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Dokumentenidentifikation DE69834046T2 11.01.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001007627
Titel EXTRAZELLULÄRE SERINPROTEASE
Anmelder The Board of Trustees of the University of Arkansas, Little Rock, Ark., US
Erfinder O'BRIEN, J., Timothy, Little Rock, AR 72227, US;
UNDERWOOD, J., Lowell, Little Rock, AR 72205, US
Vertreter Lederer & Keller, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69834046
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 21.08.1998
EP-Aktenzeichen 989457643
WO-Anmeldetag 21.08.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/17372
WO-Veröffentlichungsnummer 1999009138
WO-Veröffentlichungsdatum 25.02.1999
EP-Offenlegungsdatum 14.06.2000
EP date of grant 29.03.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.01.2007
IPC-Hauptklasse C12N 1/21(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 9/48(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 9/50(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 9/64(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/55(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/63(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Zellbiologie und der Diagnose neoplastischer Erkrankungen. Insbesondere betrifft diese Erfindung eine neue extrazelluläre Serinprotease, die Tumor Antigen Derived Gene-14 (TADG-19) genannt wird.

Beschreibung des Standes der Technik

Extrazelluläre Proteasen hängen direkt mit dem Tumorwachstum, der Ablösung von Tumorzellen bzw. Migration von Tumorzellen und der Invasion von Zielorganen zusammen. Einzelne Klassen von Proteasen sind (1) an dem Abbau des den anfänglichen Tumorbereich umgebenden Stromas, (2) am Abbau der Zelladhäsionsmoleküle, was die Dissoziation von Tumorzellen erlaubt, und (3) an der Invasion der Basismembran beim metastatischen Wachstum und der Aktivierung von sowohl Tumorwachstumsfaktoren als auch angiogenen Faktoren sowie anderen Vorgängen beteiligt.

Der Stand der Technik ist dahingehend unzureichend, dass wirksame Screeningtechniken zur Identifizierung von Proteasen, die beim Karzinom überexprimiert werden, fehlen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen im Fachgebiet seit langem bestehenden Bedarf.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung offenbart ein Screeningsystem zur Identifizierung von bei Karzinomen überexprimierten Proteasen durch Untersuchung von PCR-Produkten, die aus Tumoren im frühen Stadium, metastatischen Tumoren und normalem Ovarienepithel amplifiziert werden.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine ein TADG-14-Protein codierende DNA bereitgestellt, die aus der Gruppe, bestehend aus (a) isolierter DNA, die ein TADG-14-Protein codiert, (b) isolierter DNA, die mit der vorstehenden isolierten DNA von (a) hybridisiert und die ein TADG-14-Protein codiert, und (c) isolierter DNA, die sich von den vorstehenden isolierten DNAs von (a) und (b) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes in der Codon-Sequenz unterscheidet und die ein TADG-14-Protein codiert, ausgewählt ist.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der zur Expression der DNA der vorliegenden Erfindung befähigt, zur Expression in einer rekombinanten Zellen angepasst ist und für die Expression der DNA in der Zelle erforderliche Regulationselemente umfasst.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit dem Vektor der vorliegenden Erfindung transfiziert ist, wobei der Vektor ein TADG-14-Protein exprimiert.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Expression einer TADG-14-mRNA bereitgestellt, das die Schritte (a) In-Kontakt-Bringen von mRNA, die aus der Zelle erhalten wurde, mit der markierten Hybridisierungssonde und (b) Detektieren der Hybridisierung der Sonde mit der mRNA umfasst.

Andere und weitere Gesichtspunkte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der nachfolgenden Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die zum Zwecke der Offenbarung angegeben sind, ersichtlich.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Damit der Gegenstand, in welchem die vorstehend genannten Merkmale, Vorteile und Ziele der Erfindung sowie andere, die ersichtlich werden, enthalten sind, bereitgestellt und im Einzelnen verstanden werden kann, werden genauere Beschreibungen der vorstehend kurz zusammengefassten Erfindung mit Bezug auf bestimmte Ausführungsformen davon, die in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht werden, bereitgestellt. Diese Zeichnungen bilden einen Teil der Spezifikation. Es wird jedoch darauf aufmerksam gemacht, dass die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen und daher nicht als den Schutzbereich einschränkend anzusehen sind.

1 zeigt einen Vergleich von PCR-Produkten, die von normaler und Karzinom-cDNA abgeleitet sind, nach Färbung in einem Agarosegel. Es lagen zwei getrennte Banden (Spur 2) beim Primerpaar Sense-His-Antisense-Asp (AS1) vor und es wurden multiple Banden mit etwa 500 Basenpaaren in der Karzinomspur beim Primerpaar Sense-His-Antisense-Ser (AS2) (Spur 4) beobachtet.

2 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen katalytischer Domänen von TADG-14.

3 zeigt die Überexpression von TADG-14 in Ovarkarzinomen.

4 zeigt die TADG-14-Expression in Tumoren und Zelllinien.

5 zeigt Blots der TADG-14-Expression in fötalen, adulten und Ovarkarzinomgeweben.

6 zeigt die vollständige Sequenz des TADG-14-Transkripts, einschließlich des offenen Leserasters und üblicher Domänen.

7 zeigt die Homologie zwischen TADG-14 und Neuropsin der Maus. Es ergab sich eine Identität von ungefähr 76% im offenen Leseraster und eine geringe Homologie außerhalb des offenen Leserasters.

8 zeigt die Aminosäurehomologie zwischen TADG-19 und Neuropsin der Maus.

9 zeigt die Northern-Blot-Analyse. (9A) Boten-RNA wurde aus interessierenden Geweben isoliert und der Northern-Hybridisierung unter Verwendung eines zufällig markierten, für TADG14 spezifischen RT-PCR-Produkts mit 230 Bp unterworfen. Der Blot wurde gestrippt und mit einer Sonde für &bgr;-Tubulin hybridisiert. (9B, 9C, 9D) Northern Blots mit verschiedenen Geweben (Clontech) wurden mit den gleichen TADG14- und &bgr;-Globulin-spezifischen RT-PCR-Produkten hybridisiert. Die TADG14-mRNA wurde als Transkript mit 1,4 kB in Tumoren detektiert, und sie wurde in keinem der untersuchten normalen Geweben nachgewiesen.

10 zeigt die cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz von TADG14 und einen Vergleich der vorhergesagten TADG14-Sequenz mit bekannten Proteasen. Die cDNA-Sequenz von TADG14 ist zusammen mit der abgeleiteten Sequenz von 260 Aminosäuren gezeigt, die unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes für jeden Rest dargestellt ist. Innerhalb der cDNA stellen unterstrichene Teile die Kozak-Konsensussequenz zur Translationsinitiation bzw. das Polyadenylierungssignal dar. Die TADG14-Proteinsequenz enthält eine Sekretionssignalsequenz nahe dem Aminoterminus (grün schraffiert). Die kritischen Reste der katalytischen Triade sind durch gelbe Schattierung angezeigt, während eine potentielle Glycosylierungsstelle durch violette Schattierung markiert ist. Das Stopp-Codon ist durch das Symbol (*) dargestellt. Unter Verwendung des Programms GCG PILEUP (REF) wurde die Aminosäuresequenz von TADG14 mit humanem glandulärem Kallikrein (hHk2, Zugriffs-Nr. P06870), humanem PSA (hPSA, Zugriffs-Nr. P07288), Neuropsin der Maus (mNeur, Zugriffs-Nr. D30785) und humaner Protease M (hProM, Zugriffs-Nr. U62801) verglichen. In mindestens drei der fünf Sequenzen identische Aminosäurereste sind grün schattiert. Gelb schattierte Reste stellen Aminosäuren dar, die bei mindestens drei Sequenzen ähnlich sind. Die Positionen der Reste der katalytischen Triade sind markiert.

11 zeigt die quantitative TADG14-PCR. Es sind typische Resultate eines quantitativen TADG14-PCR-Experiments gezeigt (11A). Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 2% Agarose-TAE-Gel elektrophoretisch getrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. In dieser Figur ist die Bande mit 954 Bp das &bgr;-Tubulin-Produkt und die Bande mit 230 Bp das TADG14-Produkt. Die radiomarkierten PCR-Produkte wurden quantifiziert (11B). Gemäß der Bestimmung durch den Student's-t-Test waren die TADG14-mRNA-Expressionsspiegel in LMP-Tumoren (*, P = 0,05) und Karzinomen (P < 0,0001) im Vergleich zu in normalen Ovarien festgestellten Spiegeln deutlich erhöht. Einzelne Fälle sind in einer Punktwolke dargestellt. Dies zeigt die Heterogenität der TADG14-Expression in diesen Tumorproben.

12 zeigt einen Western-Blot. Es wurden polyklonale Antikörper durch Immunisierung von Kaninchen mit einem von drei mit Polylysin verknüpften Mehrfachantigenpeptiden, die anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz von TADG14 erzeugt wurden, hergestellt. Diese Sequenzen sind KYTRVRLGDHSLQ (T14-1), GHECQPHSQPWQ (T14-2) und LDWIKKIIGSKG (T14-3). (A) Für die Western-Blot-Analyse wurden ungefähr 20 g MDA-MB-435S- und HeLa-Zell-Lysate auf einem 15% SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und auf PVDF bei 100 V für 40 Minuten bei 4°C elektrogeblottet. Der Blot wurde über Nacht in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), pH 7,8, enthaltend 0,2% fettfreie Milch, blockiert. Der Primärantikörper wurde zu der Membran bei einer Verdünnung von 1:100 in 0,2% Milch/TBS gegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Blot wurde gewaschen und mit einer 1:3000-Verdünnung mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege- und Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Bio-Rad) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Blot wurde gewaschen und mit einem Chemilumineszenzsubstrat (Bio-Rad) inkubiert, bevor er für 10 Sekunden zur Visualisierung auf einen Röntgenfilm aufgelegt wurde.

