähig, in Mäusen Anti-APX1-Antikörper zu induzieren. Die Expression des APX1-Gens von dem Tox-Stamm produzierte außerdem einen Lebendimpfstoff, der sich als in der Lage erwies, Mäuse vor einer heterologen Challenge-Infektion mit APP zu schützen, wiederum im Gegensatz zu dem Tox-Elternstamm.

Um das Potential von APP als Bakterienvektor weiter aufzuzeigen, wurde eine Reihe von pIG-basierten Expressionskassetten für die Expression einer Reihe von Fremdproteinen von APP konstruiert, wie in 8 gezeigt. Die Gene, die Fremdproteine kodierten, wurden zusammen mit geeigneten Promotoren in pIG-basierte Plasmide kloniert, um eine Expression in APP zu ermöglichen. Nach Konstruktion und Charakterisierung in E. coli wurden die Expressionsplasmide in APP transformiert, wie unter „Materialien und Methoden" beschrieben. Aus antibiotikaresistenten Kolonien wurde Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsenzymverdau analysiert, um die vorhergesagten Profile zu bestätigen.

Zytokine sind die Hormone des Immunsystems, die die Wirkung von Immunantworten nach Infektion und Impfung kontrollieren und festlegen. Zytokine können verwendet werden, um die Immunantwort auf ein bestimmtes Antigen zu erhöhen und die Immunantwort in die angemessenste Richtung (humoral oder zellulär) zu lenken, um protektive Immunität zu induzieren. Die Expression von Zytokinen von APP-Vektoren könnte sich als Mittel erweisen, die Immunantwort gegen APP und etwaiger zusätzlicher koexprimierter Fremdantigene zu optimieren. Das IL-Gen des Schweins wurde von Dr. David Strom, CSIRO Division of Animal Health erhalten und in einen geeigneten Plasmidvektor kloniert (8, pIG-IL6), um eine Expression in APP zu erhalten (HS93/pIG-IL6). Im Falle von Schweine-IL6, wurde die Expression von APP-Vektoren mithilfe eines monoklonalen Antikörpers festgestellt (zur Verfügung gestellt von Dr. David Strom, CSIRO Division of Animal Health). Aus 9 ist ersichtlich, dass der monoklonale Antikörper mit einem einzelnen Protein in APP/3B-IL6 der erwarteten Größe (22 kDalton) und identischer Größe wie das aus E. coli stammende Material reagiert. HS93 ohne die Expressionskassette reagiert dagegen nicht mit dem monoklonalen Antikörper.

Das Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT)-Gen kodiert ein Enzym, das Resistenz gegen das Antibiotikum Chloramphenicol bietet und in Enzymreaktionen leicht quantifiziert werden kann. Es wurde ein Plasmid konstruiert, um eine höhere Expression von CAT aus APP zu erreichen (8), und APP-Stämmen angeboten, welche diese Plasmidresistenz gegen Chloramphenicol trugen.

Die Entwicklung von APP als Bakterienvektor stellt ein Mittel bereit, um kommerziell signifikante Moleküle in den Respirationstrakt von Schweinen abzugeben. Zu diesen Molekülen gehören Zytokine, um das Immunsystem zu regulieren, und protektive Antigene von anderen krankheitserregenden Bakterien, wodurch Möglichkeiten geschaffen werden, multivalente Impfstoffe herzustellen. Solche Impfstoffe könnten nach einer einzigen Impfung Schutz vor mehr als einer Krankheit bieten.

Tabelle 6. Lungenläsionen in Schweinen bei der Autopsie

Schweine wurden zweimal in Abständen von zwei Wochen mit APP HS93CAr geimpft, und erhielten anschließend zwei Wochen nach der letzten Impfung eine Serovar-übergreifende Challenge-Infektion mit APP HS25. Fünf Tage nach der Challenge-Infektion wurden Post-Mortem-Untersuchungen durchgeführt und die Lungenläsionen notiert.

