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Dokumentenidentifikation DE60028411T2 04.01.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001235851
Titel VERBINDUNGEN ZUR REGULIERUNG DES HEDGEHOG-SIGNALWEGS, ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERWENDUNGEN DAVON
Anmelder Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Md., US
Erfinder BEACHY, A., Philip, Baltimore, MD 21204, US;
Taipale, Anssi Jussi, 02230 Espoo, FI;
Chen, James K., Baltimore, MD 21230, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 60028411
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.10.2000
EP-Aktenzeichen 009735440
WO-Anmeldetag 13.10.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/US00/28479
WO-Veröffentlichungsnummer 2001027135
WO-Veröffentlichungsdatum 19.04.2001
EP-Offenlegungsdatum 04.09.2002
EP date of grant 31.05.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 04.01.2007
IPC-Hauptklasse C07J 69/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 31/58(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Anmeldung basiert auf den vorläufigen U.S.-Patentanmeldungen Nr. 60/159,215, eingereicht am 13. Oktober 1999, und Nr. 60/229,273, eingereicht am 30. August 2000, deren Beschreibungen hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.

Hintergrund der Erfindung

Durch den Vorgang der Musterbildung bilden die Embryonalzellen geordnete Raumanordnungen differenzierter Gewebe. Die physische Komplexität höherer Organismen entsteht während der Embryogenese durch das Zusammenspiel von zellintrinsischer Abstammung und zellextrinsischer Signalwirkung. Induktive Interaktionen sind für die embryonale Musterbildung in der Vertebratenentwicklung aus der frühesten Anlage des Körperplans wesentlich zur Musterbildung der Organsysteme, zur Erzeugung diverser Zelltypen während der Gewebedifferenzierung (Davidson, E., (1990) Development 108: 365 – 389; Gurdon, J. B., (1992) Cell 68: 185 – 199; Jessell, T. M. et al., (1992) Cell 68: 257 – 270). Die Wirkungen der entwicklungsbedingten Zellinteraktionen sind verschieden. Typischerweise werden reagierende Zellen von einem Weg der Zelldifferenzierung zu einem anderen durch induzierende Zellen umgelenkt, die sowohl von den nicht induzierten als auch den induzierten Zuständen der reagierenden Zellen abweichen (Induktionen). Manchmal induzieren Zellen ihre Nachbarn, zu differenzieren wie sie selbst (homeogenetische Induktion); in anderen Fällen hemmt eine Zelle seine Nachbarn vom Differenzieren wie sie selbst. Zellinteraktionen in früher Entwicklung können sequenziell sein, derart, dass eine anfängliche Induktion zwischen zwei Zelltypen zu einer progressiven Erweiterung der Diversität führt. Darüber hinaus kommen induktive Interaktionen nicht nur in Embryos vor, sondern ebenso in adulten Zellen, und können bewirken, dass morphogenetische Muster etabliert und bewahrt werden sowie Differenzierung induzieren (J. B. Gurdon (1992), Cell 68: 185 – 199).

Die Mitglieder der Hedgehog-Familie der Signalmoleküle vermitteln viele wichtige kurz- und langfristige Musterbildungsprozesse während der Entwicklung von Invertebraten und Vertebraten. In der Fliege reguliert ein einzelnes hedgehog-Gen die Musterbildung von Segment- und Imaginalscheibe. Im Gegensatz dazu ist in Vertebraten eine hedgehog-Gen-Familie an der Steuerung der Links-Rechts-Asymmetrie, der Polarität in ZNS, Somiten und Extremitäten, Organogenese, Chondrogenese und Spermatogenese beteiligt.

Das erste hedgehog-Gen wurde durch ein genetisches Screenen der Fruchtfliege Drosophila melanogaster (Nüsslein-Volhard, C. und Wieschaus, E. (1980), Nature 287, 795 – 801) identifiziert. Dieses Screenen identifizierte ein Anzahl von Mutationen, welche die embryonale und larvale Entwicklung beeinflussen. In den Jahren 1992 und 1993 wurde die molekulare Natur des Drosophila-hedgehog-(hh)-Gens aufgezeigt (C. F., Lee at al. (1992) Cell 71, 33 – 50), und seitdem sind etliche hedgehog-Homologe aus verschiedenen Vertebraten-Spezies isoliert worden. Während nur ein hedgehog-Gen in Drosophila und anderen Invertebraten gefunden worden ist, sind in Vertebraten viele Hedgehog-Gene vorhanden.

Die Vertebraten-Familie der hedgehog-Gene schließt mindestens vier Mitglieder ein, z. B. paraloge Gene des einzigen Drosophila-hedgehog-Gens. Beispielhafte hedgehog-Gene und -Proteine sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 95/18856 und WO 96/17924 beschrieben. Drei dieser Mitglieder, hierin als Desert hedgehog (Dhh), Sonic hedgehog (Shh) und Indian hedgehog (Ihh) bezeichnet, existieren offensichtlich in allen Vertebraten, einschließlich Fischen, Vögeln und Säugern. Ein viertes Mitglied, hierin als tiggy-winkle hedgehog (Twhh) bezeichnet, scheint für Fisch spezifisch zu sein. Desert hedgehog (Dhh) wird hauptsächlich in den Testikeln exprimiert, sowohl in der embryonalen Entwicklung der Maus als auch im adulten Nager und Menschen; Indian hedgehog (Ihh) ist an der Knochenentwicklung während der Embryogenese und an der Knochenbildung im Erwachsenen beteiligt; und Shh, welches wie vorstehend beschrieben primär an morphogenetischen und neuroinduktiven Aktivitäten beteiligt ist. In Anbetracht der entscheidenden induktiven Rolle der hedgehog-Polypeptide in der Entwicklung und Bewahrung von Vertebraten-Organen ist die Identifizierung von Proteinen, die mit hedgehog interagieren, von überragender Bedeutung sowohl für den klinischen Kontext als auch für den Forschungskontext.

Die verschiedenen Hedgehog-Proteine bestehen aus einem Signalpeptid, einer hoch geschützten N-terminalen Region und einer stärker divergenten C-terminalen Domäne. Zusätzlich zur Spaltung der Signalsequenz im sekretorischen Stoffwechselweg (Lee, J. J. et al. (1992) Cell 71: 33 – 50; Tabata, T. et al., (1992) Genes Dev. 2635 – 2645; Chang, D. E. et al. (1994) Development 120: 3339 – 3353) unterlaufen Hedgehog-Vorläuferproteine eine interne autoproteolytische Spaltung, welche von konservierten Sequenzen im C-terminalen Abschnitt abhängig ist (Lee et al. (1994) Science 266: 1528 – 1537; Porter et al. (1995) Nature 374: 363 – 366). Diese Autospaltung führt zu einem 19 kD N-terminalen Peptid und einem C-terminalen Peptid von 26 – 28 kD (Lee et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra: Lee et al. (1994) supra; Bumcrot, D. A. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 2294 – 2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S.C. et al. (1995) Curr. Biol. 5: 944 – 955; Lai. C. J. et al. (1995) Development 121: 2349 – 2360). Das N-terminale Peptid bleibt mit der Oberfläche der Zellen, in denen es synthetisiert wurde, eng verbunden, während das C-terminale Peptid sowohl in vitro als auch in vivo frei diffusionsfähig ist (Porter et al. (1995) Nature 374: 363; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot et al. (1995) supra; Marti, E. et al. (1995) Development 121: 2537 – 2547; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81: 445 – 455). Interessanterweise ist die Retention des N-terminalen Peptids an der Zelloberfläche von der Selbstspaltung abhängig, während eine gekürzte Form von HH, welche durch eine RNA kodiert wird, die präzise an der normalen Position der internen Spaltung terminiert, in vitro (Porter et al. (1995) supra und in vivo (Porter, J. A. et al. (1996) Cell 86, 2 – 34) diffusionsfähig ist. Biochemische Studien haben gezeigt, dass die autoproteolytische Spaltung des HH-Vorläuferproteins über ein internes Thioester-Zwischenprodukt abläuft, welches anschließend in einer nucleophilen Substitution gespalten wird. Es ist wahrscheinlich, dass das Nucleophil ein kleines lipophiles Molekül ist, welches an das C-terminale Ende des N-Peptids kovalent gebunden wird (Porter et al. (1996) supra), wobei es an die Zelloberfläche gebunden wird. Die biologischen Auswirkungen sind tiefgreifend. Als ein Ergebnis des Bindens wird eine hohe lokale Konzentration von N-terminalem Hedgehog-Peptid an der Oberfläche der Hedgehog-produzierenden Zellen erzeugt. Es ist dieses N-terminale Peptid, welches sowohl notwendig als auch hinreichend für kurz- und langfristige Hedgehog-Signalaktivitäten in Drosophila und Vertebraten ist (Porter et al. (1995) supra; Ekker et al. (1995) supra; Lai et al. (1995) supra; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81: 445-455; Porter et al. (1996) supra; Fietz, M. J. et al, (1995) Curr. Biol. 5: 643 – 651; Fan, C.-M. et al. (1995) Cell 81: 457 – 465; Marti, E. et al. (1995) Nature 375: 322 – 325; Lopez-Martinez et al. (1995) Curr. Biol. 5: 791 – 795; Ekker, S. C. et al. (1995) Development 121: 2337 – 2347; Forbes, A. J. et al. (1996) Development 122: 1125 – 1135).

HH ist mit kurz- und langfristigen Musterbildungsprozessen an verschiedenen Stellen während der Drosophila-Entwicklung in Zusammenhang gebracht worden. In der Etablierung der Segmentpolarität in frühen Embryos weist es kurzfristige Effekte auf, welche direkt vermittelt zu sein scheinen, während es in der Musterbildung der Imaginalscheiben langfristige Effekte über die Induktion von sekundären Signalen induziert.

Von Vertrebraten sind in den letzten Jahren mehrere hedgehog-Gene kloniert worden. Von diesen Genen hat Shh die größte experimentelle Aufmerksamkeit erfahren, da es in verschiedenen Organisationszentren exprimiert wird, welche die Quellen für Signale sind, die Nachbargewebe zur Musterbildung anregen. Neueste Anzeichen weisen darauf hin, dass Shh an diesen Interaktionen beteiligt ist.

Die Expression von Shh beginnt kurz nach dem Einsetzen der Gastrulation im voraussichtlichen Mittellinien-Mesoderm, dem Primitivknoten, in der Maus (Chang et al. (1994) supra; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75: 1417 – 1430), der Ratte (Roelink H. et al. (1994) Cell 76: 761 – 775) und dem Huhn (Riddle, R. D. et al. (1993) Cell 75: 1401 – 1416) und dem Schild des Zebrafisch (Ekker et al. (1995) supra; Krauss, S. et al. (1993) Cell 75: 1431 – 1444). In Hühnerembryos entwickelt das Shh-Expressionsmuster im Primitivknoten eine Links-Rechts-Asymmetrie, welche für die Links-Rechts-Stellung des Herzens verantwortlich zu sein scheint (Levin, M. et al. (1995) Cell 82: 803 – 814).

Im ZNS scheint Shh von der Chorda dorsalis und der Bodenplatte aus ventrale Zellschicksale zu induzieren. Wenn ektopisch exprimiert, führt Shh zu einer Ventralisierung großer Regionen des Mittel- und Hinterhirns in Maus (Echelard et al. (1993) supra; Goodrich, L. V. et al. (1996) Genes Dev. 10: 301 – 312) Xenopus (Roelink, H, et al., (1994), supra; Ruiz i Altaba, A. et al. (1995) Mol. Cell. Neurosci. 6: 106 – 121) und Zebrafisch (Ekker et al. (1995) supra; Krauss et al. (1993) supra; Hammerschmidt, M. et al. (1996) Genes Dev. 10: 647 – 658). In Explantaten von intermediärem Neuroektoderm auf Rückenmarksebene induziert Shh-Protein die Bodenplatten- und Motoneuronentwicklung mit unterschiedlichen Konzentrations-Schwellenwerten, die Bodenplatte bei hohen und die Motoneuronen bei niedrigeren Konzentrationen (Roelink et al. (1995) supra; Marti et al. (1995) supra; Tanabe, Y. et al. (1995) Curr. Biol. 5: 651 – 658). Darüber hinaus weist Antikörper-Blocking darauf hin, dass von der Chorda dorsalis produziertes Shh für die Chorda-dorsalis-vermittelte Induktion von Motoneuronen-Schicksalen erforderlich ist (Marti et al. (1995) supra). Deshalb scheinen hohe Konzentrationen von Shh an der Oberfläche von Shh-produzierenden Mittellinienzellen die kontaktvermittelte Induktion der Bodenplatte, welche in vitro beobachtet wurde (Placzek, M. et al. (1993) Development 117: 205 – 218), und die Mittellinienpositionierung der Bodenplatte unmittelbar über der Chorda dorsalis in vivo zu bedingen. Geringere Konzentrationen von Shh, welches von der Chorda dorsalis und der Bodenplatte freigesetzt wird, induzieren vermutlich Motoneuronen in weiter entfernten ventrolateralen Regionen in einem Prozess, von dem gezeigt wurde, dass er in vitro kontaktunabhängig ist (Yamada, T. et al. (1993) Cell 73: 673 – 686). In Explantaten, welche auf Mittelhirn- und Vorderhirnebene entnommen wurden, induziert Shh ebenfalls die passenden ventrolateralen neuronalen Zelltypen, dopaminerge (Heynes, M. et al. (1995) Neuron 15: 35 – 44; Wang, M. Z. et al. (1995) Nature Med. 1: 1184 – 1188) beziehungsweise cholinerge (Ericson, J. et al. (1995) Cell 81: 747 – 756) Vorläufer, was darauf hinweist, dass Shh ein gemeinsamer Induktor der ventralen Spezifizierung über die gesamte Länge des ZNS ist. Diese Beobachtungen werfen die Frage auf, wie die unterschiedliche Reaktion auf Shh an bestimmten anteroposterioren Positionen reguliert wird.

Shh aus der Mittellinie regt auch die paraxialen Regionen im Vertrebratenembryo zur Musterbildung an, die Somiten im Rumpf (Fan et al. (1995) supra) und das rostrale Kopfmesenchym der Somiten (Hammerschmidt et al. (1996) supra). In paraxialen Mesoderm-Explantaten von Huhn und Maus fördert Shh die Expression von Sklerotom-spezifischen Markern wie Pax1 und Twist auf Kosten des dermamyotomalen Markers Pax3. Darüber hinaus weisen Filterbarrierenexperimente darauf hin, dass Shh die Induktion des Sklerotoms eher direkt als durch Aktivierung eines sekundären Signalmechanismus vermittelt (Fan, C.-M. und Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79, 1175 – 1186).

Shh induziert ebenfalls die Myotomal-Gen-Expression (Hammerschmidt et al. (1996) supra; Johnson, R. L. et al. (1994) Cell 79: 1165 – 1173; Münsterberg, A. E. et al. (1995) Genes Dev. 9: 2911 – 2922; Weinberg, E. S. et al. (1996) Development 122: 271 – 280), obwohl neueste Experimente darauf hinweisen, dass die Mitglieder der WNT-Familie, Vertebraten-Homologe von Drosophila wingless, für das Zusammenspiel erforderlich sind (Münsterberg et al. (1995) supra). Verblüffenderweise erfordert die myotomale Induktion in Hühnern höhere Shh-Konzentrationen als die Induktion von rotomalen Markern (Münsterberg et al. (1995) supra), obwohl das Sklerotom aus somitischen Zellen abstammt, die viel näher an der Chorda dorsalis positioniert sind. Ähnliche Ergebnisse wurden im Zebrafisch erhalten, wo hohe Konzentrationen von hedgehog die myotomale Markergenexpression induzieren und die sklerotomale unterdrücken (Hammerschmidt et al. (1996) supra). Im Gegensatz zu den Amnioten jedoch stimmen diese Beobachtungen mit der Architektur des Fischembryos überein, da hier das Myotom die vorherrschende und stärker axiale Komponente der Somiten ist. Deshalb kann die Modulation der Shh-Signalwirkung und die Beschaffung neuer Signalfaktoren die Somitstruktur während der Vertebraten-Evolution modifiziert haben.

In Vertebraten-Extremitätenknospen reguliert eine Untergruppe von posterioren Mesenchymalzellen, die "Zone of polarizing activity" (ZPA), die anteroposteriore Digitus-Identität (rezensiert in Honig, L.S. (1981) Nature 291: 72 – 73). Ektopische Expression von Shh oder die Anwendung von Kügelchen, die mit Shh-Peptid getränkt sind, ahmen die Wirkung der anterioren ZPA-Transplantate nach, wobei sie eine spiegelbildliche Verdopplung der Digiti erzeugen (Chang et al. (1994) supra; Lopez-Martinez et al. (1995) supra, Riddle et al. (1993) supra) (2g). Deshalb scheint die Digitus-Identität primär von der Shh-Konzentration abzuhängen, obwohl es möglich ist, dass andere Signale diese Information über die beträchtlichen Distanzen, die für AP-Musterbildung erforderlich zu sein scheinen (100 – 150 &mgr;m), weiterleiten. Ähnlich zur Interaktion von HH und DPP in Drosophila-Imaginalscheiben aktiviert Shh in der Vertebraten-Extremitätenknospe die Expression von Bmp2 (Francis, P. H. et al. (1994) Development 120: 209 – 218), einem dpp-Homolog. Jedoch scheitert Bmp2 im Gegensatz zu DPP in Drosophila daran, die polarisierende Wirkung von Shh unter ektopischer Anwendung in der Huhn-Extremitätenknospe nachzuahmen (Francis et al. (1994) supra). Zusätzlich zur anteroposterioren Musterbildung scheint Shh auch an der Regulation des proximodistalen Herauswachsens der Extremitäten beteiligt zu sein durch Induzieren der Synthese des Fibroblastenwachstumsfaktors FGF4 in der posterioren apikalen Ektodermalleiste (Laufer, E. et al. (1994) Cell 79: 993 – 1003; Niswander, L. et al. (1994) Nature 371: 609 – 612).

Die enge Beziehung zwischen Hedgehog-Proteinen und BMPs ist wahrscheinlich an vielen, aber wahrscheinlich nicht allen Stellen der Vertebraten-Hedgehog-Expression bewahrt worden. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Shh im Hühner-Dickdarm die Expression von Bmp4, einem anderen Vertebraten-dpp-Homolog (Roberts, D. J. et al. (1995) Development 121: 3163 – 3174), induziert. Darüber hinaus zeigen Shh und Bmp2, -4 oder -6 eine auffällige Wechselbeziehung in ihrer Expression in Epithel- und Mesenchymalzellen des Magens, des urogenitalen Systems, der Lunge, den Zahnknospen und den Haarfollikeln (Bitgood, M. J. und McMahon, A. P. (1995) Dev. Biol. 172: 126 – 138). Ferner wird Ihh, eines der beiden anderen Maus-Hedgehog-Gene, neben den Bmp-exprimierenden Zellen im Darm und sich entwickelnden Knorpeln exprimiert (Bitgood und McMahon (1995) supra).

Eine Hauptfunktion von hedgehog im Drosophilaembryo ist die Aufrechterhaltung der wg-Transkription an der Grenze jeder Segmenteinheit (Hidalgo und Ingham (1990) Development 110: 291 – 302); von dort diffundiert das Wg-Protein über das Segment, um den Charakter der ektodermalen Zellen zu spezifizieren, welche die larvale Kutikula sezernieren (Lawrence et al. (1996) Development 122: 4095 – 4103). Wie hh schalten Mutationen in den drei anderen Segment-Polaritätsgenen smoothened (smo), fused (fu) und cubitus interruptus (ci) die wg-Transkription an den parasegmentalen Grenzen aus (Forbes et al. (1993) Development Suppl. 115 – 124; Ingham (1993) Nature 366: 560 – 562; Preat et al., (1993) Genetics 135: 1047 – 1062; und van den Heuvel et al. (1996) Nature 3 82: 547 – 551); im Gegensatz dazu führt eine Mutation eines vierten Gens, patched (ptc) zur Depression von wg (Ingham et al. (1991) Nature 353: 184 – 187; und Martinez Arias et al. (1988) Development 103: 157 – 170). Indem Doppelmutations-Kombinationen zwischen ptc und anderen Genen hergestellt wurden, wurde bewiesen, dass smo, fu und ci alle stromabwärts von ptc agieren, um die wg-Transkription zu aktivieren (Forbes et al. (1993) supra; Hooper (1994) Nature 372: 461 – 464), während andererseits die Transkription von wg in Abwesenheit von ptc unabhängig von hh wird (Ingham und Hidalgo (1993) Development 117: 283 – 291). Diese Entdeckungen weisen auf einen einfachen Signalweg hin, wodurch hh wirkt, um der Aktivität von ptc entgegenzuwirken, welches umgekehrt der Aktivität von smo, fu und ci entgegenwirkt. Die Allgemeingültigkeit dieses Signalwegs ist anschließend sowohl in Drosophila bewiesen worden, wo ptc, smo, fu und ci die Aktivität von Hh in allen bis heute untersuchten Prozessen vermitteln (Ma et al. (1993) Cell 75: 927 – 938); Chen et al. (1996) Cell 87: 553 – 563; Forbes et al. (1996) Development 122: 3283 – 3294; Sanchez-Herrero et al. (1996) Mech. Dev. 55: 159 – 170; Strutt et al. (1997) Development 124: 3233 – 3240), als auch in Vertebraten, wo Homologe von ptc, smo und ci identifiziert und mit Prozessen in Zusammenhang gebracht worden sind, welche durch das eine oder andere Protein der Hh-Familie vermittelt werden (Concordet et al., (1996) Development 122: 2835 – 2846; Goodrich et al. supra; Marigo et al. (1996) Dev. Biol. 180: 273 – 283; Stone et al. (1996) Nature 3 84: 129 – 134; Hynes et al. (1997) Neuron 19: 15 – 26; und Quirk et al. (1997) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 62: 217 – 226).

Patched wurde ursprünglich in Drosophila als ein Segmentpolaritätsgen identifziert, eines aus einer Gruppe von Entwicklungsgenen, welche die Zelldifferenzierung innerhalb der einzelnen Segmente beeinflussen, die in einer homologen Reihe entlang der anterioposterioren Achse des Embryo vorkommen. Siehe Hooper, J. E. et al. (1989) Cell 59: 751; und Nakano, Y. et al. (1989) Nature 341: 508. Die Expressionsmuster des Vertebraten-Homologs von patched weisen auf seine Beteiligung an der Entwicklung des Neuralrohrs, des Skeletts, der Extremitäten, der kraniofaszialen Struktur und der Haut hin.

Ein anderes Protein, welches an der Hedgehog-Signalwirkung beteiligt ist, trat mit der Entdeckung in Erscheinung, dass smoothened auch ein Transmembranprotein kodiert, welches ein Mitglied der 7-Transmembran-Rezeptor-(7TM)-Familie ist (Alcedo et al. (1996) Cell 86: 221 – 232; van den Heuvel et al. supra). Es sind humane Homologe von smo identifiziert worden. Siehe zum Beispiel Stone et al. (1996) Nature 384: 129 – 134, und GenBank Zugang U84401. In-vitro-Bindungstests scheiterten daran, eine physische Interaktion zwischen Vertebraten-Smo und Hh-Proteinen (Stone et al., supra nachzuweisen, wohingegen unter den gleichen Bedingungen Vertebraten-Ptc an das Sonic-Hedgehog-(Shh)-Protein mit relativ hoher Affinität bindet (Marigo et al. (1996) Nature 384: 176 – 179; Stone et al. supra). Kürzlich ist berichtet worden, dass aktivierende smoothened-Mutationen im sporadischen Basalzellenkarzinom, Xie et al. (1998) Nature 391: 90 – 2, und primitiven neuroektodermalen Tumoren des Zentralnervensystems, Reifenberger et al. (1998) Cancer Res. 58: 1798 – 803, vorkommen.

Die Entdeckungen auf dem Fachgebiet weisen darauf hin, dass Hh durch Binden an Ptc wirkt, wodurch eine inhibierende Wirkung von Ptc auf Smo freigesetzt wird. Da Ptc und Smo beide Transmembranproteine sind, besteht ein mögliches Szenarium darin, dass sie sich physisch verbinden, um einen Rezeptorkomplex zu bilden, obwohl indirekte Wirkmechanismen ebenfalls plausibel sind. Die Depression von Smo aus der Ptc-Hemmung schließt sehr wahrscheinlich eine konformative Veränderung in Smo ein. Es ist jedoch wichtig, daran zu erinnern, dass Ptc für die Aktivität von Smo nicht wesentlich ist, da Smo in vollständiger Abwesenheit von Ptc-Protein konstitutiv aktiviert wird (Alcedo et al. supra; Quirk et al., supra).

Aus dem Modell folgt, dass mindestens einige Mutationen, in ptc, die zum Funktionsverlust führen, wirken sollten, indem sie das Binden an Smo unterbrechen. Die Entdeckung, dass Mutationen in dem humanen ptc-Homolog in Basalzellenkarzinomen (BCCs) weit verbreitet sind (Hahn et al. (1996) Cell 85: 841 – 851; Johnson et al. (1996) Science 272: 1668 – 1671), hat einen wichtigen Anreiz zur Analyse der Ptc/Smo-Funktion ebenso wie eine reiche Quelle an Mutationen, die zum Funktionsverlust führen, bereitgestellt. Viele von Tumoren abgeleitete Allele von humanem ptc sind nun sequenziert worden, wobei die Mehrheit der Mutationen dadurch gekennzeichnet ist, dass sie auf eine vorzeitige Terminierung der kodierenden Region zurückzuführen sind (Chidambaram et al. (1996) Cancer Res. 56: 4599 – 4601; Wicking et al. (1997) Am. J. Hum. Genet. 60: 21 – 26).

Die Unterbrechung des Bindens von Smo und Ptc könnte auch durch Mutationen in smo verursacht sein; im Gegensatz zu ptc-Mutationen sollten diese dominant wirken (da sie zu konstitutiver Aktivität des Mutantenproteins führen würden). Neueste Studien zu humanen BCCs haben eine aktivierende Mutation (aktivierende Mutationen) in Smo identifiziert und scheinen für die Transformation von basalen Keratinocyten verantwortlich zu sein (Xie et al. (1998) Nature 391: 90 – 92). Proc. Nat. Acad. USA, Bd. 95, S. 13036 – 13041 (1998) offenbart die Verwendung von Cyclopamin als Hedgehog-Signalweg-Inhibitor, um die Pankreas-Entwicklung zu fördern. Die Verwendung von Cyclopamin als Hedgehog-Signalweg-Inhibitor, um die Haarfollikel-Morphogenese, die mit Hautneoplasien in Zusammenhang steht, zu hemmen, ist in Developmental Biology Bd. 205, S 1-9 (Jan. 1999) offenbart.

Ohne sich zu sehr an eine bestimmte Theorie binden zu wollen, ist der entstehende Mechanismus, durch den der smo-ptc-Signalweg die Signaltransduktion vermittelt, wie folgt. In Abwesenheit der Hh-Induktion wird die Aktivität von Smo durch Ptc vermutlich durch ihre physikalische Bindung gehemmt. Ci in voller Länge bildet einen Komplex mit Fu, Cos-2 und dem Suppressor des kondensierten [Su(fu)], über den es sich mit den Mikrotubuli vereinigt. Diese Verbindung führt dazu, dass Ci auf das Proteasom zielt, wo es gespalten wird, um die transkriptional unterdrückende Form Ci75 freizusetzen. Die Phosphorylierung von Ci155 fördert seine Spaltung, entweder indem es die Verbindung mit dem Cos-2-Fu fördert oder indem es die Ubiquitinierung (oder beides) fördert. Wenn Hh an Ptc bindet, wird die inhibierende Wirkung auf Smo unterdrückt. Die so erhaltene Aktivierung von Smo führt zur Dissoziation des Fu-Cos-2-Ci-Komplexes von den Mikrotubuli. Die Spaltung von Ci155 ist blockiert; diese oder eine verwandte Form von Ci dringt dann vermutlich in den Zellkern ein, um die Transkription von ptc, gli und anderen Zielgenen in Verbindung mit CREB-Bindungsprotein (CBP) zu aktivieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung macht Verfahren und Reagenzien zum Hemmen der Aktivierung des smoothened-abhängigen Signalwegs verfügbar. In bestimmten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um den phänotypischen Auswirkungen der unerwünschten Aktivierung eines hedgehog-Signalwegs entgegenzuwirken, wie sie aus hedgehog-Funktionsgewinn-, ptc-Funktionsverlust- oder smoothened-Funktionsgewinn-Mutationen herrühren. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Verfahren das In-Kontakt-Bringen einer Zelle (in vitro oder in vivo) mit einem smoothened-Antagonisten (nachstehend definiert) wie einem Steroidalkaloid oder anderen kleinen Molekülen in einer Menge einschließen, die ausreichend ist, um der Aktivierung des smoothened-abhängigen Signalwegs entgegen zu wirken.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung macht Verfahren und Reagenzien zum Aktivieren des smoothened-abhängigen Signalwegaktivierung verfügbar, z. B. um alle oder eine bestimmte der Wirkungen nachzuahmen, welche die Behandlung mit einem hedgehog-Protein verursachen könnte. Das erfindungsgemäße Verfahren kann das In-Kontakt-Bringen einer Zelle (in vitro oder in vivo) mit einem smoothened-Agonisten (nachstehend definiert) in einer Menge einschließen, die ausreichend ist, um einen smoothened -abhängigen Signalweg zu aktivieren.

Die erfindungsgemäßen Verfahren und Verbindungen können verwendet werden, um die Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen in vitro und/oder in vivo, z. B. bei der Bildung von Gewebe aus Stammzellen, zu regulieren oder um das Wachstum von hyperproliferativen Zellen zu verhindern, um nur einige wenige Anwendungen zu veranschaulichen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als pharmazeutische Zubereitung formuliert werden, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten. Die smoothened-Antagonisten der Erfindung und/oder die Präparate, welche diese umfassen, können an einen Patienten verabreicht werden, um Zustände zu behandeln, die eine unerwünschte Zellproliferation einschließen, z. B. Krebs und/oder Tumore (wie das Medulloblastom, Basalzellenkarzinom etc.), nicht maligne hyperproliferative Störungen etc. Smoothened-Agonisten können ebenfalls verwendet werden, um das Wachstum und die Differenzierung normaler Gewebe zu regulieren. In bestimmten Ausführungsformen werden derartige Verbindungen oder Präparate systemisch und/oder lokal, z. B. topisch, verabreicht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 stellt die Strukturen der synthetischen Verbindungen AY9944 und Triparanol, der Pflanzen-Steroidalkaloide Jervin, Cyclopamin und Tomatidin und des Cholesterins dar.

2 bezieht sich auf einen Sensibilitätstest für die Shh-Signalwirkung in NIH-3T3-Zellen. (A) Reinigung der Cholesterin- und Palmitat-modifizierten Maus-Sonic-hedgehog Signaldomäne ShhNp. Detergens-unlösliche Proteolipid-Komplexe wurden aus 293 Zellen isoliert, welche Shh in voller Länge exprimieren (M. K. Cooper, J. A. Porter, K. E. Young, P. A. Beachy, Science 280, 1603 (1998)), und ShhNp wurde durch Immunoaffinitätschromatographie bis zur offensichtlichen Homogenität gereinigt. Obwohl rekombinantes ShhN, dem Cholesterin- und Palmitatmodifikationen fehlten, in Neuralplatten-Explantatkulturtests voll aktiv ist, war diese Form von ShhN in den NIH-3T3-Zellen nur wenig aktiv. Wir verwendeten deshalb die Detergens-Unlöslichkeit des cholesterin-modifizierten ShhN und Affinitätschromatographie, um das prozessierte ShhN-Protein (ShhNp) aus einer humanen 293-Zelllinie zu reinigen, welche gentechnisch verändert worden war, um das Maus-Shh-Konstrukt in voller Länge zu exprimieren. Die Detergens-unlöslichen Komplexe (DIGs) wurden wie von Brown und Rose (1992) beschrieben mit den folgenden Modifikationen isoliert. Zellen aus einer 150-mm-Schale wurden lysiert und in 2 ml Lysepuffer (10 mM NaHPO4, pH-Wert 6,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM PMSF, 1 % Triton X-100, 2 &mgr;g/ml Pepstatin A, 10 &mgr;g/ml Leupeptin, 5 &mgr;g/ml Aprotinin, 2 &mgr;g/ml E64) bei 4 °C gesammelt. Acht Saccharosedichte-Schritte (35,625 – 5 %, 4,375 %/Schritt; in der vorstehenden Lösung durchgeführt, ohne Detergens) wurden auf das 40 % Saccharose-Lysat geschichtet und Zentrifugation wurde für 2 – 12 h durchgeführt. Es wurde flockiges Material von geringer Dichte gesammelt (von der ursprünglichen Position des 18,125 % Schritts), 5-fach in 10 mM NaHPO4, pH-Wert 6,5, 150 mM NaCl verdünnt und durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 15 min (alles bei 4 °C) geerntet. Die Komplexe wurden bei Umgebungstemperatur in 1 % n-Oktyl-&agr;-D-glucopyranosid, 50 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl solubilisiert und der einzige ShhNp-Immunoaffinitäts-Reinigungsschritt verlief im wesentlichen wie in Pepinsky et al. (1998) beschrieben, mit der Ausnahme, dass der anti-Shh-N-monoklonale Antikörper 5E1 an Affi-Gel 10 (Bio-Rad) mit 6,6 mg/ml Gel gekoppelt war. Die Masse der gereinigten Spezies entsprach, wie durch Massenspektrometrie bestimmt, der des ShhN-Polypeptids, welches kovalente Palmitoyl- und Cholesteryladdukte trug: murines ShhN-Polypeptid 19.574,05 Da; verestertes Cholesterin, 368,65; Palmitoylmasse (in Ester oder Amidbindung), 238,42; Summe, 20.181,1. Der Einsatz zeigte Proben vom Lysat, detergensunlösliche Glycolipid-Komplexe (DIGs; 8 Lysatproben-Aquivalente) und gereinigtes ShhNp (0,75 &mgr;g), wie durch SDS-PAGE (14 %) getrennt und mit Coomassie-Blau eingefärbt. Die Massestandards migrierten wie angegeben. (B) NIH-3T3-Zellen reagieren auf ShhNp. NIH-3T3-Zellen, cotransifiziert mit Gli-luc-Reporter und TK-Promoter gesteuerter Renilla-Luciferase-Kontrolle, wurden mit den angegebenen Konzentrationen von ShhNp für 2 Tage behandelt. Konfluente Kulturen von NIH-3T3-Zellen wurden in 1 : 6 Verdünnung auf Platten mit 24 oder 96 Vertiefungen plattiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit Renilla-Luciferase (pRL-TK oder pRL-SV40, Clontech) oder &bgr;-Galactosidase-Transfektionskontrolle (10 % Gew./Gew. DNA), Gli-Luc-Reporter (40 %) und den angegebenen Konstrukten (50 %) unter Verwendung von Fugene 6 (Roche) Transfektionsreagens (250 ng (Platte mit 24 Vertiefungen) oder 100 ng (Platte mit 96 Vertiefungen) DNA/Vertiefung, Verhältnis 3 : 1 (Vol./Gew.) von Reagens zu DNA) transfiziert. Nachdem die Zellen Sättigungsdichte erreicht hatten (1 – 2 Tage), wurden sie in Medium mit geringem Serumanteil (0,5 % bovines Kälberserum) gewechselt und mit den angegebenen Reagenzien für 1 – 2 Tage behandelt. Die Firefly- und Renilla-Luciferase und &bgr;-Galactosidase-Aktivitäten wurden durch Luminometrie unter Verwendung von Dual-Luciferase- (Promega) beziehungsweise Galacto-Light-(Tropix)-Kits aus den Zelllysaten getestet. Die Luciferase-Aktivitäten sind bezogen auf die Kontrolle normalisiert; ein repräsentatives Experiment ist gezeigt. Es sollte beachtet werden, dass in diesem und in allen nachfolgenden Reporter-Tests die TK-Renilla-Luciferase-Aktivität als Kontrolle für die Normalisierung verwendet wird. (C) Die Shh-Signalweg-Aktivierung ist auf Cyclopamin in NIH-3T3-Zellen sensitiv. NIH-3T3-Zellen, die wie vorstehend transfiziert wurden (in dreifacher Ausführung), wurden mit ShhNp (4 nM) und/oder Cyclopamin (5 &mgr;M) für 2 Tage wie angezeigt behandelt. Normalisierte Luciferase-Aktivitäten werden als das Mehrfache der Induktion bezogen auf die Kontrolle angegeben. Die Fehlerbalken zeigen eine Standardabweichung. (D) Die geringe Zelldichte hemmt die Shh-Signalweg-Aktivität stromabwärts von Smo. Kulturen von Shh-LIGHT- (leere Kästchen) oder SmoAl-LIGHT- (gefüllte Rauten) Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen in einer Folge von zweifachen Verdünnungen ausplattiert. Der NIH-3T3-Zellklon Shh-LIGHT und Shh-LIGHT2, welche die Gli-luc-Reporter und TK-Renilla-Vektoren stabil inkorporieren, wurden durch Cotransfektion mit einem Vektor, der G418-Resistenz kodiert (pSV-Neo), hergestellt, gefolgt von Selektion mit G418 und Zellklonieren. Anschließend wurde eine klonale Unterlinie von Shh-LIGHT exprimierendem aktiviertem Smo (SmoAl-LIGHT) unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt, der Hygromycin-Selektion (pcDNA3.1 + hygro; Invitrogen) ermöglicht. Die Expression von SmoAl in der Zelllinie wurde durch Immun-Blotting verifiziert. Die Shh-LIGHT-Zellen wurden mit 4 nM ShhNp behandelt und die Gli-Luciferase-Reporter-Aktivität wurde nach 24 h getestet. Die Mehrfachinduktion des Reporters (% des Maximums ist auf die Shh-LIGHT-Kontrollkultur gleicher Dichte bezogen) und die Zelldichten (% des Maximums der Renilla-Luciferase-Aktivität) wurden am Ende des Experiments gemessen. Die Fehlerbalken zeigen eine Standardabweichung (vierfache Vertiefungen).