13 zeigt Immunhistochemieexperimente. Die Färbung erfolgte mit dem TADG19-1-Antikörper bei normalen Ovarien, zwei serösen Karzinomen, Schleimhautkarzinom, endometriosem Karzinom und klarem Zellkarzinom der Ovarien (A, B, C, D, E bzw. F). Bei normalen Ovarien wurde keine Färbung beobachtet. Das in B gezeigte seröse Karzinom weist TADG19 am stärksten mit der Oberfläche des Tumors assoziiert auf, während im serösen Tumor in C TADG19 in granulärer Form in einem ersichtlichen Sekretionsweg zu finden ist. Im Schleimhautkarzinom scheint TADG14 entlang der invasiven Front des Tumors am höchsten exprimiert zu werden. TADG14 wird in das Lumen der glandulären Struktur sezerniert, die durch das endometrioide Karzinom in E gebildet wird. Das in der Teilfigur F gefärbte klare Zellkarzinom zeigt eine diffuse Färbung über sämtliche Tumorzellen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN

Vorliegend bezieht sich der Ausdruck „cDNA" auf die DNA-Kopie des mRNA-Transkripts eines Gens.

Vorliegend bedeutet der Ausdruck „abgeleitete Aminosäuresequenz" die durch Ablesen der Triplet-Sequenz der Nukleotidbasen in der cDNA bestimmte Aminosäuresequenz.

Vorliegend bezieht sich der Ausdruck „Screening einer Bibliothek" auf den Prozess der Verwendung einer markierten Sonde, um zu prüfen, ob unter den geeigneten Bedingungen eine zu der Sonde komplementäre Sequenz in einer bestimmten DNA-Bibliothek vorliegt. Außerdem könnte das „Screenen einer Bibliothek" auch mittels PCR durchgeführt werden.

Vorliegend bezieht sich der Ausdruck „PCR" auf die Polymerase-Kettenreaktion, die Gegenstand der U.S.-Patente Nr. 4,683,195 und 4,632,202 von Mullis ist, sowie andere derzeit im Stand der Technik bekannte Verbesserungen.

Die TADG-14-cDNA ist 1343 Basenpaare lang (SEQ ID NO: 6) und codiert für ein Protein mit 260 Aminosäuren (SEQ ID NO: 7). Die Verfügbarkeit des TADG-14-Gens eröffnet den Weg für eine Anzahl von Untersuchungen, die zu verschiedenen Anwendungen führen können. Liegt beispielsweise das TADG-19-Gen einer spezifischen menschlichen genetischen Erkrankung zugrunde, kann die cDNA als Basis für einen diagnostischen Prognosetest dienen.

Erfindungsgemäß können übliche molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken, die einem Fachmann bekannt sind, eingesetzt werden. Derartige Techniken sind in der Literatur vollständig beschrieben. Siehe beispielsweise Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); „DNA Cloning: A Practical Approach", Bände I und II (D.N. Glover Hrsg. 1985); „Oligonucletide Synthesis" (M.J. Gait Hrsg. 1989); „Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. (1985)]; „Transcription and Translation" [B.D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. (1984)]; „Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, Hrsg. (1986)]; „Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press (1986)]; B. Perbal „A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984).

Falls vorliegend verwendet, sind daher die folgenden Ausdrücke wie nachstehend angegeben definiert.

Die vorliegend beschriebene Aminosäure liegt vorzugsweise in der isomeren „L"-Form vor. Es können jedoch Reste in der isomeren „D"-Form beliebige L-Aminosäurereste ersetzen, solange die erwünschte funktionelle Eigenschaft der Immunglobulinbindung im Polypeptid erhalten bleibt. NH2 bezieht sich auf die am Aminoterminus eines Polypeptids befindliche Aminogruppe. COOH bezieht sich auf die am Carboxyterminus eines Polypeptids vorhandene Carboxygruppe. Zur Einhaltung der Polypeptid-Standardnomenklatur werden die Abkürzungen für Aminosäuren gemäß J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969) verwendet.

Es wird darauf hingewiesen, dass sämtliche Aminosäurerestsequenzen vorliegend durch Formeln dargestellt werden, deren Schreibweise von Links nach Rechts in der üblichen Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus vorliegt. Des Weiteren wird darauf hingewiesen, dass ein Bindestrich am Anfang oder Ende einer Aminosäurerestsequenz eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz mit einer oder mehreren Aminosäureresten anzeigt. Die vorstehende Tabelle ist dargestellt, um die Drei-Buchstaben- und Ein-Buchstaben-Bezeichnungen gegenüberzustellen, die vorliegend abwechselnd erscheinen können.

Ein „Replicon" ist ein beliebiges genetisches Element (z. B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als autonome Einheit bei der DNA-Replikation in vivo wirkt, d. h. zur Replikation unter der eigenen Kontrolle befähigt ist.

Ein „Vektor" ist ein Replicon wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, mit dem ein weiteres DNA-Segment verknüpft werden kann, so dass die Replikation des verknüpften Segments bewirkt wird.

Ein „DNA-Molekül" bezeichnet die polymere Form von Desoxyribonukleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) entweder in der einzelsträngigen Form oder als doppelsträngige Helix. Dieser Ausdruck bezieht sich ausschließlich auf die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und schränkt es nicht auf eine beliebige bestimmte tertiäre Form ein. Somit schließt dieser Ausdruck doppelsträngige DNA, die unter anderem in linearen DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen zu finden ist, ein. Bei der vorliegenden Diskussion der Struktur wird gemäß der üblichen Konvention nur die Sequenz in der 5'- nach 3'-Richtung entlang des nicht-transkribierten DNA-Strangs (d. h. der Strang mit einer zur mRNA homologen Sequenz) angegeben.

Ein „Replikationsursprung" bezieht sich auf diejenigen DNA-Sequenzen, die an der DNA-Synthese beteiligt sind.

Eine „codierende DNA-Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die transkribiert wird und in ein Polypeptid in vivo translatiert wird, wenn sie der Steuerung durch geeignete Regulationssequenzen unterliegt. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'-(Amino-)Terminus und ein Translationsstoppcodon am 3'-(Carboxyl-)Terminus bestimmt. Eine codierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA aus eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryotischer (z. B. Säuger-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz befindet sich üblicherweise in 3' zur codierenden Sequenz.

Sequenzen zur Kontrolle der Transkription und Translation sind DNA-Regulationssequenzen wie Promotoren, Enhancer bzw. Verstärker, Polyadenylierungssignale, Terminatoren und ähnliche, welche die Expression einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle gewährleisten.

Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-Regulationsregion, die zur Bindung von RNA-Polymerase in einer Zelle und Initiation der Transkription einer stromabwärts (in 3'-Richtung) befindlichen codierenden Sequenz befähigt ist. Zum Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung wird die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle begrenzt, und sie erstreckt sich stromaufwärts (in 5'-Richtung) über die minimale Anzahl von Basen oder Elementen, die zur Initiation von Transkriptionsspiegeln, die über den Hintergrund detektierbar sind, erforderlich sind. Innerhalb der Promotorsequenz sind eine Transkriptionsinitiationsstelle sowie Proteinbindungsdomänen (Konsensussequenzen) vorhanden, die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren enthalten oft aber nicht immer „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen. Prokaryotische Promotoren enthalten Shine-Dalgarno-Sequenzen zusätzlich zu den -10- und -35-Konsensussequenzen.

Eine „Expressionskontrollsequenz" ist eine DNA-Sequenz, welche die Transkription und Translation einer anderen DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert. Eine codierende Sequenz befindet sich „unter der Kontrolle" von Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche dann in das Protein, das durch die codierende Sequenz codiert wird, translatiert wird.

Es kann eine „Signalsequenz" nahe der codierenden Sequenz vorliegen. Diese Sequenz codiert, N-terminal zum Polypeptid, ein Signalpeptid, welches der Wirtszelle mitteilt, dass das Polypeptid zur Zelloberfläche dirigiert wird oder das Polypeptid in das Medium sezerniert wird, und dieses Signalpeptid wird von der Wirtszelle abgespalten, bevor das Protein die Zelle verlässt. Signalsequenzen können mit verschiedenen prokaryotischen oder eukaryotischen Proteinen assoziiert vorliegen.

Der Ausdruck „Oligonukleotid", wie vorliegend in Bezug auf die Sonde der vorliegenden Erfindung verwendet, ist als ein Molekül aus zwei oder mehreren Ribonukleotiden, vorzugsweise mehr als drei, definiert. Seine genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, die wiederum von der endgültigen Funktion und Verwendung des Oligonukleotids abhängen.

Der Ausdruck „Primer", wie vorliegend verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, ob natürlich auftretend, wie in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder synthetisch produziert, das dazu befähigt ist, als Syntheseinitiationspunkt zu dienen, wenn es Bedingungen unterworfen wird, durch welche die Synthese eines Primerextensionsprodukts, das zu einem Nukleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird, d. h. in Gegenwart von Nukleotiden und einem induzierenden Mittel wie einer DNA-Polymerase und einer geeigneten Temperatur und geeignetem pH. Der Primer kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und muss ausreichend lang sein, um die Synthese des erwünschten Extensionsprodukts in Gegenwart des induzierenden Mittels zu starten. Die genaue Länge des Primers hängt von vielen Faktoren, einschließlich Temperatur, Quelle des Primers und Verwendung des Verfahrens, ab. Beispielsweise enthält der Oligonukleotidprimer bei diagnostischen Anwendungen in Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz 15 bis 25 oder mehr Nukleotide, obwohl er weniger Nukleotide enthalten kann.

Die vorliegenden Primer sind derart gewählt, dass sie zu verschiedenen Strängen einer bestimmten Ziel-DNA-Sequenz „im Wesentlichen" komplementär sind. Dies bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Daher braucht die Primersequenz nicht die exakte Sequenz der Matrize widerzuspiegeln. Beispielsweise kann ein nichtkomplementäres Nukleotidfragment an das 5'-Ende des Primers angefügt werden, wobei der Rest der Primersequenz zu dem Strang komplementär ist. In einer anderen Ausführungsform können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen mit der Maßgabe in den Primer eingefügt werden, dass die Primersequenz eine ausreichende Komplementarität mit der Sequenz aufweist oder damit hybridisiert und dadurch die Matrize für die Synthese des Extensionsprodukts bildet.