In Schweinen bei der Autopsie vorhandene Lungenläsionen

Gruppe 1 Nicht geimpft und ohne Challenge-Infektion

  • 1. Keine Läsionen zu erkennen
  • 2. Keine Läsionen zu erkennen
  • 3. Keine Läsionen zu erkennen

Gruppe 2 Geimpft und ohne Challenge-Infektion

  • 1. Keine Läsionen zu erkennen
  • 2. Keine Läsionen zu erkennen
  • 3. Keine Läsionen zu erkennen

Gruppe 3 Nicht geimpft und mit Challenge-Infektion

  • 1. Keine Läsionen zu erkennen
  • 2. Keine Läsionen zu erkennen
  • 3. Keine Läsionen zu erkennen
  • 4. Keine Läsionen zu erkennen
  • 5. Keine Läsionen zu erkennen
  • 6. Kleine Adhäsion auf der linken Lungenseite, erschien älter zu sein als 5 Tage, abgegrenzt (es wurden Bakterien isoliert und festgestellt, dass es keine APP waren)

Gruppe 4 Ungeimpft und mit Challenge-Infektion

  • 1. Adhäsion am rechten Zwerchfelllappen, Läsion mit 5 cm Durchmesser am linken Herzlappen.
  • 2. Zwei Adhäsionen am rechten Zwerchfelllappen, lokalisierte Läsion (Abszess) am rechten Zwerchfelllappen, Läsion am rechten ventralen Zwerchfelllappen, Adhäsion am linken dorsalen Zwerchfelllappen, zwei Läsionen (0,5 cm) am dorsalen Herzlappen, Läsionen am mittleren linken Zwerchfelllappen.
  • 3. Kleine Adhäsion am rechten hinteren Apikallappen, Pleuritis im gesamten linken dorsalen Zwerchfelllappen.
  • 4. Kleine Adhäsion am rechten Apikallappen, Läsion (4 cm) am rechten dorsalen Zwerchfelllappen, Abszess (1 cm) am rechten Herzlappen, Läsionen (7 × 1 cm) auf der gesamten linken Lungenseite.
  • 5. Exsudative Pleuritis und Entzündung des Herzbeutels (diffuse Perikarditis), Adhäsion am rechten Zwerchfelllappen.
  • 6. Adhäsive Pleuritis am rechten Zwerchfelllappen, Läsion (1 cm) am linken ventralen Zwerchfelllappen.

Schließlich wird darauf hingewiesen, dass verschiedene Änderungen, Modifikationen und/oder Ergänzungen in die Konstruktionen und Anordnungen der zuvor beschriebenen Inhalte eingeführt werden können, ohne vom Geist oder Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.