3 demonstriert, wie Cyclopamin wirkt, indem es die Aktivität von Smo hemmt. (A) Ptc1-/- Zellen sind auf Cyclopamin sensitiv. Fibroblasten aus Ptc1-/- Embryos wurden mit Cyclopamin oder Forskolin wie angezeigt behandelt. Nach 3 Tagen wurden die Zellen lysiert und die &bgr;-Galactosidase-Aktivität wurde bezogen auf die Proteinkonzentration gemessen. Da &bgr;-Galactosidase vom Ptc1-Locus exprimiert wird, reflektiert seine Expression die Aktivität des Shh-Signalwegs. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt. (B) Aktivierte Mutanten von Smo sind gegenüber Cyclopamin resistent. Kulturen von NIH-3T3-Zellen wurden mit Gli-Luciferase-Reporter, TK-Renilla-Luciferase-Kontrollvektor und Smo- oder SmoAl-Expressionsvektoren transfiziert (in dreifacher Ausfertigung). Smo-DNA wurde in 50 % Gew./Gew. verwendet und SmoAl in 50 %, 5 % und 0,5 % Gew./Gew. Anschließend wurden die Kulturen mit 5 &mgr;M Cyclopamin für 2 Tage behandelt. Die Fehlerbalken zeigten eine Standardabweichung an. Die vier Balken ganz links, welche zum Vergleich gezeigt werden, sind wie in 2C. (C) Die hohen Expressionsspiegel von Ptc1 stellen die Cyclopamin-resistente Reaktion von SmoAl auf ShhNp wieder her. NIH-3T3-Zellen wurden mit Gli-luc-Reporter, TK-Renilla, Ptc1CTD und SmoAl Expressionsvektoren transfiziert (Verhältnis Ptc zu Smo-DNA = 9). Anschließend wurden die Kulturen mit ShhNp (2 nM), Cyclopamin (5 &mgr;M) und/oder Forskolin (100 &mgr;M) wie angezeigt für 2 Tage behandelt. Es sollte beachtet werden, dass die SmoAl-Aktivierung des Signalwegs durch hohe Grade der Ptc1-Aktivität dramatisch verringert ist (vergleiche Tafel B) und dass 2 nM ShhNp die Signalweg-Aktivität sogar in Gegenwart von 5 &mgr;M Cyclopamin wieder herstellten. Ein repräsentatives Experiment wird gezeigt. (D) Tumor-abstammende mutierte Smo-Proteine sind intrinsisch stärker aktiv als Smo vom Wildtyp. NIH-3T3-Zellen wurden mit Gli-luc-Reporter, &bgr;-Galactosidase-Transfektionskontrolle und einem Kontrollvektor oder einem Expressionsvektor, welcher das angezeigte Smo-Renilla-Luciferase-Fusionsprotein kodiert, cotransfiziert. In dem gezeigten repräsentativen Experiment wurden die Shh-Signalweg-Aktivität und die Smo-Proteinspiegel als Firefly- beziehungsweise Renilla-Luciferase-Aktivitäten bezogen auf &bgr;-Galactosidase gemessen. Epitop-markierte Smo und aktivierte Smo-Proteine zeigten ähnliche Expressionsgrade in diesen Zellen (nicht gezeigt).

4 bildet ein Cyclopaminderivat von erhöhter Leistungsfähigkeit ab (A) 3-Keto-N-aminoethylaminocaproyldihydrocinnamoylcyclopamin (KAAD Cyclopamin) wurde aus Cyclopamin synthetisiert. Die Struktur von KAAD Cyclopamin wurde durch NMR und Massenspektrometrie-Analysen verifiziert. KAAD Cyclopamin kann die Signalweg-Aktivierung durch Tumor-abgeleitetes Smo blockieren. Shh-LIGHT2- (Rauten) und SmoAl-LIGHT-(Kreise) Zellen wurden mit 4 nM ShhNp (Shh-LIGHT2) und ansteigenden Konzentrationen von KAAD Cyclopamin (beide Linien) für 2 Tage behandelt. Die relative Reporteraktivität ist auf das Maximum normalisiert. Die erhöhte inhibitorische Wirksamkeit von KAAD Cyclopamin verglichen mit Cyclopamin in 3A – C sollte beachtet werden. (B) KAAD Cyclopamin kann die Signalweg-Aktivierung in Ptc1-/- Zellen aktivieren. p2 PTC-/- Zellen (diese Zellen sind eine klonierte Linie, die aus Ptc-/- Maus-Embryo-Fibroblasten abgeleitet wurde) wurden mit ansteigenden Konzentrationen von Cyclopamin (leere Kästchen) oder KAAD Cyclopamin (gefüllte Kästchen) für 2 Tage behandelt. Die Unterdrückung der Signalweg-Aktivität, die durch SmoAl-Renilla durch hohe Konzentrationen von Cyclopaminderivaten induziert wurde, schloss keine Abnahme im Expressionsgrad des Smo-Konstrukts ein (nicht gezeigt). Die Zellen wurden in doppelter Ausfertigung in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät, man ließ sie bis zur Sättigungsdichte wachsen und inkubierte mit Cyclopamin und KAAD Cyclopamin für 2 Tage. Die &bgr;-Galactosidase-Aktivität wurde unter Verwendung eines Galacto-Light-Kits (keine Inaktivierung von endogener &bgr;-gal-Aktivität, Tropix) bestimmt. Die &bgr;-Galactosidase-Aktivitäten wurden auf die Zellmasse normalisiert, wie von einer behandelten Kopie-Platte unter Verwendung des Zelltiter 96AQ-Tests (Promega) bestimmt. Die maximal normalisierten &bgr;-Galactosidase-Aktivitäten (1103 für KAAD-Cyclopamin und 916 für Cyclopamin) wurden auf 1 gesetzt und die minimalen Aktivitäten (191 beziehungsweise 144) wurden auf 0 gesetzt. Signifikante Toxizität (mikroskopisch sichtbarer Zelltod oder Abnahme des Zelltitermesswerts) wurde nicht beobachtet, sogar bei den höchsten Dosen der verwendeten Verbindungen. Die &bgr;-Galactosidase-Aktivität ist auf das Maximum normalisiert. Die Fehlerbalken A und B zeigen eine Standardabweichung an.

5 stellt Inhibitoren des Hedgehog-Signalwegs gemäß der vorliegenden Erfindung dar.

6 bildet die Reaktion eines Fibrosarkomtumors auf die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Verbindung ab.

7 vergleicht Tumorgewebe nach der Behandlung mit Tomatidin mit Gewebe, das mit einer erfindungsgemäßen Verbindung behandelt wurde.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung 1. Übersicht

Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass Signaltransduktions-Signalwege, welche durch patched (ptc) und/oder smoothened reguliert werden, zumindest teilweise durch Steroidalkaloide und Analoga davon gehemmt werden können. Wir haben, wie nachstehend detaillierter ausgeführt werden wird, beobachtet, dass Derivate von Cyclopamin die smoothened-abhängige Aktivität des hedgehog-Signalwegs hemmen können. Ohne uns zu sehr an eine bestimmte Theorie binden zu wollen, zeigen unsere Daten, dass Cyclopamin an dem Smoothened-Spiegel wirkt, welcher direkt oder indirekt das Steady-State-Verhältnis von aktiven und inaktiven Formen von Smoothened in Richtung inaktive Form verschiebt (z. B. bezogen auf die Abwesenheit des Steroidalkaloids).

Es wird deshalb besonders in Betracht gezogen, dass andere kleine Moleküle, steroidal und nicht steroidal in der Struktur, ähnliche Auswirkungen auf die smoothened-vermittelte Signaltransduktion aufweisen können. Zum Beispiel können derartige Verbindungen nützlich sein zum Hemmen von Proliferation und/oder zur Induktion der Differenzierung normaler Gewebe (z. B. Gewebe, welche smo exprimieren, oder die auf andere Weise auf hedgehog reagieren). Die erfindungsgemäßen smoothened-Antagonisten können auch verwendet werden, um Proliferation (oder andere biologische Auswirkungen) in Zellen oder Geweben zu hemmen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen patched-Funktionsverlust-Phänotypus, einen smoothened-Funktionsgewinn-Phänotypus oder einen hedgehog-Funktionsgewinn-Phänotypus aufweisen.

Es wird ebenfalls besonders in Betracht gezogen, dass angesichts von Cyclopamin und anderen kleinen Molekülen, die fähig sind smoothened-vermittelte Signaltransduktion zu hemmen, Aktivatoren der smoothened-vermittelten Signaltransduktion identifiziert werden können, z. B. Verbindungen, die direkt oder indirekt das Steady-State-Verhältnis von aktiven und inaktiven Formen von smoothened in Richtung der aktiven Form verschieben. Derartige Verbindungen können nützlich sein um zur Veranschaulichung Proliferation zu induzieren und/oder der Differenzierung normaler Gewebe (z. B. Gewebe, welche smo exprimieren oder die auf andere Weise auf hedgehog reagierend sind) vorzubeugen.

In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Inhibitoren und Aktivatoren organische Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 2500 amu, stärker bevorzugt weniger als 1500 amu und am meisten bevorzugt von weniger als 750 amu, und sie sind fähig, mindestens einen Teil der Aktivität eines smoothened-Signaltransduktions-Signalwegs zu hemmen.

Deshalb schließen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Mitteln, wie von kleinen Molekülen, ein, welche der smoothened-abhängigen Aktivität des hedgehog-Signalwegs entgegenwirken oder sie aktivieren (soweit erforderlich), was zu einer Regulation in der Reparatur und/oder der funktionellen Leistung eines breiten Bereichs von Zellen, Geweben und Organen führt. Zum Beispiel weisen die erfindungsgemäßen Verfahren therapeutische oder kosmetische Anwendungen auf, die sich über die Regulation des Nervengewebes, der Knochen- und Knorpelbildung und -reparatur, der Regulation der Spermatogenese, der Regulation der glatten Muskulatur, der Regulation der Lunge, Leber, des Pankreas und anderer Organe, die aus dem primitiven Darm entstehen, der Regulation der hämatopoetischen Funktion, der Regulation des Haut- und Haarwachstums etc. erstrecken. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verfahren an Zellen, welche in Kultur (in vitro) bereitgestellt werden, oder an Zellen in einem vollständigen Lebewesen (in vivo) durchgeführt werden. Siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichungen WO 95/18856 und WO 96/17924 (deren Beschreibungen hierin durch Bezugnahme ausdrücklich aufgenommen sind).

In einer bestimmten bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen smoothened-Antagonisten Epithelzellen behandeln, welche einen Phänotypus des ptc-Funktionsverlustes, des hedgehog-Funktionsgewinns oder des smoothened-Funktionsgewinns aufweisen, wobei ein Mittel verwendet wird, welches der hedgehog-Funktion entgegenwirkt. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Verfahren in der Behandlung oder Vorbeugung von Basalzellenkarzinom oder anderen hedgehog-Signalweg-bezogenen Störungen verwendet werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen smoothened-Antagonisten und -Aktivatoren wie erforderlich verwendet werden, um die Proliferation oder Differenzierung von Pankreaszellen zu modulieren (z. B. sich erstreckend über Pankreas-Progenitorzellen und reife endokrine oder exokrine Zellen), oder um das Wachstum oder die Entwicklung von Pankreasgewebe, z. B. in vivo oder in vitro, zu regulieren.

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden als ein Teil eines Behandlungsregimes für das maligne Medulloblastom und andere primäre maligne neuroektodermale ZNS-Tumore.

In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Präparate bereit, welche als Wirkstoff einen smoothened-Antagonisten oder -Aktivator wie hierin beschrieben umfassen, der in einer Menge formuliert wurde, die ausreichend ist, um einen smoothened-abhängigen Signalweg in vivo zu regulieren, z. B. die Proliferation, Differenzierung oder andere biologische Auswirkungen der normalen oder anormalen Funktion von zum Beispiel ptc, hedgehog oder smoothened.

Die erfindungsgemäßen Behandlungen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen können sowohl für menschliche als auch tierische Individuen wirksam sein. Tierische Individuen, an denen die Erfindung anwendbar ist, erstrecken sich sowohl auf domestizierte Tiere als auch auf Nutzvieh, welches entweder als Haustier oder für kommerzielle Zwecke gehalten wird. Beispiele sind Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine und Ziegen.

II. Definitionen

Der Einfachheit halber sind bestimmte Begriffe, die in der Beschreibung, den Beispielen und den anhängenden Ansprüchen verwendet werden, hier erfasst.

Der Ausdruck "aberrante Modifikation oder Mutation" eines Gens bezieht sich auf solche genetische Läsionen, wie zum Beispiel Deletion, Substitution oder Addition von Nucleotiden an einem Gen, ebenso wie grobe chromosomale Umlagerungen des Gens und/oder anormale Methylierung des Gens. Gleichermaßen bezieht sich die Fehlexpression eines Gens auf aberrante Transkriptionsgrade des Gens bezogen auf derartige Grade in einer normalen Zelle unter ähnlichen Bedingungen, ebenso wie auf das nicht wild-typische Spleißen der mRNA, die vom Gen transkribiert wird.

"Basalzellenkarzinome" kommen in einer Vielzahl von klinischen und histologischen Formen vor wie nodular-ulzerös, oberflächlich, pigmentiert, Morphea-artig, als Fibroepitheliom und nävoides Syndrom. Basalzellenkarzinome sind die häufigsten im Menschen gefundenen kutanen Neoplasmen. Die Mehrheit der neuen Fälle der Nicht-Melanom-Hautkrebse fällt unter diese Kategorie.

"Brandwunden" bezieht sich auf Fälle, in denen große Oberflächenbereiche der Haut einer Person entfernt wurden oder verloren gingen aufgrund von Hitze und/oder chemischen Mitteln.

Der Begriff "cAMP-Regulator" bezieht sich auf ein Mittel, welches den Aktivitätsgrad von cAMP in einer Zelle verändert, einschließlich Mittel, welche auf Adenylatcyclase, cAMP-Phosphodiesterase oder andere Moleküle wirken, welche wiederum die cAMP-Spiegel oder -Aktivität regulieren. Zudem beziehen sich cAMP-Regulatoren so, wie der Begriff hierin verwendet wird, auf stromabwärtige Effektoren der cAMP-Aktivität, wie Proteinkinase A. "cAMP-Agonisten" beziehen sich auf die Untergruppe von cAMP-Regulatoren, welche die Aktivitätsgrade von cAMP in einer Zelle erhöhen, während "cAMP-Antagonisten" sich auf die Untergruppe beziehen, welche die Aktivitätsgrade von cAMP in einer Zelle verringern.

Der Begriff "Karzinom" bezieht sich auf ein malignes, von Epithelzellen vollzogenes neues Wachstum, welche dazu neigen, die umgebenden Gewebe zu infiltrieren und Metastasen entstehen zu lassen. Beispielhafte Karzinome schließen ein: das "Basalzellenkarzinom", welches ein Epitheltumor der Haut ist, der, obwohl er selten metastasiert, Möglichkeiten für lokale Invasion und Zerstörung aufweist; das "Plattenepithelzellkarzinom", welches sich auf Karzinome bezieht, die aus dem Plattenepithel entstehen und kuboide Zellen aufweisen; das "Karzinosarkom", welches maligne Tumoren einschließt, die aus karzinomatösem und sarkomatösem Gewebe zusammengesetzt sind; das "adenozystische Karzinom", ein Karzinom, welches durch Zylinder oder Hyalinbänder oder muzinöses Stroma gekennzeichnet ist, welches abgetrennt oder von Nestern oder Schnüren aus kleinen Epithelzellen umgeben ist, wobei es in Brust- oder Speicheldrüsen und Schleimdrüsen des Respirationstrakts vorkommt; das "Epidermoidkarzinom", welches sich auf Krebszellen bezieht, die dazu neigen, sich auf die gleiche Weise wie die der Epidermis zu differenzieren; d. h. sie neigen dazu, Stachelzellen zu bilden und sich einer Verhornung zu unterziehen; das "Nasopharynxkarzinom", welches sich auf einen Tumor bezieht, der in der Epithelauskleidung des Raumes hinter der Nase entsteht; und das "Nierenzellkarzinom", welches zum Krebs des renalen Parenchyms gehört, welches sich aus tubulären Zellen in verschiedenen Anordnungen zusammensetzt. Andere karzinomatöse epitheliale Wachstumsvorgänge sind die "Papillome", welche sich auf benigne Tumore beziehen, die aus dem Epithelium abgeleitet sind und ein Papillomavirus als kausative Ursache aufweisen; und "Epidermoidome", welche sich auf einen zerebralen oder meningealen Tumor beziehen, der durch den Einschluss von ektodermalen Elementen zur Zeit des Schließens der Neuralfurche gebildet wurde.

Das "Corium" oder "Dermis" bezieht sich auf die Schicht der Hauttiefe bis zur Epidermis, welche aus einem dichten Bett von vaskulärem Bindegewebe besteht und die Nerven und Endorgane der Empfindung beinhaltet. Die Haarwurzeln, Talg- und Schweißdrüsen sind Strukturen der Epidermis, welche tief in die Dermis eingebettet sind.

"Dentalgewebe" bezieht sich auf Gewebe im Mund, welches Epithelgewebe ähnlich ist, zum Beispiel Zahnfleischgewebe. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Behandlung von Paradontose nützlich.

"Dermale Hautgeschwüre" bezieht sich auf Läsionen der Haut, welche durch den oberflächlichen Verlust von Gewebe verursacht wurden, üblicherweise mit Entzündung. Dermale Hautgeschwüre, welche durch Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen Dekubitusgeschwüre, diabetische Geschwüre, Geschwüre durch venöse Stase und arterielle Geschwüre ein. Dekubituswunden beziehen sich auf chronische Geschwüre, welche vom Druck herrühren, der auf Hautbereiche über ausgedehnte Zeiträume ausgeübt wurde. Wunden dieses Typs werden häufig wund gelegene Stellen oder Druckgeschwüre genannt. Geschwüre durch venöse Stase rühren von der Stagnation des Blutes oder anderer Flüssigkeiten aus defekten Venen her. Arterielle Geschwüre beziehen sich auf nekrotische Haut im Bereich um Arterien mit geringer Blutdurchströmung herum.

Der Begriff "ED50" bedeutet die Dosis eines Arzneistoffes, welche 50 % seiner maximalen Reaktion oder Wirkung erzeugt.

Eine "wirksame Menge" einer erfindungsgemäßen Verbindung bezieht sich im Hinblick auf das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren auf eine Menge des Antagonisten in einer Zubereitung, welche, wenn sie als Teil eines erwünschten Dosierungsregimes angewendet wird, z. B. eine Veränderung in der Zellproliferationsrate und/oder dem Differenzierungsstatus einer Zelle und/oder der Überlebensrate einer Zelle klinisch verträglichen Standards entsprechend für die zu behandelnde Störung oder den kosmetischen Zweck hervorbringt.

Die Begriffe "Epithelin", "epithelial" und "Epithelium" beziehen sich auf die Zellbedeckung der internen und externen Körperoberflächen (kutan, mukös und serös), einschließlich der Drüsen und anderer Strukturen, die davon abgeleitet sind, z. B. korneale, ösophageale, epidermale und Haarfollikelepithelzellen. Andere beispielhafte Epithelgewebe schließen ein: das olfaktorische Epithel, welches die scheinbar in Schichten angelegte Epithelauskleidung der olfaktorischen Region in der Nasenhöhle ist und die Rezeptoren für den Geruchssinn enthält; das Drüsenepithel, welches sich auf das Epithel bezieht, das aus sezernierenden Zellen zusammengesetzt ist; das Plattenepithel, welches sich auf das Epithel bezieht, das aus abgeflachten plattenartigen Zellen zusammengesetzt ist. Der Begriff Epithel kann sich auch auf das Übergangsepithel beziehen, wie das, welches charakteristischerweise Hohlorgane auskleidet, die großen mechanischen Veränderungen aufgrund von Kontraktion und Distension unterzogen werden, z. B. Gewebe, welches einen Übergang zwischen geschichteten Platten- und Zylinderepithel darstellt.

Der Begriff "Epithelialisierung" bezieht sich auf Heilung durch das Wachstum von Epithelgewebe über eine entblößte Oberfläche.

Der Begriff "epidermale Drüse" bezieht sich auf eine Zellaggregation, die mit der Epidermis in Verbindung steht und darauf spezialisiert ist, Materialien zu sezernieren oder auszuschütten, die nicht auf ihre gewöhnlichen metabolischen Bedürfnisse bezogen sind. Zum Beispiel sind "Talgzellen" holokrine Drüsen im Corium, welche eine ölige Substanz und Talg sezernieren. Der Begriff "Schweißdrüsen" bezieht sich auf Drüsen, die Schweiß sezernieren, wobei sie im Corium oder subkutanen Gewebe untergebracht sind, durch einen Gang zur Körperoberfläche hin geöffnet.

Der Begriff "Epidermis" bezieht sich auf die äußerste und nicht vaskuläre Hautschicht, die vom embryonalen Ektoderm abgeleitet wurde, wobei sie in einer Dicke von 0,07 – 1,4 mm variiert. Auf der palmaren und plantaren Oberfläche umfasst sie von innen nach außen fünf Schichten: die Basalschicht, bestehend aus Säulenzellen, die senkrecht angeordnet sind; die Stachelzellen- oder spinöse Schicht, bestehend aus abgeflachten vielflächigen Zellen mit kurzen Fortsätzen oder Stacheln; die Körnerzellenschicht, bestehend aus abgeflachten Körnerzellen; die Hellzellenschicht, bestehend aus verschiedenen Schichten heller, transparenter Zellen, in welchen die Zellkerne undeutlich sind oder fehlen; und die Hornschicht, bestehend aus abgeflachten, verhornten, kernlosen Zellen. In der Epidermis der allgemeinen Körperoberfläche fehlt die Hellzellenschicht üblicherweise.

"Exzisionswunden" schließen Rupturen, Abschürfungen, Schnitte, Punktionen oder Lazerationen in der Epithelschicht der Haut ein und können sich in die Dermalschicht und sogar in das subkutane Fett und weiter erstrecken. Exzisionswunden können aus chirurgischen Verfahren oder unbeabsichtiges Eindringen in die Haut herrühren.

Der "Wachstumsstatus" einer Zelle bezieht sich auf die Proliferationsrate der Zelle und/oder den Status der Differenzierung der Zelle. Ein "veränderter Wachstumsstatus" ist ein Wachstumsstatus, der durch eine abnormale Proliferationsrate gekennzeichnet ist, z. B. eine Zelle, welche eine erhöhte oder verminderte Proliferationsrate bezogen auf eine normale Zelle zeigt.

Der Begriff "Haar" bezieht sich auf eine fadenförmige Struktur, insbesondere die spezialisierte Epidermalstruktur, die aus Keratin besteht und sich aus einer Papille entwickelt, welche in das Corium versenkt ist, wobei es nur von Säugern hergestellt wird und für diese Gruppe von Lebewesen charakteristisch ist. Auch kann sich "Haar" auf die Gesamtmenge derartiger Haare beziehen. Ein "Haarfollikel" bezieht sich auf eine der tubulären Invaginationen der Epidermis, welche die Haare umschließen, und aus denen die Haare wachsen. "Haarfollikelepithelzellen" beziehen sich auf Epithelzellen, welche die dermale Papille im Haarfollikel umgeben, z. B. Stammzellen, die Hüllzellen der äußeren Wurzel, Matrixzellen und Hüllzellen der inneren Wurzel. Derartige Zellen können normale, nicht maligne Zellen oder transformierte/immortalisierte Zellen sein.

Der Begriff "smoothened-Antagonist" bezieht sich auf ein Mittel, welches die Transkription von Zielgenen, z. B. gli1- und ptc-Genen, unterdrückt, welche in normalen Zellen durch Kontakt der Zelle mit hedgehog induziert oder unterdrückt werden. Zusätzlich zum Abändern eines smoothened-abhängigen Signalwegs können bevorzugte smoothened-Antagonisten verwendet werden, um einen ptc-Funktionsverlust und/oder einen smoothened-Funktionsgewinn zu überwinden. Der Begriff "smoothened-Antagonist" wie hierin verwendet bezieht sich auch auf jedes Mittel, das durch Regulieren eines stromabwärtigen Effektors des smoothened-Signalwegs wie fused, suppressor of fused, cubitus interruptus, costal-2 etc. wirken kann, wodurch die smoothened-abhängige Signalweg-Aktivierung gehemmt wird.

Die Begriffe "Funktionsverlust" und "Funktionsgewinn" beziehen sich, wie angemessen, auf eine aberrante Modifikation oder Mutation z. B. eines ptc-Gens, hedgehog-Gens oder smoothened-Gens oder eine Abnahme oder Zunahme im Expressionsgrad eines derartigen Gens, was zu einem Phänotypus führt, der z. B. dem In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem hedgehog-Protein ähnelt, wie einer aberranten Aktivierung eines hedgehog-Signalwegs, oder einem Verlust der smo-Funktion ähnelt. Die Mutation kann einen Verlust der Fähigkeit des ptc- oder smo-Gen-Produkts (der Gen-Produkte), den Grad der Aktivität von Ci-Proteinen, z. B. Gli1, Gli2 und Gli3 zu regulieren, einschließen.

Wie hierin verwendet bezieht sich "immortalisierte Zellen" auf Zellen, die über chemische und/oder rekombinante Mittel derart verändert wurden, dass die Zellen die Fähigkeit, über eine unbegrenzte Anzahl von Zellteilungen in Kultur zu wachsen, aufweisen.

"Inneres epitheliales Gewebe" bezieht sich auf Gewebe im Inneren des Körpers, welches Merkmale ähnlich der epidermalen Schicht in der Haut aufweist. Beispiele schließen die Auskleidung des Darms ein. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist nützlich zum Fördern der Heilung von bestimmten inneren Wunden, zum Beispiel Wunden, die aus einem chirurgischen Eingriff herrühren.

Der Begriff "Keratose" bezieht sich auf eine proliferative Hautstörung, welche durch Hyperplasie der Hornschicht der Epidermis gekennzeichnet ist. Beispielhafte keratotische Störungen schließen Keratosis follicularis, Keratosis palmaris et plantaris, Keratosis pharyngea, Keratosis pilaris und Strahlenkeratose ein.

Der Begriff "LD50" bedeutet die Dosis eines Arzneistoffs, welche in 50 % der Testpersonen tödlich ist.

Der Begriff "Nagel" bezieht sich auf die kutane Hornplatte auf der dorsalen Oberfläche des distalen Endes eines Fingers oder Zehs.

Ein "Patient" oder eine "Person", welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden soll, kann entweder ein humanes oder nicht humanes Lebewesen bedeuten.

Wie hierin verwendet beziehen sich "proliferierend" und "Proliferation" auf Zellen, die Mitose unterlaufen.

In dieser Anmeldung bezieht sich der Begriff "proliferative Hautstörung" durchgehend auf jede Erkrankung/Störung der Haut, welche durch ungewollte oder aberrante Proliferation von kutanem Gewebe gekennzeichnet ist. Diese Zustände sind typischerweise durch epidermale Zellproliferation oder unvollständige Zelldifferenzierung gekennzeichnet und schließen zum Beispiel X-gebundene Ichthyose, Psoriasis, atopische Dermatitis, allergische Kontaktdermatitis, epidermolytische Hyperkeratose und seborrhoische Dermatitis ein. Zum Beispiel ist die Epidermodysplasie eine Form von fehlerhafter Entwicklung der Epidermis. Ein anderes Beispiel ist die "Epidermolyse", welche sich auf einen gelösten Zustand der Epidermis mit der Bildung von Bläschen und Blasen, entweder spontan oder an der Stelle eines Traumas, bezieht.

Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Psoriasis" auf eine hyperproliferative Hautstörung, welche die Regulationsmechanismen der Haut verändert. Insbesondere werden Läsionen gebildet, welche primäre und sekundäre Änderungen in der epidermalen Proliferation, entzündliche Reaktionen der Haut und eine Expression von Regulationsmolekülen wie Lymphokinen und Entzündungsfaktoren beinhalten. Psoriatische Haut ist morphologisch durch einen erhöhten Umsatz von Epidermiszellen, verdickter Epidermis, anormaler Keratinisation, entzündlichen Zellinfiltraten in die Dermis-Schicht und polymorphkernige Leukozyteninfiltration in die Epidermisschicht gekennzeichnet, was zu einer Zunahme des Basalzellenzyklus führt. Zudem sind hyperkeratotische und parakeratotische Zellen vorhanden.

Der Begriff "Haut" bezieht sich auf die äußere Schutzhülle des Körpers, bestehend aus dem Corium und der Epidermis, und wird so verstanden, dass sie Schweiß- und Talgdrüsen ebenso wie Haarfollikel-Strukturen einschließt. Das Adjektiv "kutan" kann in der vorliegenden Anmeldung durchgehend verwendet werden und sollte so verstanden werden, dass es sich im Allgemeinen auf die Attribute der Haut bezieht, dem Kontext entsprechend, in dem sie verwendet werden.

Der Begriff "therapeutischer Index" bezieht sich auf den therapeutischen Arzneistoff-Index, der als LD50/ED50 definiert wird.

Wie hierin verwendet bezieht sich "transformierte Zellen" auf Zellen, welche sich spontan in einen Zustand ungehinderten Wachstums umgewandelt haben, d. h. sie haben die Fähigkeit erworben, über eine unbegrenzte Anzahl von Teilungen in Kultur zu wachsen. Transformierte Zellen können durch derartige Begriffe wie neoplastisch, anaplastisch und/oder hyperplastisch in Hinsicht auf ihren Verlust der Wachstumskontrolle gekennzeichnet werden.

Der Begriff "Acylamino" ist auf dem Fachgebiet anerkannt und bezieht sich auf einen Rest, welche durch die allgemeine Formel: dargestellt werden kann, wobei R9 die vorstehende Bedeutung hat und R'11 für ein Wasserstoffatom, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 steht, wobei R8 für ein Aryl, ein Cycloalkyl, ein Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycyclus steht; und m 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8 ist.

Hierin bezieht sich der Begriff "aliphatischer Rest" auf einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest und schließt gesättigte und ungesättigte aliphatische Reste, wie einen Alkylrest, einen Alkenylrest und einen Alkinylrest, ein.

Die Begriffe "Alkenyl" und "Alkinyl" beziehen sich auf ungesättigte aliphatische Reste, die in der Länge und möglicher Substitution den vorstehend beschriebenen Alkylen analog sind, jedoch mindestens eine Doppel- beziehungsweise Dreifachbindung enthalten.

Die Begriffe "Alkoxyl" oder "Alkoxy" beziehen sich wie hierin verwendet auf einen Alkylrest wie vorstehend definiert mit einem Sauerstoffradikal daran gebunden. Repräsentative Alkoxylreste schließen Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, tert-Butoxy und dergleichen ein. Ein "Ether" besteht aus zwei Kohlenwasserstoffen, die durch ein Sauerstoffatom kovalent gebunden sind. Dementsprechend ist der Substituent eines Alkyls, welcher aus einem Alkyl einen Ether macht, ein Alkoxyl oder ähnelt einem solchen, welches durch -O-Alkyl, -O-Alkenyl, -O-Alkinyl, -O-(CH2)m-R8 dargestellt werden kann, wobei m und R8 die vorstehende Bedeutung haben.

Der Begriff "Alkyl" bezieht sich auf das Radikal von gesättigten aliphatischen Gruppen, einschließlich geradkettige Alkylreste, verzweigte Alkylreste, Cycloalkyl-(alicyclische)Reste, alkylsubstituierte Cycloalkylreste und cycloalkylsubstituierte Alkylreste. In bevorzugten Ausführungsformen weist ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl 30 oder weniger Kohlenstoffatome im Gerüst auf (z. B. C1-C30 für gerade Ketten, C3-C30 für verzweigte Ketten) und stärker bevorzugt 20 oder weniger. Gleichermaßen weisen bevorzugte Cycloalkyle 3 – 10 Kohlenstoffatome in ihrer Ringstruktur und stärker bevorzugt 5, 6 oder 7 Kohlenstoffatome in der Ringstruktur auf.

Darüber hinaus soll der Begriff "Alkyl" (oder "Niederalkyl"), wie in der Beschreibung, den Beispielen und Ansprüchen durchgehend verwendet, sowohl "unsubstituierte Alkyle" als auch "substituierte Alkyle" einschließen, wobei sich die letzteren von diesen auf Alkyleinheiten mit Substituenten beziehen, welche ein Wasserstoffatom an einem oder mehreren Kohlenstoffatomen des Kohlenwasserstoffgerüsts ersetzen. Derartige Substituenten können zum Beispiel eine Halogen-, eine Hydroxyl-, eine Carbonyl- (wie eine Carboxyl-, eine Alkoxycarbonyl-, eine Formyl- oder eine Acyl-), eine Thiocarbonyl- (wie einen Thioester, ein Thioacetat oder ein Thioformiat), eine Alkoxyl-, eine Phosphoryl-, eine Phosphat-, eine Phosphonat-, eine Phosphinat-, eine Amino-, eine Amido-, eine Amidin-, eine Imin-, eine Cyano-, eine Nitro-, eine Azido-, eine Sulfhydryl-, eine Alkylthio-, eine Sulfat-, eine Sulfonat-, eine Sulfamoyl-, eine Sulfonamido-, eine Sulfonyl-, eine Heterocyclyl-, eine Aralkyl- oder eine aromatische oder heteroaromatische Einheit einschließen. Es wird dem Fachmann selbstverständlich sein, dass die Einheiten, welche an der Kohlenwasserstoffkette substituiert sind, ihrerseits substituiert sein können, falls angemessen. Zum Beispiel können die Substituenten eines substituierten Alkyls substituierte und unsubstituierte Formen von Amino-, Azido-, Imino-, Amino-, Phosphoryl- (einschließlich Phosphonat und Phosphinat), Sulfonyl-(einschließlich Sulfat, Sulfonamido, Sulfamoyl und Sulfonat) und Silylreste ebenso wie Ether, Alkylthioreste, Carbonyle (einschließlich Ketone, Aldehyde, Carboxylate und Ester), -CF3, -CN und dergleichen einschließen. Beispielhafte substituierte Alkyle werden nachstehend beschrieben. Die Cycloalkyle können mit Alkylen, Alkenylen, Alkoxy-Resten, Alkylthioresten, Aminoalkylen, carbonylsubstituierten Alkylen, -CF3, -CN und dergleichen weiter substituiert sein.

Wenn die Anzahl der Kohlenstoffatome nicht näher bestimmt ist, bedeutet "Niederalkyl" wie hierin verwendet einen Alkylrest mit der vorstehenden Bedeutung, der jedoch ein bis zehn Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt ein bis sechs Kohlenstoffatome in seiner Gerüststruktur aufweist. Gleichermaßen weisen "Niederalkenyl" und "Niederalkinyl" gleiche Kettenlängen auf. In der Anmeldung sind die bevorzugten Alkylreste durchgehend Niederalkyle. In den bevorzugten Ausführungsformen ist ein Substituent, der hierin als Alkyl bezeichnet wird, ein Niederalkyl.

Der Begriff "Alkylthio" bezieht sich auf einen Alkylrest wie vorstehend definiert mit einem Schwefelrest daran gebunden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die "Alkylthioeinheit" durch eines von -S-Alkyl, -S-Alkenyl, -S-Alkinyl und -S-(CH2)m-R8 dargestellt, wobei m und R8 die vorstehende Bedeutung haben. Repräsentative Alkylthioreste schließen Methylthio, Ethylthio und dergleichen ein.

Die Begriffe "Amin" und "Amino" sind auf dem Fachgebiet anerkannt und beziehen sich sowohl auf unsubstituierte als auch substituierte Amine, z. B. eine Einheit, die durch die allgemeine Formel: dargestellt werden kann, wobei R9, R10 und R'10 jeweils unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, ein Alkyl, ein Alkenyl, -(CH2)m-R8 stehen oder R9 und R10 zusammen genommen mit dem N-Atom, an welches sie gebunden sind, einen Heterocyclus mit 4 bis 8 Atomen in der Ringstruktur komplettieren; R8 steht für ein Aryl, ein Cycloalkyl, ein Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycylus; und m ist Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 8. In bevorzugten Ausführungsformen kann nur einer von R9 oder R10 ein Carbonyl sein, z. B. bilden R9, R10 und das Stickstoffatom zusammen kein Imid. In noch stärker bevorzugten Ausführungsformen stehen R9 und R10 (und gegebenfalls R'10) jeweils unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8. Deshalb bedeutet der Begriff "Alkylamin" wie hierin verwendet einen Aminrest wie vorstehend definiert mit einem substituierten oder unsubstituierten Alkyl daran gebunden, d. h. mindestens einer von R9 und R10 ist ein Alkylrest.

Der Begriff "Amido" ist auf dem Fachgebiet als ein aminosubstituiertes Carbonyl anerkannt und schließt eine Einheit ein, welche durch die allgemeine Formel: dargestellt werden kann, wobei R9, R10 die vorstehende Bedeutung haben. Bevorzugte Ausführungsformen des Amids werden keine Imide, die instabil sein können, einschließen.

Der Begriff "Aralkyl" bezieht sich wie hierin verwendet auf einen Alkylrest, der mit einem Arylrest (z. B. einem aromatischen oder heteroaromatischen Rest) substituiert ist.

Der Begriff "Aryl" schließt, wie hierin verwendet, 5-, 6- und 7-gliedrige aromatische Gruppen mit einem einzelnen Ring, die Heteroatome (bevorzugt 1 – 4) einschließen können, zum Beispiel Benzol, Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Triazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin und Pyrimidin und dergleichen ein. Diese Arylreste mit Heteroatomen in der Ringstruktur können auch als "Arylheterocyclen" oder "Heteroaromaten" bezeichnet werden. Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen mit solchen Substituenten wie vorstehend beschrieben substituiert sein, zum Beispiel Halogen-, Azid-, Alkyl-, Aralkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Amino-, Nitro-, Mercapto-, Imino-, Amido-, Phosphat-, Phosphonat-, Phosphinat-, Carbonyl-, Carboxyl-, Silyl-, Ether-, Alkylthio-, Sulfonyl-, Sulfonamido-, Keton-, Aldehyd-, Ester-, Heterocyclyl-, aromatischen oder heteroaromatischen Resten, -CF3, -CN oder dergleichen. Der Begriff "Aryl" schließt auch polycyclische Ringsysteme mit zwei oder mehr cyclischen Ringen ein, in denen zwei oder mehr Kohlenstoffatome zwei benachbarten Ringen gemeinsam sind (diese Ringe sind "kondensierte Ringe"), wobei mindestens einer der Ringe aromatisch ist, z. B. können die anderen cyclischen Ringe Cycloalkyle, Cycloalkenyle, Cycloalkinyle, Aryle und/oder Heterocyclyle sein.

Der Begriff "Carbocyclus" bezieht sich wie hierin verwendet auf einen aromatischen oder nicht aromatischen Ring, in welchem jedes Ringatom Kohlenstoff ist.

Der Begriff "Carbonyl" ist auf dem Fachgebiet anerkannt und schließt solche Einheiten ein, welche durch die allgemeine Formel: dargestellt werden können, wobei X eine Bindung ist oder für ein Sauerstoffatom oder Schwefelatom steht und R11 ein Wasserstoffatom, ein Alkyl, ein Alkenyl, -(CH2)m-R8 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz, R'11 für ein Wasserstoffatom, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 steht, wobei m und R8 die vorstehende Bedeutung haben. Wo X ein Sauerstoffatom ist und R11 oder R'11 nicht Wasserstoff ist, steht die Formel für einen "Ester". Wo X ein Sauerstoffatom ist und R11 die vorstehende Bedeutung hat, wird die Einheit hierin als eine Carboxylgruppe bezeichnet und insbesondere steht, wenn R11 ein Wasserstoffatom ist, die Formel für eine "Carbonsäure". Wo X ein Sauerstoffatom ist und R'11 ein Wasserstoffatom, steht die Formel für ein "Formiat". Im Allgemeinen steht, wo das Sauerstoffatom der vorstehenden Formel durch Schwefel ersetzt wird, die Formel für eine "Thiocarbonylgruppe". Wenn X ein Schwefelatom ist und R11 oder R'11 nicht Wasserstoff ist, steht die Formel für einen "Thioester". Wo X ein Schwefelatom ist und R11 Wasserstoff, steht die Formel für eine "Thiocarbonsäure". Wo X ein Schwefelatom ist und R11' Wasserstoff, steht die Formel für ein "Thiolformiat". Andererseits steht, wo X eine Bindung ist und R11 nicht Wasserstoff ist, die vorstehende Formel für eine "Keton"-Gruppe. Wo X eine Bindung ist und R11 Wasserstoff, steht die vorstehende Formel für eine "Aldehydgruppe".