Vorliegend beziehen sich die Ausdrücke „Restriktionsendonukleasen" und „Restriktionsenzyme" auf Enzyme, von denen jedes doppelsträngige DNA in oder nahe bei einer spezifischen Nukleotidsequenz schneidet.

Eine Zelle wurde mit exogener oder heterologer DNA „transformiert", wenn derartige DNA in die Zelle eingeführt wurde. Die transformierende DNA kann in das Genom der Zelle integriert (damit kovalent verknüpft) werden oder auch nicht. In Prokaryoten, Hefen und Säugerzellen wird die transformierende DNA beispielsweise auf einem episomalen Element wie einem Plasmid gehalten. Bei eukaryotischen Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine solche, in welcher die transformierende DNA in ein Chromosom integriert wurde, so dass sie an die Tochterzellen durch die Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Befähigung der eukaryotischen Zellen zur Erzeugung von Zelllinien oder Klonen, die eine Population von Tochterzellen enthalten, welche die transformierende DNA aufweisen, demonstriert. Ein „Klon" ist eine Zellpopulation, die sich von einer einzelnen Zelle oder Vorfahr durch Mitose ableitet. Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer primären Zelle, die in vitro zu einem stabilen Wachstum für viele Generationen befähigt ist.

Zwei DNA-Sequenzen sind „im Wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 75 (vorzugsweise mindestens etwa 80% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90 oder 95%) der Nukleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen übereinstimmen. Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können durch Vergleich der Sequenzen unter Verwendung von in Sequenzdatenbanken erhältlicher Standardsoftware oder in einem Sothern-Hybridisierungsexperiment unter beispielsweise stringenten Bedingungen, wie sie für das jeweilige System definiert sind, identifiziert werden. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist einem Fachmann bekannt. Siehe beispielsweise Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Bände I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Eine „heterologe" Region des DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, das in der Natur nicht in Assoziation mit dem größeren Molekül zu finden ist. So wird, wenn die heterologe Region ein Säugergen codiert, das in üblicher Weise durch DNA flankiert, welche die genomische Säuger-DNA im Genom des Quellorganismus nicht flankiert. In einem anderen Beispiel ist die codierende Sequenz ein Konstrukt, in welchem die codierende Sequenz selbst in der Natur nicht vorkommt (z. B. eine cDNA, bei der die genomische codierende Sequenz Introns enthält, oder synthetische Sequenzen mit vom nativen Gen abweichenden Codons). Allelvariationen oder natürlicherweise auftretende Mutationsereignisse ergeben keine wie vorliegend definierte heterologe DNA-Region.

Die üblicherweise für diese Untersuchungen verwendeten Markierungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden, und andere. Es sind eine Anzahl von fluoreszierenden Stoffen bekannt und können als Markierungen verwendet werden. Diese schließen beispielsweise Fluorescein, Rhodamin, Auramin, Texas-Rot, AMCA-Blau und Lucifer-Gelb ein. Ein bestimmtes Detektionsmaterial ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper, der in Ziegen hergestellt wird, und mit Fluorescein über ein Isothiocyanat konjugiert ist.

Proteine können auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert werden. Die radioaktive Markierung kann durch beliebige der derzeit verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann aus 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I und 186Re ausgewählt werden.

Enzymmarkierungen sind in ähnlicher Weise geeignet und können durch beliebige der gegenwärtig verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen Techniken nachgewiesen werden. Das Enzym ist mit dem ausgewählten Partikel bzw. Teilchen durch Reaktion mit Verbrückungsmolekülen wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und ähnlichen konjugiert. Viele Enzyme, die in diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können eingesetzt werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, &bgr;-Glucuronidase, &bgr;-Glucosidase, &bgr;-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase. Es wird beispielhaft auf die U.S.-Patentnummern 3,654,090, 3,850,752 und 4,016,043 hinsichtlich ihrer Offenbarung verschiedener Markierungsstoffe und -verfahren Bezug genommen.

Ein bestimmtes Testsystem, das im Fachgebiet entwickelt und verwendet wurde, ist als Rezeptortest bekannt. In einem Rezeptortest wird das zu testende Material in geeigneter Weise markiert, und dann werden bestimmte Testzellkolonien mit einer Menge der Markierung beimpft, wonach Bindungsuntersuchungen durchgeführt werden, um das Ausmaß zu bestimmen, bis zu welchem das markierte Material an die Zellrezeptoren bindet. Auf diese Weise können Unterschiede in den Affinitäten zwischen den Materialien festgestellt werden.

Ein im Fachgebiet geeigneter Test ist als „Cis/Trans"-Test bekannt. Kurz beschrieben, verwendet dieser Test zwei genetische Konstrukte, wobei eines typischerweise ein Plasmid ist, das einen bestimmten interessierenden Rezeptor kontinuierlich exprimiert, wenn es in eine geeignete Zelllinie transfiziert wird, und das zweite ein Plasmid ist, das einen Reporter wie Luciferase unter Kontrolle eines Rezeptor/Liganden-Komplexes exprimiert. Falls es beispielsweise erwünscht ist, eine Verbindung als Ligand eines bestimmten Rezeptors zu bewerten, wäre eines der Plasmide ein Konstrukt, das in der Expression des Rezeptors in der gewählten Zelllinie resultiert, während das zweite Plasmid das Luciferasegen verknüpft mit einem Promotor aufweisen würde, in welches das Reaktionselement auf den jeweiligen Rezeptor eingefügt ist. Falls die zu testende Verbindung ein Agonist des Rezeptors ist, bildet der Ligand einen Komplex mit dem Rezeptor, und der resultierende Komplex bindet das Reaktionselement und initiiert die Transkription des Luciferasegens. Dann wird die resultierende Chemilumineszenz photometrisch gemessen, und es werden Dosis-Antwort-Kurven erhalten und mit denjenigen von bekannten Liganden verglichen. Das vorstehende Protokoll wird im Einzelnen im U.S.-Patent Nr. 9,981,784 beschrieben.

Wie vorliegend verwendet, bedeutet der Ausdruck „Wirt" nicht nur Prokaryoten sondern auch Eukaryoten wie Hefe-, Pflanzen- und Tierzellen. Ein rekombinantes DNA-Molekül oder Gen, das ein humanes TADG-14-Protein der vorliegenden Erfindung codiert, kann zur Transformation eines Wirts unter Verwendung beliebiger einem Fachmann bekannter üblicher Techniken verwendet werden. Für die Zwecke der prokaryotischen Transformation ist die Verwendung eine Vektors, der die codierenden Sequenzen für das Gen, welches ein humanes TAGD-14-Protein der vorliegenden Erfindung codiert, enthält, besonders bevorzugt.

Prokaryotische Wirte können E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Eukaryotische Wirte schließen Hefen wie Pichia pastoris, Säugerzellen und Insektenzellen ein.

Im Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten, welche die wirksame Transkription des eingefügten DNA-Fragments erleichtern, zusammen mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, einen oder mehrere Promotor(en), ein oder mehrere Terminator(en) sowie spezifische Gene, die zur Bereitstellung einer phänotypischen Selektion in transformierten Zellen befähigt sind. Die transformierten Wirte können gemäß im Fachgebiet bekannter Mittel fermentiert und kultiviert werden, um ein optimales Zellwachstum zu erreichen.

Die Erfindung umfasst eine im Wesentlichen reine DNA, die für ein TADG-14-Protein codiert, wobei ein Strang dieser DNA bei hoher Stringenz mit einer Sonde hybridisiert, die eine Sequenz mit mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von (SEQ ID NO: 6) enthält. Das durch die DNA dieser Erfindung codierte Protein kann mindestens 80% Sequenzidentität (vorzugsweise 85%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95%) mit den in 6 angegebenen Aminosäuren (SEQ ID NO: 7) aufweisen. Mehr bevorzugt schließt die DNA die codierende Sequenz der Nukleotide von 6 (SEQ ID NO: 6) oder eine degenerative Variante einer derartigen Sequenz ein.

Die Sonde, mit der die erfindungsgemäße DNA hybridisiert, besteht vorzugsweise aus einer Sequenz von mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, mehr bevorzugt 40 Nukleotiden, noch mehr bevorzugt 50 Nukleotiden und am meisten bevorzugt 100 Nukleotiden oder mehr (bis zu 100%) der codierenden Sequenz der in 6 angegebenen Nukleotide (SEQ ID NO: 6) oder dem Komplement davon. Eine derartige Sonde ist zum Nachweis der Expression von TADG-14 in einer humanen Zelle durch ein Verfahren geeignet, das die Schritte (a) In-Kontakt-Bringen von aus der Zelle erhaltener mRNA mit der markierten Hybridisierungssonde und (b) Detektieren der Hybridisierung der Sonde mit der mRNA einschließt.

Diese Erfindung schließt auch eine im Wesentlichen reine DNA ein, die eine Sequenz von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden (vorzugsweise 20, mehr bevorzugt 30, noch mehr bevorzugt 50 und am meisten bevorzugt sämtliche) der Region von Nukleotid 1 bis 1343 der in 6 gezeigten Nukleotide (SEQ ID NO: 6) enthält.

„Hohe Stringenz" bedeutet DNA-Hybridisierungs- und Waschbedingungen, die durch eine hohe Temperatur und geringe Salzkonzentration, z. B. Waschbedingungen bei 65°C bei einer Salzkonzentration von ungefähr 0,1 x SSC, oder dem funktionellen Äquivalent davon, gekennzeichnet sind. Beispielsweise können Bedingungen hoher Stringenz eine Hybridisierung bei etwa 42°C in Gegenwart von etwa 50% Formamid, einem ersten Waschschritt bei etwa 65°C mit etwa 2 x SSC, enthaltend 1 SDS, gefolgt von einem zweiten Waschschritt bei etwa 65°C mit etwa 0,1 x SSC, einschließen.