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Anspruch[de]
Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), umfassend ein TRX-Toxinoperon, das ein strukturelles RTX-Gen und ein teilweise oder vollständig inaktiviertes posttranslationales RTX-Aktivatorgen enthält, das ein RTX-Toxin erzeugt, wobei das RTX-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert ist. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach Anspruch 1, das eine wirtschützende Immunität gegen strukturelles RTX-Polypeptid und Infektion durch Actinobacillus pleuropneumoniae induziert. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach Anspruch 1 oder 2, wobei das teilweise oder vollständig inaktivierte RTX-Toxin ein Vorläufer eines RTX-Toxins ist. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das teilweise oder vollständig inaktivierte RTX-Toxin ein unverarbeitetes Expressionsprodukt eines strukturellen RTX- Gens ist. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das strukturelle Gen ein RTX A-Gen ist. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der posttranslationale Aktivator teilweise oder vollständig deletiert ist. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der posttranslationale Aktivator ein Produkt eines RTX C-Gens ist. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das posttranslationale Aktivatorgen teilweise oder vollständig durch rekombinante DNA-Techniken, einschließlich des Einführens und der Deletion von DNA aus dem Gen, das für das posttranslationale Aktivatorgen kodiert, einschließlich der einfachen oder mehrfachen Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion, einschließlich der vollständigen oder teilweisen Deletion des Gens, der homologen Rekombination unter Anwendung eines Targetkonstrukts oder der Plasmidsegregation; und chemisch induzierter, strahlungsinduzierter oder stellenspezifischer Mutagenese inaktiviert ist. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das erzeugte RTX-Toxin ein APX-Toxin ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die APX 1, APX 2 oder APX 3 einschließt. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Mikroorganismus nicht in der Lage ist, mindestens eines der Proteine zu erzeugen, das bei der Absonderung eines RTX-Toxingenprodukts involviert ist. Genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach Anspruch 10, wobei der Mikroorganismus ein teilweise oder vollständig inaktiviertes RTX B- und/oder ein teilweise oder vollständig inaktiviertes RTX D-Gen aufweist. Impfstoffzusammensetzung für das Induzieren einer immunologischen Anwort auf ein RTX-Toxin in einem Wirtstier, wobei die Impfstoffzusammensetzung den genetisch modifizierte Actinobacillus pleuropneumoniae nach einem der Ansprüche 1 bis 11 einschließt. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 12 für das Induzieren einer Immunantwort auf eine Reihe von Serovaren eines Mikroorganismus, der das entsprechende RTX-Toxin erzeugt. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das APX-Toxin aus der Gruppe ausgewählt wird, die APX 1, APX 2 und APX 3 einschließt. Biologischer Vektor, der einen genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae nach einem der Ansprüche 1 bis 11 einschließt. Biologischer Vektor nach Anspruch 15, der des Weiteren biologisch aktive Moleküle bereitstellt, die in der Lage sind, eine Antwort in einem Wirtstier zu verbessern. Biologischer Vektor nach Anspruch 16, wobei das biologisch aktive Moekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die funktionelle Moleküle wie Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, Antigene oder antigene Teile derselben, Zytokine wie Interleukine, Interferone und Tumornekrosefaktoren einschließt. Biologischer Vektor nach Anspruch 15 oder 16, wobei das biologisch aktive Molekül durch den biologischen Vektor mit einem Plasmid ausgedrückt ist, das ein für das biologisch aktive Molekül kodierendes Gen trägt. Biologischer Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei der genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae in der Lage ist, eine Immunantwort auf zwei oder mehr Antigenepitope zu induzieren, die in dem Actinobacillus pleuropneumoniae nativ sind. Biologischer Vektor nach Anspruch 19, wobei die Immunantwort gegen eine virulente Form von Actinobacillus pleuropneumoniae und durch Actinobacillus pleuropneumoniae exprimierte heterologe Antigene induziert wird. Biologischer Vektor nach Anspruch 20, wobei die Immunantwort gegen ein RTX-Toxin und mindestens einen Antigenepitop eines oder mehrerer Krankheitserreger induziert wird, die aus Bakterienkrankheitserregern ausgewählt sind, einschließlich Haemophilus spp, Serpulina hyodysenteriae, Pasteurella spp, Bordetella bronchiseptica, Leptospira spp, Streptococcus spp, Salmonella spp, Escherichia coli, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae oder Viruskeimerregern einschließlich HVC, PRRSV, PRV, TGEV oder PPV. Verfahren für die Erzeugung eines genetisch modifizierter Actinobacillus pleuropneumoniae, der ein RTX-Toxin erzeugt, wobei das RTX-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert ist, welches Verfahren Folgendes umfasst:

Bereitstellen eines Actinobacillus pleuropneumoniae teilweises oder vollständiges Inaktivieren eines posttranslationalen RTX-Aktivatorgens in dem RTX-Toxinoperon des Actinobacillus pleuropneumoniae.
Verwendung einer immunologisch wirksamen Menge einer Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments für das Impfen eines Tiers gegen einen RTX-Toxin erzeugenden Mikroorganismus. Verwendung einer immunologisch wirksamen Menge einer Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei der Behandlung von Schweinepleuropneumonie. Verfahren für die Erzeugung eines inaktiven RTX-Toxins, welches Verfahren das Züchten eines genetisch modifizierten Actinobacillus pleuropneumoniae einem der Ansprüche 1 bis 11 gemäß und das Gewinnen des teilweise oder vollständig inaktiven Toxins, das durch den Mikroorganismus erzeugt wird.






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