Der Begriff "Heteroatom" bezieht sich wie hierin verwendet auf jedes andere Element außer Kohlenstoff oder Wasserstoff. Bevorzugte Heteroatome sind Bor, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel und Selen.

Die Begriffe "Heterocyclyl" oder "heterocyclischer Rest" beziehen sich auf 3- bis 10-gliedrige Ringstrukturen, stärker bevorzugt 3- bis 7-gliedrige Ringe, deren Ringstrukturen ein bis vier Heteroatome einschließen. Heterocyclen können auch Polycyclen sein. Heterocyclische Gruppen schließen zum Beispiel Thiophen, Thianthren, Furan, Pyran, Isobenzofuran, Chromen, Xanthen, Phenoxathiin, Pyrrol, Imidazol, Pyrazol, Isothiazol, Isoxazol, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Pyridazin, Indolizin, Isoindol, Indol, Indazol, Purin, Chinolizin, Isochinolin, Chinolin, Phthalazin, Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Pteridin, Carbazol, Carbolin, Phenanthridin, Acridin, Pyrimidin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenarsazin, Phenothiazin, Furazan, Phenoxazin, Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Oxazol, Piperidin, Piperazin, Morpholin, Lactone, Lactame wie Azetidinone und Pyrrolidinone, Sultame, Sultone und dergleichen ein. Der heterocyclische Ring kann an einer oder mehreren Positionen mit Substituenten wie vorstehend beschrieben substituiert sein, wie zum Beispiel Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Mercapto, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclyl, einer aromatischen oder heteroaromatischen Einheit, -CF3, -CN oder dergleichen.

Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff "Nitro" -NO2; der Begriff "Halogen" bezeichnet -F, -Cl, -Br oder -I; der Begriff "Mercapto" bedeutet -SH; der Begriff "Hydroxyl" bedeutet -OH und der Begriff "Sulfonyl" bedeutet -SO2-.

Ein Phosphonamidit" kann in der allgemeinen Formel: dargestellt werden, wobei R9 und R10 die vorstehende Bedeutung haben, Q2 für O, S oder N steht und R48 für ein Niederalkyl oder ein Aryl steht, Q2 für O, S oder N steht.

Ein "Phosphoramidit" kann in der allgemeinen Formel dargestellt werden, wobei R9 und R10 die vorstehende Bedeutung haben und Q2 für O, S oder N steht.

Die Begriffe "Polycyclyl" oder "polycyclischer Rest" beziehen sich auf zwei oder mehr Ringe (z. B. Cycloalkyle, Cycloalkenyle, Cycloalkinyle, Aryle und/oder Heterocyclyle), in denen zwei oder mehr Kohlenstoffatome zwei benachbarten Ringen gemeinsam sind, z. B. die Ringe "kondensierte Ringe" sind. Ringe, welche durch nicht benachbarte Atome miteinander verbunden sind, werden "überbrückte" Ringe genannt. Jeder der Ringe dieses Polycyclus kann mit derartigen Substituenten wie vorstehend beschrieben substituiert werden, zum Beispiel Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Mercapto, Imino, Amido, Phosphat, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, einem Heterocyclyl, einer aromatischen oder heteroaromatischen Einheit, -CF3, -CN oder dergleichen.

Der Ausdruck "Schutzgruppe" bedeutet wie hierin verwendet zeitweilige Substituenten, welche eine potenziell reaktive funktionelle Gruppe vor unerwünschten chemischen Umwandlungen schützen. Beispiele für derartige Schutzgruppen schließen Ester von Carbonsäuren, Silylether von Alkoholen und Acetale und Ketale von Aldehyden beziehungsweise Ketonen ein. Das Gebiet der Schutzgruppenchemie ist erörtert worden (Green, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Auflage, Wiley: New York, 1991).

Ein "Selenoalkyl" bezieht sich auf einen Alkylrest mit einer substituierten Selengruppe daran gebunden. Beispielhafte "Selenoether", welche an dem Alkyl substituiert sein können, sind -Se-Alkyl, -Se-Alkenyl, -Se-Alkinyl und -Se-(CH2)m-R8, wobei m und R8 die vorstehende Bedeutung haben.

Wie hierin verwendet, soll der Begriff "substitutiert" so verstanden werden, dass alle zulässigen Substituenten von organischen Verbindungen eingeschlossen sind. In einer breiteren Ausführungsform schließen die zulässigen Substituenten acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht aromatische Substituenten von organischen Verbindungen ein. Anschauliche Substituenten schließen zum Beispiel die hierin vorstehend beschriebenen ein. Die zulässigen Substituenten können einer oder mehrere und der gleiche oder verschiedene für die entsprechenden organischen Verbindungen sein. Zum Zweck dieser Erfindung können die Heteroatome wie Stickstoff Wasserstoffsubstituenten aufweisen und/oder jeden zulässigen Substituenten der hierin beschriebenen organischen Verbindungen, welcher die Valenzen des Heteroatoms sättigt. Die Erfindung soll nicht auf irgendeine Weise durch zulässige Substituenten organischer Verbindungen eingeschränkt sein.

Es wird selbstverständlich sein, dass "Substitution" oder "substituiert mit" die implizite Maßgabe einschließt, dass eine derartige Substitution in Übereinstimmung mit den zulässigen Valenzen des substituierten Atoms und des Substituenten steht und dass die Substitution zu einer stabilen Verbindung führt, welche zum Beispiel nicht spontan eine Umwandlung unterläuft wie durch Umlagerung, Cyclisierung, Eliminierung etc.

Der Begriff "Sulfamoyl" ist auf dem Fachgebiet anerkannt und schließt einen Rest ein, welcher durch die allgemeine Formel: dargestellt werden kann, in welchem R9 und R10 die vorstehende Bedeutung aufweisen.

Der Begriff "Sulfat" ist auf dem Fachgebiet anerkannt und schließt einen Rest ein, welcher durch die allgemeine Formel: dargestellt werden kann, in dem R41 die vorstehende Bedeutung hat.

Der Begriff "Sulfonamido" ist auf dem Fachgebiet anerkannt und schließt einen Rest ein, der durch die allgemeine Formel: dargestellt werden kann, in dem R9 und R'11 die vorstehende Bedeutung aufweisen.

Der Begriff "Sulfonat" ist auf dem Fachgebiet anerkannt und schließt einen Rest ein, welcher durch die allgemeine Formel: dargestellt werden kann, in welchem R41 ein Elektronenpaar, Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl ist.

Die Begriffe "Sulfoxido" oder "Sulfinyl" beziehen sich, wie hierin verwendet, auf einen Rest, welche durch die allgemeine Formel: dargestellt werden kann, in welchem R44 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aralkyl oder Aryl.

Wie hierin verwendet soll die Definition jedes Ausdrucks, z. B. Alkyl, m, n etc., wenn er mehr als einmal in einer Struktur vorkommt, unabhängig von seiner Definition irgendwo in der gleichen Struktur sein.

Die Begriffe Triflyl, Tosyl, Mesyl und Nonaflyl sind auf dem Fachgebiet anerkannt und beziehen sich auf Trifluormethansulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, Methansulfonyl- beziehungsweise Nonafluorbutansulfonylreste. Die Begriffe Triflat, Tosylat, Mesylat und Nonaflat sind auf dem Fachgebiet anerkannt und beziehen sich auf Trifluormethansulfonsäureester-, p-Toluolsulfonsäureester-, Methansulfonsäureester- und Nonafluorbutansulfonsäureestergruppen beziehungsweise Moleküle, welche die Gruppen enthalten.

Die Abkürzungen Me, Et, Ph, Tf Nf Ts, Ms stehen für Methyl, Ethyl, Phenyl, Trifluormethansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, p-Toluolsulfonyl beziehungsweise Methansulfonyl. Ein umfassendere Liste der von Fachleuten der organischen Chemie benutzten Abkürzungen erscheint in der ersten Ausgabe jedes Bandes des Journal of Organic Chemistry; diese Liste wird typischerweise in einer Tabelle angegeben mit dem Titel Standard List of Abbreviations. Die in der Liste enthaltenen Abkürzungen und alle von Fachleuten der organischen Chemie verwendeten Abkürzungen sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.

Bestimmte Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in besonderen geometrischen oder stereoisomeren Formen vorkommen. Die vorliegende Erfindung zieht alle derartigen Verbindungen in Betracht, einschließlich cis- und trans-Isomere, R- und S-Enantiomere, Diastereomere, (D)-Isomere, (L)-Isomere und racemische Gemische davon und andere Gemische davon, wie sie in den Umfang der Erfindung fallen. Zusätzliche asymmetrische Kohlenstoffatome können in einem Substituenten wie einem Alkylrest vorhanden sein. Alle derartigen Isomere, ebenso wie Gemische davon, sollen in diese Erfindung eingeschlossen sein.

Wenn zum Beispiel ein bestimmtes Enantiomer einer Verbindung der vorliegenden Erfindung gewünscht wird, kann es durch asymmetrische Synthese hergestellt werden oder durch Derivatisierung mit einem chiralen Hilfsstoff, wobei das so erhaltene diastereomere Gemisch getrennt wird und die Hilfsgruppe abgespalten wird, um die reinen gewünschten Enantiomere bereitzustellen. In einer anderen Ausführungsform können, wo die Moleküle eine basische funktionelle Gruppe enthalten, wie Amino, oder eine saure funktionelle Gruppe, wie Carboxyl, diastereomere Salze mit einer geeigneten optisch aktiven Säure oder Base gebildet werden, gefolgt von Racemattrennung der so gebildeten Diastereomere durch fraktionierende Kristallisation oder durch auf dem Fachgebiet bekannte chromatographische Mittel und anschließende Gewinnung des reinen Enantiomers.

Die in Betracht gezogenen Äquivalente der vorstehend beschriebenen Verbindungen schließen Verbindungen ein, welche ihnen anderweitig entsprechen und welche die gleichen allgemeinen Eigenschaften davon aufweisen (z. B. die Fähigkeit, die hedgehog-Signalwirkung zu hemmen), wobei eine oder mehrere einfache Variationen der Substituenten hergestellt werden, welche die Wirksamkeit der Verbindung nicht nachteilig beeinflussen. Im Allgemeinen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch die in den allgemeinen Reaktionsschemata veranschaulichten Verfahren wie zum Beispiel nachstehend beschrieben oder durch Modifikationen davon hergestellt werden unter Verwendung leicht erhältlicher Ausgangsmaterialien, Reagenzien und üblicher Syntheseverfahren. In diesen Umsetzungen ist es auch möglich, Verwendung von Varianten zu machen, welche an und für sich bekannt sind, hier jedoch nicht erwähnt werden.

Zum Zweck dieser Erfindung werden die chemischen Elemente in Übereinstimmung mit der Periodensystem der Elemente, CAS Version, Handbook of Chemistry and Physics, 67. Ausgabe, 1986 – 87, Innendeckel, identifiziert. Ebenfalls wird zum Zweck dieser Erfindung der Begriff "Kohlenwasserstoff" so betrachtet, dass er alle zulässigen Verbindungen einschließt, welche mindestens ein Wasserstoffatom und ein Kohlenstoffatom aufweisen. In einer weitgefassten Ausführungsform schließen die zulässigen Kohlenwasserstoffe acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht aromatische organische Verbindungen ein, die substituiert oder unsubstituiert sein können.

III. Beispielhafte Verbindungen der Erfindung

Wie nachstehend detaillierter beschrieben, wird in Betracht gezogen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung einer Vielzahl unterschiedlicher Steroidalkaloide durchgeführt werden kann, welche leicht, z. B. durch solche Arzneistoff-Screening-Tests wie hierin beschrieben, identifiziert werden können. Steroidalkaloide weisen einen ziemlich komplexen, stickstoffhaltigen Nukleus auf. Zwei beispielhafte Klassen von Steroidalkaloiden zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren sind der Solanum-Typ und der Veratrum-Typ. Ungeachtet des Vorstehenden machen die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform Gebrauch von Verbindungen mit einem Steroidalkaloid-Ringsystem von Cyclopamin.

Es gibt mehr als 50 natürlich vorkommende Veratrum-Alkaloide, einschließlich Veratramin, Cyclopamin, Cycloposin, Jervin und Muldamin, welche in Pflanzen der Veratrum spp. vorkommen. Die Zigadenus spp., Death Camas, produziert auch verschiedene Steroidalkaloide vom Veratrum-Typ, einschließlich Zygacin. Im Allgemeinen bestehen viele der Veratrum-Alkaloide (z. B. Jervin, Cyclopamin und Cycloposin) aus einem modifizierten Steroidskelett, das an ein Furanopiperidin spiro gebunden ist. Ein typisches Alkaloid vom Veratrum-Typ kann dargestellt werden durch:

Ein Beispiel für den Solanum-Typ ist Solanidin. Dieses Steroidalkaloid ist der Nukleus (d. h. Aglykon) für zwei wichtige Glycoalkaloide, Solanin und Chaconin, welche sich in Kartoffeln finden. Andere Pflanzen in der Solanumfamilie einschließlich verschiedener Nachtschatten, Korallenstrauch und Tomaten enthalten ebenfalls Alkaloide vom Solanum-Typ. Glykoalkaloide sind Glykoside von Alkaloiden. Ein typisches Alkaloid vom Solanum-Typ kann durch: dargestellt werden. Basierend auf diesen Strukturen und der Möglichkeit, dass bestimmte ungewollte Nebenwirkungen durch eine gewisse Manipulation der Struktur verringert werden können, wird ein breiter Bereich von Steroidalkaloiden als potenzielle smoothened-Antagonisten angesehen. Zum Beispiel schließen nützliche Verbindungen Steroidalkaloide ein, welche durch die allgemeinen Formeln (I) dargestellt werden, oder gesättigte Formen davon und/oder Seco-, Nor- oder Homoderivate davon: welche durch die vorliegende Erfindung nicht umfasst werden.

Formel I

  • wobei, wie Valenz und Stabilität es gestatten,
  • R2, R3, R4 und R5 eine oder mehrere Substitutionen am Ring bedeuten, an den jeder gebunden ist, bei jedem Auftreten unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogene, Alkyle, Alkenyle, Alkinyle, Aryle, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Amine, Imine, Amide, Phosphoryle, Phosphonate, Phosphine, Carbonyle, Carboxyle, Carboxamide, Anhydride, Silyle, Ether, Thioether, Alkylsulfonyle, Arylsulfonyle, Selenoether, Ketone, Aldehyde, Ester, Zucker (z. B. Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid etc.), Carbamat (z. B. an das Steroid am Sauerstoff gebunden), Carbonat oder -(CH2)m-R8 bedeuten;
  • R6, R7, R'7 abwesend sind oder unabhängig voneinander Halogene, Alkyle, Alkenyle, Alkinyle, Aryle, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Amine, Imine, Amide, Phosphoryle, Phosphonate, Phosphine, Carbonyle, Carboxyle, Carboxamide, Anhydride, Silyle, Ether, Thioether, Alkylsulfonyle, Arylsulfonyle, Selenoether, Ketone, Aldehyde, Ester oder -(CH2)m-R8 bedeuten oder
  • R6 und R7 oder R7 und R'7 zusammen genommen einen Ring oder polycyclischen Ring bilden, welcher z. B. substituiert oder unsubstituiert ist, mit der Maßgabe, dass mindestens einer von R6, R7 oder R'7 vorhanden ist und ein Amin einschließt, z. B. als eines der Atome, welche den Ring ausmachen;
  • R8 ein Aryl, ein Cycloalkyl, ein Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycyclus bedeutet; und
  • m eine ganze Zahl ist im Bereich von 0 bis einschließlich 8.

In bestimmten Ausführungsformen bedeutet R2 =O, Zucker (z. B. Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid etc.), Carbamat (z. B. an das Steroid am Sauerstoff gebunden), Ester (z. B. an das Steroid am Sauerstoff gebunden), Carbonat oder Alkoxy. Substituenten wie Carbamat, Ester, Carbonat und Alkoxy können substituiert oder unsubstituiert sein, z. B. können sie zusätzliche funktionelle Gruppen einschließen wie Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroaralkyl, Amid, Acylamino, Carbonyl, Ester, Carbamat, Harnstoff, Keton, Sulfonamid etc.

In bestimmten Ausführungsformen ist das Amin von R6, R7 oder R'7 ein tertiäres Amin.

In besonderen Ausführungsformen ist R3 bei jedem Auftreten -OH, Alkyl, -O-Alkyl, -C(O)-Alkyl oder -C(O)-R8.

In besonderen Ausführungsformen fehlt R4 oder bedeutet bei jedem Auftreten -OH, =O, Alkyl, -O-Alkyl, -C(O)-Alkyl oder -C(O)-R8.

In besonderen Ausführungsformen bilden zwei von R6, R7 und R'7 zusammen genommen einen stickstoffhaltigen Ring, wie ein Furanopiperidin, wie Perhydrofuro[3,2-b]pyridin, ein Pyranopiperidin, ein Chinolin, ein Indol, ein Pyranopyrrol, ein Naphthyridin, ein Thiofuranopiperidin oder ein Thiopyranopiperidin.

In bestimmten Ausführungsformen umfasst der stickstoffhaltige Ring ein tertiäres Amin, z. B. indem es einen außerhalb des Rings befindlichen Substituenten an dem Stickstoffatom aufweist, z. B. ein Alkyl, substituiert mit zum Beispiel Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroaralkyl, Amid, Acylamino, Carbonyl, Ester, Carbamat, Harnstoff, Keton, Sulfonamid etc. In bestimmten Ausführungsformen ist der außerhalb des Rings befindliche Substituent des tertiären Amins ein hydrophober Substituent. In bestimmten Ausführungsformen schließt der hydrophobe, außerhalb des Rings befindliche Substituent ein Aryl, Heteroaryl, Carbocyclyl, Heterocyclyl oder einen Polycyclyl-Rest wie Biotin, einen zwitterionischen Bor-Komplex, einen steroidalen Polycyclus etc. ein. In bestimmten Ausführungsformen kann der hydrophobe Substituent im Wesentlichen aus einer Kombination aus Alkyl, Amido, Acylamino, Keton, Ester, Ether, Halogen, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Harnstoff oder ähnlichen funktionellen Gruppen bestehen, wobei zwischen 5 und 40 Nicht-Wasserstoffatome, stärker bevorzugt zwischen 5 und 20 Nicht-Wasserstoffatome eingeschlossen sind.

In besonderen Ausführungsformen bedeutet R8 ein Aryl, ein Cycloalkyl, ein Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycyclus und bevorzugt ist R8 ein Piperidin, Pyrrolidin, Pyridin, Pyrimidin, Morpholin, Thiomorpholin, Pyridazin etc.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in der allgemeinen Formel (IV) oder ungesättigten Formen davon dargestellt: wobei

R2 unabhängig bei jedem Vorkommen eine oder mehrere Substitutionen an dem Ring, an den es gebunden ist, bedeutet, ausgewählt aus Wasserstoff, Halogenatomen, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Arylresten, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Aminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonyl-, Carboxylgruppen, Carboxamiden, Anhydriden, Silylgruppen, Ethern, Thioethern, Alkylsulfonylen, Arylsulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern, Zucker, Carbamat, Carbonat oder -(CH2)m-R8;

R3 unabhängig bei jedem Vorkommen einen oder mehrere Substitutenten an dem Ring, an den es gebunden ist, bedeutet, ausgewählt aus Wasserstoff, Halogenatomen, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Arylresten, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Aminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonyl-, Carboxylgruppen, Carboxamiden, Anhydriden, Silylgruppen, Ethern, Thioethern, Alkylsulfonylen, Arylsulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern oder -(CH2)m-R8;

R4 und R5 unabhängig bei jedem Vorkommen abwesend sind oder einen oder mehrere Substitutionen an dem Ring, an den sie jeweils gebunden sind, bedeuten, ausgewählt aus Wasserstoff, Halogenatomen, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Arylresten, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Aminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonyl-, Carboxylgruppen, Carboxamiden, Anhydriden, Silylgruppen, Ethern, Thioethern, Alkylsulfonylen, Arylsulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern oder -(CH2)m-R8;

R6 abwesend ist oder unabhängig Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Carboxamid, Anhydrid, Silyl, Ether, Thioether, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R8 bedeutet;

R8 ein Aryl, ein Cycloalkyl, ein Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycyclus bedeutet;

R9 abwesend ist oder unabhängig bei jedem Vorkommen einen oder mehrere Substitutenten an dem Ring, an den es gebunden ist, bedeutet, ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Carboxamid, Anhydrid, Silyl, Ether, Thioether, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R8;

R22 abwesend ist oder ein Alkyl, ein Alkoxyl oder -OH bedeutet; und

m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis einschließlich 8 ist,

wobei mindestens ein Vorkommen von R9 ein außerhalb des Rings befindlicher Substituent ist, der an N gebunden ist, wodurch ein tertiäres Amin gebildet wird, und dieses Vorkommen von R9 ein Alkyl, substituiert mit einem Acylamino, ist,

wobei Alkyl gesättigte aliphatische Gruppen, geradkettige Alkylreste, verzweigte Alkylreste, Cycloalkyl-(alicyclische)-reste, Alkyl-substituierte Cycloalkylreste und Cycloalkyl-substituierte Alkylreste bedeuten, welche substituiert oder unsubstituiert sind,

wobei Amin und Amino sowohl substituierte als auch unsubstituierte Amine und Aminogruppen einschließen;

wobei Heterocyclus sich auf 3- bis 10-gliedrige Ringstrukturen bezieht, wobei deren Ringstrukturen ein bis vier Heteroatome einschließen.

In bestimmten Ausführungsformen steht R2 für =O, Zucker (z. B. Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid etc.), Carbamat (z. B. am Sauerstoff an das Steroid gebunden), Ester (z. B. am Sauerstoff an das Steroid gebunden), Carbonat oder Alkoxy. Substituenten wie Carbamat, Ester, Carbonat und Alkoxy können substituiert oder unsubstituiert sein, sie können z. B. funktionelle Gruppen wie Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroaralkyl, Amid, Acylamino, Carbonyl, Ester, Carbamat, Harnstoff, Keton, Sulfonamid etc. einschließen.

In bestimmten Ausführungsformen ist der außerhalb des Rings befindliche Substituent (z. B. R9) des tertiären Amins ein hydrophober Substitutent. In bestimmten Ausführungsformen schließt der außerhalb des Rings befindliche hydrophobe Substituent eine Aryl-, Heteroaryl-, Carbocyclyl-, Heterocyclyl- oder Polycyclylgruppe wie Biotin, einen zwitterionischen Borkomplex, einen steroidalen Polycyclus etc. ein. In bestimmten Ausführungsformen kann der hydrophobe Substituent im Wesentlichen aus einer Kombination aus Alkyl, Amido, Acylamino, Keton, Ester, Ether, Halogen, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Harnstoff oder ähnlichen funktionellen Gruppen bestehen, wobei zwischen 5 und 40 Nicht-Wasserstoffatome, stärker bevorzugt zwischen 5 und 20 Nicht-Wasserstoffatome eingeschlossen sind.

In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen gelten die vorstehend aufgeführten Definitionen, und die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch die allgemeine Formel IVa oder ungesättigte Formen davon dargestellt:

In bestimmten Ausführungsformen wird das Steroidalkaloid in der allgemeinen Formel (V) oder ungesättigten Formen davon dargestellt. wobei R2, R3, R4, R6 und R9 die für Formel IV vorstehend definierte Bedeutung aufweisen.

In bestimmten Ausführungsformen bedeutet R2 =O, Zucker (z. B. Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, etc.), Carbamat (z. B. am Sauerstoff an das Steroid gebunden), Ester (z. B. am Sauerstoff an das Steroid gebunden), Carbonat oder Alkoxy. Substituenten wie Carbamat, Ester, Carbonat und Alkoxy können substituiert oder unsubstituiert sein, können z. B. zusätzliche funktionelle Gruppen wie Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroaralkyl, Amid, Acylamino, Carbonyl, Ester, Carbamat, Harnstoff, Keton, Sulfonamid etc. einschließen.

In bestimmten Ausführungsformen ist der außerhalb des Rings befindliche Substituent des tertiären Amins (z. B. R9) ein hydrophober Substituent. In bestimmten Ausführungsformen schließt der hydrophobe, außerhalb des Rings befindliche Substituent einen Aryl-, Heteroaryl-, Carbocyclyl-, Heterocyclyl- oder Polycyclylrest wie Biotin, einen zwitterionischen Borkomplex, einen steroidalen Polycylus etc. ein. In bestimmten Ausführungsformen kann der hydrophobe Substituent im Wesentlichen aus einer Kombination aus Alkyl, Amido, Acylamino, Keton, Ester, Ether, Halogen, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Harnstoff oder ähnlichen funktionellen Gruppen bestehen, welche zwischen 5 und 40 Nicht-Wasserstoffatome, stärker bevorzugt zwischen 5 und 20 Nicht-Wasserstoffatome einschließen.

In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen werden gelten die vorstehenden Definitionen und die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch die allgemeine Formel Va oder ungesättigte Formen davon dargestellt:

In bestimmten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Antagonisten und Aktivatoren auf der Grundlage ihrer Selektivität für den smoothened-Signalweg ausgewählt werden. Diese Selektivität kann für den smoothened-Signalweg bestehen gegen andere Steroid-vermittelte Signalwege (wie Testosteron- oder Östrogen-vermittelte Aktivitäten), ebenso wie die Selektivität für bestimmte hedgehog/ptc/smoothened-Signalwege, z. B. welcher Isotyp für ptc (z. B. ptc-1, ptc-2) oder hedgehog (z. B. Shh, Ihh, Dhh etc.) spezifisch ist. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Verfahren Steroidalkaloide verwenden, welche die biologische Aktivität derartiger Steroide wie Aldosteron, Androstan, Androsten, Androstendion, Androsteron, Cholecalciferol, Cholestan, Cholinsäure, Corticosteron, Cortisol, Cortisolacetat, Cortison, Cortisonacetat, Desoxycorticosteron, Digitoxigenin, Ergocalciferol, Ergosterol, Östradiol-17-&agr;, Östradiol-17-&bgr;, Östriol, Östran, Östron, Hydrocortison, Lanosterol, Lithocholsäure, Mestranol, &bgr;-Methason, Prednison, Pregnan, Pregnolon, Progesteron, Spironolacton, Testosteron, Triamcinolon und ihre Derivate nicht wesentlich stören, zumindest insofern diese Aktivitäten mit der ptc-verbundenen Signalwirkung nicht in Zusammenhang stehen.

In einer Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Steriodalkaloid zur Verwendung in der vorliegenden Verfahren einen kd für die Mitglieder der Zellkern-Hormon-Rezeptor-Superfamilie von mehr als 1 &mgr;M und stärker bevorzugt mehr als 1 mM auf, z. B. bindet es nicht an Östrogen-, Testosteron-Rezeptoren oder dergleichen. Bevorzugt weist der erfindungsgemäße smoothened-Antagonist keine östrogene Wirkung in physiologischen Konzentrationen (z. B. im Bereich von 1 ng – 1 mg/kg) auf.

Auf diese Weise können bedauerliche Nebenwirkungen, die mit bestimmten Mitgliedern der Steroidalkaloid-Klasse in Zusammenhang stehen, verringert werden. Zum Beispiel stellt, unter Verwendung der hierin beschriebenen Screening-Tests, die Anwendung kombinatorischer und medizinisch-chemischer Verfahren bei den Steroidalkaloiden, Mittel zur Verringerung derartiger unerwünschter negativer Nebenwirkungen bereit, welche Persönlichkeitsveränderungen, verkürzte Lebenserwartung, kardiovaskuläre Erkrankungen und vaskuläre Okklusion, Organtoxizität, Hyperglykämie und Diabetes, Merkmale des Cushing-Syndroms, "Auszehrungs"-Syndrom, Steroidglaukom, Hypertension, peptische Ulceri und erhöhte Infektionsanfälligkeit einschließen. Für bestimmte Ausführungsformen wird es nützlich sein, die teratogene Aktivität bezogen auf Jervin zu verringern, wie zum Beispiel in der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, um die Spermatogenese selektiv zu hemmen.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Antagonisten andere Steroidalkaloide als Spirosolan, Tomatidin, Jervin etc.

In besonderen Ausführungsformen wird das Steroidalkaloid zur Verwendung ausgewählt, weil es stärker selektiv auf eine patched-Isoform, z. B. 10-fach, gegenüber der nächsten und stärker bevorzugt mindestens 100- oder sogar 1000-fach stärker selektiv auf einen patched -Signalweg (ptc-1, ptc-2) gegenüber einem anderen ist. Gleichermaßen kann das Steroidalkaloid zur Verwendung ausgewählt werden, weil es stärker selektiv auf eine smoothened-Isoform, z. B. 10-fach, gegenüber der nächsten und stärker bevorzugt mindestens 100- oder sogar 1000-fach stärker selektiv auf ein smoothened-Protein vom Wildtyp (sollten verschiedene Isoformen vorkommen) oder auf aktivierte smoothened-Mutanten ist bezogen auf smoothened vom Wildtyp. In bestimmten Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Verfahren zusätzlich mit der Verabreichung von Wachstums- und/oder trophischen Faktoren oder Zusammensetzungen durchgeführt werden, welche auch auf andere Teile des hedgehog/smoothened-Signalwegs wirken. Zum Beispiel wird in Betracht gezogen, dass erfindungsgemäße Verfahren eine Behandlung mit einem Mittel einschließen, welches cAMP-Spiegel moduliert, z. B. indem es die intrazellulären Spiegel von cAMP erhöht oder verringert.

In einer Ausführungsform verwendet das erfindungsgemäße Verfahren einen smoothened-Antagonisten und das zusätzliche Mittel erhöht die cAMP-Spiegel, um die Wirksamkeit des smoothened-Antagonisten zu verstärken.

Zum Beispiel schließen Verbindungen, welche die Adenylatcyclase aktivieren können, Forskolin (FK), Cholera-Toxin (CT), Pertussis-Toxin (PT), Prostaglandine (z. B. PGE-1 und PGE-2), Colforsin und &bgr;-adrenerge Rezeptor-Agonisten ein. &bgr;-adrenerge Rezeptor-Agonisten (hierin manchmal als "&bgr;-adrenerge Agonisten" bezeichnet) schließen Albuterol, Bambuterol, Bitolterol, Carbuterol, Clenbuterol, Clorprenalin, Denopamin, Dioxethedrin, Dopexamin, Ephedrin, Epinephrin, Etafedrin, Ethylnorepinephrin, Fenoterol, Formoterol, Hexoprenalin, Ibopamin, Isoetharin, Isoproterenol, Mabuterol, Metaproterenol, Methoxyphenamin, Norepinephrin, Oxyfedrin, Pirbuterol, Prenalterol, Procaterol, Propranolol, Protokylol, Quinterenol, Reproterol, Rimiterol, Ritodrin, Salmefamol, Soterenol, Salmeterol, Terbutalin, Tretoquinol, Tulobuterol und Xamoterol ein.

Die Verbindungen, welche eine cAMP-Phosphodiesterase hemmen können, schließen Amrinon, Milrinon, Xanthin, Methylxanthin, Anagrelid, Cilostamid, Medorinon, Indolidan, Rolipram, 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), Chelerythrin, Cilostazol, Glucocorticoide, Griseolsäure, Etazolat, Koffein, Indomethacin, Papverin, MDL 12330A, SQ 22536, GDPssS, Clonidin, Typ III und Typ IV Phosphodiesterase-Inhibitoren, Methylxanthine wie Pentoxifyllin, Theophyllin, Theobromin, Pyrrolidinone und Phenylcycloalkan- und -cycloalkenderivate (beschrieben in den PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 92/19594 und WO 92/10190), Lisophyllin und Fenoxamin ein.

Analoga von cAMP, welche in dem vorliegenden Verfahren nützlich sein können, schließen Dibutyryl-cAMP (db-cAMP), (8-(4)-Chlorphenylthio)-cAMP (cpt-cAMP), 8-[(4-Brom-2,3-dioxobutyl)thio]-cAMP, 2-[(4-Brom-2,3-dioxobutyl)thio]-cAMP, 8-Brom-cAMP, Dioctanoyl-cAMP, Sp-Adenosin-3':5'-cyclisches Phosphorothioat, 8-Piperidino-cAMP, N6-Phenyl-cAMP, 8-Methylamino-cAMP, 8-(6-Aminohexyl)amino-cAMP, 2'-Desoxy-cAMP, N6,2'-O-Dibutryl-cAMP, N6,2'-O-Disuccinyl-cAMP, N6-Monobutyryl-cAMP, 2'-O-Monobutyryl-cAMP, 2'-O-Monobutryl-8-Brom-cAMP, N6-Monobutryl-2'-desoxy-cAMP und 2'-O-Monosuccinyl-cAMP ein.

Verbindungen, welche die Spiegel oder die Aktivität von cAMP verringern können, schließen cyclisches Prostaglandylinositolphosphat (cyclisches PIP), Endotheline (ET)-1 und -3, Norepinepurin, K252a, Didesoxyadenosin, Dynorphine, Melatonin, Pertussis-Toxin, Staurosporin, Gi-Agonisten, MDL 12330A, SQ 22536, GDPssS und Clonidin, beta-Blocker und Liganden von G-Protein gekoppelten Rezeptoren ein. Zusätzliche Verbindungen sind in den U.S.-Patenten Nr. 5,891,875, 5,260,210 und 5,795,756 offenbart.

Die vorstehend aufgelisteten Verbindungen, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, können modifiziert werden, um die Bioverfügbarkeit, die Wirksamkeit oder eine andere pharmakologisch relevante Eigenschaft der Verbindung zu erhöhen. Zum Beispiel weist Forskolin die Formel: auf.

Modifikationen von Forskolin, von denen entdeckt wurde, dass sie den hydrophilen Charakter von Forskolin erhöhen, ohne die gewünschte biologische Aktivität ernsthaft abzuschwächen, schließen Acylierung der Hydroxyle an C6 und/oder C7 (nach Entfernen der Acetylgruppe) mit hydrophilen Acylgruppen ein. In Verbindungen, in denen C6 mit einer hydrophilen Acylgruppe acyliert ist, kann C7 gegebenenfalls deacyliert sein. Geeignete hydrophile Acylgruppen schließen Gruppen mit der Struktur -(CO)(CH2)nX ein, wobei X OH oder NR2 ist; R Wasserstoff, ein C1-C4-Alkylrest ist, oder zwei Rs zusammen genommen einen Ring bilden, umfassend 3 – 8 Atome, bevorzugt 5 – 7 Atome, welcher Heteroatome einschließen kann (z. B. Piperazin- oder Morpholinringe); und n eine ganze Zahl von 1 – 6, bevorzugt von 1 – 4 ist, noch stärker bevorzugt von 1 – 2. Andere geeignete hydrophile Acylgruppen schließen hydrophile Aminosäuren oder Derivate davon ein, wie Asparaginsäure, Glutamsäure, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin etc., einschließlich Aminosäuren mit einer heterocyclischen Seitenkette. Forskolin oder andere vorstehend aufgelistete Verbindungen, welche durch andere mögliche, dem Fachmann bekannte hydrophile Acylseitenketten modifiziert wurden, können leicht synthetisiert und in dem vorliegenden Verfahren auf Wirksamkeit getestet werden.

Gleichermaßen können Varianten oder Derivate von jeder der vorstehend aufgelisteten Verbindungen als cAMP-Antagonisten in dem erfindungsgemäßen Verfahren wirksam sein, z. B. um die cAMP-Spiegel zu verringern und die Aktivität eines smoothened-Aktivators zu ermöglichen. Ein Fachmann wird leicht dazu in der Lage sein, derartige Derivate zu synthetisieren und auf die entsprechende Wirksamkeit hin zu testen.

IV. Beispielhafte Anwendungen des Verfahrens und der Zusammensetzungen

Im nachstehenden Text soll jeder Bezug auf Stammellen als nicht humane Stammzellen verstanden werden und alle Bezüge auf Behandlungsverfahren sollen verstanden werden als Bezugnahme auf Herstellungsverfahren zur Herstellung von Medikamenten für medizinische Anwendungen.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Modulieren eines differenzierten Zustandes, des Überlebens und/oder der Proliferation einer Zelle, wie einer normalen Zelle oder einer Zelle mit einem ptc-Funktionsverlust, hedgehog-Funktionsgewinn oder smoothened Funktionsgewinn, durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einer Verbindung wie vorstehend ausgeführt gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und wie die Umstände es zulassen können.

Zum Beispiel wird durch die Erfindung in Betracht gezogen, dass im Licht der Entdeckung der offensichtlich breiten Beteiligung von hedgehog, ptc und smoothened bei der Bildung geordneter räumlicher Anordnungen von differenzierten Geweben in Vertebraten das erfindungsgemäße Verfahren als Teil eines Prozesses zur Erzeugung und/oder Bewahrung einer Anordnung von unterschiedlichem Vertebraten-Gewebe sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden könnte. Die Verbindung, ob sie nun induktiv oder anti-induktiv hinsichtlich der Proliferation oder Differenzierung eines gegebenen Gewebes ist, kann, soweit erforderlich, jede der vorstehend beschriebenen Zubereitungen sein.

Zum Beispiel ist das vorliegende Verfahren der Verwendung erfindungsgemäßer Verbindungen in Zellkultur-Techniken anwendbar, in denen es erwünscht ist, die Proliferation oder Differenzierung der Zelle zu steuern. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann in einem Verfahren verwendet werden, das sich gegen Zellen richtet, welche einen ptc-Funktionsverlust-, einen hedgehog-Funktionsgewinn- oder smoothened-Funktionsgewinn-Phänotypus aufweisen. In vitro Nervenzellen-Kultursysteme haben sich als grundlegende und unabdingbare Werkzeuge zur Erforschung der Neuralentwicklung erwiesen, ebenso zur Identifizierung von neurotrophen Faktoren wie dem Nervenwachstumsfaktor (NGF), ziliaren trophischen Faktoren (CNTF) und vom Hirn abgeleiteten neurotrophischem Faktor (BDNF). Eine Anwendung des vorliegenden Verfahrens kann in Kulturen von neuronalen Stammzellen liegen, wie in der Verwendung derartiger Kulturen zur Erzeugung von neuen Neuronen und Glia. In derartigen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können die kultivierten Zellen mit einer Verbindung der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht werden, um die Proliferationsrate der neuronalen Stammzellen in der Kultur zu verändern und/oder die Differenzierungsrate zu verändern oder die Integrität einer Kultur bestimmter terminal differenzierter neuronaler Zellen zu bewahren. In einer beispielhaften Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um zum Beispiel sensorische Neuronen oder in einer anderen Ausführungsform Motoneuronen zu kultivieren. Derartige neuronale Kulturen können als praktische Testsysteme verwendet werden, ebenso als Quellen für implantierbare Zellen zu therapeutischen Behandlungen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können große Mengen von nicht tumorbildenden neuralen Progenitorzellen in vitro perpetuiert werden und ihre Proliferationsrate und/oder Differenzierung kann durch Kontakt mit Verbindungen der vorliegenden Erfindung beeinflusst werden. Im Allgemeinen wird ein Verfahren bereit gestellt umfassend die Schritte des Isolierens von neuralen Progenitorzellen aus einem Lebewesen, des Perpetuierens dieser Zellen in vitro oder in vivo, bevorzugt in Gegenwart von Wachstumsfaktoren, und Regulieren der Differenzierung dieser Zellen in bestimmte neurale Phänotypen, z. B. Neuronen und Glia, durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung.