„Im Wesentlichen reine DNA" bedeutet DNA, die aufgrund einer Reinigung (teilweiser oder vollständiger Aufreinigung) von einigen oder allen Molekülen in diesem Milieu oder aufgrund der Veränderung von Sequenzen, welche die beanspruchte DNA flankieren, nicht Teil eines Milieus ist, in welchem die DNA natürlicherweise auftritt. Der Ausdruck schließt daher beispielsweise eine rekombinante DNA, die in einen Vektor, in ein autonom replizierendes Plasmid oder Virus, oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingefügt ist, oder die als getrenntes Molekül (z. B. eine cDNA oder ein genomisches oder cDNA-Fragment, die/das durch Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Restriktionsendonukleaseverdau) unabhängig von anderen Sequenzen existiert, ein. Er schließt ebenfalls eine rekombinante DNA ein, die Teil eines Hybridgens ist, das eine zusätzliche Polypeptidsequenz, z. B. ein Fusionsprotein, codiert. Ebenfalls eingeschlossen ist eine rekombinante DNA, die einen Teil der in 6 gezeigten Nukleotide (SEQ ID NO: 6) einschließt, die eine alternative Spleißvariante von TADG-14 codiert.

Die DNA kann mindestens etwa 70% Sequenzidentität mit der codierenden Sequenz der in 6 angegebenen Nukleotide (SEQ ID NO: 6), vorzugsweise mindestens 75 (z. B. mindestens 80%) und am meisten bevorzugt mindestens 90% aufweisen. Die Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine unmittelbare Funktion der Anzahl von übereinstimmenden oder identischen Positionen. Wenn eine Unterposition in beiden der zwei Sequenzen von der gleichen monomeren Untereinheit besetzt wird, z. B. falls eine gegebene Position in beiden DNA-Molekülen durch Adenin besetzt wird, sind diese an dieser Position identisch. Falls beispielsweise sieben Positionen in einer Sequenz mit einer Länge von 10 Nukleotiden mit den entsprechenden Positionen in einer zweiten Sequenz mit 10 Nukleotiden identisch sind, weisen diese zwei Sequenzen eine Sequenzidentität von 70% auf. Die Länge von Vergleichssequenzen beträgt im Allgemeinen mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 60 Nukleotide, mehr bevorzugt mindestens 75 Nukleotide und am meisten bevorzugt 100 Nukleotide. Die Sequenzidentität wird typischerweise unter Verwendung einer Sequenzanalyse-Software (z. B. Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53605) gemessen.

Die vorliegende Erfindung umfasst einen Vektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein humanes TADG-14-Protein codiert, und wobei der Vektor zur Replikation in einem Wirt befähigt ist, umfassend in funktionsfähiger Verknüpfung: a) einen Replikationsursprung, b) einen Promotor und c) eine für das Protein codierende DNA-Sequenz. Vorzugsweise enthält der erfindungsgemäße Vektor einen Teil der in SEQ ID NO: 6 gezeigten DNA-Sequenz. Ein „Vektor" kann als ein replizierbares Nukleinsäurekonstrukt, z. B. ein Plasmid oder eine virale Nukleinsäure, definiert werden. Vektoren können zur Amplifikation und/oder Expression einer Nukleinsäure, die das TADG-14-Protein codiert, verwendet werden. Ein Expressionsvektor ist ein replizierbares Konstrukt, in welchem eine ein Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz in funktionsfähiger Weise mit geeigneten Kontrollsequenzen verknüpft ist, die zur Bewirkung der Expression des Polypeptids in einer Zelle befähigt sind. Der Bedarf nach derartigen Kontrollsequenzen hängt von der gewählten Zelle und dem ausgewählten Transformationsverfahren ab. Allgemein schließen Kontrollsequenzen einen Transkriptionspromotor und/oder -verstärker bzw. -enhancer, geeignete mRNA-Ribosomen-Bindungsstellen und Sequenzen, welche die Termination von Transkription und Translation steuern, ein. Es können einem Fachmann bekannte Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die geeignete transkriptionelle und translationelle Kontrollsignale enthalten, verwendet werden. Siehe beispielsweise die in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl.), Cold Spring Harbor Press, N.Y., beschriebenen Techniken. Ein Gen und seine Transkriptionskontrollsequenzen sind als „in funktionsfähiger Weise verknüpft" definiert, wenn die Transkriptionskontrollsequenzen in wirksamer Weise die Transkription des Gens steuern. Vektoren der Erfindung schließen Plasmidvektoren und virale Vektoren ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugte virale Vektoren der Erfindung sind diejenigen, die von Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierten Viren, SV40-Virus oder Herpesviren abgeleitet sind.

Ein „im Wesentlichen reines Protein" bedeutet ein Protein, das mindestens von einigen von denjenigen Komponenten getrennt wurde, welche es natürlicherweise begleiten. Typischerweise ist das Protein im Wesentlichen rein, wenn es zu mindestens 60 Gew.-% frei von den Proteinen und anderen natürlicherweise auftretenden organischen Molekülen, mit denen es natürlicherweise in vivo assoziiert ist, frei ist. Vorzugsweise beträgt die Reinheit der Präparation mindestens 75%, mehr bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt 99%, bezogen auf das Gewicht. Ein im Wesentlichen reines TADG-14-Protein kann beispielsweise durch Extraktion aus einer natürlichen Quelle, durch Expression einer rekombinanten Nukleinsäure, die ein TADG-14-Polypeptid codiert, oder durch chemische Synthese des Proteins erhalten werden. Die Reinheit kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren, z. B. Säulenchromatographie, wie Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung eines für TADG-14 spezifischen Antikörpers, Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder HPLC-Analyse bestimmt werden. Ein Protein ist im Wesentlichen frei von natürlicherweise damit assoziierten Komponenten, wenn es von mindestens einigen dieser Verunreinigungen, die es in seinem natürlichen Zustand begleiten, getrennt ist. Somit ist ein Protein, das chemisch synthetisiert wird oder in einem zellulären System produziert wird, das sich von der Zelle unterscheidet, aus dem es natürlicherweise stammt, definitionsgemäß im Wesentlichen frei von seinen natürlicherweise assoziierten Komponenten. Demgemäß schließen im Wesentlichen reine Proteine eukaryotische Proteine ein, die in E. coli oder anderen Prokaryoten oder beliebigen anderen Organismen, in welchen sie natürlicherweise nicht auftreten, synthetisiert sind, ein.

Zusätzlich zu im Wesentlichen vollständigen Proteinen schließt die Erfindung auch Fragmente (z. B. antigene Fragmente) des TADG-14-Proteins (SEQ ID NO: 7) ein. Wie vorliegend verwendet, enthält ein „Fragment", angewendet auf ein Polypeptid, üblicherweise mindestens 10 Reste, typischerweise mindestens 20 Reste und vorzugsweise mindestens 30 (z. B. 50) Reste, jedoch weniger als die vollständige, intakte Sequenz. Fragmente des TADG-14-Proteins können durch einem Fachmann bekannte Verfahren, z. B. durch enzymatischen Verdau des natürlicherweise auftretenden oder rekombinanten TADG-14-Proteins, durch rekombinante DNA-Techniken unter Verwendung eines Expressionsvektors, der ein definiertes Fragment von TADG-14 codiert, oder durch chemische Synthese erzeugt werden. Die Befähigung eines Kandidatenfragments zur Ausübung einer charakteristischen Eigenschaft von TADG-14 (z. B. Bindung an einen für TADG-14 spezifischen Antikörper) kann durch vorliegend beschriebene Verfahren festgestellt werden. Gereinigtes TADG-14 oder antigene Fragmente von TADG-14 können zur Erzeugung neuer Antikörper oder zum Testen existierender Antikörper (z. B. als Positivkontrollen in einem diagnostischen Test) durch Verwendung von einem Fachmann bekannten Standardprotokollen verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung sind polyklonale Antiseren eingeschlossen, die unter Verwendung von TADG-14 oder einem Fragment von TADG-14 als Immunogen beispielsweise in Kaninchen erzeugt werden. Es werden Standardprotokolle zur Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper, die einem Fachmann bekannt sind, verwendet. Die durch dieses Verfahren hergestellten monoklonalen Antikörper können hinsichtlich ihrer Befähigung zur Identifizierung rekombinanter TADG-14-cDNA-Klone und zu deren Unterscheidung von bekannten cDNA-Klonen gescreent werden.

Des Weiteren sind in dieser Erfindung TADG-14-Proteine eingeschlossen, die mindestens teilweise von Teilen der SEQ ID NO: 7 codiert werden, z. B. Produkte der alternativen mRNA-Spleißung oder alternativer Proteinprozessierungsereignisse, oder in welchen ein Abschnitt der TADG-19-Sequenz deletiert wurde. Das Fragment oder das intakte TADG-14-Polypeptid kann mit einem anderen Polypeptide, das z. B. als Markierung, Ligand oder Mittel zur Erhöhung der Antigenizität dient, kovalent verknüpft werden.

Die Erfindung schließt auch einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper ein, der spezifisch an TADG-19 bindet. Die Erfindung schließt nicht nur einen intakten monoklonalen Antikörper, sondern auch ein immunologisch wirksames Antikörperfragment, z. B. ein Fab- oder (Fab)2-Fragment, ein künstliches Einzelketten-FV-Molekül oder ein chimeres Molekül, z. B. einen Antikörpers, der die Bindungsspezifität eines Antikörper, z. B. aus der Maus, und die verbleibenden Teile eines anderen Antikörpers, z. B. aus Mensch, enthält, ein.

In einer Ausführungsform kann der Antikörper oder ein Fragment davon mit einem Toxin oder mit einer detektierbaren Markierung, z. B. einer radioaktiven Markierung, einer nicht-radioaktiven Isotop-Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Chemilumineszenzmarkierung, paramagnetischen Markierung, Enzymmarkierung oder kolorimetrischen Markierung, verknüpft sein. Beispiele geeigneter Toxine schließen das Diphtherietoxin, Pseudomonas Exotoxin A, Ricin und das Choleratoxin ein. Beispiele geeigneter Enzymmarkierungen schließen Malathydrogenase, Staphylococcusnuklease, Delta-5-Steroid-Isomerase, Alkoholdehydrogenase, alpha-Glycerinphosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase usw. ein. Beispiele geeigneter Radioisotopmarkierungen schließen 3H, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C usw. ein.