Man glaubt, dass Progenitorzellen unter einem tonischen Hemmeinfluss stehen, der die Progenitoren in einem unterdrückten Zustand hält, bis ihre Differenzierung erforderlich ist. Jedoch sind neueste Techniken bereitgestellt worden, welche es diesen Zellen gestatten, proliferiert zu werden, und im Unterschied zu Neuronen, welche terminal differenziert sind und sich deshalb nicht teilen, können sie in unbegrenzter Anzahl produziert werden und sind hochgradig zur Transplantation in heterologe und autologe Wirte mit neurodegenerativen Erkrankungen geeignet.

Mit "Progenitor" ist eine oligopotente oder multipotente Stammzelle gemeint, welche fähig ist, sich unbegrenzt zu teilen, und die unter spezifischen Bedingungen Tochterzellen produzieren kann, welche terminal differenzieren, wie in Neuronen und Glia. Diese Zellen können zur Transplantation in einen heterologen oder autologen Wirt verwendet werden. Mit heterolog ist gemeint, dass der Wirt ein anderes Lebewesen ist als das, von dem die Progenitorzellen ursprünglich abgeleitet wurden. Mit autolog ist der identische Wirt gemeint, von dem die Zellen ursprünglich abgeleitet wurden.

Zellen können aus embryonalem, post-natalem, juvenilem oder adultem Neuralgewebe von jedem Lebewesen erhalten werden. Mit jedem Lebewesen ist jedes vielzellige Lebewesen gemeint, das Nervengewebe enthält. Stärker spezifisch ist jeder Fisch, jedes Reptil, jeder Vogel, jede Amphibie oder jeder nicht humane Säuger und dergleichen gemeint. Die am meisten bevorzugten Spender sind nicht humane Säuger, insbesondere Mäuse.

Im Fall eines heterologen, nicht humanen Spender-Lebewesens kann das Lebewesen euthanasiert werden und das Hirn und spezielle Bereiche, welche von Interesse sind, können unter Verwendung eines sterilen Verfahrens entfernt werden. Bereiche des Hirns von besonderem Interesse schließen jeden Bereich ein, aus dem Progenitorzellen erhalten werden können, die dazu dienen werden, eine Funktion für einen degenerierten Bereich des Wirtshirns wiederherzustellen. Diese Regionen schließen Bereiche des zentralen Nervensystems (ZNS) einschließlich des zerebralen Cortex, des Cerebellums, des Mittelhirns, des Hirnstamms, des Rückenmarks und des ventrikulären Gewebes und Bereiche des peripheren Nervensystems (PNS) einschließlich der Karotisdrüse und des Nebennierenmarks ein.

Insbesondere schließen diese Bereiche Regionen im Basalganglion, bevorzugt dem Striatum, welches aus Caudatum und Putamen besteht, oder verschiedene Zellgruppen ein wie Globus Pallidus, Nucleus subthalamicus, den Nucleus basalis, von dem entdeckt wurde, dass er in Patienten mit Alzheimer-Krankheit degeneriert ist, oder die Substantia nigra pars compacta, von der entdeckt wurde, dass sie in Patienten mit Parkinson-Krankheit degeneriert ist.

Humane heterologe neurale Progenitorzellen können aus fötalem Gewebe abgeleitet werden, welches aus einem elektiven Abort oder aus einem post-natalen, juvenilen oder adulten Organspender erhalten wurde. Autologes Nervengewebe kann durch Biopsie erhalten werden, oder von Patienten, welche sich einem neurochirurgischen Eingriff unterziehen, in welchem Nervengewebe entfernt wird, insbesondere während eines chirurgischen Epilepsie-Eingriffs und stärker bevorzugt während temporärer Lobektomien und Hippocampektomien.

Zellen können aus Spendergewebe durch Dissoziation von einzelnen Zellen aus der verbindenden extrazellulären Gewebematrix erhalten werden. Die Dissoziation kann erreicht werden unter Verwendung eines jeden bekannten Verfahrens, einschließlich Behandlung mit Enzymen wie Trypsin, Kollagenase und dergleichen oder durch Verwendung von physikalischen Dissoziations-Verfahren wie mit einem stumpfen Instrument oder durch Zerhacken mit einem Skalpell, um das Herauswachsen von spezifischen Zelltypen aus einem Gewebe zu gestatten. Die Dissoziation von fötalen Zellen kann in Gewebekulturmedium durchgeführt werden, während ein bevorzugtes Dissoziationsmedium von juvenilen und adulten Zellen künstliche Hirn-Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) ist. Reguläre aCFS enthält 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 und 10 mM D-Glucose. aCFS mit wenig Ca2+ enthält die gleichen Bestandteile, mit der Ausnahme von MgCl2 in einer Konzentration von 3,2 mM und CaCl2 in einer Konzentration von 0,1 mM.

Dissoziierte Zellen können in jedes bekannte Kulturmedium gebracht werden, das fähig ist, das Zellwachstum zu unterstützen, einschließlich MEM, DMEM, RPMI, F-12 und dergleichen, welche Supplemente enthalten, die für den Zellmetabolismus erforderlich sind, wie Glutamin und andere Aminosäuren, Vitamine, Mineralien und nützliche Proteine wie Transferrin und dergleichen. Das Medium kann auch Antibiotika enthalten wie Penicillin, Streptomycin, Gentamicin und dergleichen, um der Kontamination mit Hefe, Bakterien und Pilzen vorzubeugen. In einigen Fällen kann das Medium Serum enthalten, das von Rind, Schwein, Huhn und dergleichen abgeleitet ist. Ein besonders bevorzugtes Zellmedium ist ein Gemisch aus DMEM und F-12.

Die Bedingungen zum Kultivieren sollten nahe an physiologischen Bedingungen liegen. Der pH-Wert der Zellkulturmedien sollte nahe am physiologischen pH-Wert liegen, bevorzugt zwischen pH 6 – 8, stärker bevorzugt nahe an pH 7, noch stärker bevorzugt bei etwa pH 7,4. Die Zellen sollten bei einer Temperatur nahe der physiologischen Temperatur, bevorzugt zwischen 30 °C – 40 °C, stärker bevorzugt zwischen 32 °C – 38 °C und am meisten bevorzugt zwischen 35 °C – 37 °C kultiviert werden.

Man kann die Zellen in Suspension oder auf einem fixierten Substrat wachsen lassen, jedoch wird die Proliferation der Progenitoren bevorzugt in Suspension durchgeführt, um eine große Anzahl von Zellen zu erzeugen durch die Bildung von "Neurosphären" (siehe zum Beispiel Reynolds et al. (1992) Science 255: 1070 – 1709; und die PCT-Veröffentlichungen WO 93/01275, WO 94/09119, WO 94/10292 und WO 94/16718). Im Falle des Vermehrens (oder des Spaltens) der Suspensionszellen werden die Kolben gut geschüttelt und man lässt Neurosphären sich an der Ecke des Kolbenbodens absetzen. Die Sphären werden dann in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei geringer Geschwindigkeit zentrifugiert. Das Medium wird abgesaugt, die Zellen werden in einer kleinen Menge Medium mit Wachstumsfaktor resuspendiert und die Zellen mechanisch dissoziiert und in getrennten Aliquots aus Medium resuspendiert.

Die Zellsuspensionen im Kulturmedium werden mit einem Wachstumsfaktor supplementiert, welcher die Proliferation von Progenitorzellen ermöglicht, und in einen Aufnahmebehälter, der fähig ist, Zellen zu erhalten, gesät, obgleich, wie vorstehend ausgeführt, bevorzugt in Kulturkolben oder Rollflaschen. Die Zellen proliferieren typischerweise innerhalb von 3 – 4 Tagen in einem 37 °C-Inkubator und die Proliferation kann nach der Dissoziation der Zellen und Resuspension in frischem Medium, das Wachstumsfaktoren enthält, jederzeit neu angeregt werden.

In Abwesenheit von Substrat heben die Zellen vom Boden des Kolbens ab und fahren fort, in der Suspension zu proliferieren, wobei sie eine hohle Sphäre aus undifferenzierten Zellen bilden. Nach etwa 3 – 10 Tagen in vitro werden die proliferierenden Cluster (Neurosphären) alle 2 – 7 Tage und stärker spezifisch alle 2 – 4 Tage durch leichte Zentrifugation und Resuspension in einem Wachstumsfaktor enthaltendem Medium ernährt.

Nach 6 – 7 Tagen in vitro können einzelne Zellen in den Neurosphären durch physische Dissoziation der Neurosphären mit einem stumpfen Instrument getrennt werden, stärker spezifisch durch Verreiben der Neurosphären mit einer Pipette. Einzelne Zellen aus den dissoziierten Neurosphären werden in Kulturmedium, welches Wachstumsfaktoren enthält, suspendiert, und die Differenzierung der Zellen kann in Kultur kontrolliert werden, indem die Zellen in Gegenwart einer erfindungsgemäßen Verbindung ausplattiert (oder resuspendiert) werden.

Um andere Anwendungen der erfindungsgemäßen Verbindungen weiter zu veranschaulichen, sollte beachtet werden, dass intracerebrale Gewebeverpflanzung als eine zusätzliche Herangehensweise zu Therapien des zentralen Nervensystems aufgekommen ist. Zum Beispiel schließt eine Herangehensweise zum Reparieren von geschädigten Hirngeweben die Transplantation von Zellen aus fötalen oder neonatalen Lebewesen in das adulte Hirn ein (Dunnett et al. (1987) J. Exp. Biol. 123: 265 – 289; und Freund et al. (1985) J. Neurosci. 5: 603 – 616). Fötale Neuronen aus einer Vielzahl von Hirnregionen können in das adulte Hirn erfolgreich inkorporiert werden, und derartige Gewebeverpflanzungen können Verhaltensdefekte lindern. Zum Beispiel kann eine Bewegungsstörung, ausgelöst durch Läsionen der dopaminergen Projektionen zu den Basalganglia durch Gewebeverpflanzungen von embryonalen dopaminergen Neuronen unterbunden werden. Komplexe kognitive Funktionen, welche sich nach Läsionen des Neocortex verschlechterten, können ebenfalls teilweise durch Gewebeverpflanzungen von embryonalen kortikalen Zellen wiederhergestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um den Wachstumszustand in der Kultur zu regulieren oder es kann, wo nicht humanes fötales Gewebe verwendet wird, insbesondere nicht humane neuronale Stammzellen, verwendet werden, um die Differenzierungsrate der Stammzellen zu regulieren.

Nicht humane Stammzellen, die gemäß den vorstehenden Verfahren nützlich sind, sind im Allgemeinen bekannt. Zum Beispiel sind verschiedene Neuralleistenzellen identifiziert worden, von denen einige multipotent sind und wahrscheinlich nicht festgelegte Neuralleistenzellen darstellen, und andere, von denen nur ein Zelltyp wie sensorische Neuronen erzeugt werden kann und die wahrscheinlich festgelegte Progenitorzellen darstellen. Die Rolle der Verbindungen, welche in dem vorliegenden Verfahren zum Kultivieren von derartigen Stammzellen verwendet werden, kann sein, die Differenzierung des nicht festgelegten Progenitors zu regulieren oder die weitere Beschränkung des Entwicklungsschicksals einer festgelegten Progenitorzelle in Richtung auf das Entstehen einer terminal differenzierten Nervenzelle zu regulieren. Zum Beispiel kann das vorliegende Verfahren in vitro verwendet werden, um die Differenzierung von Neuralleistenzellen in Gliazellen, Schwann-Zellen, chromaffine Zellen, cholinerge sympathische oder parasympathische Neuronen, ebenso wie peptiderge und serotonerge Neuronen zu regulieren. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein verwendet werden oder können in Kombination mit anderen neurotrophen Faktoren verwendet werden, welche dahin wirken, ein besonderes Differenzierungsschicksal der neuronalen Progenitorzelle stärker spezifisch zu fördern.

Zusätzlich zur Implantation von Zellen, welche in Gegenwart der erfindungsgemäßen Verbindungen kultiviert wurden, betrifft noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die therapeutische Anwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung, um den Wachstumsstatus der Neuronen und anderer Nervenzellen sowohl im zentralen Nervensystem als auch im peripheren Nervensystem zu regulieren. Die Fähigkeit von ptc, hedgehog und smoothened, die neuronale Differenzierung während der Entwicklung des Nervensystems und vermutlich auch im adulten Status zu regulieren, weist darauf hin, dass unter bestimmten Umständen von den erfindungsgemäßen Verbindungen erwartet werden kann, dass sie die Steuerung von adulten Neuronen hinsichtlich der Instandhaltung, der funktionalen Leistung und des Alterns von normalen Zellen; die Reparatur- und Regenerationsprozesse in chemisch oder mechanisch geschädigten Zellen; und die Behandlung von Degeneration in bestimmten pathologischen Zuständen ermöglichen. Angesichts dieses Verständnisses zieht die vorliegende Erfindung die Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens in Betracht speziell für ein Behandlungsprotokoll (Vorbeugung und/oder Verringerung der Schwere von) von neurologischen Zuständen, abgeleitet von: (i) akuter, subakuter oder chronischer Verletzung des Nervensystems, einschließlich traumatische Verletzung, chemische Verletzung, vaskuläre Verletzung und Defizite (wie Ischämie, welche von einem Schlaganfall herrührt), zusammen mit infektiöser/entzündlicher und tumorinduzierter Verletzung; (ii) Altern des Nervensystems einschließlich Alzheimer Krankheit; (iii) chronische neurodegenerative Erkrankungen des Nervensytems, einschließlich Parkinson-Krankheit, Huntington-Chorea, amyotrophe Lateralsklerose, diabetische Neuropathie und dergleichen, ebenso wie spinocerebelläre Degererationen; und (iv) chronische immunologische Erkrankungen des Nervensystems oder das Nervensystem betreffende einschließlich Multipler Sklerose.

Entsprechend kann das erfindungsgemäße Verfahren auch verwendet werden beim Erzeugen von Nervenprothesen zur Reparatur eines zentralen und peripheren Nervenschadens. Insbesondere können, wo ein gequetschtes oder durchtrenntes Axon durch Verwendung einer prothetischen Vorrichtung intubuliert wird, die erfindungsgemäßen Verbindungen der prothetischen Vorrichtung zugegeben werden, um die Wachstumsrate und die Regeneration der dendritischen Prozesse zu regulieren. Beispielhafte Nervenleitkanäle sind in den U.S.-Patenten 5,092,871 und 4,955,892 beschrieben.

In einer anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren in der Behandlung von neoplastischen oder hyperplastischen Transformationen, welche im zentralen Nervensystem vorkommen können, verwendet werden. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, um zu verursachen, dass derartige transformierte Zellen entweder postmitotisch oder apoptotisch werden. Das vorliegende Verfahren kann deshalb als Teil einer Behandlung von z. B. malignen Gliomen, Meningiomen, Medulloblastomen, neuroektodermalen Tumoren und Ependymomen verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren als Teil eines Behandlungregimes für das maligne Medulloblastom und andere, primäre maligne neuroektodermale ZNS-Tumore verwendet werden.

In bestimmten Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße Verfahren als Teil eines Behandlungsprogramms für das Medulloblastom verwendet. Das Medulloblastom, ein primärer Hirntumor, ist der häufigste Hirntumor bei Kindern. Ein Medulloblastom ist ein primitiver neuroektodermaler Tumor, der in der posterioren Fossa entsteht. Sie machen etwa 25 % aller pädiatrischen Hirntumore (Miller) aus. Histologisch sind sie kleine, rundzellige Tumore, die üblicherweise in echten Rosetten angeordnet sind, sie können jedoch eine gewisse Differenzierung zu Astrozyten, Ependymalzellen oder Neuronen zeigen (Rorke, Kleihues). PNETs können in anderen Bereichen des Gehirns entstehen einschließlich der Zirbeldrüse (Pineoblastom) und des Cerebrum. Patienten mit Tumoren, welche in der supratentorialen Region entstehen, ergeht es im Allgemeinen schlechter als ihren PF-Kollegen.

Medulloblastome/PNETs sind bekannt dafür, dass sie irgendwo im ZNS nach der Resektion wieder auftreten und sogar in den Knochen metastasieren können. Eine Vorbehandlungsdiagnose sollte deshalb eine Untersuchung des Rückenmarks einschließen, um die Möglichkeit von "abgesiedelten" Metastasen auszuschließen. Gadolinium-verstärkte MRI hat die Myelographie für diesen Zweck weitgehend ersetzt und CSF-Zytologie wird postoperativ als Routineverfahren erhalten.

In anderen Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße Verfahren als Teil des Behandlungsprogramms für Ependymome verwendet. Ependymome machen etwa 10 % der pädiatrischen Hirntumore bei Kindern aus. Kurz gesagt, es sind Tumore, welche aus der Ependymalauskleidungsschicht der Ventrikel entstehen und mikroskopisch Rosetten, Kanäle und perivaskuläre Rosetten bilden. In den CHOP-Reihen wurde von 51 Kindern mit Ependymomen berichtet, wobei 3/4 histologisch benign waren. Annähernd 2/3 entstanden aus der Region des 4. Ventrikels. Ein Drittel war in der supratentorialen Region vorhanden. Die Alters- und Auftrittspeaks lagen zwischen Geburt und 4 Jahren, wie durch SEER-Daten gezeigt wurde, ebenso wie von CHOP-Daten. Das mittlere Alter beträgt etwa 5 Jahre. Weil so viele Kinder mit dieser Erkrankung Babies sind, erfordern sie häufig eine multimodale Therapie.

Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Beobachtung auf dem Fachgebiet, dass ptc, hedgehog und/oder smoothened an morphogenetischen Signalen beteiligt sind, welche an anderen organogenetischen Vertebraten-Signalwegen beteiligt sind, zusätzlich zur neuronalen Differenzierung wie vorstehend beschrieben, wobei sie offensichtliche Funktionen in einer anderen entodermalen Musterbildung aufweisen, ebenso wie im mesodermalen als auch im entodermalen Differenzierungsprozess. Deshalb wird durch die Erfindung in Betracht gezogen, dass Zusammensetzungen, welche eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen aufweisen, auch verwendet werden können sowohl für Zellkultur- als auch therapeutische Verfahren, welche die Erzeugung und Bewahrung von nicht-neuronalem Gewebe umfassen.

In einer Ausführungsform macht die vorliegende Erfindung Gebrauch von der Entdeckung, dass ptc, hedgehog und smoothened offensichtlich an der Steuerung der Entwicklung der nicht humanen Stammzellen beteiligt sind, welche für die Bildung des Verdauungstraktes, der Leber, der Lungen und anderer Organe verantwortlich sind, die sich aus dem primitiven Darm entwickeln. Shh dient als ein induktives Signal aus dem Endoderm zum Mesoderm, welches für die Darm-Morphogenese entscheidend ist. Deshalb können zum Beispiel Verbindungen des gegenwärtigen Verfahrens zum Regulieren der Entwicklung und Bewahrung einer künstlichen Leber, welche die multiplen metabolischen Funktionen einer normalen Leber aufweisen kann, verwendet werden. In einer beispielhaften Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um die Proliferation und Differenzierung von nicht humanen Verdauungstrakt-Stammzellen zu regulieren, um Hepatozyten-Kulturen zu bilden, welche verwendet werden können, um extrazelluläre Matrizen zu besiedeln oder welche in biokompatible Polymere eingekapselt werden können, um sowohl implantierbare als auch extrakorporale künstliche Lebern zu bilden.

In einer anderen Ausführungsform können die therapeutischen Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen Verbindungen in Verbindung mit der Transplantation derartiger künstlicher Lebern, ebenso wie mit nicht humanen embryonischen Leberstrukturen verwendet werden, um die Inkorporation der intraperitonealen Implantation, Vaskularisation und in vivo Differenzierung und Bewahrung des transplantierten Lebergewebes zu regulieren.

In noch einer anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren therapeutisch verwendet werden, um derartige Organe nach einem physischen, chemischen oder pathologischen Insult zu regulieren. Zum Beispiel können therapeutische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, bei der Rekonstruktion der Leber nach einer partiellen Hepatektomie verwendet werden.

Die Erzeugung von Pankreas und Dünndarm aus dem embryonalen Darm hängt von der intrazellulären Signalwirkung zwischen den endodermalen und mesodermalen Zellen des Darms ab. Insbesondere wird angenommen, dass die Differenzierung des intestinalen Mesoderms in glatte Muskulatur von Signalen aus den benachbarten endodermalen Zellen abhängt. Ein Kandidaten-Mediator von endodermal abgeleiteten Signalen im embryonalen Enddarm ist Sonic hedgehog. Siehe zum Beispiel Apelqvist et al. (1997) Curr. Biol. 7: 801 – 4. Das Shh-Gen wird im gesamten embryonalen Darm-Endoderm exprimiert mit der Ausnahme des Pankreas-Knospen-Endoderms, welches stattdessen hohe Spiegel des Homöodomäne-Proteins Ipf1/Pdx1 (Insulin Promoter Faktor 1/pankreatische und duodenale Homöobox 1) exprimiert, einen wesentlichen Regulator der frühen Pankreas-Entwicklung. Apelqvist et al., supra, haben untersucht, ob die unterschiedliche Expression von Shh im embryonalen Darmrohr die Differenzierung des umgebenden Mesoderms in spezialisierte Mesodermderivate von Dünndarm und Pankreas steuert. Um dies zu testen, verwendeten sie den Promoter des Ipf1/Pdx1-Gens, um Shh selektiv in dem sich entwickelnden pankreatischen Epithelium zu exprimieren. In Ipf1/Pdx1-Shh transgenen Mäusen entwickelte sich das pankreatische Mesoderm in glatte Muskulatur und interstitielle Cajal-Zellen, welche für das Intestinum charakteristisch sind, eher als in pankreatisches Mesenchym und Milz. Auch unterliefen pankreatische Explantate, welche Shh ausgesetzt wurden, ein ähnliches Programm der Intestinaldifferenzierung. Diese Ergebnisse stellen den Beweis dafür bereit, dass die unterschiedliche Expression von entodermal abgeleitetem Shh das Schicksal des benachbarten Mesoderms in verschiedenen Regionen des Darmrohrs steuert.

Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird deshalb in Betracht gezogen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können, um die Proliferation und/oder Differenzierung von Pankreasgewebe sowohl in vivo als auch in vitro zu steuern oder zu regulieren.

Es gibt eine breite Vielzahl von pathologischen zellproliferativen und -differenzierenden Zuständen, für welche die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung therapeutischen Nutzen bereitstellen können, wobei die allgemeine Strategie zum Beispiel in der Korrektur aberranter Insulinexpression oder Modulation der Differenzierung besteht. Allgemeiner jedoch betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Induzieren und/oder Aufrechterhalten eines differenzierten Zustands, wobei das Überleben und/oder das Beeinflussen der Proliferation von Pankreaszellen durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit den erfindungsgemäßen Inhibitoren gefördert wird. Zum Beispiel wird durch die Erfindung in Betracht gezogen, dass, angesichts der offensichtlichen Beteiligung von ptc, hedgehog und smoothened bei der Bildung von geordneten Raumanordnungen pankreatischer Gewebe, das erfindungsgemäße Verfahren als Teil einer Technik verwendet werden könnte, um derartige Gewebe in vitro und in vivo zu erzeugen und/oder zu bewahren. Zum Beispiel kann die Modulation der Funktion von Hedgehog sowohl in Zellkultur- als auch in therapeutischen Verfahren, welche die Erzeugung und Bewahrung von &bgr;-Zellen einschließen, und möglicherweise auch für nicht pankreatisches Gewebe verwendet werden, wie beim Steuern der Entwicklung und der Bewahrung von Gewebe aus dem Verdauungstrakt, der Milz, den Lungen, den urogenitalen Organen (z. B. Blase) und anderen Organen, welche sich vom primitiven Darm ableiten.

In einer beispielhaften Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren in der Behandlung von hyperplastischen und neoplastischen Störungen verwendet werden, welche das Pankreas-Gewebe beeinflussen, insbesondere solche, die durch aberrante Proliferation von Pankreaszellen gekennzeichnet sind. Zum Beispiel sind Pankreas-Karzinome durch anormale Proliferation von Pankreaszellen gekennzeichnet, was zu Veränderungen der Insulinsekretionskapazität des Pankreas führen kann. Zum Beispiel können bestimmte pankreatische Hyperplasien wie Pankreaskarzinome zu Hypoinsulinämie aufgrund von Dysfunktion der &bgr;-Zellen oder verringerter Inselzellmasse führen. In dem Ausmaß, wie die aberrante ptc-, hedgehog- und smoothened Signalwirkung im Fortschreiten der Erkrankung angezeigt werden kann, können die erfindungsgemäßen Regulatoren verwendet werden, um die Regeneration des Gewebes nach der Anti-Tumor-Therapie zu fördern.

Darüber hinaus kann die Manipulation der hedgehog-Signalwirkungs-Eigenschaften an verschiedenen Punkten nützlich sein als Teil einer Strategie zum Umformen/Regenerieren von Pankreasgewebe sowohl in vivo als auch in vitro. In einer Ausführungsform macht die vorliegende Erfindung Gebrauch von der offensichtlichen Beteiligung von ptc, hedgehog und smoothened an der Regulation der Entwicklung von Pankreasgewebe. Im Allgemeinen kann das erfindungsgemäße Verfahren therapeutisch verwendet werden, um das Pankreas nach einem physischen, chemischen oder pathologischen Insult zu regulieren. In noch einer anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren in Zellkulturtechniken angewendet werden und insbesondere kann es verwendet werden, um die anfängliche Erzeugung von prothetischen Pankreasgewebevorrichtungen zu fördern. Die Manipulation der Proliferation und Differenzierung von Pankreasgewebe kann zum Beispiel durch Verändern der hedgehog-Aktivität ein Mittel bereitstellen, um die Merkmale eines kultivierten Gewebes sorgfältiger zu steuern. In einer beispielhaften Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um die Produktion von prothetischen Vorrichtungen, welche &bgr;-Inselzellen erfordern, zu steigern, wie sie in den Vorrichtungen zur Einkapselung verwendet werden, welche zum Beispiel in dem Aebischer et al. U.S.-Patent Nr. 4,892,538, dem Aebischer et al. U.S.-Patent Nr. 5,106,627, dem Lim U.S.-Patent Nr. 4,391,909 und dem Sefton U.S.-Patent Nr. 4,353,888 beschrieben sind. Die frühen Progenitorzellen der pankreatischen Inselzellen sind multipotent und offensichtlich coaktivieren sie alle inselzellspezifischen Gene vom Zeitpunkt ihres ersten Erscheinens. Während die Entwicklung voranschreitet, wird die Expression der inselzellspezifischen Hormone, wie Insulin, auf das Expressionsmuster, das für reife Inselzellen charakteristisch ist, beschränkt. Der Phänotypus der reifen Inselzellen ist jedoch in der Kultur nicht stabil, da das Wiedererscheinen embryonaler Merkmale in reifen &bgr;-Zellen beobachtet werden kann. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann der Differenzierungsweg oder der proliferative Index der Zellen reguliert werden.

Darüber hinaus kann die Manipulation des Differenzierungszustandes von Pankreasgewebe in Verbindung mit der Transplantation eines künstlichen Pankreas verwendet werden, um die Implantation, Vaskularisation und in-vivo-Differenzierung und Bewahrung des transplantierten Gewebes zu fördern. Zum Beispiel kann die Manipulation der hedgehog-Funktion, um die Gewebedifferenzierung zu beeinflussen, als ein Mittel zum Bewahren der Lebensfähigkeit des Transplantats verwendet werden.

Bellusci et al. (1997) Development 124: 53 berichten, dass Sonic hedgehog die lungenmesenchymale Zellproliferation in vivo reguliert. Dementsprechend kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um die Regeneration von Lungengewebe, z. B. in der Behandlung eines Emphysems, zu regulieren.

Fujita et al. (1997), Biochem. Biophys. Res. Commun. 238: 658 berichtete, das Sonic hedgehog in Zellen des humanen Lungen-Plattenepithelkarzinoms und in Adenokarzinomzellen exprimiert wird. Die Expression von Sonic hedgehog wurde auch in Geweben des humanen Lungen-Plattenepithelkarzinoms beobachtet, jedoch nicht in normalem Lungengewebe des gleichen Patienten. Sie beobachteten auch, dass Sonic hedgehog die Inkorporation von BrdU in die Karzinomzellen stimuliert und ihr Zellwachstum stimuliert, während Anti-Shh-N ihr Zellwachstum hemmte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ptc, hedgehog und/oder smoothened am Zellwachstum von derart transformiertem Lungengewebe beteiligt ist und dies weist darauf hin, dass das erfindungsgemäße Verfahren als Teil einer Behandlung des Lungenkarzinoms und von Adenokarzinomen und anderer proliferativen Störungen, welche das Lungenepithel betreffen, verwendet werden kann.

Viele andere Tumore können, basierend auf Hinweisen wie der Beteiligung des hedgehog-Signalwegs in diesen Tumoren oder der nachgewiesenen Expression von hedgehog oder seines Rezeptors in diesen Geweben während der Entwicklung, durch Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen beeinflusst werden. Derartige Tumore schließen Tumore, welche mit dem Gorlin-Syndrom (z. B. Basalzellenkarzinom, Medulloblastom, Meningiom etc.) in Zusammenhang stehen, Tumore, welche in pct-Knockout-Mäusen nachgewiesen wurden (z. B. Hämangiom, Rhabdomyosarkom etc.), Tumore, welche aus gli-I-Amplifikation herrühren (z. B. Glioblastom, Sarkom etc.), Tumore, die mit TRC8, einem ptc-Homolog (z. B. Nierenkarzinom, Schilddrüsenkarzinom etc.) verbunden sind, Ext-1-bezogene Tumore (z. B. Knochenkrebs etc.), Shh-induzierte Tumore (z. B. Lungenkrebs, Chondrosarkome etc.) und andere Tumore ein (z. B. Brustkrebs, urogenitaler Krebs (z. B. Niere, Blase, Harnleiter, Prostata etc.), Nebennierenkrebs, gastrointestinaler Krebs (z. B. Magen, Darm etc.) etc.) ein, sind jedoch in keiner Weise darauf beschränkt.

In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Zusammensetzungen, umfassend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen, in der in-vitro-Erzeugung von Skelettgewebe verwendet werden, wie aus nicht humanen skeletogenen Stammzellen, ebenso wie in der in-vivo-Behandlung von Skelettgewebedefekten. Die vorliegende Erfindung zieht insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zum Regulieren der Chondrogeneserate und/oder der Osteogeneserate in Betracht. Mit "Sklelettgewebedefekt" ist ein Defekt im Knochengewebe oder anderem Skelett-Bindegewebe an jedem Ort gemeint, wo es erwünscht ist, den Knochen oder das Bindegewebe wieder herzustellen, ungeachtet des Ursprungs des Defekts, z. B. ob er das Ergebnis einer chirurgischen Intervention, der Entfernung eines Tumors, von Ulzeration, eines Implantats, eines Bruchs oder anderer traumatischer oder degenerativer Zustände ist.

Zum Beispiel kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung als Teil eines Therapieplans zur Wiederherstellung der Knorpelfunktion für ein Bindegewebe verwendet werden. Derartige Verfahren sind nützlich zum Beispiel bei der Reparatur von Defekten oder Läsionen im Bindegewebe, welche von degenerativer Abnutzung herrühren wie derjenigen, welche zu Arthritis führt, ebenso wie von anderen mechanischen Störungen, welche durch ein Trauma des Gewebes wie Fehllagerung von zerrissenem Meniskusgewebe, eine Menisektomie, eine Luxation eines Gelenks durch eine abgerissene Sehne, eine Knochenfehlstellung, einen Knochenbruch oder eine Erbkrankheit verursacht werden. Das vorliegende Reparaturverfahren ist auch für die Remodellierung der Knorpelmatrix nützlich, wie in der plastischen oder rekonstruktiven Chirurgie, ebenso wie in der Periodontalchirurgie. Das vorliegende Verfahren kann auch angewendet werden, um ein früheres Reparaturverfahren zu verbessern, zum Beispiel nach der chirurgischen Reparatur eines Meniskus, eines Bandes oder eines Knorpels. Darüber hinaus kann es dem Einsetzen oder der Verschlimmerung einer degenerativen Erkrankung vorbeugen, wenn es nach dem Trauma früh genug angewendet wird.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Behandlung des belasteten Bindegewebes mit einer therapeutisch ausreichenden Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung, um eine Knorpel-Reparatur-Reaktion in dem Bindegewebe zu regulieren, indem die Differenzierungs- und/oder Proliferationsrate der in das Gewebe eingebetteten Chondrocyten bewerkstelligt wird. Derartige Bindegewebe wie Gelenkknorpel, interartikuläre Knorpel (Menisci), Rippenknorpel (verbinden die echten Rippen mit dem Sternum), Bänder und Sehnen sind für die Behandlung in rekonstruktiven und/oder regenerativen Therapien unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders empfänglich. Wie hierin verwendet schließen die regenerativen Therapien die Behandlung von degenerativen Zuständen ein, welche bis zu dem Punkt fortgeschritten sind, an dem die Beeinträchtigung des Gewebes offensichtlich manifest geworden ist, ebenso wie die vorbeugenden Behandlungen von Gewebe, wo die Degeneration in ihren frühesten Stadien oder bevorstehend ist.

In einer anschaulichen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren als Teil einer therapeutischen Intervention in der Behandlung eines Knorpels von einem Synovialgelenk wie einem Knie, einem Knöchel, einem Ellbogen, einer Hüfte, einer Handwurzel, einem Knöchel entweder von einem Finger oder einem Zeh, oder von einem temporo-mandibulären Gelenk sein. Die Behandlung kann auf den Meniskus des Gelenks, auf den Gelenkknorpel oder beides gerichtet sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann, um es weiter zu veranschaulichen, verwendet werden, um eine degenerative Störung des Knies zu behandeln, wie einer solchen, die das Ergebnis einer Traumaverletzung (z. B. eine Sportverletzung oder exzessive Abnutzung) oder von Osteoarthritis sein könnten. Die erfindungsgemäßen Regulatoren können als Injektion in das Gelenk mit zum Beispiel einer arthroskopischen Nadel verabreicht werden. In einigen Fällen kann das injizierte Mittel in Form eines Hydrogels oder eines anderen langsam freisetzenden Vehikels vorliegen, um einen ausgedehnteren und gleichmäßigeren Kontakt des Mittels mit dem behandelten Gewebe zu gestatten.

Die vorliegende Erfindung zieht ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf dem Gebiet der Knorpeltransplantation und der Therapien mit prothetischen Vorrichtungen in Betracht. Jedoch werfen sich Probleme auf, weil die Merkmale von Knorpel und Faserknorpel zwischen verschiedenen Geweben variieren: wie zum Beispiel zwischen Gelenk- und Meniskusknorpel, Bändern und Sehnen, zwischen den zwei Enden der gleichen Bänder oder der gleichen Sehne und zwischen den oberflächlichen und tiefen Teilen des Gewebes. Die Zonenanordnung dieser Gewebe kann eine graduelle Veränderung in den mechanischen Eigenschaften widerspiegeln und es tritt ein Defekt auf, wenn implantiertes Gewebe, welches nicht unter solchen Bedingungen differenziert hat, nicht die Fähigkeit aufweist, entsprechend zu reagieren. Zum Beispiel durchläuft, wenn ein Meniskusknorpel verwendet wird, um vordere Kreuzbänder zu reparieren, das Gewebe eine Metaplasie zu reinem Fasergewebe. Durch Regulieren der Chondrogeneserate kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um auf dieses Problem besonders einzugehen, indem geholfen wird, die implantierten Zellen in der neuen Umgebung angepasst zu steuern und den hypertrophen Chondrozyten eines früheren Entwicklungsstadiums dieses Gewebes anzugleichen.

Auf ähnliche Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um sowohl die Erzeugung von prothetischen Knorpel-Vorrichtungen als auch ihre Implantation zu fördern. Der Bedarf an einer verbesserten Behandlung hat die Forschung motiviert, die auf das Kreieren von neuem Knorpel zielt, der auf Collagen-Glycosaminoglycan-Matrizen basiert (Stone et al. (1990), Clin. Orthop. Relat. Red. 252: 129), isolierten Chondrozyten (Grande et al. (1989) J. Orthop. Res. 7: 208; und Takigawa et al. (1987) Bone Miner. 2: 449) und Chondrozyten, welche an natürlichen oder synthetischen Polymeren haften (Walitani et al. (1989), J. Bone Jt. Surg. 71B: 74; Vacanti et al. (1991) Plast. Reconstr. Surg. 88: 753; von Schroeder et al. (1991) J. Biomed. Mater. Res. 25: 329; Freed et al. (1993) J. Biomed. Mater. Res. 27: 11; und das Vacanti et al. U.S.-Patent Nr. 5,041,138). Zum Beispiel kann man Chondrozyten in Kultur auf biologisch abbaubaren, biokompatiblen, hoch porösen Gerüsten wachsen lassen, die aus Polymeren wie Polyglykolsäure, Polymilchsäure, Agarosegel oder anderen Polymeren gebildet werden, welche sich mit der Zeit als eine Funktion der Hydrolyse des Polymerrückgrats in harmlose Monomere abbauen. Die Matrizen sind so entworfen, dass sie einen adäquaten Nährstoff- und Gasaustausch zu den Zellen ermöglichen, bis die Verpflanzung. Die Zellen können in vitro kultiviert werden, bis sich ein adäquates Zellvolumen und eine adäquate Zelldichte entwickelt haben, um die Zellen zu implantieren. Ein Vorteil der Matrizen ist, dass sie in die gewünschte Form auf einer individuellen Basis gegossen oder geformt werden können, so dass das Endprodukt dem eigenen Ohr oder der Nase (um Beispiele zu nennen) des Patienten ähneln, oder es können flexible Matrizen verwendet werden, welche die Manipulation zum Zeitpunkt der Implantation, wie in ein Gelenk, gestatten.

Die Implantate werden während bestimmter Stadien des Kultivierungsprozesses mit einer erfindungsgemäßen Verbindung in Kontakt gebracht, um die Differenzierungsrate der Chondrozyten und die Bildung von hypertrophen Chondrozyten in der Kultur zu bewerkstelligen.

Die implantierte Vorrichtung wird mit einer erfindungsgemäßen Verbindung behandelt, um die implantierte Matrix aktiv zu remodellieren und sie für ihre beabsichtigte Funktion passender zu machen. Wie vorstehend hinsichtlich der Gewebetransplantate ausgeführt, leiden die künstlichen Transplantate unter dem gleichen Mangel, nicht in einem Milieu abgeleitet worden zu sein, das der aktuellen mechanischen Umgebung, in welche die Matrix implantiert wird, vergleichbar ist. Die Fähigkeit, die Chondrozyten in der Matrix durch das erfindungsgemäße Verfahren zu regulieren, kann es dem Implantat ermöglichen, Merkmale zu erwerben, welche dem Gewebe, das es ersetzen soll, ähnlich sind.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann verwendet werden, um die Befestigung der prothetischen Vorrichtungen zu fördern. Zur Veranschaulichung, das erfindungsgemäße Verfahren kann bei der Implantation einer periodontalen Prothese verwendet werden, wobei die Behandlung des umgebenden Bindegewebes die Bildung von Periodontium über der Prothese stimuliert.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Teil eines Therapieplans zur Erzeugung von Knochen (Osteogenese) an einer Stelle im Lebewesen verwendet werden, wo derartiges Skelettgewebe mangelhaft ist. Indian hedgehog steht besonders mit den hypertrophen Chondrocyten in Zusammenhang, welche letztendlich von Osteoblasten ersetzt werden. Zum Beispiel kann die Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung als Teil eines Verfahrens zum Regulieren der Knochenverlustrate in einem Patienten verwendet werden. Zum Beispiel können Präparate, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, verwendet werden, um zum Beispiel die enchondrale Ossifikation bei der Bildung eines "Modells" zur Ossifikation zu steuern.

Eine erfindungsgemäße Verbindung kann verwendet werden, um die Spermatogenese zu regulieren. Von den hedgehog-Proteinen, insbesondere Dhh, ist gezeigt worden, dass sie an der Differenzierung und/oder Proliferation und Bewahrung testikulärer Keimzellen beteiligt sind. Die Dhh-Expression wird in Sertoli-Zellen-Vorläufern kurz nach der Aktivierung von Sry (testikuläres Bestimmungsgen) angeregt und dauert in den Hoden bis zur Reife fort. Die männlichen Wesen sind lebensfähig, aber unfruchtbar wegen des vollständigen Fehlens von reifem Sperma. Die Untersuchung der sich entwickelnden Hoden vor verschiedenen genetischen Hintergründen weist darauf hin, dass Dhh sowohl die frühen als auch die späten Phasen der Spermatogenese reguliert. Bitgood et al. (1996) Curr. Biol. 6: 298. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Verbindung als ein Kontrazeptivum verwendet werden. Auf gleiche Weise sind die Verbindungen des erfindungsgemäßen Verfahrens potenziell nützlich zur Modulierung der normalen Ovarialfunktion.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist auch eine breite Anwendbarkeit für die Behandlung oder Prophylaxe von Störungen auf, welche das Epithelgewebe belasten, ebenso wie für kosmetische Anwendungen. Ein Schritt der Verabreichung einer Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung an ein Lebewesen, welche wirksam ist, um den Wachstumszustand eines behandelten Epithelgewebes zu verändern, kann ausgeführt werden.

Die Verabreichungsweise und der Dosierungsplan werden in Abhängigkeit von dem Epithelgewebe (den Epithelgeweben), welche(s) behandelt werden soll(en), variieren. Zum Beispiel werden topische Formulierungen bevorzugt werden, wenn das zu behandelnde Gewebe epidermales Gewebe ist, wie dermale oder mukosale Gewebe.

Ein Verfahren, welches "das Heilen einer Wunde fördert", führt als Ergebnis der Behandlung schneller zur Wundheilung, als eine gleiche Wunde in Abwesenheit der Behandlung heilt. "Förderung der Wundheilung" kann auch bedeuten, dass das Verfahren die Proliferation und/oder das Wachstum von unter anderem Keratinocyten reguliert oder dass die Wunde mit weniger Narbenbildung, geringerer Wundkontraktion, weniger Collagenablagerung und einem stärker oberflächlichen Oberflächenbereich heilt. In bestimmten Fällen kann "Förderung der Wundheilung" auch bedeuten, dass bestimmte Verfahren der Wundheilung verbesserte Erfolgsraten aufweisen (z. B. die Annahmerate von Hauttransplantaten), wenn sie mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zusammen verwendet werden.

Ungeachtet des bedeutenden Fortschritts in den rekonstruktiven Operationstechniken kann Narbenbildung ein wesentliches Hindernis bei der Wiedererlangung der normalen Funktion und des normalen Erscheinungsbildes der geheilten Haut sein. Dies ist besonders zutreffend, wenn pathologische Narbenbildung wie Keloide oder hypertrophe Narben der Hände oder des Gesichts eine funktionelle Behinderung oder physische Deformation verursacht. In schwersten Fällen kann derartige Narbenbildung psychosoziales Leiden und ein Leben in ökonomischer Deprivation herbeiführen. Die Wundreparatur schließt die Stadien der Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung ein. Das proliferative Stadium umfasst die Multiplikation der Fibroblasten und der endothelialen und epithelialen Zellen. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Proliferationsrate der Epithelzellen in und proximal zur Wunde gesteuert werden, um das Schließen der Wunde zu beschleunigen und/oder die Bildung von Narbengewebe zu minimieren.

Die vorliegende Behandlung kann auch als Teil eines Therapieplanes zur Behandlung oraler und paraoraler Geschwüre sein, welche z. B. aus einer Strahlen- und/oder Chemotherapie herrühren. Derartige Geschwüre entwickeln sich gewöhnlich innerhalb von Tagen nach der Chemotherapie oder der Strahlentherapie. Diese Geschwüre beginnen üblicherweise als kleine, schmerzhafte, irregulär geformte Läsionen, die üblicherweise von einer feinen, grauen, nekrotischen Membran bedeckt und von entzündetem Gewebe umgeben sind. In vielen Fällen führt das Fehlen einer Behandlung zu Gewebeproliferation um die Peripherie der Läsion auf einer entzündlichen Basis. Zum Beispiel zeigt das Epithel, welches das Geschwür umgibt, üblicherweise proliferative Aktivität, welche zu einem Verlust der Kontinuität des Oberflächenepithels führt. Diese Läsionen setzen den Körper aufgrund ihrer Größe und dem Verlust der epithelialen Integrität potenziellen Sekundärinfektionen aus. Die routinemäßige Aufnahme von Nahrung und Wasser wird zum sehr schmerzhaften Ereignis und, wenn die Geschwüre durch den Verdauungskanal proliferieren, Diarrhoe wird üblicherweise mit all ihren komplizierenden Faktoren offensichtlich. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Behandlung für derartige Geschwüre, welche die Anwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung einschließt, die anormale Proliferation und Differenzierung des betroffenen Epithels verringern, was dabei hilft, die Schwere der nachfolgenden entzündlichen Ereignisse zu verringern.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Zusammensetzungen können auch verwendet werden, um Wunden zu behandeln, welche von dermatologischen Erkrankungen herrühren wie Läsionen, die aus Autoimmunstörungen wie Psoriasis herrühren. Die atopische Dermatitis bezieht sich auf ein Hauttrauma, das aus Allergien herrührt, welche mit einer Immunreaktion in Zusammenhang stehen, die durch Allergene wie Pollen, Nahrung, Ärger, Insektengifte und Pflanzentoxine verursacht werden.

In anderen Ausführungsformen können die antiproliferativen Präparate der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, um die Linsenepithel-Zellproliferation zu hemmen, um postoperativen Komplikationen einer extracapsulären Kataraktextraktion vorzubeugen. Der Katarakt ist eine refraktäre Augenerkrankung und es wurden verschiedene Studien zur Behandlung eines Katarakts unternommen. Jedoch wird die Behandlung eines Katarakts gegenwärtig durch chirurgische Operationen erreicht. Die Katarakt-Chirurgie ist für eine lange Zeit angewendet worden und es sind verschiedene Operationsmethoden untersucht worden. Die extrakapsuläre Linsenextraktion ist zum Verfahren der Wahl geworden, um Katarakte zu entfernen. Die wesentlichen medizinischen Vorteile dieser Technik gegenüber der intrakapsulären Extraktion liegen im geringeren Auftreten des aphakischen cystoiden Makulaödems und Netzhautlösung. Die extrakapsuläre Extraktion ist auch für die Implantation von intraokularen Linsen vom posterioren Kammertypus, welche in den meisten Fällen nun als die Linsen der Wahl angesehen werden, erforderlich.

Jedoch ist ein Nachteil der extrakapsulären Kataraktextraktion das hohe Auftreten einer posterioren Linsenkapseltrübung, häufig Sekundärkatarakt genannt, der in bis zu 50 % der Fälle innerhalb von drei Jahren nach dem chirurgischen Eingriff auftreten kann. Der Sekundärkatarakt wird durch Proliferation von Epithelzellen der äquatorialen und anterioren Linsenkapsel verursacht, welche nach der extrakapsulären Linsenextraktion übrig bleiben. Diese Zellen proliferieren, wobei sie Sommerling-Ringe verursachen, und sie verursachen zusammen mit Fibroblasten, welche sich ebenfalls absetzen und auf der posterioren Kapsel vorkommen, die Trübung der posterioren Kapsel, was das Sehvermögen stört. Die Vorbeugung eines Sekundärkatarakts wäre für die Behandlung bevorzugt. Um die Bildung eines Sekundärkatarakts zu hemmen, stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein Mittel zum Hemmen der Proliferation der verbleibenden Linsenepithelzellen bereit. Zum Beispiel können derartige Zellen veranlasst werden, ruhig zu bleiben, indem eine Lösung, welche eine Zubereitung einer erfindungsgemäßen Verbindung enthält, in die anteriore Kammer des Auges nach der Linsenentfernung eingeträufelt wird. Darüber hinaus kann die Lösung osmotisch ausbalanciert werden, um eine minimal wirksame Dosierung bereitzustellen, wenn sie in die anteriore Kammer des Auges eingeträufelt wird, wodurch das subkapsuläre Epithelwachstum mit einer gewissen Spezifität gehemmt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in der Behandlung von Korneopathien verwendet werden, die durch Kornealepithelzellproliferation gekennzeichnet sind, wie zum Beispiel bei Okularepithelstörungen wie epitheliales Downgrowth oder Plattenepithelkarzinome der okularen Oberfläche.

Levine et al. (1997) J. Neurosci. 17: 6277 zeigen, dass hedgehog-Proteine die Mitogenese und die Photorezeptor-Differenzierung in der Vertebraten-Retina regulieren können, und Ihh ist ein Kandidatenfaktor aus dem pigmentierten Epithel, um die retinale Progenitor-Proliferation und die Photorezeptor-Differenzierung zu fördern. Gleichermaßen zeigten Jensen et al. (1997) Development 124: 363, dass die Behandlung von Kulturen retinaler Zellen aus perinatalen Mäusen mit dem amino-terminalen Fragment des Sonic hedgehog zu einem Anstieg im Anteil der Zellen führt, die Bromdesoxyuridin inkorporieren, in der gesamten Zellanzahl und in Stäbchen-Photorezeptoren, amakrinen Zellen und Müller-Gliazellen führt, was darauf hinweist, dass Sonic hedgehog die Proliferation von retinalen Vorläuferzellen fördert. Deshalb kann das erfindungsgemäße Verfahren in der Behandlung von proliferativen Erkrankungen retinaler Zellen vewendet werden und die Photorezeptor-Differenzierung regulieren.

Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, um das Haarwachstum zu steuern. Haar besteht grundsätzlich aus Keratin, einem harten und unlöslichen Protein; seine hauptsächliche Festigkeit liegt in seiner Cystin-Disulfidbindung. Jedes einzelne Haar umfasst einen zylindrischen Schaft und eine Wurzel und es ist in einem Follikel enthalten, einer kolbenartigen Senkung in der Haut. Der Boden des Follikels enthält einen fingerartigen Vorsprung, der als Papille bezeichnet wird, welcher aus Bindegewebe besteht, aus dem das Haar wächst und durch welchen Blutgefäße die Zellen mit Nahrung versorgen. Der Schaft ist der Teil, der sich nach außen von der Hautoberfläche erstreckt, während die Wurzel als der verborgene Teil des Haares beschrieben wird. Die Basis der Wurzel expandiert zur Haarzwiebel, welche auf der Papille ruht. Die Zellen, aus denen das Haar erzeugt wird, wachsen in der Zwiebel des Follikels; sie werden in Form von Fasern extrudiert, da die Zellen in dem Follikel proliferieren. Haar-"Wachstum" bezieht sich auf die Bildung und Verlängerung der Haarfasern durch sich teilende Zellen.

Wie auf dem Fachgebiet bekannt wird der gewöhnliche Haarzyklus in drei Stadien geteilt: Anagen, Katagen und Telogen. Während der aktiven Phase (Anagen) teilen sich die epidermalen Stammzellen der dermalen Papille schnell. Die Tochterzellen bewegen sich aufwärts und differenzieren sich, um die konzentrischen Schichten des Haares selbst zu bilden. Das Übergangsstadium, Katagen, ist durch die Einstellung der Stammzellen-Mitose im Follikel gekennzeichnet. Die Ruhephase ist als Telogen bekannt, in der das Haar innerhalb der Kopfhaut für mehrere Wochen gehalten wird, bevor ein entstehendes neues Haar, welches sich unter diesem entwickelt, den Telogenphasen-Schaft aus seinem Follikel vertreibt. Aus diesem Modell wird klar, dass, je größer der Pool an sich teilenden Stammzellen ist, die sich in Haarzellen differenzieren, desto mehr Haarwachstum gibt es. Dementsprechend können Verfahren zum Steigern oder Verringern des Haarwachstums durch Verstärken beziehungsweise Hemmen der Proliferation dieser Stammzellen durchgeführt werden.

In bestimmten Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden als ein Weg zur Verringerung des Wachstums von humanem Haar im Gegensatz zu seiner üblichen Entfernung durch Schneiden, Rasieren oder Depilation. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden in der Behandlung von Trichosis, welche von anormal schnellem oder dichtem Haarwachstum gekennzeichnet ist, z. B. Hypertrichosis. In einer beispielhaften Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, um Hirsutismus, eine Störung, die durch anormale Behaarung gekennzeichnet ist, zu handhaben. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch ein Verfahren zur Verlängerung der Dauer einer Depilation bereitstellen.

Darüber hinaus können, da eine erfindungsgemäße Verbindung für Epithelzellen häufig zytostatisch, eher als zytotoxisch sein wird, derartige Mittel verwendet werden, um Haarfollikelzellen vor zytotoxischen Mitteln zu schützen, welche für die Wirksamkeit, z. B. strahleninduzierten Tod, das Fortschreiten in die S-Phase des Zellzyklus erfordern. Die Behandlung durch das erfindungsgemäße Verfahren kann Schutz bereitstellen, indem die Haarfollikelzellen veranlasst werden, ruhend zu werden, z. B. indem die Zellen daran gehindert werden, in die S-Phase einzutreten und indem dadurch die Follikelzellen daran gehindert werden, die mitotische Katastrophe oder den programmierten Zelltod zu durchlaufen. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Verbindungen für Patienten verwendet werden, welche sich einer Chemo- oder Strahlentherapie unterziehen, die gewöhnlich zum Haarverlust führt. Indem die Zellzyklusprogression während solcher Therapien gehemmt wird, kann die erfindungsgemäße Behandlung Haarfollikelzellen vor dem Tod schützen, der andernfalls aus der Aktivierung des Zelltodprogramms herrühren könnte. Nachdem die Therapie abgeschlossen ist, kann auch das vorliegende Verfahren aufgegeben werden mit gleichzeitiger Aufgabe der Hemmung der Haarfollikelzellproliferation.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in der Behandlung der Folliculitis, wie Folliculitis decalvans, Folliculitis ulerythematosa reticulata oder Follikulitis keloidalis verwendet werden. Zum Beispiel kann ein kosmetisches Präparat einer erfindungsgemäßen Verbindung topisch in der Behandlung einer Pseudofollikulitis angewendet werden, einer chronischen Störung, welche am häufigsten in der submandibularen Region des Nackens auftritt und mit Rasieren im Zusammenhang steht, deren charakteristische Läsionen erythematöse Papeln und Pusteln sind, welche verborgene Haare enthalten.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um die Differenzierung zu induzieren und/oder die Proliferation von epithelial abgeleitetem Gewebe zu hemmen. Derartige Formen dieser Moleküle können eine Basis für eine Differenzierungstherapie zur Behandlung von hyperplastischen und/oder neoplastischen Zuständen bereitstellen, an denen Epithelgewebe beteiligt ist. Zum Beispiel können derartige Präparate verwendet werden zur Behandlung von Hauterkrankungen, in denen es anormale Proliferation oder anormales Zellwachstum der Haut gibt.

Zum Beispiel sind die pharmazeutischen Präparate der Erfindung für die Behandlung von hyperplastischen epidermalen Zuständen wie Keratosis gedacht, ebenso wie für die Behandlung von neoplastischen epidermalen Zuständen wie solchen, welche durch eine hohe Proliferationsrate für verschiedene Hautkrebse gekennzeichnet sind, wie zum Beispiel das Basalzellenkarzinom oder das Plattenepithelzellenkarzinom. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, welche die Haut beeinträchtigen, verwendet werden, insbesondere von dermatologischen Erkrankungen, an welchen eine pathologische Proliferation und/oder Keratinisierung der Epidermis beteiligt ist, welche zum Beispiel durch Psoriasis oder atopische Dermatose verursacht wird.

Viele häufige Erkrankungen der Haut, wie Psoriasis, Epithelzellenkarzinom, Keratoakanthom und Strahlenkeratose sind durch lokalisierte anormale Proliferation und Wachstum gekennzeichnet. Zum Beispiel ist bekannt, dass die Keratinocyten bei der Psoriasis, welche durch schuppige rote erhöhte Plaques auf der Haut gekennzeichnet ist, sehr viel schneller proliferieren als normal, und dass sie weniger vollständig differenzieren.

In einer Ausführungsform sind die Präparate der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von mit Keratinisierungsstörungen verbundenen dermatologischen Krankheiten geeignet, welche eine anormale Proliferation von Hautzellen verursachen, wobei diese Störungen entweder durch entzündliche oder nicht entzündliche Komponenten gekennzeichnet werden können. Zur Veranschaulichung, es können therapeutische Präparate einer erfindungsgemäßen Verbindung, die zum Beispiel eine Ruhigstellung oder Differenzierung fördert, verwendet werden, um verschiedene Formen von Psoriasis, seien sie nun kutan, mukosal oder ungual, zu behandeln. Psoriasis ist, wie vorstehend beschrieben, typischerweise durch epidermale Keratinocyten gekennzeichnet, welche eine deutliche proliferative Aktivierung und Differenzierung entlang eines "regenerativen" Stoffwechselwegs zeigen. Die Behandlung mit einer antiproliferativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann verwendet werden, um die pathologische epidermale Aktivierung umzukehren, und kann eine Basis für eine anhaltende Remission der Erkrankung bereitstellen.

Eine Vielzahl von anderen keratotischen Läsionen sind ebenfalls Kandidaten für eine Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren. Strahlenkeratosen zum Beispiel sind oberflächliche, entzündliche, prämaligne Tumore, welche auf sonnenexponierter und bestrahlter Haut entstehen. Die Läsionen sind erythematös bis braun mit variabler Schuppung. Die gegenwärtigen Therapien schließen exzisionale und Kältechirurgie ein. Diese Behandlungen sind jedoch schmerzhaft und erzeugen häufig eine kosmetisch inakzeptable Narbenbildung. Dementsprechend kann die Behandlung einer Keratose wie einer Strahlenkeratose die Anwendung, bevorzugt topisch, einer erfindungsgemäßen Verbindungs-Zusammensetzung in Mengen einschließen, die ausreichend sind, um die Hyperproliferation der epidermalen/epidermoiden Zellen der Läsion zu hemmen.

Akne stellt noch ein anderes dermatologisches Leiden dar, welches durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt werden kann. Akne vulgaris zum Beispiel ist eine multifaktorielle Erkrankung, welche am häufigsten bei Teenagern und jungen Erwachsenen auftritt und durch das Erscheinen von entzündlichen und nicht entzündlichen Läsionen im Gesicht und am oberen Rumpf charakterisiert ist. Der Basisdefekt, welcher Akne vulgaris entstehen läßt, ist eine Hyperkeratinisierung im Ductus einer hyperaktiven Talgdrüse. Die Hyperkeratinisierung blockiert die normale Mobilität der Haut- und Follikel-Mikroorganismen, und indem sie dies tut, stimuliert sie die Freisetzung von Lipasen durch Propinobacterium acnes- und Staphylococcus epidermidis-Bakterien und Pitrosporum ovale, einer Hefe. Die Behandlung mit einer antiproliferativen erfindungsgemäßen Verbindung, insbesondere topische Präparate, kann zum Vorbeugen der vorübergehenden Merkmale der Ducti, z. B. Hyperkeratinisierung, welche zu Läsionsbildung führt, nützlich sein. Die erfindungsgemäße Behandlung kann ferner zum Beispiel Antibiotika, Retinoide und Antiandrogene einschließen.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung von verschiedenen Formen der Dermatitis bereit. Dermatitis ist ein beschreibender Begriff, der sich auf schlecht abgegrenzte Läsionen bezieht, welche entweder pruritisch, erythematös, schuppig, blasig, nässend, rissig oder verkrustet sind. Diese Läsionen entstehen aus einer breiten Vielzahl von Ursachen. Die häufigsten Dermatitis-Typen sind atopische, Kontakt- und Windeldermatitis. Zum Beispiel ist eine seborrhoische Dermatitis eine chronische, üblicherweise pruritische Dermatitis mit Erythem, trocken, feucht oder fettig schuppig und mit gelben Krustenpflastern auf verschiedenen Bereichen, insbesondere der Kopfhaut, mit Exfoliation und einer exzessiven Menge an trockenen Schuppen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in der Behandlung von Stauungsdermatitis, einer oft chronischen, üblicherweise ekzematösen Dermatitis, verwendet werden. Aktinodermatitis ist eine Dermatitis aufgrund der Exposition zu aktinischer Strahlung wie der der Sonne, ultravioletten Wellen oder X- oder Gamma-Strahlung. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren in der Behandlung und/oder Vorbeugung von bestimmten Symptomen der Dermatitis verwendet werden, die durch ungewollte Proliferation von Epithelzellen verursacht wurde. Derartige Therapien für diese verschiedenen Formen der Dermatitis können auch topische und systemische Kortikosteroide, Antipruritika und Antibiotika einschließen.

Die Krankheiten, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt werden können, sind Störungen, welche für nicht humane Lebewesen spezifisch sind, wie Räude.

In noch einer anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung von humanen Karzinomen verwendet werden, insbesondere von Basalzellenkarzinomen und anderen Tumoren des Epithelgewebes wie der Haut. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Verbindungen in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Teil einer Behandlung des Basalzellnävussyndroms (BCNS) und anderen humanen Karzinomen, Adenokarzinomen, Sarkomen und dergleichen verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren als Teil einer Behandlung oder eines Prophylaxe-Therapieplans zum Behandeln (oder Vorbeugen) eines Basalzellenkarzinoms verwendet werden. Die Deregulation des hedgehog-Signalweges kann ein allgemeines Merkmal der Basalzellenkarzinome sein, welche durch ptc-Mutationen verursacht werden. Beständige Überexpression von humaner ptc-mRNA wurde in Tumoren familiärer und sporadischer BCCs beschrieben, bestimmt durch in-situ-Hybridisierung. Es kann erwartet werden, dass Mutationen, welche ptc inaktivieren, zur Überexpression von Mutanten-Ptc führen, da ptc eine negative Autoregulation abbildet. Frühere Forschung hat gezeigt, dass die Überexpression von hedgehog-Proteinen auch zu Tumorgenese führen kann. Es wurde darauf hingewiesen, dass sonic hedgehog (Shh) eine Rolle in der Tumorgenese in der Maus aufweist, durch Forschung, in der transgene Mäuse, welche Shh überexprimieren, in der Haut Merkmale von BCNS entwickelten, einschließlich multipler BCC-artiger epidermaler Proliferationen über die gesamte Hautoberfläche nur ein paar Tage nach der Hautentwicklung. Eine Mutation in dem humanen Shh-Gen von einem BCC wurde ebenfalls beschrieben; es wurde darauf hingewiesen, dass Shh oder andere Hh-Gene in Menschen als dominante Onkogene in Menschen wirken könnten. Sporadische ptc-Mutationen sind ebenfalls in BCCs von ansonsten normalen Individuen beobachtet worden, von denen einige Mutationen mit UV-Signatur sind. In einer neuesten Studie über sporadische BCCs wurden in fünfzehn Tumoren, von denen festgestellt worden war, dass sie ptc-Mutationen enthalten, fünf Mutationen vom UV-Signatur-Typ gefunden, entweder CT oder CCTT-Veränderungen. Eine andere neueste Analyse sporadischer ptc-Mutationen in BCCs und neuroektodermalen Tumoren offenbarte eine CT-Veränderung in einer der drei ptc-Mutationen, die in den BCCs gefunden worden waren. Siehe zum Beispiel Goodrich et al. (1997) Science 277: 1109 – 13; Xie et al. (1997) Cancer Res. 57: 2369 – 72; Oro et al. (1997) Science 276: 817 – 21; Xie et al. (1997) Genes Chromosomes Cancer 18: 305 – 9; Stone et al. (1996) Nature 384: 129 – 34; und Johnson et al. (1996) Science 272: 1668 – 71.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch verwendet werden, um Patienten mit BCNS zu behandeln, z. B. um BCC oder anderen Wirkungen der Erkrankung vorzubeugen, welche ein Ergebnis des ptc-Funktionsverlusts, des hedgehog-Funktionsgewinns oder des smoothened-Funktionsgewinns ist. Das Basalzellennävussyndrom ist eine seltene autosomale dominante Störung, gekennzeichnet durch multiple BCCs, die in jungem Alter auftritt. BCNS-Patienten sind für die Entwicklung dieser Tumore sehr empfänglich; in der zweiten Lebensdekade erscheint eine große Anzahl, hauptsächlich auf den sonnenexponierten Bereichen der Haut. Diese Erkrankung verursacht auch eine Reihe von Entwicklungsanomalien, einschließlich Rippen-, Kopf- und Gesichtsveränderungen und manchmal Polydaktylie, Syndaktylie und Spina bifida. Sie entwickeln ebenfalls eine Reihe von Tumortypen zusätzlich zu BCCs: Fibrome der Eierstöcke und des Herzens, Zysten der Haut und der Kiefer und im zentralen Nervensystem, Medulloblastome und Meningiome. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch verwendet werden, um derartige Tumortypen in BCNS- und Nicht-BCNS-Patienten zu behandeln. Studien zu BCNS-Patienten zeigen, dass sie sowohl genomische als auch sporadische Mutationen im ptc-Gen aufweisen, was darauf hinweist, dass diese Mutationen die letztendliche Ursache dieser Erkrankung sind.

In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Präparate und Verfahren zur Steuerung der Bildung von Megakaryocyt-abgeleiteten Zellen und/oder zur Steuerung der funktionellen Leistung von Megakaryocyt-abgeleiteten Zellen bereit. Zum Beispiel können bestimmte der hierin offenbarten Zusammensetzungen zur Behandlung oder Vorbeugung einer Vielzahl von hyperplastischen oder neoplastischen Zuständen, welche die Blutplättchen beeinflussen, angewendet werden.

In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Präparate bereit, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen. Die Verbindungen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren können zur Verabreichung mit einem biologisch verträglichen und/oder sterilen Medium wie Wasser, gepufferter Salzlösung, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen) oder geeigneten Gemischen davon bequem formuliert werden. Die optimale Konzentration des Wirkstoffs (der Wirkstoffe) in dem gewählten Medium kann gemäß den dem Pharmazeuten bekannten Verfahren empirisch bestimmt werden. Wie hierin verwendet, schließt "biologisch verträgliches Medium" jegliche Lösungsmittel, Dispersionsmedien und dergleichen ein, welche für den gewünschten Verabreichungsweg des pharmazeutischen Präparats geeignet sind. Die Verwendung derartiger Medien für pharmazeutisch wirksame Stoffe ist auf dem Fachgebiet bekannt. Außer wenn ein übliches Medium oder Mittel mit der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen inkompatibel ist, wird seine Verwendung in dem pharmazeutischen Präparat der Erfindung in Betracht gezogen. Geeignete Vehikel und ihre Formulierung inklusive anderer Proteine sind zum Beispiel in dem Buch Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa. USA 1985) beschrieben. Diese Vehikel schließen injizierbare "Depotformulierungen" ein.

Die pharmazeutischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung können auch veterinäre Zusammensetzungen einschließen, z. B. pharmazeutische Präparate der erfindungsgemäßen Verbindungen, welche für veterinäre Anwendungen, z. B. für die Behandlung von Nutztieren oder Haustieren, z. B. Hunde, geeignet sind.

Die Verfahren der Einbringung können ebenfalls durch wieder befüllbare oder biologisch abbaubare Vorrichtungen bereitgestellt werden. Es sind verschiedene polymere Vorrichtungen zur langsamen Freisetzung entwickelt und in den letzten Jahren auf die kontrollierte Freisetzung von Arzneistoffen, einschließlich proteinhaltiger Biopharmazeutika, in vivo getestet worden. Eine Vielzahl von biokompatiblen Polymeren (einschließlich Hydrogelen), welche sowohl biologisch abbaubare als auch nicht abbaubare Polymere einschließen, können verwendet werden, um ein Implantat zur verlängerten Freisetzung einer erfindungsgemäßen Verbindung an einem bestimmten Zielort zu bilden.

Die Präparate der vorliegenden Erfindung können oral, parenteral, topisch oder rektal gegeben werden. Sie werden natürlich in Formen gegeben, die für den jeweiligen Verabreichungsweg geeignet sind. Zum Beispiel werden sie verabreicht in Tabletten- oder Kapselform, durch Injektion, Inhalation, als Augenlotion, Salbe, Suppositorium, Pflaster mit kontrollierter Freisetzung etc., Verabreichung durch Injektion, Infusion oder Inhalation, topisch als Lotion oder Salbe und rektal durch Suppositorien. Die orale und die topische Verabreichung sind bevorzugt.

Die Ausdrücke "parenterale Verabreichung" und "parenteral verabreicht" bedeuten wie hierin verwendet Verabreichungweisen, die anders sind als die enterale und topische Verabreichung, gewöhnlich durch Injektion, und schließen, ohne Einschränkung, die intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre subcapsulare, subarachnoidale, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion ein.

Die Ausdrücke "systemische Verabreichung", "systemisch verabreicht", "periphere Verabreichung" und "peripher verabreicht" bedeuten wie hierin verwendet die Verabreichung einer Verbindung, eines Arzneistoffs oder anderen Materials auf andere Weise als direkt in das zentrale Nervensystem, derart, dass sie in das System des Patienten eintritt und deshalb dem Metabolismus und anderen ähnlichen Prozessen unterzogen wird, z. B. die subkutane Verabreichung.

Diese Verbindungen können an Menschen und andere Lebewesen zur Therapie über jeden geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden, einschließlich oral, nasal wie zum Beispiel durch ein Spray, rektal, intravaginal, parenteral, intrazisternal und topisch, wie durch Pulver, Salben oder Tropfen, einschließlich bukkal und sublingual.

Ungeachtet des ausgewählten Verabreichungswegs werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, welche in einer geeigneten hydratisierten Form verwendet werden können, und/oder des Arzneimittels der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch verträgliche Dosierungsformen, wie nachstehend beschrieben oder durch andere übliche, Fachleuten bekannte Verfahren, formuliert.

Die tatsächlichen Dosierungsmengen des Wirkstoffs in den Arzneimitteln dieser Erfindung können so variiert werden, um eine Menge des Wirkstoffs zu erhalten, die wirksam ist, um die gewünschte therapeutische Reaktion für einen besonderen Patienten, eine Zusammensetzung und eine Verabreichungsweise zu erhalten, ohne für den Patienten toxisch zu sein.

Die ausgewählte Dosierungsmenge wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich der Wirksamkeit der verwendeten besonderen Verbindung der vorliegenden Erfindung oder des Esters, des Salzes oder Amids davon, dem Verabreichungsweg, der Verabreichungszeit, der Exkretionsrate der verwendeten besonderen Verbindung, der Behandlungsdauer, anderen Arzneistoffen, Verbindungen und/oder Materialien, die in Kombination mit der besonderen Verbindung verwendet werden, dem Alter, Geschlecht, Gewicht, Zustand, der allgemeinen Gesundheit und der medizinischen Vorgeschichte des zu behandelnden Patienten und ähnlichen Faktoren, die auf dem medizinischen Fachgebiet bekannt sind.

Ein fachmännischer Arzt oder Veterinärmediziner kann die wirksame Menge des erforderlichen Arzneimittels leicht bestimmen und verordnen. Zum Beispiel könnte der Arzt oder Veterinärmediziner mit Dosen beginnen, welche die Verbindungen der Erfindung in niedrigeren Spiegeln in dem Arzneimittel verwenden, als erforderlich ist, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erreichen, und die Dosierung allmählich erhöhen, bis die gewünschte Wirkung erreicht ist.

Im Allgemeinen wird eine geeignete tägliche Dosis einer Verbindung der Erfindung die Menge der Verbindung sein, welche die niedrigste wirksame Dosis ist, um eine therapeutische Wirkung herzustellen. Eine derartige wirksame Dosis wird im Allgemeinen von den vorstehend beschriebenen Faktoren abhängen. Im Allgemeinen werden intravenöse, intracerebroventrikulare und subkutane Dosen der Verbindungen dieser Erfindung für einen Patienten im Bereich von etwa 0,0001 bis etwa 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag liegen.

Falls gewünscht, kann die wirksame tägliche Dosis der aktiven Verbindung in zwei, drei, vier, fünf sechs oder mehr Unterdosen getrennt in geeigneten Intervallen über den Tag verabreicht werden, gegebenenfalls in Einheitsdosierungsformen.

Der Begriff "Behandlung" soll ebenfalls die Prophylaxe, Therapie und Kur umfassen.

Der diese Behandlung erhaltende Patient ist jedes bedürftige Lebewesen, einschließlich Primaten, insbesondere Menschen und andere Säuger wie Pferde, Rinder, Schweine und Schafe; und Geflügel und Haustiere im Allgemeinen.

Die Verbindung der Erfindung kann als solche oder in Beimischungen mit pharmazeutisch verträglichen und/oder sterilen Trägern verabreicht werden und kann auch in Verbindung mit anderen antimikrobiellen Mitteln wie Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglykosiden und Glycopeptiden verabreicht werden. Eine verbindende Therapie schließt deshalb die aufeinander folgende, gleichzeitige und separate Verabreichung der aktiven Verbindung auf eine Weise ein, dass die therapeutischen Wirkungen der zuerst verabreichten nicht vollständig verschwunden sind, wenn die nachfolgende verabreicht wird.

V. Arzneimittel

Obwohl es möglich ist, eine Verbindung der vorliegenden Erfindung allein zu verabreichen, ist es bevorzugt, die Verbindung als eine pharmazeutische Formulierung (Arzneimittel) zu verabreichen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß der Erfindung können zur Verabreichung über jeden zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin geeigneten Weg formuliert werden.

Deshalb stellt eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen bereit, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Verbindungen, die zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern (Zusatzstoffen) und/oder Verdünnungsmitteln formuliert sind. Wie nachstehend im Detail beschrieben, können die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung spezifisch für die Verabreichung in fester oder flüssiger Form formuliert werden, einschließlich solchen, die für das Folgende angepasst sind: (1) orale Verabreichung, zum Beispiel Güsse (wässrige oder nicht wässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, große Pillen, Pulver, Granula, Pasten zur Anwendung auf der Zunge; (2) parenterale Verabreichung, zum Beispiel durch eine subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion wie zum Beispiel einer sterilen Lösung oder Suspension; (3) topische Anwendung, zum Beispiel als eine Creme, Salbe oder Spray, welches auf die Haut angewendet wird; oder (4) intravaginal oder intrarektal, zum Beispiel als Pessar, Creme oder Schaum. Jedoch können die erfindungsgemäßen Verbindungen in bestimmten Ausführungsformen einfach in sterilem Wasser gelöst oder suspendiert sein. In bestimmten Ausführungsformen ist das pharmazeutische Präparat nicht pyrogen, d. h. sie erhöht die Körpertemperatur eines Patienten nicht.

Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" bedeutet wie hierin verwendet die Menge einer Verbindung, eines Materials oder einer Zusammensetzung umfassend eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, welche wirksam ist, um eine gewisse gewünschte therapeutische Wirkung herzustellen, z. B. durch Überwinden eines ptc-Funktionsverlusts, eines hedgehog Funktionsgewinns oder eines smoothened-Funktionsgewinns in mindestens einer Sub-Population von Zellen in einem Lebewesen, und die biologischen Auswirkungen des Stoffwechselwegs in den behandelten Zellen in einem vernünftigen Nutzen/Risikoverhältnis, welches für jede medikamentöse Behandlung anwendbar ist, zu blockieren.

Der Ausdruck "pharmazeutisch verträglich" wird hierin verwendet als Bezug auf solche Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen, welche innerhalb des Umfangs fundierter medizinischer Beurteilung zur Verwendung in Kontakt mit Geweben von Menschen und Tieren ohne übermäßige Toxizität, Irritation, allergischer Reaktion oder einem anderen Problem oder Komplikation, im Einklang mit einem begründeten Nutzen/Risiko-Verhältnis geeignet sind.

Der Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger" bedeutet wie hierin verwendet ein pharmazeutisch verträgliches Material, Zusammensetzung oder Vehikel wie einen flüssigen oder festen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, einen Exzipienten, ein Lösungsmittel oder einkapselndes Material, das daran beteiligt ist, die erfindungsgemäßen Regulatoren von einem Organ oder einem Körperteil zu einem anderen Organ oder Körperteil zu tragen oder zu transportieren. Jeder Träger muss "verträglich" im Sinn von kompatibel mit den anderen Bestandteilen der Formulierung und für den Patienten nicht schädlich sein.

Einige Beispiele von Materialien, welche als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen, schließen ein: (1) Zucker, wie Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken wie Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Cellulose und ihre Derivate wie Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; (4) gepulvertes Tragant; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Talk; (8) Exzipienten wie Kakaobutter und Suppositorienwachse, (9) Öle wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojaöl; (10) Glykole wie Propylenglykol; (11) Polyole wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglykol; (12) Ester wie Ethyloleat und Ethyllaurat; (13 ) Agar; (14) Puffer wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Salzlösung; (18) Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) Phosphatpuffer-Lösungen; und (21) andere, nicht toxische kompatible Stoffe, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden.