Paramagnetische Isotope zum Zwecke der In-vivo-Diagnose können gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden. Es gibt viele Beispiele von Elementen, die für die magnetische Resonanzbildgebung geeignet sind. Hinsichtlich Diskussionen der magnetischen In-vivo-Resonanzbildgebung siehe beispielsweise Schaefer et al., (1989) JACC 14, 472-480, Shreve et al., (1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-340, Wolf, G.L., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93-95, Wesbey et al., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155, Runge et al. (1984) Invest. Radiol., 19, 408-915. Beispiele geeigneter Fluoreszenzmarkierungen schließen eine Fluoresceinmarkierung, eine Isothiocyalatmarkierung, eine Rhodaminmarkierung, eine Phycoerythrinmarkierung, eine Phycocyaninmarkierung, eine Allophycocyaninmarkierung, eine Ophthaldehydmarkierung, eine Fluorescaminmarkierung usw. ein. Beispiele von Chemilumineszenzmarkierungen schließen eine Luminalmarkierung, eine Isoluminalmarkierung, eine Markierung mit einem aromatischen Acridiniumester, eine Imidazolmarkierung, eine Acridiniumsalzmarkierung, eine Oxalatestermarkierung, eine Luciferinmarkierung, eine Luciferasemarkierung, eine Aequorinmarkierung usw. ein.

Ein Fachmann kennt weitere geeignete Markierungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die Bindung dieser Markierungen an Antikörper oder Fragmenten davon kann unter Verwendung von Standardtechniken, die einem Fachmann bekannt sind, erreicht werden. Typische Techniken sind von Kennedy et al., (1976) in Clin. Chim. Acta 70, 1-31, und von Schurs et al., (1977) in Clin., Chim. Acta 81, 1-40, beschrieben. In Letzterem erwähnte Kopplungstechniken sind das Glutaraldehydverfahren, das Periodatverfahren, das Dimaleinimidverfahren, das m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren.

Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis des TADG-14-Proteins in einer biologischen Probe bereit, welches die Schritte des In-Kontakt-Bringens der Probe mit dem markierten Antikörper, z. B. einem für TADG-14 spezifischen radioaktiv markierten Antikörper, und Bestimmen, ob der Antikörper an eine Komponente der Probe bindet, einschließt.

Wie vorliegend beschrieben, stellt die Erfindung eine Anzahl diagnostischer Vorteile und Verwendungen bereit. Beispielsweise ist das TADG-14-Protein für die Diagnose von Krebs in verschiedenen Geweben geeignet, da dieses Protein in hoch proliferativen Zellen fehlt. Antikörper (oder Antigen bindende Fragmente davon), die an ein für TADG-14 spezifisches Epitop binden, sind in einem Verfahren zum Nachweis des TADG-19-Proteins in einer biologischen Probe zur Diagnose einer cancerogenen oder neoplastischen Transformation geeignet. Dieses Verfahren schließt die Schritte des Gewinnens einer biologischen Probe (z. B. Zellen, Blut, Gewebe usw.) aus einem Patienten mit Verdacht auf Krebs, In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem markierten Antikörper (z. B. einem radioaktiv markiertem Antikörper), der für TADG-14 spezifisch ist, und Detektieren des TADG-14-Proteins unter Verwendung von Standardimmuntesttechniken, wie einem ELISA, ein. Die Antikörperbindung an die biologische Probe zeigt an, dass die Probe eine Komponente enthält, die spezifisch an ein Epitop in TADG-14 bindet.

In ähnlicher Weise kann ein Northern-Blot-Standardtest verwendet werden, um die relativen Mengen von TADG-14-mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe, die/das von einem Patienten mit Verdacht auf Krebs erhalten wird, gemäß üblichen Northern-Hybridisierungstechniken, die einem Fachmann bekannt sind, zu bestimmen. Dieser Northern-Test verwendet eine Hybrisierungssonde, z. B. radiomarkierte TADG-14-cDNA, die entweder die vollständige einzelsträngige DNA mit einer zur SEQ ID NO: 6 (6) komplementären Sequenz oder ein Fragment dieser DNA-Sequenz mit einer Länge von mindestens 20 (vorzugsweise mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden) enthält. Die DNA-Hybridisierungssonde kann durch beliebige der vielen verschiedenen, einem Fachmann bekannten Verfahren markiert werden.

Antikörper gegen das TADG-14-Protein können in einem Immuntest zur Bestimmung erhöhter TADG-14-Proteinexpressionsspiegel in Geweben mit Verdacht auf neoplastische Transformation verwendet werden. Die gleichen Verwendungen können mit Northern-Blot-Tests und -Analysen erreicht werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA, die ein TADG-14-Protein codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) isolierter DNA, die ein TADG-14-Protein codiert, (b) isolierter DNA, die mit vorstehender isolierter DNA von (a) hybridisiert und die ein TADG-14-Protein codiert, und (c) isolierter DNA, die sich von den vorstehenden isolierten DNAs von (a) und (b) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes in der codierenden Sequenz unterscheidet, und die ein TADG-14-Protein codiert. Vorzugsweise weist die DNA die in SEQ ID NO: 6 gezeigte Sequenz auf. Mehr bevorzugt codiert die DNA ein TADG-14-Protein mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen Vektor, der zur Expression der DNA der vorliegenden Erfindung, angepasst zur Expression in einer rekombinanten Zelle, befähigt ist und für die Expression der DNA in der Zelle erforderliche Regulationselemente aufweist. Vorzugsweise enthält der Vektor DNA, die für ein TADG-19-Protein mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, codiert.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit dem vorliegend beschriebenen Vektor transfiziert ist, wobei der Vektor ein TADG-14-Protein exprimiert. Repräsentative Wirtszellen schließen Bakterienzellen, Säugerzellen und Insektenzellen ein.

Die vorliegenden Erfindung betrifft auch ein isoliertes und gereinigtes TADG-14-Protein, das von einer DNA codiert wird, das aus der Gruppe, bestehend aus (a) isolierter DNA, die ein TADG-19-Protein codiert, (b) isolierter DNA, die mit der vorstehenden isolierten DNA von (a) hybridisiert und die ein TADG-14-Protein codiert, und (c) isolierter DNA, die sich von den vorstehenden isolierten DNAs von (a) und (b) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes in der codierenden Sequenz unterscheidet und die ein TADG-14-Protein codiert, ausgewählt ist. Vorzugsweise weist das isolierte und gereinigte TADG-14-Protein nach Anspruch 9 die in SEQ ID NO: 7 gezeigte Aminosäuresequenz auf.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis der Expression des Proteins nach Anspruch 1, umfassend die Schritte: (a) In-Kontakt-Bringen von mRNA, die aus der Zelle erhalten wurde, mit der markierten Hybridisierungssonde und (b) Detektieren der Hybridisierung der Sonde mit der mRNA.

Die nachfolgenden Beispiele sind zum Zwecke der Veranschaulichung verschiedener Ausführungsformen der Erfindung angegeben und schränken die vorliegende Erfindung in keiner Weise ein.

BEISPIEL 1 Gewebegewinnung und -lagerung

Nach der Entfernung der Gebärmutter, bilateraler Salpingo-Oophorektomie oder operativer Entfernung des neoplastischen Gewebes der Patientin wurde die Prone erfasst und eisgekühlt. Die Probe wurde dann dem örtlichen Pathologen zur Isolierung und Identifizierung spezifischer Gewebeproben übergeben. Schließlich wurde die Probe in flüssigem Stickstoff eingefroren, in die Labordaten aufgenommen und bei –80°C gelagert. Zusätzliche Proben wurden regelmäßig vom Cooperative Human Tissue Network (CHTN) erhalten. Diese Proben wurden von der CHTN präpariert und uns auf Eis zugesandt. Nach der Ankunft wurden diese Proben in die Labordaten aufgenommen und bei –80°C gelagert.

BEISPIEL 2 mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese

Die Isolierung von Boten-RNA (mRNA) wurde unter Verwendung des von Becton Dickinson (Kat. # 30039) erhaltenen Mini RiboSepTM Ultra mRNA-Isolierungskits gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Dieses war ein auf der Oligo(dt)-Chromatographie beruhendes mRNA-Isolierungssystem. Die gewonnene mRNA-Menge wurde durch UV-Spektrophotometrie quantifiziert.

Der erste Strang der komplementären DNA (cDNA) wurde unter Verwendung von 5,0 mg mRNA und entweder Zufallshexamer- oder Oligo(dT)-Primern gemäß dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung eines Erststransynthesekits von Clontech (Kat. # K1402-1) synthetisiert. Die Reinheit der cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung von für das p53-Gen spezifischen Primern bewertet. Diese Primer erfassen ein Intron, so dass reine cDNA von mit genomischer DNA kontaminierter cDNA unterschieden werden kann.

BEISPIEL 3 PCR-Reaktionen

Die Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt: Erststrang-cDNA, ausgehend von 50 ng mRNA, wurde als Matrize in Gegenwart von 1,0 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,025 U Taq-Polymerase/ml der Reaktion und mit dem Enzym geliefertem 1x Puffer verwendet. Außerdem wurden Primer zu der PCR-Reaktion gegeben. Degenerierte Primer, die verschiedene cDNAs amplifizieren, wurden jeweils bei einer Endkonzentration von 2,0 mM verwendet, während spezifische cDNAs amplifizierende Primer jeweils bis auf eine Endkonzentration von 0,2 mM zugegeben wurden.

Nach anfänglicher Denaturierung bei 95°C für 3 Minuten, wurden 30 PCR-Zyklen in einem Gene Amp 2400 Thermocycler von Perkin Elmer durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 30 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 30 Sekunden Primer-Anlagerung bei der geeigneten Anlagerungstemperatur* und 30 Sekunden Extension bzw. Verlängerung bei 72°C. Im Endzyklus wurde eine Verlängerung bei 72°C für 7 Minuten durchgeführt. Um sicherzustellen, dass die Reaktion erfolgreich war, wird eine Fraktion des Gemischs auf einem 2% Agarose/TAE-Gel, gefärbt mit Ethidiumbromid (Endkonzentration 1 mg/ml), elektrophoretisiert. Die Anlagerungstemperatur hing von den in der PCR-Reaktion verwendeten Primern ab. Bei Reaktionen mit degenerierten Primern wurde eine Anlagerungstemperatur von 48°C verwendet. Die geeignete Anlagerungstemperatur für die TADG14- und &bgr;-Tubulin-spezifischen Primer betrug 62°C.

BEISPIEL 4 T-Vektor-Ligation und Transformationen

Die gereinigten PCR-Produkte wurden in das T-Vektorplasmid von Promega ligiert, und die Ligationsprodukte wurden zur Transformation kompetenter JM109-Zellen gemäß den Angaben des Herstellers (Promega Kat. # A3610) verwendet. Positive Kolonien wurden für die Amplifikation kultiviert, die Plasmid-DNA wurde mittels des WizardTM Miniprep DNA-Reinigungssystems (Promega Kat. # A7500) isoliert, und die Plasmide wurden mit den Restriktionsenzymen ApaI und SacI zur Bestimmung der Größe des Inserts verdaut. Plasmide mit Inserts der Größe(n), die bei der vorstehend beschriebenen Gel-Elektrophorese der PCR-Produkte sichtbar waren, wurden sequenziert.

BEISPIEL 5 DNA-Sequenzierunq

Unter Verwendung eines nahe der Klonierungsstelle Plasmid-spezifischen Primers wurden Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung des PRISMTM Ready Reaction Dye DeoxyTM Terminators (Applied Biosystems Kat. # 401384) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Überschüssige Farbterminatoren wurden aus der vervollständigten Sequenzierungsreaktion unter Verwendung einer Centri-sepTM-Zentrifugationssäule (Princeton Separation Kat. # CS-901) entfernt. Es war ein DNA-Sequenzierungssystem Modell 373A von Applied Biosystems verfügbar, und es wurde für die Sequenzanalyse verwendet. Aufgrund der bestimmten Sequenz wurden Primer, die das interessierende Gen spezifisch amplifizieren, entworfen und synthetisiert.

BEISPIEL 6 Northern-Blot-Analyse

mRNAs (ungefähr 5 mg) wurden durch Elektrophorese in einem 1,2% Agarose-Gel mit 6,3% Formaldehyd in 0,02 M MOPS, 0,05 M Natriumacetat (pH 7,0) und 0,001 M EDTA nach der Größe getrennt. Die mRNAs wurden dann durch Kapillarkraft in 20x SSPE auf Hybond-N (Amersham) geblottet. Die RNAs wurden durch Backen für 2 Stunden bei 80°C auf der Membran fixiert. Zusätzliche Northern-Blots multipler Gewebe (MTN)-Blots wurden von CLONTECH Laboratories, Inc., erhalten. Diese Blots schlossen den humanen MTN-Blot (Kat. # 7760-1), den humanen MTN-II-Blot, (Kat. # 7759-1), den humanen fötalen MTN-II-Blot (Kat. # 7756-1) und den humanes Gehirn MTN-III-Blot (Kat. # 7750-1) ein. Die geeigneten Sonden wurden unter Verwendung des von Promega erhältlichen Prime-a-Gene Markierungssystems (Kat. # U1100) radiomarkiert. Die Blots wurden hybridisiert und gemäß des ExpressHyb Hybridization Solution Protokolls, das von CLONTECH (Kat. # 8015-1 oder 8015-2) erhältlich ist, gestrippt.

BEISPIEL 7 Quantitative PCR

Es wurde eine quantitative PCR in einem Reaktionsgemisch, bestehend aus ausgehend von 50 ng mRNA erhaltener cDNA, 5 pmol Sense- und Antisense-Primern für TADG14 und die interne Kontrolle &bgr;-Tubulin, 0,2 mmol dNTPs, 0,5 mCi [&agr;-32P]dCTP und 0,625 U Taq-Polymerase in 1x Puffer in einem Endvolumen von 25 ml, durchgeführt. Dieses Gemisch wurde einer Denaturierung bei 95°C für 1 Minute unterworfen, gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung für 30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden Anlagerung bei 62°C und 1 Minute Verlängerung bei 72°C mit zusätzlichen 7 Minuten Verlängerung im letzten Zyklus. Das Produkt wurde in einem 2b-Agarosegel zur Auftrennung elektrophoretisiert, das Gel wurde unter Vakuum getrocknet und autoradiographiert. Die relative Radioaktivität jeder Bande wurde mit dem PhosphoImager von Molecular Dynamics bestimmt.

BEISPIEL 8

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von auf die konservierten Bereiche der Serinprotease gerichteten Primern zur Identifizierung von Mitgliedern dieser Klasse, die in Karzinomen überexprimiert werden. Einige Gene wurden in anderen Geweben identifiziert und kloniert, jedoch zuvor nicht mit dem Ovarkarzinom in Zusammenhang gebracht. Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue, im Ovarkarzinom identifizierte Protease. Dieses Gen wurde unter Verwendung von Primern identifiziert, die auf den konservierten Bereich gerichtet waren, der die Aminosäure Histidin in der katalytischen Domäne und die Aminosäure Serin in der katalytischen Domäne, die sich etwa 150 Aminosäuren stromabwärts zum Carboxylende hin befindet, umgibt.

Das die neue extrazelluläre Serinprotease der vorliegenden Erfindung codierende Gen wurde aus einer Gruppe von im Karzinom überexprimierter Proteasen durch Subklonierung und Sequenzierung geeigneter PCR-Produkte identifiziert. Ein Beispiel einer derartigen PCR-Reaktion ist in der 1 gezeigt. Die Subklonierung und Sequenzierung einzelner Banden aus einer derartigen Amplifikation stellte die Grundlage zur Identifizierung der neuen Protease der vorliegenden Erfindung bereit.

BEISPIEL 9

Die für die katalytische Domäne für TADG-14 bestimmte Sequenz ist in der 2 dargestellt, und sie stimmt mit anderen Serinproteasen überein und enthält spezifische konservierte Aminosäuren, die für die katalytische Domäne der Familie der Serinproteasen charakteristisch sind. Es wurden spezifische Primer (20mere), die von dieser Sequenz abgeleitet sind, verwendet.

Es wurden eine Reihe normaler und Tumor-cDNAs untersucht, um die Expression des TADG-14-Proteins zu bestimmen. Bei einer Reihe von neun Karzinomen im Vergleich zu drei normalen unter Verwendung von &bgr;-Tubulin als interne Kontrolle für die PCR-Amplifikation war TADG-14 in acht der neun Karzinomen überexprimiert, und es wurde entweder nicht oder mit einem sehr geringen Gehalt in normalem epithelialem Gewebe nachgewiesen (3). Diese Untersuchung wurde auf eine Standardreihe mit etwa 35 Tumoren ausgedehnt. Unter Verwendung dieser spezifischen Primer wurde die Expression dieses Gens auch sowohl in Tumorzelllinien als auch anderen Tumorgeweben, wie in 9 gezeigt, untersucht. Die Expression von TADG-14 wurde ebenfalls in Brustkarzinom und Kolonkarzinom beobachtet. Es wurde keine TADG-14-Expression in anderen Geweben festgestellt. Beispielsweise wurden keine TADG-14-Spiegel mittels Northern-Blot-Analyse in irgendeinem der folgenden normalen Gewebe nachgewiesen: fötale Lunge, fötales Herz, fötales Hirn, fötale Niere, adulte Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Ovarien, Dünndarm, Kolon, Leucozyten aus dem peripheren Blut, Herz, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Pankreas, Amygdala, caudater Nucleus, Corpus callosum, Hippocampus, Gesamthirn, subthalamischer Nucleus und Thalamus.

Unter Verwendung der spezifischen Sequenz für TADG-14, welche die gesamte Domäne des katalytischen Zentrums umfasst, als Sonde für eine Northern-Blot-Analyse, wurden drei Northern-Blots untersucht: Einer wurde aus Ovargeweben, sowohl normal als auch mit Karzinom, einer aus fötalen Geweben und einer aus adulten normalen Geweben gewonnen. Wie in 5 gezeigt, wurden große Mengen des TADG-14-Transkripts in Ovarkarzinomen festgestellt. Die Transkripte wurden in allen Karzinomen nachgewiesen, jedoch bei geringeren Gehalten in einigen Ovarkrebs-Subtypen. Des Weiteren wurde kein Transkript in normalem Ovargewebe festgestellt. Die Transkriptgröße betrug ungefähr 1,4 kB. Von besonderem Interesse ist die Tatsache, dass im untersuchten fötalen Gewebe, einschließlich Hirn, Lunge, Leber, Niere, und in den verschiedenen untersuchten adulten Geweben keiner dieser Blots eine Expression des TADG-14-Transkripts zeigte. Die Hybridisierung bei den fötalen und adulten Blots war in Ordnung und wurde mit der gleichen Probe wie beim Ovargewebe durchgeführt. Nach dieser Untersuchung wurde bestätigt, dass die Blots andere nachweisbare mRNA-Transkripte enthielten.

Unter Verwendung der vom originären vollständigen PCR-Klon, entsprechend den Nukleotiden 713-1160 der katalytischen Domäne, abgeleiteten Basensequenz als Sonde zum Screening von Bibliotheken wurde eine von Ascites-Tumorzellen erhaltene Ovarkarzinom-Bibliothek hinsichtlich des Vorhandenseins von TADG-14 untersucht. Es wurden vier Klone erhalten, von denen zwei das vollständige mRNA-Transkript von 1,4 kB des TADG-14-Gens abdeckten. Die vollständige Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 6) ist in der 6 zusammen mit der Translation des offenen Leserasters (SEQ ID NO: 7) gezeigt.

In der Nukleotidsequenz befindet sich eine Kozak-Sequenz, die für Sequenzen stromaufwärts von der Translationsinitiationsstelle typisch sind. Es ist ebenfalls eine Polyadenylierungs-Signalsequenz und ein Poly-A-Schwanz vorhanden. Das offene Leseraster besteht aus einer Sequenz von 260 Aminosäuren (SEQ ID NO: 7), die eine Sekretionssignalsequenz innerhalb der ersten 25 Aminosäuren einschließt, was die extrazelluläre Prozessierung der Protease bestätigt. Es ist ebenfalls eine eindeutige Skizzierung der konservierten Histidin-, Asparaginsäure-, Serin-Reihe der katalytischen Domäne zusammen mit einer Reihe von in der Serinprotease-Familie konservierten Aminosäuren dargestellt.