Wie vorstehend ausgeführt können bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein basische funktionelle Gruppe enthalten wie ein Amino oder Alkylamino und sind deshalb fähig, pharmazeutisch verträgliche Salze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren zu bilden. Der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich in dieser Hinsicht auf die relativ nicht toxischen anorganischen und organischen Säureadditionssalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Diese Salze können in situ während der finalen Isolierung und Reinigung der Verbindungen der Erfindung hergestellt werden oder durch separates Umsetzen einer gereinigten Verbindung der Erfindung in seiner freien Basenform mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure, und Isolieren des so gebildeten Salzes. Repräsentative Salze schließen das Hydrobromid-, Hydrochlorid-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-, Nitrat-, Acetat-, Valerat-, Oleat-, Palmitat-, Stearat-, Laurat-, Benzoat-, Lactat-, Phosphat-, Tosylat-, Citrat-, Maleat, Fumarat-, Succinat, Tartrat-, Naphthylat-, Mesylat-, Glucoheptonat-, Lactobionat- und Laurylsulfonatsalz und dergleichen ein. (Siehe zum Beispiel Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1 – 19).

Die pharmazeutisch verträglichen Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen schließen die üblichen nicht toxischen Salze oder quartäre Ammoniumsalze der Verbindungen ein, z. B. von nicht toxischen organischen oder anorganischen Säuren. Zum Beispiel schließen derartige übliche nicht toxische Salze solche ein, welche von anorganischen Säuren abgeleitet wurden wie Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Sulfam-, Phosphor-, Salpetersäure und dergleichen; und die Salze, welche aus organischen Säuren wie Essig-, Propion-, Bernstein-, Glykol-, Stearin-, Milch-, Äpfel-, Wein-, Citronen-, Ascorbin-, Palmitin-, Malein-, Hydroxymalein-, Phenylessig-, Glutam-, Benzoe-, Salicyl-, Sulfanil-, 2-Acetoxybenzoe-, Fumar-, Toluolsulfon-, Methansulfon-, Ethandisulfon-, Oxal-, Isothionsäure und dergleichen hergestellt wurden.

In anderen Fällen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere saure funktionelle Gruppen enthalten und sind deshalb fähig, pharmazeutisch verträgliche Salze mit pharmazeutisch verträglichen Basen zu bilden. Der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich in diesen Fällen auf die relativ nicht toxischen, anorganischen und organischen Basenadditionssalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Diese Salze können gleichfalls in situ während der endgültigen Isolierung und Reinigung der Verbindungen hergestellt werden oder durch separates Umsetzen der gereinigten Verbindung in seiner freien Säureform mit einer geeigneten Base, wie dem Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines pharmazeutisch verträglichen Metallkations mit Ammoniak oder mit einem pharmazeutisch geeigneten organischen primären, sekundären oder tertiären Amin. Repräsentative Alkali- oder Erdalkalisalze schließen Lithium-, Natrium-, Kalium-, Kalzium-, Magnesium- und Aluminiumsalze und dergleichen ein. Repräsentative organische Amine, welche für die Bildung von Basenadditionssalzen nützlich sind, schließen Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergleichen ein. (Siehe zum Beispiel Berge et al., supra).

Netzmittel, Emulgatoren und Gleitmittel wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, ebenso wie Färbemittel, Freisetzungsmittel, Überzugsmittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Parfümstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidanzien können ebenfalls in den Zusammensetzungen vorhanden sein.

Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Antioxidanzien schließen ein: (1) wasserlösliche Antioxidanzien wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfat und dergleichen, (2) öllösliche Antioxidanzien wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, Alpha-Tocopherol und dergleichen; und (3) Metallchelatbildner wie Citronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbit, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.

Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, die für die orale, nasale, topische (einschließlich bukkal und sublingual), rektale, vaginale und/oder parenterale Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können bequem in Einheitsdosierungsform dargereicht und durch jedes auf dem Fachgebiet der Pharmazie bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Menge des Wirkstoffs, der mit einem Trägermaterial vereinigt werden kann, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, wird variieren in Abhängigkeit von dem Patienten, der behandelt wird, der besonderen Verabreichungsweise. Die Menge des Wirkstoffs, der mit einem Trägermaterial vereinigt werden kann, um eine Einzeldosierungsform zu erzeugen, wird im Allgemeinen die Menge der Verbindung sein, welche eine therapeutische Wirkung erzeugt. Im Allgemeinen wird diese Menge, bezogen auf einhundert Prozent, im Bereich von etwa 1 Prozent bis etwa neunundneunzig Prozent des Wirkstoffs liegen, bevorzugt bei etwa 5 Prozent bis etwa 70 Prozent und am meisten bevorzugt bei etwa 10 Prozent bis etwa 30 Prozent.

Die Verfahren zum Herstellen dieser Formulierungen oder Verbindungen schließen den Schritt des In-Verbindung-Bringens einer Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einem Träger und gegebenenfalls einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen ein. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch einheitliches und inniges In-Verbindung-Bringen einer Verbindung der vorliegenden Erfindung mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder beidem und dann, falls notwendig, Formen des Produkts hergestellt.

Die für die orale Verabreichung geeigneten Formulierungen der Erfindung können in Form von Kapseln, Stärkekapseln, Pillen, Tabletten, Lutschtabletten (unter Verwendung einer mit Geschmack versehenen Grundlage, üblicherweise Saccharose und Gummi Arabicum oder Tragant), Pulvern, Granula oder als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht wässrigen Flüssigkeit oder als Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl-Flüssigemulsion oder als Elixir oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Base wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummi Arabicum) und/oder als Mundwasser und dergleichen vorliegen, wobei jede eine vorbestimmte Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff beinhaltet. Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch als eine große Pille, Elektuarium oder Paste verabreicht werden.

In festen Dosierungsformen der Erfindung für orale Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granula und dergleichen) wird der Wirkstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder einem der folgenden gemischt: (1) Füllstoffe oder Streckmittel wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glukose, Mannit und/oder Kieselsäure; (2) Bindemittel wie zum Beispiel Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Gummi Arabicum; (3) Beleuchtungsmittel wie Glycerin; (4) Sprengmittel wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte Silikate und Natriumcarbonat; (5) Lösungsverzögerer wie Paraffin; (6) Absorptionsbeschleuniger wie quartäre Ammoniumverbindungen, (7) Netzmittel wie zum Beispiel Cetylalkohol und Glycerinmonostearat; (8) Absorber wie Kaolin- und Bentonitton; (9) Gleitmittel wie ein Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat und Gemische davon; und (10) Färbemittel. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Arzneimittel auch Puffer umfassen. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in weichen und harten gefüllten Gelatinekapseln verwendet werden unter Verwendung derartiger Exzipienten wie Lactose und Milchzucker, ebenso wie Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht und dergleichen.

Eine Tablette kann durch Verpressen oder Gießen hergestellt werden, gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen. Verpresste Tabletten können unter Verwendung eines Bindemittels (zum Beispiel Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose), eines Gleitmittels, eines inerten Verdünnungsmittels, eines Konservierungsstoffs, eines Sprengmittels (zum Beispiel Natriumstärkeglykolat oder vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), eines oberflächenaktiven Mittels oder Dispergiermittels hergestellt werden. Gegossene Tabletten können durch Gießen eines Gemischs der pulverisierten Verbindung, die mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet ist, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden.

Die Tabletten und andere feste Dosierungsformen der Arzneimittel der vorliegenden Erfindung wie Dragees, Kapseln, Pillen und Granula können gegebenenfalls gekerbt oder mit Überzügen und Hüllen wie magensaftresistente Überzüge und anderen auf dem Fachgebiet des pharmazeutischen Formulierens bekannten Überzügen hergestellt werden. Sie können auch so formuliert werden, dass sie eine langsame oder gesteuerte Freisetzung des Wirkstoffs darin bereitstellen unter Verwendung von zum Beispiel Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen, anderer Polymermatrizen, Liposome und/oder Mikrokügelchen. Sie können zum Beispiel durch Filtration durch einen bakterienzurückhaltenden Filter oder durch Inkorporieren von sterilisierenden Mitteln in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in sterilem Wasser gelöst werden können, oder durch einige andere sterile injizierbare Medien unmittelbar vor der Anwendung sterilisiert werden. Diese Zusammensetzungen können auch gegebenenfalls Trübungsmittel enthalten und können von einer Zusammensetzung sein, dass sie den Wirkstoff (die Wirkstoffe) nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltrakts freisetzen, gegebenenfalls auf verzögerte Weise. Beispiele für die eingebetteten Zusammensetzungen, welche verwendet werden können, schließen Polymerstoffe und Wachse ein.

Der Wirkstoff kann auch in mikroeingekapselter Form vorliegen, falls angemessen, mit einem oder mehreren der vorstehend beschriebenen Exzipienten.

Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung der Verbindungen der Erfindung schließen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere ein. Zusätzlich zum Wirkstoff kann die flüssige Dosierungsform inerte Verdünnungsmittel, die üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendet werden, wie zum Beispiel Wasser oder andere Lösungsmittel, Solubilisierungsmittel und Emulgatoren wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Rizinus- und Sesamöl), Glycerin, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglykole und Sorbitan-Fettsäureester und Gemische davon enthalten.

Neben den inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe wie Netzmittel, Emulgatoren und Suspendiermittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe, Färbemittel und Konservierungsmittel enthalten.

Suspensionen können zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Suspendiermittel wie zum Beispiel ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und -sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant und Gemische davon enthalten.

Es ist bekannt, dass Sterine wie Cholesterin Komplexe mit Cyclodextrinen bilden. Deshalb kann es in bevorzugten Ausführungsformen, in denen der Inhibitor ein Steroidalkaloid ist, mit Cyclodextrinen formuliert werden, wie &agr;-, &bgr;- und &ggr;-Cyclodextrin, Dimethyl-&bgr;-cyclodextrin und 2-Hydroxypropyl-&bgr;-cyclodextrin.

Die Formulierungen der Arzneimittel der Erfindung für die rektale oder vaginale Verabreichung können als Suppositorium dargereicht werden, welches durch Mischen von einer oder mehreren Verbindungen der Erfindung mit einem oder mehreren geeigneten, nicht irritierenden Exzipienten oder Trägern hergestellt werden kann, umfassend zum Beispiel Kakaobutter, Polyethylenglykol, ein Suppositoriumswachs oder ein Salycilat, und welche bei Raumtemperatur fest, jedoch bei Körpertemperatur flüssig ist und deshalb im Rektum oder der Vaginalhöhle schmelzen und den Wirkstoff freisetzen wird.

Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung, welche für die vaginale Verabreichung geeignet sind, schließen auch Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen, welche solche Träger enthalten, die auf dem Fachgebiet als passend bekannt sind, ein.

Die Dosierungsformen für die topische oder transdermale Verabreichung einer Verbindung dieser Erfindung schließen Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen, Pflaster und Inhalationsmittel ein. Der Wirkstoff kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und mit jeglichen Konservierungsmitteln, Puffern oder Treibmitteln gemischt werden, welche erforderlich sein können.

Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu dem Wirkstoff dieser Erfindung Exzipienten wie tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Gemische davon enthalten.

Die Pulver und Sprays können zusätzlich zu einer Verbindung dieser Erfindung Exzipienten wie Lactose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikate und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Die Sprays können zusätzlich gewöhnliche Treibmittel wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige, unsubstituierte Kohlenwasserstoffe wie Butan und Propan enthalten.

Transdermale Pflaster weisen den zusätzlichen Vorteil des Bereitstellens der kontrollierten Freisetzung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung in den Körper auf. Derartige Dosierungsformen können durch Lösen oder Dispergieren der erfindungsgemäßen Verbindungen in dem geeigneten Medium hergestellt werden. Absorptionsverstärker können auch verwendet werden, um den Fluss der Verbindung über die Haut zu steigern. Die Rate eines derartigen Flusses kann entweder durch Bereitstellen einer die Rate steuernden Membran oder Dispergieren der Verbindung in einer Polymermatrix oder einem Gel gesteuert werden.

Ophthalmische Formulierungen, Augensalben, Pulver, Lösungen und dergleichen werden ebenfalls als innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegend angesehen.

Die für die parenterale Verabreichung geeigneten Arzneimittel dieser Erfindung umfassen eine oder mehrere Verbindungen der Erfindung in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch verträglichen sterilen isotonischen wässrigen oder nichtwässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen oder sterilen Pulvern, welche in sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen unmittelbar vor der Anwendung wieder hergestellt werden können, welche Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika, aufgelöste Stoffe, welche die Formulierung mit dem Blut des betreffenden Rezipienten isotonisch machen können, oder Suspendier- oder Verdickungsmittel enthalten können.

Beispiele für geeignete wässrige und nichtwässrige Träger, welche in den Arzneimitteln der Erfindung verwendet werden können, schließen Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Gemische davon, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat ein. Geeignete Fluidität kann aufrecht erhalten werden durch zum Beispiel die Verwendung von Beschichtungsmaterialien wie Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall der Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln.

Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulgatoren und Dispergiermittel enthalten. Die Vorbeugung gegenüber der Wirkung von Mikroorganismen kann durch den Einschluss von verschiedenen antibakteriellen und antifungalen Mitteln, zum Beispiel Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen bewirkt werden. Es kann auch wünschenswert sein, isotonische Mittel wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen in die Zusammensetzungen einzuschließen. Zusätzlich kann die verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form durch den Einschluss von Mitteln bewerkstelligt werden, welche die Absorption verzögern, wie Aluminiummonostearat und Gelatine.

In einigen Fällen ist es, um die Wirkung eines Arzneistoffs zu verlängern, erwünscht, die Absorption des Arzneistoffs aus subkutaner oder intramuskulärer Injektion zu verlangsamen. Dies kann ausgeführt werden durch die Verwendung einer flüssigen Suspension aus kristallinem oder amorphem Material mit schlechter Wasserlöslichkeit. Die Absorptionsrate des Arzneistoffs hängt dann von seiner Auflösungsrate ab, welche wiederum von der Kristallgröße und der kristallinen Form abhängen kann. In einer anderen Ausführungsform wird die verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Arzneistoffform durch Lösen oder Suspendieren des Arzneistoffs in einem Ölvehikel ausgeführt.

Injizierbare Depotformen werden durch das Formen von Mikrokapsel-Matrizen der erfindungsgemäßen Verbindungen in biologisch abbaubaren Polymeren wie Polylactid-Polyglycolid hergestellt. In Abhängigkeit von dem Verhältnis von Arzneistoff zu Polymer und der Natur des besonderen, verwendeten Polymers kann die Rate der Wirkstofffreisetzung gesteuert werden. Beispiele von anderen biologisch abbaubaren Polymeren schließen Poly(orthoester) und Poly(anhydride) ein. Injizierbare Depot-Formulierungen werden ebenfalls durch Einfangen des Arzneistoffs in Liposome oder Mikroemulsionen, die mit Körpergewebe kompatibel sind, hergestellt.

Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Pharmazeutika an Menschen und Lebewesen verabreicht werden, können sie als solche oder als Arzneimittel gegeben werden, das zum Beispiel 0,1 bis 99,5 % (stärker bevorzugt 0,5 – 90 %) des Wirkstoffs in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

Die Zugabe der aktiven Verbindung der Erfindung an Tiernahrung wird bevorzugt ausgeführt, indem eine entsprechende Nahrungsvormischung hergestellt wird, welche die aktive Verbindung in einer wirksamen Menge enthält, und Inkorporieren der Vormischung in die vollständige Ration.

In einer anderen Ausführungsform kann ein Zwischenprodukt-Konzentrat oder ein Nahrungsergänzungsmittel, welches den Wirkstoff enthält, in die Nahrung gemischt werden. Die Weise, wie derartige Nahrungsvormischungen und vollständige Rationen hergestellt und verabreicht werden können, sind in Nachschlagewerken (wie "Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman und CO. San Francisco, U.S.A., 1969 oder "Livestock Feeds and Feeding", O and B books, Corvallis, Ore. U.S.A., 1977) beschrieben.

VI. Syntheseschemata und Identifizierung der aktiven Regulatoren

Die erfindungsgemäßen Verbindungen und Derivate davon können leicht durch Anwendung bekannter Syntheseverfahren hergestellt werden. Wie auf dem Fachgebiet bekannt, werden diese Kupplungsreaktionen unter relativ milden Bedingungen durchgeführt und tolerieren einen breiten Bereich von "unbeteiligter"-Funktionalität.

a. Kombinatorische Bibliotheken

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, insbesondere die Bibliotheken von Varianten mit verschiedenen repräsentativen Klassen von Substituenten sind für die kombinatorische Chemie und andere parallele Syntheseschemata verbesserungsfähig (siehe zum Beispiel PCT WO 94/08051). Das Ergebnis ist, dass große Bibliotheken von verwandten Verbindungen, z. B. eine abgewandelte Bibliothek der vorstehend dargestellten Verbindungen, schnell in Tests mit hohem Durchlauf gescreent werden können, um potentielle hedgehog-Regulator-Leitverbindungen zu identifizieren, ebenso wie die Spezifität, Toxizität und/oder das zytotoxisch-kinetische Profil einer Leitverbindung zu verfeinern. Zum Beispiel können ptc-, hedgehog- oder smoothened-Bioaktivitätstests, wie sie unter Verwendung von Zellen mit entweder einem ptc-Funktionsverlust, einem hedgehog-Funktionsgewinn oder smoothened-Funktionsgewinn entwickelt werden können, verwendet werden, um eine Bibliothek der erfindungsgemäßen Verbindungen auf solche Verbindungen zu screenen, welche Agonist-Aktivität gegenüber ptc oder Antagonist-Aktivität gegenüber hedgehog oder smoothened aufweisen. In einer anderen Ausführungsform können Bioaktivitätstests, die Zellen mit entweder einem ptc-Funktionsgewinn, einem hedgehog-Funktionsverlust oder einem smoothened-Funktionsverlust verwenden, verwendet werden um eine Bibliothek der erfindungsgemäßen Verbindungen auf solche Verbindungen zu screenen, welche Antagonist-Aktivität gegenüber ptc oder Agonist-Aktivität gegenüber hedgehog oder smoothened aufweisen.

Einfach zur Veranschaulichung, eine kombinatorische Bibliothek zum Zweck der vorliegenden Erfindung ist ein Gemisch aus chemisch verwandten Verbindungen, welche zusammen auf eine gewünschte Eigenschaft gescreent werden können. Die Zubereitung von vielen verwandten Verbindungen in einer einzigen Umsetzung verringert und vereinfacht die Anzahl von Screening-Prozessen, welche durchgeführt werden müssen, außerordentlich. Das Screenen auf die gewünschten physikalischen Eigenschaften kann mittels üblicher Verfahren durchgeführt werden.

Diversität in der Bibliothek kann in einer Vielzahl von verschiedenen Stufen erzeugt werden. Zum Beispiel können die Substrat-Arylgruppen, die in den kombinatorischen Umsetzungen verwendet werden, hinsichtlich der Kern-Aryleinheit verschieden sein, z. B. eine Vielfalt hinsichtlich der Ringstruktur, und/oder können in Bezug auf andere Substituenten variiert sein.

Eine Vielzahl von Techniken sind auf dem Fachgebiet zur Erzeugung von kombinatorischen Bibliotheken von kleinen organischen Molekülen wie den erfindungsgemäßen Verbindungen erhältlich. Siehe zum Beispiel Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14: 83; die Affymax U.S. Patente 5,359,115 und 5,362,899: das Ellman U.S. Patent 5,288,514; die Still et al. PCT-Veröffentlichung WO 94/08051; die ArQule U.S. Patente 5,736,412 und 5,712,171; Chen et al. (1994) JACS 116: 2661: Kerr et al. (1993) JACS 115: 252, PCT-Veröffentlichungen WO92/10092, WO93/09668 und WO91/07087; und die Lerner et al. PCT-Veröffentlichung WO93/20242). Dementsprechend kann eine Vielzahl von Bibliotheken in der Größenordnung von 100 bis 1.000.000 oder mehr Diversomeren der erfindungsgemäßen Verbindungen synthetisiert und auf eine bestimmte Aktivität oder Eigenschaft gescreent werden.

In einer beispielhaften Ausführungsform kann eine Bibliothek von Kandidaten-verbindungs-Diversomeren unter Verwendung eines Schemas synthetisiert werden, welches an die in der Still et al. PCT-Veröffentlichung WO 94/08051 beschriebenen Techniken angepasst ist, z. B. indem es mit einem Polymerkügelchen über eine hydrolysierbare oder photolysierbare Gruppe verknüpft ist, welche gegebenenfalls an einer der Positionen des Kandidaten-Regulators oder einem Substituenten eines synthetischen Zwischenprodukts lokalisiert ist. Der Technik von Still et al. entsprechend wird die Bibliothek an einem Satz von Kügelchen synthetisiert, wobei jedes Kügelchen einen Satz von Markierungen einschließt, welche das besondere Diversomer an diesem Kügelchen identifizierten. Die Kügelchen-Bibliothek kann dann mit zum Beispiel ptc-Funktionsverlust-, hedgehog-Funktionsgewinn- oder smoothened-Funktionsgewinn-Zellen "plattiert" werden, für die ein smoothened-Antagonist gesucht wird. Die Diversomere können vom Kügelchen freigesetzt werden, z. B. durch Hydrolyse.

Viele der Variationen an den vorstehenden und verwandten Signalwegen gestatten die Synthese von weitgehend verschiedenen Bibliotheken von Verbindungen, welche als Regulatoren der hedgehog-Funktion getestet werden können.

b. Screening-Tests

Es ist eine Vielzahl von Tests erhältlich zur Bestimmung der Fähigkeit einer Verbindung, wie einem hedgehog-Regulator, die ptc-, smoothened- oder hedgehog-Funktionen zu regulieren, von denen viele in eine Ausführung mit hohem Durchlauf eingefügt werden können. In vielen Arzneistoff-Screening-Programmen, welche die Bibliotheken von Verbindungen und natürlichen Extrakten testen, sind Tests mit hoher Durchlaufleistung erwünscht, um die Anzahl der geprüften Verbindungen in einem gegebenen Zeitraum zu maximieren. Deshalb können Bibliotheken aus synthetischen und natürlichen Produkten auf andere Verbindungen durchmustert werden, die hedgehog-Regulatoren sind.

Zusätzlich zu diesen zellfreien Tests können die Testverbindungen auch in zellbasierten Tests getestet werden. In einer Ausführungsform können Zellen, welche einen ptc-Funktionsverlust-, einen hedgehog-Funktionsgewinn- oder einen smoothened-Funktionsgewinn-Phänotypus aufweisen, mit einem Testagens von Interesse in Kontakt gebracht werden, wobei der Test zum Beispiel auf die Hemmung der Proliferation der Zelle in Gegenwart des Testagens zielt.

Eine Anzahl von Genprodukten ist mit der patched-vermittelten Signaltransduktion in Zusammenhang gebracht worden, einschließlich patched, die Transkriptionsfaktoren der cubitus interruptus- (ci) Familie, die Serin/Threoninkinase fused (fu) und die Genprodukte von costal-2, smoothened und suppressor of fused.

Die Induktion von Zellen durch hedgehog-Proteine setzt eine Kaskade in Gang, welche die Aktivierung und Hemmung der stromabwärtigen Effektoren einschließt, deren letztendliche Konsequenz in einigen Fällen eine nachweisbare Veränderung in der Transkription oder Translation eines Gens ist. Potenzielle transkriptionale Ziele der hedgehog-vermittelten Signalwirkung sind die patched-Gene (Hidalgo und Ingham, 1990, Development 110, 291 – 301; Marigo et al., 1996) und die Vertebraten-Homologe des Drosophila cubitus interruptus Gens, die GLI-Gene (Hui et al. (1994) Dev. Biol. 162: 402 – 413). Es wurde gezeigt, dass die patched-Genexpression in Zellen der Extremitätenknospe und der Neuralplatte für Shh verantwortlich sind. (Marigo et al. (1996) PNAS 93: 9346 – 51; Marigo et al. (1996) Development 122: 1225 – 1233). Die Gli-Gene codieren vermeintliche Transkriptionsfaktoren, welche Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen aufweisen (Orenic et al. (1990) Genes & Dev. 4: 1053 – 1067; Kinzler et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 634 – 642). Es wurde berichtet, dass die Transkription des G1i-Gens als Reaktion auf hedgehog in Extremitätenkospen hochreguliert ist, während die Transkription des Gli3-Gens als Reaktion auf die hedgehog-Induktion herunterreguliert ist (Marigo et al. (1996) Development 122: 1225 – 1233). Durch Auswählen der transkriptionalen Regulationssequenzen von derartigen Zielgenen, z. B. von patched oder Gli-Genen, die für die Herauf- oder Herunterregulierung dieser Gene als Reaktion auf die hedgehog-Signalwirkung verantwortlich sind, und operatives Verknüpfen derartiger Promoter an ein Reportergen kann man einen transkriptionsbasierten Test ableiten, der auf die Fähigkeit einer spezifischen Testverbindung sensitiv ist, hedgehog-vermittelte Signalwege zu modifizieren. Die Expression des Reportergens stellt deshalb ein wertvolles Screening-Werkzeug für die Entwicklung von Verbindungen bereit, welche als Regulatoren von hedgehog agieren.

Die Reportergen-basierten Tests dieser Erfindung messen das Endstadium der vorstehend beschriebenen Ereigniskaskade, z. B. die transkriptionale Modulation. Dementsprechend wird beim Umsetzen einer Ausführungsform dieses Tests ein Reportergen-Konstrukt in die Reagenz-Zelle eingefügt, um ein Nachweissignal zu erzeugen, welches von dem ptc-Funktionsverlust, dem hedgehog-Funktionsgewinn, dem smoothened-Funktionsverlust oder von der Stimulation durch Shh selbst abhängig ist. Die Menge der Transkription von dem Reportergen kann unter Verwendung eines jeden, dem Fachmann als geeignet bekannten Verfahrens gemessen werden. Zum Beispiel kann die mRNA-Expression von dem Reportergen unter Verwendung von RNAse-Protektion oder RNA-basierter PCR nachgewiesen werden, oder das Proteinprodukt des Reportergens kann durch eine charakteristische Färbung oder eine intrinsische biologische Aktivität identifiziert werden. Die Menge der Expression aus dem Reportergen wird dann mit der Menge der Expression entweder in der gleichen Zelle in Abwesenheit der Testverbindung verglichen oder sie kann mit der Menge der Transkription in einer im Wesentlichen identischen Zelle verglichen werden, der das Ziel-Rezeptorprotein fehlt. Jede statistisch oder auf andere Weise signifikante Abnahme in der Menge der Transkription zeigt an, dass die Testverbindung das ptc-Signal auf gewisse Weise agonisiert hat (oder das Funktionsgewinn-hedgehog- oder smoothened-Signal antagonisiert hat), z. B. dass die Testverbindung ein potenzieller smoothened-Antagonist ist.

Erläuterung

Die Erfindung wird nun im Allgemeinen beschrieben, sie wird leichter durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden werden, welche nur zum Zweck der Veranschaulichung von bestimmten Aspekten und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind und den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.

Beispiel 1: Steroidverbindungen

Die Hedgehog-Signalwege sind für die normale embryonale Entwicklung erforderlich, sie stehen jedoch auch mit der Karzinogenese in Zusammenhang (L. V. Goodrich und M. P. Scott, Neuron 21, 1243, (1998)). Der Verlust der Sonic hedgehog Signalwirkung (Shh) kann zum Beispiel zu Zyklopie und anderen Entwicklungsdefekten des Gesichts, des Vorderhirns und anderer Organe und Strukturen führen (C. Chiang et al., Nature 383, 407 (1996)), wohingegen die unangebrachte Aktivierung dieses Reaktionswegs mit Basalzellenkarzinom, Medulloblastom und anderen neoplastischen Störungen in Zusammenhang steht (H. Hahn et al., Cell 85 841 (1996); R. L. Johnson et al., Science 272 1668 (1996); M. Gailani et al., Nat. Genet. 14, 78 (1996); T. Pietsch et al., Cancer Res. 57, 2085 (1997); J. Reifenberger et al. Cancer Res. 58 1798 (1998); C. Raffel et al., Cancer Res. 57, 842 (1997); J. Xie et al., Nature 391, 90 (1998)). Die pharmakologische Manipulation dieses Signalwegs könnte deshalb dabei helfen, die Mechanismen der Signaltransduktion zu verdeutlichen und auch ein praktisches Mittel bereitstellen, um somatischen und kongenitalen Anomalien vorzubeugen oder diesen abzuhelfen. Von Cyclopamin, einem pflanzlichen Steroidalkaloid, ist seit langem bekannt, dass es Zyklopie und andere Manifestationen von schwerer HPE in Vertebratenembryos auslöst (R. F. Keeler und W. Binns, Teratology 1, 5 (1968)), und kürzlich wurde gezeigt, dass es durch Hemmen der zellulären Reaktion auf das Shh-Signal wirkt (M. K. Cooper, J. A. Porter, K. E. Young, P. A. Beachy, Science 280, 1603 (1998); J. P. Incardona, W. Gaffield, R. P. Kapur, H. Roelink, Developement 125, 3553 (1998)). Um das therapeutische Potenzial von Cyclopamin zu bewerten, untersuchten wir den Mechanismus darauf, wodurch er wirkt.

Die zellulären Reaktionen auf das Hh-Signal werden durch zwei mehrflutige Transmembranproteine, Smo und Ptc1 gesteuert, von denen vorausgesagt wird, dass sie sieben, beziehungsweise zwölf transmembrane Spannweiten aufweisen. Smo ist mit der Frizzled-Familie der Wnt-Rezeptoren verwandt und entfernter mit der Secretin-Familie der G-Proteingekoppelten Rezeptoren (M. R. Barnes, D. M. Duckworth, L. J. Beely, Trends Pharmacol. Sci. 19, 399 (1998)). Genetische und biochemische Befunde weisen darauf hin, dass Ptc die Aktivität von Smo unterdrückt, und dass das Binden von Hh an Ptc diese Unterdrückung aufhebt, was die Aktivierung der stromabwärtigen Ziele durch die Ci/GLI-Familie von transkriptionalen Effektoren gestattet (P. Aza-Blanc, F.-A. Remirez-Weber, M.-P. Laget, C. Schwartz, T. B. Kornberg, Cell 89 1043 (1997); N. Methot und K. Basler, Cell 96, 819 (1999); C. H. Chen et al., Cell 98, 305 (1999); B. Wang, J. Fallon, P. Beachey, Cell 100, 423 (2000). Um einen zellkulturbasierten Test einzurichten, der auf Cyclopamin sensitiv ist (ein früher eingerichteter Hedgehog-Signalwirkungstest in Drosophila-c1-8-Zellen (Chen et al., 1999) ist gegenüber Cyclopamin resistent (nicht gezeigt)), screenten wir verschiedene Vertebratenzelllinien auf eine transkriptionale Reaktion auf vollständig modifiziertes ShhNp (2A) unter Verwendung eines Luciferase-Reporters, welcher durch einen Promoter angetrieben wurde, der acht synthetische Gli-Bindungsstellen umfasste, welche mit dem Linsenkristallin-Minimalpromoter kondensiert sind (H. Sasaki, C.-C. Hui, M. Nakafuku, H. Kondoh, Development 124, 1313 (1997)). Unter den verschiedenen Fibroblasten-Zelllinien, welche auf ShhNp reagieren, waren die NIH-3T3-mausembryonalen Fibroblasten, welche mit einer 20 – 150-fachen Induktion der Luciferase-Aktivität (28) reagierten, für weitere Studien ausgewählt worden. Es ist wichtig, dass, wenn die Zellen mit Cyclopamin behandelt wurden, die Induktion durch ShhNp vollständig aufgehoben wurde (2C).

Ähnlich wie im Hh-Signalwirkungstest in Drosophila-c1-8-Zellen erforderte die Reaktion auf die Induktion durch ShhNp funktionale Gli-Bindungsstellen im Reporter (nicht gezeigt) und die Reaktion wurde durch Überexpression von Smo vergrößert und durch Überexpression von Ptc oder von aktivierter PKA unterdrückt (Tabelle 1). Die pharmakologische Aktivierung von endogener PKA durch Forskolin verhinderte auch die Induktion der Reporterexpression (Tabelle 1). Unter Verwendung dieses Tests bestätigten wir die Ergebnisse von Xie et al., dass die Tumormutation W539L (SmoAl) Smo konstitutiv aktiviert und wir fanden heraus, dass eine andere Mutation aus dem Tumorgewebe, S537N (SmoA2) Smo ebenfalls aktiviert. Die Expression beider aktivierender Mutanten induzierte die Reporterexpression auf einem Niveau, das dem, welches in ShhNp- behandelten Zellen beobachtet wurde, vergleichbar ist. Um die Validität dieses Signalwirkungstests weiter zu untersuchen, transfizierten wir Zellen mit Konstrukten, welche bekannte Signalweg-Komponenten kodierten, oder wir behandelten Zellen mit bekannten Inhibitoren dieses Signalwegs und analysierten die Wirkungen dieser Behandlungen, allein und in Kombination, auf die Reporter-Aktivierung (Tabelle 1). Die wesentlichen Befunde von Drosophila und Maus-Genanalysen, die anzeigten, dass NIH-3T3-Zellen ein zuverlässiges und physiologisch aussagefähiges Modell zur Analyse des Shh-Signalwegs bereitstellen, wurden bestätigt.

  • * Höher als die normale Dosis, welche erforderlich, um vollständig zu unterdrücken Gli3-N = Gli3 abgeschnitten bei Rest 700, wobei eine Repressor-Form erzeugt wird

Verwendete Expressionskonstrukte: pRK5 für Maus Ptc1 in voller Länge, C-terminal abgeschnittenes Ptc1-CTD, Gli3- (1 – 700) Repressor und aktive PKA-cDNAs; und pGE (transiente Transfektionen) oder pcDNA3.1+hygro (stabile Linien; Invitrogen) für die verschiedenen Smo-cDNAs. Der CMV-betriebene Säuger-Expressionsvektor pGE wurde von pEGFP-C1 (Clontech) abgeleitet durch Entfernen der Sequenzen, welche das EGFP codieren. Renilla-Luciferase (pRL-TK) wurde an den C-Terminus des offenen Smo-Leserahmens kondensiert. Die so erhaltenen Fusionsproteinkonstrukte wiesen eine vergleichbare Aktivität zu den entsprechenden unmarkierten Konstrukten in dem NIH-3T3-Test auf.

Wir stellten dann verschiedene klonale NIH-3T3-Zellinien her, welche stabil integrierten Reporter enthielten. In den am besten reagierenden Zelllinien beobachteten wir die 20 – 60-fache Induktion von Luciferase-Aktivität durch ShhNp. Unter Verwendung dieser Zelllinien entdeckten wir, dass eine vollständige Reaktion auf ShhNp erfordert, dass die Zellen Sättigungsdichte erreicht haben, gegenüber einer Abnahme der Reaktion, welche für weniger dichte Kulturen beobachtet wurde (2D). Die Erfordernis der Sättigungsdichte trifft auch für die Shh-Reaktion in NIH-3T3-Zellen zu, welche transient mit Luciferase-Reporter (nicht gezeigt) transfiziert wurden, und für die Reporter-Aktivierung durch Expression von aktiviertem Smo (2D), jedoch nicht für die Induktion durch Gli1-Überexpression (nicht gezeigt).

Die steroidale Natur dieser Pflanzenteratogene und ihre Fähigkeit, die Cholesterinsynthese und/oder den Transport zu unterbrechen (P. A. Beachey et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 62, 191 (1997); Y. Lange, J. Ye, M. Rigney, T. L. Steck, J. Lipid. Res. 40, 2294 (1999)) wiesen auf die Möglichkeit hin, dass sie die Wirkung von Ptc1 beeinflussen können, welches eine offensichtliche sterinwahrnehmende Domäne enthält (S. K. Loftus et al., Science 277, 232 (1997)). Indem wir die Merkmale der Shh-Reaktion und der Cyclopaminhemmung in embryonischen Mausfibroblasten eingerichtet hatten, testeten wir die Fibroblasten, die aus Ptc1-/-Mausembryos abgeleitet worden waren, auf Sensibilität gegenüber Cyclopamin. Mäuse, denen die Funktion von Ptc 1 fehlt, bilden eine weitgestreute Aktivierung von Zielen der Shh-Signalwirkung ab, einschließlich der des Ptc1-Gens selbst (L. V. Goodrich, L. Milenkovic, K. M. Higgins, M. P. Scott, Science 277, 1109 (1997)). Da &bgr;-Galactosidase unter der Steuerung von dem Ptc1-Promoter in diesen Zellen exprimiert wird, kann die &bgr;-Galactosidase-Expression dazu verwendet werden, den Status der Shh-Signalweg-Aktivität zu testen (3A). Überraschenderweise unterdrückte die Zugabe von Cyclopamin zu Ptc-I-Zellen die &bgr;-Galactosidase-Expression signifikant (3A) und unterdrückte gleichermaßen die Aktivität des Gli-Luc-Reporters (nicht gezeigt), was anzeigt, dass Cyclopamin fähig ist, die Shh-Signalweg-Aktivität in Abwesenheit der Ptc1-Funktion zu unterdrücken. Im Gegensatz dazu scheiterte Cyclopamin darin, die Signalweg-Aktivierung, die durch die Gli2-Überexpression induziert wurde, zu verhindern (Tabelle 1). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Ziel der Cyclopamin-Wirkung nicht Ptc1 ist (Ptc2 ist kein wahrscheinliches Ziel von Cyclopamin in Ptc1-/-Zellen, da die Expression des Ptc2-Proteins die Signalweg-Aktivierung unterdrückt und der Signalweg in Ptc1-/-Fibroblasten maximal aktiviert ist (Daten nicht gezeigt)), sondern wahrscheinlich eine andere Signalweg-Komponente, die irgendwo zwischen den Ptc1- und den Gli-Proteinen funktioniert.