Ein Datenbankabgleich sowohl hinsichtlich der exprimierten Markierungssequenz als auch der vollständigen Transkripte ergab sieben Gene, die eine signifikante Homologie zu dieser neu identifizierten Serinprotease aufwiesen. Ein Gen wurde im Maushirn identifiziert, und ein Vergleich der Nukleotidhomologie ist in der 7 dargestellt. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzhomologie ist in der 8 gezeigt. Die Gegenüberstellung von TADG-14 und Neuropsin der Maus (Chen Z.L. et al., J. Neuroscience, 1995, Bd. 15 (7), Seiten 5088-5097) ergab eine Ähnlichekeit von 77,2% und eine Identität von 72,2% auf Aminosäureebene für diese zwei Gene. In Anbetracht der Größe des Maustranskripts von 1,4 kB und dass das Maus-Gen 260 Aminosäuren enthält und eine Homologie von größer als 70% besteht, könnte dieses Gen ein humanes Äquivalent des Neuropsin-Gens der Maus oder ein Mitglied Neuropsin-ähnlicher Gene sein.

TADG-14 wird sezerniert und früh in der Tumorentwicklung exprimiert und weist eine invasive Kapazität auf. Daher ist TADG-14 ein potentielles Diagnostikum für Ovar- und andere Krebsarten. TADG-14 kann ebenfalls ein Ziel zur Intervention bei der Regulierung der Tumorverbreitung durch Inhibition, Gentherapie, Antikörperinaktivierungstechnologie sein. Zusätzlich zu seiner offensichtlichen Eignung beim Ovarkarzinom und anderen Karzinomen, einschließlich der vorläufigen Daten in der Brust und der Prostata, können die Neuropsin-ähnlichen Eigenschaften eine Möglichkeit hinsichtlich der Verwendbarkeit bei neuropathologischen Störungen eröffnen.

BEISPIEL 10

Zur Identifizierung der exprimierten Serinproteasen wurden degenerierte Oligodesoxynukleotid-Primer, die für die Amplifikation der konservierten Aminosäuresequenzen, welche die Invarianten His- und Ser-Reste der katalytischen Triade umgeben, entworfen, und in PCR-Reaktionen mit cDNA entweder aus normalem Ovargewebe oder Ovarkarzinom als Matrize verwendet. PCR-Produkte geeigneter Größe wurden in den T-Vektor subkloniert und sequenziert. Von den bereits unter Verwendung dieser Strategie identifizierten Proteasen, z. B. Hepsin und Stratum-corneumchemotryptisches-Enzym (SCCE) wurde festgestellt, dass sie mit abnorm hohen Spiegeln in Ovarkarzinomen exprimiert werden. Homologie-Recherchen nach dieser neuen Protease TADG114 ergaben, dass einer der aus Ovarkarzinom erhaltenen Subklone, eine neue Sequenz mit 406 Basenpaaren (Bp) darstellte, die eine signifikate Sequenzähnlichkeit zu anderen bekannten Proteasen, einschließlich Neuropsin der Maus, humanem glandulären Kallikrein und humanem PSA, aufweist. Die vollständige cDNA dieser neuen Sequenz wurde kloniert, und es wurde festgestellt, dass sie eine Trypsin-ähnliche Serinprotease, TADG14 genannt, codiert. Bedeutsamerweise wurde festgestellt, dass das TADG14-Transkript in einer Mehrzahl von Ovartumoren stark exprimiert wird, jedoch nicht in normalem Ovargewebe exprimiert ist. Die starke Expression von TADG19 scheint auf Tumore beschränkt zu sein, und diese Protease scheint in einer Weise sezerniert zu werden, die eine mögliche Rolle bei der Invasion und Metastase nahelegt. Darüber hinaus ist es aufgrund der extrazellulären Natur dieses Enzyms möglich, seine Expression als diagnostisches Werkzeug für Ovarkrebs auszunutzen.

Unter Verwendung der neuen 406 Bp-Sequenz als Sonde, wurden Northern-Blot-Analysen durchgeführt, um die Transkriptgröße und Gewebsspezifität seiner Expression zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die mRNA dieses Klons ungefähr 1,4 Kilobasen (kb) (9A) enthält und dass sie in Ovarkarzinomen, nicht jedoch in normalen Ovarien, stark exprimiert wird. Bedeutsamerweise wurde festgestellt, dass das Transkript mittels Northern-Analyse in 28 untersuchten normalen humanen Geweben (9B, 9C, 9D, einige Daten nicht gezeigt) nicht nachweisbar ist. Im Rahmen eines empfindlicheren Tests mit 50 normalen humanen Geweben (Clontech) ergab eine RNA-Dot-Blot-Analyse, dass dieser Klon sehr schwach in nur drei von diesen 50 Geweben, nämlich Niere, Lunge und Brustdrüse (Daten nicht gezeigt), exprimiert wird.

Unter Verwendung von Standardhybridisierungstechniken wurde eine cDNA-Bibliothek, die ausgehend von mRNA, welche aus Asciteszellen einer Patientin mit einem ovarialen Cystadenokarzinom isoliert wurde, konstruiert wurde, gescreent. Es wurden fünf Klone erhalten, von denen sich zwei überlappten und 1343 Nukleotide umspannten (10A). Die letzten zwei Nukleotide vor dem Poly(A)-Schwanz und der Poly(A)-Schwanz selbst wurden aus der EST-Datenbank von NCBI (Zugriffs-Nr. AA343629) erhalten. Nachfolgende Northern-Blot-Analysen mit Proben, die von Sequenzen nahe dem 5'- oder 3'-Ende dieser cDNA abgeleitet waren, bestätigten vorhergehende Resultate, die nahelegen, dass die erhaltenen Klone vom gleichen Gen produziert wurden (Daten nicht gezeigt). Diese cDNA schließt eine Kozak-Konsensussequenz zur Translationsinitiation und ein Polyadenylierungssignal ein. Die mRNA enthält ein offenes Leseraster mit 260 Aminosäuren, das die erforderlichen Reste (His73, Asp120, Ser212) im geeigneten Kontext enthält, um dieses Protein der Klasse der Trypsin-ähnlichen Serinproteasen zuzuordnen. Nahe seinem Aminoterminalen Ende enthält das vorhergesagte Protein einen Strang hydrophober Aminosäuren, die als Sekretionssignalsequenz dienen können. Außerdem codieren die Reste 110 bis 112 eine potentielle Glycosylierungsstelle, die bei Serinprotasen der Kallikrein-Unterfamilie, wie PSA, üblich ist. Dieses Enzym wurde TADG14 genannt. Ein Vergleich der abgeleiteten TADG14-Aminosäuresequenz mit Sequenzen bekannter Proteasen ergab, dass es eine deutliche Ähnlichkeit mit humanem glandulären Kallikrein (hHk2), PSA, Protease M und Neuropsin der Maus aufweist. Auf Aminosäureebene ist TADG14 zu 48% mit der Protease M identisch, zu 46% mit hHk2 identisch und zu 43% mit PSA identisch. Interessanterweise zeigen die Maus-Protease Neuropsin und TADG14 eine Aminosäureidentität von 72%. Zusätzlich zur Ähnlichkeit der Proteinsequenzen weisen die Neuropsin- und TADG14-mRNAs eine ähnliche Größe (1,4 kB) und Struktur mit ungefähr der gleichen Menge an 5'- und 3'-nicht-translatierten Bereichen auf, was nahelegt, dass die Sequenzen möglicherweise ortholog sind. Neuropsin wurde ursprünglich aus dem Hippocampus der Maus kloniert, und es wurde gezeigt, dass es bei Stimulation differentiell exprimiert wird. Die TADG14-mRNA war jedoch im Northern-Blot im humanen Hippocampus nicht nachweisbar.

Um das Ausmaß und die Häufigkeit der Expression des TADG14-Gens in Ovarialtumoren zu bestimmen, wurde die quantitative PCR mit cDNA aus normalen Ovarien, Ovarkarzinom und Tumoren mit schwachem malignem Potential (LMP) als Matrize verwendet. Diese Technik wurde zuvor durch Northern-Blot und Western-Blot authentifiziert und verifiziert. Es wurden PCR-Primer, die ein für TADG14 spezifisches Produkt von 230 Bp amplifizieren, synthetisiert, und gleichzeitig in Reaktionen mit Primern, die ein für &bgr;-Tubulin spezifisches PCR-Produkt mit 459 Bp erzeugen, verwendet. Bei der TADG14-spezifischen PCR würden die folgenden Primer verwendet: Sense, 5'-ACAGTACGCCTGGGAGACCA-3'; Antisense, 5'-CTGAGACGGTGCAATTCTGG-3'. Die Tubulin-Primer waren wie in der Referenz 11 beschrieben. Die Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt: Ausgehend von 50 ng mRNA erzeugte Erststrang-cDNA wurde als Matrize in Gegenwart von 1,0 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,025 U Taq-Polymerase/ml Reaktion und mit dem Enzym geliefertem 1x Puffer verwendet. Primer zur Amplifikation spezifischer cDNAs wurden in einer Endkonzentration von jeweils 0,2 mM zugegeben. Nach anfänglicher Denaturierung bei 95°C für 3 Minuten wurden 30 PCR-Zyklen in einem Gene Amp 2400 Thermo-Cycler von Perkin Elmer durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 30 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 30 Sekunden Primer-Anlagerung bei 62°C und 30 Sekunden Verlängerung bei 72°C. Im letzten Zyklus wurde bei 72°C für 7 Minuten verlängert. Die Reaktionen enthielten ein radiomarkiertes Nukleotid, die PCR-Produkte wurden auf einem 2%-Agarose-Gel aufgetrennt und die Intensität jeder Bande wurde mit einem PhosphoImager (Molecular Dynamics) quantifiziert. Die 11A zeigt ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarose-Gel mit den aufgetrennten quantitativen PCR-Produkten, und es ist für die typischerweise erhaltenen Resultate repräsentativ.

Das Verhältnis des TADG14-PCR-Produkts zu demjenigen von &bgr;-Tubulin (Mittelwert ± SD) wurde für normale Ovarproben berechnet (0,034 ± 0,024), die sämtlich vergleichsweise geringe Expressionsspiegel zeigten. Die TADG14-Überexpression lag definitionsgemäß vor, wenn sie den Mittelwert des Verhältnisses von TADG14 zu &bgr;-Tubulin bei normalen Proben um mehr als zwei Standardabweichungen (SD) überstieg. Es wurde festgestellt, dass TADG14 in 4 von 10 LMP-Tumoren (40 %) und 20 von 30 untersuchten Ovarkarzinomen (67 %) überexprimiert wurde. Bei einzelnen histologischen Tumorsubtypen betrug das Expressionsverhältnis 0,110 ± 0,092 bei serösen LMP-Tumoren, 0,096 ± 0,142 bei Schleimhaut-LMP-Tumoren, 0,457 ± 0,345 bei serösen Karzinomen, 0,171 ± 0,300 bei Schleimhautkarzinomen, 0,308 ± 0,149 bei klaren Zellkarzinomen und 0,485 ± 0,325 bei endometrioiden Karzinomen. Von den 30 untersuchten Karzinomen überexprimierten TADG14 13 von 17 serösen Tumoren, 1 von 7 Schleimhauttumoren, 3 von 3 klaren Zelltumoren und 3 von 3 endometrioiden Tumoren (11B).

Es wurden auf Basis der abgeleiteten Aminosäuresequenz von TADG14 immunogene Polylysin-verknüpfte Multiantigen-Peptide synthetisiert und zur Immunisierung von Kaninchen zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet. Das gegen die Peptidsequenz LDWIKKIIGSKG erzeugte Antiserum wurde in einer Western-Blot-Analyse verwendet, um zu bestimmen, ob dieser Antikörper ein Protein mit der vorhergesagten Größe von 28 kDa erkennt. Proteine aus der Gebärmutterhalskrebszelllinie HeLa und der Brustkarzinomzelllinie MD-MBA-4355 wurden in diesem Experiment verwendet, und es wurde festgestellt, dass der Antikörper in beiden ein einzelnes 30-kDa-Protein erkennt (12A, Spuren 3 und 4). Diese Größe liegt innerhalb des üblichen Bereichs des vorhergesagten Molekulargewichts. Als Negativkontrolle wurden HeLa- und MD-MB435S-Lysate zweifach mit Kaninchen-Präimmunserum untersucht (12A, Spuren 1 und 2). Bedeutsamerweise war dieses Experiment mit Antiseren gegen ein Peptid aus einer anderen Region von TADG19 reproduzierbar, was nahelegt, dass kultivierte Krebszellen das TADG14-Protein herstellen.

Eine immunhistochemische Färbung stützte die mittels quantitativer PCR und Northern-Blot erhaltenen Daten, wie in der 13 gezeigt wird. Unter Verwendung eines gegen ein TADG14-Peptid gerichteten Antikörpers wurde keine Färbung bei normalen ovarialen Gewebsproben beobachtet. Es ergab sich jedoch eine intensive Färbung bei Tumorzellen aller der verschiedenen untersuchten histologischen Ovarkarzinom-Subtypen. Bei serösen Karzinomen scheint das Antigen mit den Tumorzellen in Form von Granulae assoziiert zu sein. Diese granulären Strukturen können Intermediate im Stoffwechselweg darstellen, der schließlich zur Sekretion von TADG14 führt. In Schleimhaut- und klaren Zellkarzinomproben ist TADG14 stark mit den Tumorzellen assoziiert. Im endometrioiden Karzinom herrscht das Antigen im von den Tumorzellen gebildenden glandulären Lumen vor.

Die Lethalität der Krebszellen beruht auf ihrer Befähigung, abnorm zu proliferieren und in normale Wirtsgewebe einzuwandern. Maligne Veränderungen bedienen sich Proteasen, um eine Vielzahl von Mechanismen bereitzustellen, die den Prozess der Tumorprogression, einschließlich der Aktivierung von Wachstums- und angiogenen Faktoren, zu unterstützen und so die Grundlage für die Invasion und Metastase zu legen. Im Verlauf der Untersuchungen dieser Enzyme wurde die Überexpression der bekannten Proteasen Hepsin und SCCE festgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine cDNA kloniert, die eine neue Serinprotease, TADG14, codiert. Es wurde festgestellt, dass diese Protease in 67 % (20/30) der untersuchten Ovarkarzinomen sehr stark exprimiert wird, während sie in normalem Ovargewebe nicht nachweisbar war. Es wurden keine Spiegel des TADG14-Transkripts in irgendeinem der 50 normalen humanen Gewebe, die untersucht wurden, festgestellt, die ähnlich denjenigen in den Tumorproben waren. Dies legt die Möglichkeit nahe, dass dieses Gen von einem Promotor kontrolliert wird, der in Ovartumoren am aktivsten ist, und es ist möglich, diese Tatsache therapeutisch auszunutzen.

Auf der Aminosäureebene ähnelt TADG14 am deutlichsten einer als Neuropsin bekannten Maus-Protease, die ursprünglich aus dem Hippocampus der Maus kloniert wurde. Neuropsin wurde mit der neuronalen Plastizität in Zusammenhang gebracht, was nahelegt, dass TADG14 möglicherweise zur Restrukturierung der dreidimensionalen Architektur eines Tumors befähigt ist und es die Ablösung von Tumorzellen oder die Invasion normaler Wirtsgewebe erlaubt. Die immunhistochemische Färbung von Ovartumoren ergab, dass TADG14 stark mit Tumorzellen und Zellen nahe der invasiven Fronten der Tumorzellen assoziiert ist. Daher ist TADG14 ein wichtiges Ziel zur Inhibition der Tumorprogression.

Bedeutsamerweise bleibt die Fünfjahres-Überlebensrate bei Patientinnen mit Ovarkrebs unterhalb von 50 %, da man nicht in der Lage ist, diese Erkrankung in einem frühen Stadium zu diagnostizieren. TADG14 enthält eine Sekretionssignalsequenz, und immunhistochemische Daten legen nahe, dass TADG14 sezerniert wird. Des Weiteren scheint TADG14 anhand von Northern-Blot- und RNA-Dot-Blot-Analysen eher tumorspezifisch zu sein. Aufgrund dessen erscheint es möglich, auf dem Nachweis dieses Proteins beruhende Tests zur frühen Detektion von Ovarkrebs zu entwerfen. Derzeit ist der beste verfügbare Ovarkrebs-Tumormarker CA125. Aufgrund der hohen endogenen Kreislaufspiegel dieses Antigens beschränkt das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis jedoch dessen Verwendbarkeit als diagnostisches Werkzeug. Daher könnte sich erweisen, dass TADG14 aufgrund seiner eingeschränkten Expression in anderen Geweben ein wertvolles Werkzeug zur Diagnose von Ovarkrebs, insbesondere des am meisten vorherrschenden serösen Cystadenokarzinom-Subtyps, ist.


Anspruch[de]
DNA, codierend ein Protein von einem Tumor-Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14), worin sich das genannte Protein mindestens 80 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:7 gezeigten Aminosäuresequenz teilt und worin die genannte DNA aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) Isolierter DNA, die ein Protein von einem Tumor- Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) codiert;

(b) isolierter DNA, die bei hoher Stringenz an isolierte DNA von (a) vorstehend hybridisiert und die ein Protein von einem Tumor-Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) codiert; und

(c) isolierter DNA, die sich von den isolierten DNAs von (a) und (b) vorstehend aufgrund der Degeneration des genetischen Codes in der Codonsequenz unterscheidet, und die ein Protein von einem Tumor-Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) codiert.
DNA nach Anspruch 1, worin genannte DNA die in SEQ ID NO:6 gezeigte Sequenz aufweist. DNA nach Anspruch 1, worin genanntes Protein von einem Tumor-Rntigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) die in SEQ ID NO:7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Vektor, der zur Expression der DNA nach Anspruch 1 in einer rekombinanten Zelle fähig ist, worin der genannte Vektor die genannte DNA und zur Expression von genannter DNA in einer Zelle notwendige Regulationselemente umfasst. Vektor nach Anspruch 4, worin genannte DNA ein Protein von einem Tumor-Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) mit der in SEQ ID NO:7 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist. Mit dem Vektor nach Anspruch 4 transfizierte Wirtszelle, wobei genannter Vektor ein Protein von einem Tumor-Rntigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) exprimiert. Wirtszelle nach Anspruch 6, worin genannte Zelle aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Bakterienzellen, Säugerzellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen. Wirtszelle nach Anspruch 7, worin die genannte Bakterienzelle E. coli ist. Isoliertes und gereinigtes Protein von einem Tumor-Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14), worin sich das genannte Protein mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:7 gezeigten Aminosäuresequenz teilt und worin das genannte Protein durch DNA codiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) Isolierter DNA, die ein Protein von einem Tumor-Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) codiert;

(b) isolierter DNA, die bei hoher Stringenz an isolierte DNA von (a) vorstehend hybridiziert und die ein Protein von einem Tumor-Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) codiert; und

(c) isolierter DNA, die sich von den isolierten DNAs von (a) und (b) vorstehend aufgrund der Degeneration des genetischen Codes in der Codonsequenz unterscheidet und die ein Protein von einem Tumor-Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) codiert.
Isoliertes und gereinigtes Protein von einem Tumor-Antigen-Derived-Gene-14 (TADG-14) nach Anspruch 9, das die in SEQ ID NO:7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Verfahren zum Nachweis der Expression des Proteins, das durch die DNA nach Anspruch 1 codiert ist, umfassend die Schritte von:

(a) Kontaktieren der aus einer Zelle mit der markierten Hybridisierungssonde erhaltenen mRNA, umfassend den gesamten offenen Leserahmen oder einen Teil eines offenen Leserahmens von SEQ ID NO:6, und

(b) Nachweis der Hybridisierung von genannter Sonde mit genannter mRNA.






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