Um den Ort der Cyclopaminwirkung weiter zu untersuchen, transfizierten wir NIH-3T3-Zellen mit Smo-cDNA (eine Maus-Smo-cDNA-Sonde wurde unter Verwendung von RT-PCR erzeugt mit degenerierten Oliginucleotid-Primern basierend auf Ratten- und humanen Smo-Sequenzen; diese Probe wurde anschließend verwendet, um einen cDNA-Klon zu isolieren, der die vollständige codierende Sequenz von Maus-Smo enthält) und fanden, dass die Überexpression von Smo in Abwesenheit von Shh die Reporterexpression ~10-fach induziert. Da diese Aktivierung des Signalwegs in Abwesenheit von Shh geschieht und durch 5 &mgr;M Cyclopamin (3B) unterdrückt werden kann, folgern wir daraus, dass der Mechanismus der Cyclopaminwirkung keine direkte Interferenz mit dem Shh-Binden ist (d. h. als neutraler Antagonist von Shh). Interessanterweise zeigt Cyclopamin in dieser Konzentration geringe Wirkung auf die Reporterexpression, welche durch die tumorabgeleiteten aktivierten Smo-Mutanten induziert wird (21B), was auf die Möglichkeit hinweist, dass Cyclopamin direkt oder indirekt auf Smo wirkt und dass das Aktivieren der Mutationen die Smo-Proteine resistent macht. Die Cyclopamin-Resistenz von SmoAl wurde ebenfalls bei submaximalen Graden der Aktivierung des Signalwegs beobachtet, welche mit der verringerten SmoAl-Expression in Zusammenhang steht (3B). Zudem testeten wir, ob die Shh-Signalwirkung durch aktiviertes Smo durch Cyclopamin beeinflusst wird. Obwohl vorher berichtet wurde, dass aktivierte Smo-Proteine der Unterdrückung durch Ptc1 widerstehen (M. Murone, A. Rosenthal, F. J. de Sauvage, Current Biol. 9, 76 (1999)), fanden wir, dass dieser Widerstand partiell ist, da vorher gezeigt wurde, dass die Transfektion eines Ptc1-Konstrukts im Verhältnis 9 zu 1 (nicht gezeigt) oder von Ptc1-CTD, einem C-terminal deletiertem Konstrukt (es wurde vorher gezeigt, dass Ptc1-CTD in höheren Graden als Ptc1 exprimiert wurde; N. Fuse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 10992 (1999)) die aktivierenden Wirkungen von SmoAl oder SmoA2 (3C) vollständig hemmen kann. In derart transfizierten Zellen kann der Gli-reagierende Reporter unter Behandlung mit ShhNp induziert werden; die Induktion unter diesen Bedingungen ist gegenüber 5 &mgr;M Cyclopamin resistent (3C), welche normalerweise die Shh-Signalwirkung aufheben würde. Diese Ergebnisse zeigen, dass aktivierte Smo-Moleküle in Gegenwart von ausreichend hohen Spiegeln von Ptc1 zu einer im Wesentlichen normalen, wenn auch Cyclopamin-resistenten Reaktion auf das Shh-Signal beitragen können. Die Erfordernis für höhere Ptc1-Spiegel ist nicht einfach einem höheren Spiegel der Smo-Proteinvariante zuzuschreiben, da wir entdeckt haben, dass die Spiegel von Wildtyp- und aktivierten Smo-Proteinen, welche in transfizierten Zellen produziert worden waren, gleich waren, trotz der dramatisch erhöhten Grade von Reporteraktivität, welche mit aktiviertem Smo in Zusammenhang stehen (3D).

Obwohl das Erhöhen der Cyclopaminspiegel eine gewisse Hemmung von aktiviertem Smo erzeugt (obwohl eine kleine, wenn überhaupt eine Hemmwirkung auf aktiviertes Smo bei 3 &mgr;M Cyclopamin (nicht gezeigt) beobachtet wurde, einer Konzentration, die ausreichend ist, um die normale Shh-Signalwirkung vollständig zu hemmen, wird eine gewisse Hemmwirkung bei 5 &mgr;M Cyclopamin in 4B gezeigt), wurde eine vollständige Hemmung durch die toxischen Wirkungen von Cyclopamin, welche im Bereich von 10 – 40 &mgr;M auftraten, ausgeschlossen (Daten nicht gezeigt). Jedoch zeigte ein chemisch synthetisiertes Cyclopaminderivat, 3-Keto-N-aminoethylaminocaproyldihydrocinnamoylcyclopamin (KAAD Cyclopamin, Verbindung 33) eine 10 – 20-fach größere Leistungsfähigkeit in der Unterdrückung der ShhNp-induzierten Signalweg-Aktivität, während es eine ähnliche oder geringere Toxizität beibehielt (4A). Diese Verbindung unterdrückte die SmoAl-induzierte Reporteraktivität bei einer annähernd 10-fach höheren Konzentration als jener, die für die Unterdrückung der ShhNp-Signalwirkung (4A) erforderlich ist, und sie zeigte auch höhere Leistungsfähigkeit als Cyclopamin in p2PTC-/- Zellen (4B). Dieses stärker potente Cyclopaminderivat unterdrückt deshalb aktiviertes Smo ebenso wirksam wie hohe Spiegel von Ptc1.

Die einfachste Erklärung der Cyclopaminresistenz, wie durch aktivierte Smo-Proteine verliehen, ist, dass Cyclopamin die Smo-Aktiviät beeinflusst und dass aktivierende Mutationen die Smo-Proteine resistent machen. Eine alternative Interpretation würde sein, dass aktivierte Smo-Proteine eine große Fülle an stromabwärtiger Komponente erzeugen und dass ein hoher Cyclopaminspiegel erforderlich ist, um die erhöhte Konzentration dieser stromabwärtigen Komponente zu unterdrücken. Dieses alternative Modell kann jedoch nicht die anhaltende Cyclopaminresistenz der aktivierten Smo-Proteine erklären, die bei dazwischen liegenden oder niedrigen Graden der Signalweg-Aktivierung beobachtet wurde (3B) (die Erzeugung von hohen Spiegeln einer stromabwärtigen Komponente, welche das Cyclopaminziel ist, durch aktiviertes Smo kann die anhaltende Cyclopaminresistenz nicht erklären, welche bei dazwischen liegenden Graden der Signalweg-Aktivierung beobachtet wurde (3B), da das hypothetische Cyclopaminziel unter diesen Umständen in gewissen moderaten Spiegeln wie solchen, die durch die ShhNp-Signalwirkung über das unveränderte Smo erzeugt werden, vorhanden sein würde. Wir finden auch, dass hohe Spiegel von Smo in maximal stimulierten Zellen Cyclopaminresistenz nicht verleihen (nicht gezeigt), wieder nicht in Übereinstimmung mit der Auffassung, dass die extensive Produktion oder Aktivierung einer stromabwärtigen Komponente durch Smo Cyclopaminresistenz verleihen kann). Da aktiviertes Smo nicht in höheren Spiegeln exprimiert wird als unverändertes Smo (3D), würde es den Anschein haben, dass aktivierende Mutationen eine höhere intrinsische Fähigkeit, den Signalweg zu aktivieren, verleihen können. Dies weist darauf hin, dass Smo wie die anderen sieben Transmembran-Rezeptoren (R. A. Bond et al., Nature 374, 272 (1995); H. R. Bourne, Curr. Opin. Cell Biol. 9, 134 (1997)) in einem Gleichgewicht zwischen aktiven und inaktiven Formen vorkommen kann. Die Cyclopamin- und Ptc-Aktivitäten können dieses Gleichgewicht in Richtung des inaktiven Zustands und tumorassoziierte Mutationen in Richtung des aktiven Zustands verschieben, auf diese Weise für die höheren Spiegel von Ptc- und Cyclopaminaktivitiät verantwortlich zeichnend, welche erforderlich sind, um die aktivierten Smo-Proteine zu unterdrücken.

Cyclopamin scheint auf den Shh-Signalweg am Grad der Smo-Aktivität (siehe vorstehend) einzuwirken, jedoch muss diese Wirkung nicht direkt sein und könnte durch einen Effekt auf Moleküle funktionieren, welche am intrazellullären Transport beteiligt sind, auf Moleküle, welche die posttranslationale Modifikation von Smo beeinflussen, oder auf andere Moleküle, welche auf die Smo-Aktivität einwirken. Eine derartige indirekte Wirkung von Cyclopamin würde nicht notwendigerweise mit einem Konformationsübergang zwischen aktivem und inaktivem Smo nicht in Übereinstimmung stehen, da der Konformationszustand durch eine Vielzahl von Mechanismen an die subzelluläre Lokalisation oder den Zustand der kovalenten Modifikation gekoppelt sein könnte. Wie auch immer der Mechanismus funktionieren mag, derartige Inhibitoren können einen Nutzen in der Behandlung von Störungen aufweisen, welche durch eine unpassende Shh-Signalweg-Aktivierung verursacht werden. Patienten mit Basalzellnävussyndrom (auch Gorlin-Syndrom genannt), einer autosomal-dominanten Störung, welche mit heterozygoten Funktionsverlust-Mutationen im humanen Ptc1-Gen in Zusammenhang steht, zeigen ein erhöhtes Auftreten von zahlreichen Tumoren auf, vor allem Basalzellenkarzinom (BCC), Medulloblastom, Rhabdomyosarkom und Fibrosarkom. Funktionsverlustmutationen in Ptc 1 oder aktivierende Mutationen in Smo werden zudem in 40 % der sporadischen BCC und ~ 25 % der primitiven neuroektodermalen Tumoren gefunden. Die Fähigkeit von Cyclopamin und seinen Derivaten, die Signalweg-Aktivierung durch diese beiden Typen von Mutationen zu blockieren, weist darauf hin, dass diese pflanzenabgeleiteten Verbindungen oder andere, welche die Aktiviät von Smo beeinflussen, als therapeutische Mittel nützlich sein können.

Beispiel 2: Steroidderivate Neue synthetisierte Derivate

Cyclopamin und Jervin (Strukturen 1 beziehungsweise 2 von 5) sind eng verwandte, pflanzenabgeleitete Steroidalkaloide, welche dafür bekannt sind, dass sie den Sonic hedgehog-Signalweg spezifisch hemmen (Cooper et al., Science 280, S. 1603 – 1607, 1998). Wir haben 23 neue Derivate dieser zwei Verbindungen durch zahlreiche Modifikationen seines sekundären Amins, des C-3-Sauerstoffs und/oder des C5-C6-Olefins chemisch synthetisiert. Einige dieser Verbindungen können leicht in markierter Form synthetisiert werden, was sie für Bindungsstudien nützlich macht. Einige dieser Verbindungen enthalten auch funktionelle Gruppen, die für UV-Quervernetzen und folgendes radioaktives Markieren oder Bindung einer Biotineinheit, um auf Proteine zu zielen, nützlich sind. Eine der Verbindungen ist fluoreszierend markiert und kann für die direkte Beobachtung des zellulären Ziels der Cyclopaminwirkung nützlich sein. Die Leistungsfähigkeit der verschiedenen Derivate wird in Tabelle II dargelegt.

Realisierung von verbesserten Leistungsfähigkeit durch SAR-Studien

Unter Verwendung einer klonalen Zelllinie, die aus parentalen NIH-3T3-Fibroblastenzellen abgeleitet wurde, welche einen stabil integrierten, auf Shh reagierenden Luciferasereporter beinhalten, haben wir die Konzentration jeder Verbindung bestimmt, die erforderlich ist, um die Sonic-hedgehog-Induktion um 50 % zu hemmen (IC50). Durch SAR-Studien haben wir herausgefunden, dass Addukte am 3,&bgr;-Hydroxyl die Aktivität dramatisch verringern, wohingegen die Oxidation des 3,&bgr;-Hydroxyls zu einer Ketogruppe die Leistungsfähigkeit erhöht. Wir haben auch herausgefunden, dass die Addition von massigen Gruppen an das sekundäre Amin die Leistungsfähigkeit verringert, dass jedoch längere aliphatische Linker die Addition derartiger massiger Gruppen nicht nur nicht zulässt, sondern auch die Leistungsfähigkeit verstärkt. Die am meisten wirksame Verbindung, welche so weit identifiziert wurde (Struktur 34 in 5; IC50 = 30 nM), zeigt eine zehnfach größere Leistungsfähigkeit als die von Cyclopamin (Struktur 1; IC50 = 300 nM). Es sollte unkompliziert sein, durch systematisches Testen verschiedener Addukte an dem sekundären Amin und Vereinigen dieser in Kombination mit einer 3-Keto-Funktionalität, noch größere Leistungsfähigkeit zu erhalten. Die stärker potenten Derivate, die wir bereits synthetisiert haben, zeigen die gewünschte Eigenschaft, die Hemmung der Shh-Signalwirkung mit stärker verringerter Toxizität, verglichen mit den Stammverbindungen, zu erreichen.

Breiter Nutzen der Verbindungen

Wir haben untersucht, dass diese Verbindungen fähig sind, die Stoffwechselaktivität in Zellen mit erhöhten Graden an Signalweg-Aktivität aufgrund des Fehlens der Funktion des Patched1(Ptc 1) Proteins oder aufgrund der grundlegend aktivierten Funktion des Smo-Proteins zu blockieren. Die Fähigkeit dieser Verbindungen, die Signalweg-Aktivität in Zellen mit diesen beiden Defekttypen zu blockieren, weist darauf hin, dass sie in der Behandlung von bestimmten sporadischen Tumoren oder in der vorbeugenden Behandlung von Patienten mit einer ererbten Disposition zur Bildung dieser Tumore mit hoher Häufigkeit ganz allgemein nützlich sein können. Derartige Tumore schließen Basalzellenkarzinom, Medulloblastom, Fibrosarkom und Rhabdomyosarkom ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Zusätzliche Anwendungen für diese Verbindungen schließen die Induktion von Pankreasgewebe, Beseitigung von exzessivem Haarwachstum und die Behandlung anderer Hautstörungen ein.

Die Reaktion auf das Hh-Signal wird durch zwei Transmembranproteine gesteuert, Patched (Ptc) und Smoothened (Smo). Ptc ist ein zwölfmal die Membran durchspannendes Transmembranprotein, das direkt an Hh bindet. Smo enthält sieben Transmembranspannen, ist mit der Frizzled-Familie der Wnt-Rezeptoren verwandt und ist entfernter mit den Mitgliedern der G-Protein gekoppelten Rezeptor-Familie verwandt. Genetische Hinweise zeigen an, das Ptc die Aktivität von Smo unterdrückt; Hh hebt diese Unterdrückung auf und läßt die Aktivierung der stromabwärtigen Ziele, einschließlich der Ci/GLI-Familie von transkriptionalen Effektoren, zu.

Das Ptc1-Protein ist an der Unterdrückung der Signalweg-Aktivität beteiligt und die Zellen, die es nicht aufweisen, zeigen grundlegend hohe Grade der Stoffwechselweg-Aktivierung. Ein Fehlen der Ptc1-Funktion steht ursächlich mit einem hohen Prozentsatz von sporadischem Basalzellenkarzinom, Medulloblastom, Fibrosarkom, Rhabdomyosarkom ebenso wie anderen Tumoren in Zusammenhang. Zudem steht familiäre Heterozygosität am Ptc1-Locus mit einer Prädisposition zur Bildung dieser Tumoren mit hoher Häufigkeit in Zusammenhang. Wir haben gezeigt, dass Cyclopamin, Jervin und verwandte Verbindungen fährig sind, die Stoffwechselweg-Aktivität in Zellen, welche die Ptc-Funktion nicht aufweisen, vollständig zu unterdrücken.

Das Smo-Protein ist für die Signalweg-Aktivierung erforderlich und bestimmte Mutationen des Smo-Locus führen zu grundlegender Signalweg-Aktivität, sogar in Abwesenheit der Shh-Stimulation. Wir haben herausgefunden, dass Zellen, welche derartige aktivierte Smo-Proteine exprimieren, auf gewisse Weise gegenüber diesen Verbindungen resistent sind, jedoch noch auf Niveaus unterdrückt werden können, die ein bis zwei Größenordnungen höher sind als die für die Unterdrückung von normalen Zellen, die mit Shh-Protein stimuliert werden, erforderlichen. Deshalb können Tumore, welche mit sporadischen aktivierenden Mutationen am Smo-Locus in Zusammenhang stehen, auch auf die Behandlung mit diesen Verbindungen ansprechen.

Zusammenfassung der Struktur-Wirksamkeits-Beziehungsdaten (SAR). Die Modifikationen an Cyclopamin (1) und Jervin (2) werden am wirksamsten an Heteroatompositionen ausgeführt, nämlich am sekundären Amin und dem sekundären Alkohol. Unsere anfänglichen Untersuchungen der Alkaloidderivate konzentrierten sich deshalb auf die chemische Synthese von derartigen Heteroatom-Modifikationen und die biologische Bewertung dieser neuen Verbindungen. Unter Verwendung von Standardsyntheseverfahren und einem zellbasierten Shh-Signalwirkungstest wurde bestimmt, dass die Konjugation der chemischen Gruppen an den Steroidalkohol durch eine Carbamat-Bindung die Shh-Hemmwirkung wirksam verkleinert; die C3-OH modifizierten Verbindungen 8 und 12 zeigen in dem zellbasierten Test IC50s, welche fast 100-mal höher sind als die von Cyclopamin. Diese Carbamat-enthaltenden Verbindungen sind auch 10-mal schwächer als Cycloposin (3), welches eine stärker labile Modifikation der C3-OH-Gruppe aufweist, was darauf hinweist, dass die beobachtete Hemmwirkung von Cycloposin tatsächlich auf die partielle Hydrolyse der Glycosid-Bindung zurückzuführen ist.

Im Gegensatz dazu werden bestimmte Modifikationen des sekundären Amins, welche die Basizität dieser Einheit bewahren, durch das Cyclopaminziel angepasst. Alle N-Alkylderivate in dieser Studie wurden synthetisch über das Diamin-Zwischenprodukt 17 erhalten, welches die effiziente Herstellung zahlreicher Cyclopaminanaloga ermöglicht. Sogar mittelgroße Strukturelemente wie die in den Verbindungen 29, 33, 39, 40 und 43 gefundenen verkleinern die Fähigkeiten dieser Alkaloide, die Shh-Signalwirkung zu blockieren, nicht signifikant und die meisten Additionen scheinen sogar die Hemmaktivität (29, 33, 39 und 43) zu betonen. Diese Beobachtungen unterscheiden sich in gewisser Weise von den von Keeler und Mitarbeitern gemeldeten, in denen kleine N-Alkylderivate von Cyclopamin ein verkleinertes teratogenes Potenzial in lebenden Tieren zeigte. Die Gründe für diese Unterschiede sind unklar, obwohl sie die metabolischen und/oder pharmakologischen Einflüsse in den tierbasierten Studien widerspiegeln könnten. Gemäß unseren zellbasierten Tests gibt es jedoch noch Einschränkungen für den Typ der N-Alkyl-Strukturen, welche von dem Cyclopaminziel akzeptiert werden. Verbindungen mit großer sterischer Masse sind unfähig, die Shh-Signalwirkung in Konzentrationen von bis zu 15 &mgr;M zu blockieren (Derivate 57, 58 und 63), entweder aufgrund der Impermeabilität der Zellmembran oder sterischer Ausgrenzung vom Cyclopamin-Wechselwirkungsort. Sogar relativ kleine, verzweigte Elemente nahe am Cyclopaminskelett setzen die biologische Wirksamkeit signifikant außer Kraft (Verbindung 50).

Diese Verbindungen veranschaulichen die Vielzahl von N-Modifikationen, welche von dem Cyclopaminziel akzeptiert werden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Oxidation der Hydroxylgruppe zu einem Keton die Hemmwirkungen der Cyclopaminderivate um annähernd das zweifache grundlegend verbessert (siehe Verbindung 18 vs. 19; 20 vs. 21, 22 vs. 26; 33 vs. 34; 40 vs. 41; und 50 vs. 51). Die Bildung des Enons durch Migration des C5-C6-Olefins an die C4-C5-Position (siehe Verbindungen 26 und 41) scheint die Verbindungsleistungsfähigkeit nicht zu beeinflussen, was darauf hinweist, dass die Bedeutung der Ungesättigtheit an der C5-C6-Position, von der Keeler und Mitarbeiter berichteten, primär der sp2-Hybridisierung an dem C5-Kohlenstoffatom zuzuschreiben ist. Insgesamt haben diese SAR-Daten die Synthese von potenten Shh-Signalwirkungsinhibitoren (zum Beispiel ist die Verbindung 34 der bis heute potenteste Shh-Inhibitor), radioaktiv markierten Sonden (30 und 39), Photoaffinitäts-Reagenzien (39 und 41) und Fluorophoren (43) ermöglicht.

Am bezeichnendsten führen die in dieser Studie beschriebenen Verbindungen die Vorrichtung exemplarisch aus, durch welche Cyclopaminderivate synthetisiert und bewertet werden können. Das wandlungsfähige Zwischenprodukt 17 sollte die Entwicklung von weiteren Cyclopaminbasierten Molekülen voranbringen, indem es die Entdeckung von Derivaten mit gewünschten pharmakologischen Eigenschaften beschleunigt. Derartige Cyclopamin-Analoga könnten auch durch eine kombinatorische Synthese-Herangehensweise schnell hergestellt werden; das Cyclopaminskelett von 17 könnte auf einem festen Träger über C3-OH immobilisiert werden und strukturell verschiedene Funktionalitäten könnten an das primäre Amin auf eine repetitive Split-and-Pool-Weise konjugiert werden. Im Prinzip würde diese Strategie die gleichzeitige Synthese von Millionen von Cyclopaminderivaten in einem Format erlauben, das zu einem Screening mit hoher Durchlaufleistung verbesserungsfähig ist.

Herstellung der Verbindungen

Allgemeine Syntheseverfahren. Alle Umsetzungen wurden unter einem positiven Stickstoffdruck durchgeführt. Luft- und feuchtigkeitsempfindliche Verbindungen wurden über eine Spritze oder Kanüle durch ein Gummiseptum eingeführt. Alle Reagenzien und Lösungsmittel waren von analytischer Qualität und wurden wie erhalten mit den folgenden Ausnahmen verwendet. DMF und DMSO wurden über 4 Å Molekularsieben gelagert und Wasser wurde deionisiert und destilliert. Flash-Chromatographie-Reinigungen wurden mit dem angezeigten Lösungsmittelsystem auf Merck Silicagel 60 (230 – 400 mesh) durchgeführt. Niedrig- und hochauflösende Massenspektren wurden durch die Massenspektrometrie-Vorrichtungen am Harvard Department of Chemistry and Chemical Biology erhalten. Protonenmagnetresonanzspektren (1H NMR) wurden auf einem Varian-500-MHz-Spektrophotometer aufgezeichnet.

Isolation von rohem Cyclopamin (1). Ein Benzolextrakt von Veratrum californicum (6,06 g), das vom United States Department of Agriculture erhalten worden war, wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (SiO2, schrittweiser Gradient von 50 : 1 bis 6,25 : 1 Dichlormethan/Ethanol, um das rohe Cyclopamin als einen hellbraunen Feststoff (460 mg, annähernd 1,12 mmol) zu ergeben. 1H NMR: Spektrum bestätigt die Isolation von Cyclopamin zusammen mit einigen Verunreinigungen.

Isolation von rohem Jervin (2). Ein Benzolextrakt von Veratrum virides (1,1 g), das vom United States Department of Agriculture erhalten worden war, wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (SiO2, schrittweiser Gradient von 50 : 1 bis 6,25 : 1 Dichlormethan/Ethanol), um ein braunes Öl (550 mg) zu ergeben. Der Rückstand wurde dann in Ethanol/Wasser umkristallisiert (35 ml, 1 : 1), um einen schwach gelben Feststoff (215 mg, annähernd 505 &mgr;mol) zu ergeben. Einengung und Umkristallisation der Mutterflüssigkeit ergab eine andere Charge von rohem Jervin (101 mg, annähernd 237 &mgr;mol). 1H NMR: Spektrum bestätigt die Isolation von Jervin zusammen mit einigen Verunreinigungen.

Cycloposin (3). Cycloposin wurde vom United States Department of Agriculture als ein weißer Feststoff erhalten.

Dihydrozimtsäure-N-hydroxysuccinimidester (4). Dihydrocinnamoylchlorid (638 &mgr;l, 4,21 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung aus N-Hydroxysuccinimid (500 mg, 4,21 mmol) und Triethylamin (704 &mgr;l, 5,05 mmol) in Dichlormethan (5 ml) bei 0 °C zugegeben. Die Umsetzung wurde auf Raumtemperatur aufgewärmt und für 1 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zu Diethylether (50 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (1 × 20 ml) und gesättigtem wässrigem NaHCO3 (1 × 20 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um einen weißen Feststoff zu ergeben (1,03 g, 4,17 mmol, 99 %). HRMS: (EI+) berechnet für C13H13NO4 (M+H): 247,0845; gefunden: 247,0841. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetylcyclopamin (5). Trifluoressigsäureanhydrid (77,3 &mgr;l, 547 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus rohem Cyclopamin (75,0 mg, 182 &mgr;mol) und Triethylamin (102 &mgr;l, 729 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde für 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockenheit durch einen Stickstoffgasstrom eingedampft und in MeOH (2 ml) resuspendiert. Die Methanollösung wurde für 45 Minuten unter Rückfluss erhitzt, dann bis zur Trockenheit unter Vakuum eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 8 : 1 bis 2 : 1 Hexan : Aceton) ergab das Amid als einen weißen Feststoff (47,3 mg, 93,2 &mgr;mol, 51 %). LRMS: (ES+) berechnet für C29H40NO3F3 (M+H): 508; gefunden: 508. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetyl-3-O-succinimidylcarbonylcyclopamin (6). Disuccinimidylcarbonat (107 mg, 417 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 5 (42,3 mg, 83,3 &mgr;mol) und Triethylamin (116 &mgr;l, 833 &mgr;mol) in Acetonitril (1,0 ml) zugegeben und das Gemisch wurde für 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Diethylether (10 ml) gelöst, mit 5 % Citronensäure (1 × 2 ml) und gesättigtem, wässrigen NaHCO3 (1 × 2 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 8 : 1 bis 2 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Carbonat als einen weißen Feststoff (35,6 mg, 54,9 &mgr;mol, 66 %). LRMS: (ES+) berechnet für C34H43N2O7F3 (M+H): 649; gefunden: 649. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetyl-3-O-dihydrocinnamoylethylendiamincarbamoylcyclopamin (7). Ethylendiamin (22,9 &mgr;l, 342 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 6 (11,1 mg, 17,1 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben und das Gemisch wurde für 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockenheit durch einen Stickstoffgasstrom eingedampft und überschüssiges Ethylendiamin wurde unter Vakuum entfernt. Der so erhaltene Rückstand wurde wieder in Dichlormethan (0,5 ml) gelöst und mit 4 (10,6 mg, 4,28 &mgr;mol) und Triethylamin (5,97 &mgr;l, 42,8 &mgr;mol) behandelt. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 30 min wurde die Lösung durch einen Glaswollepfropfen filtriert. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 4 : 1 bis 1 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Carbamat als einen weißen Feststoff (6,7 mg, 9,23 &mgr;mol, 54 %). LRMS: (ES+) berechnet für C41H54N3O5F3 (M+H): 726; gefunden: 726. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

3-O-dihydrocinnamoylethylendiamincarbamoylcyclopamin (8). Die Verbindung 7 (3,0 mg, 4,13 &mgr;mol) wurde in einer 2 M Lösung aus Ammoniak in Methanol (0,5 ml, 1,00 mmol) gelöst. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 2 h gerührt und dann durch einem Stickstoffgasstrom bis zu Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,1 bis 20 : 2 : 0,1 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Amin als ein farbloses Öl (2,1 mg, 3,33 &mgr;mol, 81 %). LRMS: (ES+) berechnet für C39H55N3O4 (M+H): 630; gefunden 630. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetyljervin (9). Trifluoressigsäureanhydrid (84,4 &mgr;l, 299 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus rohem Jervin (50,9 mg, 120 &mgr;mol) und Triethylamin (100 &mgr;l, 359 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben und das Gemisch wurde für 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft und in MeOH (0,5 ml) resuspendiert. Die Methanollösung wurde bei Raumtemperatur für 10 min gerührt und dann bis zur Trockenheit unter Vakuum eingedampft.

Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 16 : 1 bis 2 : 1 Hexan Aceton) ergab das Amid als einen weißen Feststoff (37,8 mg, 72,5 &mgr;mol, 60 %). LRMS: (ES+) berechnet für C29H38NO4F3 (M+H): 522; gefunden 522. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetyl-3-O-succinimidylcarbonyljervin (10). Disuccinimidylcarbonat (92,9 mg, 363 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 9 (37,8 mg, 72,5 &mgr;mol) und Triethylamin (101 &mgr;l, 725 &mgr;mol) in Acetonitril (1,0 ml) zugegeben und das Gemisch wurde für 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Diethylether (10 ml) gelöst, mit 5 % Citronensäure (1 × 2 ml) und gesättigtem wässrigen NaHCO3 (1 × 2 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 8 : 1 bis 2 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Carbonat als einen weißen Feststoff (38,4 mg, 57,9 &mgr;mol, 80 %). HRMS: (ES+) berechnet für C34H41N2O8F3 (M + Na): 685,2712; gefunden: 685,2711. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetyl-3-O-dihydrocinnamoylethylendiamincarbamoyljervin (11). Ethylendiamin (20,2 &mgr;l, 302 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 10 (10,0 mg, 15,1 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben und das Gemisch wurde für 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft und überschüssiges Ethylendiamin wurde unter Vakuum entfernt. Der so erhaltene Rückstand wurde wieder in Dichlormethan (0,5 ml) gelöst und mit 4 (7,47 mg, 30,2 &mgr;mol) und Triethylamin (4,21 &mgr;l, 30,2 &mgr;mol) bei 0 °C behandelt. Nach dem Rühren bei 0 °C für 30 min wurde die Lösung durch einen Glaswollepfropfen filtriert. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 4 : 1 bis 1 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Carbamat als einen weißen Feststoff (8,0 mg, 10,8 &mgr;mol, 72 %). LRMS: (ES+) berechnet für C41H52N3O6F3 (M+H): 740; gefunden: 740. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

3-O-Dihydrocinnamoylethylendiamincarbamoyljervin (12). Wässriges Ammoniak (200 &mgr;l einer 29%igen (Gew./Gew.) Lösung in Wasser, 3,04 mmol) wurde zu einer Lösung aus 11 (1,0 mg, 1,35 &mgr;mol) in Methanol (200 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 30 min gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,1 bis 20 : 2 : 0,1 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Amin als ein farbloses Öl (0,8 mg, 1,24 &mgr;mol, 92 %). LRMS: (ES+) berechnet für C39H53N3P5 (M+H): 644, gefunden: 644. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetylglycin (13). Methyltrifluoracetat (804 &mgr;l, 7,99 mmol) und Triethylamin (928 &mgr;l, 6,66 mmol) wurden zu einer Suspension aus Glycin (500 mg, 6,66 mmol) in Methanol (2,5 ml) zugegeben. Nachdem das Gemisch für 18 h kräftig gerührt worden war, wurde 1 N HCl tropfenweise zugegeben, bis ein pH-Wert von 2 erhalten wurde. Die Umsetzung wurde zu Ethylacetat (30 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 10 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um das Amid als einen weißen Feststoff (991 mg, 5,79 mmol, 87 %) zu ergeben. LRMS: (Cl+) berechnet für C4H4NO3F3 (M + NH4): 189; gefunden: 189. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetylglycin-N-hydrosuccinimidester (14). Disuccinimidylcarbonat (300 mg, 1,17 mmol) wurde zu einer Lösung aus 13 (200 mg, 1,17 mmol) und Pyridin (94,6 &mgr;l, 1,17 mmol) in Acetonitril (1,0 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt, wobei die Lösung klar wurde und sich Gas entwickelte. Die Lösung wurde zu Ethylacetat (10 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 5 ml) und gesättigtem wässrigem NaHCO3 (2 × 5 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um einen weißen Feststoff (232 mg, 865 &mgr;mol, 74 %) zu ergeben. LRMS: (ES+) berechnet für C8H7N2O5F3 (M + NH4): 286. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-Trifluoracetylglycyl)cyclopamin (15). Triethylamin (135 &mgr;l, 972 &mgr;mol) und 14 (261 mg, 972 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus Cyclopamin in Dichlormethan (2,0 ml) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und dann direkt der Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 8 : 1 bis 2 : 1 Hexan/Aceton) unterzogen, wobei sich das Amid als ein weißer Feststoff (166 mg, 294 &mgr;mol, 60 %) ergab. LRMS: (ES+) berechnet für C31H43N2O4F3 (M+H): 565; gefunden : 565. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Glycylcyclopamin (16): Wässriges Ammoniak (3 ml einer 29%igen (Gew./Gew.) Lösung in Wasser, 45,6 mmol) wurde zu einer Lösung aus 15 (162 mg, 296 &mgr;mol) in Methanol (4 ml) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 5 h gerührt und dann unter Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2; Chloroform, dann schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,1 bis 20 : 2 : 0,1 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Amin als einen weißen Feststoff (110 mg, 235 &mgr;mol, 79 %). LRMS: (ES+) berechnet für C29H44N2O3 (M+H): 469; gefunden: 469. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Aminoethylcyclopamin (17). Lithiumaluminiumhydrid (939 &mgr;l einer 1 M Lösung in THF, 939 &mgr;mol) wurde zu einer Suspension aus 16 (110 mg, 235 &mgr;mol) in THF (6 ml) zugegeben. Die Umsetzung wurde für 3 h unter Rückfluss erhitzt und dann mit Wasser (5 ml) und wässrigem KOH (10 ml einer 10%igen Lösung) gequencht. Nach dem Extrahieren des Gemischs mit Chloroform (2 × 20 ml) wurde die organische Schicht über Na2SO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,1 bis 20 : 2 : 0,1 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Diamin als ein farbloses Öl (94,4 mg, 208 &mgr;mol, 88 %). LRMS: (ES+) berechnet für C29H46N2O2 (M+H): 455; gefunden: 455. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-Dihydrocinnamoylaminoethyl)cyclopamin (18). Triethylamin (5,03 &mgr;l, 36,1 &mgr;mol) und 4 (4,46 mg, 18,0 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (8,2 mg, 18,0 &mgr;mol) in Dichlormethan (500 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 4 : 1 bis 1 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Amid als einen weißen Feststoff (5,7 mg, 9,71 &mgr;mol, 54 %). LRMS: (ES+) berechnet für C38H54N2O3 (M+H): 587. Gefunden: 587. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

3-Keto-N-(N'-dihydrocinnamoylaminoethyl)cyclopamin (19). Dimethylsulfoxid (6,89 &mgr;l, 97,1 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus Oxalylchlorid (4,24 &mgr;l, 48,6 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) bei –78 °C zugegeben. Nachdem das Gemisch bei –78 °C für 10 min gerührt worden war, wurde eine Lösung aus 18 (5,7 mg, 9,71 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben und die Umsetzung wurde bei –78 °C für weitere 30 min gerührt. Die Oxidation wurde durch Zugabe von Triethylamin (20,3 &mgr;l, 146 &mgr;mol) zu der Lösung abgeschlossen, welche bei –78 °C für 10 min gerührt wurde, und man ließ sie dann auf Raumtemperatur aufwärmen. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von Wasser (1 ml) und Chloroform (5 ml) gequencht und die organische Schicht wurde isoliert, mit Salzlösung (1 × 2 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 8 : 1 bis 4 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Keton als einen weißen Feststoff (2,0 mg, 3,42 &mgr;mol, 35 %). Wiedergewonnenes Ausgangsmaterial (1,6 mg, 2,73 &mgr;mol, 28 %). LRMS: (ES+) berechnet für C38H52N2O3 (M+H): 585; gefunden: 585. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(4-Benzoylbenzoyl)aminoethyl)benzophenon (20). 4-Benzoylbenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester (8,01 mg, 23,5 &mgr;mol) und Triethylamin (6,55 &mgr;l, 47,0 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (10,7 mg, 23,5 &mgr;mol) in Dichlormethan (500 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 2 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 100 : 1 bis 50 : 1 Chloroform/Methanol) ergab das Benzophenon als ein farbloses Öl (10,8 mg, 16,3 &mgr;mol, 69 %). LRMS: (ES+) berechnet für C43H54N2O4 (M+H): 663; gefunden: 663. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

3-Keto-N-(N'-(4-benzoylbenzoyl)aminoethyl)cyclopamin (21). Dimethylsulfoxid (11,6 &mgr;l, 163 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus Oxalylchlorid (7,11 &mgr;l, 81,5 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) bei –78 °C zugegeben. Nachdem das Gemisch bei –78 °C für 10 min gerührt worden war, wurde ein Lösung aus 20 (10,8 mg, 16,3 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben, und die Umsetzung wurde bei –78 °C für weitere 30 min gerührt. Die Oxidation wurde durch die Zugabe von Triethylamin (34,1 &mgr;l, 245 &mgr;mol) zu der Lösung abgeschlossen, welche bei –78 °C für 10 min gerührt wurde, und die man dann auf Raumtemperatur aufwärmen ließ. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von Wasser (1 ml) und Chloroform (5 ml) gequencht. Die so erhaltene organische Schicht wurde dann mit Salzlösung (1 × 2 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 8 : 1 bis 2 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Keton als einen weißen Feststoff (6,3 mg, 9,53 &mgr;mol, 58 %). LRMS: (ES+) berechnet für C43H52N2O4 (M+H): 661; gefunden: 661. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-Azidoidophenylpropionylaminoethyl)cyclopamin (22). Azidoiodophenylpropionyl-N-hydroxysuccinimidester (1,9 mg, 4,18 &mgr;mol) und Triethylamin (2,34 &mgr;l, 16,7 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (1,9 mg, 4,18 &mgr;mol) in Dichlormethan (500 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 4 : 1 bis 1 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Benzophenon als einen weißen Feststoff (1,6 mg, 2,12 &mgr;mol, 51 %). LRMS: (ES+) berechnet für C38H52N5O3I (M+H): 754; gefunden: 754. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-Trifluoracetylaminoethyl)cyclopamin (23). Trifluoressigsäureanhydrid (20,6 &mgr;l, 146 &mgr;mol) und Triethylamin (24,5 &mgr;l, 176 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (13,3 mg, 29,3 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde für 30 min bei Raumtemperatur gerührt und dann bis zur Trockenheit durch einen Stickstoffgasstrom eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wurde in Methanol (1 ml) wieder gelöst und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum ergab die Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 4 1 bis 2 : 1 Hexan : Aceton) das Amid als einen weißen Feststoff (9,2 mg, 16,7 &mgr;mol, 57 %). LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

3-Keto-N-(N'-trifluoracetylaminoethyl)cyclopamin (24). Dimethylsulfoxid (11,9 &mgr;l, 167 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus Oxalylchlorid (7,28 &mgr;l, 83,5 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) bei –78 °C zugegeben. Nachdem das Gemisch bei –78 °C für 10 min gerührt worden war, wurde eine Lösung aus 23 (9,2 mg, 16,7 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben und die Umsetzung wurde bei –78 °C für weitere 30 min gerührt. Die Oxidation wurde durch die Zugabe von Triethylamin (35,0 &mgr;l, 251 &mgr;mol) zur Lösung abgeschlossen, welche bei –78 °C für 10 min gerührt wurde, und man ließ sie dann auf Raumtemperatur aufwärmen. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von gesättigtem wässrigen NaHCO3 (2 ml) und Chloroform (5 ml) gequencht, und die organische Schicht wurde isoliert, über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 8 : 1 bis 4 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Keton als einen weißen Feststoff (6,0 mg, 10,9 &mgr;mol, 65 %). LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

3-Enon-N-Aminoethylcyclopamin (25). Wässriges Ammoniak (250 &mgr;l einer 29%igen (Gew./Gew.) Lösung in Wasser, 3,80 mmol) wurde zu einer Lösung aus 24 (3,0 mg, 5,47 &mgr;mol) in Methanol (250 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 24 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,1 bis 20 : 2 : 0,1 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Amin als ein farbloses Öl (3,0 mg, 6,63 &mgr;mol quant.). LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

3-Enon-N-(N'-azidoiodophenylpropionylaminoethyl)cyclopamin (26). Azidoiodophenylpropionyl-N-hydroxysuccinimidester (1,4 mg, 3,31 &mgr;mol) und Triethylamin (1,8 &mgr;l, 13,2 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 25 (1,5 mg, 3,31 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt und dann mit Dimethylaminopropylamin gequencht. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 8 : 1 bis 2 : 1 Hexan/Aceton), um das Arylazid als einen weißen Feststoff (0,5 mg, 0,665 &mgr;mol, 20 %) zu ergeben. LRMS: (ES+) berechnet für C38H50N5O3I (M+H): 752; gefunden: 752. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetyl-12-aminododecansäure (27). Methyltrifluoracetat (200 &mgr;l, 1,99 mmol) und Triethylamin (184 &mgr;l, 1,32 mmol) wurden zu einer Suspension aus 12-Aminododecansäure (300 mg, 1,32 mmol) in Methanol (2 ml) zugegeben. Nachdem das Gemisch für 18 h kräftig gerührt worden war, wurde 1 N HCl tropfenweise zugegeben, bis ein pH-Wert von 2 erhalten wurde. Die Umsetzung wurde zu Ethylacetat (20 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 5 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um das Amid als einen weißen Feststoff (398 mg, 1,28 mmol, 97 %) zu ergeben. LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetyl-12-aminododecansäure-N-hydroxysuccinimidester (28). Disuccinimidylcarbonat (247 mg, 964 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 27 (200 mg, 642 &mgr;mol) und Pyridin (104 &mgr;l, 1,28 mmol) in Acetonitril (2,0 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 4,5 h gerührt, wobei die Lösung klar wurde und sich ein Gas entwickelte. Die Lösung wurde zu Ethylacetat (10 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 1 ml) und gesättigtem wässrigen NaHCO3 (2 × 1 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um einen weißen Feststoff (257 mg, 629 &mgr;mol, 98 %) zu ergeben. LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-Trifluoracetylaminododecanoyl)aminoethyl)cyclopamin (29). Triethylamin (4,78 &mgr;l, 34,3 &mgr;mol) und 28 (8,4 mg, 20,6 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (7,8 mg, 17,2 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 12 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 100 : 1 bis 25 : 1 Chloroform/Methanol) ergab das Amid als einen weißen Feststoff (8,0 mg, 10,7 &mgr;mol, 62 %). LRMS: (ES+) berechnet für C43H68N3O4 (M+H): 748; gefunden 748. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-Propionylaminoethyl)cyclopamin (30). Propionyl-N-hydroxysuccinimidester (1,08 mg, 6,33 &mgr;mol) und Triethylamin (1,48 &mgr;l, 10,6 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (2,4 mg, 5,28 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 12 h gerührt und dann mit Dimethylaminopropylamin gequencht. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 100 : 1 bis 25 : 1 Chloroform/Methanol) ergab das Amid als ein farbloses Öl (1,8 mg, 3,52 &mgr;mol, 67 %). LRMS: (ES+) berechnet für C32H50N2O3 (M+H): 511; gefunden: 511. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

Herstellung von 3H-markierter 30. Propionyl-N-hydroxysuccinimidester (1 mCi, spezifische Aktivität = 100 Ci/mmol, 10 nmol) in Ethylacetat (1,0 ml) wurde mit 17 (1,1 mg, 2,5 &mgr;mol) in Chloroform (100 &mgr;l) gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde ohne Rühren für 20 h bei Raumtemperatur inkubiert. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 100 : 1 bis 25 : 1 Chloroform/Methanol) ergab das tritiummarkierte Cyclopaminderivat. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden zusammengefasst und durch einen Stickstoffgasstrom eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde in Methanol (200 &mgr;l) resuspendiert und bei –20 °C gelagert. Beta/Szintillationszähleranalyse bestimmte, dass die Umsetzungsausbeute annähernd 81 % ergab, und die Dünnschichtchromatographie-Analyse (Rf = 0,80; 10 : 2 : 0,1 Dichlormethan/Methanol/Triethylamin) stimmt mit den bekannten Eigenschaften von kaltem 30 überein.

N-Dihydrocinnamoylaminocapronsäure (31). Aminocapronsäure (100 mg, 747 &mgr;mol) und 4 (185 mg, 747 &mgr;mol) wurden in DMF/Wasser (1 ml; 1 : 1) gelöst. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und dann mit 1 N HCl angesäuert, bis ein pH-Wert von 2 erhalten wurde. Das Gemisch wurde zu Ethylacetat (10 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 5 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um einen weißen, wachsartigen Feststoff (175 mg, 665 &mgr;mol, 89 %) zu ergeben. LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Dihydrocinnamoylaminocapronsäure-N-hydrozysuccinimidester (32). Disuccinimidylcarbonat (155 mg, 604 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 31 (159 mg, 604 &mgr;mol) und Pyridin (97,7 &mgr;l, 1,21 mmol) in Acetonitril (1 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2,5 h gerührt, wobei die Lösung klar wurde und sich Gas entwickelte. Die Lösung wurde zu Ethylacetat (5 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 1 ml) und gesättigtem wässrigen NaHCO3 (2 × 1 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um ein farbloses Öl (156 mg, 433 &mgr;mol, 72 %) zu ergeben. LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-Dihydrocinnamoylaminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (33). Triethylamin (4,43 &mgr;l, 31,8 &mgr;mol) und 32 (5,75 mg, 15,9 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (7,25 mg, 15,9 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und bis zur Trockenheit durch einen Stickstoffgasstrom eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 100 : 1 bis 25 : 1 Chloroform/Methanol) ergab das Amid als ein farbloses Öl (5,8 mg, 8,29 &mgr;mol, 52 %). LRMS: (ES+) berechnet für C44H65N3O4 (M+H): 700; gefunden: 700. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Strukur überein.

3-Keto-N-(N'-(N''-Dihydrocinnamoylaminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (34). Dimethylsulfoxid (12,7 &mgr;l, 177 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus Oxalylchlorid (7,73 &mgr;l, 88,6 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) bei –78 °C zugegeben. Nachdem das Gemisch bei –78 °C für 10 min gerührt worden war, wurde eine Lösung aus 33 (6,2 mg, 8,86 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben, und die Umsetzung wurde bei –78 °C für weitere 30 min gerührt. Die Oxidation wurde durch die Zugabe von Triethylamin (37,1 &mgr;l, 266 &mgr;mol) zur Lösung abgeschlossen, welche bei –78 °C für 10 min gerührt wurde und die man dann auf Raumtemperatur aufwärmen ließ. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von gesättigtem, wässrigen NaHCO3 (2 ml) gequencht und mit Chloroform (2 × 2 ml) extrahiert. Die so erhaltene organische Schicht wurde dann isoliert, über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt.

Reinigung durch Flash-Chromatographie ergab (SiO2, schrittweiser Gradient von 100 : 1 bis 25 1 Chloroform/Methanol) das Keton als ein hellgelbes Öl (5,4 mg, 7,74 &mgr;mol, 87 %). LRMS: (ES+) berechnet für C44H63N3O4 (M+H): 698; gefunden: 698. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetylaminocapronsäure (35). Methyltrifluoracetat (513 &mgr;l, 5,10 mmol) und Triethylamin (474 &mgr;l, 3,40 mmol) wurden zu einer Suspension aus Aminocapronsäure (455 mg, 3,40 mmol) in Methanol (2 ml) zugegeben. Nachdem das Gemisch für 8 h kräftig gerührt worden war, wurde 1 N HCl tropfenweise zugegeben, bis ein pH-Wert von 2 erhalten wurde. Die Umsetzung wurde zu Ethylacetat (10 ml) zugegeben und mit 1 N HCl (2 × 2 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um das Amid als einen weißen Feststoff (745 mg, 3,49 mmol, quant.) zu ergeben. LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetylaminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (36). Disuccinimidylcarbonat (541 mg, 2,11 mmol) wurde zu einer Lösung aus 35 (300 mg, 1,41 mmol) und Pyridin (227 &mgr;l, 2,81 mmol) in Acetonitril (2,0 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 13 h gerührt, wobei die Lösung klar wurde und sich Gas entwickelte. Die Lösung wurde zu Ethylacetat (10 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 1 ml) und gesättigtem wässrigen NaHCO3 (2 × 1 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um einen weißen Feststoff (471 mg, 1,45 mmol, quant.) zu ergeben. LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-Trifluoracetylaminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (37). Triethylamin (12,3 &mgr;l, 88,0 &mgr;mol) und 36 (71,1 mg, 52,8 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (20,0 mg, 44,0 &mgr;mol) in Dichlormethan (200 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 13 h gerührt, mit Dimethylaminopropylamin (11,2 &mgr;l, 88,0 &mgr;mol) gequencht und durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 50 : 1 bis 25 : 1 Chloroform/Methanol) ergab das Amid als ein farbloses Öl (26,9 mg, 40,5 &mgr;mol, 92 %). LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-Aminocaproylaminoethyl)cyclopamin (38). Wässriges Ammoniak (200 &mgr;l einer 29%igen (Gew./Gew.) Lösung in Wasser, 3,04 mmol) wurde zu einer Lösung aus 37 (26,9 mg, 40,5 &mgr;mol) in Methanol (400 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 20 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flashchromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,1 bis 20 : 4 0,1 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Amin als einen weißen, wachsartigen Feststoff (19,3 mg, 34,0 &mgr;mol, 84 %). LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-Azidoiodophenylpropionylaminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (39). Azidoiodophenylpropionyl-N-hydroxysuccinimidester (1,4 mg, 3,38 &mgr;mol) und Triethylamin (0,94 &mgr;l, 6,76 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 38 (1,92 mg, 3,38 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 2,5 h gerührt und bis zur Trockenheit durch einen Stickstoffgasstrom eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 4 : 1 : 0,025 bis 1 : 2 : 0,015 Hexan/Aceton/Triethylamin) ergab das Azid als ein farbloses Öl (2,2 mg, 2,54 &mgr;mol, 75 %). LRMS: (ES+) berechnet für C44H63N6O4I (M+H): 867; gefunden: 867. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

Herstellung von 125I-markierter Verbindung 39. 125I-markierter Azidoiodophenylpropionyl-N-hydroxysuccinimidester (0,250 mCi, spezifische Aktivität = 2200 Ci/mmol, 0,114 nmol) in Ethylacetat (2,1 ml) wurde auf ein Volumen von annähernd 10 &mgr;l durch einen Stickstoffgasstrom eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit Ethylacetat (100 &mgr;l) verdünnt und mit 38 (1,0 mg, 1,76 &mgr;mol) in Chloroform (100 &mgr;l) verdünnt. Die Umsetzung wurde ohne Rühren für 43 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann auf annähernd 10 &mgr;l durch einen Stickstoffgasstrom eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform (200 &mgr;l) resuspendiert und durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 100 : 1 bis 12,5 : 1 Chloroform/Methanol) gereinigt, um das radioaktiv markierte Azid zu ergeben. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden zusammengefasst, durch einen Stickstoffgasstrom eingeengt, in Methanol (1 ml) resuspendiert und ein kleines Aliquot wurde zur Quantifizierung entfernt. Gamma-Counter-Analyse legte fest, dass die Umsetzungsausbeute im wesentlichen quantitativ war, und die Lösung wurde durch einen Stickstoffgasstrom wieder eingeengt, in Methanol (250 &mgr;l) resuspendiert und bei –20 °C gelagert. Dünnschichtchromatographie-Analyse (Rf = 0,62; 10 : 2 : 0,1 Dichlormethan/Methanol/Triethylamin) stimmt mit den bekannten Eigenschaften von kalter 39 überein.

N-(N'-(N''-Biotinoylaminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (40). Biotinoyl-N-hydroxysuccinimidester (6,72 mg, 14,8 &mgr;mol) und Triethylamin (3,43 &mgr;l, 24,6 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 38 (5,6 mg, 12,3 &mgr;mol) in DMF (250 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 14 h gerührt und dann zu Chloroform (2 ml) zugegeben. Das organische Gemisch wurde mit gesättigtem wässrigen NaHCO3 (3 × 1 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,05 bis 20 : 5 : 0,05 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Keton als einen weißen Feststoff (9,4 mg, 12,5 &mgr;mol, quant.). LRMS (ES+) berechnet für C45H71N5O5S (M+H): 794; gefunden: 794. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

3-Enon-N-(N'-(N''-biotinoylaminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (41). Dimethylsulfoxid (3,66 &mgr;l, 51,6 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus Oxalylchlorid (2,25 &mgr;l, 25,8 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) bei –78 °C zugegeben. Nachdem das Gemisch bei –78 °C für 10 min gerührt worden war, wurde eine Lösung aus 40 (4,1 mg, 5,16 &mgr;mol) in Dichlormethan (200 &mgr;l) zugegeben und die Umsetzung wurde bei –78 °C für weitere 30 min gerührt. Die Oxidation wurde durch die Zugabe von Triethylamin (10,8 &mgr;l, 77,4 &mgr;mol) abgeschlossen, welche bei –78 °C für 10 min gerührt wurde und die man auf Raumtemperatur aufwärmen ließ. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von gesättigtem wässrigen NaHCO3 (2 ml) gequencht und mit Chloroform (2 × 2 ml) extrahiert. Die so erhaltene organische Schicht wurde dann über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde wieder in MeOH (0,5 ml) gelöst und mit wässrigem Ammoniak (250 &mgr;l einer 29%igen (Gew./Gew.) Lösung in Wasser, 3,80 mmol) für 20 h bei Raumtemperatur behandelt. Die Umsetzung wurde zu Chloroform (2 ml) zugegeben, mit gesättigtem wässrigen NaHCO3 (2 × 2 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,1 bis 20 : 5 0,1 Chloroform/Methanol/Triethylamin), um das Enon als einen gelblichen Feststoff (1,4 mg, 1,77 &mgr;mol, 34 %) zu ergeben. LRMS: (ES+) berechnet für C45H69N5O5S (M+H): 792; gefunden: 792. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-Propionylaminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (42). Propionyl-N-hydroxysuccinimidester (1,00 mg, 5,87 &mgr;mol) und Triethylamin (1,37 &mgr;l, 9,80 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 38 (2,78 mg, 4,90 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 12 h gerührt und dann mit Dimethylaminopropylamin gequencht. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 100 : 1 bis 10 : 1 Chloroform/Methanol) ergab das Amid als ein farbloses Öl (2,5 mg, 4,01 &mgr;mol, 82 %). LRMS: (ES+) berechnet für C38H61N3O4 (M+H): 624; gefunden: 624. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

(N-(N'-(N''-BODIPY-FL-aminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (43). BODIPY-FL-N-hydroxysuccinimidester (2,0 mg, 5,28 &mgr;mol) und Triethylamin (0,98 &mgr;l, 7,04 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 38 (2,0 mg, 3,52 &mgr;mol) in Dichlormethan (500 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 20 h gerührt und dann bis zur Trockenheit in einem Stickstoffgasstrom eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 50 : 1 bis 12,5 : 1 Chloroform/Methanol) ergab das Fluorophor als ein farbloses Öl (2,6 mg, 3,09 &mgr;mol, 88 %). LRMS: (ES+) berechnet für C49H70N5O4BF2 (M+H): 842; gefunden: 842. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetyl-4-benzoylphenylalanin (45). Methyltrifluoracetat (89,6 &mgr;l, 891 &mgr;mol) und Triethylamin (104 &mgr;l, 743 &mgr;mol) wurden zu einer Suspension aus 4-Benzoylphenylalanin (200 mg, 743 &mgr;mol) in Methanol (0,5 ml) zugegeben. Die Umsetzung wurde für 24 h kräftig gerührt und dann mit 1 N HCl angesäuert, bis ein pH-Wert von 2 erhalten wurde. Das Gemisch wurde zu Ethylacetat (10 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 10 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um einen weißen Feststoff zu ergeben (49,7 mg, 136 &mgr;mol, 18 %). LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-Trifluoracetyl-4-benzoylphenylalanin-N-hydrogysuccinimidester (46). Disuccinimidylcarbonat (33,0 mg, 129 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 45 (47,1 mg, 129 &mgr;mol) und Pyridin (20,9 &mgr;l, 258 &mgr;mol) in Acetonitril (0,5 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt, wobei die Lösung klar wurde und sich Gas entwickelte. Die Lösung wurde zu Ethylacetat (5 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 1 ml) und gesättigtem wässrigen NaHCO3 (2 × 1 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um einen weißen Feststoff (48,8 mg, 106 &mgr;mol, 82 %) zu ergeben. LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

Lävulinsäure-N-hydroxysuccinimidester (47). Disuccinimidylcarbonat (692 mg, 2,70 mmol) und Pyridin (437 &mgr;l, 2,70 mmol) wurden zu einer Lösung aus Lävulinsäure (320 mg, 2,70 mmol) in Acetonitril (2,0 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 4,5 h gerührt, wobei die Lösung klar wurde und sich Gas entwickelte. Die Lösung wurde zu Ethylacetat (10 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (2 × 5 ml) und gesättigtem wässrigen NaHCO3 (2 × 5 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um einen weißen Feststoff (333 mg, 1,56 mmol, 58 %) zu ergeben. LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-Trifluoracetyl-4-benzoylphenylalanin)aminoethyl)cyclopamin (48). Triethylamin (12,6 &mgr;l, 90,6 &mgr;mol) und 46 (20,9 mg, 45,3 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (20,6 mg, 45,3 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 8 : 1 bis 1 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Benzophenon als einen weißen Feststoff (22,7 mg, 28,3 &mgr;mol, 62 %). LRMS: nicht durchgeführt. 1 H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(4-Benzoylphenylalanin)aminoethyl)cyclopamin (49). Wässriges Ammoniak (0,5 ml einer 29%igen (Gew./Gew.) Lösung in Wasser, 7,6 mmol) wurde zu einer Lösung aus 48 (20,4 mg, 25,4 &mgr;mol) in Methanol (1 ml) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 19 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 40 : 1 : 0,1 bis 40 : 2 : 0,1 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Amin als ein farbloses Öl (17,9 mg, 25,4 &mgr;mol, quant.) LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-Lävulinoyl-(4-benzoylphenylalaninoyl))aminoethyl)cyclopamin (50). Triethylamin (5,30 &mgr;l, 38,0 &mgr;mol) und 47 (8,10 mg, 38,0 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 49 (13,4 mg, 19,0 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 4 h gerührt und dann in einem Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 40 : 1 0 bis 40 : 2 : 0,1 Chloroformn/Methanol/Triethylamin) ergab das Diketon als ein farbloses Öl (11,3 mg, 14,1 &mgr;mol, quant.). LRMS: (ES+) berechnet für C50H65N3O6 (M+H): 804; gefunden: 804. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

3-Keto-N-(N'-(N''-Lävulinoyl-(4-benzoylphenylalaninoyl))aminoethyl)cyclopamin (51). Dimethylsulfoxid (12,9 &mgr;l, 182 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus Oxalylchlorid (7,69 &mgr;l, 91,2 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) bei –78 °C zugegeben. Nachdem das Gemisch bei –78 °C für 10 min gerührt worden war, wurde eine Lösung aus 50 (5,65 mg, 7,03 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) zugegeben und die Umsetzung wurde bei –78 °C für weitere 30 min gerührt. Die Oxidation wurde durch die Zugabe von Triethylamin (38,1 &mgr;l, 273 &mgr;mol) zur Lösung abgeschlossen, welche bei –78 °C für 10 min gerührt wurde und die man dann auf Raumtemperatur aufwärmen ließ. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von gesättigtem wässrigen NaHCO3 (2 ml) gequencht, mit Chloroform (2 × 5 ml) extrahiert. Die so erhaltene organische Schicht wurde dann über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 4 : 1 bis 1 : 1 Hexan/Aceton) ergab das Keton als einen weißen Feststoff (1,4 mg, 1,75 &mgr;mol, 25 %). LRMS: (ES+) berechnet C50H63N3O6 (M+H): 802; gefunden: 802. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N,N'-(4-Benzoylbenzoyl)(tert-butoxycarbonyl)lysin (52). 4-Benzoylbenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester (50,0 mg, 147 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus tert-Butoxycarbonyllysin (43,4 mg, 176 &mgr;mol) in DMF (0,5 ml) zugegeben. 1 N NaOH (176 &mgr;l, 176 &mgr;mol) und Wasser (74 &mgr;l) wurden zu der Umsetzung zugegeben und das Gemisch wurde für 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Wieder wurde 1 N NaOH (352 &mgr;l, 352 &mgr;mol) zugegeben und die Lösung wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Wasser (2 ml) gemischt und mit Diethylether (2 × 2 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit 1 N HCl angesäuert, bis ein pH-Wert von 2 erhalten wurde, und die Lösung wurde mit Ethylacetat (2 × 2 ml) extrahiert. Die so erhaltene organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,2 bis 20 : 2 : 0,2 Chloroform/Methanol/Essigsäure) ergab das Benzophenon als ein farbloses Öl (40,0 mg, 88,0 &mgr;mol, 60 %). LRMS: (ES+) berechnet für C25H30N2O6 (M+H): 455; gefunden: 455. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N,N'-(4-Benzoylbenzoyl)(trifluoracetyl)lysin (53). Das Benzophenon 52 (3,55 mg, 78,1 &mgr;mol) wurde in Trifluoressigsäure (0,5 ml, 6,49 mmol) gelöst und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Die Trifluoressigsäure wurde dann unter einem Stickstoffgasstrom entfernt und der Rückstand wurde in Methanol (0,5 ml) resuspendiert. Nachdem Triethylamin (134,8 &mgr;l, 968 &mgr;mol) und Methyltrifluoracetat (24,3 &mgr;l, 242 &mgr;mol) zu der Methanollösung zugegeben worden waren, wurde die Umsetzung für 26 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde bis zur Trockenheit unter Vakuum eingedampft und die Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,1 bis 20 : 2 0,1 Chloroform/Methanol/Essigsäure) ergab das Trifluoracetamid als ein farbloses Öl (31,3 mg, 69,5 &mgr;mol, 89 %). LRMS: (ES+) berechnet für C22H21N2O5F3 (M+H): 451; gefunden: 451. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N,N'-(4-Benzoylbenzoyl)(trifluoracetyl)lysin-N-hydrogysuccinimidester (54). Disuccinimidylcarbonat (16,0 mg, 62,6 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 53 (28,2 mg, 62,6 &mgr;mol) und Pyridin (10,1 &mgr;l, 125 &mgr;mol) in Acetonitril (1,0 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt, wobei die Lösung klar wurde und sich Gas entwickelte. Die Lösung wurde zu Ethylacetat (10 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (1 × 2 ml) und gesättigtem, wässrigen NaHCO3 (1 × 2 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt, um ein farbloses Öl (32,8 mg, 59,9 &mgr;mol, 96 %) zu ergeben. LRMS: (ES+) berechnet für C26H24N3O7F3 (M+H): 548; gefunden: 548. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N'',N'''-(4-Benzoylbenzoyl)(trifluoracetyl)lysin)aminoethyl)cyclopamin (55). Triethylamin (8,36 &mgr;l, 60,0 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 54 (16,4 mg, 30,0 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben. Die Lösung wurde hellgelb, was die Racemisierung des &agr;-Kohlenstoffs der Aminosäure anzeigte. Eine Lösung aus 17 (13,6 mg, 30,0 &mgr;mol) in Dichlormethan (250 &mgr;l) wurde dann zu der gelben Lösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 1 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei sie farblos wurde, und Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 2 : 1 bis 1 : 2 Hexan/Aceton) ergab das Cyclopaminderivat als ein farbloses Öl (15,8 mg, 17,8 &mgr;mol, 59 %, Gemisch aus Diastereomeren). LRMS: (ES+) berechnet für C51H65N4O6F3 (M+H): 887; gefunden: 887. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(4-Benzoylbenzoyl)lysin)aminoethyl)cyclopamin (56). Die Verbindung 55 (13,0 mg, 14,7 &mgr;mol) wurde in einer 2 M Lösung aus Ammoniak in Methanol (1,0 ml, 2,00 mmol) gelöst. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 23 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,1 bis 20 : 2 : 0,1 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Amin als einen weißen, wachsartigen Feststoff (11,0 mg, 13,9 &mgr;mol, Gemisch aus Diastereomeren, 95 %). LRMS: (ES+) berechnet für C49H66N4O5 (M+H): 791; gefunden: 791. 1H NMR-Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N'',N'''-(4-Benzoylbenzoyl)(N''''-digoxigenin-3-O-methylcarbonylaminocaproyl)lysin)aminoethyl)cyclopamin (57). Digoxigenin-3-O-methylcarbonylaminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (5,0 mg, 7,59 &mgr;mol) und Triethylamin (1,59 &mgr;l, 11,4 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 56 (4,5 mg, 5,69 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben. Nachdem die Lösung für 2 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde Ethylendiamin (10 &mgr;l, 150 &mgr;mol) zugegeben und die Umsetzung wurde für zusätzliche 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Gesättigtes, wässriges NaHCO3 (2 ml) wurde zu dem Gemisch zugegeben, welches dann mit Chloroform (5 ml, dann 2 ml) extrahiert wurde. Die organischen Schichten wurden vereinigt und über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 bis 5 : 1 Dichlormethan/Methanol) ergab das Digoxigeninderivat als weißen, wachsartigen Feststoff (3,5 mg, 2,62 &mgr;mol, 46 %). LRMS: (ES+) berechnet für C80H111N5O12 (M+H): 1337; gefunden: 1337. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N'',N'''-(4-Benzoylbenzoyl)(N''''-biotinoylaminocaproyl)lysin)aminoethyl)cyclopamin (58). N-Biotinoylaminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (2,6 mg, 5,69 &mgr;mol) und Triethylamin (1,59 &mgr;l, 11,4 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 56 (4,5 mg, 5,69 &mgr;mol) in DMF (250 &mgr;l) zugegeben. Nachdem die Umsetzung für 2 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde Ethylendiamin (10 &mgr;l, 150 &mgr;mol) zur Lösung zugegeben, die für zusätzliche 15 min bei Raumtemperatur gerührt wurde. Gesättigtes wässriges NaHCO3 (2 ml) wurde zu dem Gemisch zugegeben, welches dann mit Chloroform (1 × 2 ml) extrahiert wurde. Die organischen Schichten wurden vereinigt und über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 bis 5 : 1 Dichlormethan/Methanol) ergab das Digoxigeninderivat als weißen, wachsartigen Feststoff (3,4 mg, 3,01 &mgr;mol, 53 %). LRMS: (ES+) berechnet für C65H91N7O8S (M+H): 1130; gefunden: 1130. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-Trifluoracetyl-(4-benzoylphenylalanin))aminocapronsäure (59). Eine Lösung aus Aminocapronsäure (10,8 mg, 80,5 &mgr;mol) in Wasser (100 &mgr;l) und eine Lösung aus 46 (24,4 mg, 53,7 &mgr;mol) in DMF (100 &mgr;l) wurden vereinigt und für 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde dann mit 1 N HCl angesäuert, bis ein pH-Wert von 2 erreicht wurde, zu Ethylacetat (1 ml) zugegeben und mit 1 N HCl (2 × 0,5 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft, wobei sich ein farbloses Öl (25,9 mg, 54,1 &mgr;mol, quant.) ergab. LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-Trifluoracetyl(4-benzoylphenylalanin))aminocapronsäure-N-hydrogysuccinimidester (60). Disuccinimidylcarbonat (18,7 mg, 73,0 &mgr;mol) wurde zu einer Lösung aus 59 (23,3 mg, 48,7 &mgr;mol) und Pyridin (7,88 &mgr;l, 97,4 &mgr;mol) in Acetonitril (200 &mgr;l) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 12 h gerührt, wobei die Lösung klar wurde und sich Gas entwickelte. Die Lösung wurde zu Ethylacetat (1 ml) zugegeben, mit 1 N HCl (1 × 0,5 ml) und gesättigtem wässrigen NaHCO3 (1 × 0,5 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und bis zur Trockenheit durch einen Stickstoffgasstrom eingedampft, wobei sich ein farbloses Öl (26,4 mg, 45,9 &mgr;mol, 94 %) ergab. LRMS: nicht durchgeführt.1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-(N'''-Trifluoracetyl(4-benzoylphenylalaninoyl))aminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (61). Die Verbindung 60 (23,8 mg, 41,4 &mgr;mol) und Triethylamin (11,5 &mgr;l, 82,8 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 17 (15,7 mg, 34,5 &mgr;mol) in Dichlormethan (0,5 ml) zugegeben. Die Umsetzung wurde für 1 h bei Raumtemperatur gerührt und Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 2 : 1 bis 1 : 2 Hexan/Aceton) ergab das Benzophenonderivat als farbloses Öl (5,3 mg, 5,79 &mgr;mol, 17 %). LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-(4-Benzoylphenylalaninoyl)aminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (62). Wässriges Ammoniak (250 &mgr;l einer 29%igen (Gew./Gew.) Lösung in Wasser, 3,80 mmol) wurde zu einer Lösung aus 61 (5,3 mg, 5,79 &mgr;mol) in Methanol (200 &mgr;l) zugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 18 h gerührt und dann durch einen Stickstoffgasstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Reinigung durch Flash-Chromatographie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,05 bis 20 : 2 : 0,05 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Amin als ein farbloses Öl (4,0 mg, 4,88 &mgr;mol, 84 %). LRMS: nicht durchgeführt. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

N-(N'-(N''-(N'''-(N'''-Biotinoylaminocaproyl)(4-benzoylphenylalaninoyl))aminocaproyl)aminoethyl)cyclopamin (63). N-Biotinoylaminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (2,7 mg, 5,86 &mgr;mol) und Triethylamin (1,4 &mgr;l, 9,76 &mgr;mol) wurden zu einer Lösung aus 62 (4,0 mg, 4,88 &mgr;mol) in DMF (250 &mgr;l) zugegeben. Nachdem die Umsetzung für 15 min bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde sie zu Chloroform (2 ml) zugegeben, mit gesättigtem, wässrigen NaHCO3 gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Reinigung durch Flash-Chromatograpie (SiO2, schrittweiser Gradient von 20 : 1 : 0,05 bis 20 : 4 : 0,05 Chloroform/Methanol/Triethylamin) ergab das Biotinderivat als einen weißen Feststoff (4,5 mg, 3,88 &mgr;mol, 80 %). LRMS: (ES+) berechnet für C67H95N7O8S (M+H): 1158; gefunden: 1158. 1H NMR: Spektrum stimmt mit der vorhergesagten Struktur überein.

Beispiel 3: Testen in vivo

Verfahren: Weibliche nackte Mäuse wurden mit 5 Millionen P2A6-Fibrosarkornzellen, abgeleitet aus Ptc-/- embryonalen Fibroblasten, subkutan injiziert. Drei Wochen nach der Injektion hatte jede Maus einen einzelnen subkutanen Tumor entwickelt. Jeder Tumor wurde gemessen und die Behandlungen wurden am gleichen Tag begonnen. Die Mäuse wurden einmal täglich mit intraperitonealen Injektionen von Tomatidin, Cyclopamin oder KAAD-Cyclopamin 33 (eine Maus pro Behandlung) für vier Tage behandelt. Die Mäuse wurden getötet und die Tumore wurden gemessen und für die histopathologische Analyse seziert. Die Tumorvolumen wurden als das Produkt von Länge × Breite berechnet. Die Proben wurden in Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet, und es wurden Objektträgerschnitte für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung und zur Immunohistochemie mit polyklonalen Antikörpern gegen den Proliferationsmarker Ki-67 (Novacastra NCL-Ki67p; Test wurde gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt) angefertigt.

Ergebnisse: Wie in der Grafik dargestellt, führte die Kontrollbehandlung mit Tomatidin zu einem 17 %igen Tumorwachstum über den Behandlungszeitraum, wohingegen die Behandlung mit Cyclopamin die Tumorgröße um 0,14 % verringerte und die Behandlung mit KAAD-Cyclopamin 33 die Tumorgröße um 19 % verringerte.

Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden Ki-67 Proliferationsraten durch einen Pathologen bestimmt, der blind gegenüber den Behandlungsbedingungen war. Die tiefroten Balken in der Graphik zeigen Proliferationsraten für die drei Behandlungen. Die Proliferationsraten für die mit Tomatidin, Cyclopamin und KAAD-Cyclopamin behandelten Tumore betrugen 30 %, 16 % beziehungsweise 12 %.

Da die Differenzierung vieler Tumore mit der Prognose in Beziehung steht, wurde der Differenzierungsstatus des Tumors untersucht. Alle Tumore zeigten zonale Variation in der Differenzierung, wie in den Mikrofotographien von 7 veranschaulicht. Verglichen mit den weniger gut differenzierten Tumoren weisen die gut differenzierten Fibrosarkome kleinere, weniger volle Kerne auf, welche durch relativ reichliches pinkfarbenes Collagen abgetrennt sind. Wie veranschaulicht, zeigten die mit KAAD-Cyclopamin und Cyclopamin (nicht gezeigt) behandelten Tumore einen größeren Differenzierungsgrad als die mit Tomatidin behandelte Kontrolle.


Anspruch[de]
Verbindung der allgemeinen Formel (IV) oder der allgemeinen Formel (V) oder ungesättigte Formen oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon: wobei

R2 unabhängig bei jedem Vorkommen einen oder mehrere Substituenten an dem Ring, an den es gebunden ist, bedeutet, ausgewählt aus Wasserstoff, Halogenatomen, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Arylresten, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Aminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonyl-, Carboxylgruppen, Carboxamiden, Anhydriden, Silylgruppen, Ethern, Thioethern, Alkylsulfonylen, Arylsulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern, Zucker, Carbamat, Carbonat oder -(CH2)m-R8;

R3 unabhängig bei jedem Vorkommen einen oder mehrere Substituenten an dem Ring, an den es gebunden ist, bedeutet, ausgewählt aus Wasserstoff, Halogenatomen, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Arylresten, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Aminen, Iminen, Aminen, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonyl-, Carboxylgruppen, Carboxamiden, Anhydriden, Silylgruppen, Ethern, Thioethern, Alkylsulfonylen, Arylsulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern oder -(CH2)m-R8;

R4 und R5 unabhängig bei jedem Vorkommen abwesend sind oder einen oder mehrere Substituenten an dem Ring, an den sie jeweils gebunden sind, bedeuten, ausgewählt aus Wasserstoff, Halogenatomen, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Arylresten, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Aminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonyl-, Carboxylgruppen, Carboxamiden, Anhydriden, Silylgruppen, Ethern, Thioethern, Alkylsulfonylen, Arylsulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern oder -(CH2)m-R8;

R6 abwesend ist oder unabhängig Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Carboxamid, Anhydrid, Silyl, Ether, Thioether, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R8 bedeutet;

R8 ein Aryl, ein Cycloalkyl, ein Cycloalkenyl, einen Heterocyclus oder einen Polycyclus bedeutet;

R9 abwesend ist oder unabhängig bei jedem Vorkommen einen oder mehrere Substituenten an dem Ring, an den es gebunden ist, bedeutet, ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyl, =O, =S, Alkoxyl, Silyloxy, Amino, Nitro, Thiol, Amin, Imin, Amid, Phosphonat, Phosphin, Carbonyl, Carboxyl, Carboxamid, Anhydrid, Silyl, Ether, Thioether, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Selenoether, Keton, Aldehyd, Ester oder -(CH2)m-R8;

R22 abwesend ist oder ein Alkyl, ein Alkoxyl oder -OH bedeutet; und

m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis einschließlich 8 ist,

wobei mindestens ein Vorkommen von R9 ein außerhalb des Rings befindlicher Substituent ist, der an N gebunden ist, wodurch ein tertiäres Amin gebildet wird, und dieses Vorkommen von R9 ein Alkyl, substituiert mit einem Acylamino, ist,

wobei Alkyl gesättigte aliphatische Gruppen, geradkettige Alkylreste, verzweigte Alkylreste, Cycloalkylreste, Alkyl-substituierte Cycloalkylreste und Cycloalkyl-substituierte Alkylreste bedeutet, bei denen es sich um substituierte oder unsubstituierte Alkylreste handelt,

wobei Amin und Amino sowohl substituierte als auch unsubstituierte Amine und Aminogruppen bedeutet;

wobei Heterocyclus sich auf 3- bis 10-gliedrige Ringstrukturen bezieht, wobei die Ringstrukturen ein bis vier Heteroatome beinhalten.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei:

R2 =O, Zucker, Carbamat, Ester, Carbonat oder Alkoxy bedeutet;

R3 bei jedem Vorkommen eine -OH-Gruppe, Alkyl, -O-Alkyl, -C(O)-Alkyl oder -C(O)-R8 bedeutet;

R4 bei jedem Vorkommen abwesend ist oder -OH, =O, Alkyl, -O-Alkyl, -C(O)-Alkyl oder -C(O)-R8 bedeutet; und

R5 bei jedem Vorkommen abwesend ist oder -OH, =O oder Alkyl bedeutet.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Basalzellenkarzinom. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Medikament zur lokalen Verabreichung an einen Tumor bestimmt ist. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Regulierung der Differenzierung oder der Proliferation einer Zelle. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Kontrolle des Wachstums oder der Entwicklung von Pankreasgewebe. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Medulloblastoms. Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Medikament zur lokalen Verabreichung an einen Tumor bestimmt ist. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer hyperproliferativen Störung. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Medikament zur topischen Verabreichung bestimmt ist. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Medikament zur lokalen Verabreichung bestimmt ist. Arzneimittel umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (IV) und (V) wie in den Ansprüchen 1 und 2 definiert bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des Hedgehog-Signalwegs oder Entgegenwirkung eines ptc-Funktionsverlust-Phänotyps oder eines Smoothened-Funktionsgewinn-Phänotyps. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der außerhalb des Rings befindliche Substituent hydrophob ist. Verwendung nach Anspruch 14, wobei der außerhalb des Rings befindliche Substituent einen Aryl-, Heteroaryl-, Carbocyclyl-, Heterocyclyl- oder Polycyclylrest beinhaltet. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der außerhalb des Rings befindliche Substituent einen polycyclischen Rest, ausgewählt aus Biotin, einem zwitterionischen Borkomplex und einem steroiden Polycyclus, beinhaltet. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Verbindung die durch ptc-Funktionsverlust oder Smoothened-Funktionsgewinn vermittelte Signalübertragung mit einem ED50-Wert von 1 mM oder weniger hemmt. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Verbindung die durch ptc-Funktionsverlust oder Smoothened-Funktionsgewinn vermittelte Signalübertragung mit einem ED50-Wert von 1 &mgr;M oder weniger hemmt. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Verbindung die durch ptc-Funktionsverlust oder Smoothened-Funktionsgewinn vermittelte Signalübertragung mit einem ED50-Wert von 1 nM oder weniger hemmt. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (IV) und (V) wie in dem Ansprüchen 1 und 2 definiert bei einer kosmetischen Anwendung. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die kosmetische Anwendung aus der Regulierung des Haut- und Haarwachstums ausgewählt ist.






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